JPH06500558A - 組み換えコロニー刺激因子―1の使用 - Google Patents
組み換えコロニー刺激因子―1の使用Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
組み換えコロニー刺激因子−1の使用
本発明は、組み換え的に生産されたコロニー刺激因子−1(C3F−1)の種々
の治療的使用に関する。
マクロファージおよび/または顆粒球への骨髄の先祖細胞の成長および発育を刺
激する種々の組織の中で非常に低い濃度で生産される種々の因子の能力は、はぼ
15年間知られてきている。ある数の種からの血清、尿の試料、および組織の抽
出物の中のこのような因子の存在は、半固体の培地の中でプレートした骨髄細胞
によりコロニー形成の刺激を測定するin vitroのアッセイを使用して証
明することができる。許容されうるin vivoのアッセイは存在しない。こ
れらの因子はこのようなコロニーの形成を誘発するので、集合的にコロニー刺激
因子(C3F)と呼ばれてきている。
より最近、生ずるコロニーの中に見いだされる細胞の型に従い定義てきるヒトC
SFのタンパク質の少なくとも4つのサブクラスが存在することが示された。1
つのサブクラスのC5F−1は、主としてマクロファージを含有するコロニーを
生ずる。他のサブクラスは、好中球の顆粒球およびマクロファージの両者を含有
するコロニー(GM−C3F) ;主として好中球の顆粒球を含有するコロニー
(G−C3F) ;並びに好中球および好酸球の顆粒球、マクロファージ、およ
び他の骨髄様細胞の型(好塩基球、赤血球および巨核球)を含有する([L−3
)コロニーを生産する。
GM−C3FはGough ら、Nature (1984) 309 : 7
63−767に記載されている。このタンパク質はさらに、WO3710206
0,1987年4月9日公開に、伝統的癌の処置後に癌患者を処置して白血球を
再生し、及び免疫無防備化個体、例えば、後天性免疫欠損症候群(エイズ)を有
する個体におけるウィルス、細菌、真菌および寄生生物の感染の可能性を減少す
るために有用であると記載されている。ヒトTL−3は、Yank、 Y、 C
,ら、Ce1l (1986) 47: 3によりクローニングされた。
前述のヒトCSFに類似するネズミ因子か存在し、このような因子はすべてのこ
れらの細胞の型+巨核球、赤血球およびマスト細胞を種々の組合せでを含有する
ネズミ骨髄細胞からのコロニーを誘発する、IL−3とちょぶネズミ骨髄細胞を
包含する。ネズミIL−3は、Fung。
G−C3Fのクローニングおよび発現は米国特許第4.810.643号に記載
されており、そしてヒトの口の癌組織からのG−C3Fを精製する方法は米国特
許第4.833.127号に記載されている。
本発明は、これらのサブクラスの第1のC5F−1の構成員であるタンパク質の
組み換え生産に関する。このサブクラスは、さらに、他のサブクラスの生物学的
活性に影響を与えないで、C5F−1の活性を特別に抑制するための特定のラジ
オイムノアッセイおよびラジオレセプタにより特性決定および描写され、そして
マクロファージ細胞系J774はC3F−1に特異的に結合するレセプタを含有
する。これら表された。
一般にCSFタンパク質、とくにC3F−1を任意の有用な機能にすることがか
なり困難であることは、それらの治療的使用を実際的にするまたは可能とするた
めにさえ十分な量で、個々のなかつ特性決定可能な形態で入手可能できないこと
であった。本発明は、組み換え技術により有用な量で、精製されたヒトおよびネ
ズミのC3F−1を提供することによって、これらの困難を除去し、そしてその
種々の治療的使用を開示する。
エイズに悩む患者をC3F−1単独でまたはそえとエリスロボイエチンおよび/
または抗ウィルス剤および/またはIL−2との組み合わせで処置することは、
WO37103204,1987年6月4日公開、に報告された。米国特許第4
.482.485号、1984年11月13日発行は、ヒトの尿から単離された
CSFは癌の処置における支持的役割のために使用できることを述べている。さ
らに、欧州特許(EP)第118.915号、1984年9月19日発行は、癌
の治療を受けている患者における顆粒球血症およびマクロファージ血症の予防お
よび治療のために、感染の予防のために、そして骨髄を移植された患者の処置の
ためにC3Fを生産することを報告している。
さらに、C5F−1は非特異的殺腫瘍活性を刺激すると報告された生物活性のた
めの、マクロファージの活性化において直ちの直接の役割をもたないと報告した
。Ra1phら、Ce1l Immunol、 (1987) 105 :27
0−279は、ネズミ肉腫T[J5標的へのC3F−1単独の遅延した殺腫瘍作
用およびC5F−1とリンフ才力インとの組み合わせの付加された殺腫瘍作用を
報告している。継続中の米国出願環126.221号、1988年2月18日出
願、は、免疫系を刺激するためのC3F−1およびG−C3Fの相乗作用を開示
している。
さらに、Warrenら、J、 of Immunol、 (1986) 13
7 : 2281−2285は、C5F−1がインターフェロンの単球生産、T
NFおよびコロニー刺激活感染に対するC5F−1誘発耐性を開示している。
本発明の1つの面において、バクテリア、ウィルスまたは真菌により引き起こさ
れるものを包含する、ある数の感染症に対する耐性を誘発するCSF〜1の能力
に基づく治療的処置を開示する。なおさらに他の面は、創傷の治癒において使用
するための組織の損傷の修復を促進C5F−1の能力に関する。最後に、本発明
は、腫瘍の悩みを処置するために有効量のC3F−1を使用することによって、
哺乳類における腫瘍細胞を処置する方法を提供する。本発明の1つの面において
、本発明は、すべてが2官能性抗体により仲介される、腫瘍細胞に対してヒトエ
フェクター細胞、例えば、骨髄由来細胞、組織マクロファージ、または末梢血液
単核細胞を使用して、抗体依存性ターゲテッド細胞の細胞障害性の刺激を増大す
る方法に関する。さらに、本発明は、C5F−1またはそれとサイトメガロ、リ
ンフ才力インとの混合物、または前述の種々の応用において使用するための賦形
剤との混合物を含んでなる医薬組成物に関する。
第1図は、腫瘍細胞を殺すマクロファージの能力の増強における、C5F−1お
よび他のコロニー刺激因子の活性の比較である。
第2図は、C5F−1の存在および不存在下に付着性血液単核細胞(AMC)に
よる癌細胞の溶解を仲介する、lμg/mlのへテロ接合体113PIF(ab
’ )z−3G8F(ab’ )tの能力を示す。
第3図は、抗体単独と比較した、14〜100 ng/m1(7)CSF−1と
共に予備インキュベーションしたAMCによる溶解を仲介する、二重特異性抗体
2B1の能力を示す。
第4図は、100 ng/mlの281を使用してのAl1ICについてのC3
F−1の投与量の範囲の研究の結果を示す。
第5図は、ネズミのサイトメガロウィルス(mcMV)の致死的投与量に対する
C3F−1の保護作用を示す。
第6図は、対照およびC5F−1処置したマウスにおける創傷閉鎖のデータを示
す。
「コロニー刺激因子−1(CSF−1またはM−CSF)Jは、C5F−1につ
いてこの分野において理解されている活性スペクトルを示すタンパク質、すなわ
ち、Metcalf、 D、、 J、 Ce11. Pysiol、 (197
0) 76: 89の標準的in VitrOコロニー刺激アッセイに適用した
とき、−次的マクロファージのコロニーの形成を刺激することができるタンパク
質を意味する。天然C5F−1はグリコジル化された二量体であり、モノマーは
Metcalfのコロニー刺激アッセイ(前掲)または種々の他の1nvitr
o生物活性のアッセイにおいて活性ではないので、二重化は活性のために必要で
あると報告されている(Ralph、 P、ら、Blood(1986) 68
: 633 ; 5tanley、 E、 R,、J、 Biol、 Che
m、 (1977) 25 g:4305)。ここで使用するとき、C5F−1
単位はタイトレージョン可能な範囲におけるマウス骨髄コロニーのアッセイにお
けるコロニーの数に相当する(Ralphら、Blood、前掲、に記載されて
いる)。本発明の範囲内およびC3F−1の定義内に、二量体およびモノマーの
両者の形態が包含される。モノマーの形態は、同時係属出願のPCT WO38
108003、1988年lO月20日公開、および米国特許第4.929.7
00号、1990年5月29日発行、に記載されているような適当なりフォルデ
ィング条件をin VitrOて準備することによって二量体の形態に転化する
ことができ、そしてモノマーそれ自体は抗C5F−1抗体の生産のための抗原と
して有用である。
いくらかの種特異性が存在するように思われる:ヒトC5F−1はヒトおよびネ
ズミの両者の骨髄細胞で作用可能である。したがって、「ヒトC3F−I Jは
、Das、 1981、前掲、の特異的ネズミラジオリセプターアッセイにおい
て陽性であるが、必然的に完全な相関関係があるわけではない。タンパク質の生
物学的活性は、一般に、またヒト尿C5F−1に対する中和抗によって阻害され
るであろう(Das、 1981゜前掲)。しかしながら、ある種の特別の場合
(例えば、特定の抗体調製物は生物学的機能に必須ではないC5F−1のエピト
ープを認識することができ、そして前記エピトープは試験する特定のC5F−1
のムティンの中に存在しない)において、この基準は満足されないことがある。
C3F−1のある種の他の性質は、より最近認識されてきており、ネズミのマク
ロファージからの系列Eのプロスタグランジン類、インターリューキン−1およ
びインターフェロンの分泌を刺激するこのタンパク質の能力を包含する(Moo
re、 R,ら、5cience (1984) 223 :178)。これら
の後者の活性についてのメカニズムは現在理解されておらず、そしてここにおい
て定義する目的で、定義を満足する基準は、出発物質として適当な種からの骨髄
細胞を使用して、単球/マクロファージのコロニーを刺激する能力にあり、そし
てほとんどの環境(上を参照)下で、精製されたヒト尿C5F−1に対する中和
抗血清によってこの活性の阻害を示し、そして、種の型について適当ならば、ラ
ジオリセブターアッセイにおいて陽性の応答を示す。(C3F−1の増殖作用は
単核食細胞の系統の細胞に制限されること(Stanley。
E、 R,、The Lymphokines (1981)、Stewart
、 W、E、、Ir、ら、纏、Humana Press、ニュージャーシイ州
りリフトン)、PI)、、102−132)およびC5F−1のためのりセブタ
ーはこの系統の細胞(Byrnc、 P、 V、 ら、Ce11. Biol、
(1981,) 91 : 848)、胎盤のトロホブラストおよびいくつか
の他の細胞の上に見いだされることか知られている)。
「有効量」は、特定した機能を実行する、例えば、腫瘍細胞を殺すか、あるいは
腫瘍負荷を減少か、あるいは感染症を予防または治癒するために有効な量を意味
する。
「治療的処置」は、病気にかかった後の被検体を処置することを示し、そして予
防的治療を包含する。
「哺乳動物」は、任意の哺乳動物の種を示し、そしてウサギ、マウス、イヌ、ネ
コ、霊長類およびヒト、好ましくはヒトを包含する。
「免疫抑制」は、感染、化学的物質、熱傷、主要な外傷、または照射による、免
疫応答の予防または減少を意味する。
「発現系jは、所望のコード配列および調節配列を作用可能な連鎖で含有するD
NA配列を呼び、こうしてこれらの配列で形質転換された宿主はコードされたタ
ンパク質を発現することができる。形質転換を実施するために、発現系をベクタ
ーの中に含めることもできるが、次いて関係するDNAを宿主の染色体の中に組
み込むことができる。
ここで使用するとき、「細胞J、「細胞系」および「細胞培養物」は互換的に使
用し、そしてすへてのこのような表示は子孫を包含する。こうして「形質転換体
」または「形質転換された細胞」は、被検体の一次的細胞および、継代の数に無
関係に、その細胞から誘導された培養物を包含する。また、すべての子孫は、意
図的なまたは不注意な突然変異ために、DNA含量が正確な同一でないことがあ
る。
もとの形質転換された細胞においてスクリーニングしたのと同一の機能を有する
突然変異体子孫が含められる。別の表示を意図する場合、文脈から明らかであろ
う。
ここにおいて述べる、すべての特許、特許出願および刊行物は、前掲および後掲
の両者を含めて、ここに詳しく引用によって加える。
C5F−1は明らかに多数の形態で存在し、それらのすべては本発明の態様の中
に含められる。3つの異なる長さく256アミノ酸=554アミノ酸:および4
38アミノ酸)のC5F−1のpre−pro−ポリペプチドをコードするヒト
C3F−iのcDNAのクローンは、単一のC5F−1遺伝子を発現する細胞か
ら単離された(参照、米国特許第4.847.201号、1989年7月11日
発行および米国特許第4.868.119号、1989年9月19日発行;Wo
ng、 G、 G、ら、5cience (1987) 235 : 1504
. Kawasakiら、5cience (1985) 230 : 291
; Ladnerら、EMBOJ、(1987) 6 : 2693 ;Ce
rrtti、 D、 P、ら、Microbiol、Immunol、 (19
88) 25 : 761 o ここにおいて開示する治療において有用なC5
F−1タンパク質は、また、例えば、長い形態の、238におけるLys残基、
249におけるArg残基、および411におけるArg残基を包含する、タン
パク質分解によりプロセシングされることができる。C3F−1は1または2以
上のC−末端が欠失された形態で天然に存在する。さらに、最初の2または4ア
ミノ酸を欠如するC5F−1タンパク質は、ヒト細胞系AGR−ON(CEIi
l−ON号、1987年6月23日発行)の上澄み液から活性な形態で単離され
た。
アミノ酸145をコードするモノマーを含むC5F−1タンパク質は1nvit
ro生物学的活性を有することが報告された(欧州特許公開第261、592号
、1988年3月30日公開)。いくつかの生物学的活性は、アミノ酸132を
コードするモノマーから構成された二量体のC5F−1タンパク質について報告
された(欧州特許(EP)第328.061号、1989年8月16日公開)。
モノマーのC5F−1ポリペプチド(C−末端において切断されているか否かに
かかわらず)を、また、リフオルディングしてマルチマー、最も頻繁には二量体
を形成することがてきる。
天然ヒト尿C3F−1は、45〜90kDの高度にグリコジル化された二量体と
