FI79140B - Foerfarande foer framstaellning av ett tf-500-aemne med karsinostatisk och immunitet stimulerande aktivitet. - Google Patents

Description

1 79140

Menetelmä karsinostaattisen ja inununostimuloivan TF-500-aineen valmistamiseksi Tämä keksintö koske uutta menetelmä karsino-5 staattisen ja inununostimuloivan aineen TF-500 tai sen suolan valmistamiseksi, jolla aineella on jäljempänä esitetyt ominaisuudet. Tässä menetelmässä Fusobacterium-su-kuun kuuluvia organismeja uuttokäsitellään dialkyylisul-foksidilla ja saadusta uutteesta otetaan talteen TF-500 10 tai sen suola.

Viime vuosina on laajalti otettu käyttöön eri syöpätyyppejä sairastavia potilaita varten hoitomuoto, joka käsittää potilaan immunologisen toiminnan parantamisen ja karsinostaattisen vaikutuksen aikaansaamiseksi immunolo-15 gisen toiminnan avulla (ks. suomalaiset patenttijulkaisut 68 080 ja 69 096).

Nyt on tutkittu sellaisten komponenttien farmakologista aktiivisuutta, jotka on saatu uuttamalla suuontelosta eristettyjä Fusobacterium- sukuun kuuluvia organismeja 20 dialkyylisulfoksidilla ja on havaittu, että eräällä määrätyllä uutteesta saadulla komponentilla on karsinostaat-tinen vaikutus. Mainitun komponentin karsinostaattinen vaikutus on välillinen, mikä ilmenee kasvaimen vastaisen .·; aktiivisuuden tai immuniteetin lisääntymisenä sekä im- 25 muniteetin hyväksikäyttönä. Mainitun komponentin myrkyl-. lisyys on hyvin lievä.

; Tämän keksinnön kohteena on uusi TF-500-aineen val- • mistusmenetelmä, jossa mikro-organismia Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077, ATCC 31647) uuttokäsitellään 30 dialkyylisulfoksidilla ja saadusta uutteesta otetaan talteen karsinostaattinen aine.

2 79140

Fusobacterium nucleatum TF-031:n bakteriologiset ominaisuudet ovat seuraavat: (I) Muoto 5 1) Solumuoto: sukkulamainen (kuvio 1) 2) solujen monimuotoisuus: puuttuu 3) Liikkuvuus: puuttuu 4) Itiöt: puuttuvat 10 5) Happoresistenssi: negatiivinen (II) Kasvuolosuhteet elatusaineessa 1) TF-agarlevy ja vinopintakasvualusta 15 Ulkoinen muoto: pyöreä

Koko: noin 1 mm Kohouma: puolipallon muotoinen Rakenne: kastepisaramainen Pinta: tasainen 20 Reunat: tasaiset Väri: maitomainen kellertävän valkoinen Läpinäkyvyys: samea ·; (2) TF-nestemäinen elatusaine - 2 5 Kasvuaste: voimakas

Sameus: hyytymä Saostuma: ei

Pinnan kasvu: ei todettu, ei kasvua noin 5 mm:n syvyyteen.

30 Kaasu: ei

II

3 79140 (III) Fysiologiset ominaisuudet 1) Rikkivedyn tuotanto: + 2) Nitraattien pelkistys: - 3) Butyyrihapon tuotanto: + 5 4) Indolin tuotanto: + 5) Ureaasi: - 6) Katalaasi: - 7) Tärkkelyshydrolyysi: - 8) Käyttäytyminen hapen suhteen: anaerobinen 10 9) Ammoniakin tuotanto: + 10) Hiilidioksidin tuotanto: +

11) Kasvualue: pH 5,0-8,5, lämpötila 30-45°C

12) Kaasun tuotanto sakkarideista: L-arabinoosi {-), D-ksyloosi (-), D-glukoosi (-), 15 D-mannoosi (-), D-fruktoosi (-), D-galaktoosi (-), mallassokeri (-), sakkaroosi (-) , trehaloosi (-), sorbitoli (-), mannitoli (-), inositoli (-), glyseroli (-), tärkkelys (-)

Karsinostaattisen aineen TF-500 valmistus voidaan 20 suorittaa esimerkiksi seuraavan kaavion mukaisesti:

Fusobacterium nucleatum-bakteeriviljelmä

Suodatus 25 -5, Supernatantti

Organismit

Dialkyylisulf- 30 oksidi -* -* Liukenemattomat aineet

Uute (hapan) hydrofiili-nen orgaaninen liuotin__» 35 4 79140

Sakka (Mahdollisesti deproteihisointi) 5 Ultrasuodatus

Karsinostaattinen aine TF-500 Yllämainittua valmistusmenetelmää kuvataan seuraa- 10 vassa.

(I) Bakteeriviljelmä

Fusobacterium-sukuun kuuluvan bakteerin viljely suoritetaan tavanomaisella anaerobisten bakteerien viljelymenetelmällä. Tämä tarkoittaa, että viljelyalusta, joka 15 sisältää typpilähteen, kuten naudan aivo-sydän-uuttei- ta, erilaisia peptoneja tai vastaavia, vitamiinilähteen, kuten hiivauutetta tai vastaavaa, epäorgaanista suolaa, kuten natriumkloridia tai vastaavia, hiililähteen, kuten glukoosia, laktoosia tai vastaavia, pelkistävän aineen, 20 kuten L-kystiiniä, natriumsulfiittia, natriumtioglyko- laattia tai vastaavaa, säädetään pH-arvoon 5-8,5, edullisesti 6,5-7,5, natriumhydroksidin vesiliuoksella ja bakteerit siirretään viljelyalustaan, minkä jälkeen suoritetaan vakiotilainen tai sekoitettava viljely anaerobi-25 sissa olosuhteissa lämpötilassa 30-45°C, edullisesti 32-37°C, 1-5 päivää, edullisesti 1-4 päivää. Erityisesti on suositeltavaa käyttää taulukossa 1 esitettyä viljelyvä-alustaa (tästä lähtien siihen viitataan TF-viljelyaiustana. Aivo-sydäninfuusio, joka on naudan aivo-sydän uute, 30 ei kuitenkaan aina ole välttämätön typpilähteenä ja voi daan korvata sydän- infuusiolla, joka on naudan sydänuute, pihviuute, kalauute, maissiuute tai vastaava. Erilaisista peptoneista proteoosipeptoni ja kasvipeptoni eivät aina ole tarpeellisia ja tryptikaasipeptoni voidaan kor-35 vata polypeptonilla.

