KR800001361B1

KR800001361B1 - 용연균제제(溶連菌製劑)의 제법

Info

Publication number: KR800001361B1
Application number: KR7400494A
Authority: KR
Inventors: 하루기 오가와; 가네오 노가기; 시게오 수즈기; 요시오 다가가기
Original assignee: 우에노 기미오; 쥬우가이세이야꾸 가부시기가이샤
Priority date: 1974-01-01
Filing date: 1974-01-01
Publication date: 1980-11-17

Abstract

내용 없음.

Description

용연균제제(溶連菌製劑)의 제법

본 발명은 특히 생균수(生菌數)가 적으면서도 항종양(抗腫瘍) 활성이 높은 용연균 용혈연쇄구균(溶血連

球菌) 제제의 제법에 관한 것이다.

용연균의 생균체가 항종양 활성을 가지고 있음은 오래전부타 알려져 있는 사실이나 이 균은 단독(丹毒) 산욕열, 폐혈증 등의 병원균이기도 하며 이로 인하여 생균체 그 자체를 종양의 치료에 사용한다는 것은 극히 위험한 것이다.

이 용연균의 약독주(弱毒株)의 생균을 비교적 고농도의 페니실린을 함유하는 적의(適宜)한 배지(培地), 예를 들면 바안하이머 기초배지(이하 BBM이라 함)에 현탁(懸濁)시키고 30-38℃로 유지시킨 후 다시 40-50℃에서 열처리하므로서 균체가 가지고 있는 독성(병원성)이 현저히 저하하며 스트렙트리진 S산생능(産生能)이 현저히 상승한다는 것이 보고되어 있다.(이하 이균현탁액을 PCB-45라 함:일본의학실험지 36권, 175-186페이지, 1966년 참조)

본 발명자들은 이 PCB-45에 안정제로서 알루기닌, 메티오닌 등의 아미노산 또는 당류를 가하여 동결 건조시키므로서 그 항종양 활성을 전혀 저하시키지 않고 대단히 안정화시킬 수가 있으며 또 상기 페니실린 대신에 세팔로스포린 C 및 사이클로셀린을 사용하여도 같은 결과가 얻어지는 것을 발견하였다.(일본 특허공보 1970-8871호 및 1971-2674호 참조) 이하 세팔로스포린 C를 사용하여서 얻어진 균 현탁액을 CEB-45, 사이클로셀린을 사용하여서 얻어진 균 현탁액을 CYB-45라고 한다.

그려나 이들 방법에 의하여서 얻어진 용연균제제는 생균수(이 때의 생균수라 함은 각 제제 중에 함유되어 있는 항생물질을 충분히 세정하여서 제거하고 다시 필요에 따라 분해 효소에 의해서 잔존하는 항생물질을 분해시킨 후 혈액한천평판(平板)을 작성하고 이 평판을 배양하여 생육하는 균수를 의미한다)는 감소되어 있기는 하나 아직도 상당한 생균을 함유하고 있으므로 이것을 사용하여 종양의 치료에 제공하기에는 균 감염의 우려성이 있어서 만족할 만한것은 못된다.

여기서 본 발명자들은 이들 항종양활성을 저하시킴이 없이 그 중에 포함되어 있는 생균수를 다시 감소시키며 더욱 안전성이 큰 제제를 얻음을 목적으로 하고 더욱 연구를 한 결과 상기 PCB-45, CEB-45 및 CYB-45의 각 용연균제제를 제조하는 공정중에, 용연균 균체에 과산화수소와 접촉시키는 처리를 삽입시키므로서 생균수가 적고 항종양 활성이 높은 용연균제제가 얻어짐을 알게 되었다.

본 발명은 이와 같은 견지에 기초를 둔 것으로서 용연균을 영양배지에서 배양하고 그 균체를 비교적 고농도의 페니실린, 세팔로스포린 C 또는 사이클로셀린을 함유하는 배지에 현탁시키고, 30-38℃에 유지시킨 후 다시 40-50℃로 열처리하므로서 용연균 균체를 포함하는 항종양성제제로 하고 이 공정 중에서 과산화수소를 접촉시킴을 특징으로 하는 생균수가 적고 항종양활성이 높은 용연균제제의 제법인 것이다.