して、源、測定法および報告者の同一性に依存して単離された。
Wongら(前掲)により報告された、組み換え的に生産された未グリコジル化
C3F−1は、はぼ21kDの分子量を有するように思われる。他方において、
Kawasakiら(前掲)(参照、米国特許第4.847.201号(前掲)
およびPCT公開第WO36104607号、1986年8月14日公開)によ
りC3F(SCSF)の「短い」224アミノ酸について推定されたアミノ酸配
列に基づいて推定された分子量は、26kD程度であるが、「長い」アミノ酸の
形態(LCSF)のそれは55kD程度である(Wongら(前掲):Ladn
erら(前掲);欧州特許(EP)第272.779号、1988年6月29日
公開:およびPCT公開第WO37106954号、1987年11月19日公
開)。これらの遺伝子の欠失された構成体をE、 coliの中で発現するたお
き(グリコジル化が起こらない場合)、それらはもちろんかなり低い分子量のタ
ンパク質を生ずるであろう。
本発明において有用な1の他の形態は、米国特許第4.847.325号に記載
されているポリマー接合C5F−1を包含する。欧州特許(EP)第249.4
77号、入987年12月16日公開に開示されているトランスメンプレイン領
域欠失突然変異体および欧州特許(BP)第272.779号、前掲、に開示さ
れているグリコジル化部位欠失突然変異体もまた、現在開示する治療に有用であ
ると考えられる。
種々の源からこれらの種々の形態のC3F−1を生産する方法は、米国特許第4
.879.227号、■989年11月7日発行、 WO36104587号、
1986年8月14日公開、 WO39/10407号、1989年11月2日
公開; WO38108003号、前掲および欧州特許(EP)第276、55
1号、1988年8月3日公開、に報告されている。
ATG開始コドンが直ぐ前に存在するバクテリアで生産された成熟タンパク質は
、N−末端のメチオニンを含むか、あるいは含まないことができることは、もち
ろん、知られており、そして欧州特許(EP)第272.779号、前掲、に示
されているように、残基lおよび2(両者はグルタミン酸)または残基1〜3
(Glu−Glu−Val)の欠失はこのように役立つ。欠失はマおよび引き続
くN−末端配列から欠失されたアミノ酸数、あるいはアミノ酸がC−末端配列か
ら欠失されるとき、残りのアミノ酸の数で記載される。こうして、最初の2およ
び最初の3残基の欠失を有する前述のN−末端の欠失は、それぞれ、Nマ2およ
びNマ3と表示される。例えば、長さ150.158゜190および221アミ
ノ酸のタンパク質を生ずるC3F−1のC−末端の切頭は、ツレツレ、Cマ15
0 、Cv158 、 CY190 オヨヒCV221と呼ばれる。3アミノ酸
のN−末端の欠失を有するLCSFから誘導された221アミノ酸のC5F−1
分子は、例えば、LC3F/Nマ3Cマ221と記載される。アミノ酸の置換は
、置換されるアミノ酸の位置に言及して表示される。例えば、Ladnerら(
前掲)の第4図の中の位置157のシスティン残基のセリンによる置換はC5F
−1ser+ s□と呼ばれる。
要約すると、N−末端およびC−末端の欠失へおよび集成に加えて、鎖の中の個
々のアミノ酸残基は酸化、還元、欠失または他の誘導体化により修飾することが
でき、そしてまたこれらのタンパク質は切断および/または重合して、活性を保
持する二量体生成物を得ることかできる。活性を破壊しないこのような変更は定
義からタンパク質配列を除去せず、そして実質的な同等体として特別に包含され
る。他の種から誘導されたC3F−1は、[ヒトC5F−I Jの活性を存する
タンパク質の定義に、ヒト基質に関する前述の要求される活性のパターンのその
表示のおかげで適合することができる。
すべてのタンパク質の場合におけるように、正確な構造はある数の因子に依存す
る。イオン化可能なアミノおよびカルボキシル基か分子の中に存在するので、特
定のタンパク質は酸性または塩基性の塩として、あるいは中性の形態で得ること
かできる。適当な環境的状態に置かれたとき、それらの活性を保持するすべての
このような調製物は、この定義の中に包含される。さらに、主なアミノ酸配列は
、糖部分を使用して誘導体化(グリコジル化)によるか、あるいは他の補助的分
子、例えば、脂質、ボスフェート、アセチル基などにより、より普通には糖類、
ポリエチレングリコール(PEG)およびポリオキシエチレングリコール(PO
G)との接合により米国特許第4、847.325号に示されているように増大
することができる。このような増大のある種の面は、生産性宿主の翻訳後のプロ
セシング系を通して達成される:他のこのような修飾はin vitroで導入
することができる。いずれの場合においても、このような修飾は、上に定義した
、二量体のタンパク質の活性が破壊されないかぎり、定義の中に包含される。こ
のような修飾は、タンパク質の活性を種々のアッセイにおいて増強または減少す
ることによって、量的または質的に活性に影響を与えることができる。
さらに、鎖の中で個々のアミノ酸残基は酸化、還元または他の誘導化により修飾
することかでき、そしてタンパク質を切断して活性を保持する断片を得ることが
できる。活性を破壊しないこのような変更は定義からタンパク質配列を除去しな
い。
翻訳の間に配列の中に組み込まれたアミノ酸の欠失、付加または変更による、−
次構造それ自体の修飾は、タンパク質の活性を破壊しないで、なすことかできる
。このような置換および他の変更は、rC3F−1のそれに実質的に等しいアミ
ノ酸配列を有する」タンパク質の定義内に入るアミノ酸配列を有するタンパク質
を生ずる。事実、ヒトおよびネズミ由来のC3F−1タンパク質は、高い相同性
を表す、同一でないが、同様な一次アミノ酸配列を有する。
本発明のC5F−1タンパク質は、先祖骨髄細胞からの単球−前駆体/マクロフ
ァージの細胞の両者の生産を刺激し、こうして免疫系の有効性を増強し、そして
成熟マクロファージの中のリンフ才力インの分泌のような分化する細胞の機能を
刺激することができる。
1つの応用において、これらのタンパク質は化学療法への付加物として有用であ
る。化学療法の処置は免疫系の抑制を生ずることか理解されるであろう。しばし
ば、化学療法の処置は、腫瘍細胞の破壊において有望であるが、骨髄細胞へのこ
れらの毒性剤の副作用のために、対象の死亡を生ずる。このような患者へのC5
F−1の投与は、骨髄由来の前駆体のマクロファージおよび単球への成長および
分化を仲介および増強しかつこれらの成熟細胞の機能を刺激するC5F−1の能
力のために、この副作用を防止し、こうして二次感染に屈する患者の傾向を防止
するために免疫系の再刺激をもたらす。
C5F−1は、また、白血球減少症、すなわち、白血球の合計数の減少を包含す
る疾患を治療するために使用することができる。好中球減少症は多形性の白血球
(好中球、顆粒球)に主として影響を与える欠陥を反映し、そして種々の感染、
ある種の薬物(例えば、細胞障害性薬物)またはイオン化放射線に基づくであろ
う。こうして、C3F−1のin vivo投与を使用して幹細胞を誘導して多
形性白血球の生産を増加し、こうして白血球の計数を増加することができる。
このような処置により助けられる他の患者は、骨髄移植により白血病を処置され
る患者を包含する:このような患者はしばしば拒絶反応を予防するために免疫抑
制されている。これらの患者について、また、免疫抑制はC5F−1の投与によ
り逆転されることがある。
一般に、化学療法、骨髄移植、または他の形態の免疫抑制、例えば、疾患(例え
ば、後天性免疫欠損症候群)のためかどうかにがかわらず、免疫抑制に悩む対象
は薬理学的使用のためのC5F−1入手可能性から利益を受けるであろう。
日和見感染には免疫抑制の結果としてかかることかある。例えば、記載されてい
る。Millsらは、普通の一次感染は次の因子により引き起こされることを示
す:サイトメガロウイルス、ニューモジステイス・アリニイイ(Pneumoc
ystis carinii) 、カンジダ・アルビカンス(Candida
albicans) 、水痘−帯状庖疹ウィルス、ニスバインバールウィルス、
トキソプラズマ・ゴンジイ(Toxoplasma gondii)、鳥型結核
菌(Mycobaeterium avium) 、クリブトコッス・ネオフォ
ルマンス(Cryptococcus neoformans)など。著者らは
また、これらの感染を処置するために使用される種々の薬物を記載している。C
3F−1をそれらの薬物の1種または2種以上と組み合わせて、これらおよび日
和見感染を処置することができるか考えられる。
さらに、C5F−1をクリプトコツカル(Cryptococcal) 、例え
ば、クリプトコツカル・メニンギチス(cryptococcal menin
gitis)の感染の処置のために使用することか思い浮かぶ。クリプトコツカ
ル・メニンギチス(Cryptococcal meningitis)は米国
において菌類の髄膜炎の最も普通の形態であり、そしてエイズの患者においてヒ
ト免疫不全ウィルス(l(IV)およびトキソプラズマ・ゴンジイ(Toxop
lasmagondii)後の神経学の疾患の第3の最も重要な因子である。
クリプトコックス症は米国においてエイズ患者の5〜7%において病気の間のあ
る時点において発生するが、散在性クリプトコツカス症はアフリカのエイズの患
者の第3までにおいて発生することかある。
これらの日和見性の感染のための治療的処置は、菌類の病気について下に記載す
るものと同様であることかできる。例えば、csp−iは同様な投与レベルあつ
同一のスケジュールで投与することができる。
さらに、対象者に固有の系の量を補充するために前板て分化したマクロファージ
の増大量を投与することができ、これらのマクロファージは骨髄のin vit
ro培養によるか、あるいは血液の単球、または他の適当な調製物および引き続
< C3F−1の処理から生産される。
これらの調製物は、患者自身の血液の単球または骨髄誘導細胞の調製物を包含し
、これらはそのように培養し、そして局所的または全身的処置のために戻すこと
ができる。
C5F−1がマクロファージによるリンフ才力インの生産を刺激し、そして榎的
細胞を殺すマクロファージの能力を増強する能力は、また、新形成および感染の
処置においてC3F−1を直接有用とする。そのうえ、C5F−1を使用する創
傷の処置は組織の修復を促進する。
C5F−1はネズミ由来マクロファージによりインターフェロンの生産を増強し
くFleit、 Il、 B、ら、J、 Ce11. PYSiol、 (19
81) 108 :347)、そしてMrAPaCa細胞からのヒトの、部分的
に精製されたC3F−1は、PCP WO36104607、前掲、に例示され
ているように、ヒト単球からのインターフェロンおよびTNPのポリ(■):ポ
リ(c)誘発生産を刺激する。さらに、C5F−1はヒト血液単球により骨髄様
CSFの生産を刺激する。
そのうえ、ここに記載する種々の使用のために、C5F−1を他の効率よい因子
と組み合わせて使用することができ、このような因子は、例えば、IFN−7ル
ア y、IFN−ベータ、rFN−ガンマ、rL−2,TNF 、または腫瘍を
処置するためのネズミジベブチドおよびその類似体を包含する。
また、正常C3H/HeNマウス腹膜のマクロファージを刺激して、ネズミ肉腫
TU5ターゲットを殺すC5F−1(ネズミL−細胞一コンディションドおよび
E、coli生産ヒト組み換えC5F−1からの)の能力を下において証明する
。C5F−1を予備処置としておよびエフェクター相の間に使用するとき、この
活性は最も有効である。そのよう(こするC3F−1の能力は、他のC3Fが示
すものより非常に大きし)。
C5F−1はまた、リンフ才力イン誘発の抗体依存性細胞の細胞障害性(ADC
C)またはターゲラテッドADCCを腫瘍細胞に対するマクロファージまたは天
然キラー細胞により増大するため(こ使用すること力為できる。この活性が特に
効果的である場合、C5F−1をIL−2,1FN−アC3F−1の投与量、お
よびエフェクター/タープ・ソトの比に依存すると信じられる。ターゲラテッド
細胞の細胞障害性は、細胞障害性細胞、例えば、単球、マクロファージ、ナチュ
ラルキラー細胞なとの上の細胞表面のりセブターに頼ると考えられる。これらの
細胞表面のりセブタ−CD16の発現は、追加のリンフ才力イン、例えば、IL
−2の存在または不存在下に、C5F−1の中のこれらのエフェクター細胞を培
養することによって増強される。細胞障害性細胞はタープ・ソト細胞に対するま
で上に位置つけされる場合、2価の抗体は、その結合部位の1つを通してターゲ
ット細胞に結合しかつその第2結合部位を通して細胞障害性細胞上の溶菌促進リ
セブターに結合し、これにより2つの細胞の型を接合しそして細胞障害性細胞が
殺しのシグナルを送り出すようにさせることによって、このプロセスを促進する
ことができる。「2価の抗体」は、トリオーマ(trioma)またはハイブリ
ッドのハイブリドーマ細胞系における抗体鎖のin vivo組み換えにより生
産された抗体、および2つの抗体または抗体断片のin Vitro化学的接合
により生産された抗体を包含する;後者の化学的に連鎖された抗体はへテロ接合
体と呼ぶ。
本発明において、このような2価の抗体は白血球上のヒトリセプター111(F
cRIII)として知られているCD16抗原をターゲットする、ハイブリッド
のハイブリドーマ誘導二重特異性またはへテロ接合した抗体を包含する。3G8
、ヒトFcRr I Iに対するIgG+モノクローナル抗体を分泌するネズミ
ハイブリドーマは、Unkeless、 J、 B、ら、Ann Rev 1m
m (1988) 6 : 251に記載されている。ハイブリッドのハイブリ
ドーマ誘導二重特異性抗体2B1を発生するために、この抗体およびモノクロー
ナル抗体520C9を使用することは、同時継続米国出願第07/249.71
0号、1988年9月27日提出、に記載されている。
生ずる二重特異性抗体はCD16FcリセブターIII陽性細胞への結合、なら
びに陽性のプロト腫瘍遺伝子生産物crbB−2を表す肺癌細胞への結合を示す
。3G8はまた113F1抗体、肺癌関連抗原に対するネズミモノクローナル抗
体(米国特許第4.753.894号)に化学的に交差結合され(例えば、Ka
rpovskyら、J、 Exp、 Med、 (1984) 160 : 1
686、に記載されているように化学的クロスリンカ−を使用して)、また、2
価の特異性を有する抗体が生成された。
このようなターゲラテッド細胞障害性のアッセイにおけるcsp−iのin v
itro存効投与量はlO〜200 ng/mlの範囲である。しかしながら、
