JP2003292454A - 組み換えコロニー刺激因子−１の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】真菌感染を治療するための組成物を提供するこ
と。 【解決手段】コロニー刺激因子ＣＳＦ−１は細菌性、ウ
イルス性又は真菌性感染、新生物、白血球減少症、創傷
の予防及び治療において、並びに化学療法により誘導さ
れるか又は他の原因による免疫抑制の克服において有用
なリンフォカインである。ＣＳＦ−１は、この蛋白質を
コードするネズミ及びヒトＤＮＡ配列のクローニング及
び発現を含む組換法により使用可能な量で得られる。ま
た、本発明は、組み換えＣＳＦ−１を１種または２種以
上の抗真菌剤とともに含んで成る医薬組成物を提供す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】 本発明は、組み換え的に生
産されたヒトコロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）の種
々の治療的使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】 マクロファージおよび／または顆粒球
への骨髄の先祖細胞の成長および発育を刺激する種々の
組織の中で非常に低い濃度で生産される特定の因子の能
力は、ほぼ１５年間知られてきている。多数の種からの
血清、尿の試料、および組織の抽出物の中のこのような
因子の存在は、半固体の培養培地の中でプレートした骨
髄細胞によりコロニー形成の刺激を測定するｉｎ ｖｉ
ｔｒｏのアッセイを使用して証明することができる。許
容されうるｉｎ ｖｉｖｏのアッセイは存在しない。こ
れらの因子はこのようなコロニーの形成を誘発するの
で、集合的にコロニー刺激因子（ＣＳＦ）と呼ばれてき
ている。

【０００３】より最近、生ずるコロニーの中に見いださ
れる細胞の型に従い定義できるヒトＣＳＦのタンパク質
の少なくとも４つのサブクラスが存在することが示され
た。１つのサブクラスのＣＳＦ−１は、主としてマクロ
ファージを含有するコロニーを生ずる。他のサブクラス
は、好中球の顆粒球およびマクロファージの両者を含有
するコロニー（ＧＭ−ＣＳＦ）；主として好中球の顆粒
球を含有するコロニー（Ｇ−ＣＳＦ）；並びに好中球お
よび好酸球の顆粒球、マクロファージ、および他の骨髄
様細胞の型（好塩基球、赤血球および巨核球）を含有す
る（ＩＬ−３）コロニーを生産する。

【０００４】ＧＭ−ＣＳＦはＧｏｕｇｈら、Ｎａｔｕｒ
ｅ（１９８４）３０９：７６３−７６７に記載されてい
る。このタンパク質はさらに、ＷＯ８７／０２０６０，
１９８７年４月９日公開に、伝統的癌の処置後に癌患者
を処置して白血球を再生し、及び免疫無防備化個体、例
えば、後天性免疫欠損症候群（エイズ）を有する個体に
おけるウイルス、細菌、真菌および寄生生物の感染の可
能性を減少するために有用であると記載されている。ヒ
トＩＬ−３は、Ｙａｎｋ，Ｙ．Ｃ，ら、Ｃｅｌｌ（１９
８６）４７：３によりクローニングされた。

【０００５】前述のヒトＣＳＦに類似するネズミ因子が
存在し、このような因子はすべてのこれらの細胞の型＋
巨核球、赤血球およびマスト細胞を種々の組合せで含有
するネズミ骨髄細胞からのコロニーを誘発する、ＩＬ−
３と呼ぶネズミ因子を包含する。ネズミＩＬ−３は、Ｆ
ｕｎｇ，Ｍ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３０
７：２３３によりクローニングされた。参照、Ｙｏｋｏ
ｔａ，Ｔ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．（ＵＳＡ）（１９８４）８１：１０７０−１０７
４；Ｗｏｎｇ，Ｇ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８
５）２２８：８１０−８１５；Ｌｅｅ，Ｆ．ら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９８
５）８２：４３６０−４３６４；およびＣａｎｔｒｅｌ
ｌ，Ｍ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．（ＵＳＡ）（１９８５）８２：６２５０−６２５
４。これらのＣＳＦおよび他のものは、Ｄｅｃｔｅｒ，
Ｔ．Ｍ．Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３０９：７４６およ
びＶａｄａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８３）１
３０：７９３，Ｃｌａｒｋ，Ｓ．Ｃ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ
（１９７８）２３６：１２２９、およびＳａｃｈｓ，
Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９７８）２３８：１３７４、
に概観されている。

【０００６】Ｇ−ＣＳＦのクローニングおよび発現は米
国特許第４，８１０，６４３号に記載されており、そし
てヒトの口の癌組織からのＧ−ＣＳＦを精製する方法は
米国特許第４，８３３，１２７号に記載されている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】 本発明は、これらの
サブクラスの第１のＣＳＦ−１の構成員であるタンパク
質の組み換え生産に関する。このサブクラスは、さら
に、他のサブクラスの生物学的活性に影響を与えない
で、ＣＳＦ−１の活性を特別に抑制するための特定のラ
ジオイムノアッセイおよびラジオレセプタアッセイによ
り特性決定および描写され、そしてマクロファージ細胞
系Ｊ７７４はＣＳＦ−１に特異的に結合するレセプタを
含有する。これらのアッセイの説明は、Ｄａｓ，Ｓ．
Ｋ，ら、Ｂｌｏｏｄ（１９８１）５８：６３０に発表さ
れた。

【０００８】一般にＣＳＦ タンパク質、とくにＣＳＦ
−１を任意の有用な機能にすることがかなり困難である
ことは、それらの治療的使用を実際的にするまたは可能
とするためにさえ十分な量で、個々のかつ特性決定可能
な形態で入手不可能なことであった。本発明は、組み換
え技術により有用な量で、精製されたヒトおよびネズミ
のＣＳＦ−１を提供することによって、これらの困難を
除去し、そしてその種々の治療的使用を開示する。

【０００９】エイズに悩む患者をＣＳＦ−１単独でまた
はエリスロポイエチンおよび／または抗ウイルス剤およ
び／またはＩＬ−２との組み合わせで処置することは、
ＷＯ８７／０３２０４，１９８７年６月４日公開、に報
告された。米国特許第４，４８２，４８５号、１９８４
年１１月１３日発行は、ヒトの尿から単離されたＣＳＦ
は癌の処置における支持的役割のために使用できること
を述べている。さらに、欧州特許（ＥＰ）第１１８，９
１５号、１９８４年９月１９日発行は、癌の治療を受け
ている患者における顆粒球血症およびマクロファージ血
症の予防および治療のために、感染の予防のために、そ
して骨髄を移植された患者の処置のためにＣＳＦを生産
することを報告している。

【００１０】さらに、ＣＳＦ−１は非特異的殺腫瘍活性
を刺激すると報告された（Ｒａｌｐｈら、Ｉｍｍｕｎｏ
ｂｉｏｌ．（１９８６）１７２：１９４−２０４）。Ｒ
ａｌｐｈら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８３）
７６：１０−２１は、線維肉腫ｌ０２３、リンパ腫１８
−８およびＬ．トロピカ（Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ）無鞭毛
型に対する殺腫瘍および殺微生物活性のための、マクロ
ファージの活性化において直ちの直接の役割をもたない
と報告した。Ｒａｌｐｈら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．（１９８７）１０５：２７０−２７９は、ネズミ肉
腫ＴＵ５標的へのＣＳＦ−１単独の遅延した殺腫瘍作用
およびＣＳＦ−１とリンフォカインとの組み合わせの付
加された殺腫瘍作用を報告している。継続中の米国出願
第１２６，２２１号、１９８８年２月１８日出願、は、
免疫系を刺激するためのＣＳＦ−１およびＧ−ＣＳＦの
相乗作用を開示している。

【００１１】さらに、Ｗａｒｒｅｎら、Ｊ．ｏｆ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．（１９８６）１３７：２２８１−２２８５
は、ＣＳＦ−１がインターフェロンの単球生産、ＴＮＦ
およびコロニー刺激活性を刺激することを開示してい
る。Ｌｅｅら、Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８
７）１３８：３０１９−３０２２は、ネズミのマクロフ
ァージにおけるウイルスの感染に対するＣＳＦ−１誘発
耐性を開示している。

【００１２】本発明の１つの面において、バクテリア、
ウイルスまたは真菌により引き起こされるものを包含す
る、哺乳動物において多数の感染症に対する耐性を誘発
するＣＳＦ−１の能力に基づく治療的処置を開示する。
なおさらに他の面は、創傷の治癒において使用するため
の組織の損傷の修復を促進するＣＳＦ−１の能力に関す
る。最後に、本発明は、腫瘍の悩みを処置するために有
効量のＣＳＦ−１を使用することによって、哺乳類にお
ける腫瘍細胞を処置する方法を提供する。本発明の１つ
の面において、本発明は、すべてが２官能性抗体により
仲介される、腫瘍細胞に対してヒトエフェクター細胞、
例えば、骨髄由来細胞、組織マクロファージ、または末
梢血液単核細胞を使用して、抗体依存性ターゲテッド細
胞の細胞障害性の刺激を増大する方法に関する。さら
に、本発明は、ＣＳＦ−１またはそれとサイトカイン、
リンフォカインとの混合物、または前述の種々の応用に
おいて使用するための賦形剤との混合物を含んでなる医
薬組成物に関する。

【００１３】

【課題を解決するための手段】（１）本発明の医薬組成
物は、コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）を含んでな
る、ヒトにおける真菌の感染を治療するための医薬組成
物を包含する。 （２）１つの実施態様において、本発明は、上記感染
が、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス属
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリプトコックス属（Ｃ
ｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヒストプラスマ属（Ｈｉｓ
ｔｏｐｌａｓｍａ）、コクシジオイデス属（Ｃｏｃｃｉ
ｄｉｏｉｄｅｓ）、パラコシジオイデス属（Ｐａｒａｃ
ｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）、
ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、スポロロト
リクス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）およびブラストミセ
ス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）から本質的に成る群より
選択される少なくとも１種の真菌により生ずる医薬組成
物を提供する。 （３）１つの実施態様において、本発明は、上記真菌が
カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の種である医薬組成物を
提供する。 （４）１つの実施態様において、本発明は、組み換えＣ
ＳＦ−１を１種または２種以上の抗真菌剤とともに含ん
で成る医薬組成物を提供する。 （５）１つの実施態様において、本発明は、上記１種ま
たは２種以上の抗真菌剤がアンフォテリシン（Ａｍｐｈ
ｏｔｅｒｉｃｉｎ）Ｂ、フルコナゾール（Ｆｌｕｃｏｎ
ａｚｏｌｅ）、５フルオロ−サイトシン、ケトコナゾー
ル（Ｋｅｔｏｃｏｎａｚｏｌｅ）、ミコナゾール（Ｍｉ
ｃｏｎａｚｏｌｅ）およびイントラコナゾール（Ｉｎｔ
ｒａｃｏｎａｚｏｌｅ）から本質的に成る群より選択さ
れる、医薬組成物を提供する。 （６）１つの実施態様において、本発明は、非経口的に
投与するための医薬組成物を提供する。 （７）１つの実施態様において、本発明は、ＣＳＦ−１
をボーラスの注射により、ｉ．ｖ．ボーラスにより、一
定の注入によるか、あるいは連続的注入により皮下投与
するための医薬組成物を提供する。 （８）１つの実施態様において、本発明は、真菌の感染
を処置するのに有効である１日のＣＳＦ−１の投与量が
０．５〜１０ｍｇ／ｍ^２である医薬組成物を提供する。 （９）１つの実施態様において、本発明は、真菌の感染
を処置するのに有効である上記１日のＣＳＦ−１の投与
量が０．５〜５ｍｇ／ｍ^２である医薬組成物を提供す
る。 （１０）１つの実施態様において、本発明は、上記ＣＳ
Ｆ−１を少なくとも１４日間投与するための医薬組成物
を提供する。 （１１）１つの実施態様において、本発明は、上記ＣＳ
Ｆ−１を少なくとも２１日間投与するための医薬組成物
を提供する。 （１２）１つの実施態様において、本発明は、上記ＣＳ
Ｆ−１を免疫抑制した個体に投与するための医薬組成物
を提供する。 （１３）１つの実施態様において、本発明は、エイズま
たは他の感染のために、骨髄移植とともにまたは癌の化
学療法において与えられる化学薬物のために、あるいは
熱傷または他の主要な外傷のために、免疫抑制された個
体に上記ＣＳＦ−１を投与するための医薬組成物を提供
する。 （１４）１つの実施態様において、本発明は、上記ＣＳ
Ｆ−１がポリエチレングリコールに共有結合により連結
されている医薬組成物を提供する。 （１５）１つの実施態様において、本発明は、上記ＣＳ
Ｆ−１が短い形のＣＳＦ又は長い形のＣＳＦである医薬
組成物を提供する。 （１６）１つの実施態様において、本発明は、日用量
０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇのＣＳＦ−１を含む医薬組成
物を提供する。

【００１４】

【発明の実施の形態】 「コロニー刺激因子−１（ＣＳ
Ｆ−１またはＭ−ＣＳＦ）」は、ＣＳＦ−１についてこ
の分野において理解されている活性スペクトルを示すタ
ンパク質、すなわち、Ｍｅｔｃａｌｆ，Ｄ．，Ｊ．Ｃｅ
ｌｌ．Ｐｙｓｉｏｌ．（１９７０）７６：８９の標準的
ｉｎ ｖｉｔｒｏコロニー刺激アッセイに適用したと
き、一次的マクロファージのコロニーの形成を刺激する
ことができるタンパク質を意味する。天然ＣＳＦ−１は
グリコシル化された二量体であり、モノマーはＭｅｔｃ
ａｌｆのコロニー刺激アッセイ（前掲）または種々の他
のｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性のアッセイにおいて活性で
はないので、二量化は活性のために必要であると報告さ
れている（Ｒａｌｐｈ，Ｐ．ら、Ｂｌｏｏｄ（１９８
６）６８：６３３；Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｒ．，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７７）２５ ２：４３０
５）。ここで使用するとき、ＣＳＦ−１単位はタイトレ
ーション可能な範囲におけるマウス骨髄コロニーのアッ
セイにおけるコロニーの数に相当する（Ｒａｌｐｈら、
Ｂｌｏｏｄ、前掲、に記載されている）。本発明の範囲
内およびＣＳＦ−１の定義内に、二量体およびモノマー
の両者の形態が包含される。モノマーの形態は、同時係
属出願のＰＣＴ ＷＯ８８／０８００３，１９８８年１
０月２０日公開、および米国特許第４，９２９，７００
号、１９９０年５月２９日発行、に記載されているよう
な適当なリフォルディング条件をｉｎ ｖｉｔｒｏで準
備することによって二量体の形態に転化することがで
き、そしてモノマーそれ自体は抗ＣＳＦ−１抗体の生産
のための抗原として有用である。

【００１５】いくらかの種特異性が存在するように思わ
れる：ヒトＣＳＦ−１はヒトおよびネズミの両者の骨髄
細胞で作用可能である；ネズミＣＳＦ−１はヒト細胞で
活性を示さない。したがって、「ヒト」ＣＳＦ−１は、
Ｄａｓ，１９８１、前掲、の特異的ネズミラジオリセプ
ターアッセイにおいて陽性であるが、必然的に完全な相
関関係があるわけではない。タンパク質の生物学的活性
は、一般に、またヒト尿ＣＳＦ−１に対する中和抗血清
によって阻害されるであろう（Ｄａｓ，１９８１、前
掲）。しかしながら、ある種の特別の場合（例えば、特
定の抗体調製物は生物学的機能に必須ではないＣＳＦ−
１のエピトープを認識することができ、そして前記エピ
トープは試験する特定のＣＳＦ−１のムテインの中に存
在しない）において、この基準は満足されないことがあ
る。