Kun agaria ei käytetä on suositeltavaa suorittaa sekoitettava viljely.

Il 5 79140

Taulukko 1

Viljelyalustan aineosat (g/λ TF-a TF-b TF-c TF-d TF-e TF-f

Tryptikaasi- peptoni 17 17 17 17 17 17

Kasvipep- toni 3 3 1,5 - - -

Valkuais- peptoni 10 5 5

Aivo-sydän- infuusio 35 17,5 -

Sydän- infuusio - - 25 20 10 15

Hiivauute 333333

Natrium- kloridi 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5

Glukoosi 6 6 6 12 12 12

Laktoosi 5 5 5 10 10 10 L-kystiini 0,25 0,5 0,5

Natrium- sulfiitti 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Natriumtio- glykolaatti 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Agar 0 tai 0 tai 0 tai 0 tai 0 tai 0 tai 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7

Dikaliumvety- 1 fosfaatti - - 2,5 2,5 2,5 2,5 6 79140 (II) Organismien talteenotto viljelmästä Supernatantti poistetaan edellä saadusta viljelmästä organismien erottamiseksi. Supernatantin poistamiseksi voidaan käyttää tavanomaista menetelmää, kuten sentri- 5 fugointia ja suodatusmenetelmää käyttäen suodatusapuainet-ta esim. Celiteä (Jonson-Manville, USA, kauppanimi). Saadut organismit pestään fysiologisella suolaliuoksella ja kuivataan sitten tavanomaisella menetelmällä, esimerkiksi lyofilisaatiolla, tai pestään fysiologisella suolaliuok-10 sella ja sen jälkeen hydrofiilisellä orgaanisella liuottimena kuten etanolilla, asetonilla tai vastaavalla, vähän aikaa ja sitten kuivataan tavanomaisella tavalla, kuten ilmakuivauksella tai vastaavasti, jolloin saadaan kuivatut organismit. Jos on tarpeellista, kuivatut orga-15 nismit jauhetaan kuivan jauheen saamiseksi.

(III) Uuttokäsittely

Edellä saatuihin kuiviin organismeihin lisätään di-alkyylisulfoksidia, esimerkiksi dimetyylisulfoksidia, di-etyylisulfoksidia tai vastaavaa, edullisesti dimetyyli-20 sulfoksidia suhteessa 10-50 ml yhtä grammaa kohti kuivattuja organismeja. Uuttokäsittely suoritetaan sekoittamatta lämpötila-alueella huoneen lämpötilasta 80°C:seen 30 minuutista useihin vuorokausiin, edullisesti noin 65°C:ssa 3-5 tuntia. Tämän jälkeen liukenemattomat aineet poiste-25 taan tavanomaisella menetelmällä, kuten dekantoimalla, sentrifugoimalla, suodattamalla tai vastaavasti. Edellä saatuun uutteeseen lisätään hydrofiilistä orgaanista liuotinta, esimerkiksi ketonia, kuten asetonia, dietyyliketo-nia, metyylietyyliketonia tai vastaavaa, tai alkoholia, 30 kuten metanolia, etanolia, isopropanolia tai vastaavaa, määrä, joka on enemmän kuin 5 kertaa uutteen määrä (tila-vuus/tilavuus), alhaisessa lämpötilassa. Hydrofiilinen orgaaninen liuotin lisätään edullisesti happamissa olosuhteissa, esimerkiksi asetoni lisätään yhdessä suolahapon 35 kanssa, ja muodostuneen seoksen annetaan seistä noin 40°C:ssa useista tunneista useisiin päiviin.

Il 7 79140

Sakka erotetaan tavanomaisella tavalla. Sitten saadulle sakalle suoritetaan deproteinisointikäsittely ja ultrasuodatuskäsittely tai ainoastaan viime mainittu.

(IV) Deproteinisointikäsittely, ultrasuodatus ja halutun 5 aineen talteenotto

Edellä mainitulle sakalle suoritetaan deproteinisointikäsittely ja sen jälkeen ultrasuodatus tai ainoastaan ultrasuodatus, jolloin saadaan karsinostaattinen aine TF-500 tai sen suola.

10 Deproteinisointiin voidaan käyttää alalla sinänsä tunnettuja menetelmiä. Kun deproteinisointi suoritetaan proteolyyttisellä entsyymillä, saatu sakka liuotetaan tai suspendoidaan veteen tai puskuriliuokseen, proteolyytti-nen entsyymi lisätään saatuun liuokseen tai suspensioon 15 ja entsyymikäsittely suoritetaan tavanomaisella tavalla.

Proteolyyttisenä entsyyminä voidaan käyttää pronaa-sia, papaiinia, trypsiiniä, kemotrypsiiniä tai vastaavaa. Pronaasi ja trypsiini ovat edullisia. Ennen entsyymikäsit-telyjä tai sen aikana on edullista säätää ja ylläpitää ve-20 siliuoksen pH arvossa 7-8. Tätä tarkoitusta varten voidaan käyttää natriumhydroksidia, kaliumhydroksidia, natriumkarbonaattia, ammoniumkarbonaattia, natriumbikarbonaattia tai vastaavaa. Reaktioseoksen pilaantumisen estämiseksi entsyymikäsittelyn aikana on suositeltavaa lisätä pieni 25 määrä orgaanista liuotinta, kuten kloroformia, tolueenia tai vastaavaa. Entsyymiä käytetään yleensä noin 1-4 painoprosenttia käsiteltävän jauheen (kiinteän aineen) määrästä.

Yllä mainittu entsyymikäsittely suoritetaan yleensä 30 lämpötilassa 30-40°C ja käsittelyaika on 1-72 tuntia, edullisesti 24-48 tuntia. Se voidaan myös suorittaa lisäämällä aluksi esimerkiksi noin 1-2 paino-% entsyymiä jauheeseen (kiinteään aineeseen) ja käsittelemällä jauhetta (kiinteää ainetta) entsyymillä 1-24 tuntia ja lisää-35 mällä sen jälkeen taas 1-2 paino-% entsyymiä lisäkäsitte-lyä varten.

