KR0183443B1 - 연쇄상 구균으로부터 항종양 및 면역증가 활성성분의 제조방법 - Google Patents

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Description

연쇄상 구균으로부터 항종양 및 면역증가 활성성분의 제조방법

본 발명은 연쇄상구균으로부터 항종양 및 면역증가 활성성분의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 연쇄상구균 속의 그룹 B에 속하는 스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae) 균으로부터 유도된 배양균체 분쇄물을 효소 처리하여서 제조되는 수득물로서 항종양 및 면역증가활성을 갖는 신규한 물질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

연쇄상구균 속의 그룹 B 혹은 스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae)는 신생아 패혈증의 원인 균으로 잘 알려져 있다.

한편, 이러한 용혈성 연쇄구균의 생균체가 항종양효과를 가지고 있는 것은 잘 알려져 있고 생균체에서 안정화된 항종양활성을 갖는 성분을 추출하는 방법도 많이 연구가 되어서 페니실린, 페사로스포린 C, 시클로세린 등의 항생물질을 함유한 염용액 속에 생균체를 현탁하고 적당한 안정화제를 첨가하여 동결건조하는 방법(일본특공 소 43-6690, 소 45-8871, 소 46-2035, 소 46-2675)이 실용화되어 각종 암종에 사용되어져 왔다.

그 외에 항종양 성분을 추출하는 방법으로는 균체를 파쇄해서 얻어진 상청획분에 유기용매를 가하여 침전물로 얻는법(일본특공 소 38-1647), 50-80%의 포화유안 획분을 얻는 방법(일본특공 소 48-43841) 등이 보고되었다.

그러나, 위와같은 항종양 성분의 제조방법 중에서도 스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae)에서 항종양물질을 얻는 방법은 거의 연구되어 있지 않다.

따라서, 본 발명자들은 환자의 병소에서 분리한 세균중 베타용혈성 연쇄구균을 이용하여 다각적 연구 검토한 결과, 연쇄상구균 속에 속하는 특정균을 배양하고 이를 배양액으로부터 얻은 약독화 균체는 숙주가 매개된 항종양 작용 또는 면역증진 작용이 있음을 밝혀내므로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 종래 항암제로 활발히 개발된 바 없는 연쇄상구균 속의 스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae)균을 배양한 배양물을 파쇄하여서 생기는 파쇄물을 효소처리하므로써 우수한 항종양 및 면역증진효과를 갖는 활성성분을 제공하는데 그 목적이 있다.

제1도는 본 발명에서 사용된 연쇄상구균인 스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae) HS-026(KCTC 0281BP)에 대한 자외선 흡수스펙트럼을 나타낸 것이고, 제2도는 본 발명에서 사용된 연쇄상구균인 스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae) HS-026(KCTC 0281BP)에 대한 적외선 흡수스펙트럼을 나타낸 것이다.

본 발명은 스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae) HS-026(KCTC 0281BP) 균으로부터 유도된 배양 파쇄물에서 수불용 물질을 분취하고 효소로 처리하여서 연쇄상 구균으로부터 항종양 및 면역증가 활성성분을 제조하는 것을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 활성물질을 유효성분으로 함유하는 항종양제와 면역증진제를 포함한다.

이하, 본발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서 이용되는 세균은 연쇄상구균 속에 속하는 세균으로서, 환자의 병소에서 분리한 베타용혈성 연쇄구균인 바, 이러한 신균주인 스트렙토코커스 아갈락티아 (Streptococcus agalactiae) HS-026 는 1996년 10월 10일자로 국제기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소내 유전자원센타에 기탁하고 기탁번호 KCTC 0281BP를 부여 받았다.

본 발명에 따른 신균주인 상기 스트렙토코커스 아갈락티아 (Streptococcus agalactiae) HS-026 (KCTC 0281BP)는 이하에서 HS-026으로 표기한다.

본 발명에서 새롭게 분리한 HS-026의 세균학적 특성은 다음과 같다.