そのin vivo投与量は、種々の因子、例えば、癌のひどさ、宿主の免疫の
状態、体重、エフェクター/ターゲット細胞の比に依存し、それらの多くは場合
に応じて決定することができるだけである。
C5F−1は、全身の毒性反応を引き起こさないが、エフェクター細胞上に強化
の応答を誘発する投与量で投与すべきである。
2価の抗体のin vitro有効投与量はlog/m1〜200 ng/ml
の範囲である。in vivo投与量は、ある数の因子、例えば、腫瘍の大きさ
の臨床的推定、転移の程度、および活性薬物および活性化された細胞の生物分布
に依存する。有効なin vitroエフェクター/細胞の比はほぼ10:1〜
80:1である。実際のエフェクター/ターゲットの比in vivoは、エフ
ェクター細胞および抗体への腫瘍の接近可能性に依存する。
を引き起こすものを包含するバクテリアの因子、および菌類を攻撃するネズミ細
胞の能力は、C3F−1により増強される。(ネズミC3F−1はネズミマクロ
ファージかP815腫瘍細胞に対して静細胞性であることを刺激する(Wing
、 E、 、L ら、J、 Cl1n、 Invest、(1982) 69
:270)か、あるいは他の白血病のターゲットを殺さない(Ralph、 P
、ら、の調製物かマクロファージがカンジダ属(Candida)を摂取および
殺あることが発見された。これらの菌類の感染は、典型的には、免疫抑制された
患者(例えば、骨髄移植体、エイズを有する患者など)において発生するが、ま
た、免疫抑制されていない個体において起こることがある。処置することかでき
る菌類は、次の属からのものである:カンジダ属(Candida) 、アスペ
ルギルス@(Aspergi 1lus)、クリプトコツカス属(Crypto
coccus) 、ヒストブラスマ属0(istoplasma) 、プラスト
ミセス!!(Blastomyces) 、コシジオイデス属(Coccidi
oides) 、バラコシジオイデス属(Paracoccidioides)
、ケカビBE(Mucor) 、aドトルラ@(Rhodotorula) 、
スボロロトリクス属(Sporothrix) 、ダーマトフイトシス属(De
rmatophytosis)、シュードアレスケリア@ (Pseudall
escheria) 、ブロトセカ属(Prototheca) 、リノスボリ
ジウム@(Rhinosporidium) 、または菌腫またはクロモミコー
シスを引き起こす菌類など(参照、Pr1nciples and Pract
ice of Infectious Diseases、第3版、Madel
lら、Churcell Livigtone [1990] 1)、1942
−2016)。
好ましくは、C3F−1は、菌類の感染か陰性の培養結果により決定して除去さ
れるまで、非経口的に投与する。C5F−1は、皮下的に、連続的注入により、
ポーラス注射により、あるいは一定の注入により投与することができる。「連続
的注入」とは少なくとも24時間の投与を意味し、そして「一定の注入」は24
時間以下の投与を意味する。C5F−1は好ましくは1〜4時間持続する一定の
注入を意味する。
菌類の感染を処置するために有効な1日のC5F−1の投与量は好ましくは0.
01〜50mg/ rd、より好ましくは0.05〜10mg/ rd、最も好
ましくは0.5〜5 mg/イである。好ましくは、C5F−1は少なくとも1
4日間、より好ましくは21〜59日間投与する。上の処置が不都合な結果を引
き起こす場合(しかしながら、最小の効果はi、 V、ポーラスにより30mg
/ rd /日までの投与量で観測された)あるいはより効率よい結果を示すこ
とができる場合、他の投与のスケジュールをまた使用することができる。
好ましくは、前述したようにかつ下に詳しくを示すように、C5F−1はカンジ
ダ@ (Cand 1da)およびアスペルギルス属(Aspergi 1lu
s)の感染を処置するために使用することができる。クリプトコックス属(Cr
yptococcus)の感染、例えば、クリプトコックスの髄膜炎は同様に処
置することかできる。
こうして、免疫抑制それ自体を克服ことに加えて、C3F−1はマクロファージ
の分泌および活性の刺激により侵入性有機体または悪性細胞を破壊するために使
用できる。マクロファージの活性は抗微生物剤、例えば、1種または2種以上の
抗ウィルス、抗菌剤または抗バクテリア剤と組み合わせたC3F−1の治療によ
り増強することができる。
抗菌剤の例は次のものを包含する:アンフすテリシンB、フルコナゾール(Di
flucan) 、5フルオロ−サイドシン(Flucytosine。
5−FC) 、ケトコナゾール、ミコナゾール、イトラコナゾールなと(参照、
また、Madellら、前掲、9.361−370またはMillsら、p。
54−55)。上の抗菌剤の1つの臨床的スペクトルの例として、典型的にはア
シフオテリシンは次の菌類および原生動物を阻害する:アスペルギルス・フミガ
ラス(Aspergillus fumigatus) 、バラコシジオイデス
ーブラシリエンシス(Paracoccidioides brasilien
sis) 、コシジオイデス・イミチス(Coccidioides 1mm1
tis) 、クリブトコッス°ネオフオルマンス(Cryptoeoceus
neoformans) 、ヒストブラスマ゛カブスラツム(Histopla
s[lla eapsulatum) 、ムコル・ムセド(Mucor mue
edo) 、ロドトルラ@ (Rhodotorula)種、スポロロトリクス
・デルマチチジス(Sporothrix dermatitidis) 、カ
ンジダ属(Candida)種、レイシュマニア@(Leishmania)種
、およびアカンタメバ属(Aeanthamoeba)種。抗菌剤は、C5F−
1の投与の前に、間にまたは後に、投与することができる。これらの剤の投与量
は当業者に知られており、そして1日量の範囲、例えば、アンプォテリシンB(
こついて0.4〜0.6 mg/kg/日、フルコナゾ−ツしについて200m
g/日〜400 mg/日、5−フルオロ−サイトシンについて約150 mg
/kg7日、そしてケトコナゾ−ル(二ついて200 mg/日〜400 mg
/日を包含する。これらの範囲は単に例示であり、そしていかなる方法において
も限定的として解釈すべきでない。また、C3F−1は菌類の感染の処置に有効
であるか、あるいは有効であろう他の剤と組み合わせることかできると考えられ
る。抗菌剤はポリマーに接合して、それらのin vivo半減期および毒性を
調節することができる、参照、米国特許出願第365.914号、その開示の全
体をここに引用によって加える。
前述したように、C5F−1は池の抗微生物剤、例えば、抗バクテリア剤と組み
合わせることができる。C5F−1と組み合わせることができる抗生物質の例は
、次のカテゴリーから選択されるものを包含する:β−ラクタム環(ペニシリン
)、グリコシド結合にあるアミノ糖(アミノグリコシド)、マクロサイクルのラ
クトン環(マクロリド)、ナフタセンカルボキシアミドのポリサイクルの誘導体
(テトラサイクリン)、ジクロロ酢酸のニトロベンゼン誘導体、ペプチド(バシ
トラシン、グラミシンおよびポリミキシン)、共役二重結合系をもつ大きい環(
ポリエン)、スルファニルアミドから誘導されたスルファ薬物(スルホンアミド
)、5−ニトロ−2−フラニルの群にトロフラン)、キノロンカルボン酸(すな
わち、ナリジキシン酸)、および多数の他のもの。前述の抗生物質の群はは好ま
しい抗生物質の例であり、それらの群の範囲内の例は次の通りである:ペプチド
の抗生物質、例えば、アンフォマイシン、バシトラシン、プレオマイシン、カブ
レオマイシン、カブレオマイシン、コリスチン、ダクチノマイシン、エンヅラシ
ジン、グラミシジンA1グラミシジンJ (S)、ミカマイシン類、ポリミキシ
ン類、ステンドマイシン、チオペブチン、チウトレブトン、チロレジン類、ビオ
マイシン、ピルギニマイシン類、およびアクチノマイシン(参照、化学技術の百
科事典(Encyclopedia of Chen+1cal Techno
logy) 、第3版、Kirk−Othmer II、 Vol、 2. p
、 991 (1978) 二アミノグリコシド類、例えば、ストレプトマイシ
ン、ネオマイシン、バシトラシン、ゲンタマイシン、リボメタマイシン、トブラ
マイシン、アミカシン、およびリビドマイシン(参照、Kirk−Othmer
、 Vol、 2. p、 8−19) ;β−ラクタム類、例えば、ベジルペ
ニシリン、metisilin 、オキサシリン、ヘタシリン、ピペラジリン、
アモキシリン、およびカルベニシリン(参照、Kirk−Othmer、 Vo
l、 2. p、 871) ;フロラ:/ 7 エニーコール(参照、Kir
k−Othmer、 Vol、 2. p、 920) ;リンコサミニド類、
例えば、タリンダマイシン、リンコマイシンセレスセチン、デサリセチン(参照
、Kirk−Othmer、 Vat、 2. p、 930) ;マクロリド
類、例えば、エリスオマイシンA−E 、ランカマイシン、ロイコマイシン、お
よびピクロマイシン(参照、Kirk−Othmer、 Vol、 2. p、
937) ;ヌクレオシド類、例えば、5−アザシチジン、アミセチン、プロ
マイシン、およびセブタシジン(参照、Kirk−Othmer、 Vol、
2. p、 962) ;オリゴ糖類、例えば、クラマイシン、およびエベルニ
ノミシンB(参照、Kirk−Othmer、 Vol、 2.9.986)
;フェナジン類、例えば、ミキシン、ロモフンギン、イオジニンなど(参照、K
irk−Othmer。
Vol、 3. p、 1) ;ポリエン類、例えば、アンフォテリシン類、カ
ンジンジン、二スタチンなど(参照、Kirk−Othmer、 Vol、 3
. I)、 21) ;ポリエーテル票(参照、Kirk−Othmer、 V
ol、 3. p、 47) ;テトラサイクリン類、例えば、り四ロチトラサ
イクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロシクリン、メタサイクリン、ドキ
シサイクリン、およびミノサイクリン(参照、Kirk−Othmer、 Vo
l、 3. p、 65) ;スルホンアミド類、例えば、スルファチアゾール
、スルファジアジン、スルファピラジン、およびスルファニルアミド(参照、K
irk−Othmer。
Vol、 2. p、 795) ;ニトロフラン類、例えば、ニトロフラン類
ラジリジン、ニトロフラン類ン、ツリウム、ニトロビン、およびンミフロキシム
(参照、Kirk−Othmer、 Vol、 2. p、 790) ;キノ
ロンカルボン酸類、例えば、ナリジキシン、ピロミド酸、ピペミド酸、およびオ
キソリン酸(参照、Kirk−Othmer、 Vol、 2. p、 782
)。
C5F−1は、また、抗ウィルス剤、例えば、次のものと組み合わせることがで
きる:アマンタジン、リマンタジナジルドン、リバビリン、あしくろびる、9−
[(1,3−ジヒドロキシ−2−プロポキシ)メチルjグアニ(D)IPG)
、ビダラビン(ARA−A) 、ガンシクロビル、エンピロキシム、フォスカー
ネト、インターフェロン(アルファー、ベーターおよびガンマ−)、アンブリゲ
ン、ボドフオルロトキシン、2.3−シトキシシトジン(DDC) 、ヨードデ
オキシウリジン(IDU)、トリフルオロチミジン(TPT) 、ジデオキシイ
ノシン:ddD、ジデオキシサイトジン(dde) 、シトプシンおよび特定の
抗ウイルス性免疫第11版、Braunwald、 E、ら纏、ニューヨーク:
McGraw Hill BookCo、、 1987. pp668−67
2)。
最後に、C5F−1は、局所的または全身的に適用したとき、創傷の治癒のため
の組織の修復を促進するために使用できる。C5F−1はマクロファージを補充
しくWang、 J、 M、ら、J、 !m+nunol (1988) 14
1 :575)ならびにマクロファージを誘発して結合組織の成長因子、例えば
、血小板誘導成長因子(PDGF) 、および活性因子、例えば、腫瘍壊死因子
(TFN)を、細胞増殖の刺激として、提供することができる。
創傷のマクロファージは、線維増殖、コラーゲンの合成、および脈管形成をin
vivoで刺激する物質を解放すると報告された(Hunt T。
K、ら、Surgery (1984) 96 : 48)。
本発明のC5F−1は、タンパク質物質の投与する分野において標準の普通の方
法で配合することができる。注射による投与は1つの好ましいルートである:そ
してこのような配合物は、溶液または懸濁液、乳濁液、または注射可能なまたは
ゲルの配合物に再構成するための固体の組成物を包含する。適当な賦形剤は、例
えば、リンゲル溶液、ハング溶液、水、生理食塩水、グリセロール、テキストロ
ースまたはマンニトール溶液などを包含する。C5F−1の液体の溶液はm*の
包帯の上または下に直接使用することができるが、再構成された組成物は創傷の
治癒のための軟膏、ゲル配合物、泡沫剤などに有用である。再構成された配合物
は、創傷部位にC3F−1のためのコントロールされた供給系を提供する。コン
トロールされた解放は、延長された期間、例えば、24時間またはそれ以上、好
ましくは24〜72時間にわたって治療的レベルを維持するために十分な薬物の
解放を意味する。成長因子の接触時間の増加は、創傷の治癒速度の有意な増加を
達成するために必要であることがある。
さらに、本発明のC5F−1は細胞の調製物と予備インキュベーションして適当
な応答を刺激することができ、そして全体の調製物またはそれからの上澄み液を
被検体に導入することができる。下に示すように、種々の型の血球によりC5F
−1の刺激に応答して生産された物質は所望のターゲットに対して有効であり、
そして侵入性有機体または新形成を攻撃する血球それら自体の性質は増強される
ことができる。被検体自身の細胞を抜き出しそしてこのようにして使用すること
ができるか、あるいは、例えば、他の適合性の個体からの単球またはリンパ球を
を包含するにおいて使用することができる。
前に、とくに米国特許第4.874.201号(前掲)に開示されている液系に
適用可能な発現ベクターは構成され、そして解読配列は発現された。米国特許第
4.874.201号において提供された発現系に加えて、バキュロウィルスに
より提供されたコントロール系を利用する昆虫の細胞を使用して発現系は記載さ
れた(Miller、 D、 W、ら、Genetic Engeneerin
g (1986) Setlow、J、K、ら編、 PlenuTIIPubl
ishing、 Vol、 8. り11.277−279 、米国特許第4.
