JPS5993092A - 蛋白多糖体 - Google Patents

蛋白多糖体

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JPS5993092A
JPS5993092A JP57200585A JP20058582A JPS5993092A JP S5993092 A JPS5993092 A JP S5993092A JP 57200585 A JP57200585 A JP 57200585A JP 20058582 A JP20058582 A JP 20058582A JP S5993092 A JPS5993092 A JP S5993092A
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acid
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Toshihiro Omori
俊弘 大森
Jun Saeki
純 佐伯
Kousuke Tamura
幸資 田村
Shuichi Yanagidaira
修一 柳平
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規な蛋白多糖体、更に詳しくは制癌作用、
血液浄化作用並びに酸性蛋白の凝集作用等の生理活性を
示す蛋白多糖体に関する。
近年1種々の微生物が生産する多糖類の制癌作用につい
ているいろと報告されており、それらのうちには工業的
に製品化されているものもある。
しかし外から、従来、報告されているとれら多糖類の制
癌作用dその機構が未だ解明されてにいないが免疫賦活
活性に基づくものと推定されている。
本発明者は、多数種の微生物が生産する多糖類について
その制癌作用を研究した結果、子のり菌類のノムシタケ
属並びにアクレモニウム属に属する菌を液体培養するこ
とによりイ(lられる培養液中に橙めて低置性であって
腫瘍細胞の増殖を泊接強く抑制する作用を有する蛋白多
糖体を見出し、本発明をなすに至った。
以下本発明ft、詳しく説明する。
本発明に係る蛋白多糖体(以下本物質と称する)は下記
に示す緒性質によって特徴づりられる。
(1)元素分析値 炭素(C1:42〜47チ 水素I:5〜8チ 窒素(N)ニア−10チ (2)糖質部分の組成 本物質を4N−Hellで100Cにおいて16時間加
水分解後アミノ酸分析計によシ測定した結果、第3図に
示すとおり、主としてガラクトサミンから成るアミノ糖
(70〜80重景%)と、−および本物質を4 N −
H,S 04で100Cにおいて6時間加水分解後、中
和してトリメチルシリル化を行なってガスクロマトグラ
フィによシ測定した結果、第4図に示すとおり、グルコ
ース、マンノースおよびガラクトースから成る中性糖(
5〜10重量%)とから成ることが確認される。
(3)蛋白質部分のアミノ酸組成 本物質における蛋白質部分は5〜10重量%であって、
本物質10m(lに6 N −)ICA’ 1 mlを
加え真空下に封管し、1101:’で22時間加水分m
u。
ロータリーエバポレーターにょシ■Iを除去したもの(
回収されたアミノ酸総量約aOp&)についてアミノ酸
分折開にょシ測定した結果、グルタミン酸、アスノqラ
ギン酸、アルギニン、スレオニン、セリン、フロリン、
グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン
、スレオニン、フェニルアラニン、リジンと少量のシス
ティン、メチオニンを含む。なお、総アミノ酸量として
の含量は3〜5重量%であって、そのうちグルタミン酸
およびアスノQラギン酸の含量が多い。
(4)分子量 ゲルろ過法(東洋)9−ル藺−65を使用)による測定
