JPS61112023A - がん細胞傷害活性物質の新規製法 - Google Patents
がん細胞傷害活性物質の新規製法Info
- Publication number
- JPS61112023A JPS61112023A JP59233857A JP23385784A JPS61112023A JP S61112023 A JPS61112023 A JP S61112023A JP 59233857 A JP59233857 A JP 59233857A JP 23385784 A JP23385784 A JP 23385784A JP S61112023 A JPS61112023 A JP S61112023A
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- JP
- Japan
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- glucomannan
- substance
- water
- soluble peptide
- cells
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明はがん細胞傷害活性物質の新規製法に関する。
近年、がん治療の分野においてヒトや動物のがん細胞、
リンパ芽球、マクロファージなどの産生ずるがん細胞傷
害活性物質（例えばＴＮＦ ）が注目されている。
リンパ芽球、マクロファージなどの産生ずるがん細胞傷
害活性物質（例えばＴＮＦ ）が注目されている。
従来、かかるがん細胞傷害活性物質の製法としては例え
ば哺乳動物に網内系賦活物質を投与し。
ば哺乳動物に網内系賦活物質を投与し。
次いでダラム陰性菌由来のエンドトキシンを注射するか
もしくは該哺乳動物由来の活性化マクロファージを含む
組織培養系にエンドトキシンを加えることによってがん
細胞傷害活性物質を生成させる方法（特開昭５７−１４
０７２５号）、或いは哺乳動物又は哺乳動物由来の単球
系細胞又はその癌化細胞にダラム陰性菌由来のエンドト
キシンのみを作用させてがん細胞傷害活性物質を生成さ
せる方法（特開昭５９−８２３１５号）が知られている
。
もしくは該哺乳動物由来の活性化マクロファージを含む
組織培養系にエンドトキシンを加えることによってがん
細胞傷害活性物質を生成させる方法（特開昭５７−１４
０７２５号）、或いは哺乳動物又は哺乳動物由来の単球
系細胞又はその癌化細胞にダラム陰性菌由来のエンドト
キシンのみを作用させてがん細胞傷害活性物質を生成さ
せる方法（特開昭５９−８２３１５号）が知られている
。
′〔発明が解決しようとする問題点〕
しかしながらこれらの方法によるときはエンドトキシン
の使用が不可欠となるが、得られたがん細胞傷害活性物
質からエンドトキシンを完全に除去することは極めて困
難であるという問題がある。即ち実際に患者にがん細胞
傷害活性物質を投与するに際してエンドトキシンが僅か
でも残存すれば患者に発熱が生じ１時としてショック死
などの重篤な結果も生じる恐れがある。そのためがん細
胞傷害活性物質の製造にあたっては極めて高度の精製が
必要となり技術的、経済的に大きな負担が避けられない
。
の使用が不可欠となるが、得られたがん細胞傷害活性物
質からエンドトキシンを完全に除去することは極めて困
難であるという問題がある。即ち実際に患者にがん細胞
傷害活性物質を投与するに際してエンドトキシンが僅か
でも残存すれば患者に発熱が生じ１時としてショック死
などの重篤な結果も生じる恐れがある。そのためがん細
胞傷害活性物質の製造にあたっては極めて高度の精製が
必要となり技術的、経済的に大きな負担が避けられない
。
かかる状況に鑑み本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、
従来用いられていたエンドトキシンに代えて微生物由来
の水溶性ペプチドグル°コマンナンを用いることにより
極めて安全性の高いがん細胞傷害活性物質を製すること
に成功し本発明を完成するに至った。
従来用いられていたエンドトキシンに代えて微生物由来
の水溶性ペプチドグル°コマンナンを用いることにより
極めて安全性の高いがん細胞傷害活性物質を製すること
に成功し本発明を完成するに至った。
即ち１本発明は哺乳動物に又は哺乳動物由来の単球系細
胞に微生物由来の水溶性ペプチドグルコマンナンを作用
させるか、或いは網内系賦活物質を作用させた後微生物
由来の水Ｉ容性ペプチドグルコマンナンを作用させるこ
とによりがん細胞傷害活性物質を生成させることを特徴