본 발명을 실시함에 있어서는 과산화수소와 균체의 접촉은 과산화수소 농도 0.6-3%에서 행함이 좋다. 작용온도는 37℃ 이하이며 항종양능을 저하시키지 않게 하기 위하여서는 0-5℃가 가장 좋다. 처리시간은 20-60분 정도이면 충분하다.

용연균에 과산화수소를 작용시키는 처리는 용연균의 배양이 끝난 후의 배양액단계, 배양액에서 균체를 집균(集菌)시킨 단계, 또는 이에 계속되는 PCB-45, CEB-45 또는 CYB-45의 제제화의 각 단계의 어디서 행하여도 좋다. 예를 들면 배양이 끝날시의 배양액에 대하여서 이를 행할 경우에는 배양액에 과산화수소를 과산화수소가 0.6-3%의 농도가 되도록 첨가시켜 작용을 시킨다.

또 배양액에서 집균된 균체의 경우에는 과산화수소를 0.6-3%의 농도로 함유되는 생리식염액에 균체를 현탁시킴이 좋다. 기타 PCB-45, CEB-45 및 CYB-45의 제제화할 시에 처리를 행하는 경우도 같다. 처리후의 균체에 부착한 과산화수소는 균체를 적당한 용매, 예를들면 물, 생리식염수, 인산 완충액 등으로서 충분히 씻으므로서 쉽게 제거시킬 수가 있다.

이와 같이 하여서 얻어진 생균수가 적은 항종양성 용연균제제는 필요에 따라 안정제로서 알루기닌, 메티오닌 등의 아미노산 또는 당류를 가하여 동결 건조시키므로서 생균을 전혀 함유하지 않는 PCB-45, CEB-45 또는 CYB-45의 동결 건조제제로 할 수가 있다.

본 발명의 방법은 대량처리할 경우에 있어서도 조건의 설정이 용이하며 확실하게 효과가 기대되는 우수한 방법이다.

[실시예 1]

스트렙토콕크스 헤모리틱크스 Su주(약독주. ATCC 21060)을 37℃에서 24시간 정치배양하고 얻어진 배양액 50ml를 효모액키스 배지 1ℓ(효모액키스 50g을 증류수 700ml에 용해시켜 수산화나트륨으로서 pH7.4로 조정하고 100℃에서 60분간 가열한 후 냉각시킨 다음 여과하여 여액을 증류수로서 전량이 1ℓ가 되게 한다. 이것을 멸균 플라스크에 넣고 1kg/cm²에서 10분간 증기멸균시킨 것)에 접종시키고 37℃에서 20시간 정치배양한다. 이 배양액을 원침(遠沈)에 의하여 집균시키고 이 균체에 과산화수소를 1% 포함한 냉(冷) 생리식염수 50ml를 가하여 현탁액으로 하고 빙냉(氷冷)하에서 30분간 유지시킨다. 다음에 이 현탁액을 냉시원침시키고 균체에 냉생리식염액을 가하여 다시 현탁시킨 후 원침시켜서 균체에 대해서 다시 한번 같은 조작을 되풀이 한다.

얻어진 균체를 냉 BBM에 현탁시키고 660mμ에 있어서의 흡광도를 측정하고 이 값으로 부터 건조균 체량(體量)을 산출하여 6mg/ml가 되도록 BBM의 액량을 조절한다(전액량 60ml). 이 현탁액 50ml에 페니실린 G칼륨을 생리식염수에 용해시킨 액(1.6×10⁵단위/ml)을 10ml 가하고 37℃에서 20분간, 다시 45℃에서 30분간 유지시킨 후 곧 빙냉시킨다(PCB-45, 건조균체량으로서 5mg/ml). 이 액에 빙냉시킨 페니실린 G칼륨 함유 1% DL-메티오닌 수용액(페니실린 G칼륨. 1.08×10⁵단위/ml) 60ml를 가하고 5ml 용(容) 바이알병에 2ml씩 분주(分注)시켜서 동결(凍結) 건조시켜 분말 정제(동결 건조 PCB-45)로 한다.

