KR20240028370A - 3차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
2D 배양조건 대비 3D 배양조건에서 특정 유전자와 사이토카인의 발현량이 변화하는 특성을 갖는 3차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 및 이의 용도에 관련된 것이다.
Description
2D 배양조건 대비 3D 배양조건에서 특정 유전자와 사이토카인의 발현량이 변화하는 특성을 갖는 3차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 및 이의 용도에 관련된 것이다.
일반적으로 사용되고 있는 단일층 세포배양 시스템(monolayer cell culture system)은 배양법이 비교적 용이하고 세포 생존 능력이 탁월하다는 장점을 가지고 있어 생물학 분야에 많이 이용되고 있다. 하지만 인체 조직과 같은 3차원적인 미세 환경 조건을 구현하기에는 한계가 있다. 실제, 세포가 생존하며 생활사를 유지하기 위해서는 세포 주변의 환경을 구성하고 있는 성장인자, 호르몬, 부착성분자(adhesion molecule), 세포외기질과 같은 인자들과의 상호작용이 유지되어야 하지만 이전까지 이루어진 특정 질환 세포의 생성 및 전이 그리고 이를 치료하기 위한 치료요법에 관한 연구에 있어서는 세포의 미세 환경 조건을 고려하지 않은 채 연구되어 왔다. 이러한 단일층 세포배양 시스템의 한계점을 보완할 수 있는 모델로서 3차원(3D) 세포배양이 주목을 받고 있다. 3D 세포배양 시스템의 이점은 형태학상 실제 특정 질환 세포와 매우 유사한 구조를 가지고 있다는 것이다. 세포의 스페로이드(spheroid) 구조는 단지 형태학적 의미뿐 아니라 그가 지니고 있는 기능과도 매우 연관성이 깊은 것으로 알려져 있기에 다양한 세포에서 형성될 수 있는 스페로이드의 구조가 세포 생활사에 미치는 영향을 고려할 수 있다. 또한 세포와 세포사이의 상호작용뿐 아니라 세포와 주변의 미세 환경과의 상호작용으로 인한 세포 내 신호전달이 가능하기에 특정 질환의 치료에서 나타나는 세포의 성장, 분화, 죽음을 조절하는 기전을 단일층에서 보다 정교하게 구현할 수 있다.
또한, 세포 치료제 상용화를 위해서 완제품의 수요가 대량으로 요구됨과 동시에 동일한 품질의 제품이 생산되어야 하나, 기존의 2D(2-Dimensional) 배양시스템 사용 시 세포치료제 생산이 매우 제한적이라는 문제점이 존재한다. 현재 2D 배양 생산으로 대량배양을 진행할 경우, 세포 및 배지의 양이 많아질수록 생산시간이 길어지게 되며, 또한 생산능력의 저하가 나타날 수 있다. 생산담당인원 및 보조 인력의 투입을 통해 일정부분 해결할 수 있지만, 이는 인건비 증가에 따라 생산 단가의 상승 원인이 되므로, 차후 상품 개발 후 가격 경쟁력이 낮아질 수 있다. 이에, 공정 효율성의 최적화할 수 있는 새로운 배양 시스템으로서, 3D(3-Dimensional) 바이오리액터(bioreactor)를 이용한 대량배양 시스템이 주목받고 있다.
2D 배양조건 대비 3D 배양조건에서 특정 유전자와 사이토카인의 발현량이 변화하는 특성을 갖는 3차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 및 이의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
일 양태로서, 하기 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 특성을 갖는 3차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 집합체(stem cell cluster)를 제공한다:
(a) IL-33, RAB27B, KDR 및 COL3A1 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 2차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 더 많이 발현되는 것;
(b) ANKRD1, MYCT1, MFAP5, OLR1, SERPINB7, CEMIP 및 CD27로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 2차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 더 적게 발현되는 것;
(c) IGFBP1, KIT, IL-20, IL-3, HGF, PDFG-A, PDFG-B 및 VEGF-A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인이 2차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 더 많이 발현되는 것; 및
(d) IL-26, MMP 및 PF4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인이 2차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 더 많이 발현되는 것.
상기 "탯줄(umbilical cord)"은 포유류의 태아가 태반에서 성장할 수 있도록 모체와 배를 연결해주는 줄을 의미할 수 있으며, 일반적으로 와튼 젤리로 둘러싸인 3개의 혈관, 즉, 2개의 배꼽 동맥과 1개의 배꼽 정맥으로 구성된 조직을 의미할 수 있다. 따라서, "탯줄 유래 중간엽 줄기세포(Umbilical Cord Mesenchymal Stem cells)"는 탯줄 또는 탯줄의 와튼 젤리(Wharton's Jelly) 조직으로부터 유래되고, 다양한 조직 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지는 세포를 의미할 수 있다.