745.051号、1988年5月17日発行、および同時継続米国出願第07
7、188号、1987年7月27日提出。昆虫の細胞に基づく発現は、スポド
ブテラ・フルギペイダ(Spodoptera frugipeida)の中で
実施することができる。
これらの系はまたC5F−1の生産に有望である。哺乳動物の発現はCO3−7
,CHO、マウス、およびCV−1細胞、およびまたCV−A2 、ハムスター
およびネズミの細胞であることかできる。
種々の利用可能な宿主、ならびにこのような宿主のために適当な発現ベクターは
、翻訳後のプロセシング合成の選択、およびこうして生産されたタンパク質のコ
ンフォメーションの調節を提供する環境的因子の選択を可能とする。こうして、
この情報の利用可能性はここに記載する種々の治療において使用するために十分
な量でC5F−1タンパク質を提供する。
前述の特許刊行物の中に開示されているベクターの中で、プラスミドpLcsF
221A(これはaSp s s LCSF/Nマ3Cマ221を1中コードす
る遺伝子を含有する)およびpccsF−17(これは5CSFをシラコードす
る遺伝子を含有する)は、ヒトC5F−1の、それぞれ、原核生物および真核生
物の発現のために好ましい。E、 coli株DG116の中に形質転換された
プラスミドpLcsF221A(以後E、 coli (221))は、ATC
CCに1987年4月14日に受け入れ番号67390で受託された。E、 c
oli MM294の中のpcC3F−17は、ATCCCに1985年6月1
4日に受け入れ番号53149で受託された。
また、5CSFおよびLCSFの最初の3−150または4−150酢酸および
C−末端の欠失を含有するアミノ酸配列、例えば、LCSF/マ221からなる
C3F−1タンパク質が好ましい。
C5F−1の活性は、以下の実施例において、部分的に精製されたMIAPaC
aのC5F−1、ネズミL細胞C3F−1、CV−1により生産された組み換え
物質またはE、 coliにより生産されたヒトC3F−1を使用して決定され
た。C5F−1は、誘発されたヒト単球によるインターフェロン(IFN)およ
び腫瘍壊死因子(TNF)の生産を、10〜30倍まで増強することか示された
。C3F−1はまた、マクロファージのin vitro抗腫瘍毒性を刺激し、
in vivo腫瘍増殖を阻止し、マウスを致死的バクテリアの感染から保護し
、組織損傷のin vivo修復を促進し、サイトメガロウィルスのin vi
vo増殖を阻止し、そして酵母のin viv。
増殖を阻止することか証明された。次の実施例によって、特許請求した治療的使
用を説明する。これらの実施例は本発明を限定しない。
ヒト単球によるTNFの生産の刺激
MIAPaCaのC5F−1を上澄み液からリン酸カルシウムゲル濾過およびレ
ンチルレクチンクロマトグラフィーにより精製した。リンフ才力イン生産のアッ
セイのために、末梢血液−付着性細胞を各々107細胞を含有する二重反復実験
のフラスコの中でインキュベーションした。1個のフラスコを100OU /m
lの上のようにして精製されたC3F−1で処置した。3日後、細胞を収獲し、
洗浄し、そして5X105/mlの細胞濃度に再懸濁し、そして24ウエルプレ
ートの中に0.5ml/ウェルでプレートした。ウェルを10μg/mlリポ多
糖(LPS)および20ng/mlのPMAで処理し、そして上澄み液をTNF
アッセイのために収獲した。C3Pで処理した細胞は、未処理細胞よりほぼ9倍
高いTNFの分泌を示した(162U/mlに比較して、+500U/ml)。
ヒト単球によるインターフェロンの生産の刺激インターフェロンの生産に対する
C5F−1の効果を決定する類似する実験において、末梢血液−付着性細胞を、
前述したように、1000U/mlのC3F−1の存在および不存在下に3日間
インキュベーションし、収獲し、5 x 10’ /mlて再懸濁させ、そして
前述したように24ウエルのプレートの中にプレートした。インターフェロンの
生産のために、変化する量のポリ(■):ポリ(C)の添加により細胞を誘発し
た。上澄み液を、VS■感染した0M2504細胞への細胞変性作用により、イ
ンターフェロンの生産についてアッセイした。C3F−1刺激した細胞は、50
μg/mlのポリ(I):ポリ(C)で誘発したとき、100 U/mlの生産
を示したが、同等に誘発された未処理細胞は3U/mlより少なくを生産した。
ヒト単球による骨髄様C3Fの生産の刺激単球を士C3F−1と3日間インキュ
ベーションし、次いで表1におけるように骨髄様CSFの生産について誘発した
。示した3つの代表的な実験において、異なるドナーからの血液を使用した。
実験l 実験2 実験3
誘導 −CSF +CSF −C3F +C3F −CSF +C3F媒地 o
oooo。
したかって、C5F−1は骨髄様C3Fまたはコロニー刺激活性の生産を刺激す
る。
ネズミマクロファージによる腫瘍細胞の殺しの刺激:マクロファージの刺激を測
定するために、ネズミマクロファージが肉腫ターゲットを殺す能力の刺激を示す
アッセイにおいて、pcC3F−17から組み換え的に生産されたC3F−1の
ためのモデルとして、L−細胞−コンディショニング培地から得られたネズミC
3F−1を使用した。このアッセイにおいて、2時間の付着性C3H/HeNマ
ウスの腹膜のマクロファージを、C5F−1の存在および不存在下に、1日間i
n vitroインキュベーションし、次いで20:lの比で3H−チミジン標
識したマウス肉111TtJ5細胞と10%(V/V)のConAで誘発した(
10μg/ml)牌臓すンフォカイン(LK) (これはガンマ−インターフェ
ロンを含有する)と−緒に混合した。このアッセイにおいてLK調製物を精製さ
れたガンマ−インターフェロンにより置き換えることができる。次の48時間に
わたる標識したチミジンの解放を腫瘍細胞の殺しの測定値として使用した。12
00U/mlのC3F−1を含有するネズミL−細胞コンディショニング培地と
してC5F−1を添加する効果を表2に示す。
精製されたネズミC3F−1並びにCV−1およびE、 coli (221)
からのrhC3F−1もまた、このアッセイにおいて有効であった。
表2
処 理 殺し C5F−1による増加
第1日 第13日 % %
−CSF−1+LK 49 26
C3F−I LK 51 31
C3F−I C3F−1+LK 60 54−C3F−1+LK 47 34
CSF−17−−
C5F−I LK 49 40
C3F−I C3F−1+LK 69 97増殖の前1日または誘発期間の間に
C3F−1を添加するかどうかにかかわらず、ターゲット細胞を殺す能力の増加
が認められた;しかしながら、最も劇的な効果は、C3F−1がこれらの両者の
期間の間に存在したときに観察された。
単球およびマクロファージの刺激の原因としての汚染するバクテリアのLPSの
可能性は排除された:適用したC3F−1のLPSの含量は低かった( <0.
3ng/ 3000 UのC5F−1、リムルス(Limulus)の変形細胞
のリゼイト(LAL)アッセイによる);活性を抗C5F−1カラムへの適用に
より除去した;ポリミキシンBを使用してLPSを中性した;C3H/HeJマ
ウスからのマクロファージはC5F−1に応答したが、LPSに応答しなかった
。
他のミニロイドC3Fの効果
5μgのLPSの静脈内ci、 v、)投与後5時間に得られた6匹のマウスの
肺から、CSF−GMを調製した。肺を細かく切り、血清不含培地の中で3日間
インキュベーションしそして、WO36104587、前掲、に記載されている
ように、YYG106免疫アフィニティーカラムを使用して上澄み液からC3F
−1を消耗した(C3F−1の含量は227 U/mlから78U/mlに減少
した)。C5F−Gを同様に処理したLDI(黒色腫細胞系)の血清不含培地か
ら調製した。CSF−GMおよびC3F−Gの両者の含量は、コロニー刺激アッ
セイにより、2000U/mlにおいて測定した。
腹腔マクロファージを40%の前述の培地または2000U/mlのC5F−1
で測定したL−細胞培地と1日間インキュベーションし、次いで追加の培地また
はLKと48時間インキュベーションし、そして前述したようにTU5の殺しに
ついて測定した。
結果を第1図に示す。C5F−1はTU5に対する毒性の顕著な増強を示したが
、C5F−GおよびCSF−GMはいずれも効果をもたなかった。
ADCCの刺激因子としてのC5F−1のin vitro試験MIAPaCa
細胞系から精製されたC5F−1(はぼ40%の純度、比活性はぼ2 XIO’
U/mg) 、ネズミL−細胞コンディション培地(比活性はぼ2.3x10
6U/mg) 、およびCV−1からの組み換えヒト(rh)(〉95%の純度
、比活性はぼ4X107)は、IL−2またはアルファー、ベーターまたはガン
マ−IFNと組み合わせて、腫瘍ターゲットに対するマウスのマクロファージの
ADCCを刺激することが見出された。
ADCCのアッセイにおいて、雌のC3H/HeNまたはC3H/HeJ 7ウ
スに1.5mlのプロテ才−スペブトン([fcLlboratories、ミ
シガン州デトロイト)を腹腔内(i、 p、)注射した。3日後、腹膜の滲出細
胞を3X10’個のbig細胞10.5mlアルファーMEM培地+10%加熱
不活性化胎児仔ウシ血清において平行の組のレプリカ1mlのウェルに付着させ
た。2時間後、ウェルをPBSで3回よく洗浄し、そしてC5F−1またはリン
フ才力インを添加し、モして37°Cにおいて2日間インキュベーションした。
細胞集団は形態的に〉95%のマクロファージであり、そして第2日に平行のウ
ェルにおいて回収された細胞数は異なる処理について同様であった。第2日に、
加熱不活性化抗血清(抗Thy 、ウサギ抗マウス脳、Accurate Ch
emicals、 =!−ヨーク州ウつストバーリイ)を、種々の希釈で平行の
組の1つの添加した。
ターゲット、R1,1,7−リンパ腫の細胞系をマクロファージのウェルおよび
マクロファージ±C3F−1、リンフ才力インまたは抗血清を含まない平行のウ
ェルに添加した。
高い濃度(1Hg/ml)のバクテリアLPSはマクロファージのADCCを刺
激するので、ネズミおよびヒトのC5F−1m製物をLALアッセイにより試験
し、そして0.2mg/mlより少ないLPSを有していた。
次いで、10sのR1,1タ一ゲツト士抗血清を導入し、そして生きているター
ゲット細胞を9.24.48および96時間に計数することによって、マクロフ
ァージを3:lのエフエクタm:ターゲットの比でADCCについて試験した。
対照マクロファージ+抗体を伴うR1,1の増殖は、抗体の不存在下に対照また
はサイトカイニン処理したマクロファージの増殖、あるいはR1,1単独士抗体
士サイトカイニンを伴う増殖のそれと同一であった。結果を表3に示す。
表3
培地 0 0 0
M−C3F 0 0 0
IFN−ガンマ−44±5 63±3 72±3本ADCC殺し%= 100(
y−x)/y1 ここでy=ツタ−ット細胞の数−抗血清、そしてX=ターゲッ
ト細胞の数+l : 20.000希釈の抗血清。
rFN−ガンマを5U/mlで使用した。
IFN−アルファおよびIFN−ベータは5OU/mlにおいて5U/mlのI
FN−ガンマと同一のADCC−刺激作用を有した。IFN−アルファおよびr
FN−ベータは5OU/mlにおいてADCCに対する作用を本質的にもたない
か、C5F−1の存在下に腫瘍の殺しを5OU/mlの各々[FNの単独を使用
して見られるレベルに刺激した。同様な作用はrhIL−2で見られた:5U/
ml5U/マクロファージを2日間処理すると、マクロファージのADCCか有
意に促進された。C5F−1はこの強いIL−2誘発された活性を適度に増強し
た。しかしながら、IL−2はIU/mlまたは0゜2U/mlのより低い無効
の濃度で使用したとき、C3F−1の添加は殺腫瘍活性について強い増強作用を
示した。
他のリンフすカインをADCCの一次的刺激因子として試験した。l。
lOまたは100 U/mlのrhTNF単独と共に、あるいは100OU/m
lのC3F−1と共にマクロファージを2日間インキュベーションすると、AD
CC活性は有意に誘発されなかった。rhIL−1アルフアまたはベータは0.
