KR900003303B1 - 스트레팍스 및 이를 생성하는 균주 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

스트레팍스 및 이를 생성하는 균주

제 1 도는 스트레팍스 중에 함유된 아미노산의 분석 크로마토그램.

제 2 도는 스트레팍스의 적외선 흡수 스펙트럼.

제 3 도는 스트레팍스의 NMR 스펙트럼.

제 4 도는 스트레팍스가 동물 백혈구에 미치는 영향.

본 발명은 면역 증강제, 더 상세히는 단백 다당체를 유효성분으로 하는 면역증강 효과, 특히 항 암효과가 있는 면역증강제 및 이를 생산하는 균주에 관한 것이다. 비스테로이드성 제제가 부작용이 적기때문에 각종암, 특히 재발된 암에 대한 치료제로 널리 사용되고 있다.

일찌기 19세기에 용혈성 스트렙토코카스에 감염된 암환자에게서 암이 자연히 치유되는 현상이 발견되었다. [L loyd J.old : Scientific American 236(5) 62-79('79)] 또한 20세기에 들어서 용혈성 스트렙토코카스에 항암효과가 있음을 발견하고 Coley 독소, OK-432, CFE, 60-F 등과 같은 용혈성 스트렙토코카스 제품을 동물 실험 및 임상실험에 사용하였다. [Y.Sakurai S. Tsukagoshi, Cancer Chemother Rep.59 : 9('72) : Shoin. S 등, Gann 71, 220-225('80) : Kurata. Y 등, Gann 52, 121-125('61) : Hattori. T 등, Gann 67,105-110('76) : Okamoto. H 등, Jap. J.Microbiol,11 : 323('167)].

본 발명자는 면역효과가 있는 물질을 발견하고자 예의 연구 검토한 결과 α-용혈성 스트렙토코카스 속에 속하는 균주를 배양하여 생산된 단백 다당체를 분리, 정제하여 이를 시험해 본 결과 우수한 항 종양 및 항암효파가 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다. 즉, 본 발명은 단백 다당체(이하 "스트레팍스"라 칭한다)를 유효성분으로 하는 면역 증강제에 관한 것이다.

본 발명의 단백 다당체는 α-용혈성 스트렙토코카스 속에 속하는 균주로부터 배양, 생산된 물질로부터 분리된 물질을 의미한다.

본 발명의 균주는 α-용혈성외 스트렙토코카스 속에 속하는 균주를 의미하며, 이를 특별히 한정하는 것은 아니나, 가장 바람직한 균주로서는 스티렙토코카스 패시움 G-1001의 명칭으로서 1987년 10월 19일에 한국 종균협회에 기탁 번호 KFCC-l0447로 기탁되어 있다.

상기 KFCC 10447의 기원은 저습한 지대 즉, 성남시의 화훼단지인 비닐하우스에서 종사하는 100명의 건강한 나자의 구강내에서 채취, 분리한 75종의 α-용혈성 스트렙토코카스 중에서 스트레팍스의 생산량이 가장 많고, 독성이 작은 균주이며, 다른 균주와의 차이점은 소독면을 사용하여 건강한 사람의 구강내 인후부로 부터 수집하여 35℃, 18∼24시간, 혈청 배지에서 배양하면 녹색의 용혈군이 생기고, 현미경으로 확실히 확인한 후 단일군락을 분리한다. 용혈상태를 재확인하기 위하여 냉장고에 하루 보관한 후, 균 배양시간이 18∼24시간이 된 시험관 안에 일정량의 양 또는 토기 혈구를 넣고 35℃, 24시간 발육하며 용혈 현상을 관찰한다. 스트레팍스 생산성이 높고, 독성이 없는 균주를 찾기 위하여 분리한 75종의 α-용혈성 스트렙토코카스를 각각 배양하여 스트레팍스 생산능력을 실험하고, 독성을 실험하여 본원발명의 균주를 찾아내었다.

[스트레팍스 생산 능력시험(RING TEST 시험방법)]

가. 마이크로 튜브에 균주 배양액을 2배씩 희석하여 각각 20㎕씩 넣는다.

나. 항스트레팍스 면역혈청을 경계면이 형성되도록 천천히 조심스럽게 20㎕씩 가하고

다. 실온에서 경계면에서의 침강반응을 관찰하여 침강반응이 일어나는 최대 희석배수를 역가(TITER)로 측정한다.(편의상 75종의 α-용혈성 스트렙토코카스는 1부터 75의 번호로 쓴다.)