상기 "세포 집합체(cell cluster)"는 2 이상의 세포가 밀집된 상태를 말하며, 조직 상태일 수도 있고, 단일 세포 상태일 수도 있다. 각각의 세포 집합체는 조직 자체 또는 일부, 또는 단일 세포의 집합체로 존재할 수 있으며, 3차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포로부터 분화된 세포 유사-조직체를 포함할 수 있다.
상기 "3차원(three-dimension)"은 2차원이 아닌 기하학적인 3개의 파라미터(예를 들면, 깊이, 넓이, 높이 또는 X, Y, Z 축) 모델을 갖는 입체를 의미할 수 있으며, 따라서 일 구체예에 따른 3차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포로부터 분화된 세포집합체는 3차원 배양, 즉 배양 용기에서 탈착되어 부유상태로 배양되어 세포가 증식함에 따라 입체적으로 구형, 시트(sheet) 또는 그와 유사한 3차원의 형태(예를 들면, 유사 조직체)를 갖는 세포 집합체를 의미할 수 있다.
상기 "IL-33"은 치주(Dental) 유래 줄기세포의 골형성(osteogenesis) 유도 및 증식과 전분화능을 증가시키고, 조혈줄기세포(Hematopoietic stem and progenitor cells; HSPC)과 비-조혈줄기세포에서의 염증 과정의 모든 단계에 관여할 수 있다.
상기 "RAB27B"는 소포성 융해와 트래피킹(Vesicular fusion and trafficking)에 관여하여 엑소좀 분비 경로를 제어할 수 있다.
상기 "KDR"은 혈관 신생(angiogenesis), 림프관 신생(lymphangiogenesis), 혈관발달(vascular development), 혈관 투과성(vascular permeability), 그리고 배아에서의 조혈(embryonic hematopoiesis) 조절에 필수적인 역할을 수행하고, 내피 세포의 증식(proliferation), 생존(survival), 이동(migration) 및 분화(differentiation)를 촉진할 수 있다.
상기 "COL3A1"은 초기 배아와 배아 발생 전반에 걸쳐 발현하며, 성인에서는 다양한 내부 장기 및 피부에 주요성분일 수 있다.
상기 "HGF" 는 배아 기관 발달(embryonic organ development), 근육발달(myogenesis), 성인의 장기 기관 재생(organ regeneration) 및 상처 치유(wound healing)에 중요한 역할을 수행하고, 세포 성장(cell growth), 세포 운동성(cell motility), 형태 형성(morphogenesis)을 조절하며, 체세포 분열(mitogenesis)을 유도, 세포 운동성(cell motility), 및 혈관 신생(angiogenesis)과 조직재생(tissue regeneration)에 중요한 역할을 수행하고, 조혈 전구 세포(hematopoietic progenitor cells)의 성장을 자극할 수 있다.
상기 "ANKRD1"은 심장 유전자의 발현을 부정적으로 조절하는 핵 전사 인자(nuclear transcription factor)로 작용하고, 간세포에서 세포 사멸과 연관이 있을 수 있다.
상기 "MYCT1"은 세포자연사(apoptosis) 촉진, 형태의 변경(alteration of morphology), 종양 형성 전환(tumorigenic conversion), 유전자 불안정성(genomic instability)의 촉진 및 조혈 분화(hematopoietic differentiation)의 억제 역할을 할 수 있다.
상기 "MFAP5"는 유방암(breast cancer)에서 ERK/MMP 신호 전달 경로를 조절함으로써 종양 진행(tumor progression) 및 뼈 전이(bone metastasis)를 촉진할 수 있다.
상기 "OLR1"은 '종양 유전자(oncogene)' 역할을 할 수 있음을 암시, 비정상적인 세포 증식(aberrant cellular proliferation), 이동(migration)에 관여할 수 있다.
상기 "SERPINB7"은 췌관선암(pancreatic ductal adenocarcinoma)에 대한 최초의 예측 RNA 바이오 마커로 확인 및 위암 진행 관련 유전자일 수 있다.
상기 "CEMIP"는 암에서 발현이 증가, 세포 생존(regulator of cell survival), 성장 및 침습(growth and invasion)의 조절 인자, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)에서 혈관 신생 마커(angiogenic marker)라고 불릴 수 있으며, 히알루론산 분해(hyaluronic acid degradation)에 참여할 수 있다.
상기 "CD274"는 상향 조절시 암이 숙주 면역계를 회피(evade the host immune system)하도록 허용할 수 있고, 자가 면역(autoimmunity)과 관련이 있을 수 있다.