【００１６】ＣＳＦ−１のある種の他の性質は、より最
近認識されてきており、ネズミのマクロファージからの
系列Ｅのプロスタグランジン類、インターリューキン−
１およびインターフェロンの分泌を刺激するこのタンパ
ク質の能力を包含する（Ｍｏｏｒｅ，Ｒ．ら、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ（１９８４）２２３：１７８）。これらの後者の
活性についてのメカニズムは現在理解されておらず、そ
してここにおいて定義する目的で、定義を満足する基準
は、出発物質として適当な種からの骨髄細胞を使用し
て、単球／マクロファージのコロニーの形成を刺激する
能力にあり、そしてほとんどの環境（上を参照）下で、
精製されたヒト尿ＣＳＦ−１に対する中和抗血清によっ
てこの活性の阻害を示し、そして、種の型について適当
ならば、ラジオリセプターアッセイにおいて陽性の応答
を示す。（ＣＳＦ−１の増殖作用は単核食細胞の系統の
細胞に制限されること（Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｅ．Ｒ．，Ｔ
ｈｅＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ（１９８１），Ｓｔｅｗａ
ｒｔ，Ｗ．Ｅ．，ＩＩ、ら、編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅ
ｓｓ、ニュージャージイ州クリフトン）、ｐｐ．．１０
２−１３２）およびＣＳＦ−１のためのリセプターはこ
の系統の細胞（Ｂｙｒｎｃ，Ｐ．Ｖ．ら、Ｃｅｌｌ．Ｂ
ｉｏｌ．（１９８１）９１：８４８）、胎盤のトロホブ
ラストおよびいくつかの他の細胞の上に見いだされるこ
とが知られている）。

【００１７】「有効量」は、特定した機能を実行する、
例えば、腫瘍細胞を殺すか、あるいは腫瘍負荷を減少
か、あるいは感染症を予防または治癒するために有効な
量を意味する。

【００１８】「治療的処置」は、病気にかかった後の被
検体を処置することを示し、そして予防的治療を包含す
る。

【００１９】「哺乳動物」は、任意の哺乳動物の種を示
し、そしてウサギ、マウス、イヌ、ネコ、霊長類および
ヒト、好ましくはヒトを包含する。

【００２０】「免疫抑制」は、感染、化学的物質、熱
傷、主要な外傷、または照射による、免疫応答の予防ま
たは減少を意味する。

【００２１】「発現系」は、所望のコード配列および調
節配列を作用可能な連鎖で含有するＤＮＡ配列を呼び、
こうしてこれらの配列で形質転換された宿主はコードさ
れたタンパク質を発現することができる。形質転換を実
施するために、発現系をベクターの中に含めることもで
きるが、次いで関係するＤＮＡを宿主の染色体の中に組
み込むことができる。

【００２２】ここで使用するとき、「細胞」、「細胞
系」および「細胞培養物」は互換的に使用し、そしてす
べてのこのような表示は子孫を包含する。こうして「形
質転換体」または「形質転換された細胞」は、被検体の
一次的細胞および、継代の数に無関係に、その細胞から
誘導された培養物を包含する。また、すべての子孫は、
意図的なまたは不注意な突然変異のために、ＤＮＡ含量
が正確な同一でないことがある。もとの形質転換された
細胞においてスクリーニングしたのと同一の機能を有す
る突然変異体子孫が含められる。別の表示を意図する場
合、文脈から明らかであろう。

【００２３】ここにおいて述べる、すべての特許、特許
出願および刊行物は、前掲および後掲の両者を含めて、
ここに詳しく引用によって加える。

【００２４】ＣＳＦ−１は明らかに多数の形態で存在
し、それらのすべては本発明の態様の中に含められる。
３つの異なる長さ（２５６ アミノ酸：５５４ アミノ
酸：および４３８ アミノ酸）のＣＳＦ−１のｐｒｅ−
ｐｒｏ−ポリペプチドをコードするヒトＣＳＦ−１のｃ
ＤＮＡのクローンは、単一のＣＳＦ−１遺伝子を発現す
る細胞から単離された（参照、米国特許第４，８４７，
２０１号、１９８９年７月１１日発行および米国特許第
４，８６８，１１９号、１９８９年９月１９日発行：Ｗ
ｏｎｇ，Ｇ．Ｇ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３
５：１５０４，Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
（１９８５）２３０：２９１；Ｌａｄｎｅｒら、ＥＭＢ
Ｏ Ｊ．（１９８７）６：２６９３；Ｃｅｒｒｔｔｉ，
Ｄ．Ｐ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
（１９８８）２５：７６１。ここにおいて開示する治療
において有用なＣＳＦ−１タンパク質は、また、例え
ば、長い形態の、２３８におけるＬｙｓ残基、２４９に
おけるＡｒｇ残基、および４１１におけるＡｒｇ残基を
包含する、タンパク質分解によりプロセシングされるこ
とができる。ＣＳＦ−１は１または２以上のＣ−末端が
欠失された形態で天然に存在する。さらに、最初の２ま
たは４アミノ酸を欠如するＣＳＦ−１タンパク質は、ヒ
ト細胞系ＡＧＲ−ＯＮ（ＣＥＭ−ＯＮに等しい；ＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．ＣＲＬ−８１９９：Ｔａｋａｈａｓｈｉ，
Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃ
ｏｍｍ．（１９８８）１５２：１４０１および米国特許
第４，６７５，２９１号、１９８７年６月２３日発行）
の上澄み液から活性な形態で単離された。アミノ酸１４
５をコードするモノマーを含むＣＳＦ−１タンパク質は
ｉｎ ｖｉｔｒｏ生物学的活性を有することが報告され
た（欧州特許公開第２６１，５９２号、１９８８年３月
３０日公開）。いくつかの生物学的活性は、アミノ酸１
３２をコードするモノマーから構成された二量体のＣＳ
Ｆ−１タンパク質について報告された（欧州特許（Ｅ
Ｐ）第３２８，０６１号、１９８９年８月１６日公
開）。モノマーのＣＳＦ−１ポリペプチド（Ｃ−末端に
おいて切断されているか否かにかかわらず）を、また、
リフォルディングしてマルチマー、最も頻繁には二量体
を形成することができる。

【００２５】天然ヒト尿ＣＳＦ−１は、４５〜９０ｋＤ
の高度にグリコシル化された二量体として、源、測定法
および報告者の同一性に依存して単離された。Ｗｏｎｇ
ら（前掲）により報告された、組み換え的に生産された
未グリコシル化ＣＳＦ−１は、ほぼ２１ｋＤの分子量を
有するように思われる。他方において、Ｋａｗａｓａｋ
ｉら（前掲）（参照、米国特許第４，８４７，２０１号
（前掲）およびＰＣＴ公開第ＷＯ８６／０４６０７号、
１９８６年８月１４日公開）によりＣＳＦ（ＳＣＳＦ）
の「短い」２２４アミノ酸について推定されたアミノ酸
配列に基づいて推定された分子量は、２６ｋＤ程度であ
るが、「長い」アミノ酸の形態（ＬＣＳＦ）のそれは５
５ｋＤ程度である（Ｗｏｎｇら（前掲）；Ｌａｄｎｅｒ
ら（前掲）；欧州特許（ＥＰ）第２７２，７７９号、１
９８８年６月２９日公開；およびＰＣＴ公開第ＷＯ８７
／０６９５４号、１９８７年１１月１９日公開）。これ
らの遺伝子の欠失された構成体をＥ．ｃｏｌｉの中で発
現する場合（グリコシル化が起こらない場合）、それら
はもちろんかなり低い分子量のタンパク質を生ずるであ
ろう。

【００２６】本発明において有用なＣＳＦ−１タンパク
質の１の他の形態は、米国特許第４，８４７，３２５号
に記載されているポリマー接合ＣＳＦ−１を包含する。
欧州特許（ＥＰ）第２４９，４７７号、１９８７年１２
月１６日公開に開示されているトランスメンブレイン領
域欠失突然変異体および欧州特許（ＥＰ）第２７２，７
７９号、前掲、に開示されているグリコシル化部位欠失
突然変異体もまた、現在開示する治療に有用であると考
えられる。

【００２７】種々の源からこれらの種々の形態のＣＳＦ
−１を生産する方法は、米国特許第４，８７９，２２７
号、１９８９年１１月７日発行；ＷＯ８６／０４５８７
号、１９８６年８月１４日公開；ＷＯ８９／１０４０７
号、１９８９年１１月２日公開；ＷＯ８８／０８００３
号：前掲および欧州特許（ＥＰ）第２７６，５５１号、
１９８８年８月３日公開、に報告されている。

【００２８】ＡＴＧ開始コドンが直ぐ前に存在するバク
テリアで生産された成熟タンパク質は、Ｎ−末端のメチ
オニンを含むか、あるいは含まないことができること
は、もちろん、知られており、そして欧州特許（ＥＰ）
第２７２，７７９号、前掲、に示されているように、残
基１および２（両者はグルタミン酸）または残基１〜３
（Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ）の欠失はこのように役立
つ。欠失は▼および引き続くＮ−末端配列から欠失され
たアミノ酸数、あるいはアミノ酸がＣ−末端配列から欠
失されるとき、残りのアミノ酸の数で記載される。こう
して、最初の２および最初の３残基の欠失を有する前述
のＮ−末端の欠失は、それぞれ、Ｎ▼２およびＮ▼３と
表示される。例えば、長さ１５０，１５８，１９０およ
び２２１ アミノ酸のタンパク質を生ずるＣＳＦ−１の
Ｃ−末端の切頭は、それぞれ、Ｃ▼１５０，Ｃ▼１５
８，Ｃ▼１９０およびＣ▼２２１と呼ばれる。３アミノ
酸のＮ−末端の欠失を有するＬＣＳＦから誘導された２
２１ アミノ酸のＣＳＦ−１分子は、例えば、ＬＣＳＦ
／Ｎ▼３Ｃ▼２２１と記載される。アミノ酸の置換は、
置換されるアミノ酸の位置に言及して表示される。例え
ば、Ｌａｄｎｅｒら（前掲）の第４図の中の位置１５７
のシステイン残基のセリンによる置換はＣＳＦ−１Ｓｅ
ｒ_１５７と呼ばれる。

【００２９】要約すると、Ｎ−末端およびＣ−末端の欠
失および集成に加えて、鎖の中の個々のアミノ酸残基は
酸化、還元、欠失または他の誘導体化により修飾するこ
とができ、そしてまたこれらのタンパク質は切断および
／または重合して、活性を保持する二量体生成物を得る
ことができる。活性を破壊しないこのような変更は定義
からタンパク質配列を除去せず、そして実質的な同等体
として特別に包含される。他の種から誘導されたＣＳＦ
−１は、「ヒトＣＳＦ−１」の活性を有するタンパク質
の定義に、ヒト基質に関する前述の要求される活性のパ
ターンのその表示のおかげで適合することができる。

【００３０】すべてのタンパク質の場合におけるよう
に、正確な化学的構造は多数の因子に依存する。イオン
化可能なアミノおよびカルボキシル基が分子の中に存在
するので、特定のタンパク質は酸性または塩基性の塩と
して、あるいは中性の形態で得ることができる。適当な
環境的状態に置かれたとき、それらの活性を保持するす
べてのこのような調製物は、この定義の中に包含され
る。さらに、主なアミノ酸配列は、糖部分を使用して誘
導体化（グリコシル化）によるか、あるいは他の補助的
分子、例えば、脂質、ホスフェート、アセチル基などに
より、より普通には糖類、ポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）およびポリオキシエチレングリコール（ＰＯＧ）
との接合により米国特許第４，８４７，３２５号に示さ
れているように増大することができる。このような増大
のある種の面は、生産性宿主の翻訳後のプロセシング系
を通して達成される；他のこのような修飾はｉｎ ｖｉ
ｔｒｏで導入することができる。いずれの場合において
も、このような修飾は、上に定義した、二量体のタンパ
ク質の活性が破壊されないかぎり、定義の中に包含され
る。もちろん、このような修飾は、タンパク質の活性を
種々のアッセイにおいて増強または減少することによっ
て、量的または質的に活性に影響を与えることができ
る。

【００３１】さらに、鎖の中で個々のアミノ酸残基は酸
化、還元または他の誘導化により修飾することができ、
そしてタンパク質を切断して活性を保持する断片を得る
ことができる。活性を破壊しないこのような変更は定義
からタンパク質配列を除去しない。

【００３２】翻訳の間に配列の中に組み込まれたアミノ
酸の欠失、付加または変更による、一次構造それ自体の
修飾は、タンパク質の活性を破壊しないで、なすことが
できる。このような置換および他の変更は、「ＣＳＦ−
１のそれに実質的に等しいアミノ酸配列を有する」タン
パク質の定義内に入るアミノ酸配列を有するタンパク質
を生ずる。事実、ヒトおよびネズミ由来のＣＳＦ−１タ
ンパク質は、高い相同性を表す、同一でないが、同様な
一次アミノ酸配列を有する。

【００３３】本発明のＣＳＦ−１タンパク質は、先祖骨
髄細胞からの単球−前駆体／マクロファージの細胞の両
者の生産を刺激し、こうして免疫系の有効性を増強し、
そして成熟マクロファージの中のリンフォカインの分泌
のような分化する細胞の機能を刺激することができる。

【００３４】１つの応用において、これらのタンパク質
は化学療法への付加物として有用である。化学療法の処
置は免疫系の抑制を生ずることが理解されるであろう。
しばしば、化学療法の処置は、腫瘍細胞の破壊において
有望であるが、骨髄細胞へのこれらの毒性剤の副作用の
ために、対象の死亡を生ずる。このような患者へのＣＳ
Ｆ−１の投与は、骨髄由来の前駆体のマクロファージお
よび単球への成長および分化を仲介および増強しかつこ
れらの成熟細胞の機能を刺激するＣＳＦ−１の能力のた
めに、この副作用を防止し、こうして二次感染に屈する
患者の傾向を防止するために免疫系の再刺激をもたら
す。

【００３５】ＣＳＦ−１は、また、白血球減少症、すな
わち、白血球の合計数の減少を包含する疾患を治療する
ために使用することができる。好中球減少症は多形性の
白血球（好中球、顆粒球）に主として影響を与える欠陥
を反映し、そして種々の感染、ある種の薬物（例えば、
細胞障害性薬物）またはイオン化放射線に基づくであろ
う。こうして、ＣＳＦ−１のｉｎ ｖｉｖｏ投与を使用
して幹細胞を誘導して多形性白血球の生産を増加し、こ
うして白血球の計数を増加することができる。

【００３６】このような処置により助けられる他の患者
は、骨髄移植により白血病を処置される患者を包含す
る；このような患者はしばしば拒絶反応を予防するため
に免疫抑制されている。これらの患者について、また、
免疫抑制はＣＳＦ−１の投与により逆転されることがあ
る。

【００３７】一般に、化学療法、骨髄移植、または他の
形態の免疫抑制、例えば、疾患（例えば、後天性免疫欠
損症候群）のためかどうかにかかわらず、免疫抑制に悩
む対象は薬理学的使用のためのＣＳＦ−１入手可能性か
ら利益を受けるであろう。

【００３８】日和見感染には免疫抑制の結果としてかか
ることがある。例えば、エイズに関係する日和見感染
は、Ｍｉｌｌｓら、１９９０，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ａｍｅｒｉｃａｎ ２６３：５１−５７、この開示をこ
こに引用によって加える、に記載されている。Ｍｉｌｌ
ｓらは、普通の一次感染は次の因子により引き起こされ
ることを示す：サイトメガロウイルス、ニューモシステ
ィス・アリニイイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒ
ｉｎｉｉ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ
ａｌｂｉｃａｎｓ）、水痘−帯状庖疹ウイルス、エス
パインバールウイルス、トキソプラズマ・ゴンジイ（Ｔ
ｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、鳥型結核菌（Ｍ
ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、クリプトコ
ッス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）など。著者らはまた、これらの
感染を処置するために使用される種々の薬物を記載して
いる。ＣＳＦ−１をそれらの薬物の１種または２種以上
と組み合わせて、これらおよび日和見感染を処置するこ
とができると考えられる。

【００３９】さらに、ＣＳＦ−１をクリプトコッカル
（Ｃｒｙｐｏｃｏｃｃａｌ）、例えば、クリプトコッカ
ル・メニンギチス（ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｍｅｎ
ｉｎｇｉｔｉｓ）の感染の処置のために使用することが
思い浮かぶ。クリプトコッカル・メニンギチス（Ｃｒｙ
ｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）は米国に
おいて真菌の髄膜炎の最も普通の形態であり、そしてエ
イズの患者においてヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）お
よびトキソプラズマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ
ｇｏｎｄｉｉ）後の神経学の疾患の第３の最も重要な
因子である。クリプトコックス症は米国においてエイズ
患者の５〜７％において病気の間のある時点において発
生するが、散在性クリプトコッカス症はアフリカのエイ
ズの患者の第３までにおいて発生することがある。