8 79140

Edellä mainitun entsyymikäsittelyn jälkeen liukenemattomat aineet tarvittaessa poistetaan sentrifugoimal-la, suodattamalla tai vastaavalla menetelmällä, minkä jälkeen saadusta vesiliukoisesta osasta otetaan talteen kar-5 sinostaattinen aine TF-500.

TF-500 aineen talteenotto vesiliukoisesta osasta voidaan aluksi suorittaa ainakin yhdellä seuraavista menetelmistä: pH-arvoon perustuva fraktiointi, fraktiointi ioninvaihtimella, erillinen saostuminen hydro-10 tiilisestä orgaanisesta liuottimesta tai vastaava, minkä jälkeen suoritetaan ultrasuodatuskäsittely (käsittely voidaan toistaa kahdesti). Erityisesti karsinostaattinen aine TF-500 saadaan säätämällä edellä mainitun vesiliukoisen osan pH edullisesti arvoon enintään 2,5:n (tarvit-15 taessa voidaan lisätä trikloorietikkahappoa), poistamal la saatu saostuma, lisäämällä vesiliukoiseen osaan hydro-fiilistä liuotinta, kuten etanolia siten, että sen väkevyys on 30-80 tilavuus-%, edullisesti 60-80 tilavuus-%, ottamalla talteen muodostunut saostuma, joka on halutun 20 aineen fraktio, ja tarvittaessa käsittelemällä tätä saostumaa anioninvaihtohartsilla kuten hartsilla Dowex 1 type (kauppanimi); Amberlite IRA-400 (kauppanimi), DEAE-Sepha-dex (kauppanimi), DEAE-Cellulose (kauppanimi) tai vastaavalla (tämä käsittely voidaan suorittaa useita kertoja) 25 ei-absorboituneiden fraktioiden talteenottamiseksi ja sitten väkevöimällä ja poistamalla suola saadun saostuman vesiliuoksesta tai ultrasuodatuksella saaduista fraktioista (molekyylipainon nimellisraja 50 000 - 200 000), jolloin on käytetty esimerkiksi kalvoa Ultrafiltration 30 Membrane UK-50 (molekyylipainon nimellisraja 50 000),

Ultrafiltration Membrane UK-200 (molekyylipainon nimellisraja 200 000) tai vastaavaa (Ultrafiltration Membrane UK-50 ja UK-200 ovat Toyo Roshi Kabushiki Kaishan

II

9 79140 ultrasuodatuskalvojen kauppanimiä), ja kuivaamalla väke-vöity ja suolaton tuote. Tämän TF-500:n 0,2 % :inen vesi-liuos (paino/tilavuus) on läpinäkyvä.

Kuten edellä on selitetty, ueproteinisointikäsit- 5 telyn ja sitä seuraavan ultrasuodatuksen sijasta voidaan suorittaa pelkästään ultrasuodatus.

Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-500 on seuraavat ominaisuudet ja se voidaan muuttaa farmaseuttisesti hyväksyttäväksi suolaksi sinänsä tunnetulla tavalla.

10 Maihittuihin farmaseuttisesti hyväksyttäviin suo loihin kuuluvat esimerkiksi alkalimetallisuolat, kuten natriumsuolat, kaliumsuolat ja vastaavat sekä maa-alkalime-tallien suolat, kuten magnesiumsuolat, kalsiumsuolat ja vastaavat.

15 Karsinostaattisen TF-500-aineen ominaisuudet ovat seuraavat: a) Se on harmahtavan valkoinen - vaaleanruskea jauhe.

b) Sillä karsinostaattinen ja immunostimuloiva vaikutus.

20 c) Se on vesiliukoinen mutta liukenematon metano- liin, etanoliin, asetoniin, bentseeniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dietyylieetteriin.

d) Sillä ei ole selvää sulamispistettä ja se alkaa hajota noin 180°C,:ssa ja hajoaa huomattavasti yli 25 195°C:ssa.

e) Sen KBr-menetelmällä saadussa infrapuna-absorptio-spektrissä on absorptioalueet alueilla 3500-3200, 2850, 2920, 1660-1600, 1580-1520, 1460-1400, 1380-1360, 1120-1100, 1080-1000, 970 30 ja 840-800 cm f) ρΗ-arvon ollessa 7 sen vesiliuoksen ultravioletti- absorptiospektrissä on voimakas absorptio absorptio-alueen reunassa ja absorptiohuippu alueella 246-280 nm.

35 10 79140 g) Se on positiivinen Molish-reaktiossa, fenolirikki-happoreaktiossa, antroni-rikkihapporeaktiossa, indoli-suolahapporeaktiossa ja Lowry-Folinin reaktiossa, mutta negatiivinen ninhydriinireaktiossa.

5 h) Sen alkuaineanalyysi on: C: 38-47 %, H: 5-7 % N. 1-4 % i) Sen sakkaridipitoisuus fenoli-rikkihappomene-telmällä määritettynä on glukoosina ilmaistuna noin 12-30 paino-% ja sen proteiinipitoisuus 10 Lowry-Folinin menetelmällä määritettynä ja nau dan seerumi-albumiinina ilmoitettuna on noin 10 paino-% tai vähemmän.