상기 "IGFBP1"은 세포 이동(cell migration) 및 대사 조절에 중요하고, 진피유두세포 생존능력(dermal papilla cell viability)에 영향을 미치고 모발 유도(hair induction)와 관련된 다양한 단백질의 발현을 촉진할 수 있다.
상기 "KIT"은 세포 유형에 따라 세포 생존(cell survival), 이동(migration), 그리고 증식(proliferation)을 매개할 수 있고, 정상적인 조혈(혈구 형성, hematopoiesis), 색소 형성(pigmentation), 멜라닌 형성(melanogenesis), 생식(fertility), 정자 형성(spermatogenesis), 장 운동(gut movement) 및 신경계(nervous system) 조절에 중요할 수 있다.
상기 "IL20"은 피부와 관련된 염증에 각질 형성 세포(keratinocytes)의 증식(proliferation) 및 분화(differentiation)를 조절할 수 있고, 다능성 조혈 전구 세포(multipotential hematopoietic progenitor)의 세포 확장을 야기할 수 있다.
상기 "IL3"은 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cells)와 전구체(progenitors)의 생존(survival) 및 증식(proliferation), 이들의 성숙 세포(mature cells)로의 분화(differentiation)를 촉진함으로 혈액 세포 생산(blood-cell production)을 조절할 수 있다.
상기 "HGF"는 배아 기관 발달(embryonic organ development), 근육발달(myogenesis), 성인의 장기 기관 재생(organ regeneration) 및 상처 치유(wound healing)에 중요한 역할할 수 있고, 세포 성장(cell growth), 세포 운동성(cell motility), 형태 형성(morphogenesis)을 조절할 수 있으며, 체세포 분열(mitogenesis)을 유도, 세포 운동성(cell motility), 및 혈관 신생(angiogenesis)과 조직재생(tissue regeneration)에 중요한 역할할 수 있고, 조혈 전구 세포(hematopoietic progenitor cells)의 성장을 자극할 수 있다.
상기 "PDGFA", "PDGFB"는 배아 발생(embryonal development) 동안 특정 세포 유형의 성장(growth) 및 생존(survival) 조절 및 성인의 조직 복구(tissue repair)에 중요한 역할을 할 수 있다.
상기 "VEGFA"는 내피 세포에 특이적으로 작용하여 혈관 투과성(vascular permeability) 증가, 혈관 신생(angiogenesis), 혈관 형성(vasculogenesis) 및 내피 세포 성장(endothelial cell growth) 유도, 세포 이동(cell migration) 촉진 및 세포 자멸사 억제(inhibiting apoptosis) 등 다양한 효과를 나타낼 수 있다.
상기 "IL26"은 건선(psoriasis)을 포함한 T 세포 매개 피부 염증(T cell-mediated skin inflammation)에서 유망한 치료 표적일 수 있다.
상기 "MMP12"은 종양 세포가 침입하여 전이(invade and metastasize)되는 경로를 제거하여 종양 및 전이를 촉진하는 효소일 수 있다.
상기 "PF4"는 암 강화 내분비 신호(cancer-enhancing endocrine signal), 골수 거핵구형성(bone marrow megakaryopoiesis) 및 폐암 진행(lung cancer progression)을 자극할 수 있다.
상기 (a) 특성은 IL33 및 RAB27B 중 하나 이상이 2차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 10배 이상 더 많이 발현되는 것일 수 있다. 이러한 경우, 개체에의 적용시에, IL-33의 높은 발현으로 인해 골형성(osteogenesis) 유도 및 증식과 전분화능을 증가시킬 수 있고, 염증 과정의 모든 단계에 관여하여 염증반응을 제어할 수 있으며, RAB27B의 높은 발현으로 인해 엑소좀 분비 경로를 제어할 수 있다는 장점이 존재한다.
상기 (b) 특성은 ANKRD1이 2차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 60배 이상 더 적게 발현되는 것일 수 있다. 이러한 경우, 개체에의 적용시에, 심장 관련 유전자의 발현을 부정적으로 조절하는 핵 전사 인자의 발현을 현저히 낮출 수 있고, 간세포에서의 세포 사멸 역시 현저히 낮추어 관련 부작용을 억제할 수 있다는 장점이 존재한다.
일 양태로서, 상기 집합체, 이를 구성하는 개별세포 또는 이의 배양액을 포함하는 자가면역질환, 간질환, 산부인과적 질환 또는 근육 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
상기 집합체는 상술한 바대로 3차원으로 배양되어 2차원으로 배양되는 경우 대비 차별적으로 인자들 발현(예를 들면, IL33, RAB27B, ANKRD1 등)함에 따라 다양한 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있음은 당업계 통상의 기술자에 자명한 것이고, 구체적으로는 자가면역질환, 간질환, 산부인과적 질환 또는 근육 질환의 예방 또는 치료에 매우 효과적으로 이용될 수 있다.
