SE456014B - Forfarande for framstellning av en substans, tf-500, med karcinostatisk och immunostimulerande aktivitet - Google Patents

Description

456 014 Ett ändamål med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla ett nytt förfarande som innefattar att man utsätter organismer hörande till släktet Fusobacterium för extraktionsbehandling med en dialkylsulfoxid och utvinner en karcinostatisk substans från det erhållna extraktet. 'Ändra ändamål med föreliggande uppfinning framgår av följande beskrivning.

Som organism,som användes enligt föreliggande uppfinning kan vilka som helst TF-500-substansproducerande bakterier hörande till släktet Fusobacterium,användas och företrädesvis användes exempelvis de som hör till Fusobacterium nucleatum. Särskilt Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077) ATCC 31647) och liknande, användes.

De bakteriologiska egenskaperna hos Fusobacterium nucleatum TF-031 är följande: (I) Form (l) cellform: spindelformade (figur 1) (2) cellernas polymorfism: saknas ' (3) motilitet: saknas (4) sporer: saknas (5) gramfärgning: gramnegativ (6) syraresistans: negativ (II) Tillväxtbetingelser i kulturmedium (1) TF-a agar-agar-plattor och snedkulturmedium yttre form: rund form lnl storlek: ungefär l mm - protuberans: hemisfär form struktur: daggdroppslik yta: jämn hörn: jämna färg: mjölkaktigt gulvit transparens: opak (2) 456 014 TF-a vätskekulturmedium tillväxtgrad: kraftig grumlighet: koagel fällning: ingen tillväxtyta: ingen, ingen tillväxt till ett djup av ungefär 5 mm gas: ingen (III) Fysiologiska egenskaper (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (ll) (12) framställning av vätesulfid: + nitratreduktion: - produktion av smörsyra: + produktion av indol: + ureas: - katalas: - stärkelsehydrolys: - förhållande till syre: anaerob produktion av ammoniak: + produktion av koldioxid: + tillväxtområde: pH 5,0-8,5, temperatur 30-45°C produktion av gas från sackarider: L-arabinos (-), D-xylos (-), D-glukos (-), D-mannos (-), D-fruktos (-), D-galaktos (-), maltsocker (-), sackaros (-), trehalos (-), sorbitol (-), mannitol (-), inositol (-), glycerol (-), stärkelse (-).

Förfarandet för framställningen av den karcinostatiska substansen TF-S00 genomföres exempelvis på följande sätt: (J _ Dialkylsulfqxid--> 456 014 Odling av bakterier hörrande till Fusobacterium.nucleatum Filtrering i--3 Överstående vätska .Organismer f ___§ Olösliga beståndsdelar Extrakt (sur) hydrofilt-_-§ organiskt lösnings- medel Fällning Deproteinering och/eller ultrafiltrering - Karcinostatisk substans TF-500 Den ovannämnda produktionsprocessen förklaras nedan.

(I) Odlínå av bakterier Odlingen av bakterier hörande till släktet Fusobacterium genom- föres på konventionellt sätt för odling av anaeroba bakterier.

Det vill säga, ett kulturmedium innehållande en kvävekälla såsom bovin hjärn-hjärt-extrakt, olika peptoner eller liknande; “ en vitaminkälla såsom jästextrakt eiler liknande; ett oorga- niskt salt såsom natriumklorid eller liknande; en kolkälla 456 014 glukos, laktos eller liknande; ett reduceringsmedel såsom L- cystin, natriumsulfit, natriumtioglykolat eller liknande, justeras till pH 5 - 8,5, företrädesvis 6,5-7,5, med en vatten- haltig natriumhydroxidlösning och bakterierna ympas på kultur- mediumet, varefter fast (steady-state) odling eller omrörd odling genomföres under anaeroba betingelser vid 30-45°C, före- trädesvis 32-37°C, i 1-5 dagar, företrädesvis 1-4 dagar. Spe- ciellt är det önskvärt att använda det kulturmedium som be- skrives-i-tabell 1 (nedan benämnd TF-kulturmedium). Emellertid är inte alltid hjärn-hjärt-infusion, som är ett bovin hjärn- hjärt-extrakt nödvändigt som kvävekälla och kan ersättas genom en hjärtinfusion som är ett bovinhjärtextrakt, ett köttextrakt, ett fiskextrakt, majsstöpvätska eller liknande. Bland de olika peptonerna, erfordras inte alltid proteospepton och fytonpep- ton och tryptikaspeptonen kan ersättas med polypepton.

När agar-agar inte användes är det önskvärt att man använder omrörd odling.

Tabell 1 Kulturmediebestånds- delar (g/l) TF-a TF-b TF-c TF-d TF-e TF-f Tryptikaspepton 17 17 17 17 17 17 Fytonpepton 3 3 1,5 - - - Proteospepton 10 5 5 - - - Hjärn-hjärt- infusion 35 17,5 - - - - Hjärtinfusion - - 25 20 10 15 Jästextrakt 3 3 3 3 3 3 Natriumklorid 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 7,5 Glukos _ 6 6 6 12 12 12 Laktos ' _ s s s 1o lo Io L-cystin 0,25 0,5 0,5 - - - Natriumsulfit 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Natriumtioglykolat 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Agar-agar 0 el. O el. 0 el. O el. 0 el. O el. 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 0,7 Dikaliumvâtefosfat - - 2,5 2,5 2,5 2.5 i 456 014 (II) Samling av organismerna från kulturen En överstående vätska avlägsnas från den ovan erhållna kul- turen för att få organismerna. För att avlägsna den överståen- de vätskan kan en konventionell metod såsom exempelvis centri- fugering eller en filtreringsmetod med användning av ett filter- hjälpmedel såsom Celite (varunamn för Johns-Manville, USA) an- vändas. De erhållna organismerna tvättas med fysiologisk salt- lösning och torkas därefter på konventionellt sätt, exempel- vis genom'lyofilisering, eller tvättas med fysiologisk salt- lösning och därefter med ett hydrofilt organiskt lösningsmedel såsom etanol, aceton eller liknande, på kort tid och torkas därefter på konventionellt sätt, såsom lufttorkning eller lik- nande för att få de torkade organismerna. Om så erfordras pulv- riseras de torkade organismerna för att ge det torkade pulv- ret.