Karsinostaattisen aineen TF-500 farmakologiset ominaisuudet ovat seuraavat: 15 (I) TF-aineen vaikutus solun elinkelpoisuuteen (kasvu- pesäkkeiden muodostumiskoe)

Kokeessa, joka perustuu Kim J. H. et ai menetelmään /Cancer Res. 25 , 698 (1965)J7; HeLa S-3 soluja viljeltiin Eagelin MEMrssä, johon oli lisätty 10 % vasikan seerumia, 20 3-5 päivää lämpötilassa 37°C, minkä jälkeen viljelmä ero tettiin ja PBS(-) liuosta (vesiliuos, joka sisälsi 8,0 g/1 natriumkloridia, 0,2 g/1 kaliumkloridia, 1,15 g/1 dinatriumvetyfosfaattia ja 0,2 g/1 kaliumdivetyfosfaattia), joka sisälsi 0,01 paino-% etyleenidiamiinitetraetikka-25 happoa ja 0,1 paino-% trypsiiniä, lisättiin pipetoimalla saatuun solukerrokseen suspension muodostamiseksi. Näin saatu solususpensio laimennettiin Eagelin MEM:llä, johon oli lisätty 20 % vasikan seerumia, siten että suspensio sisälsi 300 solua millilitrassa. Yksi millilitra tätä 30 solususpensiota viljeltiin lämpötilassa 37°C 24 tuntia C02~inkubaattorissa ja muodostuneeseen viljelmään lisättiin sitten karsinostaattista ainetta TF-500, joka oli saatu myöhemmin esitettävän esimerkin 1 mukaisesti, niin että väkevyydeksi tuli 250, 500, 1000 /ug/ml. Suoritettiin kaksi 35 koetta, toisessa tapauksessa lisättiin seerumia (20 % tila-vuus/tilavuus) viljelmään ja toisessa ei lisätty seerumia.

11 79140 24 tunnin käsittelyn jälkeen solut pestiin seerumivapaalla viljelmällä, minkä jälkeen soluihin lisättiin viljelmää, johon oli lisätty 20 % vasikan seerumia tämän jälkeen soluja viljeltiin 6 päivää CC>2-inkubaattorissa. Viljelyn 5 jälkeen soluja käsiteltiin etanolilla ja värjättiin Giem- sa-liuoksella ja muodostuneet kasvupeaäkkeet laskettiin solujen elinkelpoisuuden määrittämiseksi.

Saadut tulokset on esitetty taulukossa 2, jossa solun elinkelpoisuus määritettiin seuraavan kaavan mukai-10 sesti:

Kasvuoesäkkeiden määrä

Solun elinkelpoisuus(%> = käsitellyssä ryhmässä χ10„

Kasvupesäkkeiden määrä käsittelemättömässä ryhmässä 15

Taulukko 2

Syöpästaattisen Solun elinkelpoisuus (%) aineen väkevyys _ . _ . .

ua/ml Seerumivapaa Seerumia li- / " viljelyaine sätty viljely- aineeseen 20 0 100 100 250 103,8 103,2 500 100,2 98,5 1000 55,2 97,1 25 (II) Immunostimuloiva aktiivisuus

Jokaista ryhmää varten käytettiin kolme ICR-ruvun hiirtä (naaraita, 6 viikkoa vanhoja). Hiirille annettiin vatsaontelonsisäisesti 5^ug, 50^ug ja 500^ug/kg koe-30 ainetta. 24 tunnin kuluttua aineen annosta 0,2 ml hii-lisuspensiota,joka oli valmistettu sekoittamalla 1 ml Perikan Drawing Ink 17 Black' iä (valmistaja Giinther-Wag-ner Co, Ltd.) 2 ml:aan fysiologista suolaliuosta, joka sisälsi 3 paino-% kelatiinia, ruiskutettiin suonensisäi-35 sesti hiiren häntään ja 1, 5, 10 ja 15 minuutin kuluttua ruiskutuksesta 0,02 ml verta kerättiin silmäkuopasta käyttäen hepariinilla päällystettyä hematokriitti kapillaaria ja laimennettiin sekä hemolysoitiin välittö- i2 791 40 mästi 1,6 ml:lla natriumkarbonaatin 0,1 paino-%:ista vesiliuosta. Tämä suspensio tutkittiin kolometrisesti 675 nm:ssä ja fagosytoottinen indeksi, nimittäin K-arvo, määritettiin käyttäen Helpern'in et ai. kaavaa.

5 Vertailuryhmän hiirille annettiin 0,2 ml fysio logista suolaliuosta.

T. log C - log C K - ^ o_J jossa t - t o 10 CQ = hiilen väkevyys veressä ajankohtana t ja C = hiilen väkevyys veressä ajankohtana t.

Tulokset on esitetty taulukossa 3 15 Taulukko 3

Annos jug/kg) K:n keskiarvo 5 0,0418 - 0,0089 50 0,0560 - 0,0016 500 0,0561 - 0,027 20 Vertailu 0,0276 - 0,0020 * Käytettiin esimerkissä 1 saatua karsinostaattista ainetta (III) Kasvaimen vastainen aktiivisuus Sarcoma-180 soluja vastaan 25 Sarcoma-180 soluja siirrettiin ihonalaisesti ICR-suvun hiiriin (naaras, 6 viikkoa vanha) kainalokuop- 7 paan määrä 1 x 10 solua hiirtä kohden.

Tämän jälkeen jokainen koeaine liuotettiin 5 % :iseen glukoosin vesiliuokseen ja 0,2 ml jokaista saatua liuosta 30 annettiin suonensisäisesti hiirille kerran päivässä kymmenen ja kahdentoista päivän kuluttua syöpäsolujen istuttamisesta. Vertailuryhmälle annettiin 0,2 ml 5 %:ir;ta glukoosin vesiliuosta samalla tavalla kuin edellä. Tulokset on esitetty taulukossa 4.

13 791 40

Taulukko 4 * " ~ """" ' ..... ' ~ 3

Annos Kasvaimen Kasvaimen.veren- T/£* mg/kg) keskipaino (päivä (g) (päivä 14) 14) i - - ______ _ 5 0,5*1 3,4 ± 0,7 5/5 53 Ι,Ο*1 3,6 ± 0,7 4/5 56 0,5*2 4,1 i 2,4 3/5 63 1,0*2 5,0 ±- 1,9 3/5 79 10 6f4 i 2,7 0/5 100

Huom.*l Esimerkissä 1 saatua karsinostaattista ainetta käytettiin.

*2 Esimerkissä 2 saatua karsinostaattista ainetta 15 käytettiin.

Aineella käsiteltyjen hiirien *3 T/C (%) = kasvaimen keskipaino_ x 100

Vertailuryhmän hiirien kasvaimen keskipaino 20 (IV) Akuutti myrkyllisyys TF-500:n LD^q—arvo hiirillä (ICR suku, naaras, 6 viikkoa vanha, suonensisäisesti) on yli 10 mg/kg.