실험결과

[표 1]

[토끼 피부 발적 반응 비교 실험]

링 테스트 시험 결과 유효 역가 이상의 균주만을 골라 토끼 피부 발적반응 비교시험을 실시하였다. 건강한 토끼의 털을 깎아낸 피부에, 각 균주 배양액의 세균을 여과한 시료를 0.2ml씩 피내주사하고, 4일간 피부 반응을 관찰하였다.

실험결과

[표 2]

++ : 주사부위발적 1cm이상

+ : 주사부위발적 0.5~1cm

± : 주사부위발적0.5cm이하

-: 무반응

상기 시험 결과 45번 균주가 스트레팍스 생산량이 가장 많고, 독성이 거의 없는 것으로 나타났으며, 이 균주로서 본원발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 스트레팍스를 생성하는 균주의 분류학적 특성은 다음과 같다.

1. 형태 : 그램염색(광학현미경) : 그램 양성구균

2. 평판배지에서의 발육성장

혈액 아가(Blood agar)……α-용혈현상

맥콘케이 아가(MacConkey Agar)……성장없음

T.C.B.S.아가……작은 원형의 황색 군락

3. 생리적 특성(+ : 양성, -: 음성)

옥시다제 - 글루코오즈 +

카탈라제 - 락토오즈 +

슈크로오즈 +

6.5% NaCl + 만니톨 +

10% 담즙 + 살리신 +

40% 담즙 + 소르비톨 -

고유운동성 - 라피 노오즈 +

시트르산염 - 아라비 노오즈 +

알기닌 가수분해 +

[OF 시험(Hugh-Leifson 배지) : 변화없음]

상기 분류학적 특성에 따라 상기 균주는 둥근 가장자리, 황색군락, 그램양성, 직경 0.5-1.0μm, 편모가 없고, 운동을 안하며, 포자를 형성하지 않고, 표면이 단단한 것외 분류학적 특성에 비교해 볼때 본 균주는 스트렙토코카스 그룹 D패시움(Streptococcus group D faecium)으로 판정된다.

본 발명에서 스트렙토코카스 속에 속하는 스트레팍스 생산 미생물중 상기 균주는 일예이며 스트렙토코카스 속에 속하고, 본 스트레팍스를 생산할 수 있는 균주는 사용될 수 있다. 스트렙토코카스 속에 속하는 스트레팍스 생산 미생물은 통상의 배지에서 배양될 수 있다. 배양은 액체배지 또는 고체배지 중에서 수행될수 있다.

배지의 영양원은 배양에서의 통상의 배지가 사용될 수 있다. 탄소원의 예로서는 글루코오즈, 슈크로오즈, 락토오즈, 발토오즈, 텍스트로오즈, 전분, 당밀과 같은 동화 탄소화합물을 들 수 있다.

질소원으로서는 대두분발, 펩톤, 육즙, 효모엑기스, 면실분말, 콘스팁액 등과 같은 동화질소원을 들 수있다. 마그네슘, 칼륨, 나트륨, 인산 및 이들의 염도 사용될 수 있다.

스트렙토코카스 패시움 G-1001의 배양 온도는 스트레팍스 생산을 위해 선택될 수 있으며 30-60℃, 바람직하기로는 35-45℃이다. 배양시간은 배양 조건에 따라 다르나 일반적으로 50-90 시간이다. 스트레팍스 최대생산에서 자연적으로 종료된다. 스트레팍스는 다음과 같이 제조된다. 즉 α-용혈성 스트렙토코카스 속에 속하는 균주를 통상의 배지에서 배양 한 후 배양이 완료된 배양액을 실활시키고 에탄올을 첨가 처리하여 첨전물을 회수한다. 이 첨전물을 증류수에 용해하여 균체 및 단백질등의 불용성 물질을 원심분리하여 제거한 다음, 상징액에 다시 에탄올을 첨가하여 단백 다당체를 침진시킨다.

이와같은 에탄올 처리 공정을 3∼5회 반복하여 첨전물을 회수한 다음, 침전물을 진공 감압건조하여 목적하는 스트레팍스를 얻는다.

이와같이 얻어진 스트레팍스의 특성은 다음과 같다.

(1) 분자량 : 약 71,700±500[25±0.1℃에서 이미 알려진 분자량 20000, 4 0000, 70000의 대조품을 측정하여 절대점도 값을 얻고 Mark-Howrink 방정식을 근거로 점도계의 정수를 구하여 스트레팍스의 절대점도가 23.175로 산출되어 평균분자량이 약 71.700±500으로 측정되었다]

(2) 스트레팍스의 안정 pH

pH 3.0-6.2(최적 pH 5.0)

(3) 성상 및 용해도 : 담황색 분말로서 물에 용이하게 녹으며, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 에테르 등에는 용해되지 않는다.