상기 자가면역질환은 아토피성 피부염, 크론병, 궤양성 대장염, 베체트병, 루푸스, 쇼그렌증후군, 중증근무력증, 경피증, 결절성 다발동맥염, 갑상선기능저하증, 건선 및 류마티스성 관절염으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 간질환은 간기능 손상, 간 장애, 간염, 간독성, 담즙울체, 지방간, 간경변, 간허혈, 알코올성 간 질환, 간농양, 간성 혼수, 간위축증 및 간암으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 산부인과적 질환은 난소 종양, 클라미디아, 다낭성 난포 증후군, 마이코플라즈마, 자궁 근종, 유리아플라즈마, 자궁 선근증, 자궁기형, 자궁 내막증, 매독 및 질염으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 근육 질환은 긴장감퇴증, 근위축증, 근이영양증, 근무력증, 악액질, 경직성 척추 증후군, 근위축성 축삭경화증, 샤르코-마리-투스병 및 근육 감소증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물의 투여량은 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 기준으로 1.0 X 103 내지 1.0 X 1010 세포/kg(체중) 또는 개체, 또는 1.0 X 107 내지 1.0 X 108 세포/kg(체중) 또는 개체일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인 가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 또는 개체당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
상기 약학적 조성물은 유효성분으로서 상기 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 집합체 또는 이의 배양액과, 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 바람직하다. 상기 약학적 조성물이 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는, 세포 집합체가 약학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되어 있거나 또는 용해되어 있는 용액상태로 동결된 것일 수 있다.
상기 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 집합체는, 신체의 조직 또는 기관이 목적하는 세포 군집, 예를 들어 줄기세포 또는 유래세포군집의 생착, 이식 또는 주입에 의해 강화, 치료 또는 대체되는 다양한 종류의 치료 프로토콜에 사용될 수 있다. 상기 집합체는 존재하는 조직을 대체 또는 강화시켜, 새롭거나 변화된 조직이 되게 하거나 생물학적 조직 또는 구조와 결합시킬 수 있다. 또한, 전형적으로 탯줄 이외의 다른 조직 유래 줄기세포 집합체가 사용되는 치료 프로토콜에서 줄기세포가 상기 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 집합체로 대체될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 환원제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995]에 상세히 기재되어 있다.
상기 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 주사용 제형으로 제형화될 수 있다. 이 경우 제형화하기 위한 공지된 통상적 성분이 이용될 수 있고, 통상적인 방법으로 제형화될 수 있다.
일 양태로서, 분리된 탯줄을 배양 용기에 부착하여 배양하는 단계; 상기 배양된 탯줄에 분리효소를 접촉시켜 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계; 및 상기 분리된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 겐타마이신을 포함하는 무혈청배지에서 3차원 배양하는 단계를 포함하는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 집합체를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 탯줄은 건강한 산모(예를 들면, HIV, HCV, HBV 음성인 산모)로부터 출산 후 분리된 태반을 사용할 수 있다. 즉, 상기 "분리된 탯줄"이라 함은 산모의 모체로부터 출산 후 분리되는 탯줄을 의미할 수 있다. 상기 분리된 탯줄은 분리된 후 신속하게 멸균된 용기 및 얼음에 담아 보관될 수 있다.
상기 탯줄을 태반으로부터 분리하는 수득하는 방법은 예를 들면, 분리된 태반으로부터 탯줄을 분리하는 단계; 상기 분리된 탯줄의 외부의 혈액을 제거하는 단계; 상기 혈액이 제거된 탯줄의 동맥과 정맥을 제거하는 단계; 및/또는 상기 동맥과 정맥이 제거된 혈액을 일정한 크기(예를 들면, 1 내지 20 mm)로 세절하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 혈액의 제거는 예를 들면, Ca/Mg free DPBS, 또는 겐타마이신 함유 Ca/Mg free DPBS를 사용할 수 있다.