で5,000乃至1,000o00のブロードなピーク
を示し、ピークの頂点における分子量は約140.00
0を示す。なお、超遠心分析(溶媒0.2M NaCA
’/3%酢酸溶液)によると分子量分布のビ一りが単一
であることから、本物質は均一性を示すものと言える。
(5)呈色反応 反  応            呈 色フェノール硫
酸反応       赤褐色 十アンスロン反応   
      緑 色 十モーリッシュ反応      
  青紫色 十エルソン榔モーガン反応    m  
色 −(但し加水分解物について)   赤紫色 (→
Jカル、4ゾ一ル硫酸反応      無 色 −ビュ
ーレット反応        黄 色 十トルイジンゾ
ルー0染色    無 色 −ニンヒドリン反応   
     官紫色 十(6)比旋光度 本物質は50mM酢酸溶液中で〔α〕20−+252゜
(濃度C=1■パノ)を示す。
(7)紫外線吸収スペクトル 本物質の002M酢酸溶液についての紫外部吸収は第1
図に示すとおりである。
(8)赤外線吸収スペクトル 本物質のKBr錠剤法による赤外部吸収は第2図に示す
とお)である。なお、 3600〜3200傭−1の吸
収は水素結合に由来したrOHによるもので;h I)
 、  1600cm−’の吸収はガラクトサミンの−
NH,による吸収と考えられる。また、870Cr++
−’にはα−配合による吸収がみられる。
(9)  プロトン核磁気共鳴吸収(NMR)本物質を
I C)m9/WItに々るように重酢酸−重水混液に
溶解した溶液について測定した、結果は第5図に示すと
おりである。
本物質のその他の理化学性質は次のとおシである。
(10)物質の性状 淡黄色を呈する粉末であって、X線回析により非結晶性
を示す。
01)溶解性 中性乃至アルカリ性の水性液には溶解せず、酢酸、クエ
ン酸、コハク酸、硫酸、塩酸等の酸性水性液には可溶で
あシ、エタノール、アセトン、n−ヘキサン並ひにエー
テルに不溶。
(1粉 分解点 明確な融点を示さず、220乃至240Cで褐変して分
解する。
本物質の調製 本物質は、不完全菌面間(Deuteromycoti
na)、不完全糸状画線(Hyphomycetes 
)のノムシタケ属(Cordyceps )、アクレモ
ニウム属(Acrernoni+1m)、アスペルギル
ス属(Δspergillus)、 /Qエシロマイセ
スPA (Paecllomyces+)等に属する多
糖類生産菌を液体培地中で培養するととによシ生産され
る。
上記多糖類生産菌として下記菌株を例示し得る。
Cordyceps Japonica IFO964
7Cordyceps ophioglossojde
s IJiυ8992これらの菌の培養に用いる液体培
地は一般に微生物の培養に適用されるもの、例えばグル
コースを炭素源とし、ペゾトン、酵母エキスを含むもの
であればよく、更にビタミン、無機塩類、アミノ酸等の
微昂成分を添加したものも用いられる。培地のpTlは
4〜7の範囲が適自であり、培養は、25Cの温度で3
〜6日間静置培養した後、4〜6日間振とり又は通気攪
拌培養することにより行われる。
上述のようにして培養して得られる培養液は加水後遠心
分11i1Fにょシ菌体を除去した後、活性炭、透析、
イオン交換樹脂等により低分子物質を除去する。このよ
うにして得られる溶液は極めて高い粘性を有するので超
音波処理もしくはホモプレンダーによシ粘性を低下させ
た後35〜100Cの温度に加温して液中の不純物を更
に沈澱させる。
この沈澱を遠心分離によシ分離して得られる上澄液は冷
却後アンモニアのようなアルカリ試薬を用いてpHをア
ルカリ性にすると、本物質が沈澱物としてイ0られる。
このようにして得られる沈澱物を更に酢酸溶液(50m