(III) Extraktionsförfarande Till de ovan erhållna torkade organismerna sättes en dialkyl- sulfoxid, exempelvis dimetylsulfoxid, dietylsulfoxid eller liknande, företrädesvis dimetylsulfoxid i proportionerna l0- 50 ml per gram torkad organism. Extraktionsbehandlingen genom- föres genom omröring vid rumstemperatur till 80°C i 30 minu- ter till flera dagar, företrädesvis vid ungefär 65°C i 3-5 timmar. Därefter avlägsnas olösliga beståndsdelar på konven- tionellt sätt såsom genom dekantering, centrifugering, filt- rering eller liknande. Till de enligt ovan erhållna extrakten sättes ett hydrofilt organiskt lösningsmedel, exempelvis en keton såsom aceton, dietylketon, metyletylketon eller liknan- de eller en alkohol såsom metanol, etanol, isopropanol eller liknande, i en mängd som är mera än 5 gånger extraktmängden (volym/volym) vid låg temperatur. Företrädesvis tillsättes det hydrofila organiska lösningsmedlet under sura betingelser, exempelvis tillsättes aceton tillsammans med saltsyra och den erhållna blandningen för stå vid ungefär 4°C i flera timmar till flera dagar.

Fällningen avskiljes på konventionellt sätt. Därefter utsättes den så erhållna fällningen för antingen deproteiniseringsbe- : 456 014 handling eller ultrafiltreringsbehandling eller för en kombina- tion av dessa två metoder.

När organismerna tvättas med fysiologisk saltlösning och där- efter torkas genom lyofilisering användes inte deproteinise- ringsbehandling eller ultrafiltreringsbehandling för erhållan- det av en karcinostatisk substans TF-500 eller ett salt därav.

(IV) Deproteinisering, ultrafiltrering och samling av mål- substansen Den ovan erhâllna fällningen utsättes för en deproteiniserings- behandling och efteråt för ultrafiltreringsbehandling eller enbart deproteiniseringsbehandling eller enbart ultrafiltre- ringsbehandling för att ge en karcinostatisk substans TF-500 eller ett salt därav.

För deproteiniseringsbehandlingen användes metoder kända inom tekniken. När deproteiniseringen genomföras genom behandling med ett proteolytiskt enzym upplöses den så erhållna fällningen eller suspenderas i vatten eller en buffertlösning, ett proteo- lytiskt enzym sättes till den erhållna lösningen eller suspen- sionen och enzymbehandlingen genomföres på konventionellt sätt. ' Som proteolytiska enzymer kan pronas, papain, trypsin, kemo- trypsin och liknande användas. Pronas och trypsin föredrages.

Företrädesvis skall, innan eller under enzymbehandlingen, vattenlösningen justeras till och hållas vid pH 7-8. För detta ändamål kan man använda natriumhydroxid, kaliumhydroxid, natrium- karbonat, ammoniumkarbonat, natriumvätekarbonat och liknande.

För att förhindra putrefaktion av reaktionsblandningen under enzymbehandlingen är det önskvärt att man tillsätter en liten mängd av ett organiskt lösningsmedel såsom kloroform, toluen eller liknande. Enzymet användes i allmänhet i en mängd av unge- fär l-4 viktproëent, beräknat på vikten av pulvret (fast) som skall utsättas för enzymbehandlingen.

Den ovannämnda enzymbehandlingen genomföres i allmänhet vid 4556 0'I4 . so-4o°c 1 1-72 timmar, företrädesvis 24-48 timmar. Den kan även genomföras genom att man först tillsätter, exempelvis ungefär l-2 viktprocent av ett enzym till ett pulver (fast) och utsätter pulvret (fast) för enzymbehandling i l-24 timmar och efteråt åter tillsätter ungefär l-2 viktprocent av enzymet för ytterligare enzymbehandling.

Efter den ovannämnda enzymbehandlingen avlägsnas, om så er- fordrasy olösliga beståndsdelar enligt ett förfarande såsom centrifugering, filtrering eller liknande, varefter en karcino- statisk substans TF-500 samlas från den så erhållna vattenlös- liga delen.

Samligen av TF-500 från den vattenlösliga delen kan först genomföras genom åtminstone en av fraktionering,beroende på pH, separat utfällning från ett hydrofilt organiskt lösnings- medel, fraktionering med en jonbytare och liknande, och där- efter ultrafiltrering (behandlingen kan upprepas två gånger).