【００４０】これらの日和見性の感染のための治療的処
置は、真菌の病気について下に記載するものと同様であ
ることができる。例えば、ＣＳＦ−１は同様な投与レベ
ルかつ同一のスケジュールで投与することができる。

【００４１】さらに、対象者に固有の系の量を補充する
ために前以て分化したマクロファージの増大量を投与す
ることができ、これらのマクロファージは骨髄のｉｎ
ｖｉｔｒｏ培養によるか、あるいは血液の単球、または
他の適当な調製物および引き続くＣＳＦ−１の処理から
生産される。これらの調製物は、患者自身の血液の単球
または骨髄誘導細胞の調製物を包含し、これらはそのよ
うに培養し、そして局所的または全身的処置のために戻
すことができる。

【００４２】ＣＳＦ−１がマクロファージによるリンフ
ォカインの生産を刺激し、そして標的細胞を殺すマクロ
ファージの能力を増強する能力は、また、新形成および
感染の処置においてＣＳＦ−１を直接有用とする。その
うえ、ＣＳＦ−１を使用する創傷の処置は組織の修復を
促進する。

【００４３】ＣＳＦ−１はネズミ由来マクロファージに
よりインターフェロンの生産を増強し（Ｆｌｅｉｔ，Ｉ
Ｉ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｙｓｉｏｌ．（１９８
１）１０８：３４７）、そしてＭＩＡＰａＣａ細胞から
のヒトの、部分的に精製されたＣＳＦ−１は、ＰＣＰ
ＷＯ８６／０４６０７、前掲、に例示されているよう
に、ヒト単球からのインターフェロンおよびＴＮＦのポ
リ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）誘発生産を刺激する。さらに、Ｃ
ＳＦ−１はヒト血液単球により骨髄様ＣＳＦの生産を刺
激する。

【００４４】そのうえ、ここに記載する種々の使用のた
めに、ＣＳＦ−１を他の効率よい因子と組み合わせて使
用することができ、このような因子は、例えば、ＩＦＮ
−アルファ、ＩＦＮ−べータ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−
２、ＴＮＦ；または腫瘍を処置するためのネズミジペプ
チドおよびその類似体を包含する。

【００４５】また、正常Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス腹膜のマ
クロファージを刺激して、ネズミ肉腫ＴＵ５ターゲット
を殺すＣＳＦ−１（ネズミＬ−細胞−コンディションド
およびＥ．ｃｏｌｉ生産ヒト組み換えＣＳＦ−１から
の）の能力を下において証明する。ＣＳＦ−１を予備処
置としておよびエフェクター相の間に使用するとき、こ
の活性は最も有効である。そのようにするＣＳＦ−１の
能力は、他のＣＳＦが示すものより非常に大きい。

【００４６】ＣＳＦ−１はまた、リンフォカイン誘発の
抗体依存性細胞の細胞障害性（ＡＤＣＣ）またはターゲ
ッテッドＡＤＣＣを腫瘍細胞に対するマクロファージま
たは天然キラー細胞により増大するために使用すること
ができる。この活性が特に効果的である場合、ＣＳＦ−
１をＩＬ−２、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−べータまた
はＩＦＮ−ガンマとの組み合わせで使用される。

【００４７】ターゲッテッドＡＤＣＣの活性を増強する
ＣＳＦ−１の能力は、抗体の種類、ＣＳＦ−１の投与
量、およびエフェクター／ターゲットの比に依存すると
信じられる。ターゲッテッド細胞の細胞障害性は、細胞
障害性細胞、例えば、単球、マクロファージ、ナチュラ
ルキラー細胞などの上の細胞表面のリセプターに頼ると
考えられる。これらの細胞表面のリセプターＣＤ１６の
発現は、追加のリンフォカイン、例えば、ＩＬ−２の存
在または不存在下に、ＣＳＦ−１の中のこれらのエフェ
クター細胞を培養することによって増強される。細胞障
害性細胞はターゲット細胞に対するまで上に位置付けさ
れる場合、２価の抗体は、その結合部位の１つを通して
ターゲット細胞に結合しかつその第２結合部位を通して
細胞障害性細胞上の溶菌促進リセプターに結合し、これ
により２つの細胞の型を接合しそして細胞障害性細胞が
殺しのシグナルを送り出すようにさせることによって、
このプロセスを促進することができる。「２価の抗体」
は、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）またはハイブリッドの
ハイブリドーマ細胞系における抗体鎖のｉｎ ｖｉｖｏ
組み換えにより生産された抗体、および２つの抗体また
は抗体断片のｉｎ ｖｉｔｒｏ化学的接合により生産さ
れた抗体を包含する；後者の化学的に連鎖された抗体は
ヘテロ接合体と呼ぶ。

【００４８】本発明において、このような２価の抗体は
白血球上のヒトリセプターＩＩＩ（ＦｃＲＩＩＩ）とし
て知られているＣＤ１６抗原をターゲットする、ハイブ
リッドのハイブリドーマ誘導二重特異性またはヘテロ接
合した抗体を包含する。３Ｇ８、ヒトＦｃＲＩＩＩに対
するＩｇＧ_１モノクローナル抗体を分泌するネズミハイ
ブリドーマは、Ｕｎｋｅｌｅｓｓ，Ｊ．Ｂ．ら、Ａｎｎ
Ｒｅｖ Ｉｍｍ（１９８８）６：２５１に記載されて
いる。ハイブリッドのハイブリドーマ誘導二重特異性抗
体２Ｂ１を発生するために、この抗体およびモノクロー
ナル抗体５２０Ｃ９を使用することは、同時継続米国出
願第０７／２４９，７１０号、１９８８年９月２７日提
出、に記載されている。生ずる二重特異性抗体はＣＤ１
６ＦｃリセプターＩＩＩ陽性細胞への結合、ならびに陽
性のプロト腫瘍遺伝子生産物ｃｒｂＢ−２を表す肺癌細
胞への結合を示す。３Ｇ８はまた１１３Ｆ１抗体、肺癌
関連抗原に対するネズミモノクローナル抗体（米国特許
第４，７５３，８９４号）に化学的に交差結合され（例
えば、Ｋａｒｐｏｖｓｋｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．
（１９８４）１６０：１６８６、に記載されているよう
に化学的クロスリンカーを使用して）、また、２価の特
異性を有する抗体が生成された。

【００４９】このようなターゲッテッド細胞障害性のア
ッセイにおけるＣＳＦ−１のｉｎｖｉｔｒｏ有効投与量
は１０〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲である。しかしなが
ら、そのｉｎ ｖｉｖｏ投与量は、種々の因子、例え
ば、癌のひどさ、宿主の免疫の状態、体重、エフェクタ
ー／ターゲット細胞の比に依存し、それらの多くは場合
に応じて決定することができるだけである。ＣＳＦ−１
は、全身の毒性反応を引き起こさないが、エフェクター
細胞上に強化の応答を誘発する投与量で投与すべきであ
る。

【００５０】２価の抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効投与量
は１ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲である。ｉｎ
ｖｉｖｏ投与量は、多数の因子、例えば、腫瘍の大き
さの臨床的推定、転移の程度、および活性薬物および活
性化された細胞の生物分布に依存する。有効なｉｎ ｖ
ｉｔｒｏエフェクター／細胞の比はほぼ１０：１〜８
０：１である。実際のエフェクター／ターゲットの比ｉ
ｎ ｖｉｖｏは、エフェクター細胞および抗体への腫瘍
の接近可能性に依存する。

【００５１】さらに、ウイルス、例えば、ヘルペスウイ
ルスの属、例えば、サイトメガロウイルスを包含する感
染性生物体；グラム陰性セプシスを引き起こすものを包
含するバクテリアの因子、および真菌を攻撃するネズミ
細胞の能力は、ＣＳＦ−１により増強される。（ネズミ
ＣＳＦ−１はネズミマクロファージがＰ８１５腫瘍細胞
に対して静細胞性であることを刺激する（Ｗｉｎｇ，
Ｅ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９８
２）６９：２７０）か、あるいは他の白血病のターゲッ
トを殺さない（Ｒａｌｐｈ，Ｐ．ら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．（１９８３）７６：１０）と相反することが
報告された）。Ｎｏｚａｗａ，Ｒ．Ｔ．ら、Ｃｅｌｌ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８０）５３：１１６、は、ＣＳ
Ｆ−１の調製物がマクロファージがカンジダ属（Ｃａｎ
ｄｉｄａ）を摂取および殺すことを刺激することを報告
している。

【００５２】さらに、ＣＳＦ−１はヒトにおける真菌の
感染の処置において有効であることが発見された。これ
らの真菌の感染は、典型的には、免疫抑制された患者
（例えば、骨髄移植体、エイズを有する患者など）にお
いて発生するが、また、免疫抑制されていない個体にお
いて起こることがある。処置することができる真菌は、
次の属からのものである：カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄ
ａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、
クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヒ
ストプラスマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、ブラスト
ミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、コシジオイデス
属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、パラコシジオイデス
属（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、ケカビ属
（Ｍｕｃｏｒ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌ
ａ）、スポロロトリクス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）、
ダーマトフィトシス属（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｔｏｓｉ
ｓ）、シュードアレスケリア属（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓ
ｃｈｅｒｉａ）、プロトセカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃ
ａ）、リノスポリジウム属（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉ
ｕｍ）、または菌腫またはクロモミコーシスを引き起こ
す真菌など（参照、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐ
ｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓ
ｅａｓｅｓ、第３版、Ｍａｄｅｌｌら、Ｃｈｕｒｃｅｌ
ｌ Ｌｉｖｉｇｔｏｎｅ［１９９０］ｐ．１９４２−２
０１６）。

【００５３】好ましくは、ＣＳＦ−１は、真菌の感染が
陰性の培養結果により決定して除去されるまで、非経口
的に投与する。ＣＳＦ−１は、皮下的に、連続的注入に
より、ボーラス注射により、あるいは一定の注入により
投与することができる。「連続的注入」とは少なくとも
２４時間の投与を意味し、そして「一定の注入」は２４
時間以下の投与を意味する。ＣＳＦ−１は好ましくは１
〜４時間持続する一定の注入を意味する。真菌の感染を
処置するために有効な１日のＣＳＦ−１の投与量は好ま
しくは０．０ｌ〜５０ｍｇ／ｍ^２、より好ましくは０．
０５〜１０ｍｇ／ｍ^２、最も好ましくは０．５〜５ｍｇ
／ｍ^２である。好ましくは、ＣＳＦ−１は少なくとも１
４日間、より好ましくは２１〜５９日間投与する。上の
処置が不都合な結果を引き起こす場合（しかしながら、
最小の効果はｉ．ｖ．ボーラスにより３０ｍｇ／ｍ^２／
日までの投与量で観測された）あるいはより効率よい結
果を示すことができる場合、他の投与のスケジュールを
また使用することができる。

【００５４】好ましくは、前述したようにかつ下に詳し
く示すように、ＣＳＦ−１はカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄ
ａ）およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ）の感染を処置するために使用することができる。ク
リプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の感
染、例えば、クリプトコックスの髄膜炎は同様に処置す
ることができる。

【００５５】こうして、免疫抑制それ自体を克服ことに
加えて、ＣＳＦ−１はマクロファージの分泌および活性
の刺激により侵入性有機体または悪性細胞を破壊するた
めに使用できる。マクロファージの活性は抗微生物剤、
例えば、１種または２種以上の抗ウイルス、抗真菌剤ま
たは抗バクテリア剤と組み合わせたＣＳＦ−１の治療に
より増強することができる。

【００５６】抗真菌剤の例は次のものを包含する：アン
フォテリシンＢ、フルコナゾール（Ｄｉｆｌｕｃａ
ｎ）、５フルオロ−サイトシン（Ｆｌｕｃｙｔｏｓｉｎ
ｅ，５−ＦＣ）、ケトコナゾール、ミコナゾール、イト
ラコナゾールなど（参照、また、Ｍａｄｅｌｌら、前
掲、ｐ．３６１−３７０またはＭｉｌｌｓら、ｐ．５４
−５５）。上の抗真菌剤の１つの臨床的スペクトルの例
として、典型的にはアンフォテリシンは次の真菌および
原生動物を阻害する：アスペルギルス・フミガツス（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、パラコ
シジオイデス・ブラシリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉ
ｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、コシジ
オイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍ
ｍｉｔｉｓ）、クリプトコッス・ネオフォルマンス（Ｃ
ｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒ
ストプラスマ・カプスラツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ
ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ムコル・ムセド（Ｍｕｃｏ
ｒ ｍｕｃｅｄｏ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒ
ｕｌａ）種、スポロロトリクス・デルマチチジス（Ｓｐ
ｏｒｏｔｈｒｉｘ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、カン
ジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）種、レイシュマニア属（Ｌｅ
ｉｓｈｍａｎｉａ）種、およびアカンタメバ属（Ａｃａ
ｎｔｈａｍｏｅｂａ）種。抗真菌剤は、ＣＳＦ−１の投
与の前に、間にまたは後に、投与することができる。こ
れらの剤の投与量は当業者に知られており、そして１日
量の範囲、例えば、アンフォテリシンＢについて０．４
〜０．６ｍｇ／ｋｇ／日、フルコナゾールについて２０
０ｍｇ／日〜４００ｍｇ／日、５−フルオロ−サイトシ
ンについて約１５０ｍｇ／ｋｇ／日、そしてケトコナゾ
ールについて２００ｍｇ／日〜４００ｍｇ／日を包含す
る。これらの範囲は単に例示であり、そしていかなる方
法においても限定的として解釈すべきでない。また、Ｃ
ＳＦ−１は真菌の感染の処置に有効であるか、あるいは
有効であろう他の剤と組み合わせることができると考え
られる。抗真菌剤はポリマーに接合して、それらのｉｎ
ｖｉｖｏ半減期および毒性を調節することができる、
参照、米国特許出願第３６５，９１４号、その開示の全
体をここに引用によって加える。

【００５７】前述したように、ＣＳＦ−１は他の抗微生
物剤、例えば、抗バクテリア剤と組み合わせることがで
きる。ＣＳＦ−１と組み合わせることができる抗生物質
の例は、次のカテゴリーから選択されるものを包含す
る：β−ラクタム環（ペニシリン）、グリコシド結合に
あるアミノ糖（アミノグリコシド）、マクロサイクルの
ラクトン環（マクロリド）、ナフタセンカルボキシアミ
ドのポリサイクルの誘導体（テトラサイクリン）、ジク
ロロ酢酸のニトロベンゼン誘導体、ペプチド（バシトラ
シン、グラミシンおよびポリミキシン）、共役二重結合
系をもつ大きい環（ポリエン）、スルファニルアミドか
ら誘導されたスルファ薬物（スルホンアミド）、５−ニ
トロ−２−フラニルの群（ニトロフラン）、キノロンカ
ルボン酸（すなわち、ナリジキシン酸）、および多数の
他のもの。前述の抗生物質の群は好ましい抗生物質の例
であり、それらの群の範囲内の例は次の通りである：ペ
プチドの抗生物質、例えば、アンフォマイシン、バシト
ラシン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カプレオ
マイシン、コリスチン、ダクチノマイシン、エンヅラシ
ジン、グラミシジンＡ、グラミジジンＪ（Ｓ）、ミカマ
イシン類、ポリミキシン類、ステンドマイシン、チオペ
プチン、チウトレプトン、チロシジン類、ビオマイシ
ン、ビルギニマイシン類、およびアクチノマイシン（参
照、化学技術の百科事典（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ
ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第
３版、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ編、Ｖｏｌ．２，ｐ．９
９１（１９７８）；アミノグリコシド類、例えば、スト
レプトマイシン、ネオマイシン、パロモマイシン、ゲン
タマイシン、リボスタマイシン、トブラマイシン、アミ
カシン、およびリビドマイシン（参照、Ｋｉｒｋ−Ｏｔ
ｈｍｅｒ，Ｖｏｌ．２，ｐ．８−１９）；β−ラクタム
類、例えば、ベジルペニシリン、ｍｅｔｉｓｉｌｉｎ、
オキサシリン、ヘタシリン、ピペラシリン、アモキシリ
ン、およびカルベニシリン（参照、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍ
ｅｒ，Ｖｏｌ．２，ｐ．８７１）；クロランフェニコー
ル（参照、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ，Ｖｏｌ．２，Ｐ．
９２０）；リンコサミニド類、例えば、クリンダマイシ
ン、リンコマイシンセレスセチン、デサリセチン（参
照、、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ，Ｖｏｌ．２，ｐ．９３
０）；マクロリド類、例えば、エリスオマイシンＡ−
Ｅ、ランカマイシン、ロイコマイシン、およびピクロマ
イシン（参照、Ｋｒｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ，Ｖｏｌ．２，
ｐ．９３７）；ヌクレオシド類、例えば、５−アザシチ
ジン、アミセチン、プロマイシン、およびセプタシジン
（参照、、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ，Ｖｏｌ．２，ｐ．
９６２）；オリゴ糖類、例えば、クラマイシン、および
エベルニノミシンＢ（参照、、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅ
ｒ，Ｖｏｌ．２，ｐ．９８６）；フェナジン類、例え
ば、ミキシン、ロモフンギン、イオジニンなど（参照、
Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ，Ｖｏｌ．３，ｐ．１）；ポリ
エン類、例えば、アンフォテリシン類、カンジシジン、
ニスタチンなど（参照、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ，Ｖｏ
ｌ．３，ｐ．２１）；ポリエーテル類（参照、Ｋｉｒｋ
−Ｏｔｈｍｅｒ，Ｖｏｌ．３，ｐ．４７）；テトラサイ
クリン類、例えば、クロロテトラサイクリン、オキシテ
トラサイクリン、デメクロシクリン、メタサイクリン、
ドキシサイクリン、およびミノサイクリン（参照、、Ｋ
ｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ，Ｖｏｌ．３，ｐ．６５）；スル
ホンアミド類、例えば、スルファチアゾール、スルファ
ジアジン、スルファピラジン、およびスルファニルアミ
ド（参照、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ，Ｖｏｌ．２，ｐ．
７９５）；ニトロフラン類、例えば、ニトロフラゾン、
フラゾリジン、ニトロフラトニン、フリウム、ニトロビ
ン、およびンミフロキシム（参照、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍ
ｅｒ，Ｖｏｌ．２，ｐ．７９０）；キノロンカルボン酸
類、例えば、ナリジキシ酸、ピロミド酸、ピペミド酸、
およびオキソリン酸（参照、Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ，
Ｖｏｌ．２，ｐ．７８２）。