(I) 형태

1. 세포의 형태 : 구균(Ovoid)

2. 세포의다형성 : 없음

3. 운동성 : 없음

4. 포자 : 없음

5. 그람염색 : 양성

6. 산저항성 : 음성

(II) 배양배지에서의 증식 상태

1. 브레인 하트 아가(Brain heart agar)

3일 배양시 크기 : 1-2 mm

융기 : 반구형

표면 : 평평함

가장자리 : 깨끗함

색깔 : 유백색

투명성 : 불투명

형액한천 배양시 알파용혈 생성

(III) 생리학적 특성

카탈라제 : 음성

산소에 대한 작용 : 호기성

증식범위 및 온도 : 산도 4.0-8.0, 온도, 온도 20-40℃, 산생성 : +

본 발명에 따른 상기와 같은 HS-026은 그람염색하여 양성임을 확인하고 광학 현미경으로 관찰하여 연쇄상임을 관찰한 후에 CAMP test 시행하여 양성으로 나오고 스트렙탁스라는 상품화된 항연쇄상구균 다가항체를 이용하여 분리균과 응집반응을 시행했을 때 양성으로 나타나므로 연쇄상구균 속의 아갈락티아에 속하고, 실제 환자에서 분리된 균주이므로 근원이 다르고 그외 생화학적 성상검사 및 혈청학적 검사로부터 종래와는 다른 신균주임을 알 수 있다.

이러한 본발명에 따른 신균주 HS-026은 높은 수득율을 얻기 위해 BHI 배지, 28 ℃의 조건으로 배양하고 그 배양액으로부터 분리한 배양물을 초음파파쇄기를 사용하여 파쇄하고 그 현탁액을 저속으로 원심해서 분리하고 얻어진 침전액을 생리식염액, 적당한 염류용액, 또는 증류수로 씻는다. 이어서 적당한 완충액에 현탁하고 데옥시리보뉴클레아제 및 리보뉴클레오아제를 처리한 뒤 단백질 분해효소, 예를 들면 프로나제 트립신, 펩신, 나가제 등으로 처리한 후 증류수로 씻어서 건조하여 항종양 물질을 얻는다. 핵산 분해효소 및 단백 분해효소의 처리조건은 각각의 효소가 최적의 효능을 발휘하는 조건을 사용한다. 예를들면 트리스-염산 완충액 등에 현탁해서 pH를 조절하고 37℃ 전후의 온도로서 수시간 또는 수십시간 처리를 한다.

본 발명에서 얻어진 항종양성 및 면역증가 활성성분(HS-026, 이하 HS-026로 표기함)의 물리 화학적 성질은 물에 불용의 회백색 분말이며 원소분석 결과는 C:48.5%, N:13.0%, H:7.31% 였다. 자외선 흡수스펙트럼과 적외선 흡수스펙트럼(KBr)은 각각 제1도 및 제2도에 나타냈다. 화학조성은 기본스법으로 측정한 람노오스 함량이 31.1%이고 엘슨몰간법으로 측정한 헥소사민은 13.3% 로쿠라의 방법으로 측정한 단백질의 함량는 15.7% 이었다. 또한, 올시놀 방법에 의한 RNA와 인돌 반응으로 측정한 DNA의 함량은 모두 0%였다. 이와같이, 본 발명에서 얻어진 물질 HS-026은 열에 안정하며 현탁액의 상태로 장기보존이 가능하지만 동결건조도 가능하다.

본 발명에 따른 항종양성 물질은 실험관내 실험(in vitro) 및 생체실험(in vivo)에서 탁월한 항암효과를 나타내는 바, 그 항암효과를 측정하기 위해 생체실험으로 마우스에 P388 백혈병 세포, 3LL 폐암 세포 등을 이식하고 마우스의 종양치유효과 및 연명효과를 관찰한 결과 제3도에서 확인되는 바와 같이 매우 탁월한 항종양 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다.

