DD212401A5

DD212401A5 - Neues verfahren zur herstellung einer substanz mit carcinostatischer und immunostimulierender aktivitaet

Info

Publication number: DD212401A5
Application number: DD83253996A
Authority: DD
Inventors: Kenzo Tamai; Isamu Saikawa; Takashi Yasuda; Shohachi Murakami; Toyoo Maeda; Hisatsugu Tsuda; Hiroshi Sakai; Masatoshi Sugita; Yoshiko Yamamoto; Hisashi Minami; Takako Hori
Original assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Priority date: 1982-08-17
Filing date: 1983-08-16
Publication date: 1984-08-15
Also published as: CH659256A5; AU556770B2; NZ205295A; ZA836021B; SE456014B; DK374283D0; IT1168209B; ES524977A0; NO832938L; NO159452C; ATA293783A; FI79140B; SE8304435D0; KR860001213B1; DE3329255C2; CA1202585A; NO159452B; BE897549A; JPS5931715A; AT389525B

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer TF-500 Substanz mit carcinostatischen und immunostimulierenden Aktivitaeten. Bei dem Verfahren werden zu Gattung Fusobacterium gehoerende Organismen der Extraktionsbehandlung mit einem Dialkylsulfoxid unterworfen und die TF-500 Substanz wird aus dem resultierenden Extrakt isoliert.

Description

-λ-

Titel der Erfindung:

Neues Verfahren zur Herstellung einer Substanz mit carcinostatischer und immune-stimulierender Aktivität

Anwendungsgebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung einer carcinostatischen Substanz. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung ein neues Verfahren zur Herstel-

ΛΙ'.Γ.

lung einer carcinostatischen Substanz mit den nachstehend genannten Eigenschaften oder eines Salzes derselben, bei dem ein zur Gattung Fusobacterium gehörender Organismus einer Extraktionsbehandlung mit einem Dialkylsulfoxid unterworfen wird und eine TF-500-Substanz oder ein Salz derselben aus dem resultierenden Extrakt erhalten wird.

Charakteristik der bekannten Lösungen:

In jüngster Zeit haben als Heilmittel für Patienten, die an verschiedenen Krebstypen leiden, in verstärktem Maße Mittel Verwendung gefunden, welche zu einer Steigerung der immunologischen Funktion des Wirts führen und mit denen ein carcinostatischer Effekt" unter Mitwirkung der immunologischen Funktion erzielt wird.

Die Erfinder haben die pharmakologische Wirksamkeit von Komponenten untersucht, welche durch die Extraktiοnsbehandlung mit einem Dialkylsulfoxid aus Organismen erhalten wurden, welche zur Gattung Fusobacterium gehören und welche aus der Mundhöhle isoliert wurden. Dabei wurde festgestellt, daß eine spezielle Komponente, welche aus dem Extrakt erhalten wird, eine carcinostatische Wirksamkeit aufweist, daß diese Komponente eine indirekte carcinostatische Aktivität entfaltet, und zwar durch Steigerung der wirtsvermittelten Antitumoraktivität oder, der Immunität des Wirts und Nutzung der Assistenz der Immunität; und daß diese Komponente eine äußerst, geringe Toxizität aufweist. Die Erfinder haben ferner Verfahren zur Herstellung dieser Komponente untersucht und dabei die vorliegende Erfindung gemacht.

Ziel der Erfindung:

Ss ist Ziel der Erfindung, ein neues Verfahren zu schaffen, bei dem Organismen, welche zur Gattung Fusobacterium gehören, der Extraktionsbehandlung mit einem Diaikylsulfoxid unterworfen werden und eine carcinostatische Substanz aus dem resultierenden Extrakt erhalten wird,

Andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung.

Darlegung des Vesens der Erfindung:

Als Organismen, welche bei der vorliegenden Erfindung genutzt werden,.kommen beliebige,TF-500-Substanzen produzierende Bakterien in Frage, welche zur Gattung Fusobacterium gehören« Beispielsweise werden solche, welche zu Fusοbacterium nucleatum gehören, bevorzugt verwendet. Speziell wird Fusobacterium nucleatum TF-O31 (FERM 5077; ATCC 31647; ZIMET 10852) verwendet sowie Stämme, welche gemäß dam allgemeinen Fachwissen der Mikrobiologie dessen Eigenschaften auf v/eisen, nämlich spontane Mutanten oder künstlich modifizierte Stämme.

Die bakteriologischen Eigenschaften von Fusobacterium nucleatum TF-031 sind wie folgt:

(I) Form

(1) Form der Zellen: spindelförmig (Fig. 1)

(2) Polymorphismus der Zellen: abwesend

(3) Motilltat: abwesend ^f,k) Sporen: abwesend

(5) Gramfärbung: gramnegativ (o) Säurebeständigkeit: negativ

(II) Wuchszustand im Kulturmedium

(1) TF-a Agarplatte und Schrägkultunnedium externe Form: runde Gestalt Größe: etwa 1 mm Protuberanz: halbkugelförmige Gestalt Struktur: tautropfenartig Oberfläche: glatt Kanten: glatt

Farbe: milchig gelblich-weiß Transparenz: opak

(2) TF-a Flüssigkulturmedium -Wachsturnsgrad: heftig Turbidität: Koagulum Präzipitat: keines Oberflächenwachstum: keines; kein Wachstum bis

zu einer Tiefe von etwa 5 mm Gas: keines

(III) Physiologische Eigenschaften

(1) Entwicklung von Schwefelwasserstoff: +

(2) Reduktion von Nitraten: -

(3) Produktion von Buttersäure: +

(4) Produktion von Indol: +

(5) Urease: (β) Catalase: -

(7) Stärkehydrolyse: -

(8) Verhalten gegenüber Sauerstoff: anaerob

(9) Erzeugung von Ammoniak: +

(10) Erzeugung von Kohlendioxid: +

(11) Wachstumsbereich: pH 5,0 bis 8,5; 30° bis 45⁰C

(12) Erzeugung von Gas aus Sacchariden: L-Arabinose (-), D-Xylose (-), D-Glucose (-), D-Mannose (-), D-Fructose (-), D-Galactose (-), Malzzucker (-), Saccharose (-), Trehalose (-), Sorbit (-), Mannit (-), Inosit (-), Glycerin (-), Stärke (-).

Das Verfahren zur Herstellung der carcinostatischen 'Substanz TF-5OO wird beispielsweise auf folgende Weise durchgeführt:

Kultur von Bakterien, welche zu Fusobacterium nucleatum gehören

Filtration

überstehende Flüssigkeit

Organismus

Dialkylsulfoxid

Unlösliches

Extrakt

(saures) hydrophiles organisches Lösungsmittel

Präzipitat

Deproteinisierung und/oder Ultrafiltration

carcinostatische Substanz TF-5OO

Das oben erwähnte Herstellungsverfahren wird im folgenden näher erläutert.