Föreliggande karcinostatiska substans TF-500 erhålles särskilt genom justering av den ovannämnda vattenlösliga delens pH till företrädesvis inte mer än 2,5 (om så erfordras kan triklorättik- syra tillsättas), avlägsnande av den erhållna fällningen, till- sats till den lösliga delen av ett hydrofilt organiskt lös- ningsmedel såsom etanol så att dess koncentration blir 30-80 %, företrädesvis 60-80 %, beräknat på volymen, samling av den erhållna fällningen vilken utgör fraktionen av målsubstansen, efterföljande behandling, om så erfordras, av denna fällning med ett anjonbytarharts såsom Dowex l-typ (varunamn), Amberlite IRA-400 (varunamn), DEAE-Sephadex (varunamn), DEAE-cellulosa (varunamn) eller liknande (denna behandling kan genomföras flera gånger) för att samla de icke adsorberade fraktionerna och därefter koncentrera och avsalta en vattenlösning av den erhållna fällningen eller de erhållna fraktionerna genom ultrafiltrering (nominell molekylviktsavskärning: 50.000-200.000), genom exempelvis ultrafiltreringsmembran UK-50 (nominell mole- kylviktsavskärning: 50.000), ultrafiltreringsmembran UK-200 (nominell molekylviktsavskärning: 200.000) eller liknande 4556 0'14 (ultrafiltreringsmenmran UK-50 och UK-200, varunamn för ultra- filtreringsmembran från Toyo Roshi Kabushiki Kaisha) och torkning av den koncentrerade och avsaltade produkten. En 0,2%- ig vattenlösning av denna TF-500 (vikt/volym) är transparent.

Såsom angetts ovan kan istället för deproteiniseringsbehand- ling och efterföljande ultrafiltreringsbehandling den ovan förklarade deproteiniseringsbehandlingen eller ultrafiltre- ringsbehandlingen genomföras separat.

Den så erhållna karcinostatiska substansen TF-500 har följan- de egenskaper och kan överföras till ett farmaceutiskt accep- tabelt salt enligt en konventionell metod. Särskilt inne- fattar nämnda farmaceutiska acceptabla salter exempelvis alkalimetallsalter såsom natriumsalter, kaliumsalter och lik- nande och alkaliska jordartsmetallsalter såsom magnesiumsalter, kalciumsalter och liknande.

Egenskaperna hos den karcinostatiska substansen TF-500 är följande: (a) gråvitt-ljusbrunt pulver ' (b) karcinostatisk och immunostimulerande aktivitet (c) vattenlöslig men olöslig i metanol, etanol, aceton,' bensen, kloroform, etylacetat och dietyleter (d) ingen klar smältpunkt och börjar sönderdela vid ungefär l80°C och sönderdelar anmärkningsvärt över 195°C (e) dess infraröda absorptionsspektrum erhållet enligt KBr- metoden har absorptionsband i närheten av 3500-3200, 2920, 2850, 1660-1600, 1580-1520, 1460-1400, 1380-1360, 1120-1100, 1080-1000, 970 och 840-800 om* (f) det ultravioletta absorptionsspektrumet av dess vatten- lösning vid pH 7,0 visar en stark absorption vid absorp- tionskanten och visar en absorptionstopp i närheten av 246-280 nm (g)_ positiv Molish-reaktion, fenol-svavelsyra-reaktion, antron-svavelsyra-reaktion, indol-saltsyra-reaktion och Lowry-Folins-reaktion men negativ vid ninhydrinreaktion *_ 456 014 'io (h) elementaranalysvärden: C 38-47 % H 5-7 % N l-4 % (i) dess sackaridhalt bestämd enligt fenol-svavelsyrametoden är ungefär I2=3O viktprocent uttryckt i glykos och dess proteinhalt bestämd enligt Lowry-Folins metod är ungefär viktprocent eller mindre uttryckt i bovinserumalbumin.

De farmakologiska aktiviteterna hos föreliggande karcinosta- tiska substans TF-500 är följande: (I) Effekten av TF-substansen på cellens livsduglighet (kolo- nibildande analys) Baserat på metoden av Kim. J.H. et al. [Éancer Res. gå, 698 (l965L7, odlades HeLa S-3-celler i Eagle's MEM supplemen- terade med 10 % kalvserum i 3-5 dagar vid 37°C, varefter kulturen avlägsnades och en PBS(-)-lösning (en vattenlösning innehållande 8,0 g/l natriumklorid, 0,2 g/l kaliumklorid, 1,15 g/l dinatriumvätefosfat och 0,2 g/l kaliumdivätefosfat) innehållande 0,01 viktprocent etylendiamintetraättiksyra och 0,1 viktprocent trypsin tillsattes genom pipettering till det erhållna cellskiktet till bildning av en suspension.