【００５８】ＣＳＦ−１は、また、抗ウイルス剤、例え
ば、次のものと組み合わせることができる：アマンタジ
ン、リマンタジナリルドン、リバビリン、アシクロビ
ル、９−［（１，３−ジヒドロキシ−２−プロポキシ）
メチル］グアニ（ＤＨＰＧ）、ビダラビン（ＡＲＡ−
Ａ）、ガンシクロビル、エンビロキシム、フォスカーネ
ト、インターフェロン（アルファ−、べータ−およびガ
ンマ−）、アンプリゲン、ポドフォルロトキシン、２，
３−ジドキシシトジン（ＤＤＣ）、ヨードデオキシウリ
ジン（ＩＤＵ）、トリフルオロチミジン（ＴＦＴ）、ジ
デオキシイノシン：ｄｄＩ）、ジデオキシサイトジン
（ｄｄＣ）、ジドブジンおよび特定の抗ウイルス性免疫
グロブリン類（参照、Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｊ，Ｐ．，Ｇｕ
ｉｄｅ ｔｏＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｈｅｒａ
ｐｙ， Ｗｅｓｔ Ｂｅｔｈｅｓｄａ： Ａｎｔｉｍｉ
ｃｒｏｂｉａ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｉｎｃ．，１９８９，
ｐｐ．８８−９３；およびＨａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒ
ｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｏｒｎａｌ Ｍｅｄｉ
ｃｉｎｅ、第１１版、Ｂｒａｕｎｗａｌｄ，Ｅ．ら編、
ニューヨーク；ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃ
ｏ．，１９８７，ＰＰ６６８−６７２）。

【００５９】最後に、ＣＳＦ−１は、局所的または全身
的に適用したとき、創傷の治癒のための組織の修復を促
進するために使用できる。ＣＳＦ−１はマクロファージ
を補充し（Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．（１９８８）１４１：５７５）ならびにマクロファ
ージを誘発して結合組織の成長因子、例えば、血小板誘
導成長因子（ＰＤＧＦ）、および活性因子、例えば、腫
瘍壊死因子（ＴＦＮ）を、細胞増殖の刺激として、提供
することができる。創傷のマクロファージは、線維増
殖、コラーゲンの合成、および脈管形成をｉｎ ｖｉｖ
ｏで刺激する物質を解放すると報告された（Ｈｕｎｔ
Ｔ．Ｋ．ら、Ｓｕｒｇｅｒｙ（１９８４）９６：４
８）。

【００６０】本発明のＣＳＦ−１は、タンパク質物質の
投与する分野において標準の普通の方法で配合すること
ができる。注射による投与は１つの好ましいルートであ
る；そしてこのような配合物は、溶液または懸濁液、乳
濁液、または注射可能なまたはゲルの配合物に再構成す
るための固体の組成物を包含する。適当な賦形剤は、例
えば、リンゲル溶液、ハンク溶液、水、生理食塩水、グ
リセロール、デキストロースまたはマンニトール溶液な
どを包含する。ＣＳＦ−１の液体の溶液は創傷の包帯の
上または下に直接使用することができるが、再構成され
た組成物は創傷の治癒のための軟膏、ゲル配合物、泡沫
剤などに有用である。再構成された配合物は、創傷部位
にＣＳＦ−１のためのコントロールされた供給系を提供
する。コントロールされた解放は、延長された期間、例
えば、２４時間またはそれ以上、好ましくは２４〜７２
時間にわたって治療的レベルを維持するために十分な薬
物の解放を意味する。成長因子の接触時間の増加は、創
傷の治癒速度の有意な増加を達成するために必要である
ことがある。

【００６１】さらに、本発明のＣＳＦ−１は細胞の調製
物と予備インキュベーションして適当な応答を刺激する
ことができ、そして全体の調製物またはそれからの上澄
み液を被検体に導入することができる。下に示すよう
に、種々の型の血球によりＣＳＦ−１の刺激に応答して
生産された物質は所望のターゲットに対して有効であ
り、そして侵入性有機体または新形成を攻撃する血球そ
れら自体の性質は増強されることができる。被検体自身
の細胞を抜き出しそしてこのようにして使用することが
できるか、あるいは、例えば、他の適合性の個体からの
単球またはリンパ球を包含するにおいて使用することが
できる。

【００６２】前に、とくに米国特許第４，８７４，２０
１号（前掲）に開示されている主題に関して前述したよ
うに、多数のヒトＣＳＦ−１タンパク質のための完全な
コード配列は今回入手可能であり、そして種々の宿主系
に適用可能な発現ベクターは構成され、そして解読配列
は発現された。米国特許第４，８７４，２０１号におい
て提供された発現系に加えて、バキュロウイルスにより
提供されたコントロール系を利用する昆虫の細胞を使用
して発現系は記載された（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｄ．Ｗ．ら、
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ（１９８６）
Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．ら編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌ
ｉｓｈｉｎｇ，Ｖｏｌ．８，ｐｐ．２７７−２７９、米
国特許第４，７４５，０５１号、１９８８年５月１７日
発行、および同時継続米国出願第０７７，１８８号、１
９８７年７月２７日提出。昆虫の細胞に基づく発現は、
スポドプテラ・フルギペイダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ
ｆｒｕｇｉｐｅｉｄａ）の中で実施することができる。
これらの系はまたＣＳＦ−１の生産に有望である。哺乳
動物の発現はＣＯＳ−７、ＣＨＯ、マウス、およびＣＶ
−１細胞、およびまたＣＶ−Ａ２、ハムスターおよびネ
ズミの細胞であることができる。

【００６３】種々の利用可能な宿主、ならびにこのよう
な宿主のために適当な発現ベクターは、翻訳後のプロセ
シング合成の選択、およびこうして生産されたタンパク
質のコンフォメーションの調節を提供する環境的因子の
選択を可能とする。こうして、この情報の利用可能性は
ここに記載する種々の治療において使用するために十分
な量でＣＳＦ−１タンパク質を提供する。

【００６４】前述の特許刊行物の中に開示されているベ
クターの中で、プラスミドｐＬＣＳＦ２２１Ａ（これは
ａｓｐ_５９ＬＣＳＦ／Ｎ▼３Ｃ▼２２１をコードする遺
伝子を含有する）およびｐｃＣＳＦ−１７（これはＳＣ
ＳＦをコードする遺伝子を含有する）は、ヒトＣＳＦ−
１の、それぞれ、原核生物および真核生物の発現のため
に好ましい。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＧｌ１６の中に形質転換
されたプラスミドｐＬＣＳＦ２２１Ａ（以後Ｅ．ｃｏｌ
ｉ（２２１））は、ＡＴＣＣＣに１９８７年４月１４日
に受け入れ番号６７３９０で受託された。Ｅ．ｃｏｌｉ
ＭＭ２９４の中のｐｃＣＳＦ−１７は、ＡＴＣＣＣに
１９８５年６月１４日に受け入れ番号５３１４９で受託
された。

【００６５】また、ＳＣＳＦおよびＬＣＳＦの最初の３
−１５０または４−１５０酢酸およびＣ−末端の欠失を
含有するアミノ酸配列、例えば、ＬＣＳＦ／▼２２１か
らなるＣＳＦ−１タンパク質が好ましい。

【００６６】ＣＳＦ−１の活性は、以下の実施例におい
て、部分的に精製されたＭＩＡＰａＣａのＣＳＦ−１、
ネズミＬ細胞ＣＳＦ−１、ＣＶ−１により生産された組
み換え物質またはＥ．ｃｏｌｉにより生産されたヒトＣ
ＳＦ−１を使用して決定された。ＣＳＦ−１は、誘発さ
れたヒト単球によるインターフェロン（ＩＦＮ）および
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の生産を、１０〜３０倍まで増
強することが示された。ＣＳＦ−１はまた、マクロファ
ージのｉｎ ｖｉｔｒｏ抗腫瘍毒性を刺激し、ｉｎ ｖ
ｉｖｏ腫瘍増殖を阻止し、マウスを致死的バクテリアの
感染から保護し、組織損傷のｉｎ ｖｉｖｏ修復を促進
し、サイトメガロウイルスのｉｎ ｖｉｖｏ増殖を阻止
し、そして酵母のｉｎ ｖｉｖｏ増殖を阻止することが
証明された。次の実施例によって、特許請求した治療的
使用を説明する。これらの実施例は本発明を限定しな
い。

【００６７】

【実施例】ヒト単球によるＴＮＦの生産の刺激 ＭＩＡＰａＣａのＣＳＦ−１を上澄み液からリン酸カル
シウムゲル濾過およびレンチルレクチンクロマトグラフ
ィーにより精製した。リンフォカイン生産のアッセイの
ために、末梢血液−付着性細胞を各々１０^７細胞を含有
する二重反復実験のフラスコの中でインキュベーション
した。１個のフラスコを１０００Ｕ／ｍｌの上のように
して精製されたＣＳＦ−１で処置した。３日後、細胞を
収獲し、洗浄し、そして５×１０^５／ｍｌの細胞濃度に
再懸濁し、そして２４ウェルプレートの中に０．５ｍｌ
／ウェルでプレートした。ウェルを１０μｇ／ｍｌリポ
多糖（ＬＰＳ）および２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡで処理
し、そして上澄み液をＴＮＦアッセイのために収獲し
た。ＣＳＦで処理した細胞は、未処理細胞よりほぼ９倍
高いＴＮＦの分泌を示した（１６２Ｕ／ｍｌに比較し
て、１５００Ｕ／ｍｌ）。

【００６８】ヒト単球によるインターフェロンの生産の
刺激 インターフェロンの生産に対するＣＳＦ−１の効果を決
定する類似する実験において、末梢血液−付着性細胞
を、前述したように、１０００Ｕ／ｍｌのＣＳＦ−１の
存在および不存在下に３日間インキュベーションし、収
獲し、５×１０^５／ｍｌで再懸濁させ、そして前述した
ように２４ウェルのプレートの中にプレートした。イン
ターフェロンの生産のために、変化する量のポリ
（Ｉ）：ポリ（Ｃ）の添加により細胞を誘発した。上澄
み液を、ＶＳＶ感染したＧＭ２５０４細胞への細胞変性
作用により、インターフェロンの生産についてアッセイ
した。ＣＳＦ−１刺激した細胞は、５０μｇ／ｍｌのポ
リ（Ｉ）：ポリ（Ｃ）で誘発したとき、１００Ｕ／ｍｌ
の生産を示したが、同等に誘発された未処理細胞は３Ｕ
／ｍｌより少なく生産した。

【００６９】ヒト単球による骨髄様ＣＳＦの生産の刺激 単球を±ＣＳＦ−１と３日間インキュベーションし、次
いで表１におけるように骨髄様ＣＳＦの生産について誘
発した。示した３つの代表的な実験において、異なるド
ナーからの血液を使用した。

【００７０】

【表１】 したがって、ＣＳＦ−１は骨髄様ＣＳＦまたはコロニー
刺激活性の生産を刺激する。

【００７１】ネズミマクロファージによる腫瘍細胞の殺
しの刺激： 他のコロニー刺激因子に対する比較 マクロファージの刺激を測定するために、ネズミマクロ
ファージが肉腫ターゲットを殺す能力の刺激を示すアッ
セイにおいて、ｐｃＣＳＦ−１７から組み換え的に生産
されたＣＳＦ−１のためのモデルとして、Ｌ−細胞−コ
ンディショニング培地から得られたネズミＣＳＦ−１を
使用した。このアッセイにおいて、２時間の付着性Ｃ３
Ｈ／ＨｅＮマウスの腹膜のマクロファージを、ＣＳＦ−
１の存在および不存在下に、１日間ｉｎ ｖｉｔｒｏイ
ンキュベーションし、次いで２０：１の比で^３Ｈ−チミ
ジン標識したマウス肉腫ＴＵ５細胞と１０％（ｖ／ｖ）
のＣｏｎＡで誘発した（１０μｇ／ｍｌ）脾臓リンフォ
カイン（ＬＫ）（これはガンマ−インターフェロンを含
有する）と一緒に混合した。このアッセイにおいてＬＫ
調製物を精製されたガンマ−インターフェロンにより置
き換えることができる。次の４８時間にわたる標識した
チミジンの解放を腫瘍細胞の殺しの測定値として使用し
た。１２００Ｕ／ｍｌのＣＳＦ−１を含有するネズミＬ
−細胞コンディショニング培地としてＣＳＦ−１を添加
する効果を表２に示す。

【００７２】精製されたネズミＣＳＦ−１並びにＣＶ−
１およびＥ．ｃｏｌｉ（２２１）からのｒｈＣＳＦ−１
もまた、このアッセイにおいて有効であった。

【００７３】

【表２】 増殖の前１日または誘発期間の間にＣＳＦ−１を添加す
るかどうかにかかわらず、ターゲット細胞を殺す能力の
増加が認められた；しかしながら、最も劇的な効果は、
ＣＳＦ−１がこれらの両者の期間の間に存在したときに
観察された。

【００７４】単球およびマクロファージの刺激の原因と
しての汚染するバクテリアのＬＰＳの可能性は排除され
た：適用したＣＳＦ−１のＬＰＳの含量は低かった
（０．３ｎｇ／３０００ＵのＣＳＦ−１、リムルス（Ｌ
ｉｍｕｌｕｓ）の変形細胞のリゼイト（ＬＡＬ）アッセ
イによる）；活性を抗ＣＳＦ−１カラムヘの適用により
除去した；ポリミキシンＢを使用してＬＰＳを中性し
た；Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスからのマクロファージはＣＳ
Ｆ−１に応答したが、ＬＰＳに応答しなかった。