(I) Kultivierung der Bakterien

Die Kultivierung der Bakterien der Gattung Fusobacterium wird auf herkömmliche Weise, wie "bei anaeroben Bakterien üblich, durchgeführt. Es wird ein Kulturmedium mit einem Gehalt einer Stickstoffquelle, wie Rinderhirn-Herz-Extrakte, verschiedene Peptone oder dergl., verwendet. Ferner enthält das Medium eine Vitaminquelle, wie Hefeextrakt oder dergl.; anorganische Salze, wie Natriumchlorid oder dergl.; eine Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Lactose oder dergl.; ein Reduktionsmittel, wie L-Cystin, Natriumsulfit, Natriumthioglykolat oder dergl.; und der pH-Wert-wird auf 5 bis 8,5 und vorzugsweise auf 6,5 bis 7,5 eingestellt, und zwar mit einer wäßrigen Natriumhydroxidlösung. Das Bacterium wird in das Kulturmedium eingeimpft. Danach erfolgt eine Kultivierung im Fließgleichgewicht oder eine Kultivierung unter Rühren, und zwar unter anaeroben Bedingungen bei. 30 bis 45⁰C, vorzugsweise 32 bis 37⁰C, während 1 bis 5 Tagen, vorzugsweise T bis 4 Tagen. Insbesondere erwünscht ist es, das in Tabelle 1 beschriebene.Kulturmedium zu verwenden. Dieses wird im folgenden als "TF-Kulturmedium" bezeichnet. Das Hirn-Herz-Infusionsmedium, welches einen Rinder-Hirn-Herz-Sxtrakt darstellt, ist jedoch nicht immer als Stickstoffquelle erforderlich und kann ersetzt werden durch ein Herzinfusionsmedium, insbesondere einen Rinderherzextrakt, einen Rindfleischextrakt, einen Fischextrakt, eine 'Maisquellflüssigkeit oder dergl. Unter den verschiedenen Peptonen kommen Proteose-pepton und Phytonpepton in Frage. Sie sind jedoch nicht immer erforderlich. Man kann das Trypticase-pepton auch durch PoIypepton ersetzen.

Wenn kein Agar verwendet wird, so wird vorteilhafterweise eine Rührkultur durchgeführt.

	TF-a	Tabelle	1	TF-d	TF-e	TF-f
Bestandteile des Kulturmediums(g/l)	17	TF-b	TF-c	17	17	17
Trypticase-pepton	3	17	17	-	-	-
Phyton-pepton	10	3	1,5	-	-	-
Proteose-pepton	35	5	5	-	-	-
Hirn-Herz-Infusion	-	17,5	-	20	10	15
Herz-Infusion	3	-	25	3	3	3
Hefeextrakt	7,5	3	3	7,5	7,5	7,5
Natriumchlo rid	6	7,5	7,5	12	12	12
Glucose	5	6	β	10	10	10
Lactose	0,25	5	5	-	-	-
L-Cystin	0,1	0,5	0,5	0,1	0,1	0,1
Natriumsulfit	0,5	0,1	0,1	0,5	0,5	0,5
Natriumthio- glykolat	0 0,7	0,5	0,5	0 0,7	0 0,7	0 0,7
Agar oder	-	0 0,7	0 0,7	2,5	2,5	2,5 .
Dikaliumhydro gen- phosphat	-	2,5

(II) Abtrennung der Organismen von der Kultur

Die überstehende Flüssigkeit wird von der oben erhalte-

nen Kultur entfernt, um die Organismen zu erhalten. Zur Entfernung der überstehenden Flüssigkeit kann ein herkömmliches Verfahren angewendet werden, beispielsweise ein Zentrifugeerverfahren oder Filterverfahren. Man kann dabei eine Fiitrierhilfe, wie CeIite (Warenzeichen von Johns-Manville, USA), verwenden. Die erhaltenen Organismen werden mit physiologischer Salzlösung gewaschen und anschließend nach einem herkömmlichen Verfahren getrocknet, beispielsweise durch Gefriertrocknung, oder sie werden mit physiologischer Salzlösung gewaschen und nachfolgend mit einem hydrophilen, organischen Lösungsmittel, wie Ethanol, Aceton oder dergl., während einer

kurzen Zeit gewaschen und anschließend auf herkömmliche Weise, beispielsweise durch Lufttrocknung oder dergl., getrocknet, um die getrockneten Organismen zu erhalten. Ferner werden die getrockneten Organismen erforderlichenfalls pulverisiert, um das getrocknete Pulver zu erhalten-

(III) Sxtraktionsverfahren

Zu den oben erhaltenen, getrockneten Organismen wird ein Dialkylsulfoxid zugegeben, beispielsweise Dimethylsulfoxid, DiethyIsulfoxid oder dergl., vorzugsweise Dimethylsulfoxid, und zwar in einer Menge von 10 bis 50 ml/g getrocknete Organismen. Die Extraktionsbehandlung wird durchgeführt unter Rühren bei Raumtemperatur bis 80⁰C während 30 Minuten bis mehreren Tagen, vorzugsweise bei etwa 65⁰C während 3 bis 5 Stunden. Danach werden unlösliche Bestandteile mittels eines herkömmlichen Verfahrens, wie Dekantieren, Zentrifugieren, Filtrieren oder dergl., entfernt. Ferner wird dem erhaltenen Extrakt ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel zugesetzt, beispielsweise ein Keton, wie Aceton, Diethylketon, Methylethylketon oder dergl., oder ein Alkohol, wie Methanol, Ethanol, Isopropanol oder dergl., und zwar in einer Menge von mehr als dem 5fachen, bezogen auf die Menge des Extrakts (Volumen/Volumen) bei einer tiefen Temperatur. Vorzugsweise wird das hydrophile, organische Lösungsmittel unter sauren Bedingungen zugesetzt. Beispielsweise wird Aceton zusammen mit Chlorwasserstoffsäure zugesetzt und das resultierende Gemisch mehrere Stunden bis mehrere Tage bei etwa 4⁰C, stehengelassen.

Das Präzipitat wird auf herkömmliche Weise abgetrennt. Anschließend wird das so erhaltene Präzipitat einer

Deproteinisierungsbehandlung oder einer Ultrafiltrationsbehandlung unterworfen, und zwar entweder einem dieser Verfahren allein oder einer Kombination von beiden Verfahren.

Falls die Organismen mit physiologischer Salzlösung gewaschen werden und anschließend durch Gefriertrocknung getrocknet werden, kann die Deproteinisierungsbehandlung oder die Ultrafiltrationsbehandlung bei der Isolierung einer carcinostatischen Substanz TF-5OO oder eines Salzes derselben weggelassen werden.