Den så erhållna cellsuspensionen späddes med Eag1e's MEM- supplementerat med 20%-igt kalvserum så att den innehöll 300 celler per ml. 1 ml av denna cellsuspension odlades vid 37°C i 24 timmar i en C02-inkubator och till den erhållna kulturen sattes därefter den karcinostatiska substansen TF- SOO erhâllen enligt nedan angivna exempel 1, så att koncentra- tionen blev 250, 500 och lOO0,ng/ml. Två försök genomfördes, i det ena tillsattes serum (20 %; volym/volym) till kulturen .och i det andra tillsattes inget serum. Efter behandling i 24 timmàr“tvättades cellerna med den serumfria kulturen och- till cellerna sattes därefter kulturen till vilken 20 % kalv- serum tillsatts, varefter cellerna odlades i 6 dagar i en C02- inkubator. Efter odlingen fixerades cellerna med etanol och fläckades med en Giemsa-färgningslösning och de erhållna kolonierna beräknades för bestämning av cellernas livskraft. 456 014 ll De erhållna resultaten visas i tabell 2, vari cellernas livs- kraft bestämdes enligt följande ekvation: antalet kolonier i den behandlade cellivskraft (%) = gruppen X 100 antalet kolonier i den obehandlade gruppen Tabell 2 Koncentration av Cellivskraft (%) karcinostatisk serumfritt kultur- serumtillsatt kultur- substans Ung/ml) medium medium 0 100 100 250 103,8 103,2 500 100,2 98,5 1000 55,2 97,1 (II) Immunostimulerande aktivitet Tre möss av ICR-stammen (honkön, 6 veckor gamla) användes för varje grupp. 5 pg, 50 /ug och 500 /ug/kg av testsubstansen administrerades intraperitonealt till mössen. 24 timmar efter administrationen injicerades intravenöst 0,2 ml av en kol- suspension framställd genom blandning av l ml "Perikan Drawing Ink 17 Black" (tillverkat_av Günther-Wagner Co., Ltd) och 2 ml fysiologisk saltlösning innehållande 3 viktprocent gela- tin, i mussvansen och 1, 5, 10 och 15 minuter efter injektio- nen samlades 0,02 ml blod från ögonhålan med användning av ett hematokritkapillär belagt med heparin och utspäddes omedel- bart och hemolyserades med 1,6 ml av en 0,l%-ig, beräknat på vikten, vattenhaltig natriumkarbonatlösning. Denna suspen- sion utsattes för kolorimetri vid 675 nm och det fagocyto- _ tiska indexet, nämligen K-värdet, bestämdes enligt ekva- tionen av Halpern et al.

Till mössen i kontrollgruppen administrerades 0,2 ml av en fysiologisk saltlösning. '456 014 12 log CO - log C K: t ~ to vari CO = koncentrationen av kol i blodet vid tiden to och C = koncentrationen av kol i blodet vid tiden t.

Resultaten framgår av tabell 3.

.- Tabell 3 Dos (ug/kg) Medel-K-värde s o,o418 i o,oo89 so o,o56o i o,oo16 Soo ' o,os61 i 0,027 Kontroll 0,0276 1 0,002O Anm.: * Den karcinostatiska substansen erhâllen i exempel l användes.

(III) Antitumöraktivitet mot Sarcoma-l80-celler Sarcomà 180-celler transplanterades subkutant till möss av ICRrstammen (honkön, 6 veckor gamla) i armhâlan i en mängd av l x 107 celler pe; mus¿ Därefter upplöstes var och en av testsubstanserna i en 5%-ig vattenhaltig glukoslösning och 0,2 ml av var och en av de erhållna lösningarna administrera- des intravenöst till mössen en gång om dagen l0:e och 12:e dagen efter transplanteringen av karcinom-cellerna. Till kon- trollgruppen administrerades 0,2 ml av en 5%-ig vattenhaltig glukoslösning på samma sätt som ovan. Resultaten visas i tâbêll z 4 æ- 456 014 13 Tabell 4 Dos Medeltumörvikt Hemorragisk nekros T/C *3 (mg/kg) I S.E. (g) av tumor (dag 14) (%) (dag 14) o,s *1 3,4 i 0,7 s/s 53 1,0 *l 3,6 i 0,7 4/5 56 0,5 *2 4,1 I 2,4 3/5 63 1,0 *2 - -s,o i 1,9 a/s 79 Kontroll 6,4 :_2,7 0/5 100 ANM.: *l den karcinostatiska substansen erhâllen i exempel 1 användes *2 den karcinostatiska substansen erhållen i exempel 2 användes medeltumörvikt hos mus i den substans- *3 T/C (%) = administrerade gruppen medeltumörvikt hos mus i kontroll- gruppen x 100 (IV) Akut toxicitet LDSO-värdet för mus (ICR-stam, honkön, 6 veckor gamla, intra- venös administration) av TF-500 är mer än 10 mg/kg.

Såsom framgår av de ovannämnda farmakologiska försöken är TF-500-substansen enligt föreliggande uppfinning användbar som karcinostatiskt medel och kan förväntas ha aktivitet mot olika cancersjukdomar.

TF-500-substansen eller dess farmaceutiskt acceptabla salt enligt föreliggande uppfinning kan användas efter att ha beretts till olika farmaceutiska former såsom orala läkemedel, injektionslösningar, suppositorier eller liknande.

När de användes som orala läkemedel kan de orala läkemedlen innehålla olika excipienter och kan formas till kapslar, tab- letter, pulver eller granuler. När de användes som injek- tionspreparat kan injektionerna vara subkutanta injektioner, 456 014 '14 intramuskulära injektioner och intravenösa injektioner och an- vändes i form av en suspension, en lösning eller ett pulver som upplöses i fysiologisk saltlösning eller lösningen inne- håller en glukos eller ett lokalt anestetikum när det användes.

Dosen av TF-500-substansen eller dess farmaceutiskt acceptabla salt enligt föreliggande uppfinning utväljes korrekt beroende på patientens tillstånd, fastän det i allmänhet är önskvärt att administrera denna i en dos för vuxna av 0,001 till 0,1 mg/ kg en gång'om dagen eller flera gånger per dag och beroende pâ administrationsmetod administreras de företrädesvis genom oral, subkutan, intramuskulär eller intravenös injektion eller genom injektion i den påverkade delen.