이 건조제제는 생리식염액 5ml로서 현탁액으로 되돌렸을 시의 건조균체량 1mg/ml를 포함한다.

[실시예 2]

실시예 1에서의 페니실린 G 칼륨을 생리식염수에 용해시킨 액 대신에 세팔로스포린 C(세팔로리딘)을 생리식염수에 용해시킨 액(108mg, 역가(力價)ml)을 사용하고 그 외는 실시예 1과 같이 하여 CEB-45 및 동결 건조 CEB-45를 얻는다.

[실시예 3]

실시예 1에서의 페니실린 G 칼륨을 생리식염수에 용해시킨 액 대신에 사이크로셀린을 생리식염수에 용해시킨 액(26.4mg(역가)/ml)를 사용하며, 그 외는 실시예 1과 같이 하여 CYB-35 및 동결 건조 CYB-45를 얻는다.

[시험예]

실시예 1, 2 및 3의 방법에 의하여 얻어진 PCB-45, CEB-45, CYB-45 및 이들의 동결 건조품에 대해서 항종양 시험 및 생균수 시험을 행하였다. 그 결과를 다음 표에 표시한다.

그리고 양성대조(陽性對照)로서는 과산화수소에 의한 처리만을 생략하고 기타는 실시예 1, 2 및 3과 같이 하여서 조제한 PCB-45, CEB-45, CYB-45 및 이들의 동결 건조품을 사용하였다.

I항 종양성 시험

1군 열마리의 DDY 수컷 생쥐(생후 5주령)의 복강내에 한마리당 10⁶개의 예엘릿히 복수암(腹水癌) 세포를 이식시키고 24시간 후 부터 4일간에 걸쳐 1일 1회씩 계 4회 생쥐한마리당 시료액 0.25ml씩을 복강(腹腔)내에 투여하며, 암세포이식 40일 후의 생쥐의 생존수를 측정하였다.

그리고 미동결 건조의 PCB-45, CEB-45 및 CYB-45는 생리식염수로서 희석하고, 또 동결건조품은 투여직전에 생리식염수로서 현탁시켜서 각각의 건조 균체량으로서 1mg/ml의 농도가 되도록 시료액으로 하였다.

II 생균수(生菌數)시험

(a) PCB-의 미동결건조품 및 냉생리식염수로서 현탁액으로 한 동결 건조품을 원침시키고 균체를 냉생리식염수로서 씻은 후, 페니실리나아제 용액을 가하고 37℃에서 30분간 유지시켜서 잔존하는 페니실린을 분해시킨 것을 시료액으로 하고 이것을 말의 탈섬유(脫纖維) 혈액을 첨가시킨 보통 한천 배지와 혼합하고 상법에 따라서 혈액 한청평판(平板)을 작성하고 37℃에서 48시간 배양하여서 생육한 콜소니이의 수로서 생균수로 하였다.

(b) CEB-45 및 CYB-45의 미동결 건조품 및 냉생리식염수로서 현탁액으로 한 동결 건조품을 냉생리식염수로서 네번 되풀이하여 세정하고, 균체를 냉생리식염수로서 네번 되풀이하여 세정하고, 균체를 냉생리식염수에 다시 현탁시킨 것을 시료액으로 하고, (a)와 같이 하여 혈액 한천 평판을 작성하고 37℃에서 48시간 배양하여 생육한 콜로니이의 수로서 생균수로 하였다.

*는 용연균균체를 건조중량으로서 5mg/ml 포함된 시료액 1ml 중의 생균수

**는 세정으로 의해서 제거되지 못하였던 항생물질의 영향으로서 이 이하의 농도의 생균수의 측정은 불가능하였다.

Claims

용연균을 영양배지에서 배양하고 그 균체를 비교적 고농도의 페니실린, 세팔로스포린 C 또는 사이크로셀린을 함유하는 배지에 현탁시켜서 30-38℃로 유지시킨 후 다시 40-50℃에서 열처리하므로서 용연균 균체를 포함하는 항종양성 제제로 하는, 공정 중에서 과산화수소를 접촉시킴을 특징으로 하는 생균수가 적고 항종양 활성이 높은 용연균 제제의 제법.