(IV) Deproteinisierung, Ultrafiltration und Isolierung der angestrebten Substanz

Das auf die oben beschriebene Weise erhaltene Präzipitat wird der Deproteinisierungsbehandlung und nachfolgend der Ultrafiltrationsbehandlung unterworfen oder es wird der -Deproteinisierungsbehandlung allein unterworfen oder es wird der Ultrafiltrationsbehandlung allein unterworfen, um eine carcinostatische Substanz TF-5OO oder ein Salz derselben zu erhalten.

Zur Deproteinisierungsbehandlung können an sich bekannte Verfahren verwendet werden. Falls die Deproteinisierung durchgeführt wird durch eine Behandlung mit einem proteolytischen Enzym, so wird das erhaltene Präzipitat in Wasser oder in einer Pufferlösung aufgelöst oder suspendiert, der resultierenden Lösung oder Suspension ein proteolytisch.es Enzym zugesetzt und die Enzymbehandlung auf eine herkömmliche Weise durchgeführt.

Als proteolytische Enzyme kann man beispielsweise Pronase, Papain, Trypsin, Chemotrypsin und dergl. verwenden. Pronase und Trypsin sind bevorzugt. Es ist ins-

besondere bevorzugt, vor oder während der Enzymbehandlung die wäßrige Lösung auf pH 7 bis 8 einzustellen und zu halten. Zu diesem Zweck kann man Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat, Ammoniumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat und dergl. verwenden. Zur Verhinderung einer Putrefraktion des Reaktionsgemisches während der Enzymbehandlung ist es erwünscht, eine geringe Menge eines organischen Lösungsmittels, wie Chloroform, Toluol oder dergl., zuzusetzen. Das Enzym wird gewöhnlich in einer Menge von etwa 1 bis 4 Gew.%, bezogen auf das Gewicht des der Enzymbehandlung zu unterwerfenden Pulvers (Festkörper), zugesetzt.

Die obige Enzymbehandlung erfolgt üblicherweise bei 30 bis 40° C während 1 bis 72 Stunden und vorzugsweise 24 bis 48 Stunden. Sie kann auch durchgeführt werden, indem man zunächst z.B. etwa 1 bis 2 Gew.% eines Enzyms zum Pulver (Festkörper) gibt und sodann das Pulver (Festkörper) 1 bis 24 Stunden der Snzymbehandlung unterwirft und nachfolgend nochmals etwa 1 bis 2 Gew.# des Enzyms für eine zusätzliche Enzymbehandlung zusetzt.

Nach der obigen Enzymbehandlung werden erforderlichenfalls unlösliche Bestandteile entfernt, und zwar durch Zentrifugieren, Filtrieren oder dergl.. Sodann wird aus dem auf diese Weise erhaltenen, wasserlöslichen Anteil eine carcinostatische Substanz TF-500 isoliert.

Die Isolierung von TF-500 aus dem wasserlöslichen Anteil kann zunächst durchgeführt werden durch mindestens eine Fraktionierung in Abhängigkeit vom pH-Wert .sowie durch gesonderte Fällung aus einem hydrophilen, orga- . nischen Lösungsmittel, durch Fraktionierung mit einem Ionenaustauscher und dergl. und nachfolgend durch Ultra-

filtration (die Behandlung kann zweimal wiederholt werden) . Genauer gesagt wird die vorliegende, carcinostatische Substanz TF-5OO erhalten durch Einstellen des pH-Wertes des obigen, wasserlöslichen Anteils auf vorzugsweise einen pH von nicht mehr als 2,5 (wobei man erforderlichenfalls Trichloressigsäure zusetzen kann). Dann wird der erhaltene Niederschlag abgetrennt. Nun gibt man zum löslichen Anteil ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel, wie Ethanol, so daß seine Konzentration 30 bis 80 und vorzugsweise 60 bis 80 VoI-Jo beträgt. Dann wird der gebildete Niederschlag abgetrennt. Es handelt sich dabei um die Fraktion der angestrebten Verbindung. Nachfolgend kann erforderlichenfalls dieser Niederschlag mit einem Anionenaustauscher-

(R)

harz behandelt werden, z.B. Dowex 1 , Amberlite

IRA-4Oo(^R), DEAE-Sephadex^, DEAE-Cellulose^ oder dergl.; diese Behandlung kann mehrmals durchgeführt werden. Man isoliert dabei die nichtadsorbierten Fraktionen, und diese werden erforderlichenfalls einer Ultrafiltration unterworfen (nomineller Molekulargewichtsabbruch: 50 000 bis 200 000). Hierzu verwendet man beispielsweise eine Ultrafiltrations-Membran UK-50 mit einem nominellen Molekulargewichtsabbruch von 50 000, eine Ultrafiltrations-Membran UK-200 mit einem nominellen Molekulargewichtsabbruch von 200 000 oder dergl. (Ultrafiltrations-Membran UK-50 und UK-200 sind Warenbezeichnungen für Ultrafiltrations-Membranen von Toyo Roshi Kabushiki Kaisha). Sodann werden eine erhaltene, wäßrige Lösung des Präzipitats oder die durch Ultrafiltration erhaltenen Fraktionen weiteren Behandlungen unterzogen, wie einer Einengung, Entsalzung oder Aussalzung oder dergl.. Das konzentrierte und entsalzte Produkt wird getrocknet. Sine 0,2%ige wäßrige Lösung dieser TF-5OO Substanz (Gew./Vol.) ist transparent.

Vie oben erwähnt, kann anstelle der Deproteinisierungsbehandlung und der nachfolgenden Ultrafiltrationsbe- " handlung die oben erläuterte Deproteinisierungsbehandlung oder Ultrafiltrationsbehandlung jeweils für sich allein durchgeführt werden.

Die auf diese Weise erhaltene, carcinostatische Substanz TF-500 hat die nachfolgend aufgeführten Eigenschaften. Sie kann in ein pharmazeutisch akzeptables Salz umgewandelt werden, und zwar nach herkömmlichen Verfahren. Diese pharmazeutisch akzeptablen Salze umfassen speziell beispielsweise Alkalimetallsalze, wie Natriumsalze, Kaliumsalze und dergl., und Erdalkalimetallsalze, wie Magnesiumsalze, Calciumsalze und dergl.

Die Eigenschaften der carcinostatischen Substanz TF-500 sind wie folgt:

(a) Grauweißes bis hellbraunes Pulver.

(b) Die Substanz hat eine carcinostatische und eine immunostimulierende Wirkung.

(c) Die, Substanz ist in Wasser löslich, jedoch unlöslich in Methanol, Ethanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Ethylacetat und Diethylether.

(d) Die Substanz hat keinen klaren Schmelzpunkt, beginnt sich bei etwa 180⁰C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert oberhalb 195⁰C.