2〜50U / mlにおいて、そしてネズミrlL−4はl−100U/+n
lにおいて、やはりADCC単独でまたはC3F−1とともに刺激しなかった。
C3F−Iの代わりに使用することかできる他のコファクターを発見することを
試みた。ネズミrGM−CSFおよびrlL−3は、10.100または100
0U/mlにおいて試験したとき、ADCC単独またはIFN−ガンマとともに
マクロファージの標準的2日の予備処理において、C3F−1と対照的に、促進
しなかった。これらのサイトカイニンは、培地の中で2日間インキュベーション
した後、マクロファージの不存在下にR1,1ターゲツトの増殖について作用を
もたなかった。
in vitroターゲッテッドADCCアッセイ末梢血液のマクロファージへ
のC3F−1の作用を研究して、C5F−1を使用する予備処理がターゲラテッ
ドADCCを増強することができるかどうかを決定した。
ヒトエフェクター細胞をスタッフォード大学の血液銀行(StanfordUn
iversity Blood Bank) (カリフォルニア州パロアルト)
から入手したドナーのバフィーコートから単離した。単核細胞をフィコール−ハ
イバーク(Ficoll−Hypaque)分別遠心により分離した。付着性単
核細胞(AMC)を単離するために、全単核細胞を24ウエルの組織培養プレー
トの中にプレートし、そして37°C,5%co、において30分間付着させた
。付着しない細胞を加温したバンク均衡塩溶液および50Mg/mlのゲンタマ
イシンで洗浄除去した。すべてのエフェクター細胞の調製物の生存可能性はトリ
ブタンブルー色素の排除により〉95%であった。付着性単核細胞をFITC抗
LeuM3(Beeton Dickinson、カリフォルニア州マウンテン
ビュー)で染色し、そしてEPIC3V細胞ソーターで〉85%のLeuM3陽
性であると分析された。
抗体のへテロ接合体113PIF(ab’)z−3G8F(ab’)、 、肺癌
関連抗原およびヒトFcRII[(CD16)の両者を認識する化学的に連結し
た抗体、およびハイブリッドのハイブリドーマ由来の二重特異性抗体2B1(こ
れは抗CD16および抗erbB−2の活性を有する)を次の実験において使用
した。これらの抗体の両者は、エフェクターとしてヒトの全体単核細胞を使用し
て、5K−Br〜3−ターゲット細胞のすぐれた特異的溶解を仲介する。
ADCCアッセイの1日前に、T75フラスコの中にターゲット細胞(50%の
フンフルエンド)を25m1の培地の中て62.5μCiの3Hチミジン(Ne
w England Nuclear、 6.7μCi/μC上ル)て標識した
。30時間後、細胞をフラスコの中でトリプシン処理し、そして3回洗浄した。
40.000/ウエルの標識したターゲット細胞をアッセイに使用した。
エフェクター細胞、抗体およびC5F−1を希釈するためにアッセイを通じて使
用した培地は、8[11Mのグルタミンを含むAIM、 V血清不含培地(Gi
bco)であった。最終の合計の体積は1m1/ウエルであった。
C3F−1の処理のために、C3F−1を含むか、あるいは含まない培地をエフ
ェクター細胞に添加し、そして2〜3日間インキュベーションした。次いて、抗
体および標識したターゲット細胞を添加した。3日後に、上澄み液の中のトリチ
ウムの解放をシンチレーション流体としてのシトシント(CytoscintX
ICN)を用いて測定した。
各試料を各実験において4平行において試験した。平行のウェル対ウェルの変動
は通常平均値の±20%より小さかった。平行の平均のトリチウムの解放を使用
して、式: (平均の試料の解放−自然的解放)(最大の解放−自然的解放)に
より、特異的溶解%を計算した。
自然的解放を測定するために、標識したターゲット細胞を培地単独の中でインキ
ュベーションし、そして上澄み液を3ヨ後に計数した。
ターゲット細胞からのトリチウムの自発然解放(エフェクター細胞の不存在下)
はすべての実験において平均して10%より小さかった。
ターゲット細胞単独とインキュベーションしたとき、抗体およびC5F−1のい
ずれも自然的溶解を増加しなかった。最大の解放を測定するために、標識したタ
ーゲット細胞を0.5%のSDSの最終濃度で溶解した。
ヘテロ接合体の113PIF(ab’ )z−3G8F(ab’ )2力月μg
/mlにおいて2つのドナーからのAMCて溶解を仲介する能力を、第2図に示
す。
AMC十へテロ接合体を5K−Br−3に対して20:lのEAT比で試験した
とき、観測された平均の抗体依存性溶解は28%であった。第2図に示すように
、エフェクター細胞を14%g/mlのC5F−1と予備インキュベーションし
たとき、ヘテロ接合体仲介の溶解はほぼ110%だけ増強された。
合計の11ドナーからの付着性細胞を二重特異性抗体2B1のF(ab’ )2
断片を使用して試験した。ヒトAMC上のFcRIおよびFcRI Iの起こり
得る参加を回避するために、2B1のFcRI Iをこの研究において全2Bl
の代わりに使用した。(2B1の2つの親の抗体、 520C9および3G8の
F(ab’)z断片は特異的溶解を仲介しないが、2B1のF(ab’)、がタ
ーゲット細胞のほとんど完全な溶解を引き起こすことを示すために、さらに実験
を実施した。)CSF−1の作用を10−100 ng/mlのにおいて研究し
て、C3F−1か2B1のF(ab’ )zにより仲介される溶解の増大におい
て有効であるかどうかを観察した。14〜100 ng/mlのC3F−1と予
備インキュベーションしたAMCは、C5F−1を使用しないAMCの予備イン
キュベーションより高い特異的溶解を与えた(第3図)。
得られたターゲット細胞の溶解の合計量はドナー毎に変化したが、C3F−1処
理を使用する比溶解活性の増加はすべての単球調製物において再現性があった。
応答性が最小であるか、あるいは応答しないドナーのAMCを刺激するためには
C5F−1のより高いレベルが必要であるので、C3F−1の投与量の応答の研
究は100 ng/mlの281のF(ab’>2を使用して実施し、そして結
果を第4図に示す。281のF(ab’ )2の導入前に、AMCを増加する濃
度のC5F−1と予備インキュベーションすると、10ng/mlので開始して
、より高い特異的溶解か得られ、そしてすべてのドナーにおいて100 ng/
mlにおいてなおプラトーとなcv−i細胞系から組み換え的に生産されたC5
F−1(C158)(LALアッセイ;2BのLPS /ml、8ngのLPS
/mgのC3F 、2 Xl、0” U/mg)を、7日前にMethA肉腫
を皮下的に移植した20gのマウス(3匹のマウス/群)の中に、50gg/投
与で1日2回5日間i、 p、注射した。
C3F−1処置の開始後6日間、3匹の未処置および3匹の処置したマウスを体
重および腫瘍の体積に一ついて評価した。体重の変化により測定して、毒性の証
拠は存在し2なかった。第7日に、各群からの1匹のマウスを比較組織病理学的
分析のために殺した(全体の徴候なし)。4匹の残りのマウスをMethAのモ
デルにおいて通常14日間評価した。結果を下表4に示す。
表4
処理 %
Day C3F−1緩衝化生理食塩水 ΔTV処理腫瘍体積の平均の変化(ΔT
V) ΔTV対照3 2.0 2.2 91
6 2.0 6.8 38
7 4.1 8.0 51
8 5.7 11.0 52
+4 13.9 29.4 47
ΔTV=マウスの単一群内の示された日における平均の腫瘍体積/第0日におけ
る平均腫瘍体積の比
結果が示すように、C5F−1仲介の効力が、とくに第6日の腫瘍体積の測定に
おいて、存在した。C5F−1群と対照群との間の差は、処置の開始後最初の7
日問およびその後7日間最大であり、その後腫瘍はその通常の増殖速度に戻った
。これらのデータが示唆するように、多数回の毎日投与(より長い期間の間、こ
の投与レベルにおいて効力を改良するための連続的注入)またはより高い投与レ
ベルおよび薬物なしの日を含むように変更したスケジュールは効力を増強するで
あろう。
同様な結果は、E、 coliからノLCSFcマ190 、およびLC3F/
cマ221を使用して見られた。プロトコルは5匹のマウスの群を使用して実施
した:50μg/50g各生産物を使用し、そして投与(1日2回、5日間)は
類似しタカ、タタしE、 coli (7)CV150おヨヒcマ19゜の物質
を使用し、ここでスケジュールを10日に増加し、そして投与を7〜8時間に間
隔にした。各C5F−1誘導した物質について、ΔTV処置/ΔTV対照の百分
率として、結果を表5に表す。
CSF−1を816の実験的転移のモデルにおいて試験して、肺の転移の予防へ
の効果を評価した。
lXl0’腫瘍細胞を0.2mlのCa”およびIJg +!不含のHBSSの
中に懸濁させ、麻酔しないマウスの横の尾の静脈に接種した。腫瘍の接種後、肺
および脳を取り出し、水の中にリンスし、そして秤量した。
ボウイン(Bouin)溶液の中で固定し、そして表面の腫瘍の節の数/肺の対
を解剖スコー9の助けにより決定した。
組み換えヒトC3F−1(Nマ3C221)をすへての実験について使用した。
C5F−1は各実験の前に凍結ストックから新しく準備し、そして注射直前に米
国薬局方0.9%の生理食塩水の中で希釈した。C5F−1を1日1回(QD)
X10日のスケジュールで静脈内に供給した。使用する投与量のレベルは次の
錠剤に記載されている。非特異的および非治療的タンパク質から成る陰性の対照
として、米国薬局方ヒト血清アルブミン(HSA)または沸騰したC5F−1を
使用した。C3F−1を30分間沸騰させてC5F−1活性を不活性化した。
表6に示す効力のデータが証明するように、lXl0’腫瘍細胞の静脈内接種3
日前に開始した、QDXIOで静脈内に与えたC5F−1は、肺の転移のメジア
ン数の有意な減少を生成する。対照的に、C5F−1の治療を腫瘍細胞接種後1
日に開始した場合、肺の転移のメジアン数の有意な減少は観察されなかった。致
死率により測定した、明白な毒性はこの投与量レベル(2,5〜5.0)におい
て観察されなかった。
表6
肺転移のメジアン数
群 投与量 治療開始日 (範囲)
8この群と対照との間の差はp = 0.002において有意である(Mann
−Whj tney)。
第2の実験において、C3F−1をi、 V、 gpx 5投与した。B16−
WIO腫瘍細胞を短時間の1分のトリプシン処理により収穫し、遠心し、次いで
CaおよびMg不含のHBSS中の単一の細胞懸濁液として調製した。
第08に、0.8 XIO’細胞をマウス当たりに0.2011の合計の体積で
横の尾の静脈に注射した。C5F−1(E、 co1iNマ3Cマ221)処理
(0,25〜5、0 mg/ kg/日)を、第一3日に開始して、QDX5.
