JPS643478B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は子のう菌亜門（Ascomycotina）、盤
菌網（Discomycetes）、ちやわんたけ目
（Pezizales）、べにちやわんたけ亜目
（Sarcoscyphineae）、くろちやわんたけ科
（Sarcosomataceae）、くろちやわんたけ族
（Sarcosomateae）、くろちやわんたけ属
（Pseudoplectania）に属する菌株の子実体を水
性溶媒で抽出した抽出液、もしくは上記菌株を培
養して得られた培養菌糸体を水性溶媒で抽出した
抽出液、または上記の菌糸体を培養した培養液
中より抗腫瘍性を有する多糖体を製造する方法に
関する。 本発明者等はくろちやわんたけ
〔Pseudoplectania nigrella（Pers.）Fuckel〕の
子実体もしくは菌糸体、または菌糸体を培養した
ときに得られる培養液より抗腫瘍活性を有する
多糖体を製造することに成功した。 本発明に用いられる子のう菌の種は「日本菌学
会報」1980年第21巻第149〜179頁に記載の「日本
産べにちやわんたけ亜目」（Sarcoscyphineae of
Japan）のうち第169頁のくろちやわんたけ種
〔Pseudoplectania nigrella（Pers.）Fuckel〕に
準拠するものである。即ち本菌は1969年５月北海
道札幌市効外で採取したくろちやわんたけ子実体
の組織より分離培養した菌株である。 本菌の子実体の特徴は以下の如くである。 本菌は針葉樹林の苔の間で採取され、子実体は
黒色、無柄で径約１cmのいわん形であり、典型的
なくろちやわんたけ属（Pseudoplectania）の特
徴を有する。子実体の外側はビロード状の毛でお
おわれ、外皮（ectal excipulum）の厚さは100
〜150μｍで角状組織（t.angularis）をなし、髄
組織（medullary tissue）は250〜400μｍで纒絡
菌組織（t.intricata）である。外皮の最外層より
黒褐色の長い分岐のある毛が出ており、お互いに
絡みあつて約150μｍの厚さである。子のうは厚
膜、円筒形で220〜300×12〜15μｍである。子の
う胞子は殆ど無色の球形で径は11〜14μｍであ
る。糸状体は糸状で径２〜3μｍ、上部はわずか
に膨らんでいる。 以上の特徴より本菌はくろちやわんたけ
〔Pseudoplectania nigrella（Pers.）Fuckel〕で
あることは明白であり、本発明者らは、抗腫瘍性
多糖体の生産能を有する本菌株にＫ−1426の菌株
番号を付し他の公知のくろちやわんたけと区別す
ることにした。本菌株は工業技術院微生物工業技
術研究所に微生物受託番号 微工研菌寄第5803号
として寄託されている。 微生物は一般に、分類方法の違いにより、同一
の菌株でも異なつた名称を与えられることがある
が、上記の文献に記載した分類方法によつてくろ
ちやわんたけ属（Pseudoplectania）に分類さ
れ、かつ本発明の抗腫瘍性を有する多糖体を生産
する能力を有する菌株であれば全て本発明に使用
することができる。 本発明による抗腫瘍性多糖体はくろちやわんた
けの子実体より得た水性溶媒抽出液からも、培養
菌糸体より得た水性溶媒抽出液からも、また菌糸
体を培養したときに得られる培養液からも同様
に採取できる。 本発明に用いる原料として子実体を屋外で大量
に採取することは困難であるので通常培養菌糸体
が用いられる。 菌糸体は通常固体培養法でも液体培養法でも得
ることができる。固体培養法とは寒天、ゼラチ
ン、澱粉、鋸屑、木材、パルプ、麦芽、米糖、大
豆粉、その他公知の固体培地あるいはそれらを適
宜組合せた固体培地による培養法であり、液体培
養法とは下記の栄養成分を含んだ液体培地による