Föreliggande uppfinning förklaras ytterligare i detalj nedan med hänvisning till exempel, preparationsexempel och de bifoga- de ritningarna, i vilka ritningar figur 1 visar ett mikrosko- piskt foto som visar formen av Fusobacterium nucleatum TF-031 som användes enligt föreliggande uppfinning; figur 2 visar ett infrarött absorptionsspektrum av TF-500 erhållen enligt nedan- stående exempel 1; figur 3 visar ett ultraviolett absorptions- spektrum av nämnda substans; figur 4 visar ett infrarött ab- sorptionsspektrum av TF-500 erhâllen enligt nedanstående exem- pel 2; figur 5 visar ett ultraviolett absorptionsspektrum av nämnda substans; figur 6 visar ett infrarött absorptionsspektrum av TF-500 erhållen enligt nedanstående exempel 3; figur 7 visar ett ultraviolett absorptionsspektrum av nämnda substans; figur 8 visar ett infrarött absorptionsspektrum av TF-500 erhållen enligt nedanstående exempel 4; och figur 9 visar ett ultravio- lett absorptionsspektrum av nämnda substans.

Exempel l _ (1) I en 90-liter burkfermentor (MSJ-U-typ, tillverkad av Marubishi Rika Kenkyusho) placerades 70 liter av ett TF-f- kulturmedium innehållande 1.190 g tryptikaspepton, 1.050 g hjärtinfusion, 210 g jâstextrakt, 525 g natriumklorid, 840 g glukos, 700 g laktos, 7 g natriumsulfit, 35 g natriumtioglyko~ lat och 175 g dikaliumvätefosfat och kulturemediumet justera- des till pH 7,5 med 4N vattenhaltig natriumhydroxidlösning. 4!56 0'l4 Kulturmediumet steriliserades i 15 minuter vid ll8°C. Efter kylning av kulturmediumet passerades kvävgas genom detta med en hastighet av 250 ml/min. i en timme. I detta kulturmedium inokulerades ungefär 900 ml av en förodlad lösning av Fuso- bacterium nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647) tidigare framställd genom odling därav i ett TF-f-kulturmedium av sam- ma sammansättning som ovan. Cellerna odlades i fyra dagar vid 33°C under omröring (90 varv/min.) under det att kväv- gas infördes med en hastighet av 250 ml/min. (2) En 12-liters portion av den så erhållna kulturen centri- fugerades (4 x 103 varv/minut, lO minuter) för att samla orga- nismerna och organismerna tvättades med l liter fysiologisk saltlösning och avfettades därefter och tvättades med 1 liter etanol och 1 liter aceton i denna ordningsföljd och torkades därefter och gav 14,2 g av organismerna. Organismerna suspen- derades i 300 ml dimetylsulfoxid och extraherades under om- röring i 4 timmar under det att suspensionen upphettades till 65°C. Därefter filtrerades suspensionen genom sugfiltrering för att ge ett filtrat. Till detta filtrat sattes 2 liter ace- ton och 8 ml koncentrerad saltsyra och den erhållna bland- ningen“fick därefter stå i 2 dagar för att sedimentera och åldra den erhållna fällningen. Denna fällning samlades genom centrifugering (4 x 103 varv/min., 10 min.) (748 mg). (3) 748 mg av den så erhållna fällningen upplöstes i 15 ml vatten och den erhållna läsningen justerades till pH 7,8-8,0 med ammoniumkarbonat. Till denna lösning sattes två 7,5 mg- portioner Pronas E (varunamn från Kaken Kagaku; 1.000.000 tyrosinenheter/9) i 30 minuters-intervall och flera droppar toluen;tillsattes därefter, varefter den erhållna blandningen utsattes för enzymbenanaling vid 37°c i 24 timmar. Tin den så behandlade blandningen sattes saltsyra för att justera pH till 1 och etanol tillsattes därefter så att etanolkoncentra- tionen blev 80 volymprocent. Den erhållna blandningen centri- fugerades (4 x 103 varv/min., 10 min.) och den erhållna fällningen samlades (288,6 mg). 456 014 '16 (4) 288,6 mg av den så erhållna fällningen upplöstes i 50 ml vatten och den erhållna lösningen koncentrerades till 5 ml genom ultrafiltrering med användning av "Ultrafiltration Mem- brane UK-50" och 45 ml vatten sattes till den så erhållna koncentrerade lösningen varefter den så utspädda lösningen åter koncentrerades till 5 ml genom ultrafiltrering med an- vändning av "Ultrafiltration Membrane UK-50". Denna koncen- trerade lösning filtrerades genom ett "Millipore Filter" (varunamn'för ett membranfilter från Japan Millipore Limited) med en pordiameter av 0,2 pm och frystorkades därefter och gav 264 mg av den frystorkade karcinostatiska substansen TF- 500.

Den så erhållna karcinostatiska substansen TF-500 hade de nedan angivna egenskaperna och det infraröda absorptions- spektrumet som framgår av figur 2 och det ultravioletta absorptionsspektrumet som framgår av figur 3.