Kuten yllämainituista farmakologisista kokeista ilmenee, TF-500 aine on hyödyllinen karsinostaattisena 25 aineena ja sen voidaan odottaa toimivan erilaisia syöpäsairauksia vastaan.

Karsinostaattista ainetta TF-500 tai sen farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja voidaan käyttää sen jälkeen kun ne on saatettu erilaisiin farmaseuttisiin muotoihin, 30 joita ovat esim. suun kautta annosteltavat lääkkeet, ruiskeet, peräpuikot ja vastaavat.

Kun niitä käytetään suun kautta annettavina lääkkeinä, ne voivat sisältää erilaisia täyteaineita ja voivat olla kapseleina, tabletteina, jauheina tai ra-35 keina.

Kun niitä käytetään ruiskeina, ne voivat olla joko i4 791 40 ihonalaisia ruiskeita, lihaksensisäisiä ruiskeita tai suonensisäisiä ruiskeita ja niitä käytetään suspensiona, liuoksena tai jauheena, joka on liuotettu käyttöä varten fysiologiseen suolaliuokseen tai glukoosia si-5 sältävään liuokseen tai paikallispuudutusaineeseen.

TF-500 aineen tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan annostus valitaan huolellisesti riippuen potilaan tilasta, vaikkakin yleensä on suositeltavaa antaa ainetta aikuiselle 0,001 - 0,1 mg/kg annoksena 10 kerran tai useita kertoja päivässä ja mitä tulee anto-muotoon, sitä annetaan edullisesti suun kautta, ihonalaisesti, lihaksensisäisesti tai suonensisäisesti ruiskeena tai ruiskeena taudin kohtaamaan osaan.

Tätä keksintöä kuvataan seuraavassa yksityiskoh-15 taisesti esimerkeillä ja kuvioilla.

Kuvio 1 on mikroskooppivalokuva, josta ilmenee keksinnössä käytetyn Fusobacterium nucleatum TF-031:n muoto, kuviossa 2 on esitetty esimerkin 1 mukaisesti 20 valmistetun TF-500:n infrapuna-absorptiospektri, kuvio 3 esittää mainitun aineen ultravioletti-absorptiospektriä, kuviossa 4 on esitetty esimerkin 2 mukaisesti valmistetun TF-500:n infrapuna-absorptiospektri, 25 kuvio 5 esittää mainitun aineen ultravioletti- absorptiospektriä, kuviossa 6 on esitetty esimerkin 3 mukaisesti valmistetun TF-500:n infrapuna-absorptiospektri, kuvio 7 esittää mainitun aineen ultravioletti-30 absorptiospektriä, kuviossa 8 on esitetty esimerkin 4 mukaisesti valmistetun TF-500:n infrapuna-absorptiospektri, kuvio 9 esittää mainitun aineen ultravioletti-absorptiospektriä.

15 791 40

Esimerkki 1 (1) 90-litraiseen lasiseen fermenttoriin (MSJ-U tyyppi, valmistaja Marubishi Rika Kenkyusho) laitettiin 70 litraa TF-f elatusainetta, joka sisälsi 1190 g trypti- 5 kaasi peptonia, 1050 g sydäninfuusiota, 210 g hii-vauutetta, 525 g natriumkloridia, 840 g glukoosia, 700 g laktoosia, 7 g natriumsulfiittia, 35 g natriumtio-glykolaattia ja 175 g dikaliumvetyfosfaattia/ ja elatus-aineen pH säädettiin arvoon pH 7,5 4 N natriumhydroksidin 10 vesiliuoksella. Elatusainetta steriloitiin 15 minuutin ajan lämpötilassa 118°C. Elatusaineen jäähdytyksen jälkeen sen läpi johdettiin typpikaasua virtausmäärällä 250 ml/min 1 tunnin ajan. Tähän elatusaineeseen ympättiin noin 900 ml esiviljeltyä Fusobacterium nucleatum TF-031:n 15 liuosta (FERM-5077, ATCC-31647), joka oli etukäteen valmistettu viljelemällä sitä TE-f-elatusaineessa, jonka koostumus oli sama kuin edellä. Soluja viljeltiin 4 päivää lämpötilassa 33°C sekoittaen (90 kierrosta/min) samanaikaisesti johtamalla siihen typpikaasua virtaus-20 määrällä 250 ml/min.

(2) 12 litran erä näin saatua viljelmää sentrifugoitiin • 3 (4x10 kierrosta/min, 10 min) organismien talteenottami-seksi ja organismit pestiin 1 litralla fysiologista suolaliuosta sekä seuraavaksi poistettiin rasva ja pestiin 1 25 litralla etanolia ja 1 litralla asetonia tässä järjestyksessä, minkä jälkeen ne kuivattiin jolloin saatiin 14,2 g organismeja. Organismit suspendoitiin 300 ml:aan dimetyylisulfoksidia ja uutettiin sekoittaen 4 tuntia samanaikaisesti lämmittäen suspensiota lämpötilassa 65°C.

30 Tämän jälkeen suspensio imusuodatettiin suodoksen saamiseksi. Tähän suodokseen lisättiin 2 litraa asetonia ja 8 ml väkevää suolahappoa ja saadun seoksen annettiin seistä 2 päivää muodostuneen saostuman laskeuttamiseksi ja vanhentamiseksi. Saostuma otettiin talteen sentrifu- 3 35 goimalla (4 x 10 kierrosta/min, 10 min) (748 mg).

16 791 40 (3) 748 mg näin saatua saostumaa liuotettiin 15 ml:aan vettä ja saadun liuoksen pH säädettiin arvoon 7,8 - 8,0 ammoniumkarbonaatilla. Tähän liuokseen lisättiin kaksi 7,5 mg:n annosta Pronase E:tä (Kaken Kagakun 5 kauppanimi, 1 000 000 tyrosiiniyksikköä/g) 30 minuutin välein, minkä jälkeen siihen lisättiin useita pisaroita tolueenia, ja saadulle seokselle suoritettiin entsyymi-käsittely lämpötilassa 37°C 24 tunnin ajan. Näin käsiteltyyn seokseen lisättiin suolahappoa pH:n säätämi-10 seksi arvoon 1, minkä jälkeen siihen lisättiin etanolia siten, että etanolin väkevyydeksi tuli 80 tilavuus-%.