(e) Ihr Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten nach dem K3r-Verfahren, weist Absorptionsbanden auf in der Nähe.von 3500 - 3200, 2920, 2850, 1660-1600, 1580-1520, 1460-1400, 1380-1360, 1120-1100, 1080-1000, 970 und 840-800 cm""¹ .

(f) Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum ihrer wäßrigen Lösung bei einem pH-Wert von 7,0 zeigt eine starke Absorption an der Aborptionskante und zeig

ein Absorptionsmaximum in der Nähe von 246 bis 280 nm.

(g) Die Substanz verhält sich positiv bei der Molish-Reaktion, Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion, Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und Lowry-Folin-Reaktion, jedoch negativ bei der Ninhydrin-Reaktion.

(h) Elementaranalysen-Werte C 38-47% H 5-7% N 1-4%.

(i) Der Saccharidgehalt der Substanz, bestimmt mittels eines Phenol-Schwefelsäure-Verfahrens, beträgt etwa 12 bis 30 Gew.%, ausgedrückt als Glucose, und ihr Proteingehalt, bestimmt mittels des Lowry-Folin-Verfahrens, beträgt etwa 10 Gew.% oder weniger, ausgedrückt als Rinderserumalbumin.

Die pharmakologischen Aktivitäten der vorliegenden carcinostatischen Substanz TF-500 sind wie folgt.

(I) Effekt der TF-Substanz auf Zellenlebensfähigkeit (Koloniebildungs-Assay)

Basierend auf dem Verfahren von Kim.J.H. et al. [Cancer Res. 25, 698 (1965)], werden KeLa S-3 Zellen in Eagle's MEM, das mit 10% Kalbserum ergänzt ist, kultiviert, und zwar während 3 bis 5 Tagen bei 37⁰C. Anschließend wird die Kultur entfernt und eine PBS(-)-Lösung (eine wäßrige Lösung, enthaltend 8,0 g/l Natriumchlorid, 0,2 g/l Kaliumchlorid, 1,15 g/l Dinatriumhydrogenphosphat und 0,2 g/l Kaliumdihydrogenphosphat) mit einem Gehalt an 0,01 Gew.% Ethylendiamintetraessigsäure und 0,1 Gew.% Trypsin, wird der erhaltenen Zellenschicht zugesetzt, und zwar mittels einer Pipette unter Ausbildung einer Suspension. Die erhaltene Zellensuspension wird verdünnt mit Eagle's MEM, das mit 20% Kalbserum ergänzt ist, und zwar in der Weise, daß sie 300 ZeI-

len/ml enthält. 1 ml dieser Zellensuspension wird 24 h bei 37⁰C in einem CO₂-Inkubator kultiviert und zu der resultierenden Kultur wird anschließend die carcinostatische Substanz TF-500, erhalten in dem weiter unten beschriebenen Beispiel 1, zugegeben, und zwar so, daß Konzentrationen von 250, 500 und 1000 /ug/ml erhalten werden. Es werden zwei Experimente durchgeführt, wobei in einem Fall Serum (20%-, Vol/Vol) der Kultur zugesetzt wird und wobei im anderen Fall kein Serum zugesetzt wird. Nach 24stündiger Behandlung werden die Zellen mit der serumfreien Kultur gewaschen und den Zellen wird nachfolgend die Kultur zugesetzt, welcher 20% Kalbserum zugefügt sind. Daraufhin werden die Zellen β Tage in einem COp-Inkubator inkubiert. Nach der Kultivierung werden die Zellen mittels Ethanol fixiert und mit einer Giemsa-Färbelösung angefärbt. Die resultierenden Kolonien werden gezählt, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Dabei wurde die Lebensfähigkeit der Zellen nach der folgenden Gleichung bestimmt:

Anzahl der Kolonien in

Zellenlebens- _ der behandelten Grup-pe _Ληη fähigkeit (%) " Anzahl der Kolonien in ^{x IUU}

d.unbehandelten Gruppe

Tabelle 2

Konz.der carcino- Zellenlebensfähigkeit (%) ^statischen Substanz serumfreies KuI- mit Serum versetzl)' turmedium tes Kulturmedium

0 100 100

250 103,8 103,2

500 100,2 98,5

1000 55,2 97,1

(II) Immunostimulierende Wirkung

Drei Mäuse vom ICR-Stamm (weiblich, 6 Wochen alt) werden in jeder Gruppe verwendet. 5/ug, 50/ug und 500/ug/kg Testsubstanz werden den Mäusen intraperitoneal verabreicht. 24 Stunden nach der Verabreichung werden in den Schwanz der Maus 0,2 ml einer Kohlenstoffsuspension intravenös injiziert. Diese wurde hergestellt durch Vermischen von 1 ml Pelikan Zeichentusche Nr. 17 Schwarz (Günther Wagner GmbH) mit 2 ml einer physiologischen Salzlösung, enthaltend 3 Gew.% Gelatine. 1, 5, 10 und 15 min nach der Injektion werden aus der Orbita 0,02 ml Blut gewonnen, wobei man eine Hämatokrit-Kapillare verwendet, die mit Heparin beschichtet ist. Das Blut wird sofort verdünnt und hämolysiert, und zwar mit 1,6 ml einer 0,1 gew.%igen wäßrigen Natrium-· carbonatlösung. Diese Suspension wird einer Colorimetrie bei 675 nm unterzogen. Der Phagocytose-Index (K-Wert) wird aus der Gleichung von Halpern et al. ermittelt.

Den Mäusen der Blindgruppe werden 0,2 ml physiologische Salzlösung verabreicht.

log C_n - log C

^{K =} —^ς—

Cq bezeichnet den Kohlenstoffpulvergehalt im Blut zum Zeitpunkt t_n; C bezeichnet den Kohlenstoff pulvergehalt im Blut zum Zeitpunkt t. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt.

Tabelle 5 Dosis (/ug/kg) ₄ Durchschnittlicher K-Wert

5 0,0418 + 0,0089

50 0,0560+ 0,0016

500 0,0561. + 0,027

Vergleich 0,0276 + 0,0020

Bemerkung: Es wurde die in Beispiel 1 erhaltene, carcinostatische Substanz verwendet.