静置、振盪、通気および撹拌培養のことである。
取扱いおよび生産地の見地よりすれば、本菌の菌
糸体は液体培地による通気撹拌培養により得るの
がより有利である。 本菌の液体培養のための培地としては通常の微
生物の培養に用いられる倍地の処方で十分であ
り、菌の発育に必要な諸栄養源が含有されている
ものであれば良い。即ち、炭素源としては、例え
ばブドウ糖、麦芽糖、乳糖、遮糖、澱粉、油脂
類、廃糖密等を、窒素源としては、例えばペプト
ン、酵母エキス、酵母、肉エキス、麦芽エキス、
大豆粉、コーンステイープリカー、アンモニウム
塩、尿素等の有機および無機の窒素含有物を使用
することができる。無機塩類としては、例えばリ
ン酸塩、マグネシウム塩およびその他の無機塩類
を使用することができる。これらの他に生育に必
要なビタミン類等を適宜加えても良い。 培養の初発PHは２〜９げ、培養温度は15℃〜35
℃が良好であり、培養時間は３〜30日間が普通で
ある。通気撹拌培養を行なう場合には通気量は
0.1〜2.0／・min.、撹拌速度は30〜500rpmの
範囲で実施するのが適当である。 上記の如く、固体培養して得られた菌糸体は通
常の方法により掻集め、本発明の原料とする。ま
た液体培養して得られた菌糸体は、過あるいは
遠心分離して集菌し、本発明の原料とする。この
とき培養液から菌糸体を除去した残りの液は培養
液として本発明の原料とする。本発明でいう培
養液とは、培養液から菌糸体を除去した残液の
ことであり、単に過により得られた液だけでな
く、遠心分離あるいはその他の手段により得られ
た菌糸体除去液も本発明に含まれる。培養液か
ら本発明物質を分離、精製する手段は後述するよ
うに、子実体あるいは菌糸体の水性溶媒抽出液に
用いる手段と同様の手段を用いれば良い。 本発明においては本菌の子実体、菌糸体および
菌糸体を培養したとき得られる培養液は全て抗
腫瘍性多糖体製造の原料となり得る。即ち子実体
および培養菌糸体を原料とするときはこれから水
性溶媒で抽出する。その際、それらの原料はその
まま使用しても良いが、前処理、例えば水洗、風
乾、粉砕、あるいは無極性溶媒による抽出等の前
処理を施した後、水性溶媒で抽出しても良い。 本発明において用いる水性溶媒とは水を主体と
して抽出溶媒のことであつて、水単独または水に
溶解しうる酸、塩基、塩あるいは有機溶媒を１種
乃至２種以上組合わせたものをいい、例えば0.5
規定の苛性ソーダ水溶液等が使用できる。抽出
は、前記原料またはその前処理物を適当な水性溶
媒とともに常温でまたは加熱して行なう。温度は
常温以上任意の温度を使用でき、水性溶媒の沸点
以上も使用できる。圧力は常圧から、使用温度に
より加圧下に実施しうる。温度および圧力は経済
的見地により適当に選べばよい。 上記の如くして抽出した抽出液および前記培養
液は、例えば硫安塩析、低級アルコールまたは
アセトン等による溶媒沈澱、透析、限外過、逆
滲透、ゲル過等の処理を施した後、必要であれ
ばセバツク（Sevag）法、トリフルオルトリクロ
ロメタン法またはブロナーゼ（Pronase）処理法
等で除蛋白を行ない、更に種々のイオン交換樹脂
等を用いて不純物の除去および脱色等を行なつて
精製することも可能である。これらの操作は単独
でも適宜組合わせて行なつてもよい。 上記の如くして得られた本発明による固形物質
および溶媒除去して得られた固形物質は白色〜淡
黄色の粉末である。本物質の理化学的諸性質は次
のとおりである。 ａ 元素分析：測定値 Ｃ＝43.88％ Ｈ＝6.16
％ Ｎ＝０ ｂ 分子量：ゲル過法による平均分子量は
250000以上である。 ｃ 融点：明確な融点は示さず、強熱すると炭化
分解する。 ｄ 比旋光度：〔α〕²⁵ _D＝＋35゜（0.5N NaOH、Ｃ
＝0.5％）。 ｅ 紫外吸収スペクトル：末端吸収。 ｆ 赤外吸収スペクトル：β−結合に特有な