(4) 다당체 함량분석 : ( i ) 다당체 함량 및 구성당류의 분석 : 다당류 함량은 만노오즈를 대조로 하여 페놀-황산법에 의하여 시험하였다. 만노오즈 시료에 대하여 80% 폐놀시약과 농 황산으로 발색반응 시킨 다음, 자외선 스펙트로포토메터를 이용하여 485nm에서 흡광도를 측정한 후 검량곡선을 작성 하였다.

만노오즈를 표준으로 하여 작성한 검량곡선을 사용하여 시료중 다당체의 함량을 계산한 결과 하기 표 1과같다.

[표 1]. 단백 결합 다당체의 다당체 함량

스트레팍스 중의 단백질함량(750nm에서 로리-폴린 반응 후) : 90.8±1.2%

(5) 단백질 함량 및 아미노산 분석 : (i) 단백질 함량의 분석 : 단백질 함량은 소혈청 알부민을 대조로하여 로리-폴린(Lowry-Folin) 반응을 실시하였다. 알부민과 시료에 대하여 로리-폴린 반응을 시킨 후 자외선 스펙트로포토메터를 이용하여 750nm에서 흡광도를 측정한 다음 알부민을 표준으로 하여 검량곡선을 작성하여 시료중의 단백질 함량을 계산하였다.

그 결과를 아래 표 2에 나타냈다.

[표 2]. 단백결합 다당체의 단백질 함량

스트레팍스 중의 단백질 함량(750nm에서 로리-폴린 반응 후) : 9.2±1.2%

(ii) 아미노산 분석

구성아미노산은 시료를 가수분해 시킨후, Waters PICO-TAG 시스템으로 분석하였다. 시료 50㎕를 취하여 분해 튜브에 옮긴다음 65m Torr까지 건조시킨다. 반응기에 1%(w/v) 페놀-6N-HCl 200㎕를 넣고 질소를 충전한 다음 페닐이소오시아네이트(PITC)용액^*20㎕를 가하여 진탕시켜 20분간 실온에 방치한 다음 65m Torr까지 진공 건조시킨후 5% 아세토니트릴(부피비) 인산 완충액(pH 7.4) 300㎕에 녹여 Waters PICO-TAG 아미노산 분석법에 의하여 분석하였다. 분석 조건은 아래와 같다.

컬럼 : C(PICO-TAG 컬럼 4.6×150nm)

용매 : A(인산나트롬/트리에틸아민, pH 6.4)

B(60% 아세토니트릴 수용액)

감작파장 : 254nm

유속 : 1.0-1.5m1/분

온도 : 37℃

챠트속도 : 1cm/분

동일조건으로 표준 아미노산(0.125μ mole/ml)을 분석하여 크로마토그램을 얻고 각각의 응답인자(response factor)을 계산하여 그것에 준하여 각 아미노산의 구성비를 산출 하였다.

* PITC 용액

에탄올 : H₂O : 트리에틸아민 : PITC=7 : 1 : 1 : 1(부피비)

[표 3] 단백결합 다당체중의 아미노산 함량(총 단백함량에 대한%)

·Amn : 암모니아

스트레팍스중에 함유된 아미노산의 분석은 제 1 도에 나타냈다.

(6) 스트레팍스의 적외선 스펙트럼 분석

첨부도면 제 2 도에 나타냈다. 3450cm^-1에서 넓고 강한 OH 흡수 피크가 나타나고, 1150-1000cm^-1에서 흡수피크(OH의 C-O-C 사슬로 판단됨)을 나타내는데, 이는 탄수화물의 특징이며, 810cm^-1의 흡수피크는 스트레팍스중에 만노오즈가 존재함을 나타낸다.

(7) 스트레팍스의 NMR 스펙트럼 측정 첨부도면 제 3 도에 나타냈다.

이하 실시예로서 본 발명을 상세히 설명한다.

[실시예1]

1) 종균 계대

동결건조된 스트렙토코카스 패시움 G-1001을 하기 조성의 혈액 평판 배지에 계대하여 37℃에서 24시간 배양한 후, 다른 육즙배지에 계대하여 37℃에서 20시간 배양한 것을 주된 종균으로 사용한다.