다음으로, 상기 세절된 탯줄(예를 들면, 분리된 탯줄)로부터 줄기세포를 분리하는 단계가 수행될 수 있다. 상기 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계는 상기 분리된 탯줄을 배양 용기에 부착하여 5 내지 20일, 예를 들면, 10 내지 20일, 예를 들면, 10 내지 15일 배양하는 단계; 상기 배양된 탯줄 조직에서 세포가 뻗어 나오는 것을 확인하는 단계; 및/또는 탯줄 조직에 분리효소를 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 분리효소는 콜라게나아제를 포함할 수 있다. 상기 콜라게나아제는 콜라겐의 펩티드 결합을 파괴하는 효소를 의미할 수 있으며, 콜라게나아제 타입 I, 타입 II, 타입 III, 타입 IV 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 분리효소는 5 내지 30 U/ml, 예를 들면, 5 내지 25 U/ml, 10 내지 25 U/ml, 또는 20 U/ml의 콜라게나아제를 포함할 수 있다. 또한, 상기 분리효소는 트립신(trypsin), 및/또는 디스파아제(Dispase)를 포함할 수 있으며, 또한, 상기 분리효소를 포함하는 용액은 콜라게나아제, 트립신, 및/또는 디스파아제를 포함하는 물, 염수(saline), 예를 들면, HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)를 포함할 수 있다. 또한, 분리효소의 처리 시간은 예를 들면, 1시간 내지 20시간, 2시간 내지 10시간, 4시간 내지 9시간, 또는 5시간 내지 6시간일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조직과 분리효소의 반응은 진탕을 수행하여 반응이 이루어질 수 있으며, 상기 진탕은 약 20 내지 40 ℃, 약 30 내지 40 ℃, 또는 35 내지 40 ℃, 예를 들면, 37 ℃에서 수행할 수 있고, 약 5 내지 60 분간 또는 10 내지 30분간 수행할 수 있으며, 또한 예를 들면 10 내지 30분간 2번을 수행할 수 있다.
추가적으로, 상기 조직과 분리 효소의 반응 후에, 분리 효소를 불활성화 하기 위한 과정을 추가로 수행할 수 있으며, 예를 들면, FBS를 첨가하여 상기 효소 반응을 정지시킬 수 있다. 또한, 효소 반응액으로부터 조직 세포, 예를 들면, 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 분리하는 방법은 통상의 당업계에 공지된 방법에 의해 수행할 수 있으며, 예를 들면 원심분리 한 후, 세포체(strainer)를 사용하여 세포를 분리할 수 있다.
상기 방법은 상기 3차원 배양된 배지를 칼슘과 마그네슘이 제거된 인산염완충식염수로 세척한 후, EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)와 펙티나아제(pectinase)를 포함하는 수확용액(harvest solution)을 처리하여 3차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 집합체를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 "탯줄 유래 중간엽 줄기세포 집합체의 분리"는 처리하지 않은 포유류 탯줄에서 줄기세포와 정상적으로 결부되어 있는 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%를 제거하는 것을 의미할 수 있다. 한 장기에서 얻은 줄기세포를 포함하는 세포군은 처리하지 않은 상태의 그 장기 속에서 그 줄기세포와 정상적으로 결부되어 있는 다른 세포가 전체 세포의 50% 미만일 때 "분리"되었다고 할 수 있다.
상기 방법에 의해 제조된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 집합체는 하기 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 특성을 가질 수 있다:
(a) IL-33, RAB27B, KDR 및 COL3A1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 2차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 더 많이 발현되는 것;
(b) ANKRD1, MYCT1, MFAP5, OLR1, SERPINB7, CEMIP 및 CD27로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이 2차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 더 적게 발현되는 것;
(c) IGFBP1, KIT, IL-20, IL-3, HGF, PDFG-A, PDFG-B 및 VEGF-A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인이 2차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 더 많이 발현되는 것; 및
(d) IL-26, MMP 및 PF4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 사이토카인이 2차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 더 많이 발현되는 것.
상기 3차원 배양, 탯줄 유래 중간엽 줄기세포, 차별적으로 발현되는 각 개별 인자들에 대한 구체적인 사항 등에 대한 설명은 상술한 바와 같다.
일 양태로서 제공되는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 집합체는 3차원으로 배양되어 2차원으로 배양되는 경우 대비 차별적으로 인자들 발현함에 따라 다양한 질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 집합체의 분리에 있어서, 분리효소의 전, 후의 세포 형태를 나타내는 도면이다.