とするがん細胞傷害活性物質の製法である。
胞に微生物由来の水溶性ペプチドグルコマンナンを作用
させるか、或いは網内系賦活物質を作用させた後微生物
由来の水Ｉ容性ペプチドグルコマンナンを作用させるこ
とによりがん細胞傷害活性物質を生成させることを特徴
とするがん細胞傷害活性物質の製法である。
本発明において用い得る哺乳動物としてはマウス、ラッ
ト、ウサギ。ハムスター、モルモット。
ト、ウサギ。ハムスター、モルモット。
ネコ、イヌ、サル、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマなどがあげ
られ、とりわけマウス、ウサギが好ましい。又哺乳動物
由来の単球系細胞としては例えば前記哺乳動物の腹腔、
肺胞、 Ｋｕｐｐｆｆｅｒ細胞、ミクロダリア細胞など
の各組織に定着、常在もしくは浸出してくるマクロファ
ージがあげられ、更にはヒトの骨髄細胞、肝臓、膿胸な
どに存在するマクロファージであってもよく、又マクロ
ファージに分 ”化誘導せしめることのできる細胞（
例えば、骨髄性白血病細胞、その他のマクロファージの
前駆細胞）であっても分化誘導物質で処理することによ
り用い得るものとなる。これらのうち好ましいものとし
ては例えばウサギ肺胞マクロファージ、マウス腹腔浸出
マクロファージ、ＪＴ７４．１株（Ｊ。
られ、とりわけマウス、ウサギが好ましい。又哺乳動物
由来の単球系細胞としては例えば前記哺乳動物の腹腔、
肺胞、 Ｋｕｐｐｆｆｅｒ細胞、ミクロダリア細胞など
の各組織に定着、常在もしくは浸出してくるマクロファ
ージがあげられ、更にはヒトの骨髄細胞、肝臓、膿胸な
どに存在するマクロファージであってもよく、又マクロ
ファージに分 ”化誘導せしめることのできる細胞（
例えば、骨髄性白血病細胞、その他のマクロファージの
前駆細胞）であっても分化誘導物質で処理することによ
り用い得るものとなる。これらのうち好ましいものとし
ては例えばウサギ肺胞マクロファージ、マウス腹腔浸出
マクロファージ、ＪＴ７４．１株（Ｊ。
Ｉｍｍｕｒｓｏｌ、 １１４．８９８ （１９７５））
、 Ｕ−９３７株〔Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１４３ １
５２８（１９７６））、ＨＬ−６０株（Ｎａｔｕｒｅ、
、 ２７０．３４７． （１９７７））、 Ｊ−１１１
株（Ｂｌｏｏｄ、 １０．１０１０（１９５５））、
ＣＣＲＦ−８Ｂ株（Ｃａｎｃｅｒ、 Ｒｅｓ、、 ２７
．２４７９（１９６７））などがあげられる。
、 Ｕ−９３７株〔Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１４３ １
５２８（１９７６））、ＨＬ−６０株（Ｎａｔｕｒｅ、
、 ２７０．３４７． （１９７７））、 Ｊ−１１１
株（Ｂｌｏｏｄ、 １０．１０１０（１９５５））、
ＣＣＲＦ−８Ｂ株（Ｃａｎｃｅｒ、 Ｒｅｓ、、 ２７
．２４７９（１９６７））などがあげられる。
網内系賦活物質としては例えばダラム陽性菌。
原生動物などの菌体もしくはその処理物があげられ、具
体的には例えばトキソプラズマ、マラリア原虫、プロピ
オバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉ−ｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ａｃｍｅｓ ）などの生菌体又はその菌体処
理物（例えば菌体を熱処理、ホルマリン処理もしくは凍
結乾燥処理したものの他、菌体抽出物、菌体磨砕物など
）があげられる。更には酵母由来の水不溶性ペプチドグ
ルコマンナンであるザイモサ７ （Ｚｙｍｏｓａｎ ）
、 Ｂ、 Ｃ，Ｇ、コンコナバリンＡやその他のいわゆ
るＭＡＦ （マクロファージ・アクティベイティング・
ファクター）と称される一群の物質などを用いることが
でき、本発明においてはこれらの網内系賦活物質の１種
又は２種以上を好適に用いることができる。
体的には例えばトキソプラズマ、マラリア原虫、プロピ
オバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉ−ｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ ａｃｍｅｓ ）などの生菌体又はその菌体処
理物（例えば菌体を熱処理、ホルマリン処理もしくは凍
結乾燥処理したものの他、菌体抽出物、菌体磨砕物など
）があげられる。更には酵母由来の水不溶性ペプチドグ
ルコマンナンであるザイモサ７ （Ｚｙｍｏｓａｎ ）