(Ill) Antitumor-Aktivität gegen Sarcoma-180 Zellen

Sarcoma-180 Zellen werden subkutan transplantiert, und zwar in Mäuse vom ICR-Stamm (weiblich, 6 Wochen alt) in die Armbeuge in einer Menge von 1 χ 10 Zellen/Maus. Nachfolgend wird eine jede der Testsubstanzen in einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung aufgelöst und 0,2 ml einer jeden der resultierenden Lösungen werden intravenös verabreicht, und zwar jeder Maus einmal pro Tag am 10. und 12. Tag nach der Transplantation der Krebszellen. Der Vergleichsgruppe werden 0,2 ml einer 5%igen wäßrigen Glucoselösung auf die gleiche, oben beschriebene Weise verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt,

Tabelle 4

Dosis	Mittl.	Cs)	Hämorrhagj	14)	53
(mg/kg)	,Tumorgewicht	+ 0,7	.sehe T/C⁺³ (%)	56
	+ Standardabweichung	+ 0,7	Necrose des Tu-(Tag 14)	63
0,5⁺¹		+ 2,4	mors (Tag	79
1,O⁺¹	3,4	+ 1,9	5/5	100
0,5⁺²	3,6	+ 2,7	4/5
1,O⁺²	4,1	3/5
5,0	3/5
Vergleich 6,4	... 0/5

Bemerkungen:

+1 Es wird die in Beispiel 1 erhaltene, carcinostatische Substanz verwendet.

+2 Es wird die in Beispiel 2 erhaltene, carcinostatische Substanz verwendet

+3 T/C (30 =

Mittl.Tumorgewicht der Mäuse bei Verabreichung der Testsubstanz _10Q Mittl.Tumorgewicht der Mäuse der Vergleichsgruppe

(IV) Akute Toxizität

LD₁-Q-Werte werden bei Mäusen (ICR-Stamm, weiblich,

6 Wochen alt, intravenöse Verabreichung) gemessen. Der LD -Wert von TF-500 beträgt mehr als 10 mg/kg.

Man erkennt aus den obigen pharmakologischen Experimenten, daß die TF-500 Substanz der vorliegenden Erfindung als carcinostatisches Mittel brauchbar ist. Es kann eine Wirksamkeit gegen verschiedenste Krebserkrankungen erwartet werden.

Die TF-500 Substanz oder Ihre pharmazeutisch akzeptablen Salze gemäß der vorliegenden Erfindung können zu verschiedensten pharmazeutischen Darreichungsformen verarbeitet werden. Insbesondere können orale Mittel hergestellt werden oder Injektionsmittel, Suppositorien oder dergl..

Im Falle oraler Mittel können diese verschiedene Hilfsstoffe enthalten und in Form von Kapseln, Tabletten, Pulvern oder Granulaten vorliegen. Im Falle von Injektionsmittein können diese für subkutane Injektion, intramuskuläre Injektion und intravenöse Injektion vorgesehen sein. Es kann sich dabei um Suspension oder Lösungen handeln oder um Pulver, welche vor Gebrauch in einer physiologischen Salzlösung oder in einer Glucose oder ein Lokalanäthetikum enthaltenden Lösung aufgelöst

werden. Die Dosis der erfindungsgemäßen TF-500 Substanz oder ihres pharmazeutisch akzeptablen Salzes kann je nach dem Zustand des Patienten in zweckentsprechender Weise ausgewählt werden. Es ist jedoch im allgemeinen erwünscht, einem Erwachsenen 0,001 bis 0,1 mg/kg einmal am Tag oder mehrmals am Tag zu verabreichen. Was die Verabreichungsmethode anbelangt, so ist die orale Verabreichung, die subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion oder die Injektion in den erkrankten Bereich bevorzugt.

Ausführungsbeispiele:

Im folgenden wird die Erfindung im einzelnen anhand von Beispielen, Präparatbeispielen und Zeichnungen näher erläutert; es zeigen:

Fig. 1 eine mikroskopische Fhotographie der Form des Fusobacteriums nucleatum TF-031, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird;

Fig. 2 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der in dem nachfolgenden Beispiel 1 erhaltenen Substanz TF-500;

Fig. 3 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 4 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der in dem nachfolgenden Beispiel 2 erhaltenen Substanz TF-500;

Fig. 5 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz;

Fig. 6 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der in dem nachfolgenden Beispiel 3 erhaltenen Substanz TF-500;

Fig. 7 ein Ultraviolett-AbsorptionsSpektrum dieser Substanz;

Fig. 8 ein Infrarot-Absorptionsspektrum der im folgenden Beispiel 4 erhaltenen Substanz TF-500; und

Fig. 9 ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum dieser Substanz.

Beispiel 1

(1) In ein 90 1 Fermentationsgefäß (MSJ-U-Typ, hergestellt von Marubishi Rika Kenkyusho) gibt man 70 1 eines TF-f Kulturmediums, enthaltend 119Og Trypticasepepton. 1050 g Herzinfusion, 210 g Hefeextrakt, 525 g Natriumchlorid, 840 g Glucose, 700 g Lactose, 7 g Natriumsulfit, 35 g Natriumthioglykolat und 175 g Dikaliumhydrogenphosphat. Das Kulturmedium wird mit 4N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 7,5 eingestellt. Das Kulturmedium wird 15 min bei 118⁰C sterilisiert. Nach dem Abkühlen des Kulturmediums wird Stickstoffgas während 1 h mit einem Durchsatz von 250 ml/min durchgeleitet. Nun wird das Kulturmedium mit etwa 900 ml einer Vorkulturlösung von Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647) geimpft, welche zuvor hergestellt wurde durch Kultivierung in einem TF-f Kulturmedium der gleichen Zusammensetzung wie oben. Die Zellen werden 4 Tage bei 33⁰C unter Rühren (90 U/min) kultiviert, wobei Stickstoff gas mit einer Rate von 250 ml/min eingeleitet wird.

(2) Eine 12 1-Portion der so erhaltenen Kultur wird zentrifugiert (4 χ 10 U/min; 10 min), um die Organismen zu sammeln. Die Organismen werden mit 1 1 physiologischer Salzlösung gewaschen und nachfolgend entfettet und mit 1 1 Ethanol und 1 1 Aceton in dieser Reihenfolge gewaschen und anschließend getrocknet. Man erhält 14,2 g der Organismen. Die Organismen werden in 300 ml Dimethyisulfoxid suspendiert und einer Extraktion unterworfen, und zwar während 4 h unter Rühren und Erhitzen der Suspension auf 65⁰C. Nachfolgend wird die Suspension unter Absaugen filtriert, um ein Filtrat zu erhalten. Diesem Filtrat werden 2 1 Aceton und 8 ml konz. Chlorwasserstoffsäure zugesetzt, und das resultierende Gemisch wird anschließend 2 Tage stehengelassen, damit

sich das resultierende Präzipitat absetzt und altert. Dieses Präzipitat wird durch Zentrifugieren gesammelt (4 χ 10³ U/min; 10 min) (748 mg).