Exempel 2 (l) Från 70 liter av kulturen erhållen i exempel l-(l) samla- des organismer genom filtrering genom “Hyflo Super Cel" (varu- namn för Johns-Manville, USA) och den erhållna blandningen av organismer med "Hyflo Super Cel” tvättades med 20 liter fysiologisk saltlösning och avfettades därefter och tvättades med 3 liter etanol och 3 liter aceton i denna ordningsföljd och gav 3,2 kg torkad blandning. 320 g av denna blandning suspenderades i 400 ml dimetylsulfoxid och den erhållna suspen- sionen extraherades under omröring i 4 timmar under det att den upphettades till 65°C. Därefter filtrerades suspensionen genom sugfiltrering för att samla ett filtrat och 2,5 liter aceton och lO ml koncentrerad saltsyra tillsattes, varefter den erhållna blandningen fick stå vid 4°C i 2 dagar för att' sedimentera och âldra fällningen. Fällningen samlades genom centrifugering (4 x 103 varv/min., lO min.) (94 mg). (2) I 50 ml vatten upplöstes 94 mg av den så erhållna fäll- ningen och den erhållna lösningen koncentrerades till 5 ml genom ultrafiltrering med användning av "Ultrafiltration Mem- 456 014 ' 17. brane UK-50" och 45 ml vatten tillsattes till den så erhållna koncentrerade lösningen, varefter den så utspädda lösningen åter koncentrerades till 5 ml genom ultrafiltrering med användning av-"Ultrafiltration Membrane UK-50".

Den.så koncentrerade lösningen filtrerades genom ett “Millipore"- filter med en pordiameter av 0,2 mm och frystorkades därefter och gav 62,6 mg av den frystorkade karcinostatiska substansen TF-soo.' ' Den så erhållna karcinostatiska substansen TF-500 hade de nedan angivna egenskaperna och det infraröda absorptionsspektrumet som framgår av figur 4 och det ultravioletta absorptions- spektrumet som framgår av figur 5.

Exempel 3 (1) En 7,2-liters portion av den i exempel l-(l) erhållna kulturen centrifugerades (5 x 103 varv/min., lO min) för att samla organismerna som frystorkades. 3,5 g av de så frys- torkade organismerna suspenderades i 100 ml fysiologisk salt- lösning och den erhållna suspensionen justerades till pH 8,0 med 2N vattenhaltig natriumhydroxidlösning, omrördes i 3_tim- mar, fick därefter stå i 24 timmar och_centrifugerades där- efter (5 x 103 varv/min., 10 min.) för att avlägsna den över- stående vätskan. Till den erhållna fällningen sattes 100 ml fysiologisk saltlösning och den erhållna blandningen justera- des till pH 8,0 med 2N vattenhaltig natriumhydroxidlösning.

Blandningen omrördes i 2 timmar och centrifugerades därefter (5 x 103 varv/min., 10 min.) för att avlägsna överstående vät- ska. Därefter tvättades den erhållna fällningen med tre 50 ml- portiongr.etanol, en 50-ml portion aceton och en 50 ml-por- tion dietyleter i denna ordningsšöljd (tvättvätskorna avlägsna- des genom centrifugering (5 x 10 varv/min., lO min.)) och torkades därefter för att ge torkad organism. Organismerna pulvriserades till ett pulver. Till pulvret sattes 70 ml di- metylsulfoxid och den erhållna blandningen extraherades under omröring vid 63-65°C i 4 timmar och sugfiltrerades därefter för att samla ett filtrat. Till detta filtrat sattes 536 ml 456 014 18 aceton och l ml koncentrerad saltsyra och den erhållna bland- ningen fick stå vid 4°C i 24 timmar för sedimentering och aiaring av fällningen. Fällningen samlades genom centrifuge- ring (5 x 103 varv/min., 10 min.) (269 mg). (2) Till 269 mg av den så erhållna fällningen sattes 2,7 ml vatten och den erhållna blandningen justerades till pH 8,0 med lN vattenhaltig natriumhydroxidlösning, varefter vatten tillsattes för att justera slutvolymen till 4 ml. Till blandningen sattes 2,7 mg Pronase E (l.O00.000 tyrosinenheter/ g) och den erhållna blandningen enzymbehandlades vid 37°C i en timme. Ytterligare 2,7 mg Pronase E och flera droppar toluen tillsattes och den erhållna blandningen enzymbehandla- des vid 37°C i 24 timmar. Olösliga substanser avlägsnades från den så behandlade blandningen genom centrifugering (5 x 103 varv/min., 10 min.) och till den erhållna lösningen .sattes 2N saltsyra för att justera dess pH till l,O, var- efter etanol tillsattes så att etanolkoncentrationen blev 80 volymprocent. Den så erhållna fällningen samlades genom centrifugering (5 x 103 varv/min., lO min.) (78,5 mg). (3) Till 78,5 mg av den så erhållna fällningen sattes 20 ml vatten och den erhållna blandningen justerades till pH 7 med lN vattenhaltig natriumhydroxidlösning. Därefter koncentrera- des den erhållna blandningen till 5 ml genom ultrafiltrering med användning av "Ultrafiltration Membrane UK-50" och 45 ml vatten sattes till den så erhållna koncentrerade lösningen varefter den så utspädda lösningen åter koncentrerades till ml genom ultrafiltrering med användning av "Ultrafiltra- tion Membrane UK-50". Till den så erhållna koncentrerade lösningen sattes 45 ml vatten och den så utspädda lösningen koncenårerades till 5 ml genom ultrafiltrering med användning av "Ultrafiltration Membrane UK-50". Detta koncentrat filt- rerades genom ett membranfilter med en pordiameter av O,2,um (Toyo Roshi Kabushiki Kaisha TM-4) och frystorkades därefter och gav 65 mg frystorkad karcinostatisk substans TF-500. 456 014 '19 Den så erhållna karcinostatiska substansen TF-500 hade de ovannämnda egenskaperna och det infraröda absorptionsspektrumet som framgår av figur 6 och det ultravioletta absorptions- spektrumet som framgår av figur 7.