i、 v、投与した。第14日に、マウスを殺し、肺を取り出し、水の中でリ
ンスし、次いでボウイン固定液で固定した。表面の腫瘍の節を解剖スコープの助
けにより計数した。表7に下に示すように、C5F−1は、1.0゜2.5また
は5.0 mg/kg/日、QDX5でi、 V、投与したとき、肺の転移のメ
ジアン数を有意に減少した。
表7
群 投与量 メジアン 肺転移の数(個々の値) p−値80、000の腫瘍細
胞i、 V、第0日処置: HSAまたはM−CSF QDX 5、第3日に開
始10BDF−1マウス/群、第4日に殺す次の実験は、i、 v、投与すると
きのC5F−1と等しく有効である皮下(s、 c、)または腹腔内(i、 p
、)のルートによりC3F−1を投与できることを示す。
腫瘍細胞は上に教示されるように調製した。第0日に、7.5X10’細胞をマ
ウス(5〜10匹の雌のBDF−1マウス/群)当たりに0.2mlの合計の体
積で横の尾の静脈に注射した。C3F−1を5 mg/ kg/日で、第一3日
に開始して、QDX5.3つの異なるルートで投与した。第18日にマウスを上
に教示するように調製した。結果を下表8に示す。
表8
肺転移の数
群31 投与経路 メジアン 個々の数2、 M−C3F i、 V、 1.0
0.0. l、 10.303、 HSA i、 p、22.0 16.17
.22.33.344、 M−CSF i、p、 1.0 0.1.1.3.4
’5、M−C3F s、c、 2.0 0.1.2,2.9’8、 M−CSF
i、v、 2.0 0.0.0.1,1.3.4.4.6.33’9、M−C
3F s、c、 2.5 0,0,0,2.2,3.3.4.4.72’6群6
〜9は群1〜5からの別の実験において使用したb p−値は適切なISA対照
と比較して0.05より小さい次の実験は、アルゼト(Alzet)浸透圧ポン
プおよび皮下ポーラス投与を使用して皮下的に実施した連続的注入により投与し
たC3F−1の効力を比較する。C5F−1をS、 C,ポーラスとして、ある
いは0.9%のNaC1中の連続的注入として投与した。連続的注入をS、 C
,移植したアルゼトボンブ、1003Dffiおよび2001型(これらはC5
F−1を、それぞれ、第3日または第14日に供給した)を使用して実施した。
1003D型ポンプは1μm/時の平均ポンピング速度および87μmの平均充
填体積を有する。ポンプの移植のために、BDF−1雌(18〜20g)をメト
ファン(Methofane)で麻酔し、そして小さい背中の切開を皮膚の中に
作った。ポンプは皮膚の下に切開から離れた方向をさす流れモデレータ−ととも
に移植した。切開を創傷のリップで閉じた。すべての治療は第一3日に開始した
。
第0日に、7.5 X IO’B16−WIO腫瘍細胞をマウス当たりに0.2
mlの合計の体積で横の尾の静脈に27ゲージの針を使用して注射した。第18
日に、マウスを殺し、肺を取り出し、水の中でリンスし、次いでボウイン固定液
で固定した。
表9に示すように、S、 C,連続的注入により0.25mg/ kg/日程日
程像い投与量で投与したC3F−1は肺転移のメジアン数を減少するとき高度に
有効であった。
これらの研究が示唆するように、C5F−1は、S、 C,連続的注入により投
与したとき、1日1回S、 C,ポーラスにより同一期間にわたって与えた同一
投与量より、少なくとも10倍以上効力かある。
表9
マウスにアセルゼト浸透圧ポンプを皮下的に移植した。
この実施例は、C5F−1およびIFN−γの外に、ある数のサイトカイニンを
腫瘍細胞の細胞障害性の増強について試験した。単核細胞(MNC)を、正常の
健康なボランティアのヘパリン処理した静脈の血液またはバッフィコートから、
リンパ球分離媒質上の密度勾配遠心(LSM−Organon Teknika
Copr、、ノースカロライナ州ダーハム)により分離した。次いてMNCを
PBSで2回洗浄し、そして49.2%の等張パーフル(Percoll)(P
harmacia)上に層状にしそして1500Xgで25分間遠心した。界面
における単球(細胞遠心調製物の形態学的分析により280%の純度の単球)を
収穫し、モして37°Cにおいてプラスチックの付着によりさらに精製した。付
着を96ウエルのプレートの中で1.2 XIO’細胞/ウェルの密度で実施し
た。11時間後、非付着性細胞を激しい洗浄により除去して、はぼlXl0’細
胞/ウエルの残した。
精製された単球を、C5F−1(E、 co1iNマ3Cマ221)、IL−1
,TL−3,IL−4゜GM−CSF (すべてGenzyme Corp、か
ら) 、IL−2(Cetus Corp、)を含有する0、1%のFe2 、
または培地単独(1’誘発)の中で3日間培養した。3日後、単球を洗浄し、次
いで2°誘発因子とさらに2日間インキュベーションした。C5F−1の存在ま
たは不存在下の1°誘発をいくつかの実験においてフラスコの中で実施した。単
球を組織培養フラスコの中で実施した。単球を直接組織培養フラスコの中で付着
させ、非付着性細胞を除去し、そして1°誘発因子を添加した。
10誘発後、単球をトリプシン処理およびおだやかな引っ掻きにより収穫した:
生存可能な細胞の計数をトリパンブルーの排除により実施し、そしてlXl0’
細胞/ウエルをプロトコルの残りの2日のために96ウエルのプレートの中でプ
レートした。
WEH1164殺腫瘍アッセイ(Colottaら、J、Immunol (1
984) 132 ;936)を使用して、サイトカイニンの細胞障害性を試験
した。簡単に述へると、活性な対数期のWEH1164ターゲット細胞をアクチ
ノマイノンD (actD)でlμg/mlにおいて3時間処理し、洗浄し、そ
して200μCiのG I Crて標識するか、あるいはactDおよびslC
「で1時間37°Cにおいて5%のC02の中で同時に処理した。単球から10
0μlの培養上澄み液を除去した後、標識したターゲット細胞を100μlの体
積のエフェクター細胞に添加して、特記しない限り、10:lのエフェクター/
ターゲットの比を達成した。細胞を200μlの体積で5%の002の中で37
°Cにおいて6時間インキュベーションした。
次いでプレートをテーブルトップのスウィンギングバッヶットの遠心機で120
0rpmにおいて5分間遠心した。100μmの上澄み液を各ウェルから除去し
、そしてガンマカウンターで計数した。
P815ターゲット細胞を同様に処理したが、ただしアクチノマイシンDの予備
処理を省略し、そしてターゲット細胞およびエフェクター細胞を同時に18時間
インキュベーションした。
誘発された細胞障害性%は、次の式を使用して計算した:(実験のcpm−自発
的cpm) / (最大のcpm−自発的cpm)] x 100ここで、
実験のcpm =エフェクター細胞+ターゲット細胞+誘発因子自発的cpa+
=エフェクター細胞+ターゲット細胞+培地最大のcpm = 1%のSDS
で溶解したターゲット細胞単独結果を表IOおよび11に示す:
誘導のプロトコル
1、 培地 C5F−I C5P−1
2、C5F−I C5F−1培地
実験2 12% 49% 37%
実験3 4% 8% 5%
実験4 7% 19% 9%
C5F−1により誘発される活性のレベルは可変であるが、4oのこのようなド
ナーのうちの16はC3F−1単独で刺激したとき10%〜49%の増強された
殺腫瘍活性を示した。
表11. C3F−1を種々の2°誘発因子の添加前に10誘発因子として使用
した。
2°刺激 10刺激 M−C3F、 10000/ml培地対照 2
M−CSF 100OU/ml 1 11LPS lμg/ml 4 26
[FN−710/ml O7
IFN−71000/ml 2 13
LPS lμg/ml+
IFN−7(10/ml) 11 29LPS jμg/ml+
[FN−γ(10001011) 7 49LPS lμg/ml→
PMA 2og/ml 22 53
LPS 10gg/ml+
PMA 2og/ml 24 45
[L−25OU/ml 2 5
[L−25000/ml 2 7
2°誘発因子として試験しモしてC3F−1の存在または不存在下に効果をもた
なかった他の因子は、500 U/mlまでにおいてIL−1゜IL−3,IL
−4およびGM−CSF を包含した。
ネズミ抗ウィルス活性のin vitro刺激付着性チオグリコレート誘発マク
ロファージをC5F−1と3日間インキュベーションし、そして■S■で一夜感
染させた(Lee、 M、T、ら、J、 Immunol(1987)138:
3019−3022) o表12は、付着したままである細胞の550nmにお
ける吸収により測定した、結晶の紫色の染色を示す。
表12
培地/ウィルスなし 0.346±0.02培地+ウイルス 0.170±0.
02CSF−1,1000U/+nl+ウィルス 0.264±0.02CSF
−1,2000U/ml+ウィルス0.356±0.04したがって、CSF〜
1処理した細胞はvS■に対するマクロファージの保護を示す。
CMVの感染のC5F−1によるin vivo処理異壓交配したCD−1マウ
スをCV−1細胞系から生産されたC5F−1(C158)で400mg /k
gSi、l)、の投与量で、1日1回5日間、致死投与量より少ないサイトメガ
ロウィルス(CMV)で感染2日前に開始して、処置した。マウスを感染後第3
日に殺し、そしてターゲットの器官、例えば、膵臓におけるウィルスの複製の程
度をプラークアッセイにより評価した。結果が示すように、C3F−1で処置し
たマウスは、生理食塩水で処置した対照マウスと比較して、有意に低下した(5
7.8%の減少)膵臓のウィルスの力価を有し、CMVの感染はC3F−1処理
したマウスにおいて厳しくない。
第2の実験において、20gのBa1b/Cマウス(5匹/群)を、最後のC5
F−1の投与後4時間に、致死量より少ない量のOICMV(2X 10’pf
u/マウス、i、p、)で感染させた。C3F−1を1日1回4日間、4つの投
与量のレベル(3,6,0,9,0,23および0.06[Dg/ kg/日)
でi、 11.投与した。この亜急性の感染のモデルにおいて、マウスは、感染
後7日で血液および器官(膵臓、肝臓および腎臓)の中のウィルスの力価(マウ
スの胚細胞上のプラーク形成単位)を測定することによって、感染のひどさにつ
いて評価した。C5F−1で予備処置したマウスは、膵臓、腎臓および肝臓の中
のウィルスの力価を、生理食塩水で処置した対照に比較して75〜97%の減少
を示した(P<0.01)。
C5F−1の作用は投与量依存性である。3.6.0.9.0.23および0.
06o+g/ kg/日のC3F−1の投与量において、それぞれ、97.8.
95.3.80.9および63.1%の平均膵臓ウイルス力価の減少が表13に
示すように観測された。
平均ウィルス力価(減少%)。
3.6 16.0+2.1(97,8)’ 17.5+′2.5(92,1)’
2.5+Z5(95,7)’0.9 32.9±6.4(95,3)’ 35
.0±10.0(84,3)ゝ 17.5±Z 5(69,6)’0.2313
5.0±25.0(80,9)’ 97.5±IZ5(5a2)’ 7.5±7
.5(87,0) ’0、Ofi 260.O+25.0(63,1) 90.