【００７５】他のミエロイドＣＳＦの効果 ５μｇのＬＰＳの静脈内（ｉ．ｖ．）投与後５時間に得
られた６匹のマウスの肺から、ＣＳＦ−ＧＭを調製し
た。肺を細かく切り、血清不含培地の中で３日間インキ
ュベーションしそして、ＷＯ８６／０４５８７、前掲、
に記載されているように、ＹＹＧ１０６免疫アフィニテ
ィーカラムを使用して上澄み液からＣＳＦ−１を消耗し
た（ＣＳＦ−１の含量は２２７Ｕ／ｍｌから７８Ｕ／ｍ
ｌに減少した）。ＣＳＦ−Ｇを同様に処理したＬＤ１
（黒色腫細胞系）の血清不含培地から調製した。ＣＳＦ
−ＧＭおよびＣＳＦ−Ｇの両者の含量は、コロニー刺激
アッセイにより、２０００Ｕ／ｍｌにおいて測定した。

【００７６】腹腔マクロファージを４０％の前述の培地
または２０００Ｕ／ｍｌのＣＳＦ−１で測定したＬ−細
胞培地と１日間インキュベーションし、次いで追加の培
地またはＬＫと４８時間インキュベーションし、そして
前述したようにＴＵ５の殺しについて測定した。

【００７７】結果を第１図に示す。ＣＳＦ−１はＴＵ５
に対する毒性の顕著な増強を示したが、ＣＳＦ−Ｇおよ
びＣＳＦ−ＧＭはいずれも効果をもたなかった。

【００７８】ＡＤＣＣの刺激因子としてのＣＳＦ−１の
ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験 ＭＩＡＰａＣａ細胞系から精製されたＣＳＦ−１（ほぼ
４０％の純度、比活性ほぼ２×１０^７Ｕ／ｍｇ）、ネズ
ミＬ−細胞コンディション培地（比活性ほぼ２．３×１
０^５Ｕ／ｍｇ）、およびＣＶ−１からの組み換えヒト
（ｒｈ）（＞９５％の純度、比活性ほぼ４×１０^７）
は、ＩＬ−２またはアルファ−、ベータ−またはガンマ
−ＩＦＮと組み合わせて、腫瘍ターゲットに対するマウ
スのマクロファージのＡＤＣＣを刺激することが見出さ
れた。

【００７９】ＡＤＣＣのアッセイにおいて、雌のＣ３Ｈ
／ＨｅＮまたはＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスに１．５ｍｌのプ
ロテオースペプトン（Ｄｉｆｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ、ミシガン州デトロイト）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注
射した。３日後、腹膜の滲出細胞を３×１０^５個のｂｉ
ｇ細胞／０．５ｍｌアルファＭＥＭ培地＋１０％加熱不
活性化胎児仔ウシ血清において平行の組のレプリカ１ｍ
ｌのウェルに付着させた。２時間後、ウェルをＰＢＳで
３回よく洗浄し、そしてＣＳＦ−１またはリンフォカイ
ンを添加し、そして３７℃において２日間インキュベー
ションした。細胞集団は形態的に＞９５％のマクロファ
ージであり、そして第２日に平行のウェルにおいて回収
された細胞数は異なる処理について同様であった。第２
日に、加熱不活性化抗血清（抗Ｔｈｙ、ウサギ抗マウス
脳、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ニューヨ
ーク州ウェストバーリイ）を、種々の希釈で平行の組の
１つを添加した。ターゲット、Ｒｌ．１、Ｔ−リンパ腫
の細胞系をマクロファージのウェルおよびマクロファー
ジ±ＣＳＦ−１、リンフォカインまたは抗血清を含まな
い平行のウェルに添加した。

【００８０】高い濃度（１μｇ／ｍｌ）のバクテリアＬ
ＰＳはマクロファージのＡＤＣＣを刺激するので、ネズ
ミおよびヒトのＣＳＦ−１調製物をＬＡＬアッセイによ
り試験し、そして０．２ｍｇ／ｍｌより少ないＬＰＳを
有していた。

【００８１】次いで、１０^５のＲ１．１ターゲット±抗
血清を導入し、そして生きているターゲット細胞を９、
２４、４８および９６時間に計数することによって、マ
クロファージを３：１のエフェクター：ターゲットの比
でＡＤＣＣについて試験した。対照マクロファージ＋抗
体を伴うＲ１．１の増殖は、抗体の不存在下に対照また
はサイトカイン処理したマクロファージの増殖、あるい
はＲｌ．１単独±抗体±サイトカインを伴う増殖のそれ
と同一であった。結果を表３に示す。

【００８２】

【表３】 ＩＦＮ−アルファおよびＩＦＮ−べータは５０Ｕ／ｍｌ
において５Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−ガンマと同一のＡＤＣＣ
−刺激作用を有した。ＩＦＮ−アルファおよびＩＦＮ−
べータは５０Ｕ／ｍｌにおいてＡＤＣＣに対する作用を
本質的にもたないが、ＣＳＦ−１の存在下に腫瘍の殺し
を５０Ｕ／ｍｌの各々ＩＦＮの単独を使用して見られる
レベルに刺激した。同様な作用はｒｈＩＬ−２で見られ
た：５Ｕ／ｍｌ単独でマクロファージを２日間処理する
と、マクロファージのＡＤＣＣが有意に促進された。Ｃ
ＳＦ−１はこの強いＩＬ−２誘発された活性を適度に増
強した。しかしながら、ＩＬ−２は１Ｕ／ｍｌまたは
０．２Ｕ／ｍｌのより低い無効の濃度で使用したとき、
ＣＳＦ−１の添加は殺腫瘍活性について強い増強作用を
示した。

【００８３】他のリンフォカインをＡＤＣＣの一次的刺
激因子として試験した。１，１０またはｌ００Ｕ／ｍｌ
のｒｈＴＮＦ単独と共に、あるいは１０００Ｕ／ｍｌの
ＣＳＦ−１と共にマクロファージを２日間インキュベー
ションすると、ＡＤＣＣ活性は有意に誘発されなかっ
た。ｒｈＩＬ−１アルファまたはベータは０．２〜５０
Ｕ／ｍｌにおいて、そしてネズミｒＩＬ−４は１〜ｌ０
０Ｕ／ｍｌにおいて、やはりＡＤＣＣ単独でまたはＣＳ
Ｆ−１とともに刺激しなかった。ＣＳＦ−１の代わりに
使用することができる他のコファクターを発見すること
を試みた。ネズミｒＧＭ−ＣＳＦおよびｒＩＬ−３は、
１０，１００または１０００Ｕ／ｍｌにおいて試験した
とき、ＡＤＣＣ単独またはＩＦＮ−ガンマとともにマク
ロファージの標準的２日の予備処理において、ＣＳＦ−
１と対照的に、促進しなかった。これらのサイトカイン
は、培地の中で２日間インキュベーションした後、マク
ロファージの不存在下にＲｌ．１ターゲットの増殖につ
いて作用をもたなかった。

【００８４】ｉｎ ｖｉｔｒｏターゲッテッドＡＤＣＣ
アッセイ 末梢血液のマクロファージヘのＣＳＦ−１の作用を研究
して、ＣＳＦ−１を使用する予備処理がターゲッテッド
ＡＤＣＣを増強することができるかどうかを決定した。

【００８５】ヒトエフェクター細胞をスタンフォード大
学の血液銀行（ＳｔａｎｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ）（カリフォルニア州パロアル
ト）から入手したドナーのバフィーコートから単離し
た。単核細胞をフィコール−ハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ
−Ｈｙｐａｑｕｅ）分別遠心により分離した。付着性単
核細胞（ＡＭＣ）を単離するために、全単核細胞を２４
ウェルの組織培養プレートの中にプレートし、そして３
７℃，５％ＣＯ_２において３０分間付着させた。付着し
ない細胞を加温したハンク均衡塩溶液および５０μｇ／
ｍｌのゲンタマイシンで洗浄除去した。すべてのエフェ
クター細胞の調製物の生存可能性はトリプタンブルー色
素の排除により＞９５％であった。付着性単核細胞をＦ
ＩＴＣ抗ＬｅｕＭ３（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏ
ｎ、カリフォルニア州マウンテンビュー）で染色し、そ
してＥＰＩＣＳ Ｖ細胞ソーターで＞８５％のＬｅｕＭ
３陽性であると分析された。

【００８６】抗体のヘテロ接合体１１３Ｆ１Ｆ（ａ
ｂ’）_２−３Ｇ８Ｆ（ａｂ’）_２、肺癌関連抗原および
ヒトＦｃＲＩＩＩ（ＣＤ１６）の両者を認識する化学的
に連結した抗体、およびハイブリッドのハイブリドーマ
由来の二重特異性抗体２Ｂ１（これは抗ＣＤ１６および
抗ｅｒｂＢ−２の活性を有する）を次の実験において使
用した。これらの抗体の両者は、エフェクターとしてヒ
トの全体単核細胞を使用して、ＳＫ−Ｂｒ−３−ターゲ
ット細胞のすぐれた特異的溶解を仲介する。

【００８７】ＡＤＣＣアッセイの１日前に、Ｔ７５フラ
スコの中にターゲット細胞（５０％のコンフルエント）
を２５ｍｌの培地の中で６２．５μＣｉの^３Ｈチミジン
（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，６．７μ
Ｃｉ／ミリモル）で標識した。３０時間後、細胞をフラ
スコの中でトリプシン処理し、そして３回洗浄した。４
０，０００／ウェルの標識したターゲット細胞をアッセ
イに使用した。

【００８８】エフェクター細胞、抗体およびＣＳＦ−１
を希釈するためにアッセイを通じて使用した培地は、８
ｍＭのグルタミンを含むＡＩＭ．Ｖ血清不含培地（Ｇｉ
ｂｃｏ）であった。最終の合計の体積は１ｍｌ／ウェル
であった。ＣＳＦ−１の処理のために、ＣＳＦ−１を含
むか、あるいは含まない培地をエフェクター細胞に添加
し、そして２〜３日間インキュベーションした。次い
で、抗体および標識したターゲット細胞を添加した。３
日後に、上澄み液の中のトリチウムの解放をシンチレー
ション流体としてのシトシント（Ｃｙｔｏｓｃｉｎｔ）
（ＩＣＮ）を用いて測定した。

【００８９】各試料を各実験において４平行において試
験した。平行のウェル対ウェルの変動は通常平均値の±
２０％より小さかった。平行の平均のトリチウムの解放
を使用して、式：（平均の試料の解放−自然的解放）
（最大の解放−自然的解放）により、特異的溶解％を計
算した。自然的解放を測定するために、標識したターゲ
ット細胞を培地単独の中でインキュベーションし、そし
て上澄み液を３日後に計数した。ターゲット細胞からの
トリチウムの自然的解放（エフェクター細胞の不存在
下）はすべての実験において平均して１０％より小さか
った。ターゲット細胞単独とインキュベーションしたと
き、抗体およびＣＳＦ−１のいずれも自然的溶解を増加
しなかった。最大の解放を測定するために、標識したタ
ーゲット細胞を０．５％のＳＤＳの最終濃度で溶解し
た。

【００９０】ヘテロ接合体の１１３Ｆ１Ｆ（ａｂ’）_２
−３Ｇ８Ｆ（ａｂ’）_２が１μｇ／ｍｌにおいて２つの
ドナーからのＡＭＣで溶解を仲介する能力を、第２図に
示す。ＡＭＣ＋ヘテロ接合体をＳＫ−Ｂｒ−３に対して
２０：１のＥ：Ｔ比で試験したとき、観測された平均の
抗体依存性溶解は２８％であった。第２図に示すよう
に、エフェクター細胞を１４ｎｇ／ｍｌのＣＳＦ−１と
予備インキュベーションしたとき、ヘテロ接合体仲介の
溶解はほぼ１１０％だけ増強された。

【００９１】合計の１１ドナーからの付着性細胞を二重
特異性抗体２ＢｌのＦ（ａｂ’）_２断片を使用して試験
した。ヒトＡＭＣ上のＦｃＲＩおよびＦｃＲＩＩの起こ
り得る参加を回避するために、２Ｂ１のＦｃＲＩＩをこ
の研究において全２Ｂ１の代わりに使用した。（２Ｂ１
の２つの親の抗体；５２０Ｃ９および３Ｇ８のＦ（ａ
ｂ’）_２断片は特異的溶解を仲介しないが、２Ｂ１のＦ
（ａｂ’）_２がターゲット細胞のほとんど完全な溶解を
引き起こすことを示すために、さらに実験を実施し
た。）ＣＳＦ−１の作用を１０〜１００ｎｇ／ｍｌにお
いて研究して、ＣＳＦ−１が２Ｂ１のＦ（ａｂ’）_２に
より仲介される溶解の増大において有効であるかどうか
を観察した。１４〜１００ｎｇ／ｍｌのＣＳＦ−１と予
備インキュベーションしたＡＭＣは、ＣＳＦ−１を使用
しないＡＭＣの予備インキュベーションより高い特異的
溶解を与えた（第３図）。得られたターゲット細胞の溶
解の合計量はドナー毎に変化したが、ＣＳＦ−１処理を
使用する比溶解活性の増加はすべての単球調製物におい
て再現性があった。応答性が最小であるか、あるいは応
答しないドナーのＡＭＣを刺激するためにはＣＳＦ−１
のより高いレベルが必要であるので、ＣＳＦ−１の投与
量の応答の研究は１００ｎｇ／ｍＩの２Ｂ１のＦ（ａ
ｂ’）_２を使用して実施し、そして結果を第４図に示
す。２Ｂ１のＦ（ａｂ’）_２の導入前に、ＡＭＣを増加
する濃度のＣＳＦ−１と予備インキュベーションする
と、１０ｎｇ／ｍｌで開始して、より高い特異的溶解が
得られ、そしてすべてのドナーにおいて１００ｎｇ／ｍ
ｌにおいてなおプラトーとならなかった。

【００９２】抗腫瘍効率についてのＣＳＦ−１のｉｎ
ｖｉｖｏ試験 Ａ．ＭｅｔｈＡ 肉腫のモデル ＣＶ−１細胞系から組み換え的に生産されたＣＳＦ−１
（Ｃ１５８）（ＬＡＬアッセイ；２ｎｇのＬＰＳ／ｍ
ｌ，８ｎｇのＬＰＳ／ｍｇのＣＳＦ，２×１０^７Ｕ／ｍ
ｇ）を、７日前にＭｅｔｈＡ 肉腫を皮下的に移植した
２０ｇのマウス（３匹のマウス／群）の中に、５０μｇ
／投与で１日２回５日間ｉ．ｐ．注射した。ＣＳＦ−１
処置の開始後６日間、３匹の未処置および３匹の処置し
たマウスを体重および腫瘍の体積について評価した。体
重の変化により測定して、毒性の証拠は存在しなかっ
た。第７日に、各群からの１匹のマウスを比較組織病理
学的分析のために殺した（全体の徴候なし）。４匹の残
りのマウスをＭｅｔｈＡ のモデルにおいて通常１４日
間評価した。結果を下表４に示す。

【００９３】

【表４】 結果が示すように、ＣＳＦ−１仲介の効力が、とくに第
６日の腫瘍体積の測定において、存在した。ＣＳＦ−１
群と対照群との間の差は、処置の開始後最初の７日間お
よびその後７日間最大であり、その後腫瘍はその通常の
増殖速度に戻った。これらのデータが示唆するように、
多数回の毎日投与（より長い期間の間、この投与レベル
において効力を改良するための連続的注入）またはより
高い投与レベルおよび薬物なしの日を含むように変更し
たスケジュールは効力を増強するであろう。

【００９４】同様な結果は、Ｅ．ｃｏｌｉからのＬＣＳ
ＦＣ▼１９０、およびＬＣＳＦ／ｃ▼２２１を使用して
見られた。プロトコルは５匹のマウスの群を使用して実
施した；５０μｇ／投与の各生産物を使用し、そして投
与（１日２回、５日間）は類似したが、ただしＥ．ｃｏ
ｌｉのＣ▼１５０およびＣ▼１９０の物質を使用し、こ
こでスケジュールを１０日に増加し、そして投与を７〜
８時間の間隔にした。各ＣＳＦ−１誘導した物質につい
て、△ＴＶ処置／△ＴＶ対照の百分率として、結果を表
５に表す。

【００９５】

【表５】 Ｂ．Ｂ１６転移のモデル ＣＳＦ−１をＢ１６の実験的転移のモデルにおいて試験
して、肺の転移の予防への効果を評価した。

【００９６】１×１０^５腫瘍細胞を０．２ｍｌのＣａ
^＋２およびＭｇ^＋２不含のＨＢＳＳの中に懸濁させ、麻
酔しないマウスの横の尾の静脈に接種した。腫瘍の接種
後、肺および脳を取り出し、水の中にリンスし、そして
秤量した。ボウイン（Ｂｏｕｉｎ）溶液の中で固定し、
そして表面の腫瘍の節の数／肺の対を解剖スコープの助
けにより決定した。