、 Ｂ、 Ｃ，Ｇ、コンコナバリンＡやその他のいわゆ
るＭＡＦ （マクロファージ・アクティベイティング・
ファクター）と称される一群の物質などを用いることが
でき、本発明においてはこれらの網内系賦活物質の１種
又は２種以上を好適に用いることができる。
微生物由来の水溶性ペプチドグルコマンナンとしては例
えばサツカロマイセス属に属する微生物から得られる水
溶性ペプチドグルコマンナンが好適に用いられ、とりわ
けサツカロマイセス属に属するビール酵母から特公昭５
４−７８７８号記載の方法により得られるＳＰＧＭ−Ｉ
が好ましい。
えばサツカロマイセス属に属する微生物から得られる水
溶性ペプチドグルコマンナンが好適に用いられ、とりわ
けサツカロマイセス属に属するビール酵母から特公昭５
４−７８７８号記載の方法により得られるＳＰＧＭ−Ｉ
が好ましい。
８ＰＧＭ−１は前記公報に記載されている通りマンノー
ス、クルコースヲ構成糖とするグルコマンナン５８．５
％（マンノース８３〜８７％、グルコース１３〜１７写
、グルコサミン１％）とペプチド（２８％）とが結合し
たペプチドポリサブカライドであり、更に脂質（４％）
とリン（１％）とが結合している水溶性ペプチドグルコ
マンナンである。
ス、クルコースヲ構成糖とするグルコマンナン５８．５
％（マンノース８３〜８７％、グルコース１３〜１７写
、グルコサミン１％）とペプチド（２８％）とが結合し
たペプチドポリサブカライドであり、更に脂質（４％）
とリン（１％）とが結合している水溶性ペプチドグルコ
マンナンである。
これらを用いてがん細胞傷害活性物質を製するに際し１
例えば哺乳動物を対象に実施する場合には哺乳動物に網
内系賦活物質をその静脈内、皮下もしくは腹腔内に投与
し１乃至２週間後に水溶性ペプチドグルコマンナンを静
脈内、皮下もしくは腹腔内に投与するか、或いは哺乳動
物の腹腔内。
例えば哺乳動物を対象に実施する場合には哺乳動物に網
内系賦活物質をその静脈内、皮下もしくは腹腔内に投与
し１乃至２週間後に水溶性ペプチドグルコマンナンを静
脈内、皮下もしくは腹腔内に投与するか、或いは哺乳動
物の腹腔内。
皮下もしくは静脈内に水溶性ペプチドグルコマンナンを
直接投与することにより行なうことができる。投与量は
哺乳動物によっても若干異なるが網内系賦活物質が約０
．１〜１００ ｍｙ／ｋｆ、とりわけ約１〜５０■／ｋ
ｆ、水溶性ペプチドグルコマンナンが約０．０５〜５０
巧／ｋｆ、とりわけ約２００〜４０００μり／吟である
のが好ましい。更により具体的にその１例を示すならば
哺乳動物が例えばマウスあるいはウサギの場合にはプロ
ピオバクテリウム・アクネスが約１〜１０ｍ１／ｋｇ、
ＳＰＧＭ−Ｉが約２００〜２０００μＰ／ｋｆをあげる
ことができる。
直接投与することにより行なうことができる。投与量は
哺乳動物によっても若干異なるが網内系賦活物質が約０
．１〜１００ ｍｙ／ｋｆ、とりわけ約１〜５０■／ｋ
ｆ、水溶性ペプチドグルコマンナンが約０．０５〜５０
巧／ｋｆ、とりわけ約２００〜４０００μり／吟である
のが好ましい。更により具体的にその１例を示すならば
哺乳動物が例えばマウスあるいはウサギの場合にはプロ
ピオバクテリウム・アクネスが約１〜１０ｍ１／ｋｇ、
ＳＰＧＭ−Ｉが約２００〜２０００μＰ／ｋｆをあげる
ことができる。
又、哺乳動物由来の単球系細胞を用いてがん細胞傷害活
性物質を製する場合には単球系細胞を水溶性ペプチドグ
ルコマンナンの存在下に培養するか、或いは網内系賦活
物質の存在下に培養したのち水溶性ペプチドグルコマン
ナンを加えて更に培養することにより行なうことができ
る。培養は動物細胞の培養に際して通常採用される培地
を用いて行なうことができる。かかる培地としては例え
ばＰＲＭＩ−１６４０（Ｊ、人減ん１９９．５１９（１
９６７）、 Ｊ、 Ｎａｔ、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ５ｔ、
、 ３６．４０５ （１９６６））、イーグル最少培地
（５ｃｉｅｎｃｅ、 １２３．８４５（１９５６））、
ダルベツコ最少培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。
性物質を製する場合には単球系細胞を水溶性ペプチドグ
ルコマンナンの存在下に培養するか、或いは網内系賦活
物質の存在下に培養したのち水溶性ペプチドグルコマン
ナンを加えて更に培養することにより行なうことができ
る。培養は動物細胞の培養に際して通常採用される培地
を用いて行なうことができる。かかる培地としては例え