0+5.0(59,6)’ Z5±0(56,5)a=データは個々に測定した
5匹の動物からの平均の器官の力価を表c=p<0.05
別々に、E、coli (Nマ3Cマ221)の中で生産されたC3F−1を致
死的mCMV感染のモデルにおいて試験した(これはCMVの致死的投与量より
少ないCMVを使用する上の実験と対照的である)。50μg 10.0051
1IlのC5F−1を13.5〜14.5 gのBa1b/ C7ウスに第一1
日または第一1、 0. 1. 2および3日に(与えた単一の投与量/マウス
)ウィルスの対抗前に(4X 10Spfu/マウス、0.2ml i、p、)
および7日後に投与i、p、I、たとき、表14に示すように、生理食塩水で処
置した対照と比較して、生存率の有意の増加が存在した。
対照 3/10
急性の感染のモデルにおける予防的作用について、13〜14gのBa1b/
Cマウスを致死的投与量のmcMV (5X 10’ 〜2 x lo’pfu
/ マウス、i、 p、 )で最後のC5F−1投与量(0,9mg/ kg/
日〜7.2mg /kg/日の投与量のレベルを使用する)後4時間に感染させ
、そして生存を14日間監視した。この急性の感染のモデルにおいて、第5図に
示すようにC3F−1は50.0001)fu /マウスで対抗したマウスにお
いて生存率を有意に増加したが、C3F−1のより低い投与量(0,9mg/
kgおよび3.6mg/kg)は100.000pfu/ 7ウスにおけるmc
MVで対抗したマウスにおいて効果に劣るように思われた。
これらのデータが証明するように、C5F−1は臨床医学においてウィルスの感
染に対する免疫予防剤として使用することができる。C3F−1は単独でまたは
他のリンフ才力インまたは抗ウィルス剤と組み合わせて一般にウィルスの感染の
処置において使用することができ、そしてとくに免疫抑制のウィルスの感染、例
えば、後天性免疫欠損症候群(エイズ)において利益である。
好ましいi、 p、投与量の範囲は約0.05〜8.0mg / kgのC5F
−1/vウス/日である。
C3F−1によるバクテリアの感染のin vivo予防的処置異型交配のCD
−1マウスに、CV−1細胞系(短いクローンCV 158)から生産されたC
3F−1を個々に投与し、宿主の中に導入したときグラム陰性セブシスを引き起
こすの原因となるバクテリアのE、 coli(SM18)の臨床的分離物の致
死的投与量(LD、。。6 x 107cfu)で対抗する1日前に、1回投与
i、p、L、た(10μg/投与)。次いでマウスを感染後7日間生存について
監視した。
この実験は、また、 LCSFNマ3Cマ221のバクテリア的に生産されたC
5F−1を使用して実施した。C5F−1の各ロットをlXlO7〜1.7×1
08単位/kg体重の合計の投与量範囲で4倍の希釈で試験した。
最小の保護的投与量をE、 coli (6x 10”cfu/ 7ウス)のi
、 I)、感染前の単一の1日量として定義し、この投与量、生理食塩水または
沸騰したC5F−1の対照マウスに比較して、処置したマウスの生存率の統計学
的に有意の(0,05フイツシヤーの抽出物試験より小さいp値)増強を生成し
た。
5aline 0
C3F−12,97mg/ kg 100CSF−10,74mg/ kg 9
0CSF−10,18mg/ kg 10煮騰した”’C5F−12,97mg
/kg O煮騰したC5F−10,74mg/ kg 20煮騰したC5F−1
0,18mg/kg Oa データは感染後第7日に生存する動物の%を表す。
b 加熱不活性化した対照。
宿主の耐性へのC5F−1の作用の誘発に対する投与のスケジュールの効果を研
究するために実験を実施した。マウスの群(10匹)にC3F−1を0.9mg
/kg/投与7日で第1. 2. 3. 4または5日に投与した。次いで、
マウスをE、 coli (6x 10”cfu/ マウス)i、p、で、最後
のC5F−1注射後4時間に、対抗した。
保護的作用を誘発するためには、表16のデータが示すように、バクテリアの感
染の52〜100時間前に開始するC5F−1の多数回の投与は有効である。
C5F−1° l&** 第7EI(D 益゛投与のスケジュール の時間ゝ
生存率6QDX 1 4 10
QDX2 28 10
QDX3 52 60 <0.05
QDX4 76 90 <0.01
QDX 5 100 100 <0.01Saline 76 0 −
”〜10匹のマウスの群を、最後のC3F−1投与量4時間においてE、col
iの感染前にC5F−1でi、 I)、処置した(0.9mg/ kg/投与投
口7日1. 2. 4または5日間(すなわち、QDXI〜QDX5)。
b=C3F−1の最初の投与とE、coliの感染の時間との間の時間。
°=感染後第7日に生存する動物の百分率を表す。
d=フィッシャー抽出物試験による、生理食塩水の対照群との比較。
感染の4.18.28.52または76時間前の単一のポーラスの注射(0,2
〜9.0mg /kg)は、増強された宿主の耐性を誘発するとき、有効ではな
かった。
データが示すように、C5F−1を使用する予備処置は致死的投与量のE、co
liで対抗したマウスの生存率を有意に増大する。しかしながら、この効果はC
3F−1の投与量、タイミング、および投与のスケジュールに依存する。はぼ0
.7〜3、Omg /kg/日のより高い投与量において、はとんど完全な保護
が見られた。0.2mg/kgのより低い投与量において、また、保護が存在し
たが、効果は小さかった。
白血球減少症のモデル
C3F−1は、somg/kgのシクロホスファミド(CY)で予備処置したマ
ウスにおけるIl:、coliの感染に対する保護を誘発した。マウスについて
のLD、。は約400 mg/kgであり、より低いCYの投与量はLD、。の
l/8を表す。この投与は、38早<i、p、注射したとき、合計の白血球およ
び好中球お減少を誘発し、そしてマウスをE、coliの感染に対していっそう
感受性とした(例えば、3 x 107cfu/マウスを使用する感染は、CY
処装したマウスの100%を殺したが、このCYを投与しなかったマウスの20
%のみを殺した)。CY処装したマウスにC5F−1を与えたとき(CSF−1
,0,89mg/kg、1日1回、4日間、i、 p、 )、10096の生存
率であったが、その代わり生理食塩水を与えたマウスの生存率は30%であった
。
C3F−1を異型交配のCDIマウス(27〜28g、雌)に、致死的投与量の
カンジダ・アルビカンス(C,albicans) (1,5xlO”酵母菌細
胞/マウス、i、 p、 )で対抗する3〜4日前に、毎日投与した。この対抗
は、処置しないマウスおよび生理食塩水で処置したマウスにおいて、3.0日の
メジアン生存時間(MST)を生じた。C3F−1処置したマウスは、1.9お
よび0.1mg/kgの投与量において、それぞれ、15および13日のMST
を示した。生存時間のこの4倍の増加はp=0.01(対数範囲試験)において
有意である。内毒素からの妨害の可能性を最小とするために、内毒素を事実土倉
まない(< 0.05ng/ mgのタンパク質)高度に精製したC5F−1を
使用した。また、予防作用はC5F−1の試験物質の加熱不活性化により除去さ
れることが示された。
この保護は、末梢血液の循環する単球および好中球の数の増加および腹膜のマク
ロファージの2〜3倍の増加に関連した。したがって、C5F−1はカンジダ・
アルビカンス(C,albicans)の感染に対する宿主の耐性を増強し、そ
してこの作用は多分マクロファージおよび好中球の活性化により仲介される。
C5F−1をまた追加のモデルにおいて試験し、ここでカンジダ・アルビカンス
(C,albicans)を全身的(i、 v、 )に供給した。C3F−1は
1.9mg/kg/日の投与量QDX4においてi、 p、またはi、 V、投
与した。
C5F−1の最後の投与後4時間に、2 x 10’cfu/ 7ウスをi、
v、注射した。これらの投与のいずれも、生理食塩水を注射した対照マウスと比
較したとき、生存率の有意の増大を生じた。
C3F−1の処置後の菌類の感染のラットの生存時間抗ウィルス剤のフルコナゾ
ールと組み合わせてC5F−1を使用して、与えたC3F−1の毎日のポーラス
の皮下(SQ)注射は感染した動物のメジアン生存時間をラットのカンジダ症の
モデルにおいて5日(フルコナゾール単独を与えた動物において)から30日以
上(CSF−1およびフルコナゾールの組み合わせを与えた動物において)治療
的に改良した。
雄のフィッシャー (Fisher)−344ラツト(体重2oo〜250g)
を千ャールス・リバーラボラトリーズ(Charles River Labo
ratories)から入手した。ラットを5匹/ケージで収容し、そして水お
よび実験室の餌を任意に与えた。付随的ウィルスおよびマイコプラズマについて
の血清学的試験は、これらの動物において日常的に陰性である。
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type
Culture Co11ection)(vリイランド州ベセスダ)からのカ
ンジダ・アルビカンス(Candida albicans)株ATCCNa1
8804を、37°Cにおいてトリブチカーゼ大豆ブロスの中で一夜増殖させ、
次いで遠心分離した。芽状胞子を再懸濁させ、そして95%の胎児子ウシ血清お
よび5%のジメチルスルホキシドの中にアリコートを取り、そして−80°Cに
おいて凍結した。各実験の日に、2つのアリコートをプールし、次いて注射のた
めにリン酸塩緩衝液(PBS)の中で4X10’芽状胞子/mlに希釈した。各
実験の接種を酵母エキスペプトン寒天上にプレートシて。生存可能な有機体の計
数を確証した。
フィッシャー−344ラツトを2X10“のカンジダ・アルビカンス(Cand
ida albicans)の芽状胞子(0,5m1)で横の尾の静脈の中への
i、 V、注射により感染させた。C3F−1の作用の研究において、単一の0
、3mg/ kgの投与量のフルコナゾール(Diflucan、 Pfize
r、ニューヨーク州ニューヨーク)を2時間後に皮下(SQ)投与した。フルコ
ナゾールの処置後直ちに、0.5mlのSQ投与量のC5F−1を異なる部位に
与えた。C3F−1の処置は10回の合計の投与でさらに9日間続けた。
動物を30日間毎日死亡率について評価した。
未処置のフィッシャー−344ラツトにおいて100%の死亡率を生成するため
に必要なカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の投与
量は、2X10’芽状胞子であると決定された(表17)。この投与量は3〜6
日で死亡を生じ、メジアン生存時間は4日であった。
表18は、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の感
染後C3F−1の治療的SQ投与とフルコナゾールを組み合わせた、4回の実験
の結果を表す。0.3および1.0 mg/kg/日のC3F−1の投与量は最
も効力かあるように思われ、対照動物のメジアン生存時間(5日)より少なくと
も6倍の、〉30日のメジアン生存時間を生ずる。
表17
カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)で感染したフィ
ッシャー−344ラツトの死亡率の表1.25 5 0 >30
2.5 5 20 >30 5.0
5 16 38 >30 5.0
10 16 88 4 4.4
20 50 100 4 4.4
40 51004 4.4
100 8 100 2 2.8
330 8 100 1 1.5
表18
カンジダ・アルビカンス(Candida albiear+s)で感染したラ
ットにおけるC3F−1およびフルコナゾールの治療的使用した。すべての動物
に、注射後2時間で0.3 mg/kgのフルコナゾールの一回投与を行った。
ND、データなし
C3F−1を使用する菌類の感染の消散15人の治療に対して抵抗力のある侵入
性の菌類の感染をもつ患者をC3F−1で処置した。骨髄移植(BMT)センタ
ーと呼ぶ患者は研究に適格であったが、再発性において悪性である患者は不適格
であった。
診断、年令、移植片対宿主の病気(GVHD)の状態または患者の全体の状態に
ついて排除を行わなかった。18人の患者の臨床的特性を表侵入性菌類の感染の
診断は、バイオプシーの標本における有機体の証明、閉じた体液(すなわち、大
脳を髄液)の培養物または陽性の血液培養物の存在下の侵入性の病気について放
射性学の証拠を必要とした。気管支鏡検査の洗浄液、胃腸バイオプシーの標本ま
たは単一の血液培養物の中に存在する菌類のみの証明は、侵入性の病気の不十分
の証拠であると考えた。感染性菌類の有機体、関係する器官、および感染の追跡
に使用した診断の方法を表19に示す。
すべての患者を検査し、そして毎日日常的血液培養物を取り、ならびに血液化学
および完全な血球の計数を毎日実施した。一般に、骨髄の吸引およびバイオプシ
ーを治療の前に実施して悪性を除外した。周期的基準でかつ剖検で初期の診断手
順を使用して、菌類の感染を再評価した。
この研究を相Iの投与量のニスカレーションと表示し、ここで患者を連続的に登
録した。すべての患者を最大の許容され投与量で最良の有効な抗菌的治療で維持
した。C5F−1(比活性、はぼ3〜10×10’ U/mg)を0.05〜2
.0 mg/ rriの投与量で与えた。C5F−1を100m1の0.5%の
アルブミンを含む通常の生理食塩水で中央の静脈カテーテルにより、毎日2時間
の静脈内注入で7日間投与した。7日後、臨床的応答が存在しない場合、投与量
をさらに7日間2倍にした。
3回の投与量のニスカレーションを単一の患者に許した。抗菌剤効力が認められ
た場合、菌類の感染の消散が記録することができるまで、C5F−1を続けた。
2mg/mで処置した患者はその投与量で維持した。
C5F−1はすべての投与量でよく許容された。それに帰することができる特定
の症候または血液化学の変化は存在しなかった。C5F−1の注入の過程の間に
、前取て存在するGVHDのひどさへの有意の悪影11人の患者は侵入性のカン
ジダ症を有し、4人はアスペルギルス症を有し、2人は酵母菌種をもつと診断さ
れ、そして1人はロドトルラ属(Rhodotorula)をもつと診断された
(表19)。3人の患者は、アンフォテリシンBに対して応答しなかった進行性
の菌類の疾患についてのBMTの前に、C5F−1を与えられた。これらの患者
のうちの1人は、アスペルギルス症のために2つの腔(sinus cavit
ies)の切除を実施されていた。しかしながら、CTスキャンは残留する腔の
固まりを証明し、そして吸引の培養物はアスペルギルスを証明し続けた。空洞化
する多葉の肺の節が発生しそして患者カ月mg/mgのアン7すテリシンで進行
的に窒素過剰血症となったとき、C5F−1を開始し、そしてアンフォテリシン
の投与量をo、smg/kgに減少した。
治療の35日後、CTスキャンは腔の除去を示し、そしてアスペルギルスについ
て培養物は陰性となった。2つの最大の空洞の肺の節を除外してすべては消散し
た。両者の節を引き続いて切除し、そして菌類の要素の不存在を示した。患者は
抗菌の治療なしに止まり、無関係のBMTを待っていた。第2の処置された患者
は、BMTの前に、臨床的または放射線学的応答なしでカンジダ・アルビカンス
(Candida albicans)のため(こ2gのアンフオテリシンを与
えられた(肝臓および膵臓を含む)。C3F−1の35回の投与後、改良の顕著
な放射線学的証拠が認められ、そして肝臓を再バイオプシーして、残留する菌類
の感染の証拠はなかった。第3の患者は進行性の肝臓のカンジダ症を有した。彼