、M)に溶解後該溶液を5アンモニア等を用いてアルカ
リ性にすると再び沈澱物が生成するので、該沈澱物を蒸
留水で繰返し洗浄後凍結乾燥又は真突乾燥すると、精製
された淡黄色の粉末から成る本物質が得られる。
本物質の生理活性 次に本物質の生理活性について説明する。
ill  急性毒性 マウス並びにラットを対象とした本物質の急性毒性を試
験した結果は表1のとお9である。
なお、試験に供したマウスはICR−JCL系、6〜8
週令、体重25〜30Fのものであり、ラットはウィス
ター系、4〜5週令、体重110〜1402のものであ
って、各試験群25匹宛に本物質を経口並びに腹腔内投
与してそれぞれのLDl、o値を調べた。
表     1 表1にみられるように、本物質のマウス並びにラットに
対するLDllo値が極めて高いことが分る。
(2)抗腫瘍活性 本物質について下記手順によシ抗腫瘍活性試験を行なっ
た。
(イ)invロro抗肺瘍活性試験 マウスEhrβich腹水細胞に対する増殖抑制効果を
調べる目的で、上記細胞(2X 107m1 )を、本
物質の5.10並びに50μf/mlをそれぞれ添加、
含有させたRPMI−1640培地中で37℃の温度で
3日間培養を行なった。−力対照と[7て本物質の代り
に滅菌処理した5チのブドウ糖液を添加した上記培地中
で同様にして培養を行なった。
その結果、本物質を含有させた培地群では5μf /m
/を含有する培地では38後対照に比して約30チに、
lOμ2/m/を含む培地では約20チにEhr、gi
ch細胞の増殖を抑制した。
才た、本物質を50μf/mlを含む培地では実質上全
てのEhr−61ch細胞を死滅させた。
なお、マウスの正常細胞L929を用いて上記と同様な
手順で培養を行なったところ、本物質の該細胞に対する
増殖抑制は全く認められなかった。
(rl)  in vivo抗腫瘍活性試験1)  S
arcoma180固型腫瘍に対する増殖抑制効果を調
べる目的で、マウスを用いて下記手順によシ試験を行な
った。
供試動物としてICR−JCL、6週令雌マウス(体重
25f±32)を用い、[]arCOIn8180腫瘍
細胞は該マウスの腹腔内に腹水型で1週間毎に継代して
いるものを用いた。試験に当っては、上記細胞を接種後
1週間口の腹水中の細胞を取り出し、該細胞の約400
万個を含有する生理食塩水0.1m1tl−上記試験マ
ウスの右脇腹下部皮下に移植した。移植5日後に腫瘍の
増殖が認められたマウスの腫瘍内に、本物質を乳酸酸性
の5チブドウ糖液に0.25〜/mlになるように溶解
して120℃の温度で15分間滅菌した溶液をl mq
/’kgになるように投与し、以後lO日間連続して同
様に投与を行なった。
−力、対照として乳酸酸性の5%ブドウ糖液を上記と同
様にして投与を行なった。
なお、試験マウスは10匹宛を1群として用いた。上述
のようにして腫瘍移植後30日経過してから各マウスを
解剖し、増殖した固型腫瘍を摘出してその重量を測定す
ることにより、本物質の投与群と対照群との比較を行な
った。その結果、本物質の投与群では腫瘍抑制率98.
3%を示し、10匹中9匹の腫瘍は完全に消失したこと
が認められた。
If)  Ehr−gich腹水腫瘍に対する抗腫瘍効
果を調べる目的で、マウスを用いて下記手順により試験
を行なった。
供試動物としてICR−JCL、 8週令雌マウス(体
重25?±32)を用い、このマウス11匹を1群とす
る4群の各々にlXl06個のEhrβich腫瘍杜1
胞を移植し、24時間後対照群と1〜で1群以外の各3
群に本物質を2■/ユ/日、0.5 myA9/日並び
に0,25〜/kg/日の投与量でそれぞれ10日間腹
腔内投与を行ない、各群の延命効果および治療効果を観
察した。なお、対照群には本物質に代えて乳酸酸!′!