ばＰＲＭＩ−１６４０（Ｊ、人減ん１９９．５１９（１
９６７）、 Ｊ、 Ｎａｔ、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎ５ｔ、
、 ３６．４０５ （１９６６））、イーグル最少培地
（５ｃｉｅｎｃｅ、 １２３．８４５（１９５６））、
ダルベツコ最少培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。
８．３９６（１９５９）、１２．１８５（１９６０））
ハムズＦ−１：ｌ’Ｋ （Ｐ、Ｎ、Ａ、８．且２８８（
１９６５））等の培地を用いることができ、これらの培
地中には細胞の増殖因子源として牛胎児血清を含有させ
て用いるのが好ましい。
ハムズＦ−１：ｌ’Ｋ （Ｐ、Ｎ、Ａ、８．且２８８（
１９６５））等の培地を用いることができ、これらの培
地中には細胞の増殖因子源として牛胎児血清を含有させ
て用いるのが好ましい。
培地中の網内系賦活物質及び水溶性ペプチドグルコマン
ナンの培地中の濃度はそれぞれ約１す〜１０００μり／
−９約１〜１０００μＰ／ｄであればよく、とりわけ約
１〜５００μり／−９約１０〜ＳＯＯ今／−であるのが
好ましい。
ナンの培地中の濃度はそれぞれ約１す〜１０００μり／
−９約１〜１０００μＰ／ｄであればよく、とりわけ約
１〜５００μり／−９約１０〜ＳＯＯ今／−であるのが
好ましい。
培養は動物細胞の培養に際して採用される常法■
によって実施すればよく９例えば約３０〜４０°Ｃ１と
りわけ約３７６Ｃ前後で好気的に９例えば５％炭酸ガス
−９５％空気中で培養することによって行なうことがで
きる。
りわけ約３７６Ｃ前後で好気的に９例えば５％炭酸ガス
−９５％空気中で培養することによって行なうことがで
きる。
培養時間は水溶性ペプチドグルコマンナンのみを用いて
培養する場合には約１〜４８時間、とりわけ約３〜２４
時間であればよく、又、網内系賦活物質と水溶性ペプチ
ドグルコマンナンを用いて培養する場合には網内系賦活
物質存在下において上記条件下で約１〜６時間培養した
のち、水溶性ペプチドグルコマンナンを加えて約３〜２
４時間培養することによってがん細胞傷害活性物質を製
することができる。
培養する場合には約１〜４８時間、とりわけ約３〜２４
時間であればよく、又、網内系賦活物質と水溶性ペプチ
ドグルコマンナンを用いて培養する場合には網内系賦活
物質存在下において上記条件下で約１〜６時間培養した
のち、水溶性ペプチドグルコマンナンを加えて約３〜２
４時間培養することによってがん細胞傷害活性物質を製
することができる。
かくして得られるがん細胞傷害活性物質を含む哺乳動物
の体液、血清又は培養液から該活性物質を単離するには
該培養液から遠心分離等によって細胞を除去し得られる
溶液を、メンプランろ過、硫安分画、透析、カラムク０
７トグラフイー （ＤＢＡＥ−８ｅｐｈａ−ｃｅｌクロ
フトグラフィー等）、ゲルろ過、イオン交換樹脂処理、
アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動、高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのこの技術分野に
おける公知方法を単独で又は組合わせて精製処理するこ
とにより実施することができる。
の体液、血清又は培養液から該活性物質を単離するには
該培養液から遠心分離等によって細胞を除去し得られる
溶液を、メンプランろ過、硫安分画、透析、カラムク０
７トグラフイー （ＤＢＡＥ−８ｅｐｈａ−ｃｅｌクロ
フトグラフィー等）、ゲルろ過、イオン交換樹脂処理、
アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動、高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのこの技術分野に
おける公知方法を単独で又は組合わせて精製処理するこ
とにより実施することができる。
かくして得られるがん細胞傷害活性物質は従来法の如く
エンドトキシンを用いないのでエンドトキシンががん細
胞傷害活性物質中に残存することがなく安全性の高いが
ん細胞傷害活性物質が得られるという利点がある。
エンドトキシンを用いないのでエンドトキシンががん細
胞傷害活性物質中に残存することがなく安全性の高いが
ん細胞傷害活性物質が得られるという利点がある。
実験例１
がん細胞に対する傷害作用
実施例１で得たがん細胞傷害活性物質の傷害作用をｉｎ
ｖｉｔｒｏでマウス由来線維芽細胞Ｌ−９２９株。
ｖｉｔｒｏでマウス由来線維芽細胞Ｌ−９２９株。