女は、28回のC5F−1の投与を受けた後、菌類の感染の臨床的および放射線
学的消散を有した。
18人の患者のうちの13人は、菌類の感染において消散または臨床的改良を示
した(表19)。廃人かの患者は菌類の感染の完全な消散を有し、そして病院か
ら解放された。2人の患者は、感染が除去された後、骨髄の移植を受けるために
十分に良好であった。残りの5人の患者のうちで、1人の患者は評価不可能であ
り、他の患者は侵入性菌類の感染をもっていなかったかも知れないが、肺臓炎の
ために死亡し、そして残りの3人の患者は応答を示さなかったが、C5F−1の
処置を8日間以下受けた。
白血球の計数のin vivo刺激
異型交配のCD−17ウスに、精製されたヒトC5F−1を、2mg/kg/投
与で1日3回、連続する5日間投与した。合計の血球の計数は、生理食塩水で処
置したマウスにおける8、700/μlからC3F−1処置したマウスにおいて
12.000〜13.000μmに増加した。さらに、好中球の計数は生理食塩
水で処置したマウスにおける1、078/μmに比較してC3F−1処置したマ
ウスにおいて6,821μlに増加した。
この作用はC5F−1の投与量および投与のスケジュールに依存する。
末梢血液nO好中球の増加は、単一の投与量のC5F−1を投与i、 p、後、
2〜4時間における検出可能てあった。これらの結果が示すように、C3F−1
の投与は臨床的および獣医学的に顆粒球の生産の刺激因子および白血球の計数の
増大因子として有用である。
創傷の治癒におけるC5F−1
動物のモデルおよびプロトコル、例えば、GoodsonおよびHun t(J
、 Surg、 Res、 、!982.33 : 394)のゴレテックス(
Goretex) ミアチュア創傷治癒のモデルを使用して、C3F−1をアッ
セイし、ここで移植されたゴレテックス管に侵入性マクロファージ、線維芽およ
び他の結合組織の細胞を充填する。治癒を管の内容物を穎微鏡検査により評価す
る。第2のモデルはEisengcrら(1988,PNAS(USA)、 8
5:1937)の切除の創傷治癒のモデルであり、ここで創傷を視的に観察し、
そしてパンチバイオプシーを実施して毛の小胞から生ずる表皮細胞層の数を監視
する。第3のモデルは景勝のモデル、例えば、Fotivら(1987,J、
Pathol、、 151 : 209)の熱損傷した栗丸の景勝てあり、ここ
で治癒を固定した区画において損傷した部位の中皮のリサーフエシング(res
urfecing)の程度により評価する。これらのモデルの各々の教示をここ
に引用によって加える。
一般に、切除の創傷治癒のモデルの参考文献に記載されているように、局所的創
傷のための表皮細胞誘導因子(EGF)を使用して、生理食塩水の中で10’〜
10” U/mlのC3F−1の中で非付着性包帯をソーキングすることによっ
て、C5F−1を創傷の部位に適用する。あるいは、同様な量のC3F−1をゴ
レテックス管の中にGoodsonおよびHunt、前掲、に記載されているよ
うに移植の時に導入するか、あるいはC3F−1をまた遅く解放性のマトリック
スの中に混入し、そして創傷の部位に(ゴレテックス管の中で、または包帯の中
で、遅く解放性のゼラチンまたはコラーゲンに基づくマトリックスの中で、ある
いは腹腔内申の注射により)全身的処置により1211〜3回(1゜■2、i、
p、またはs、c、) to 〜10,000μg/kg/日の投与量で適用
することかできる。
完全な厚さの皮膚の切除のモデルにおいて、5匹の雌のBDF−1マウス(体重
18〜20g)の実験群をメトキシフルランの吸入(Mctofanc。
Pitman−Moore、 Inc、、ニュージャーシイ州りロシング)によ
り麻酔した。きれいな外科的技術を使用して創傷をつくった。透明なテープのス
トリブを背中の上の仙骨と肩骨との間に適用した。皮膚をマウスの長さに対して
平行に持ち上げ、そして完全な厚さの切除の創傷を6mmの直径のボンドを使用
して作った。テープを除去し、左および右の円形の両側の創傷の間において無傷
の皮膚の幅8〜l On++nのストリブを露出した。3成分の抗生物質の軟膏
(ポリミキシンB−バシトラシンーネオマイシン)を新しい創傷に綿の先端のス
パブ捧を使用して適用した。
創傷を手持ちのノギスで前後および横方向の寸法で第0. 1. 2゜3、 4
. 7. 9および10日(第0日は創傷形成の日を表す)。創傷は最初は円形
であったが、楕円形に治癒する傾向があった。この理由で、概算の創傷の面積は
楕円の領域についての式A=l)i(BXC)/4を使用して計算し、ここでA
=領領域mmす、82前後の軸の創傷の直径(mm) 、モしてC=横方向の軸
の創傷の直径(mm)である。各創傷について、任意の所定の時点における面積
を第0日における最初の創傷の面積で割ることによって創傷の閉鎖%を計算した
。
E、 eoliが生産した長いクローンC3F−INマ3Cマ221(比活性〉
6.OX 10’単位/mg)を0.9%の塩化ナトリウム(米国薬局方)の中
に希釈し、そして100μmの最終の注射体積で横の尾の静脈の中で静脈内注射
した。0.5mg/kg/日(10μg/日) 〜10. Omg/ kg/日
(200μg/日)の範囲の投与量のC5F−1を毎日合計7日間投与し、最初
の投与は創傷形成後はぼ4時間に実施した。0.9%のNaC1の中で希釈した
ヒト血清アルブミン(HSA)を非特異的対照として選択し、そして5.0 m
g/kg/日の投与量で対照動物に投与した。
各日に処置の群の間で個々のスチューデント式テストにより統計学的分析を実施
した。すべての比較について、p<0.5のとき、統計学的意味が認められた。
新しい創傷において出血はほとんどあるいはまったく起こらなかった。薄い線維
質の皮膜か12〜24時間以内に明らかとなり、1〜2日以内に5皮に進行した
。5皮は乾燥すると、収縮し、下に横たわる造粒化組織に付着する程度か徐々に
低くなったが、創傷の面積の測定を歪めなかった。各群および日について5匹の
マウスの右および左の創傷の測定値から、平均の創傷の面積を計算した。初期の
創傷の面積は処置群のいずれに間においても異ならなかった。
第6図に示すように、創傷の閉鎖はISA処置した対照よりC5F−1処置した
マウスにおいて急速であり、ここで閉鎖は所定の日における初期の創傷の面積の
減少%として定義される。第6図に記載されている値は各時点における5匹のマ
ウスの平均を表す。C5F−1処置した群はすべての時点において対照と異なっ
た(p<0.05)。「正方形」は対照を表す:「+」はC5F−1を表す(1
0,0mg/ kg/ 日) ;「三角形」はC3F−1を表す(5,Omg/
kg/日):そして「×」はC3F−1を表す(0,5mg/kg/日)。創傷
の閉鎖の最大の増大は10.0mg/kg/日を受け取ったマウスにおいて観察
された。中間の(5,0mg/kg/日)および低い(0,5mg/kg/日)
の投与量のC3F−1は、また、創傷の閉鎖速度を有意に増加したが、これらの
投与量において、2つの応答はほぼ等しかった。
C3F−1処置した創傷において見られた創傷の閉鎖速度の増大は、最初の数日
以内に起こったより急速な初期相から生ずるように思われた。この期間の間に、
閉鎖は表18に示すようにC5F−1によりほぼ40%増大した。その後、すべ
ての群における閉鎖速度はほぼ同一であり、そして創傷が完全に治癒されるまで
、一定して減少し始める。
C5F−1処置したマウスの創傷はH3A処置した対照より1〜2日速く50%
の閉鎖に到達しく第6図)、シかも100%の閉鎖に到達するために要求される
時間をすべての群についてほぼ10日であった。
前辺
対照 ”C5F−1
035゜2 7.5 0.0 344 8.1 0.0 − 0.828+ 2
5.2 6.9 28.4 18.4 3.6 46.6 &4.0 0.01
72 19.4 4.8 44.7 11.6 2.3 66.1 47.9
0.0003 17.4 5.2 50.5 9、OZ4 73.9 46.4
0.0004 11.2 3.7 88.1 7.8 2.6 77.2 1
3.4 0.0375 9.9 al 71.8 5.1 1.9 85.2
18.7 0.0017 5.0 3.1.85.7 2.6 1.0 乾4
7.9 0.04510 0.0 0.0 1CX)、0 0.0 0.0 1
00.0 0.0 −CSF−1をマウスf:3.Omg/kg/日の投与量で
合計7日間、創傷後4時間に開始して、静朋年雫父与した。
次の式で計算した閉鎖の増大:(閉鎖%(処l−閉鎖%(M))AA鎖%(対胛
0第3日から第1O日までの時点において実施した全体の観察において、創傷の
空間を取り囲む皮膚の脈管の含量の変化は対照およびC3F−1形質転換された
創傷における治癒の過程の間に起こることか示唆された。創傷後3日程度に早く
、脈管構造の増加(より大きいかつより曲がりくねった血管)は、対照マウスに
おける創傷部位を取り囲む皮膚の領域において、肉眼により明らかであった。7
日までに、対照の創傷を取り囲む皮膚の脈管の含量は減少したが、C3F−1処
置したマウスにおける創傷を取り囲む皮膚は、創傷を取り囲む面積および創傷の
部位に隣接しない血管の両者において、対照のマウスより有意に大きい脈管形成
を示した。この応答はより大きい数の血管およびより広範な分岐形成の両者を包
含するC5F−1は、また、他の成長因子と組み合わせて創傷の治癒を促進する
ことができ、このような成長因子の例は、表皮成長因子(EGF)、線維芽成長
因子(塩基性および酸性FGF)、血小板誘導成長因子(PDGF)または形質
転換体G−C3F(TGFアルファおよびベータ) 、IL−1,IL−2、血
小板誘導創傷治癒因子(PDWHF)および他の物質、例えば、ソマトメジンC
およびビタミンCである。
C5F−1の配合および投与
組み換え的に生産されたヒトC5F−1を、標準の製剤学的手順を使用して、投
与のために配合することができる。究極的適用に依存して、C5F−1は注射可
能なまたは局所的形態で調製し、そして唯一の活性成分として、あるいは相補的
または同様な活性を有する他のタンパク質または化合物と組み合わせて使用する
ことができる。このような他の化合物は、別の抗腫瘍剤、例えば、化学療法剤、
例えば、アドリアマイシン、またはリンフ才力イン類、例えば、IL−1,−2
、−3、−4および−6、アルファー、ベーターおよびガンマ−インターフェロ
ン、CSF−GMおよびC3F−G 、および腫瘍壊死因子を包含することがで
きる。C5F−1活性成分の作用はこのような個々の化合物の存在により増強ま
たは改良することができる。前述したように、C5F−1は有益な方法で適当な
血球と相互作用することができ、したがって、本発明の化合物はこのような細胞
とC5F−1との混合物を、必要に応じて追加のリンフ才力イン類またはサイト
カイン類の存在下に、インキュベーションすることを包含する。このようなイン
キュベーション混合物の上澄み液の分画、あるいは細胞を含有する全体の混合物
を同様によく使用することができる。食い違いのタイミングはある組み合わせ、
例えば、C5F−1および1〜2日後にガンマ−インターフェロンについて好ま
しいことがある。
ここに記載するC3F−1は、一般に、治療的に0. O1〜10mg/ kg
/日の量で、単一のポーラスの投与または分別して24時間かけて、すへての適
用のために、例えば、感染症、創傷の治癒、骨髄造血および免疫性の回復、およ
び癌のために投与される。
本発明の範囲はここに記載する例示的実施態様により限定されると解釈すべきて
なく、添付する請求の範囲に従い決定されるべきである。
FIG、1
培地 C9F−I GM−C9F G−C3F測定中の培地又は10%リンホト
キシン特異的溶解(%)
特異的溶解(%)
特異的溶解(%)
0 δ ”8 go’o ざ 888
生存率(%)01
国際調査報告
bIn−一鴫−AIthImN@Dr丁ノ11(017%nC)F+ym PO
T/IWIO+fil gram 121118t+21 (1&?+国際調査
報告
US 9106052
S^ 51939
フロントページの続き
(72)発明者 デブリン、ジエイムズアメリカ合衆国、カリフォルニア 94
549゜ラフアイエツト、アッパー ハラピー バレー ロード 1146
(72)発明者 シマーマン、ロバートアメリカ合衆国、カリフォルニア 94
563゜オリンダ、ラ クレスタ ロード 64(72)発明者 オーカーマン
、シャロン リーアメリカ合衆国、カリフォルニア 94620゜オークランド
、ピー、オー、ボックス
(72)発明者 リング、デビット ビー。
アメリカ合衆国、カリフォルニア 94061゜レッドウッド シティ、トラマ
ン ストリート1248
(72)発明者 マ、シルビア シー
アメリカ合衆国、カリフォルニア 94555゜フレモント、ステファノ コー
ト33535
Claims (14)
- 1.ヒトに有効量のコロニー刺激因子−1(CSF−1)を0.5〜50mg/ m2の1日量で投与することを含んでなる、ヒトにおける菌類の感染を治療的に 処置する方法。
- 2.感染が、カンジダ属(Candida)、アスペルギルス属(Asperg illus)、クリプトコックス属(Cryptococcus)、ヒストプラ スマ属(Histoplasma)、コクシジオイデス属(Coccidioi des)、パラコシジオイデス属(Paracoccidioides)、ケカ ビ属(Mucor)、ロドトルラ属(Rhodotorula)、スポロロトリ クス属(Sporothrix)およびブラストミセス(Blastomyce s)から本質的に成る群より選択される少なくとも1種の真菌により生ずるもの である上記第2項記載の方法。
- 3.真菌がカンジダ属(Candida)の種である、請求項2に記載の方法。
- 4.組み換えCSF−1を1種または2種以上の抗真菌剤とともに投与する、上 記第1項記載の方法。
- 5.抗真菌剤がアンフォテリシン(Amphotericin)B、フルコナゾ ール(Fluconazole)、5フルオロ−サイトシン、ケトコナゾール( Ketoconazole)、ミコナゾール(Miconazole)およびイ ントラコナゾール(Intraconazole)から本質的に成る群より選択 される、上記第4項記載の方法。
- 6.菌類の感染が除去されるまで、CSF−1を非経口的に投与する、上記第1 項記載の方法。
- 7.CSF−1をボーラスの注射により、i,v,ボーラスにより、一定の注入 によるか、あるいは連続的注入により皮下投与する、上記第6項記載の方法。
- 8.真菌の感染に対して有効である1日のCSF−1の投与量が0.5〜10m g/m2である、上記第1項記載の方法。
- 9.真菌の感染に対して有効である1日のCSF−1の投与量が0.5〜5mg /m2である、上記第8項記載の方法。
- 10.CSF−1を少なくとも14日間投与する、上記第6項記載の方法。
- 11.CSF−1を少なくとも2旧聞投与する、上記第10項記載の方法。
- 12.CSF−1を免疫抑制した個体に投与する、上記第1項記載の方法。
- 13.エイズまたは他の感染のために、骨髄移植とともにまたは癌の化学療法に おいて与えられる化学薬物のために、あるいは熱傷または他の主要な外傷のため に、免疫抑制された個体にCSF−1を投与する、上記第12項記載の方法。
- 14.ウイルスまたはバクテリアの感染を処置するために、治癒を促進するため に、および腫瘍の苦しみを処置するためにCSF−1を投与することを含んでな る哺乳動物を処置する方法。
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