890^cm-1の吸収を有する（第１図参照）。 ｇ 溶解性：水、0.5規定苛性ソーダ、ジメチル
スルフオキサイド、ギ酸等に室温で可容。 石油エーテル、エーテル、アセトン、ベンゼ
ン、エタノール、メタノール等の有機溶媒に不
溶。 ｈ 呈色反応：モーリツシユ反応、アンスロン反
応に陽性。 ヨードデンプン反応、バイアル反応、ニンヒド
リン反応、エルソン−モルガン反応に陰性。 ｉ 水溶液のPH：中性。 ｊ 外観：白色〜淡黄色の粉末。 ｋ 構成糖：グリコースのみ（ペーパークロマト
グラフイー、ガスクロマトグラフイーおよびグ
ルコースオキシダーゼにより確認した）。 ｌ 極限粘度：〔η〕＝約20〜約25。 なお、本発明の極限粘度〔η〕は下記式によつて
定議される。 〔η〕＝ lim ｃ→ｏ ηsp／ｃ ここにおいて、ηsp＝（η−ηo）／ηo＝η／
ηo−１ η＝溶液の粘度（0.1M Nacl中、30℃） ηo＝溶媒の粘度 ｃ＝溶液100ml中の溶質のｇ数 以上の結果より、本物質はグルコースのみを構
成成分としβ−結合を有する高分グルカンが主成
分であることが判る。 本発明による物質の下記の動物実験により、検
定した抗腫瘍活性は次のとおりである。 １ ザルコーマ180固形ガンに対する抗腫瘍活性 (1) ICR系マウス雌性を用い、腹水型で継代し
たザルコーマ180細胞をマウス１匹当り４×
10⁶個右腋下部に移植した。移植後24時間目
から生理食塩水溶液となした本物質の腹腔内
投与を開始し、以後隔日に１回、合計６回の
投与を行ない、腫瘍移植後４週目に腫瘍を摘
出し、生理食塩水のみを投与した対照群の腫
瘍とその重量を比較して腫瘍阻止率
（Inhibition Ratio）を算出した。ここにお
いて腫瘍阻止率は次式を用いて計算された値
である。 腫瘍阻止率（％）＝（−）／×100 ；対照群の平均腫瘍重量 ；治療群の平均腫瘍重量 その結果、ICR系マウスを用いて検定した
本物質のザルコーマ180に対する腫瘍阻止率
は、１回当りの投与量3.2mg／Kgで93.6％と
いう強い抗腫瘍活性を示し、治療群６匹中５
匹の腫瘍が完全に消失した。 (2) 実験動物としてC3H／He系マウス雌性を
用い、本物質の投与回数を合計10回とし、腫
瘍の摘出を腫瘍移植後５週目に行なう以外は
(1)と同様にして腫瘍阻止率を検定した。その
結果、C3H／He系マウスを用いて検定した
本物質のザルコーマ180に対する腫瘍阻止率
は、１回当りの投与量9.0mg／Kgで68.6％で
あり、治療群５匹中２匹の腫瘍が完全に消失
していた。 ２ エールリツヒ固形ガンに対する抗腫瘍活性ガ
ン細胞として腹水型で継代したエールリツヒ細
胞を用い、本物質の投与回数を合計８回とし、
腫瘍の摘出を腫瘍移植後５週目に行う以外は１
−(1)と同様にして腫瘍阻止率を測定した。その
結果、ICR系マウスを用いて検定した本物質の
エールリツヒ固形ガンに対する腫瘍阻止率は、
１回当りの投与量の0.61mg／Kgで100％であり、
治療群５匹全部の腫瘍が完全に消失していた。 ３ エールリツヒ腹水ガンに対する抗腫瘍活性ガ
ン細胞として腹水型で継代したエールリツヒ細
胞を用い、移植ガン細胞数をマウス１匹当り５
×10⁵個とし、移植部位をマウス腹腔内とし、
本物質の投与方法を毎日１回合計10回とする以
外は１−(1)と同様にして、腫瘍移植後７週間に
マウスの生存匹数および平均生存日数を測定し
た。その結果、ICR系マウスを用いて検定した
本物質のエールリツヒ腹水ガンに対する抗腫瘍
活性は、１回当りの投与量6.1mg／Kgにおいて
マウス生存匹数では対照群の５匹中０匹に対し
５匹中３匹であり、平均生存日数では対照群の
13.3日に対し31.4日以上であつた。 ４ MethA固形ガン（３−methylcholanthrene
−induced fibro sarcoma）に対する抗腫瘍活
性 実験動物としてBALB／ｃ系マウス雌性を