マウス由来肝がん細胞ＭＨ−１３４株、マウス由来肉腫
細胞ＭｅｔｈＡ株、マウス由来白血病細胞Ｌ−１２１０
株。
細胞ＭｅｔｈＡ株、マウス由来白血病細胞Ｌ−１２１０
株。
マウス由来骨髄腫細胞Ｓ Ｐ−２１０−ｋＶ １４株、
ラット由来肝がん細胞ＡＨ−１３０株、ヒト子宮頚がん
細胞Ｈｅ１ａ株、ヒ）４咽腔がん細胞ＫＢ株、ヒトトラ
ンスフォームド羊膜細胞ＡＭ、株、ヒト肺がん細胞Ａ−
５４９株、ヒト肝由来細胞（：ｈａｎｇ １ｉｖｅｒ株
、ヒト胎児肺由来細胞ＭＲ，Ｃ−５株を用い文献（Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ 、、 １ユ互、１２７９ （１９８
１））記載の方法に準じて検討した。即ち９６穴プレー
トに各がん細胞（２，５×１０′″個）を移植し、２４
時間培養後、がん細胞傷害活性物質及びアクチノマイシ
ンＤ（１μＳ’／Ｍｔ）を添加し３７°Ｃ０２４時間培
養する。この培養液中へ０．００３にニュートラルレッ
ド溶液を添加し、さらに１時間培養を続ける。培養後、
培養液を除き、細胞を新しい培地で洗浄し、５０％エタ
ノール−０，１Ｍ第二リン酸水素ナトリウム溶液を加え
る。生細胞が取り込んだニュートラルレッドが溶出され
るので、これを比色定＠（５４０ｎｍ）することにより
実施した。
ラット由来肝がん細胞ＡＨ−１３０株、ヒト子宮頚がん
細胞Ｈｅ１ａ株、ヒ）４咽腔がん細胞ＫＢ株、ヒトトラ
ンスフォームド羊膜細胞ＡＭ、株、ヒト肺がん細胞Ａ−
５４９株、ヒト肝由来細胞（：ｈａｎｇ １ｉｖｅｒ株
、ヒト胎児肺由来細胞ＭＲ，Ｃ−５株を用い文献（Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ 、、 １ユ互、１２７９ （１９８
１））記載の方法に準じて検討した。即ち９６穴プレー
トに各がん細胞（２，５×１０′″個）を移植し、２４
時間培養後、がん細胞傷害活性物質及びアクチノマイシ
ンＤ（１μＳ’／Ｍｔ）を添加し３７°Ｃ０２４時間培
養する。この培養液中へ０．００３にニュートラルレッ
ド溶液を添加し、さらに１時間培養を続ける。培養後、
培養液を除き、細胞を新しい培地で洗浄し、５０％エタ
ノール−０，１Ｍ第二リン酸水素ナトリウム溶液を加え
る。生細胞が取り込んだニュートラルレッドが溶出され
るので、これを比色定＠（５４０ｎｍ）することにより
実施した。
結果は下記表に示す通りである。
表
注１：細胞傷害活性は下記により求めた。
（但し、Ｏ，Ｄ、＝吸光度）
注２；１単位はマウス由来線維芽細胞Ｌ−９２９（２，
５Ｘ １０’個）を用いて前記と同様の測定法で測定し
た場合該細胞（こ対し。
５Ｘ １０’個）を用いて前記と同様の測定法で測定し
た場合該細胞（こ対し。
５０イ細胞傷害活性を示すのに必要ながん細胞傷害活性
物質の電を表わす（以下 □、同）。
物質の電を表わす（以下 □、同）。
実験例２
実施例４および５で得たかん細胞傷害活性物質のがん細
胞に対する壊死活性をマウス由来肉腫Ｍｅｔｈ Ａを用
い１文献〔プロシーディンゲス、オブ、ザ、ナシコナル
ア力デミイ オブ、サイエンス、Ｕ８ｋ ７２．（９
）、３６６６（１９７５）〕記載の方法に準じて検討し
た。即ち、ＢＡＬＢｌＣ系雌性マウスの腋下部にＭｅｔ
ｈＡを２Ｘ１０”側皮下投与し、１週間後にがん細胞傷
害活性物質をｉ、 ｖ、投与する。２４時間後に次の判
定基準に従って壊死活性を判定したところ腫瘍壊死活性
は（＋）であった。
胞に対する壊死活性をマウス由来肉腫Ｍｅｔｈ Ａを用
い１文献〔プロシーディンゲス、オブ、ザ、ナシコナル
ア力デミイ オブ、サイエンス、Ｕ８ｋ ７２．（９
）、３６６６（１９７５）〕記載の方法に準じて検討し
た。即ち、ＢＡＬＢｌＣ系雌性マウスの腋下部にＭｅｔ
ｈＡを２Ｘ１０”側皮下投与し、１週間後にがん細胞傷
害活性物質をｉ、 ｖ、投与する。２４時間後に次の判
定基準に従って壊死活性を判定したところ腫瘍壊死活性
は（＋）であった。
く判定基準〉
（−）： 変化なし
く＋）： かすかな出血性壊死
（廿）： 中程度の出血性壊死（移植がん表面が中心か
ら５０に以上にわたって壊死） （＋Ｉ＋） ：顕著な出血性壊死（移植がんの中央部が
重度に壊死し１周囲のがん組織がわ ずかに残った状態） 実施例ｌ ＣＨ３／Ｈｅマウスの腹腔にチオグリコレートブロスを
体重１０２当り１ゴ投与する。、４日後に腹腔より細胞
を採取しエステラーゼ染色を行ないエステラーゼ染色陽
性細胞を２ Ｘ １０’個ずつ９６六マイクロプレート
（ファルコン社製）にまき５％ＣＯ２−９５％空気中、
３７°Ｃで１時間培養する。ついで各ウェル中の培養液