이하, 보다 구체적인 설명을 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예 1. 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 분리
정상적으로 분만한 건강한 산모로부터 사전에 충분한 설명에 근거한 동의(informed consent)를 받고, 정상 태반 분만 시에 수집된 태반조직으로부터 탯줄을 분리하였다. 분리된 탯줄을 Ca/Mg free DPBS로 2 내지 5회 세척하여 혈액을 제거하였다. 이후, 외부 양막은 벗겨내지 않고, 동맥 2개와 정맥 1개를 제거한 뒤 1 내지 5 mm 정도 크기로 탯줄을 잘라내었다. 이후, 상기 탯줄을 배양용기에 부착하여 10 내지 15일 배양을 하였고, 상기 배양된 조직에서 세포가 뻗어나오는 것을 확인한 후, 5 내지 6시간 동안 200 U/ml의 콜라게나아제 I을 처리하여 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 분리하였다. 상기 콜라게나아제 I 처리 전, 후에 탯줄 부착된 조직에서 세포가 뻗어나오는 것을 확인하기 위하여 광학현미경하에서 40x, 100x 배율로 세포형태를 확인하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1은 일 구체예에 따른 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 분리에 있어서, 분리효소의 전, 후의 세포 형태를 나타내는 도면이다.
도 1에서 나타낸 바와 같이, 분리효소인 콜라게나아제 I의 처리 후에 균질한(homogeneous) 세포의 형태를 나타냄을 알 수 있다.
실시예 2. 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 배양
1. 2차원(2D) 배양
15mL 코니컬튜브(conical tube)에 BM 8mL을 넣어 준비하고, 실시예 1에서 분리한 세포의 동결 바이알을 Heatblock을 사용하여 해동하였다. 이후, 기본배지(MEM alpha GlutaMAX(Gibco; 32561-102)에 겐타마이신(Gentamicin; Gibco; 15710-072; 50 μg/mL), 10% FBS 소분액(Gibco; 10099-141)을 혼합)가 담긴 15mL tube에 세포를 넣었다. 그 다음, 1,200 rpm에서 4분간 원심 분리 후, 상층액을 제거하고 펠렛에 완전배지(MEM alpha GlutaMAX에 헤파린 용액(중외제약; 0.2 U/mL), 겐타마이신(50 μg/mL), FBS 소분액 10%, FGF4(Peprotech; 100-31; 25 ng/mL)가 되도록 혼합)을 넣어 서스펜션(suspension)하였다. 세포부유액 10μL을 채취하여 트리판블루(trypan blue) 10μL와 섞은 후 핸드카운트를 사용하여 총 세포 수와 세포 생존율을 확인하였다. 이후, 35mL CCM을 넣은 T175 플라스크에 세포를 넣고 현미경으로 세포를 확인 후, 37°C, 5% CO2 로 설정된 인큐베이터에 넣고 3~4일간 배양하였다.
광학현미경하에서 세포의 형태를 확인한 후 3D 배양 공정을 준비하였다. 마이크로캐리어(Microcarrier; Coming; 4897) 0.4g을 50mL 코니컬튜브에 담고 증류수 20mL을 넣어 부풀렸다(soaking). 이후, Ca/Mg free DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline; Gibco; 14190144) 20mL을 넣어 세척하였다. 3D 배양기(3D spinner flask)에 무혈청배지(Prime XV Serum Free Media(Irvine Scientific; 91135)에 겐타마이신(50 μg/mL)을 혼합)로 채운 후, 마이크로캐리어를 옮겨 담아 170mL이 되도록 하였다. 4시간 동안 37°C, pH 7.4, 0 rpm으로 인큐베이션하였다. 그 다음, T175 플라스크의 배지를 제거하고, Ca/Mg free DPBS 5mL을 넣어 2번 세척한 후 Ca/Mg free DPBS(1X)를 제거하였다. 이후, T175 플라스크에 TrypLE(Gibco; 12604-021)를 넣고, 37°C, 5% CO2로 설정된 인큐베이터에서 3분간 반응시켰다. 그 다음, TrypLE 반응 후 세포가 플라스크로부터 분리되었는지 광학현미경으로 확인하였다. 이후, 세포가 모두 분리된 것이 확인되면, 플라스크에 기본배지를 더하여 중화시킨 뒤 새로운 50mL 튜브에 옮겼다. 그 다음, 1,200 rpm에서 4분간 원심분리 후, 상층액을 제거하고 펠렛에 무혈청배지를 넣어 서스펜션하였다. 이후, 세포부유액 10μL를 채취하여 트리판블루 10μL와 섞은 후 핸드카운터를 사용하여 총 세포 수와 세포 생존율을 확인하였다.
2. 3차원(3D) 배양
미리 준비한 3D 배양기(3D spinner flask)에 2D로 배양한 세포를 넣어 무혈청배지가 총 200 mL이 되게 한 후, 37°C, pH 7.2~7.4, 300~500 rpm으로 셋팅하여 5~8일 동안 배양하였다. 이후, 3~4일 후부터 수확하기 전까지, 배양액에서 200 μL를 채취하여 혈당측정기로 글루코오스 소모량을 측정하여 세포의 증식을 확인하며 글루코오스 양에 따라 50% 배지를 교환하였다.