:5%のブ[つ糖液を同様にして投与した。その結果は
表2に示すとお9である。
表    2 (註)延命率は下記式に基づいて算出した。
刈胆4片マワスの半勾生仔l:J数 上記抗腫瘍活性試験の結果から本物質の優れた制癌効果
が理解し得る。因みに、従来知られている抗腫瘍性多糖
体は中性糖を主要な構成成分とするものであって、その
制癌性も免疫賦活作用に基づくものと言われているが、
本物質はアミン糖であるガラクトサミンを主要な構成成
分とする蛋白多糖体であって、従来の多糖体とは物性的
にも全く性質を異にするものであり、加うるにその制癌
性も直接腫瘍細胞に作用することに基づくものである。
なお、本物質の有効投与量は0.02 ypy/に9/
日へ〜20〜/kV日の範囲にあると言える。
(31酸性蛋白の凝集性 本物質の酸性蛋白に対する凝集1!l:を下記手順によ
シ試験した。′本物質を50mM酢酸溶液に溶解した溶
液を、各種蛋白質の1%水溶液に添加その結果は表3に
示すとおりである。
表     3 表3にみられるように、本物質は等電点の低い酸性蛋白
を特異的に凝集させる性質を有している。
本物質のこのような酸性蛋白の凝集性は、本物質が下記
に述べるような生理活性剤として利用し得ることを示し
ている。
癌患者の血清中や担癌マウスの腹水中にはイムノザブ゛
レシブアンドプ゛ロディ7 (1mmunosuppr
essiv+acidic protein) (以下
IAPと略記する)が多量に存在することが知られてお
シ、この蛋白は等電点が2.9〜3.2で酸性側にあっ
て、生体の免疫系に対し抑制的に作用すると言われてい
る。したがって、この酸性蛋白を除去することによシ生
体の免疫系を正常に回復し得るようになる。本物質を上
記酸性蛋白の除去に適用するには、本物質を、ガラスピ
ーズ、活性炭粒、セラミック粒、シリコン粒等の表面に
塗布、噴霧等の手段で接着させた粒状物金力ラム等に充
テンし、これに例えば癌患者の血液又は面消奮通過さぜ
ることにより上記面液又fiin清中に存在するIAP
を上記粒状物に吸着させて除去し得るので、生体中の免
疫抑制蛋白の濃度を低下させて生体の免疫機能を回復し
得るようになる。
更に、本物質の酸性蛋白の凝集性は、天然物から得られ
る抽出物から酸性蛋白を吸着又は沈殿さジ  せて除去
するのに適用すると、該抽出物中の他の蛋白、多糖類、
核酸等を精製し得る。
本物質の製剤化 本物質をその抗腫瘍活性を利用して制癌剤として用いる
には、公知の製剤化手法を適用して製剤化し得る。
例えば、経口投与用では錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル
剤等として、又非経口投与用では注射形態の液剤として
それぞれ安定剤、賦形剤を用いて製剤化し得る。
以下に実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。
実施例1 本物質のp製: ポリペプトン100f、酵母エキス5F、グルコース3
002をIonの水に溶解し、pu t 5.5に調整
した液体培地の200m6宛を500m1容の三角フラ
スコ50本に分注し、細柱を施したi 120°Cで1
5分間滅菌した。
上述のようにして得られた液体培地の各々に、別に寒天
培地に培養しておいたAcremonium sp。
1i”ERMl)−6601i常法にl接種し、23〜
27°Cで5日間静置培養を行ない、引続き23〜27
℃で6日間、180 rpmの回転速度で振とり培養を
行ない、全部で高粘性の培養物10石を得た。
この培養物10pにIcIの蒸留水を加え、ホモブレン
ダーで攪拌下に混合したものを20.00 Orpmで
30分間遠心分離を行なって菌糸体を分離、除去し、粘
稠な透明液を得た。この液をホモプレンダーにより低粘
化した後、60℃に30分間加温することにより不純物
を沈殿させ、冷却後連続遠ノ1ノ分離を行なって透明な
液を得た。この透明液を局方アンモニア水でpH9,0
に調整した後、5〜10℃に冷却して淡黄色の沈殿物を
得、この沈殿物を連続遠心分離した後、蒸留水で洗浄し