3

Muodostunut seos sentrifugoitiin (4 x 10 kierrosta/min, 10 min) ja saatu saostuma otettiin talteen (288,6 mg).

(4) 288,6 g näin saatua saostumaa liuotettiin 15 50 ml:aan vettä ja muodostunut liuos väkevöitiin 5 ml:ksi uitrasuodattamalla käyttäen ultrasuodatus-kalvoa UK-50 ja 45 ml vettä lisättiin näin saatuun väke-vöityyn liuokseen, minkä jälkeen laimennettu liuos taas väkevöitiin 5 ml:ksi ultrasuodattamalla käyttäen ultra-20 suodatuskalvoa UK-50. Tämä väkevöity liuos suodatettiin suotimen Millipore Filter (Japan Millipore Limitedin kauppanimi mebraanisuodattimelle) läpi, jonka reikäkoko oli 0,2^um, ja sitten pakastekuivattiin,jolloin saatiin 264 mg pakastekuivattua karsinostaattista ainetta TF-500. 25 Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-500 011 edellä mainitut ominaisuudet ja infrapuna-absorptio-spektri on esitetty kuviossa 2 ja ultraviolettiadsorptio-spektri on esitetty kuviossa 3.

Esimerkki 2 30 (1) 70 litrasta esimerkissä 1-(1) saatua viljelmää otettiin organismit talteen suodattamalla Hyflo Super Cel'in (Johns-Manville, USA, kauppanimi) läpi ja muodostunut organismien ja Hyflo Super Cel'in seos pestiin 20 litralla fysiologista suolaliuosta, minkä jälkeen 35 poistettiin rasva ja pestiin 3 litralla etanolia ja 3 litralla asetonia tässä järjestyksessä, jolloin saatiin

II

i7 79140 3,2 kg kuivaa mainittua seosta. 320 g:n annos tätä seosta suspendoitiin 400 ml:aan dimetyylisulfoksidia ja saatua suspensiota uutettiin sekoittaen 4 tuntia samanaikaisesti kuumentaen sitä lämpötilassa 65°C. Tämän jäl-5 keen suspensio suodatettiin imulla suodoksen talteen-ottamiseksi ja 2,5 litraa asetonia sekä 10 ml väkevää suolahappoa lisättiin suodokseen, minkä jil-keen muodostuneen seoksen annettiin seistä lämpö .ilassa 4°C 2 päivää saostuman laskeuttamiseksi ja vanhentami-10 seksi. Saostuma otettiin talteen sentrifugoimalla 3 (4 x 10 kierrosta/min, 19 min) (94 mg).

(2) 50 ml:aan vettä liuotettiin 94 mg näin saatua saostumaa ja muodostunut liuos väkevöitiin 5 mlsksi ultrasuodattamalla käyttäen ultrasuodatuskalvoa UK-50 15 ja 45 ml vettä lisättiin näin saatuun väkevöityyn liuokseen, minkä jälkeen laimennettu liuos taas väkevöitiin 5 ml:ksi ultrasuodattamalla käyttäen ultrasuodatuskalvoa UK-50.

Näin väkevöity liuos suodatettiin Millipore-20 suodattimen läpi, jonka reikien halkaisija oli 0,2^-um ja sitten pakastekuivattiin, jolloin saatiin 62,6 mg pakastekuivattua karsinostaattista ainetta TF-500.

Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-500 oli edellä mainitut ominaisuudet ja sen infra-25 puna-absorptiospektri on esitetty kuviossa 4 ja ultra-violettiabsorptiospektri kuviossa 5.

Esimerkki 3 (1) 7,2 litran annos esimerkissä 1-(1) saatua vilje- 3 mää sentrifugoitiin (5 x 10 kierrosta/min, 10 min) 30 organismien talteenottamiseksi, minkä jälkeen ne pakastekuivattiin. 3,5 g:n annos näin pakastekuivattuja organismeja suspendoitiin 100 ml:aan fysiologista suolaliuosta ja saadun suspension pH säädettiin arvoon 8,0 2 N natriumhydroksidin vesiliuoksella, sekoitettiin 35 3 tuntia, sitten annettiin seitä 24 tuntia, minkä jäl- 3 keen sentrifugoitiin (5 x 10 kierrosta/min, 10 min) 18 791 40 supernatantin erottamiseksi. Saatuun saostumaan lisättiin 100 ml fysiologista suolaliuosta ja muodostuneen seoksen pH säädettiin arvoon 8,0 2 M natriumhydrok-sidin vesiliuoksella. Seosta sekoitettiin 2 tuntia ja 3 5 sitten se sentrifugoitiin (5 x 10 kierrosta/min, 10 min) supernatantin erottamiseksi. Tämän jälkeen saatu saostuma pestiin kolmella 50 ml:n annoksella etanolia yhdellä 50 ml:n annoksella asetonia ja yhdellä 50 ml:n annoksella dietyylieetteriä tässä järjestyksessä (pesunesteet 3 10 poistettiin sentrifugoimalla, 5 x 10 kierrosta/min, 10 min) ja sitten kuivattiin,jolloin saatiin kuivattuja organismeja. Organismit jauhettiin jauheeksi. Jauheeseen lisättiin 70 ml dimetyylisulfoksidia ja saatua seosta uutettiin sekoittaen lämpötilassa 63-65°C 4 tuntia, minkä 15 jälkeen suoritettiin imusuodatus suodoksen talteenotta-miseksi. Tähän suodokseen lisättiin 536 ml asetonia ja 1 ml väkevää suolahappoa ja saadun seoksen annettiin seistä lämpötilassa 4°C 24 tuntia saostuman laskeuttami-seksi ja vanhentamiseksi. Saostuma otettiin talteen 3 20 sentrifugoimalla (5 x 10 kierrosta/min, 10 min) (269 mg).