Exemgel 4 (1) En 10-liters portion av kulturen erhållen i exempel 1-(l) centrifugerades (5 x 103 varv/min., 10 min.) för att samla organismerna. Till organismerna sattes 500 ml fysiologisk saltlösning och den erhållna blandningen omrördes i 30 minuter och centrifugerades därefter (5 x 103 varv/min., 10 min.) för att samla fällningen. Detta förfarande upprepades tvâ gånger. Till den så erhållna fällningen sattes 500 ml fysiolo- gisk saltlösning och den erhållna blandningen omrördes i 30 minuter, justerades därefter till pH 8,0 med lN vattenhaltig natriumhydroxidlösning och omrördes därefter i 30 minuter.

Därefter centrifugerades blandningen (5 x 103 varv/min., 10 min.) och avfettades och tvättades med 500 ml fysiologisk salt- lösning. Därefter centrifugerades blandningen (5 x 103 varv/ min., 10 min.) för att ge fällningen. Den erhållna fällningen tvättades med en 500 ml~portion fysiologisk saltlösning, en 300 mleportion etanol och en 300 ml-portion aceton i denna ordningsföljd (tvättvätskorna avlägsnades genom centrifugë- ring (5) x 103 varv/min., 10 min.) och torkades därefter och gav torkade organismer. De så erhållna organismerna pulvrisera- des till ett pulver. Till detta pulver sattes 160 ml dimetyl- sulfoxid och den erhållna blandningen utsattes därefter för extraktion under omröring vid 63-65°C i 4 timmar. Därefter filtrerades blandningen genom sugfiltrering för att ge ett filtrat och till filtratet sattes l,2 liter aceton och 4,2 ml koncentrerad saltsyra, varefter den erhållna blandningen fick stå vid34°b i 24 timmar för att sedimentera och âldra fäll-' ningen. Denna fällning centrifugerades (5 x 103 varv/min., min.) för att samla fällningen (246 mg). (2) Till 246 mg av den så erhållna fällningen sattes 5 ml vatten och den erhållna blandningen justerades till pH 7,8 med lN vattenhaltig natriumhydroxidlösning. Till blandningen sattes 456 .014 '2o mg Pronase E (l.000.000 tyrosinenheter/9) och blandningen utsattes för enzymbehandling vid 37°C i 30 minuter, varefter lN vattenhaltig natriumhydroxidlösning sattes till bland- ningen för att justera pH till 7,8, varefter 5 mg Pronase E och flera droppar toluen åter tillsattes. Den erhållna bland- ningen utsattes för enzymbehandling vid 37°C i 24 timmar.

Till den behandlade blandningen sattes lN saltsyra för att justera pH till 1,0 och den erhållna blandningen fick stå i 2 timmar och centrifugerades därefter (5 x 103 varv/min., lO min.) för att ge överstående vätska. Till den så erhållna över- stående vätskan sattes etanol så att etanolkoncentrationen blev 80 volymprocent. Den erhållna blandningen fick stå i 2 timmar och centrifugerades (5 x 103 varv/min., 10 min.) för att samla den sedimenterade fällningen (98 mg). (3) Till 98 mg av den så erhållna fällningen sattes 20 ml vatten och den erhållna blandningen justerades till pH 7 med lN vattenhaltig natriumhydroxidlösning. Därefter koncen- trerades den erhållna blandningen till 5 ml genom centrifuge- ring med användning av "Ultrafiltration Membrane UK-50" och 45 ml vatten sattes till den så erhållna koncentrerade lös- ningen, varefter den så utspädda lösningen åter koncentrera- des till 5 ml genom ultrafiltrering med användning av "Ultra- filtration Membrane UK-50". Till den så erhållna koncentrera- de lösningen sattes 45 ml vatten och den så utspädda lösningen koncentrerades till 5 ml genom ultrafiltrering med användning av “Ultrafiltration Membrane UK-50". Det så erhållna koncentra- tet filtrerades genom ett membranfilter med en pordiameter av 0,2 pm1(Toyo Roshi KK TM-4) och frystorkades därefter och gav 83 mg av den frystorkade karcinostatiska substansen TF-S00.

Den så erhållna karcinostatiska substansen TF-500 hade de ovannämnda egenskaperna och hade det infraröda absorptions- spektrumet som framgår av figur 8 och det ultravioletta absorptionsspektrumet som framgår av figur 9. 456 014 '21 Preparationsexempel l En vattenlösning med ett pH av 7,0-7,5 innehållande den karcinostatiska substansen TF-500 erhållen i exempel l satsa- des i en flaska och frystorkades och gav ett frystorkat kar- cinostatiskt substans TF-500-preparat med en 0,5 eller 1 mg- enhet. Denna upplöses, vid användning, i steril fysiologisk saltlösning, en 0,5%-ig lidokainlösning, en 0,5%-ig vatten- haltig glukoslösning eller liknande och den erhållna lösningen användes som injektionspreparat.

Preparationsexempel 2 En vattenlösning med ett pH av 7,0~7,5 innehållande den kar- cinostatiska substansen TF-500 erhâllen i exempel 2 satsades i en flaska och frystorkades och gav ett frystorkat karcino- statiskt substans TF-500-preparat med en 0,5 eller l mg-enhet.

Denna upplöses, vid användning, i steril fysiologisk salt- lösning, en 0,5%-ig lidokainlösning, en O,5%-ig vattenhaltig glukoslösning eller liknande och den erhållna lösningen an- vändes som injektionspreparat.