、次いで50rnM酢酸溶液5看にホモゲナイザーを用
いて溶解した。この溶液に局方アンモニア水を加えてp
Hを9.0に脚整し、5〜10℃で10時間冷却して沈
殿物を得、この沈殿物を連続遠心分離した後蒸留水で洗
液がpH7以下になるまで洗浄した。次いで得られた沈
殿物を凍結乾燥して淡黄色の粉末10.Ofを得た。
本物質の物性: 上述のようにして得られた粉末の主な物性を測定した結
果を示すと下記のとおシである。
1)元素分析値 C二44.72ジ11; H:6.88チ N:8.69チ 11)分子針 東洋)”ルHW−65による分析−71’ 5,000
〜1.0(X)、(XX)111)fPtPt分 成分クトサミン     79.3 (重!!′%)1
唐類(中性糖)9.4 蛋        白        7.81V)比
旋光度 50rnM酢酸溶液中(濃度C=1mg7ml)でI:
y)、”、’−−+−252゜V)呈色反応 反応    呈色 フェノール硫酸反応   赤褐色 アンスロン反応  緑 色 モーリッシュ反応  宵紫色 カルバゾール硫酸反応   無 色 ビューレット反応  無 色 トルイノンプルー〇染色    無  色ニンヒドリン
反応  −1iデ色 Vl)紫外線吸収スペクトル、赤外線吸収スペクトル並
びにプロトン核磁気共鳴吸収(NMR)は第1図、第2
図並びに第5図にそれぞれ示すとおりである。
本物質の抗腫瘍活性: 上記粉末を、乳酸酸性の5チブドウ糖液に0.25〜7
mlになるように溶解して滅菌した溶液を、本物質の抗
腫瘍活性の項に記載した手順に従って、ICR−JCL
、6週令のマウスに移植したSarcoma180固型
腫瘍に対し1 rng/に9/日の割合で10日間投与
したところ該腫瘍の増殖抑制率は98.3優に達した。
実施例2 本例は本物質の製剤化を例示したものである。
実施例1で得られる淡黄色の粉末を50 rnMの乳酸
15%ブドウ糖液に0.02W/V%になるように溶解
後、この溶液のpHを炭酸水累ナトリウムにより6,0
に調整した。次いで、該溶液をアンプルに元テンし、1
20℃で15分間滅閘処理して注射用液剤とした。
なお、このようにして調製した注射用液剤を、本物質の
抗腫瘍活性の項に記載した手順に従って、マウスEhr
βich腹水型腫瘍に対する活性を検定したところ0.
025m1の腹腔内投与で延命率> 200 %を示し
た。
因みに、マウスに対する本物質の薬効に鑑み、ヒトに対
しては本液剤の5m1(1〜/回)投与量によ勺十分な
治癒が得られるものと考える◎
【図面の簡単な説明】
第1図は、本発明に係る蛋白多糖体の紫外部吸収スペク
トルを、第2図は該多糖体の赤外部吸収スペクトルを、
第3図並びに第4図を該多糖体の糖組成の分析図をそれ
ぞれ示したものであり、第5図は」二記多糖体のプロト
ンNMRのチャートを示したものである。 $川ノ〜+IlΔ2ノ雪印寞業株式会社代1\弁理士宮
 1)広 豊 手UCネ市正書 特許庁長官若杉和夫殿 1、事()1の表示  昭和57年持重願第20058
5号2、発明の名称  蛋白多糖体 3、袖+TE′?!:する者 事(/Iとの関係 特許出願人 名 称 (669)雪印乳業株式会社 4、代理人 住 所 東京都港区東新橋2丁目7番7号 新橋国際し
ル明細書中発明の詳細な説明の欄を下記のとおりン市正
する。 (])第8頁第8行の「褐変して分解する。」の後に下
記文を加入する。 [なお、本物質におりる中性糖とアミノ糖との結合状態
、糖質部分と蛋白質部分の結合状態およびわ、+1質部
分の構成糖の構造は、本物質を下記に示ず丁−順に従っ
てそれぞれ部分酸加水分解、アルカリ分解、過沃素酸酸
化、オリゴ糖の分析および酵素う′3h’+i Lで調
べた結果によると下記のとおりと111一定される。 1)部分酸加水分解 本物質中の中性糖とアミノ糖が結合した状態で存在する
かもしくは混在しているかを調べるために、本物質1(
lomgをIN llCl 40m1 に懸濁し、10
0°Cて4時間反応さ一已た後、反応物を中和して濃縮
し)こものをゲルllす過りロマトグラフィーにイ(J