(2) 269 mg:aan näin saatua saostumaa lisättiin 2,7 ml vettä ja muodostuneen seoksen pH säädettiin arvoon 8,0 1 N natriumhydroksidin vesiliuoksella, minkä 25 jälkeen siihen lisättiin vettä lopullisen tilavuuden säätämiseksi 4 ml:aan. Seokseen lisättiin 2,7 mg Pronace E:tä (1 000 000 tyrosiiniyksikköä/g) ja saadulle seokselle suoritettiin entsyymikäsittely lämpötilassa 37°C yhden tunnin ajan. Tämän jälkeen siihen lisättiin 30 2,7 mg Pronase E:tä ja useita pisaroita tolueenia ja muodostuneelle seokselle suoritettiin entsyymikäsittely lämpötilassa 37°C 24 tunnin ajan. Liukenemattomat aineet poistettiin näin käsitellystä seoksesta sentrifugoimalla 3 (5 a 10 kierrosta/min, 10 min) ja saatuun liuokseen 35 lisättiin 2 N suolahappoa pH:n säätämiseksi arvoon 1,0, minkä jälkeen lisättiin etanolia siten, että eta- li i9 7 91 40 nolin väkevyydeksi tuli 80 tilavuus-%. Näin saatu saos- 3 tuma otettiin talteen sentrifugoimalla (5 x 10 kierros-ta/min, 10 min) (78,5 mg).

(3) 78,5 mg:aan näin saatua saostumaa lisättiin 5 20 ml vettä ja muodostuneen seoksen pH säädettiin arvoon 7 1 N natriumhydroksidiliuoksella. Tämän jälkeen saatu seos väkevöitiin 5 mlrksi ultrasuodattamalla käyttäen ultrasuodatuskalvoa UK-50 ja saatuun väkevöityyn liuokseen lisättiin 45 ml vettä, minkä jälkeen näin laimennet-10 tu liuos taas väkevöitiin 5 mlrksi ultrasuodattamalla käyttäen ultrasuodatuskalvoa UK-50. Näin saatuun väkevöityyn liuokseen lisättiin 45 ml vettä ja laimennettu liuos väkevöitiin 5 mlrksi ultrasuodattamalla käyttäen ultrasuodatuskalvoa UK-50. Tämä väkevöity liuos suodatet-15 tiin membraanisuodattimen läpi, jonka reikien halkaisija oli 0,2^um CToyo Roshi Kabushiki Kaisha TM-4), ja sitten pakastekuivattiin, jolloin saatiin 65 mg pakastekuivat-tua karsinostaattista ainetta TF-500.

Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-500 20 oli edellä mainitut ominaisuudet ja sen infrapuna-absorp-tiospektri on esitetty kuviossa 6 ja ultraviolettiabsor-tiospektri kuviossa 7.

Esimerkki 4 (1) 10 litran erä esimerkissä 1—(1) saatua viljelmää 3 25 sentrifugoitiin (5 x 10 kierrosta/min, 10 min) organismien talteenottamiseksi. Organismeihin lisättiin 500 ml fysiologista suolaliuosta ja saatua seosta hämmennettiin 3 30 minuuttia ja sitten se sentrifugoitiin (5 x 10 kierrosta/min, 10 min) saostuman talteenottamiseksi. Tämä 30 toimenpide toistettiin kahdesti. Näin saatuun saostumaan lisättiin 500 ml fysiologista suolaliuosta ja muodostunutta seosta sekoitettiin 30 minuuttia, minkä jälkeen pH säädettiin arvoon 8,0 IN natriumhydroksidin vesi-liuoksella ja sitten sekoitettiin 30 minuuttia. Tämän 3 35 jälkeen seos sentrifugoitiin (5 x 10 kierrosta/min, 10 min) ja poistettiin rasva sekä pestiin 500 mlr11a 2o 79140 fysiologista suolaliuosta. Tämän jälkeen seos sentrifu-3 goitiin (5 x 10 kierrosta/min, 10 min) saostuman saamiseksi. Saatu saostuma pestiin yhdellä 500 ml:n annoksella fysiologista suolaliuosta, yhdellä 300 ml:n 5 annoksella etanolia ja yhdellä 300 m], :n annoksella asetonia tässä järjestyksessä (pesunesteet poistettiin 3 sentrifugoimalla, 5 x 10 kierrosta/min, 10 min) ja sitten kuivattiin, jolloin saatiin kuivattuja organismeja.

Näin saadut organismit jauhettiin jauheeksi. Tähän jau-10 heeseen lisättiin 160 ml dimetyylisulfoksidia ja saatua seosta uutettiin sekoittaen lämpötilassa 63-65°C 4 tuntia. Tämän jälkeen seos imusuodatettiin suodoksen saamiseksi ja sudokseen lisättiin 1,2 litraa asetonia ja 4,2 ml väkevää suolahappoa, minkä jälkeen muodostuneen 15 seoksen annettiin seistä lämpötilassa 4°C 24 tuntia saostuman laskeuttamiseksi ja vanhentamiseksi. Tämä saostuma sentrifugoitiin (5 x 10^ kierrosta/min, 10 min) saostuman taiteenottamiseksi (246 mg).

(2) 246 mg:aan näin saatua saostumaa lisättiin 20 5 ml vettä ja muodostuneen seoksen pH säädettiin arvoon 7,8 IN natriumhydroksidin vesiliuoksella. Seokseen lisättiin 5 mg Pronase E:tä (1 000 000 tyrosiiniyksikköä/g) ja seokselle suoritettiin entsyymikäsittely lämpötilassa 37°C 30 minuutin ajan ja sen jälkeen lisättiin 1 N nat-25 riumhydroksidin vesiliuosta seoksen pH:n säätämiseksi arvoon 7,8, minkä jälkeen siihen taas lisättiin 5 mg Pronase E:tä ja useita pisaroita tolueenia. Saadulle seokselle suoritettiin entsyymikäsittely lämpötilassa 37°C 24 tunnin ajan. Käsiteltyyn seokseen lisättiin 1 N 30 suolahappoa pH:n säätämiseksi arvoon 1,0 ja saadun seoksen annettiin seistä 2 tuntia, minkä jälkeen se sentrifu- 3 goitiin (5 x 10 kierrosta/min, 10 min) supernatantin talteenottamiseksi. Saatuun supernatanttiin lisättiin etanolia siten, että etanolin väkevyydeksi tuli 80 tila-35 vuus-%. Saadun seoksen annettiin seistä 2 tuntia ja se 3

II

sentrifugoitiin (5 x 10 kierrosta/min, 10 min) laskeutu- 21 79140 neen saostuman talteenottamiseksi (98 mg).