효모 엑기스 0.3%

쇠고기 엑기스 0.5%

NaCl 0.5%

덱스트로오즈 0.5%

펩톤 0.6%

아가 1.5%

증류수 적량

2) 배양

i) 배지 I

효모 엑기스 0.3%

쇠고기 엑기스 0.5%

덱스토로오즈 0.5%

펩톤 0.6%

증류수 적량

ii) 배양 II

콩즙^*0.3%

쇠고기 엑기스 0.5%

NaC1 0.5%

덱스트로오즈 0.5%

펩톤 0.6%

증류수 적량

콩즙^*: 콩 500g에 증류수 1.5리터를 넣고 4-8℃의 냉실에서 4-5일 방치 하여 용출되어 나온 콩즙만을 사용한다.

이 물질과 타단백은 여과하여 제거한다.

iii) 배지 III(Heart Infusion Brots)

소심장 15g

트립토오즈 0.25g

NaCl 0.125g

증류수 1

상기 각 생산용 배지에 상기 종균 5ml를 37±0.5℃의 항온실에서 60시간 배양한 후, 링 테스트(ring test)를 실시하여 역가가 32배 이상 반응이 나온것에 한하여 정제한다.

3) 정제

배양이 완료된 배양액 1를 80℃에서 30분간 실활시키고 95% 에탄올 3로 처리하여 첨전물을 회수한다. 이 침전물을 증류수 10ml에 용해하고, 균체 및 단백질 등의 불용분은 8000rpm에서 1시간 동안 원심분리하여 제거한다. 상징액에 다시 95% 에탄올 100ml을 가해 단백 다당체를 침전시킨다. 이러한 에탄올 처리 조작을 3회 반복하여 침전물을 모은 다음 진공감압 건조하여 아래 표 4와 같이 얻었다.

[표 4]

4) 확인

상기에서 얻어진 분말을 확인한 결과 전술한 스트레팍스와 같다.

시험예 1(스트레팍스의 항 암효과 시험)

1) 시험동물 : ICR-마우스(중량 : 20g)

2) 셀라인(cell line) : 사르코마-180(Sarcoma-180)

3) 시험기간 : 15일

4) 약물투여량 : 마리당 1일 스트레팍스 2mg씨 7일간 복강내 투여

5) 시험방법

암세포인 사르코마-180 2.0×10⁶세포/마우스로 2마리의 마우스의 복강내에 주사하고 7일후 복수액을 체취하여 세포수를 2.0×10⁷세포/ml로 희석(사르코마-180 현탁액)한 다음, 20마리의 마우스의 겨드랑이에 사르코마-180 현탁액을 0.1ml씩 주사하고, 10마리씩 2개의 군으로 나누었다. 24시간 후부터 매 24시간 마다 7회에 걸쳐 1군에는 시료를 다른 군에는 대조물질인 생리식염수를 투여하였다. 시료 및 대조물질을 24시간 고형암을 적출하여 각각 무게를 칭량 하였다. 각 군당 데이타에 대해 USP XXI 〈Ⅲ〉 DESIGN ＆ ANALYSIS OF BIOLOGICAL ASSAYS 방법에 따라 통계처리하여 각 군당 평균종양 무게를 산출하였다. 함 암작용의 치료로서 종양의 저지 백분율(inhibition ratio)을 다음 식에 의해 구하여 표 5에 나타냈다.

식중, Cw=대조물질 투여 군의 평균 종양 무게, Tw=시료 투여 군의 평균 종양 무게

[표 5]. 사르코마-180을 이식한 마우스에 대한 스트레팍스의 효과

시험예 2.(스트레팍스가 동물 백혈구에 미치는 영향) 1.6-2.3kg의 건강한 토끼를 5마리씩 2개군으로 나누어 1군은 스트레팍스 10mg/kg 근육주사하고, 2군(대조군)은 생리 식염수를 l0mg/kg 근육주사하였다. 주사후 2,4,8,24,48 시간에 토끼 귀정맥에서 채혈하여 백혈구 수를 측정하였다. 그 결과를 첨부도면 제 4 도에 나타냈다. 스트레팍스 투여군에서는 4-24시간에서 백혈구의 수가 모두 주사전과 비교하여 증가하였으며, 특히 4시간 때에는 현저히 상승함을 알 수 있다.