또한, 지금까지 개발된 대부분의 항암제는 암세포는 물론 정상세포까지도 손상을 입히기 때문에 사용상에 있어서 제한을 받아왔다. 그러나, 놀랍게도 본 발명의 항종양물질 HS-261은 직접적인 세포독성은 매우 낮으며 자연셀 세포의 증진을 나타내므로 종래의 항암제에서 나타나는 문제점을 극복할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 항종양물질은 실시예 2, 3, 4로부터 면역증진 효과도 있는 것임을 알수 있으며, 항종양제와 마찬가지 방법으로 면역증진제로 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 항종양물질은 통상의 담체인 생리식염수 및 증류수와 함께 주사제 방식으로 인체에 투여할 수 있으며, 그 투여 량은 연령, 치료효과, 투여방법, 투여기간에 따라 다르나 1 - 100㎎/㎖의 투여 범위로 1일 1 - 2회의 범위에서 투여하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명의 실시예 및 실험예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

환자의 병소 및 임산부의 자궁경관 등에서 멸균된 면봉을 이용하여 병소를 긁어 면양적혈구가 포함된 혈액한천배지를 이용하거나 Todd-hit배지 등을 이용하여 균을 선별하여 스트렙토코커스 아갈락티아 (Streptococcus agalactiae) HS-026(KCTC 0281BP)를 분리한다.

10리터 들이 병발효기에 증류수 리터당 37g의 BHI(Brain Heart Infusion) 배지(Calf Brains, infusion from 200g : Beef Heart Infusion from 250g : 박토 덱스트로스 2g : 박토 프로테오스 펩톤 10g : 소디움 클로라이드 10g : 디소디움 포스페이트 2.5g)을 함유하는 5리터의 배양배지를 넣는다.

배지를 120℃에서 30분 멸균한다. 배지를 냉각한후 상기에서 분리한 HS-026균주(KCTC 0281BP)를 접종한 후 28℃에서 30시간 배양한다.

배양액을 빙냉하고 원심에(10,000rpm, 3분) 의해서 집균한 균체를 냉생리식염액으로 2회 세척 후 배양한후 균액을 원심분리하여 제거한후 동결건조하여 균체를 얻는다. 얻어진 균체중 1g을 취하여 50㎖의 탈이온 증류수에 녹이고 이 용액을 0℃에서 3분 45초간 초음파 분해시킨다(vcx600, 13㎜ tip). 이때 45초간 초음파 분해시킨 후 45초간 쉬는 것을 반복한다. 이렇게 준비된 용액을 4℃에서 원심분리(30,000g, 15분)한다. 얻어진 침전을 완충액(0.05M-Tris-HCl, 1m㏖ MgCl₂, 0.02㏖ 디티오트레이톨, pH7.0)에 현탁하고 RNase A (5 kunitz units/㎖)과 DNase 1 (50 kunitz units/㎖)을 첨가하여 37℃에서 3시간동안 인큐베이션한다.

다시 원심분리하여 분획을 취한 뒤 상기의 완충액에 10㎎/㎖의 농도로 희석한 뒤 60℃에서 2시간동안 가열하고 프로나제(프로테아제 타입 XIV, 시그마제품)를 100㎍/㎖)의 농도로 가한 뒤 60℃에서 1시간 인큐베이션한다. 마지막으로 원심분리(48,000g, 15분)한 뒤 탈이온 증류수로 4번 세척후 동결건조하여 HS-026물질을 140㎎ 얻는다.

[실시예 2]

[자연셀(natural killer cell) 세포 활성에 미치는 영향]

마우스는 6-7주령의 BALB/C를 사용하였다.

시험군과 대조군 모두 50㎍/㎖를 부유하여 마우스 복강내로 각각 200㎕씩 주사하였고 대조군은 생리식염수를 동량 주사하였다.

마우스로부터 림프구의 분리는 시료를 투여하고 2일, 4일째 마우스를 희생시켜 비장으로부터 분리하였고 분리된 림프구는 10% 우태아 혈청이 함유된 RPMI 1640 배지 (2mM/㎖ L-글루타민, 100unit/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토 마이신 10mM HEPES)에 3 × 10⁶세포/㎖로 부유하였다. 자연살표적 세포는 Yacl 암세포주를 이용하였다. 표적세포는 10μCi Na₂CrO₄가 함유된 0.2㎖ 배지에 1 × 10⁶세포주로 부유하여 37℃에서 1시간 15분간 표식화 시켰다. 주효세포와 표적세포를 각각 배지에 1 × 10⁶및 1 × 10⁵세포/㎖로 부유하고 이 부유액들을 96-well round bottommed plate에 넣어 37℃에서 4시간 배양한다. 배양후 각 well에서 상층액을 취해 감마 계수기로 radioactivity를 측정하고 수학식 1을 이용하여 활성을 계산한다.