세포 수확을 위해 중력을 이용하여 세포 펠렛팅(cell pelleting)을 5분간 진행하였다. 이후, 3D 배양기(3D spinner flask)에 배지를 제거하고 Ca/Mg free DPBS(1X)를 100mL 넣어 2번 세척한 후 Ca/Mg free DPBS(1X)를 제거하였다. 그 다음, 3D 배양기(3D spinner flask)에 수확용액(harvest solution; TrypLE(5X)에 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid; Invitrogen; 15575-020; 10mM), 펙티나아제(pectinase; Sigma Aldrich; P2611; 100U/mL)을 혼합)을 60mL 넣고, 37°C, 5% CO2로 설정된 인큐베이터에서 15분간 반응시켰다. 이후, 수확용액에 반응 후 세포가 마이크로캐리어로부터 분리된 것을 육안으로 확인한 후 10mL짜리 혈청피펫(serological pipette)으로 완전히 풀어주었다. 그 다음, 세포가 모두 분리된 것이 확인되면, 3D 배양기(3D spinner flask)에 기본배지 100mL을 더하여 중화시킨 뒤 세포부유액을 40 μm 스트레이너(strainer; Falcon; Coming 352340)가 장착된 새로운 50mL 코니컬튜브에 옮겼다. 이후, 1,200 rpm에서 4분간 원심분리 후, 상층액을 제거하고 펠렛에 Ca/Mg free DPBS(1X)을 넣어 서스펜션하였다. 그 다음, 세포부유액 10 μL을 채취하여 트리판블루 10 μL와 섞은 후 핸드카운터를 사용하여 총 세포 수를 확인하고, LUNA 세포계수기를 통해 세포 사이즈와 생존율을 확인하였다.
실시예 3. 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포의 유전자 발현량 및 사이토카인 분비량 분석
1. 분석방법
2D 및 3D 배양 세포로 RNA prep(RNeasy® Mini Kit, Cat#74106)을 진행한다. 이후, RNA Prep은 키트 프로토콜에 제시된 대로 진행하였고, 추출한 RNA로 마크로젠에 마이크로어레이(GeneChip?? Human Gene 2.0 ST Array, Cat# 902112)를 의뢰하여 2D 배양 대비 3D 배양에 따라 발현이 증가 및 감소하는 유전자를 확인하였다. 그 다음, 2D 및 3D 배양으로 얻어진 배양액(conditioned media)을 모으고 초원심분리기로 다운시켜주었다. 상층액만 따서 이바오젠에 사이토카인 어레이(Human L507 Array, cat# AAH-BLG-1-4)를 의뢰하여 2D 배양 대비 3D 배양에 따라 발현이 증가 및 감소하는 사이토카인(cytokine)을 확인하였다. 유전자 및 단백질 발현 특성 비교를 통해 3D 배양세포에서 분비하는 우수인자를 발굴하였다.
2. 분석결과
발현량의 차이가 가장 많이 나는 유전자를 선정하여 하기 표 1에 나타냈다. 이들 중 IL33, RAB27B, KDR, COL3A1, 및 HGF가 2D 배양에 비해 3D 배양에서 발현량이 증가한 유전자이다. 또한, ANKRD1, MYCT1, MFAP5, OLR1, SERPINB7, CEMIP 및 CD274가 2D 배양에 비해 3D 배양에서 발현량이 감소한 유전자이다.
| Probe ID | ACCESSION | SYMBOL | fold change | |
| 1 | 17083433 | NM_001199640 | IL33 | 14.213205 |
| 2 | 16852463 | NM_004163 | RAB27B | 12.044478 |
| 3 | 16976029 | NM_002253 | KDR | 7.252206 |
| 4 | 16888610 | NM_000090 | COL3A1 | 6.121478 |
| 5 | 17059165 | NM_000601 | HGF | 5.329499 |
| 6 | 16716478 | NM_014391 | ANKRD1 | -61.672696 |
| 7 | 17013851 | NM_025107 | MYCT1 | -13.956352 |
| 8 | 16760953 | NM_001297709 | MFAP5 | -7.291977 |
| 9 | 16761293 | NM_001172632 | OLR1 | -6.719435 |
| 10 | 16852858 | NM_001040147 | SERPINB7 | -6.321075 |
| 11 | 16803754 | NM_001293298 | CEMIP | -6.009313 |
| 12 | 17083357 | NM_001267706 | CD274 | -5.802964 |
발현량의 차이가 가장 많이 나는 사이토카인을 선정하여 하기 표 2에 나타냈다. 이들 중 IGFBP1, KIT, IL20, IL3, HGF, PDGFA, PDGFB가 2D 배양에 비해 3D 배양에서 발현량이 증가한 사이토카인이다. 또한, IL26, MMP12, PF4가 2D 배양에 비해 3D 배양에서 발현량이 감소한 사이토카인이다.