【００９７】組み換えヒトＣＳＦ−１（Ｎ▼３Ｃ２２
１）をすべての実験について使用した。ＣＳＦ−１は各
実験の前に凍結ストックから新しく準備し、そして注射
直前に米国薬局方０．９％の生理食塩水の中で希釈し
た。ＣＳＦ−１を１日１回（ＱＤ）×１０日のスケジュ
ールで静脈内に供給した。使用する投与量のレベルは次
の表に記載されている。非特異的および非治療的タンパ
ク質から成る陰性の対照として、米国薬局方ヒト血清ア
ルブミン（ＨＳＡ）または沸騰したＣＳＦ−１を使用し
た。ＣＳＦ−１を３０分間沸騰させてＣＳＦ−１活性を
不活性化した。

【００９８】表６に示す効力のデータが証明するよう
に、１×１０^５腫瘍細胞の静脈内接種３日前に開始し
た、ＱＤ×１０で静脈内に与えたＣＳＦ−１は、肺の転
移のメジアン数の有意な減少を生成する。対照的に、Ｃ
ＳＦ−１の治療を腫瘍細胞接種後１日に開始した場合、
肺の転移のメジアン数の有意な減少は観察されなかっ
た。致死率により測定した、明白な毒性はこの投与量レ
ベル（２．５〜５．０）において観察されなかった。

【００９９】

【表６】 第２の実験において、ＣＳＦ−１をｉ．ｖ．ＱＤ×５で
投与した。Ｂ１６−Ｗ１０腫瘍細胞を短時間の１分のト
リプシン処理により収穫し、遠心し、次いでＣａおよび
Ｍｇ不含のＨＢＳＳ中の単一の細胞懸濁液として調製し
た。第０日に、０．８×１０^４細胞をマウス当たりに
０．２ｍｌの合計の体積で横の尾の静脈に注射した。Ｃ
ＳＦ−１（Ｅ．ｃｏｌｉＮ▼３Ｃ▼２２１）処理（０．
２５〜５．０ｍｇ／ｋｇ／日）を、第−３日に開始し
て、ＱＤ×５，ｉ．ｖ．で投与した。第１４日に、マウ
スを殺し、肺を取り出し、水の中でリンスし、次いでボ
ウイン固定液で固定した。表面の腫瘍の節を解剖スコー
ブの助けにより計数した。表７に下に示すように、ＣＳ
Ｆ−１は、１．０，２．５または５．０ｍｇ／ｋｇ／
日、ＱＤ×５でｉ．ｖ．投与したとき、肺の転移のメジ
アン数を有意に減少した。

【０１００】

【表７】 次の実験は、ｉ．ｖ．投与するときのＣＳＦ−１と等し
く有効である皮下（ｓ．ｃ．）または腹腔内（ｉ．
ｐ．）のルートによりＣＳＦ−１を投与できることを示
す。

【０１０１】腫瘍細胞は上に教示されるように調製し
た。第０日に、７．５×１０^４細胞をマウス（５〜１０
匹の雌のＢＤＦ−１マウス／群）当たりに０．２ｍｌの
合計の体積で横の尾の静脈に注射した。ＣＳＦ−１を５
ｍｇ／ｋｇ／日で、第−３日に開始して、ＱＤ×５、３
つの異なるルートで投与した。第１８日にマウスを上に
教示するように調製した。結果を下表８に示す。

【０１０２】

【表８】 次の実験は、アルゼト（Ａｌｚｅｔ）浸透圧ポンプおよ
び皮下ボーラス投与を使用して皮下的に実施した連続的
注入により投与したＣＳＦ−１の効力を比較する。ＣＳ
Ｆ−１をｓ．ｃ．ボーラスとして、あるいは０．９％の
ＮａＣｌ中の連続的注入として投与した。連続的注入を
ｓ．ｃ．移植したアルゼトポンプ、１００３Ｄ型および
２００１型（これらはＣＳＦ−１を、それぞれ、第３日
または第１４日に供給した）を使用して実施した。１０
０３Ｄ型ポンプは１μｌ／時の平均ポンピング速度およ
び８７μｌの平均充填体積を有する。ポンプの移植のた
めに、ＢＤＦ−１雌（１８〜２０ｇ）をメトファン（Ｍ
ｅｔｈｏｆａｎｅ）で麻酔し、そして小さい背中の切開
を皮膚の中に作った。ポンプは皮膚の下に切開から離れ
た方向をさす流れモデレーターとともに移植した。切開
を創傷のリップで閉じた。すべての治療は第−３日に開
始した。

【０１０３】第０日に、７．５×１０^４Ｂ１６−Ｗ１０
腫瘍細胞をマウス当たりに０．２ｍｌの合計の体積で横
の尾の静脈に２７ゲージの針を使用して注射した。第１
８日に、マウスを殺し、肺を取り拙し、水の中でリンス
し、次いでボウイン固定液で固定した。

【０１０４】表９に示すように、ｓ．ｃ．連続的注入に
より０．２５ｍｇ／ｋｇ／日程度に低い投与量で投与し
たＣＳＦ−１は肺転移のメジアン数を減少するとき高度
に有効であった。

【０１０５】これらの研究が示唆するように、ＣＳＦ−
１は、ｓ．ｃ．連続的注入により投与したとき、１日１
回ｓ．ｃ．ボーラスにより同一期間にわたって与えた同
一投与量より、少なくとも１０倍以上効力がある。

【０１０６】

【表９】 ＣＳＦ−１の単独およびＩＦＮ−γとの組み合わせの抗
腫瘍効力についてのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験 この実施例は、ＣＳＦ−１およびＩＦＮ−γの外に、多
数のサイトカインを腫瘍細胞の細胞障害性の増強につい
て試験した。単核細胞（ＭＮＣ）を、正常の健康なボラ
ンティアのヘパリン処理した静脈の血液またはバッフィ
コートから、リンパ球分離媒質上の密度勾配遠心（ＬＳ
Ｍ−Ｏｒｇａｎｏｎ ＴｅｋｎｉｋａＣｏｐｒ．、ノー
スカロライナ州ダーハム）により分離した。次いでＭＮ
ＣをＰＢＳで２回洗浄し、そして４９．２％の等張パー
コル（Ｐｅｒｃｏｌｌ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に層
状にし、そして１５００×ｇで２５分間遠心した。界面
における単球（細胞遠心調製物の形態学的分析により≧
８０％の純度の単球）を収穫し、そして３７℃において
プラスチックの付着によりさらに精製した。付着を９６
ウェルのプレートの中で１．２×１０^５細胞／ウェルの
密度で実施した。１１時間後、非付着性細胞を激しい洗
浄により除去して、ほぼ１×１０^５細胞／ウェルを残し
た。

【０１０７】精製された単球を、ｃｓＦ−１（Ｅ．ｃｏ
ｌｉＮ▼３Ｃ▼２２１）、ＩＬ−１，ＩＬ−３，ＩＬ−
４，ＧＭ−ＣＳＦ（すべてＧｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐ．
から）、ＩＬ−２（Ｃｅｔｕｓ Ｃｏｒｐ．）を含有す
る０．１％のＦＣＳ、または培地単独（１°誘発）の中
で３日間培養した。３日後、単球を洗浄し、次いで２°
誘発因子とさらに２日間インキュベーションした。ＣＳ
Ｆ−１の存在または不存在下の１°誘発をいくつかの実
験においてフラスコの中で実施した。単球を組織培養フ
ラスコの中で実施した。単球を直接組織培養フラスコの
中で付着させ、非付着性細胞を除去し、そして１°誘発
因子を添加した。１°誘発後、単球をトリプシン処理お
よびおだやかな引っ掻きにより収穫した；生存可能な細
胞の計数をトリパンブルーの排除により実施し、そして
１×１０^５細胞／ウェルをプロトコルの残りの２日のた
めに９６ウェルのプレートの中でプレートした。

【０１０８】ＷＥＨＩ１６４殺腫瘍アッセイ（Ｃｏｌｏ
ｔｔａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８４）１３２；９
３６）を使用して、サイトカインの細胞障害性を試験し
た。簡単に述べると、活性な対数期のＷＥＨＩ１６４タ
ーゲット細胞をアクチノマイシンＤ（ａｃｔＤ）で１μ
ｇ／ｍｌにおいて３時間処理し、洗浄し、そして２００
μＣｉの^５１Ｃｒで標識するか、あるいはａｃｔＤおよ
び^５１Ｃｒで１時間３７℃において５％のＣＯ_２の中で
同時に処理した。単球から１００μｌの培養上澄み液を
除去した後、標識したターゲット細胞を１００μｌの体
積のエフェクター細胞に添加して、特記しない限り、１
０：１のエフェクター／ターゲットの比を達成した。細
胞を２００μｌの体積で５％のＣＯ_２の中で３７℃にお
いて６時間インキュベーションした。次いでプレートを
テーブルトップのスウィンギングバッケットの遠心機で
１２００ｒｐｍにおいて５分間遠心した。１００μｌの
上澄み液を各ウェルから除去し、そしてガンマカウンタ
ーで計数した。

【０１０９】Ｐ８１５ターゲット細胞を同様に処理した
が、ただしアクチノマイシンＤの予備処理を省略し、そ
してターゲット細胞およびエフェクター細胞を同時に１
８時間インキュベーションした。

【０１１０】誘発された細胞障害性％は、次の式を使用
して計算した： 〔（実験のｃｐｍ−自発的ｃｐｍ）／（最大のｃｐｍ−
自発的ｃｐｍ）〕×１００ ここで、 実験のｃｐｍ＝エフェクター細胞＋ターゲット細胞＋誘
発因子 自発的ｃｐｍ＝エフェクター細胞＋ターゲット細胞＋培
地 最大のｃｐｍ＝１％のＳＤＳで溶解したターゲット細胞
単独 結果を表１０および１１に示す：

【０１１１】

【表１０】 ＣＳＦ−１により誘発される活性のレベルは可変である
が、４０のこのようなドナーのうちの１６はＣＳＦ−１
単独で刺激したとき１０％〜４９％の増強された殺腫瘍
活性を示した。

【０１１２】表１１，ＣＳＦ−１を種々の２°誘発因子
の添加前に１°誘発因子として使用した。

【０１１３】

【表１１】 ２°誘発因子として試験しそしてＣＳＦ−１の存在また
は不存在下に効果をもたなかった他の因子は、５００Ｕ
／ｍｌまでにおいてＩＬ−１，ｌＬ−３，ＩＬ−４およ
びＧＭ−ＣＳＦを包含した。

【０１１４】ネズミ抗ウイルス活性のｉｎ ｖｉｔｒｏ
刺激 付着性チオグリコレート誘発マクロファージをＣＳＦ−
１と３日間インキュベーションし、そしてＶＳＶで一夜
感染させた（Ｌｅｅ，Ｍ．Ｔ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
（１９８７）１３８：３０１９−３０２２）。表１２
は、付着したままである細胞の５５０ｎｍにおける吸収
により測定した、結晶の紫色の染色を示す。

【０１１５】

【表１２】 したがって、ＣＳＦ−１処理した細胞はＶＳＶに対する
マクロファージの保護を示す。

【０１１６】ＣＭＶの感染のＣＳＦ−１によるｉｎ ｖ
ｉｖｏ処理 異型交配したＣＤ−１マウスをＣＶ−１細胞系から生産
されたＣＳＦ−１（Ｃ１５８）で４００ｍｇ／ｋｇ、
ｉ．ｐ．の投与量で、１日１回５日間、致死投与量より
少ないサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）で感染２日前に
開始して、処置した。マウスを感染後第３日に殺し、そ
してターゲットの器官、例えば、脾臓におけるウイルス
の複製の程度をプラークアッセイにより評価した。結果
が示すように、ＣＳＦ−１で処置したマウスは、生理食
塩水で処置した対照マウスと比較して、有意に低下した
（５７．８％の減少）脾臓のウイルスの力価を有し、Ｃ
ＭＶの感染はＣＳＦ−１処理したマウスにおいて厳しく
ない。

【０１１７】第２の実験において、２０ｇのＢａｌｂ／
Ｃマウス（５匹／群）を、最後のＣＳＦ−１の投与後４
時間に、致死量より少ない量のｍＣＭＶ（２×１０^４ｐ
ｆｕ／マウス、ｉ．Ｐ．）で感染させた。ＣＳＦ−１を
１日１回４日間、４つの投与量のレベル（３．６、０．
９、０．２３および０．０６ｍｇ／ｋｇ／日）でｉ．
ｐ．投与した。この亜急性の感染のモデルにおいて、マ
ウスは、感染後７日で血液および器官（脾臓、肝臓およ
び腎臓）の中のウイルスの力価（マウスの胚細胞上のプ
ラーク形成単位）を測定することによって、感染のひど
さについて評価した。ＣＳＦ−１で予備処置したマウス
は、脾臓、腎臓および肝臓の中のウイルスの力価を、生
理食塩水で処置した対照に比較して７５〜９７％の減少
を示した（Ｐ＜０．０１）。

【０１１８】ＣＳＦ−１の作用は投与量依存性である：
３．６、０．９、０．２３および０．０６ｍｇ／ｋｇ／
日のＣＳＦ−１の投与量において、それぞれ、９７．
８、９５．３、８０．９および６３．１％の平均脾臓ウ
イルス力価の減少が表１３に示すように観測された。

【０１１９】

【表１３】 別々に、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｎ▼３Ｃ▼２２１）の中で生産
されたＣＳＦ−１を致死的ｍＣＭＶ感染のモデルにおい
て試験した（これはＣＭＶの致死的投与量より少ないＣ
ＭＶを使用する上の実験と対照的である）。５０μｇ／
０．００５ｍｌのＣＳＦ−１を１３．５〜１４．５ｇの
Ｂａｌｂ／Ｃマウスに第−１日または第−１，０，１，
２および３日に（与えた単一の投与量／マウス）ウイル
スの対抗前に（４×１０^５ｐｆｕ／マウス、０．２ｍｌ
ｉ．ｐ．）および７日後に投与ｉ．ｐ．したとき、表
１４に示すように、生理食塩水で処置した対照と比較し
て、生存率の有意の増加が存在した。

【０１２０】

【表１４】 急性の感染のモデルにおける予防的作用について、１３
〜１４ｇのＢａｌｂ／Ｃマウスを致死的投与量のｍＣＭ
Ｖ（５×１０４〜２×１０５ｐｆｕ／マウス、ｉ．
ｐ．）で最後のＣＳＦ−１投与量（０．９ｍｇ／ｋｇ／
日〜７．２ｍｇ／ｋｇ／日の投与量のレベルを使用す
る）後４時間に感染させ、そして生存を１４日間監視し
た。この急性の感染のモデルにおいて、第５図に示すよ
うにＣＳＦ−１は５０，０００ｐｆｕ／マウスで対抗し
たマウスにおいて生存率を有意に増加したが、ＣＳＦ−
１のより低い投与量（０．９ｍｇ／ｋｇおよび３．６ｍ
ｇ／ｋｇ）は１００，０００ｐｆｕ／マウスにおけるｍ
ＣＭＶで対抗したマウスにおいて効果に劣るように思わ
れた。

【０１２１】これらのデータが証明するように、ＣＳＦ
−１は臨床医学においてウイルスの感染に対する免疫予
防剤として使用することができる。ＣＳＦ−１は単独で
または他のリンフォカインまたは抗ウイルス剤と組み合
わせて一般にウイルスの感染の処置において使用するこ
とができ、そしてとくに免疫抑制のウイルスの感染、例
えば、後天性免疫欠損症候群（エイズ）において利益で
ある。

【０１２２】好ましいｉ．ｐ．投与量の範囲は約０．０
５〜８．０ｍｇ／ｋｇのＣＳＦ−１／マウス／日であ
る。

【０１２３】ＣＳＦ−１によるバクテリアの感染のｉｎ
ｖｉｖｏ予防的処置 異型交配のＣＤ−１マウスに、ＣＶ−１細胞系（短いク
ローンＣ▼１５８）から生産されたＣＳＦ−１を個々に
投与し、宿主の中に導入したときグラム陰性セプシスを
引き起こすの原因となるバクテリアのＥ．ｃｏｌｉ（Ｓ
Ｍ１８）の臨床的分離物の致死的投与量（ＬＤ_１００６
×１０^７ｃｆｕ）で対抗する１日前に、１回投与ｉ．
Ｐ．した（１０μ９／投与）。次いでマウスを感染後７
日間生存について監視した。