(3) Die auf diese Weise erhaltenen 748 mg des Präzipitats werden in 15 ml Wasser aufgelöst, und die resultierende Lösung wird mit Ammoniumcarbonat auf pH 7,8 bis 8,0 eingestellt. Dieser Lösung werden zwei 7,5-mg-Portionen Pronase E (Warenname von Kaken Kagaku; 1 000 000 Tyrosineinheiten/g) zugesetzt, und zwar mit einem 30 min- Intervall, und es werden anschließend einige Tropfen Toluol zugegeben. Daraufhin wird das resultierende Gemisch der Enzymbehandlung bei 37°C während 24 h unterworfen. Dem auf diese Weise behandelten Gemisch wird Chlorwasserstoffsäure zugesetzt, um den pH auf 1 . einzustellen. Anschließend wird Ethanol zugegeben, und zwar in der Weise, daß die Ethano!konzentration 80 VoI-^ beträgt. Das resultierende Gemisch wird zentrifugiert (4 χ 10^ U/min; 10 min) und das resultierende Präzipitat gesammelt (288,6 mg).

(4) Die 288,6 mg cLes erhaltenen Präzipitats werden in 50 ml Wasser aufgelöst und die resultierende Lösung wird durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran UK-50 auf 5 ml konzentriert. Der auf diese Weise erhaltenen, konzentrierten Lösung werden 45 ml Wasser zugesetzt, woraufhin die so erhaltene, verdünnte Lösung wiederum auf 5 ml konzentriert wird, und zwar durch Ultrafiltration unter Verwendung der Ultrafiltrationsmembran UK-50. Diese konzentrierte Lösung wird durch ein Millipore Filter (Warenname für ein Membranfilter von Japan Millipore Limited) mit einem Porendurchmesser von 0,2 /um filtriert und dann gefriergetrocknet. Man erhält 264 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-500.

Die auf diese Weise erhaltene, carcinostatische Substanz TF-5OO hat die oben erwähnten Eigenschaften und das Infrarot-Absorptionsspektrum gemäß Fig. 2 sowie das Ultraviolett-Absorptionsspektrum gemäß Fig. 3·

Beispiel 2

(1) Aus 70 1 der in Beispiel 1-(1) erhaltenen Kultur werden die Organismen isoliert, und zwar durch Filtration durch Hyflo Super CeI (Warenname von Johns-Manville, USA). Das resultierende Gemisch der Organismen mit Hyflo Super CeI wird mit 20 1 physiologischer Salzlösung gewaschen und anschließend entfettet und mit 3 1 Ethanol und 3 1 Aceton in dieser Reihenfolge gewaschen. Man erhält 3,2 kg der getrockneten Mischung. Eine 320 g-Fortion dieser Mischung wird in 400 ml Dimethylsulfoxid suspendiert und die resultierende Suspension wird einer Extraktion unterworfen, und-zwar unter Rühren während 4 h, während das Ganze auf 65⁰C erhitzt wird. Nachfolgend wird die Suspension unter Absaugen filtriert, um ein Filtrat zu isolieren. 2,5 1 Aceton und 10 ml konz. Chlorwasserstoffsäure werden dem Filtrat zugesetzt, woraufhin das resultierende Gemisch 2 Tage bei 4⁰C stehengelassen wird, um das Präzipitat abzusetzen und zu altern. Das Präzipitat wird durch Zentrifugieren gesammelt (4 χ 10 U/min; 10 min) (94 mg).

(2) In 50 ml Wasser werden die auf diese Weise erhaltenen 94 mg des Präzipitats aufgelöst und die resultierende Lösung wird auf 5 ml konzentriert, und zwar durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ul.trafiltrations-Membran UK-50. Der erhaltenen, konzentrierten Lösung werden 45 ml Wasser zugesetzt, woraufhin die so verdünnte Lösung wiederum auf 5 ml konzentriert wird durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltration -Membran UK-50.

Die so erhaltene, konzentrierte Lösung wird durch ein Millipore Filter mit einem Porendurchmesser von 0,2 /um filtriert und anschließend gefriergetrocknet. Man erhält 62,6 mg der gefriergetrockneten, carcinosta-.tischen'Substanz TF-500.

Die auf diese Weise erhaltene, carcinostatische Substanz TF-500 hat die oben erwähnten Eigenschaften und das Infrarotabsorptionsspektrum gemäß Fig. 4 sowie das Ultraviolett-Absorptionsspektrum gemäß Fig. 5.

Beispiel^

(1) Eine 7,2 1-Portion der in Beispiel 1-(1) erhaltenen Kultur wird zentrifugiert (5 x 10 U/min; 10 min), um die Organismen zu isolieren. Diese werden gefriergetrocknet. Eine 3,5 g-Portion der gefriergetrockneten Organismen wird in 100 ml physiologischer Salzlösung suspendiert und die resultierende Suspension wird mit 2N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 8,0 eingestellt, 3 h gerührt und dann 24 h stehengelassen. Dann wird die Suspension zentrifugiert (5 x 10 U/min; 10 min), um die überstehende Flüssigkeit zu entfernen. Dem erhaltenen Präzipitat werden 100 ml physiologische Salzlösung zugesetzt und das resultierende Gemisch wird mit 2N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 3,0 eingestellt. Das Gemisch wird 2 h gerührt und anschließend zentrifugiert (5 x 10-⁷ U/min; 10 min), um die überstehende Flüssigkeit zu entfernen. Nachfolgend wird das erhaltene Präzipitat mit drei 50 ml-Portionen Ethanol, einer 50 ml-Portion Aceton und einer 50 ml-Portion Diethylether in dieser Reihenfolge gewaschen, wobei die Entfernung der Waschflüssigkeiten durch Zentrifugieren erfolgt (5 x 10^ U/min; 10 min). Anschließend wird das Präzipitat getrocknet, um trockene

Organismen zu erhalten. Die Organismen werden pulverisiert, um ein Pulver derselben zu erhalten. Dem Pulver werden 70 ml Dimethylsulfoxid zugesetzt, und das resultierende Gemisch wird extrahiert, und zwar unter Rühren bei 63 bis 65⁰C während 4 h. Anschließend wird eine Saugfiltration durchgeführt, um ein Filtrat zu isolieren. Dieses Filtrat wird mit 536 ml Aceton und 1 ml konz.Chlorwasserstoffsäure versetzt und das resultierende Gemisch wird 24 h bei 4⁰C stehengelassen, um ein Absetzen und eine Alterung des Präzipitats zu bewirken. Das Präzipitat wird durch Zentrifugieren isoliert (5 x 10³ U/min; 10 min) (269 mg).