を血清を含まない培地（イーグル最小培地）で３回洗浄
して浮遊細胞を除去する。ついで各ウヱルにマウス膿胸
細胞よりフンカナバリアＡを用いて調製（Ｊ、 Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ、。
ら５０に以上にわたって壊死） （＋Ｉ＋） ：顕著な出血性壊死（移植がんの中央部が
重度に壊死し１周囲のがん組織がわ ずかに残った状態） 実施例ｌ ＣＨ３／Ｈｅマウスの腹腔にチオグリコレートブロスを
体重１０２当り１ゴ投与する。、４日後に腹腔より細胞
を採取しエステラーゼ染色を行ないエステラーゼ染色陽
性細胞を２ Ｘ １０’個ずつ９６六マイクロプレート
（ファルコン社製）にまき５％ＣＯ２−９５％空気中、
３７°Ｃで１時間培養する。ついで各ウェル中の培養液
を血清を含まない培地（イーグル最小培地）で３回洗浄
して浮遊細胞を除去する。ついで各ウヱルにマウス膿胸
細胞よりフンカナバリアＡを用いて調製（Ｊ、 Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ、。
５４．３７１ （１９８２））したマクロファージアク
ティベイティングファクターを１００１Ｌｅ／−加えた
後、５にＣＯ，−９５％空気中、３７℃で４時間培養す
る。培養後各ウェル中の培養液を血清を含まない培地（
イーグル最小培地）で２回洗浄した後。
ティベイティングファクターを１００１Ｌｅ／−加えた
後、５にＣＯ，−９５％空気中、３７℃で４時間培養す
る。培養後各ウェル中の培養液を血清を含まない培地（
イーグル最小培地）で２回洗浄した後。
同培地を２００に加えて８Ｐ（）Ｍ−Ｉが１００μ７／
ｒｎｔになるように添加し、 ５ ！’ｎＣＯ，−９５
％空気中で更に４時間培養する。かくして培養液１ ｍ
ｌ中にがん細胞傷害活性物質９０００単位を含有する培
従液１−を得た。
ｒｎｔになるように添加し、 ５ ！’ｎＣＯ，−９５
％空気中で更に４時間培養する。かくして培養液１ ｍ
ｌ中にがん細胞傷害活性物質９０００単位を含有する培
従液１−を得た。
培往液中のかん細胞傷害活性物質の分子量を５ｈｉｎ
ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ −１５０を用いＨＰＬＣにより求
めたところ分子量は約６００００であり、又がん細胞傷
害活性物質は５６℃、３０分間の熱処理に対して安定で
あった。
ｐａｃｋ Ｄｉｏｌ −１５０を用いＨＰＬＣにより求
めたところ分子量は約６００００であり、又がん細胞傷
害活性物質は５６℃、３０分間の熱処理に対して安定で
あった。
実施例２
マウス由来マクロファージ培養株Ｊ ７７ ｔ １の２
Ｘ １０’個を９６穴マイクロプレートの各ウェルに
まく。５％Ｃｏ、 −９５％空気中、 ３７℃で１時間
培養した後、上清を吸引除去する。ついで血清を含まな
い培地（ハムズＦ−１２Ｋ）を２００４加え、ＳＰＧＭ
−Ｉを１００μｙ／艷になるよう添加し、更に５にＣＯ
，−９５％空気中、３７℃で４時間培養することにより
がん細胞傷害物質を３６０００単位／−を含む培養液１
−得た。
Ｘ １０’個を９６穴マイクロプレートの各ウェルに
まく。５％Ｃｏ、 −９５％空気中、 ３７℃で１時間
培養した後、上清を吸引除去する。ついで血清を含まな
い培地（ハムズＦ−１２Ｋ）を２００４加え、ＳＰＧＭ
−Ｉを１００μｙ／艷になるよう添加し、更に５にＣＯ
，−９５％空気中、３７℃で４時間培養することにより
がん細胞傷害物質を３６０００単位／−を含む培養液１
−得た。
得られた培養液中のかん細胞傷害活性物質の分子量をリ
ン酸緩衝生理食塩水で緩衝化した３ｅｐｈａ−ｃｒｙ１
８−２００カラム（２，３Ｘ ９０ ｃｍ ）を用いて
求めたところ分子量は約４５０００であった。
ン酸緩衝生理食塩水で緩衝化した３ｅｐｈａ−ｃｒｙ１
８−２００カラム（２，３Ｘ ９０ ｃｍ ）を用いて
求めたところ分子量は約４５０００であった。
実施例３
？ ’７ ス（ｄｄＹ／ｓｌｃ ）にプロピオバクテリ
ウム・アクネス菌体（加熱、ホルマリン処理後凍結乾燥
したもの）を生理食塩水にけん濁してその１ｆｆｉＰを
腹腔内投与する。投与後９日目にＳＰＧＭ−Ｉを１０１
１ｙ静脈投与し２時間後に採血し血清を分離した。この
血清中にはがん細胞傷害活性物質１９００００単位／−
が含まれていた。
ウム・アクネス菌体（加熱、ホルマリン処理後凍結乾燥
したもの）を生理食塩水にけん濁してその１ｆｆｉＰを
腹腔内投与する。投与後９日目にＳＰＧＭ−Ｉを１０１
１ｙ静脈投与し２時間後に採血し血清を分離した。この