【０１２４】この実験は、また、ＬＣＳＦＮ▼３Ｃ▼２
２１のバクテリア的に生産されたＣＳＦ−１を使用して
実施した。ＣＳＦ−１の各ロットを１×１０^７〜１．７
×１０^８単位／ｋｇ体重の合計の投与量範囲で４倍の希
釈で試験した。最小の保護的投与量をＥ．ｃｏｌｉ（６
×ｌ０^７ｃｆｕ／マウス）のｉ．ｐ．感染前の単一の１
日量として定義し、この投与量、生理食塩水または沸騰
したＣＳＦ−１の対照マウスに比較して、処置したマウ
スの生存率の統計学的に有意の（０．０５フィッシャー
の抽出物試験より小さいｐ値）増強を生成した。

【０１２５】

【表１５】 宿主の耐性へのＣＳＦ−１の作用の誘発に対する投与の
スケジュールの効果を研究するために実験を実施した。
マウスの群（１０匹）にＣＳＦ−１を０．９ｍｇ／ｋｇ
／投与／日で第１，２，３，４または５日に投与した。
次いで、マウスをＥ．ｃｏｌｉ（６×ｌ０^７ｃｆｕ／マ
ウス）ｉ．ｐ．で、最後のＣＳＦ−１注射後４時間に、
対抗した。

【０１２６】保護的作用を誘発するためには、表１６の
データが示すように、バクテリアの感染の５２〜１００
時間前に開始するＣＳＦ−１の多数回の投与は有効であ
る。

【０１２７】

【表１６】 感染の４，１８，２８，５２または７６時間前の単一の
ボーラスの注射（０．２〜９．０ｍｇ／ｋｇ）は、増強
された宿主の耐性を誘発するとき、有効ではなかった。

【０１２８】データが示すように、ＣＳＦ−１を使用す
る予備処置は致死的投与量のＥ．ｃｏｌｉで対抗したマ
ウスの生存率を有意に増大する。しかしながら、この効
果はＣＳＦ−１の投与量、タイミング、および投与のス
ケジュールに依存する。ほぼ０．７〜３．０ｍｇ／ｋｇ
／日のより高い投与量において、ほとんど完全な保護が
見られた。０．２ｍｇ／ｋｇのより低い投与量におい
て、また、保護が存在したが、効果は小さかった。

【０１２９】白血球減少症のモデル ＣＳＦ−１は、５０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミド
（ＣＹ）で予備処置したマウスにおけるＥ．ｃｏｌｉの
感染に対する保護を誘発した。マウスについてのＬＤ
_５０は約４００ｍｇ／ｋｇであり、より低いＣＹの投与
量はＬＤ_５０の１／８を表す。この投与は、３日早く
ｉ．ｐ．注射したとき、合計の白血球および好中球の減
少を誘発し、そしてマウスをＥ．ｃｏｌｉの感染に対し
ていっそう感受性とした（例えば、３×１０^７ｃｆｕ／
マウスを使用する感染は、ＣＹ処置したマウスの１００
％を殺したが、このＣＹを投与しなかったマウスの２０
％のみを殺した）。ＣＹ処置したマウスにＣＳＦ−１を
与えたとき（ＣＳＦ−１、０．８９ｍｇ／ｋｇ、１日１
回、４日間、ｉ．ｐ．）、１００％の生存率であった
が、その代わり生理食塩水を与えたマウスの生存率は３
０％であった。

【０１３０】カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ
ａｌｂｉｃａｎｓ）へのＣＳＦ−１のｉｎ ｖｉｖｏ
作用 ＣＳＦ−１を異型交配のＣＤ１マウス（２７〜２８ｇ、
雌）に、致死的投与量のカンジダ・アルビカンス（Ｃ．
ａｌｂｉｃａｎｓ）（１．５×１０^８酵母菌細胞／マウ
ス、ｉ．ｐ．）で対抗する３〜４日前に、毎日投与し
た。この対抗は、処置しないマウスおよび生理食塩水で
処置したマウスにおいて、３．０日のメジアン生存時間
（ＭＳＴ）を生じた。ＣＳＦ−１処置したマウスは、
１．９および０．ｌｍｇ／ｋｇの投与量において、それ
ぞれ、１５および１３日のＭＳＴを示した。生存時間の
この４倍の増加はｐ＝０．０ｌ（対数範囲試験）におい
て有意である。内毒素からの妨害の可能性を最小とする
ために、内毒素を事実上含まない（＜０．０５ｎｇ／ｍ
ｇのタンパク質）高度に精製したＣＳＦ−１を使用し
た。また、予防作用はＣＳＦ−１の試験物質の加熱不活
性化により除去されることが示された。この保護は、末
梢血液の循環する単球および好中球の数の増加および腹
膜のマクロファージの２〜３倍の増加に関連した。した
がって、ＣＳＦ−１はカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａ
ｌｂｉｃａｎｓ）の感染に対する宿主の耐性を増強し、
そしてこの作用は多分マクロファージおよび好中球の活
性化により仲介される。

【０１３１】ＣＳＦ−１をまた追加のモデルにおいて試
験し、ここでカンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃ
ａｎｓ）を全身的（ｉ．ｖ．）に供給した。ＣＳＦ−１
は１．９ｍｇ／ｋｇ／日の投与量ＱＤ×４においてｉ．
ｐ．またはｉ．ｖ．投与した。ＣＳＦ−１の最後の投与
後４時間に、２×ｌ０^５ｃｆｕ／マウスをｉ．ｖ．注射
した。これらの投与のいずれも、生理食塩水を注射した
対照マウスと比較したとき、生存率の有意の増大を生じ
た。

【０１３２】ＣＳＦ−１の処置後の真菌の感染のラット
の生存時間 抗ウイルス剤のフルコナゾールと組み合わせてＣＳＦ−
１を使用して、与えたＣＳＦ−１の毎日のボーラスの皮
下（ＳＱ）注射は感染した動物のメジアン生存時間をラ
ットのカンジダ症のモデルにおいて５日（フルコナゾー
ル単独を与えた動物において）から３０日以上（ＣＳＦ
−１およびフルコナゾールの組み合わせを与えた動物に
おいて）治療的に改良した。

【０１３３】雄のフィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）−３４
４ラット（体重２００〜２５０ｇ）をチャールズ・リバ
ーラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手した。ラットを５匹／
ケージで収容し、そして水および実験室の餌を任意に与
えた。付随的ウイルスおよびマイコプラズマについての
血清学的試験は、これらの動物において日常的に陰性で
ある。

【０１３４】アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（マリイランド州ベセスダ）
からのカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌ
ｂｉｃａｎｓ）株ＡＴＣＣＮｏ１８８０４を、３７℃に
おいてトリプチカーゼ大豆ブロスの中で一夜増殖させ、
次いで遠心分離した。芽状胞子を再懸濁させ、そして９
５％の胎児子ウシ血清および５％のジメチルスルホキシ
ドの中にアリコートを取り、そして−８０℃において凍
結した。各実験の日に、２つのアリコートをプールし、
次いで注射のためにリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）の中で４
×ｌ０^６芽状胞子／ｍｌに希釈した。各実験の接種を酵
母エキスペプトン寒天上にプレートして。生存可能な有
機体の計数を確証した。

【０１３５】フィッシャー−３４４ラットを２×１０^６
のカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉ
ｃａｎｓ）の芽状胞子（０．５ｍｌ）で横の尾の静脈の
中へのｉ．ｖ．注射により感染させた。ＣＳＦ−１の作
用の研究において、単一の０．３ｍｇ／ｋｇの投与量の
フルコナゾール（Ｄｉｆｌｕｃａｎ，Ｐｆｉｚｅｒ，ニ
ューヨーク州ニューヨーク）を２時間後に皮下（ＳＱ）
投与した。フルコナゾールの処置後直ちに、０．５ｍｌ
のＳＱ投与量のＣＳＦ−１を異なる部位に与えた。ＣＳ
Ｆ−１の処置は１０回の合計の投与でさらに９日間続け
た。動物を３０日間毎日死亡率について評価した。

【０１３６】未処置のフィッシャー−３４４ラットにお
いて１００％の死亡率を生成するために必要なカンジダ
・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）
の投与量は、２×１０^６芽状胞子であると決定された
（表１７）。この投与量は３〜６日で死亡を生じ、メジ
アン生存時間は４日であった。

【０１３７】表１８は、カンジダ・アルビカンス（Ｃａ
ｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）の感染後ＣＳＦ−１の
治療的ＳＱ投与とフルコナゾールを組み合わせた、４回
の実験の結果を表す。０．３および１．０ｍｇ／ｋｇ／
日のＣＳＦ−１の投与量は最も効力があるように思わ
れ、対照動物のメジアン生存時間（５日）より少なくと
も６倍の、＜３０日のメジアン生存時間を生ずる。

【０１３８】

【表１７】

【０１３９】

【表１８】 ＣＳＦ−１を使用する真菌の感染の消散 １８人の治療に対して抵抗力のある侵入性の真菌の感染
をもつ患者をＣＳＦ−１で処置した。骨髄移植（ＢＭ
Ｔ）センターと呼ぶ患者は研究に適格であったが、再発
性において悪性である患者は不適格であった。診断、年
令、移植片対宿主の病気（ＧＶＨＤ）の状態または患者
の全体の状態について排除を行わなかった。１８人の患
者の臨床的特性を表１９に示す。

【０１４０】侵入性真菌の感染の診断は、バイオプシー
の標本における有機体の証明、閉じた体液（すなわち、
大脳脊髄液）の培養物または陽性の血液培養物の存在下
の侵入性の病気について放射性学の証拠を必要とした。
気管支鏡検査の洗浄液、胃腸バイオプシーの標本または
単一の血液培養物の中に存在する真菌のみの証明は、侵
入性の病気の不十分の証拠であると考えた。感染性真菌
の有機体、関係する器官、および感染の追跡に使用した
診断の方法を表１９に示す。

【０１４１】すべての患者を検査し、そして毎日日常的
血液培養物を取り、ならびに血液化学および完全な血球
の計数を毎日実施した。一般に、骨髄の吸引およびバイ
オプシーを治療の前に実施して悪性を除外した。周期的
基準でかつ剖検で初期の診断手順を使用して、真菌の感
染を再評価した。

【０１４２】この研究を相Ｉの投与量のエスカレーショ
ンと表示し、ここで患者を連続的に登録した。すべての
患者を最大の許容される投与量で最良の有効な抗真菌的
治療で維持した。ＣＳＦ−１（比活性、ほぼ３〜１０×
１０^７Ｕ／ｍｇ）を０．０５〜２．０ｍｇ／ｍ^２の投与
量で与えた。ＣＳＦ−１を１００ｍｌの０．５％のアル
ブミンを含む通常の生理食塩水で中央の静脈カテーテル
により、毎日２時間の静脈内注入で７日間投与した。７
日後、臨床的応答が存在しない場合、投与量をさらに７
日間２倍にした。３回の投与量のエスカレーションを単
一の患者に許した。抗真菌剤効力が認められた場合、真
菌の感染の消散が記録することができるまで、ＣＳＦ−
１を続けた。２ｍｇ／ｍ^２で処置した患者はその投与量
で維持した。

【０１４３】ＣＳＦ−１はすべての投与量でよく許容さ
れた。それに帰することができる特定の症候または血液
化学の変化は存在しなかった。ＣＳＦ−１の注入の過程
の間に、前以て存在するＧＶＨＤのひどさへの有意の悪
影響は存在しなかった。

【０１４４】１１人の患者は侵入性のカンジダ症を有
し、４人はアスペルギルス症を有し、２人は酵母菌種を
もつと診断され、そして１人はロドトルラ属（Ｒｈｏｄ
ｏｔｏｒｕｌａ）をもつと診断された（表１９）。３人
の患者は、アンフォテリシンＢに対して応答しなかった
進行性の真菌の疾患についてのＢＭＴの前に、ＣＳＦ−
１を与えられた。これらの患者のうちの１人は、アスペ
ルギルス症のために２つの腔（ｓｉｎｕｓ ｃａｖｉｔ
ｉｅｓ）の切除を実施されていた。しかしながら、ＣＴ
スキャンは残留する腔の固まりを証明し、そして吸引の
培養物はアスペルギルスを証明し続けた。空洞化する多
葉の肺の節が発生しそして患者が１ｍｇ／ｍｇのアンフ
ォテリシンで進行的に窒素過剰血症となったとき、ＣＳ
Ｆ−１を開始し、そしてアンフォテリシンの投与量を
０．５ｍｇ／ｋｇに減少した。治療の３５日後、ＣＴス
キャンは腔の除去を示し、そしてアスペルギルスについ
て培養物は陰性となった。２つの最大の空洞の肺の節を
除外してすべては消散した。両者の節を引き続いて切除
し、そして真菌の要素の不存在を示した。患者は抗真菌
の治療なしに止まり、無関係のＢＭＴを待っていた。第
２の処置された患者は、ＢＭＴの前に、臨床的または放
射線学的応答なしでカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄ
ｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）のために２ｇのアンフォテ
リシンを与えられた（肝臓および脾臓を含む）。ＣＳＦ
−１の３５回の投与後、改良の顕著な放射線学的証拠が
認められ、そして肝臓を再バイオプシーして、残留する
真菌の感染の証拠はなかった。第３の患者は進行性の肝
臓のカンジダ症を有した。彼女は、２８回のＣＳＦ−１
の投与を受けた後、真菌の感染の臨床的および放射線学
的消散を有した。

【０１４５】１８人の患者のうちの１３人は、真菌の感
染において消散または臨床的改良を示した（表１９）。
幾人かの患者は真菌の感染の完全な消散を有し、そして
病院から解放された。２人の患者は、感染が除去された
後、骨髄の移植を受けるために十分に良好であった。残
りの５人の患者のうちで、１人の患者は評価不可能であ
り、他の患者は侵入性真菌の感染をもっていなかったか
も知れないが、膵臓炎のために死亡し、そして残りの３
人の患者は応答を示さなかったが、ＣＳＦ−１の処置を
８日間以下受けた。

【０１４６】

【表１９】 白血球の計数のｉｎ ｖｉｖｏ刺激 異型交配のＣＤ−１マウスに、精製されたヒトＣＳＦ−
１を、２ｍｇ／ｋｇ／投与で１日３回、連続する５日間
投与した。合計の血球の計数は、生理食塩水で処置した
マウスにおける８，７００／μｌからＣＳＦ−１処置し
たマウスにおいて１２，０００〜１３，０００／μｌに
増加した。さらに、好中球の計数は生理食塩水で処置し
たマウスにおける１，０７８／μｌに比較してＣＳＦ−
１処置したマウスにおいて６，８２１／μｌに増加し
た。

【０１４７】この作用はＣＳＦ−１の投与量および投与
のスケジュールに依存する。末梢血液の好中球の増加
は、単一の投与量のＣＳＦ−１を投与ｉ．ｐ．後、２〜
４時間において検出可能であった。これらの結果が示す
ように、ＣＳＦ−１の投与は臨床的および獣医学的に穎
粒球の生産の刺激因子および白血球の計数の増大因子と
して有用である。

【０１４８】創傷の治癒におけるＣＳＦ−１ 動物のモデルおよびプロトコル、例えば、Ｇｏｏｄｓｏ
ｎおよびＨｕｎｔ（Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．，１９８
２，３３：３９４）のゴレテックス（Ｇｏｒｅｔｅｘ）
ミアチュア創傷治癒のモデルを使用して、ＣＳＦ−１を
アッセイし、ここで移植されたゴレテックス管に侵入性
マクロファージ、線維芽および他の結合組織の細胞を充
填する。治癒を管の内容物を顕微鏡検査により評価す
る。第２のモデルはＥｉｓｅｎｇｃｒら（１９８８，Ｐ
ＮＡＳ（ＵＳＡ），８５：１９３７）の切除の創傷治癒
のモデルであり、ここで創傷を視的に観察し、そしてパ
ンチバイオプシーを実施して毛の小胞から生ずる表皮細
胞層の数を監視する。第３のモデルは漿膜のモデル、例
えば、Ｆｏｔｉｖら（１９８７，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，
１５１：２０９）の熱損傷した睾丸の漿膜であり、ここ
で治癒を固定した区画において損傷した部位の中皮のリ
サーフェシング（ｒｅｓｕｒｆｅｃｉｎｇ）の程度によ
り評価する。これらのモデルの各々の教示をここに引用
によって加える。