(3) 98 mg:aan näin saatua saostumaa lisättiin 20 ml vettä ja muodostuneen seoksen pH säädettiin arvoon 7 IN natriumhydroksidin vesiliuoksella. Tämän jälkeen saatu 5 seos väkevöitiin 5 ml:ksi ultrasuodattamalla käyttäen ult-rasuodatuskalvoa UK-50 ja 45 ml vettä lisättiin näin saatuun väkevöityyn liuokseen, minkä jälkeen laimennettu liuos taas väkevöitiin 5 ml:ksi ultrasuodattamalla käyttäen ultrasuodatuskalvoa UK-50. Näin saatuun väkevöityyn 10 liuokseen lisättiin 45 ml vettä ja laimennettu liuos väkevöitiin 5 ml:aan ultrasuodattamalla käyttäen ultrasuodatuskalvoa UK-50. Saatu konsentraatti suodatettiin membraanisuodattimen läpi, jonka reikien halkaisija oli 0,2 yam (Toyo Roshi Kabushiki Kaisha TM-4), minkä jälkeen 15 pakastekuivattiin, jolloin saatiin 83 mg pakastekuivattua karsinostaattista ainetta TF-500.

Näin saadulla karsinostaattisella aineella TF-500 oli edellä mainitut ominaisuudet ja sen infrapuna-absorp-tiospektri on esitetty kuviossa 8 ja ultraviolettiabsorp-20 tiospektri kuviossa 9.

Claims (11)

22 791 40

1. Menetelmä karsinostaattisen aineen TF-500 tai sen suolan valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 5 ainetta TF-500 tuottavaa mikro-organismia Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077, ATCC 31647) uuttokäsitellään dialkyylisulfoksidilla, saatuun uutteeseen lisätään hydro-fiilistä orgaanista liuotinta ja näin saatu sakka saatetaan ultrasuodatuskäsittelyyn, jota mahdollisesti edeltää 10 deproteinisointikäsittely, jolloin aineella TF-500 on seu-raavat ominaisuudet: a) se on harmahtavan valkoinen - vaalean ruskea j auhe, b) sillä on karsinostaattinen ja immunostimuloiva 15 vaikutus, c) se on vesiliukoinen, mutta liukenematon metano-liin, etanoliin, asetoniin, bentseeniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dietyylieetteriin, d) sillä ei ole selvää sulamispistettä ja se alkaa 20 hajota noin 180°C:ssa ja hajoaa huomattavasti yli 195° C: ssa, e) sen KBr-menetelmällä saadussa IR-absorptiospekt-rissä on absorptiovyöhykkeet alueilla 3500 - 3200, 2920, 2850, 1660 - 1600, 1580 - 1520, 1460 - 1400, 1380 - 1360, 25 1120 - 1100, 1080 - 1000, 970 ja 840 - 800 cm'1, f) sen vesiliuoksella on pH-arvon ollessa 7 UV-ab-sorptiospektrissä voimakas absorptio absorptioalueen reunassa ja absorptiohuippu alueella 246 - 280 nm, g) se on positiivinen Molisch-reaktiossa, fenoli-30 rikkihapporeaktiossa, antroni-rikkihapporeaktiossa, indo- li-suolahapporeaktiossa ja Lowry-Folin'in reaktiossa, mutta negatiivinen ninhydriinireaktiossa, h) sen alkuaineanalyysi on: C 38 - 47 %, H 5 - 7 %, N 1 - 4 %, 35 i) sen sakkaridipitoisuus fenoli-rikkihappomenetel- mällä määritettynä on noin 12 - 30 paino-% glukoosina il- 23 791 40 maistuna ja sen proteiinipitoisuus Lowry-Folin'in menetelmällä määritettynä on noin 10 paino-% tai pienempi naudan seerumialbumiinina ilmaistuna.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että mikro-organismia Fusobacte-rium nucleatum TF-031 (FERM 5077, ATCC 31647) uuttokäsi-tellään dialkyylisulfoksidilla, saatuun uutteeseen lisätään hydrofiilistä orgaanista liuotinta ja näin saatu sakka saatetaan deproteinisointikäsittelyyn ja sen jälkeen 10 ultrasuodatuskäsittelyyn.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että dialkyylisulfoksidi on dime-tyylisulfoksidi.

4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että hydrofiilinen orgaaninen liuotin on asetoni.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 2-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että deproteinisointikä-sittely on entsyymikäsittely proteolyyttisellä entsyymil- 20 lä.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteolyyttinen entsyymi on pronaasi.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että mikro-organismille Fusobac-terium nucleatum TF-031 (FERM 5077, ATCC 31647) suoritetaan uuttokäsittely dialkyylisulfoksidilla, saatuun uutteeseen lisätään hydrofiilistä orgaanista liuotinta ja saatu sakka ultrasuodatetaan.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että dialkyylisulfoksidi on dime-tyylisulfoksidi.

9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hydrofiilinen orgaaninen 35 liuotin on asetoni. 24 791 40

10. Jonkin patenttivaatimuksista 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ultrasuodatus suoritetaan ultrasuodattimella, jonka nimellismolekyylipaino-alue on 50 000 - 200 000.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismille Fusobac-terium nucleatum TF-031 (FERM 5077, ATCC 31647) suoritetaan uuttokäsittely dialkyylisulfoksidilla, saatuun uutteeseen lisätään happamissa olosuhteissa hydrofiilistä 10 orgaanista liuotinta määrä, joka on yli 5 kertaa uutteen määrä (tilavuus/tilavuus), muodostuneelle sakalle suoritetaan deproteinisointikäsittely pronaasilla, käsiteltyyn nesteeseen lisätään alkoholia siten, että alkoholin väkevyydeksi tulee 30 - 80 tilavuus-%, muodostunut sakka ote-15 taan talteen ja sille suoritetaan ultrasuotuskäsittely ja sitten suodatetaan membraanisuodattimen läpi, minkä jälkeen suodos pakastekuivataan karsinostaattisen aineen saamiseksi . 25 791 40