그 결과는 표 1에 요약하였다.

이 표에서 알 수 있듯이 HS-261은 매우 높은 자연살 세포활성을 가지고 있다.

[실시예 3]

[P388 종양에 대한 항암 효과]

생체내 항암활성을 측정하는 모델로서 BDF1(7주령의 암컷, 1군 5마리)마우스에 P388 백혈병 세포를 1 × 10⁶개 이식하고 이식 24시간 후부터 HS-026물질, 양성대조로서 피시바닐(Picibanil)을 연일 9일간 1일 1회 복강 투여하여 생존율을 조사하였으며 대조군으로서는 생리식염액 투여군을 사용하였다. 그 결과는 표 2에 나타내었다.

상기 표 2의 결과를 보면 피시바닐 투여군(20㎍/㎖)에 비하여 HS-261 투여군이 매우 높은 생존율을 보였다.

[실시예 4]

[3LL 종양에 대한 항암효과]

마우스 폐암세포주인 3LL세포를 BDF1(7주령의 암컷, 1군 5마리)마우스당 1 × 10⁶개를 복강에 이식한 24시간 후부터 HS-261물질, 양성대조로서 피시바닐을 연일 5일간 1일 1회 정맥투여하여 생존율을 조사하였으며 대조군으로서는 생리식염액투여군을 썼다. HS-261물질을 최대 20㎍/day 용량으로 투여하여 다음 표 3과 같은 결과를 얻었다.

이 결과에서 보면 HS-261 투여군은 20㎍/day 용량에서 수명연장율이 154% 범위를 보였으며, 피시바닐 투여군(20㎍/day)의 147%에 비하여 우수한 생존율을 보였다.

[실시예 5]

3LL과 P388 암세포에 대한 HS-026 및 피시바닐의 세포독성능을 측정한 바 다음 표 4와 같았다. MTT 방법을 이용하여 직접 세포독성을 측정한 바, HS-026은 IC₅₀가 50㎍/㎖ 이상(P388) 및 100㎍/㎖ 이상 (3LL)으로 피시바닐에 비하여 20내지 50배 이상의 직접 세포독성이 적음을 확인할 수 있었다.

[실시예 6]

마우스(BDF1계, 암컷, 6주령)에 대한 LD₅₀가(정맥내 투여시) 2700㎍/㎖ 이상이었다. 또한 인위적으로 동물을 부검하여 주요장기(심장, 폐, 간, 신장, 비장)등을 검색한바 적어도 육안적인 소견에서 출혈 및 폐색 및 울혈 등의 이상 소견을 찾을 수 없었다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 항종양성 물질은 실험관내 실험(in vitro) 및 생체실험(in vivo)에서 탁월한 항암효과를 나타내며, 특히 기존 항암제와 병용시켰을 때 대단한 상승효과를 나타내는 등 종래보다 독성은 낮으면서도 항종양효과가 우수한 것이므로 향후 항암제로 널리 유용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (5)

1. 스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae) HS-026(KCTC 0281BP) 균으로부터 유도된 배양 파쇄물에서 수불용 물질을 분취하고 효소로 처리하여서 제조함을 특징으로 하는 연쇄상 구균으로부터 항종양 및 면역증가 활성성분의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 효소처리는 단백분해효소, 데옥시리보뉴클레아제 및 리보뉴클레아제 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 효소로 인큐베이션하는 것을 특징으로 하는 연쇄상 구균으로부터 항종양 및 면역증가 활성성분의 제조방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 단백분해효소는 프로나제, 트립신, 펩신 또는 나가제인 것을 특징으로 하는 연쇄상 구균으로부터 항종양 및 면역증가 활성성분의 제조방법.
4. 청구범위 제1항에 따라 제조된 활성성분을 유효성분으로 함유하는 항종양제.
5. 청구범위 제1항에 따라 제조된 활성성분을 유효성분으로 함유하는 면역증진제.