(2) Den 269 mg des auf diese Weise erhaltenen FiI-trats werden 2,7 ml Wasser zugesetzt, und das resultierende Gemisch wird mit 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 8,0 eingestellt. Dann wird Wasser zugegeben, um das Endvolumen auf 4 ml einzustellen. Dem Gemisch werden 2,7 mg Pronase E (1 000 000 Tyrosineinheiten/g) zugesetzt und das resultierende Gemisch wird 1 h bei 37⁰C der Enzymbehandlung unterworfen. Ferner werden 2,7 mg Pronase E und einige Tropfen Toluol zugesetzt und das resultierende Gemisch wird 24 h bei 37⁰C der Enzymbehandlung unterworfen. Unlösliche Bestandteile werden aus dem so behandelten Gemisch durch Zentrifugieren abgetrennt (5 x 10^ U/min; 10 min) und die erhaltene Lösung wird mit 2N Chlorwasserstoffsäure versetzt, um den pH derselben auf 1,0 einzustellen. Daraufhin wird Ethanol zugegeben, und zwar in der Weise, daß die Ethano!konzentration 80 Vol-% ausmacht. Das dabei erhaltene Präzipitat wird durch Zentrifugieren isoliert (5 x 10³ U/min; 10 min) (78,5 mg).

werden 500 ml physiologische Salzlösung zugesetzt, und das resultierende Gemisch wird 30 min gerührt, anschließend mit 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 8,0 eingestellt und nachfolgend 30 min gerührt. Dann wird das Gemisch zentrifugiert (5 x 10-⁵ U/min; 10 min) und entfettet sowie mit 500 ml physiologischer Salzlösung gewaschen. Daraufhin wird das Gemisch zentrifugiert (5 x 10^ U/min; 10 min), um das Präzipitat zu erhalten. Das erhaltene Präzipitat wird mit einer 500 ml-Portion physiologischer Salzlösung, einer 300 ml-Portion Ethanol und einer 300 ml-Portion Aceton in dieser Reihenfolge gewaschen, wobei die Entfernung der Waschflüssigkeiten durch Zentrifugieren (5 x 10^ U/min; 10 min) erfolgt. Nachfolgend wird getrocknet, um getrocknete Organismen zu erhalten. Die so· erhaltenen Organismen werden pulverisiert, um ein Pulver derselben zu erhalten. Dieses Pulver wird mit 160 ml Dimethylsulfoxid versetzt und das resultierende Gemisch anschließend der Extraktion'unter Rühren bei 63 bis 65⁰C während 4 h unterworfen. Anschließend wird das Gemisch unter Absaugen filtriert, um ein Filtrat zu erhalten. -Dem-Filtrat werden 1,2 1 Aceton und 4,2 ml konz.Chlorwasserstoff säure zugesetzt, woraufhin das resultierende Gemisch 24 h bei 4⁰C stehengelassen wird, um das Präzipitat abzusetzen und zu altern. Dieses Präzipitat wird abzentrifugiert (5 x 10 U/min; 10 min), um das Präzipitat zu sammeln (246 mg).

(2) Den 246 mg des so erhaltenen Präzipitats werden 5 ml Wasser zugesetzt, und das resultierende Gemisch wird mit 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 7,3 eingestellt. Dem Gemisch werden 5 mg Pronase Ξ (1 000 000 Tyrosin-Einheiten/g) zugesetzt und das Gemisch wird der Enzymbehandlung bei 37⁰C während 30 min

(3) Den 78,5 nig des so erhaltenen Präzipitats werden 20 ml Wasser zugesetzt und das resultierende Gemisch wird mit 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 7 eingestellt. Nachfolgend wird das resultierende Gemisch auf 5 ml konzentriert, und zwar durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrations-Membran UK-50. Der so erhaltenen, konzentrierten Lösung werden 45 ml Wasser zugesetzt, woraufhin die so verdünnte Lösung wiederum auf 5 ml konzentriert wird, und zwar durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrations-Membran UX-50. Die erhaltene, konzentrierte Lösung wird wiederum mit 45 ml Wasser versetzt und die verdünnte Lösung wiederum auf 5 ml konzentriert durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrations-Membran UK-50. Dieses Konzentrat wird durch ein Membranfilter mit einem Porendurchmesser von 0,2 /um (Toyo Roshi Kabushiki Kaisha TM-4) filtriert und dann gefriergetrocknet. Man erhält 65 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen Substanz TF-500.

Die so erhaltene, carcinostatische Substanz TF-500 hat die oben erwähnten Eigenschaften und das Infrarot-Absorptionsspektrum gemäß Fig. β und das Ultraviolett-Absorptionsspektrum gemäß Fig. 7.

Beispiel 4

(1) Eine 10 1-Portion der in Beispiel 1-(1) erhaltenen Kultur wird zentrifugiert (5 χ 10 U/min; 10 min), um die Organismen zu isolieren. Den Organismen werden 500 ml physiologische Salzlösung zugesetzt, und das resultierende Gemisch wird 30 min gerührt. Anschließend wird zentrifugiert (5 x 10^ U/min; 10 min), um das Präzipitat zu isolieren. Dieses Verfahren wird zweimal wiederholt. Dem auf diese Weise erhaltenen Präzipitat

unterworfen. Daraufhin wird dem Gemisch 1N wäßrige Natriumhydroxidlösung zugesetzt, um den pH auf 7,8 einzustellen. Dann werden wiederum 5 mg Pronase E und einige Tropfen Toluol zugegeben. Das resultierende Gemisch wird der Enzymbehandlung bei 37°C während 24 h unterworfen. Dem behandelten Gemisch wird 1N Chlorwasserstoff säure zugesetzt, um den pH auf 1,0 einzustellen, und das resultierende Gemisch wird 2 h stehengelassen und nachfolgend zentrifugiert (5 x 10 U/min;. 10 min), um die überstehende Flüssigkeit zu erhalten. Der erhaltenen, überstehenden Flüssigkeit wird Ethanol zugesetzt zur Schaffung einer Ethano!konzentration von 80 Vol-#. Das resultierende Gemisch wird 2 h stehengelassen und zentrifugiert (5 x 10-⁵ U/min; 10 min), um das abgesetzte Präzipitat zu sammeln (98 mg).

(3) Den 98 mg des auf diese Weise erhaltenen Präzipitats werden 20 ml Wasser zugesetzt, und das resultierende Gemisch wird mit 1N wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 7 eingestellt. Anschließend wird das resultierende Gemisch auf 5 ml durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrations-Membran UK-50 konzentriert. Der erhaltenen, konzentrierten.Lösung werden 45 ml Wasser zugesetzt, woraufhin die so verdünnte Lösung wiederum auf 5 ml konzentriert wird durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrations-Membran UK-50. Der erhaltenen, konzentrierten Lösung werden wiederum 45 ml Wasser zugesetzt und die so verdünnte Lösung wird wiederum auf 5 ml konzentriert durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Ultrafiltrations-Membran UK-50. Das erhaltene Konzentrat wird durch ein Membranfilter mit einem Porendurchmesser von 0,2/um (Toyo Roshi Kabushiki Kaisha TM-4) filtriert und dann gefriergetrocknet. Man erhält 83 mg der gefriergetrockneten, carcinostatischen.Substanz TF-500.