血清中にはがん細胞傷害活性物質１９００００単位／−
が含まれていた。
実施例４
マウス（Ｃ３Ｈ／Ｈｅ）の腹腔菩こチオグリコレートブ
ロスを体重１０ｙ当り１−投与する。４日後に腹腔より
細胞を採取しエステラーゼ染色を行ないエステラーゼ染
色陽性細胞を２×１０″個ずつ９６穴マイクロプレート
（ファルコン社製）にまき５％Ｃｏ、 −９５％空気中
、３７℃で１時間培養する。ついで各ウェル中の培養液
を血清を含まない培地（イーグル最少培地）で３回洗浄
して浮遊細胞を除去する。次に各ウェルに血清を含まな
い培地（イーグル最少培地）を２００４ずつ加えＳＰＧ
。
ロスを体重１０ｙ当り１−投与する。４日後に腹腔より
細胞を採取しエステラーゼ染色を行ないエステラーゼ染
色陽性細胞を２×１０″個ずつ９６穴マイクロプレート
（ファルコン社製）にまき５％Ｃｏ、 −９５％空気中
、３７℃で１時間培養する。ついで各ウェル中の培養液
を血清を含まない培地（イーグル最少培地）で３回洗浄
して浮遊細胞を除去する。次に各ウェルに血清を含まな
い培地（イーグル最少培地）を２００４ずつ加えＳＰＧ
。
Ｍ−Ｉを１００μｙ／艷になるよう添加し、更に５％Ｃ
ｏ、 −９５％空気中、３７℃で８時間培養を行なうこ
とにより１−中がん細胞傷害活性物質を４０単位含む培
養液１−を得た。
ｏ、 −９５％空気中、３７℃で８時間培養を行なうこ
とにより１−中がん細胞傷害活性物質を４０単位含む培
養液１−を得た。
実施例５
ウサギ（ＫＢＬ−ＪＷ）を開胸しリン酸緩衝生理食塩水
で肺胞洗浄細胞を採取する。得られた細胞をリン酸緩衝
生理食塩水で洗浄後、該細胞を血清１０％を含む培地（
イーグル最少培地）に２×１０１個／−となるようけん
濁しシャーレにまく。
で肺胞洗浄細胞を採取する。得られた細胞をリン酸緩衝
生理食塩水で洗浄後、該細胞を血清１０％を含む培地（
イーグル最少培地）に２×１０１個／−となるようけん
濁しシャーレにまく。
これにＳＰＧＭ−Ｉを１０μ７／−となるように添加し
、５％Ｃｏ、−９５％空気中、３７℃で３時間培養を行
ない１−中にがん細胞傷害活性物質３６０００単位を含
む培養上清を得た。
、５％Ｃｏ、−９５％空気中、３７℃で３時間培養を行
ない１−中にがん細胞傷害活性物質３６０００単位を含
む培養上清を得た。
得られたかん細胞傷害活性物質は５６℃、３０分間の熱
処理に安定であり、その分子量をＳｈ：ｎＰａｃｋ Ｄ
ｉｏｌ−１５０カラムを用いるＨＰＬＣで求めたところ
約３９０００であった。
処理に安定であり、その分子量をＳｈ：ｎＰａｃｋ Ｄ
ｉｏｌ−１５０カラムを用いるＨＰＬＣで求めたところ
約３９０００であった。
実施例６
ヒト前骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０の３×１０゜個を２
４穴マイクロプレートの各ウェルにまき。
４穴マイクロプレートの各ウェルにまき。
各ウェルに１２−０−テトラデカノイルホルボール−１
３−アセテート（ＴＰＡ）を１６０ ｆｆ Ｍ含有した
ＲＰＭ−１６４０培地１−を添加し５％Ｃへ一９５％空
気中、３７℃で２０時間培養する。培養液にプロピオバ
クテリウム・アクネス菌体（加熱、ホルマリン処理後、
凍結乾燥したもの）２５０μ２を添加し４時間培養する
。ついでこれにＳＰＧＭ−１１００μ２を添加し３時間
培養することにより培養液１−中にがん細胞傷害活性物
質１８００単位を含む培養液１−を得た。
３−アセテート（ＴＰＡ）を１６０ ｆｆ Ｍ含有した
ＲＰＭ−１６４０培地１−を添加し５％Ｃへ一９５％空
気中、３７℃で２０時間培養する。培養液にプロピオバ
クテリウム・アクネス菌体（加熱、ホルマリン処理後、
凍結乾燥したもの）２５０μ２を添加し４時間培養する
。ついでこれにＳＰＧＭ−１１００μ２を添加し３時間
培養することにより培養液１−中にがん細胞傷害活性物
質１８００単位を含む培養液１−を得た。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）哺乳動物に又は哺乳動物由来の単球系細胞に微生物
由来の水溶性ペプチドグルコマンナンを作用させるか、
或いは網内系賦活物質を作用させた後微生物由来の水溶
性ペプチドグルコマンナンを作用させることによりがん
細胞傷害活性物質を生成させることを特徴とするがん細
胞傷害活性物質の製法。 ２）微生物由来の水溶性ペプチドグルコマンナンがサッ
カロミセス属に属するビール酵母より得られる水溶性ペ
プチドグルコマンナンである特許請求の範囲第１項記載
の方法。 ３）水溶性ペプチドグルコマンナンがＳＰＧＭ−１であ