用い、BALB／ｃ系マウスに腹水型で継代し
たガン細胞としてMethAをマウス右腋下部に
１匹当り１×10⁵個移植し、投与部位を腫瘍内
とし、投与回数を合計10回とし、腫瘍摘出を腫
瘍移植後５週目とする以外は１−(1)と同様にし
て腫瘍阻止率を検定した。その結果、
BALB／ｃ系マウスを用いて検定した本物質
のMethA固形ガンに対する腫瘍阻止率は１回
当りの投与量0.64mg／Kgで91.6％であり、治療
群５匹中４匹の腫瘍が完全に消失していた。 以上の動物実験の方法および結果を第１表にま
とめて示す。

【表】 以上に述べた如く本発明による物質はザルコー
マ180−ICR系等の同種移植腫瘍系は勿論のこと、
MethA−BALB／ｃ系の同系移植腫瘍にも極め
て強い抗腫瘍活性を有し、更に比較的免疫感受性
の低いザルコーマ180−C3H／He系にも極めて強
い抗腫瘍活性を有することが判明した。 以下に実施例を挙げて本発明方法を説明する。 実施例 １ グルコース2.0％、コーンスチープリカー0.5
％、大豆粉0.1％、酵母エキス0.1％、KH₂PO₄0.1
％、MgSO・7H₂O0.05％からなる液体培地（PH
5.6）100mlを500ml溶のヒダ付三角フラスコに分
注し綿栓を付した後、120℃で20分間殺菌した。
冷却後、これに別にグルコース2.0％、エビオス
0.5％、寒天1.5％からなる培地に斜面培養してお
いたくろちやわんたけ〔Pseudoplectania
nigrella（Pers.）Fuckel〕Ｋ−1426株の菌糸を接
触し、27℃で10日間振盪培養して種菌とした。別
に30l容ジヤー・フアーメンターに前記の組成の
液体培地20を分注し、120℃で20分間殺菌し、
上記の種菌を接種して27℃、12日間通気量0.5
／・min.、撹拌220rpmの条件下で通気撹拌
培養を行なつた。培養終了後培養液を過し菌糸
体130ｇ（乾物）と培養液17を得た。 実施例 ２ 実施例１で得た培養菌糸体130ｇに水15を加
え、120℃で30分間加熱抽出し、過して抽出液
と抽出残渣とに分離し、抽出残渣からの再抽出
を、上記と同様の手段で２回繰返して行ない抽出
液43を得た。この抽出液を約1/10容まで濃縮
し、濃縮液に等量のエタノールを加えて多糖体を
沈澱させて分離し、これに少量の水を加えて溶解
した後透析した。透析内液をDEAE−セフアデツ
クスで処理して非吸着区分を得、この区分をさら
にSP−セフアデツクスで処理して非吸着区分を
得、これを再び透析し凍結乾燥して白色〜淡黄色
の紛末8.6ｇを得た。 実施例 ３ 実施例１で得た培養液17を実施例２の菌糸
体抽出液と同様に処理し、白色〜淡黄色の粉末
13.2ｇを得た。 実施例 ４ 実施例３で得た本物質の白色〜淡黄色粉末を用
い、ザルコーマ180−ICR系に対する抗腫瘍活性
を検定した。その結果を第２表に示した。

【表】 実施例 ５ 実施例４と同様にして本物質のザルコーマ180
−C3H／He系、エールリツヒ固形ガン−ICR系
およびMethA−BALB／ｃ系に対する抗腫瘍活
性を検定した。その結果をそれぞれ第３表、第４
表および第５表に示した。

【表】

【表】

【表】 実施例 ６ 実施例４と同様にして本物質のエールリツヒ腹
水ガン−ICR系に対する抗腫瘍活性を検定した。
その結果を第６表に示した。

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図は本発明物質の赤外吸収スペクトルであ
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ くろちやわんたけ属に属する抗腫瘍多糖体の
   生産菌株の培養物または該菌株の子実体よりグル
   コースを構成成分とする平均分子量250000以上の
   水溶性β−グルカンを採取することを特徴とする
   抗腫瘍多糖体の製造法。