Preparationsexempel 3 En vattenlösning med ett pH av 7,0-7,5, innehållande den karcinostatiska substansen TF-SOO erhållen i exempel 3 satsa- des i en flaska och frystorkades och gav ett frystorkat kar- cinostatiskt substans TF-560-preparat med en 0,5 eller l mg- enhet. Denna upplöses vid användning i steril fysiologisk saltlösning, en O,5%-ig lidokainlösning, en 0,5%-ig vatten- haltig glukoslösning eller liknande och den erhållna lösningen användes som injektionspreparat.

Preparationsexempel 4 En vattenlösning med ett pH av 7,0-7,5, innehållande den kar- cinostatiska substansen TF-500 erhållen i exempel 4 satsades i en flaska och frystorkades och gav ett frystorkat karcino- statiskt substans TF-S00-preparat med en 0,5 eller l mg-enhet.

Denna upplöses vid användning i steril fysiologisk saltlösning, en O,5%-ig lidokainlösning, en O,5%-ig vattenhaltig glukos- lösning eller liknande och den erhållna lösningen användes som injêkt iOnprQparat _

Claims (11)

456 Û14 'QÅ PATENTKRAV

1. Ett förfarande för framställning av en karcinostatisk substans TF-500 med följande egenskaper eller ett salt därav, k ä n n e t e c k n a t därav, att man utsätter organismer hörande till Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 31647) för extraktionsbehandling med en dialkylsulfoxid och samlar nämnda substans från extraktet: (a) (b) (C) gråyitt-ljusbrunt pulver karcinostatisk och immunostimulerande aktivitet vattenlöslig men olöslig i metanol, etanol, aceton, ben- sen, kloroform, etylacetat och dietyleter (d) ingen klar smältpunkt och börjar sönderdela vid ungefär 1so°c och sönderaelar märkbart över 19s°c (e) det infraröda absorptionsspektrumet erhållet enligt KBr- metoden har absorptionsband i närheten av 3500-3200, 2920, 2850, 1660-1600, 1580-1520, 1460-1400, 1380-1360, ll20- 1100, 1080-1000, 970 och 840-800 cm'l (f) det ultravioletta absorptionsspektrumet av dess vatten- lösning vid ett pH av 7,0 visar en kraftig absorption vid absorptionskanten och visar en absorptionstopp i närheten av 246-280 nm (g) positiv i Molisch-reaktion, fenol-svavelsyra-reaktion1 antron-svavelsyra-reaktion, indol-saltsyra-reaktion och Lowry-Folins-reaktion men negativ i ninhydrin-reaktion (h) elementaranalysvärden: C 38-47 % H 5-7 % N l-4 % (i) sackaridhalten bestämd enligt fenol-svavelsyra-metoden är ungefär 12-30 viktprocent, uttryckt i glukos och dess proteinhalt bestämd enlit Lowry-Folins metod är ungefär 10 viktprocent eller mindre uttryckt i bovinserumalbumin. 3 u.

2. 12. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t tdärav, att organismer hörande till Fusobacteríum nucleatum TF-; 031 (FERM 5077: ATCC 31647) extraktionsbehandlas med en dialkyl- sulfoxid, ett hydrofilt organiskt lösningsmedel sättes till det . í I I I erhållna extraktet, den så erhållna fällningeñ deproteiníserasë och ultrafiltreras därefter. 456 014 23

3. Förfarande enligt patentkravet 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att dialkylsulfoxiden är dimetylsulfoxid.

4. Förfarande enligt patentkravet 2 eller 3, k ä n n e t e c k- n a t därav, att det hydrofila organiska lösningsmedlet är aceton.

5. Förfarande enligt något av patentkraven 2-4, k ä n n e - t e c k n a t därav, att deproteiniseringsbehandlingen är en enzymbehandling med ett proteolytiskt enzym.

6. Förfarande enligt patentkravet 5, k ä n n e t e c k n a t därav, att det proteolytiska enzymet är ett pronas.

7. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att organismer hörande till Fusobacterium nucleatum TF- 031 (FEBM 5077; ATCC 31647) extraktionsbehandlas med en dialkyl- sulfoxid, ett hydrofilt organiskt lösningsmedel sättes till det. erhållna extraktet och den så erhållna fällningen ultrafiltreras.

8. Förfarande enligt patentkravet 7, k ä n n e t e c k n a t därav, att dialkylsulfoxiden är dimetylsulfoxid. _

9. Förfarande enligt patentkravet 7 eller 8, k ä n n e t e c k- n a t därav, att det hydrofila organiska lösningsmedlet är aceton.

10. l0. Förfarande enligt något av patentkraven 2-9, k ä n n e - t e c k n a t därav, att ultrafiltreringsbehandlingen genom- föres med ett ultrafilter med en nominal molekylviktsavskär- ning ag 50.000 till 200.000.

11. ll. Förfarande enligt patentkravet l, k ä n n e t e c k n a t därav, att organismerna hörande till Fusobacterium nucleatum TF*03l (FERM 5077: ÅTCC 31647) extraktionsbehandlas med en dialkylsulfoxid; ett hydrofilt organiskt lösningsmedel till- sättes under sura betingelser till det erhållna extraktet i en mängd mer än 5 gånger extraktets mängd (volym/volym); att 456 014 314. den bildade fällníngen deproteiniseras med ett pronas; en alko- hol sättes till den behandlade vätskan så att alkoholkoncen- trationen blir 30-80 volymprocent; den bildade fällningën samlas och utsättes för ultrafiltrering och filtreras där- efter genom ett membranfilter; och att därefter filtratet frystorkas och ger den karcinostatiska substansen. h: r