Die so erhaltene, carcinostatische Substanz TF-5OO hat die oben erwähnten Eigenschaften und das Infrarot-Absorptionsspektrum gemäß Fig. S sowie das'Ultraviolett-Absorptionsspektrum gemäß Fig. 9.

Präparat 1

Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der in Beispiel 1 erhaltenen, carcinostatischen Substanz TF-500 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet, wobei man ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz TF-500 erhält, und zwar als 0,5 mg-Einheit oder 1 mg-Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5&Lgen Lidocainlösung, einer O,596igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst. Die resultierende Lösung wird für InJektionszwecke verwendet.

Präparat 2

Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der in Beispiel 2 erhaltenen, carcinostatischen Substanz TF-500 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet, wobei man ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz TF-500 erhält, und zwar als 0,5 mg-Einheit oder 1 mg-Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 0,5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl.aufgelöst. Die resultierende Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.

Präparat 3

Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der in Beispiel 3 erhaltenen, carcinostatischen Substanz TF-500 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet, wobei man ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz TF-500 erhält, und zwar als 0,5 mg-Einheit oder 1 mg-Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5^igen Lidocainlösung, einer 0,5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst. Die resultierende Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.

Präparat 4

Eine wäßrige Lösung vom pH 7,0 bis 7,5 mit einem Gehalt der in Beispiel 4 erhaltenen, carcinostatischen Substanz TF-500 wird in eine Ampulle gegeben und gefriergetrocknet, wobei man ein gefriergetrocknetes Präparat der carcinostatischen Substanz TF-500 erhält, und zwar als· 0,5 mg-Einheit oder 1 mg-Einheit. Vor Gebrauch wird das Produkt in einer sterilisierten, physiologischen Salzlösung, einer 0,5%igen Lidocainlösung, einer 0,5%igen wäßrigen Glucoselösung oder dergl. aufgelöst. Die resultierende Lösung wird für Injektionszwecke verwendet.

Claims

Erfindungsansprüche

1. Verfahren zur Herstellung einer carcinostatischen Substanz TF-5OO mit den folgen!en Eigenschaften oder eines Salzes derselben, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Gattung Fusobacterium gehörende Organismen einer Extrakt ionsbehandlung mit einem Dialkylsulfoxid unterwirft und die Substanz aus dem Extrakt isoliert:

(a) grauweißes-hellbraunes Pulver;

(b) die Substanz hat eine carcinostatische und iminunostimulierende Aktivität;

(c) die Substanz ist löslich in Wasser, jedoch unlöslich in Methanol, Ethanol, Aceton, Benzol, Chloroform, Ethylacetat und Diethylether;

(d) die Substanz hat keinen klaren Schmelzpunkt und beginnt sich bei etwa 1SO⁰C zu zersetzen und zersetzt sich bemerkenswert oberhalb 195 C;

(e) das Infrarot-Absorptionsspektrum, erhalten nach dem KBr-Verfahren, weist Absorptionsbanden auf in der Nähe von 3500-3200, 2920, 2850, 1660-1600, 1580-1520, 1460-1400, 1380-1360, 1120-1100, 1080-1000, 970 und 840-800 cm"¹;

(f) das Ultraviolett-Absorptionsspektrum ihrer wäßrigen Lösung bei einem pH von 7,0 zeigt eine starke Absorption an der Absorptionskante und zeigt ein Absorptionsmaximum in der Nähe von 246-280 nm;

(g) die Substanz verhält sich positiv bei der Molisch-Reaktion, bei der Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, bei der Anthron-Schv/efeisäure-Reaktion, bei der Indol-Chlorwasserstoffsäure-Reaktion und der Lowry-Folin-Reaktion, jedoch negativ bei der Ninhydrin-Reaktion;

(h) Elementaranalysen-Werte: C 38-47% H 5-7% N 14#

(i) der Saccharidgehalt, bestimmt nach einem Phenol-Schwefelsäure-Verfahren, beträgt etwa 12 bis 30 Gew.^,ausgedrückt als Glucose, und der Proteingehalt der Substanz, bestimmt nach dem Lowry-Folin-Verfahren beträgt etwa 10 Gevi.% oder weniger, ausgedrückt als Rinders erumarbuinin.
2. Verfahren nach Punkt 1 , dadurch gekennzeichnet, daß zur Gattung Fusobacterium gehörende Organismen der Extraktionsbehandlung mit einem Dialkylsulfoyid unterworfen werden, ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel dem resultierenden Extrakt zugesetzt wird, das erhalten Präzipitat einer Deproteinisierungsbehandlung und nachfolgend einer Ultrafiltrationsbehandlung unterworfen wird.
3. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Dialkylsulfoxid Dimethylsulfoxid ist.
4. Verfahren nach Punkt 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile, organische Lösungsmittel Aceton ist.
5. Verfahren nach einem der Punkte 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Deproteinisierungsbehandlung eine Enzymbehandlung mit einem proteolytischen Enzym ist.
6. Verfahren nach Punkt 5, dadurch gekennzeichnet, daß das proteolytische Enzym eine Pronase ist.
7. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Gattung Fusobacterium gehörenden Organismen der Extraktionsbehandlung mit einem Dialkylsulfoxid unterworfen werden, dem resultierenden Extrakt ein hydro-

philes, organisches Lösungsmittel zugesetzt wird und das erhaltene Präzipitat ultrafiltriert wird.
8. Verfahren nach Punkt 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Dialkylsulfoxid Dimethylsulfoxid ist/
9. Verfahren nach Punkt 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das hydrophile, organische Lösungsmittel Aceton ist.
10. Verfahren nach einem der Punkte 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Ultrafiltrationsbehandlung durchgeführt wird mit einem Ultrafilter mit einem nominellen Molekulargewichtsabbruch von 50 000 bis 200 000.
11. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den zur Gattung Fusobacterium gehörenden Organismen um Fusobacteriuin nucleatum handelt.
12. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zu Fusobacterium nucleatum gehörende Organismen der Extraktionsbehandlung mit einem Dialkylsulfoxid unterwirft; ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel unter sauren Bedingungen zu dem resultierenden Extrakt in einer Menge von mehr als dem 5fachen des Extrakts (Vol./ Vol.) gibt; das gebildete Präzipitat der Deproteinisierungsbehandlung mit einer Pronase unterwirft;' der behandelten Flüssigkeit einen Alkohol zusetzt unter Schaffung einer Alkoholkonzentration von 30 bis 80 Vol-%; das gebildete Präzipitat isoliert und der Ultrafiltration unterwirft und nachfolgend durch ein Membranfilter filtriert; und daraufhin eine Gefriertrocknung des Filtrats durchführt, um die carcinostatische Substanz zu erhalten.