| Probe ID | ACCESSION | SYMBOL | fold change | |
| 1 | L507_217 | NM_001013029 | IGFBP1 | 1.6282143 |
| 2 | L507_422 | NM_001093772 | KIT | 1.533020888 |
| 3 | L507_287 | NM_018724 | IL20 | 1.496775805 |
| 4 | L507_247 | NM_000588 | IL3 | 1.49585749 |
| 5 | L507_202 | NM_001010934 | HGF | 1.473667232 |
| 6 | L507_398 | NM_002607, NM_002608 | PDGFA,PDGFB | 1.429276625 |
| 7 | L507_298 | NM_018402 | IL26 | 0.557182489 |
| 8 | L507_360 | NM_002426 | MMP12 | 0.532321872 |
| 9 | L507_405 | NM_002619 | PF4 | 0.433160755 |
Claims (12)
- 하기 (a) 내지 (d)의 특성을 갖는 3차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 집합체(stem cell cluster):
(a) IL-33, 및 RAB27B 중 하나 이상이 2차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 10배 이상 더 많이 발현되고, 추가적으로 KDR 또는 COL3A1을 2차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 더 많이 발현되는 것;
(b) ANKRD1이 2차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 60배 이상 더 적게 발현되고, 추가적으로 MYCT1, MFAP5, OLR1, SERPINB7, CEMIP 및 CD27이 2차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 더 적게 발현되는 것;
(c) IGFBP1, KIT, IL-20, IL-3, HGF, PDFG-A, PDFG-B 및 VEGF-A로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 사이토카인이 2차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 더 많이 발현되는 것; 및
(d) IL-26, MMP 및 PF4의 사이토카인이 2차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포에 비하여 더 적게 발현되는 것. - 분리된 탯줄을 배양 용기에 부착하여 배양하는 단계;
상기 배양된 탯줄에 분리효소를 접촉시켜 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 분리하는 단계;
상기 분리된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포를 2차원 배양하는 단계;
상기 2차원 배양된 세포를 마이크로캐리어에 부착하여 겐타마이신을 포함하는 무혈청배지에서 3차원 배양하는 단계; 및
상기 3차원 배양된 배지를 칼슘과 마그네슘이 제거된 인산염완충식염수로 세척한 후, EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)와 펙티나아제(pectinase)를 포함하는 수확용액(harvest solution)을 처리하여 3차원 배양된 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 집합체를 마이크로캐리어로부터 분리하는 단계를 포함하는 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 집합체를 제조하는 방법. - 청구항 2에 있어서, 상기 분리효소는 콜라게나아제인 방법.
- 청구항 2의 방법으로 제조된, 중간엽 줄기세포 집합체.
- 청구항 1의 집합체, 청구항 4의 집합체, 이를 구성하는 개별세포 또는 이의 배양액을 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 자가면역질환은 아토피성 피부염, 크론병, 궤양성 대장염, 베체트병, 루푸스, 쇼그렌증후군, 중증근무력증, 경피증, 결절성 다발동맥염, 갑상선기능저하증, 건선 및 류마티스성 관절염으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 조성물.
- 청구항 1의 집합체, 청구항 4의 집합체, 이를 구성하는 개별세포 또는 이의 배양액을 포함하는 간질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
- 청구항 7에 있어서, 상기 간질환은 간기능 손상, 간 장애, 간염, 간독성, 담즙울체, 지방간, 간경변, 간허혈, 알코올성 간 질환, 간농양, 간성 혼수, 간위축증 및 간암으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 조성물.
- 청구항 1의 집합체, 청구항 4의 집합체, 이를 구성하는 개별세포 또는 이의 배양액을 포함하는 산부인과적 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
- 청구항 9에 있어서, 상기 산부인과적 질환은 난소 종양, 클라미디아, 다낭성 난포 증후군, 마이코플라즈마, 자궁 근종, 유리아플라즈마, 자궁 선근증, 자궁기형, 자궁 내막증, 매독 및 질염으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 조성물.
- 청구항 1의 집합체, 청구항 4의 집합체, 이를 구성하는 개별세포 또는 이의 배양액을 포함하는 근육 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
- 청구항 11에 있어서, 상기 근육 질환은 긴장감퇴증, 근위축증, 근이영양증, 근무력증, 악액질, 경직성 척추 증후군, 근위축성 축삭경화증, 샤르코-마리-투스병 및 근육 감소증으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 조성물.
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