【０１４９】一般に、切除の創傷治癒のモデルの参考文
献に記載されているように、局所的創傷のための表皮細
胞誘導因子（ＥＧＦ）を使用して、生理食塩水の中で１
０^４〜１０^８Ｕ／ｍｌのＣＳＦ−１の中で非付着性包帯
をソーキングすることによって、ＣＳＦ−１を創傷の部
位に適用する。あるいは、同様な量のＣＳＦ−１をゴレ
テックス管の中にＧｏｏｄｓｏｎおよびＨｕｎｔ、前
掲、に記載されているように移植の時に導入するか、あ
るいはＣＳＦ−１をまた遅く解放性のマトリックスの中
に混入し、そして創傷の部位に（ゴレテックス管の中
で、または包帯の中で、遅い解放性のゼラチンまたはコ
ラーゲンに基づくマトリックスの中で、あるいは腹腔内
中の注射により）全身的処置により１日１〜３回（ｉ．
ｖ．、ｉ．ｐ．またはｓ．ｃ．）１０〜１０，０００μ
ｇ／ｋｇ／日の投与量で適用することができる。

【０１５０】完全な厚さの皮膚の切除のモデルにおい
て、５匹の雌のＢＤＦ−１マウス（体重１８〜２０ｇ）
の実験群をメトキシフルランの吸入（Ｍｃｔｏｆａｎ
ｃ，Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ，Ｉｎｃ．，ニュージャ
ージイ州クロシング）により麻酔した。きれいな外科的
技術を使用して創傷をつくった。透明なテープのストリ
プを背中の上の仙骨と肩骨との間に適用した。皮膚をマ
ウスの長さに対して平行に持ち上げ、そして完全な厚さ
の切除の創傷を６ｍｍの直径のポントを使用して作っ
た。テープを除去し、左および右の円形の両側の創傷の
間において無傷の皮膚の幅８〜１０ｍｍのストリプを露
出した。３成分の抗生物質の軟膏（ポリミキシンＢ−バ
シトラシン−ネオマイシン）を新しい創傷に綿の先端の
スパブ棒を使用して適用した。

【０１５１】創傷を手持ちのノギスで前後および横方向
の寸法で第０，１，２，３，４，７，９および１０日
（第０日は創傷形成の日を表す）で測定した。創傷は最
初は円形であったが、楕円形に治癒する傾向があった。
この理由で、概算の創傷の面積は楕円の領域についての
式Ａ＝ｐｉ（Ｂ×Ｃ）／４を使用して計算し、ここでＡ
＝領域（ｍｍ^２）、Ｂ＝前後の軸の創傷の直径（ｍ
ｍ）、そしてＣ＝横方向の軸の創傷の直径（ｍｍ）であ
る。各創傷について、任意の所定の時点における面積を
第０日における最初の創傷の面積で割ることによって創
傷の閉鎖％を計算した。

【０１５２】Ｅ．ｃｏｌｉが生産した長いクローツＣＳ
Ｆ−１Ｎ▼３Ｃ▼２２１（比活性＞６．０×１０^７単位
／ｍｇ）を０．９％の塩化ナトリウム（米国薬局方）の
中に希釈し、そして１００μｌの最終の注射体積で横の
尾の静脈の中で静脈内注射した。０．５ｍｇ／ｋｇ／日
（１０μｇ／日）〜１０．０ｍｇ／ｋｇ／日（２００μ
ｇ／日）の範囲の投与量のＣＳＦ−１を毎日合計７日間
投与し、最初の投与は創傷形成後ほぼ４時間に実施し
た。０．９％のＮａＣｌの中で希釈したヒト血清アルブ
ミン（ＨＳＡ）を非特異的対照として選択し、そして
５．０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で対照動物に投与した。

【０１５３】各日に処置の群の間で個々のスチューゲン
ト式テストにより統計学的分析を実施した。すべての比
較について、ｐ＜０．０５のとき、統計学的意味が認め
られた。

【０１５４】新しい創傷において出血はほとんどあるい
はまったく起こらなかった。薄い線維質の皮膜が１２〜
２４時間以内に明らかとなり、１〜２日以内に痂皮に進
行した。痂皮は乾燥すると、収縮し、下に横たわる造粒
化組織に付着する程度が徐々に低くなったが、創傷の面
積の測定を歪めなかった。各群および日について５匹の
マウスの右および左の創傷の測定値から、平均の創傷の
面積を計算した。初期の創傷の面積は処置群のいずれに
間においても異ならなかった。

【０１５５】第６図に示すように、創傷の閉鎖はＨＳＡ
処置した対照よりＣＳＦ−１処置したマウスにおいて急
速であり、ここで閉鎖は所定の日における初期の創傷の
面積の減少％として定義される。第６図に記載されてい
る値は各時点における５匹のマウスの平均を表す。ＣＳ
Ｆ−１処置した群はすべての時点において対照と異なっ
た（ｐ＜０．０５）。「正方形」は対照を表す；「＋」
はＣＳＦ−１を表す（１０．０ｍｇ／ｋｇ／日）；「三
角形」はＣＳＦ−１を表す（５．０ｍｇ／ｋｇ／日）；
そして「×」はＣＳＦ−１を表す（０．５ｍｇ／ｋｇ／
日）。創傷の閉鎖の最大の増大は１０．０ｍｇ／ｋｇ／
日を受け取ったマウスにおいて観察された。中間の
（５．０ｍｇ／ｋｇ／日）および低い（０．５ｍｇ／ｋ
ｇ／日）の投与量のＣＳＦ−１は、また、創傷の閉鎖速
度を有意に増加したが、これらの投与量において、２つ
の応答はほぼ等しかった。

【０１５６】ＣＳＦ−１処置した創傷において見られた
創傷の閉鎖速度の増大は、最初の数日以内に起こったよ
り急速な初期相から生ずるように思われた。この期間の
間に、閉鎖は表１８に示すようにＣＳＦ−１によりほぼ
４０％増大した。その後、すべての群における閉鎖速度
はほぼ同一であり、そして創傷が完全に治癒されるま
で、一定して減少し始める。ＣＳＦ−１処置したマウス
の創傷はＨＳＡ処置した対照より１〜２日速く５０％の
閉鎖に到達し（第６図）、しかも１００％の閉鎖に到達
するために要求される時間をすべての群についてほぼ１
０日であった。

【０１５７】

【表２０】 ＣＳＦ−１をマウスに５．０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で
合計７日間、創傷後４時間に開始して、静脈内投与し
た。 次の式で計算した閉鎖の増大：（閉鎖％（処置）−閉鎖
％（対照））／閉鎖％（対照） 第３日から第１０日までの時点において実施した全体の
観察において、創傷の空間を取り囲む皮膚の脈管の含量
の変化は対照およびＣＳＦ−１形質転換された創傷にお
ける治癒の過程の間に起こることが示唆された。創傷後
３日程度に早く、脈管構造の増加（より大きいかつより
曲がりくねった血管）は、対照マウスにおける創傷部位
を取り囲む皮膚の領域において、肉眼により明らかであ
った。７日までに、対照の創傷を取り囲む皮膚の脈管の
含量は減少したが、ＣＳＦ−１処置したマウスにおける
創傷を取り囲む皮膚は、創傷を取り囲む面積および創傷
の部位に隣接しない血管の両者において、対照のマウス
より有意に大きい脈管形成を示した。この応答はより大
きい数の血管およびより広範な分岐形成の両者を包含す
る。

【０１５８】ＣＳＦ−１は、また、他の成長因子と組み
合わせて創傷の治癒を促進することができ、このような
成長因子の例は、表皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽成長
因子（塩基性および酸性ＦＧＦ）、血小板誘導成長因子
（ＰＤＧＦ）または形質転換体Ｇ−ＣＳＦ（ＴＧＦアル
ファおよびベータ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、血小板誘導
創傷治癒因子（ＰＤＷＨＦ）および他の物質、例えば、
ソマトメジンＣおよびビタミンＣである。

【０１５９】ＣＳＦ−１の配合および投与 組み換え的に生産されたヒトＣＳＦ−１を、標準の製剤
学的手順を使用して、投与のために配合することができ
る。究極的適用に依存して、ＣＳＦ−１は注射可能なま
たは局所的形態で調製し、そして唯一の活性成分とし
て、あるいは相補的または同様な活性を有する他のタン
パク質または化合物と組み合わせて使用することができ
る。このような他の化合物は、別の抗腫瘍剤、例えば、
化学療法剤、例えば、アドリアマイシンまたはリンフォ
カイン類、例えば、ＩＬ−１、−２、−３、−４および
−６、アルファ−、べータ−およびガンマ−インターフ
ェロン、ＣＳＦ−ＧＭおよびＣＳＦ−Ｇ、および腫瘍壊
死因子を包含することができる。ＣＳＦ−１活性成分の
作用はこのような個々の化合物の存在により増強または
改良することができる。前述したように、ＣＳＦ−１は
有益な方法で適当な血球と相互作用することができ、し
たがって、本発明の化合物はこのような細胞とＣＳＦ−
１との混合物を、必要に応じて追加のリンフォカイン類
またはサイトカイン類の存在下に、インキュベーション
することを包含する。このようなインキュベーション混
合物の上澄み液の分画、あるいは細胞を含有する全体の
混合物を同様によく使用することができる。食い違いの
タイミングはある組み合わせ、例えば、ＣＳＦ−１およ
び１〜２日後にガンマーインターフェロンについて好ま
しいことがある。

【０１６０】ここに記載するＣＳＦ−１は、一般に、治
療的に０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の量で、単一のボ
ーラスの投与または分別して２４時間かけて、すべての
適用のために、例えば、感染症、創傷の治癒、骨髄造血
および免疫性の回復、および癌のために投与される。

【０１６１】本発明の範囲はここに記載する例示的実施
態様により限定されると解釈すべきでなく、特許請求の
範囲に従い決定されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、腫瘍細胞を殺すマクロファージの能力
の増強における、ＣＳＦ−１および他のコロニー刺激因
子の活性の比較である。

【図２】図２は、ＣＳＦ−１の存在および不存在下に付
着性血液単核細胞（ＡＭＣ）による癌細胞の溶解を仲介
する、１μｇ／ｍｌのヘテロ接合体１１３Ｆ１Ｆ（ａ
ｂ’）_２−３Ｇ８Ｆ（ａｂ’）_２の能力を示す。

【図３】図３は、抗体単独と比較した、１４〜１００ｎ
ｇ／ｍｌのＣＳＦ−１と共に予備インキュベーションし
たＡＭＣによる溶解を仲介する、二重特異性抗体２Ｂｌ
の能力を示す。

【図４】図４は、ｌ００ｎｇ／ｍｌの２Ｂ１を使用して
のＡＭＣについてのＣＳＦ−１の投与量の範囲の研究の
結果を示す。

【図５】図５は、ネズミのサイトメガロウイルス（ｍＣ
ＭＶ）の致死的投与量に対するＣＳＦ−１の保護作用を
示す。

【図６】図６は、対照およびＣＳＦ−１処置したマウス
における創傷閉鎖のデータを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/48 Ａ６１Ｐ 7/00 Ａ６１Ｐ 7/00 31/10 31/10 35/00 35/00 37/04 37/04 43/00 １２１ 43/00 １２１ Ｃ０７Ｄ 233/60 １０３ // Ｃ０７Ｄ 233/60 １０３ 239/47 Ｚ 239/47 Ｃ０７Ｈ 17/08 Ｋ Ｃ０７Ｈ 17/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 コン ティー． チョン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94587, ユニオン シティ，フェローズ ストリー ト 4343 (72)発明者 ジェイムズ デブリン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94549, ラファイエット，アッパー ハッピー バ レー ロード 1146 (72)発明者 ロバート ジマーマン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94563, オリンダ，ラ クレスタ ロード 64 (72)発明者 シャロン リー オーカーマン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94620, オークランド，ピー．オー．ボックス 20852 (72)発明者 デビッド ビー． リング アメリカ合衆国，カリフォルニア 94061, レッドウッド シティ，トラマン ストリ ート 1248 (72)発明者 シルビア シー マ アメリカ合衆国，カリフォルニア 94555, フレモント，ステファノ コート 33535 Ｆターム(参考） 4C057 BB02 CC04 DD01 KK24 4C076 AA11 AA94 AA95 BB11 BB16 CC31 CC41 EE59 FF31 4C084 AA01 AA02 AA19 AA23 AA24 BA44 DA19 MA02 MA66 NA01 NA05 ZB261 ZB351 ZC752 4C086 AA01 AA02 BC38 BC42 EA15 MA01 MA02 MA03 MA04 MA66 NA01 NA05 ZB26 ZB35 ZC75

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 コロニー刺激因子−１（ＣＳＦ−１）を
   含んでなる、ヒトにおける真菌の感染を治療するための
   医薬組成物。
2. 【請求項２】 前記感染が、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄ
   ａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、
   クリプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヒ
   ストプラスマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、コクシジ
   オイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、パラコシジ
   オイデス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、ケ
   カビ属（Ｍｕｃｏｒ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏ
   ｒｕｌａ）、スポロロトリクス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉ
   ｘ）およびブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）
   から本質的に成る群より選択される少なくとも１種の真
   菌により生ずるものである請求項１に記載の医薬組成
   物。
3. 【請求項３】 前記真菌がカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄ
   ａ）の種である、請求項２に記載の医薬組成物。
4. 【請求項４】 組み換えＣＳＦ−１を１種または２種以
   上の抗真菌剤とともに含んで成る請求項１に記載の医薬
   組成物。
5. 【請求項５】 前記１種または２種以上の抗真菌剤がア
   ンフォテリシン（Ａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ）Ｂ、５フ
   ルオロ−サイトシン、およびミコナゾール（Ｍｉｃｏｎ
   ａｚｏｌｅ）から本質的に成る群より選択される、請求
   項４に記載の医薬組成物。
6. 【請求項６】 非経口的に投与するための請求項１に記
   載の医薬組成物。
7. 【請求項７】 前記ＣＳＦ−１をボーラスの注射によ
   り、ｉ．ｖ．ボーラスにより、一定の注入によるか、あ
   るいは連続的注入により皮下投与するための請求項６に
   記載の医薬組成物。
8. 【請求項８】 真菌の感染を処置するのに有効である１
   日のＣＳＦ−１の投与量が０．５〜１０ｍｇ／ｍ^２であ
   る、請求項１に記載の医薬組成物。
9. 【請求項９】 真菌の感染を処置するのに有効である前
   記１日のＣＳＦ−１の投与量が０．５〜５ｍｇ／ｍ^２で
   ある、請求項８に記載の医薬組成物。
10. 【請求項１０】 前記ＣＳＦ−１を少なくとも１４日間
    投与するための請求項６に記載の医薬組成物。
11. 【請求項１１】 前記ＣＳＦ−１を少なくとも２１日間
    投与するための請求項１０に記載の医薬組成物。
12. 【請求項１２】 前記ＣＳＦ−１を免疫抑制した個体に
    投与するための請求項１に記載の医薬組成物。
13. 【請求項１３】 エイズまたは他の感染のために、骨髄
    移植とともにまたは癌の化学療法において与えられる化
    学薬物のために、あるいは熱傷または他の主要な外傷の
    ために、免疫抑制された個体に前記ＣＳＦ−１を投与す
    るための請求項１２に記載の医薬組成物。
14. 【請求項１４】 前記ＣＳＦ−１がポリエチレングリコ
    ールに共有結合により連結されている、請求項１〜４の
    いずれか１項に記載の医薬組成物。
15. 【請求項１５】 前記ＣＳＦ−１が短い形のＣＳＦ又は
    長い形のＣＳＦである、請求項１〜４のいずれか１項に
    記載の医薬組成物。
16. 【請求項１６】 日用量０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇのＣ
    ＳＦ−１を含む、請求項１に記載の医薬組成物。