시험예 3.(스트레팍스가 망상 내피계통의 식균작용에 미치는 영향) 스트레팍스는 항암 시험에서 40-50%의 억암율을 나타내고 동물 백혈구 수를 현저히 증가시킬 수 있다. 또한 스트레팍스는 비교적 강한 항원성을 갖고 있어 신체의 면역 기능을 개선, 강화할 수 있으며, 독성도 매우 낮다. 망상 내피계통의 식균기능이 신체의 면역 반응중 중요한 작용을 일으키고 있기 때문에 망상 내피 계통의 식균 기능을 향상시키는 것은 면역 치료의 중요한 역할을 한다.

실험 1) 투여량이 망상 내피계통의 식균기능에 미치는 영향 20-24g의 횐쥐를 7마리씩 5개군으로 나누고, 대조군에는 생리식염수를 투여하고, 나머지는 스트레팍스 50, 25, 12.5mg/kg을 1일씩 5일간 매일 1회 투여한 후, 마지막 투여 다음날, 흰쥐의 망상 내피계통의 식균지수 K를 측정하고 증강지수를 계산한 후 식균계수 α를 측정한다. 이 결과를 표 6에 나타냈다.

식중, W는 동물의 체중, W/S는 간과 비장의 중량의 합이다.

[표 6]

실험 2) 투여회수가 망상내피계통의 식균기능에 미치는 영향

20-24g의 흰쥐를 8마리씩 4개군으로 나누고 대조군은 생리식염수 100g/kg나머지는 스트레팍스 100mg/kg씩 5회, 3회, l회 투여한 후, 마지막 투여 다음날 각군 실험동물의 망상 내피계통의 식균지수 K를 측정하고, 증강지수를 계산한 후 간과 비장을 꺼내 합계 중량을 칭량하여 식균계수 α를 산출한다.

이 결과를 아래 표 7에 나타냈다.

[표 7]

상기 실험결과에서 나타난 바와같이, 스트레팍스가 망상내피계통의 식균능력에 양호한 활성화 작용을 할수 있고, 투여량과 투여회수의 증가에 따라 증가됨을 알 수 있다.

망상내피계통이 활성화되었다는 것은 특이성 또는 비특이성 종양 면역작용을 한다는 것을 의미하므로 본 스트레팍스는 효과적인 면역증강제이다.

Claims (5)

1. 다음과 같은 물리화학적 특성을 갖는 스트레팍스 :

   (1) 평균 분자량 : 약 71,700±500

   (2) 성상 및 용해도 : 담황색 분말로서 물에 용이하게 녹으며, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 에테르 등에는 불용

   (3) 다당체 함량 : 당함량(%) : 90.8±1.2(페놀-황산법에 의함 : 표준물질 : 만노오즈), 단백질 함량(%) : 9.2±1.2(로우리-폴린법에 의함 : 표준물질 : 소혈청 알부민)

   (4) 안정 pH : pH 3.0-6.2(최적 pH 5.0)

   (5) 아미노산 및 아미노산의 조성 : 아미노산 분석기로 분석한 결과, 구성 아미노산이 17종 이었으며, 주로 아스파르트산, 글루타민산, 세린, 글리신 및 트레오닌이 존재함을 알았음

   (6) 적외선 흡수 스펙트럼에서 특색적인 흡수밴드 : 3450cm^-1, 1150-1000cm^-1, 810cm^-1(KBr)

   (7) NMR(^lH) 스펙트럼 : 제 3 도와 같음.
2. 유효성분으로서 스트레팍스로 이루어진 면역증강제.
3. 제 2 항에 있어서, 면역증강제가 악성종양, 양성종양, 암에 효과적임을 특징으로 하는 면역증강제.
4. 스트레팍스를 생성하는 후술의 세균학적 특성을 나타냄을 특징으로 하는 스트렙토코카스 :

   1) 그램균주 : 양성

   2) 평판 배지에서의 성장 : i) 혈액 아가......α-용혈현상, ii) 맥콘케이 아가…　…성장 없음, iii) T.C.B.S.아가……작은 원형의 황색군락

   3) 생리적 특성(+ : 양성, -: 음성)

   옥시다제 -

   카탈라제 -

   6.5% NaCl +

   10% 담즙 +

   40% 담즙 +

   고유운동성 -

   시트르산염 -

   알기닌 가수분해 +

   글루코오즈 +

   락토오즈 +

   슈크로오즈 +

   만니톨 +

   살리신 +

   소르비톨 -

   라피노오즈 +

   아라비노오즈 +

   OF 시험 변화없음
5. 제 4 항에 있어서, 스트렙토코카스 균주가 스티렙토코카스 패시움 G-1001(한국 종균협회 기탁번호 KFCC-10447)인 것이 특징인 균주.

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