る特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59233857A JPS61112023A (ja) | 1984-11-05 | 1984-11-05 | がん細胞傷害活性物質の新規製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59233857A JPS61112023A (ja) | 1984-11-05 | 1984-11-05 | がん細胞傷害活性物質の新規製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61112023A true JPS61112023A (ja) | 1986-05-30 |
Family
ID=16961654
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59233857A Pending JPS61112023A (ja) | 1984-11-05 | 1984-11-05 | がん細胞傷害活性物質の新規製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61112023A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5989552A (en) * | 1993-12-24 | 1999-11-23 | Austin Research Institute | Antigen carbohydrate compounds and their use in immunotherapy |
| US6548643B1 (en) | 1994-11-16 | 2003-04-15 | Austin Research Institute | Antigen carbohydrate compounds and their use in immunotherapy |
| US8021667B2 (en) | 1994-11-16 | 2011-09-20 | Macfarlane Burnet Institute For Medical Research And Public Health Ltd | Compositions for immunotherapy and uses thereof |
| US8771701B2 (en) | 1997-09-29 | 2014-07-08 | Macfarlane Burnet Institute For Medical Research And Public Health Ltd | Compositions for immunotherapy and uses thereof |
-
1984
- 1984-11-05 JP JP59233857A patent/JPS61112023A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5989552A (en) * | 1993-12-24 | 1999-11-23 | Austin Research Institute | Antigen carbohydrate compounds and their use in immunotherapy |
| US6548643B1 (en) | 1994-11-16 | 2003-04-15 | Austin Research Institute | Antigen carbohydrate compounds and their use in immunotherapy |
| US8021667B2 (en) | 1994-11-16 | 2011-09-20 | Macfarlane Burnet Institute For Medical Research And Public Health Ltd | Compositions for immunotherapy and uses thereof |
| US8771701B2 (en) | 1997-09-29 | 2014-07-08 | Macfarlane Burnet Institute For Medical Research And Public Health Ltd | Compositions for immunotherapy and uses thereof |
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