してiqられ)こパターンがら、r11性糖とアミノオ
ア1は結合しているものと推定される。 ii)アルカリ分IW (イ)本物%T]!1.FImgを0.1N N301
14ml に1!!mし、25’cT:I(1時間反応
さ・已たのち中和し)こものをケル濾過クロマトクラフ
ィーにイス1して(qられたパターン、 (ロ)本物%
T]0.8mgをIN Na011 / 0.5MNa
l311.の]、5ml に懸濁し、100℃で4局間
反応さ−lだのも中和したものをケル濾過り1」マ]・
クラフィーにイマ]シて得られたパターン、お、1: 
o・(ハ)本物7(10mgを1%Na2CIII+/
 0.5MN;+1ll14の1.5+nl に1ヒ濁
し、100℃で4時間反応さ−1たのち中和したものを
ケル濾過クロマl−グーy−/イにイ(jして得られた
パターンから、本物質におりる蛋白質部分と糖質部分は
窒素を介してN−クルコシ1−結合しているものと1l
f1.定される。 山)過沃素酸酸化 1−記i)の部分酸加水分解により得られた高分子画分
(以下P△IIと称する)が、中性糖および蛋白を実質
的に含まない故にアミノ糖の構造間tl’+に適−Jる
との観点から、I)Δl(およびそのアセチル化したも
の(以下PA II NACと称する)について、それ
ぞれ過沃素酢酸化を試のた結果、本物質のアミノ糖部分
はカラクトサミンの1,4結合体で構成されていること
が111.定される。 iv)オリゴ糖の分析 本物質を3N IIc+を用いてHIO’(lで4時間
分解してiji、られろ3糖類(GalN)qの11−
アセチル化合物(f:a l N八(: )A I、、
:ついてメチル分析、酵素分解並びにN )+ 11う
′3机を71つだ結果、本物質のオリゴ糖は1とし′ζ
α(]、?! )結合から成っていると推定される。 V)riV素分解 −に記jv)で得られた3糖類(G、IINAC)9並
びに」二記iii )で用いたPΔ)l N A cに
、α−N−アセチルガラクトサミニタ−セ(α−N−a
cety1galact。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)主としてガラクトザミンから成るアミノ糖と、グ
    ルコース、マンノースおよびガラクトースから成る中性
    糖とから成る糖質部分と。 グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン。 スレオニン、セリン、フロリン+!+)シン。 7ラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン。 スレオニン、フェニルアラニン、リジン、システィンお
    よびメチオニンのアミノ酸組成を有する蛋白質部分とか
    ら構成されていて、下記の元素分析値を示し。 C:42〜47% H:5〜8チ Nニア〜10% ゲルろ過法による測定で5,000乃至1,000,0
    00の分子量を示し、フェノール硫酸反応、アンスロン
    反応、モーリッシュ反応、ビューレット反応およびニン
    ヒドリン反応でそれぞれ陽性の呈色反応を示し、エルソ
    ンーモーガン反応、カルバゾール硫酸反応およびトルイ
    ジンブルー〇染色でそれぞれ陰性の呈色反応を示し、比
    旋光度[a): =+ 252°(50mM酢酸溶液中
    で)を示し、且つ第1図に示すとおシの紫外線吸収スペ
    クトル、第2図に示すとおりの赤外線吸収スペクトルお
    よび第5図に示すとおシのプロトン核磁気共鳴吸収スペ
    クトルを示すことを特徴とする蛋白多糖体1、
  2. (2)アミノ糖、中性糖および蛋白部分の組成割合が7
    0〜80:5〜10:5〜10である特許請求の範囲第
    1項記載の蛋白多糖体。
JP57200585A 1982-11-16 1982-11-16 蛋白多糖体 Granted JPS5993092A (ja)

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