NO159452B - Fremgangsmaate for fremstilling av en carcinostatisk substans. - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved fremstilling av en carcinostatisk substans TF-500 med de følgende egenskaper:

(a) Gråaktig, lysebrunt pulver,

(b) Carcinostatisk og immunostimulerende aktivitet,

(c) Løselighet i vann, men uløselig i metanol, etanol, aceton,

benzen, kloroform, etylacetat og dietyleter,

(d) Ikke noe klart smeltepunkt, og begynner og spaltes ved

ca. 180°C og spaltes tydelig over 195°C,

(e) Infrarødt absorpsjonsspektrum erholdt ved KRr-metoden

med absorpsjonsbånd ved 3500-3200, 2920, 2850, 1660-1600, 1580-1520, 1460-1400, 1380-1360, 1120-1100, 1080-1000, 970 og 840-800 cm-<1>,

(f) Ultrafiolett absorpsjonsspektrum i vandig løsning med en

pH på 7,0 med en sterk absorpsjon ved absorpsjonskanten,

og en absorpsjonstopp ved 24 6-280 nm,

(g) Positiv i Molisch-reaksjon, fenolsvovelsyre-reaksjon,

antronsvovelsyre-reaksjon, indol-saltsyre-reaksjon og Lowry-Folin's reaksjon, men negativ i ninhydrin-reaksjon, (h) Elementæranalyse-verdier C: 38-47 %, H: 5-7 %, N :1-4 %,

(i) Sakkaridinnhold bestemt ved en fenolsvovelsyre-metode på ca. 12-30 vekt% uttrykt som glukose, og protein-innhold ved Lowry-Folin's metoden på ca. 10 vekt% eller mindre uttrykt som bovinserumalubmin, eller salt derav, karakterisert ved

(A) å ekstrahere anaerobt dyrkede mikroorganismestammer av Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077, ATCC 31647)

med et di-lavere alkylsulfoksyd, tilsette et hydrofilt organisk løsningsmiddel til det resulterende ekstrakt, ultrafiltrere den oppnådde felling og samle substansen, eller

(B) ekstrahere anaerobt dyrkede mikroorganismestammer av Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077, ATCC 31647)

med et di-lavere alkylsulfoksyd, tilsette et hydrofilt organisk løsningsmiddel til det resul-

terende ekstrakt, underkaste den oppnådde felling en deprotein-

iseringsbehandling, ultrafiltrere den oppnådde felling og oppsamle den oppnådde substans, eller

(C) Anaerobt dyrkede mikroorganismestammer av Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077, ATCC 31647) organismene ekstraheres

med et di-lavere alkylsulfoksyd; et hydrofilt organisk løsnings-middel tilsettes under sure betingelser til det resulterende ekstrakt i en større mengde enn 5 ganger ekstraktets (volum/- volum);

den dannende felling underkastes deproteiniseringsbehandling med en pronase;

den vannløselige del med pH 2,5 eller lavere tilsettes en alkohol, slik at alkoholkonsentrasjonen blir 30 til 60 volum-prosent ;

den dannende felling oppsamles og ultrafiltreres og membran-filtreres deretter; og deretter

frysetørkes filtratet og gir den carcinostatiske substans.

I de senere år har det som et middel for pasienter med forskjellige typer kreft, i stor utstrekning vært anvendt metoder som omfatter en forsterkning av den immunologiske funksjon hos pasienten slik at man oppnår en carcinostatisk virkning ved hjelp av den immunologiske funksjon.

Foreliggende oppfinnere fant tidligere en substans med en carcinostatisk og immunostimulerende virkning fra en kultur eller dens supernatant fra bakteriestammen Fusobacterium nucleatum TF-031 (ATCC 31647) (se norsk patentsøknad nr.

80.2499 og 82.0509.)

Oppfinnerne har undersøkt den famakologiske virkning av komponenter som oppnås ved ekstraksjonsbehandling med et dialkylsulfoksyd av organismer som hører til slekten Fusobacterium isolert fra munnhulen, og har funnet at en spesifikk komponent som oppnås fra ekstraktet, har en carcinostatisk aktivitet; at nevnte komponent har en indirekte carcinostatisk aktivitet ved økning av den pasient-utviklede antitumoraktivitet eller pasientens immunitet og utnyttelse av denne immunitet; og at nevnte komponent har meget lav toksisitet, og har undersøkt fremgangsmåter for fremstilling av denne komponent og kommet frem til foreliggende oppfinnelse.

Et formål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en ny fremgangsmåte som omfatter at organismer som hører til slekten Fusobacterium underkastes en ekstraksjonsbehandling med et dialkylsulfoksyd, og fra den resulterende ekstrakt oppnås en carcinostatisk substans.

Andre formål med oppfinnelsen vil fremgå av beskrivelsen. Som organismer som anvendes ifølge oppfinnelsen, kan man anvende en hvilken som helst TF-500 substans-givende bakterie som hører til slekten Fusobacterium, og f.eks. anvendes fortrinnsvis de som hører til Fusobacterium nucleatum. Spesielt anvendes Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077; ATCC 3164 7) og stammer som ansees å ha tilsvarende egenskaper som kjent fra mikro-biologien, nemlig spontane mutanter og kunstig modifiserte stammer.

De bakteriologiske egenskaper for Fusobacterium

nucleatum TF-031 er som følger:

(I) Form

(1) Cellenes form: spindelformede (figur 1)

(2) Polymorfi hos cellene: fraværende

(3) Bevegelighet: fraværende

(4) Sporer: fraværende

(5) Gram-farving: Gram-negativ

(6) Syreresistens: negativ

(II) Vekstbetingelser i et kulturmedium

(1) TF-a agarplate og skråkulturmedium

Ytre form: rund form

Størrelse: ca. 1 mm

Utvekster: halvkuleform

Struktur: duggdråpelignende

Overflate: glatt

Kanter: glatte

Farve: melkeaktig, gulaktig hvit

Gjennomsiktighet: opak

(2) TF-a væskekulturmedium

Vekstgrad: kraftig

Uklarhet: koagel

Bunnfall: intet

Overflatevekst: ingen, ingen vekst til en dybde på ca. 5 mm Gass: ingen

(III) Fysiologiske egenskaper

(1) Dannelse av hydrogensulfid: +

(2) Reduksjon av nitrater: -

(3) Dannelse av smørsyre: +

(4) Dannelse av indol: +

(5) Urease: -

(6) Katalase: -

(7) Hydrolyse av stivelse: -

(8) Oppførsel overfor oksygen: anaerob

(9) Dannelse av ammoniakk: +

(10) Dannelse av karbondioksyd: +

(11) Vekstområde: pH 5,0-8,5, temperatur 30-45°C. - (12) Dannelse av gass fra sakkarider: L-arabinose (-), D-xylose (-), D-glukose (-), D-mannose (-), D-fruktose (-), D-galaktose (-), malt sukker (-), sukrose (-), trehalose (-), sorbitol (-), mannitol (-), inositol (-), glycerol (-), stivelse (-).

Fremgangsmåten for fremstilling av den carcinostatiske substans TF-500 utføres f.eks. på følgende måte:

Den ovenfor angitte fremgangsmåte er forklart nedenfor.

(I) Dyrkning av bakterier

Dyrkningen av bakterier som hører til slekten Fusobacterium, utføres på vanlig måte for dyrkning av anaerobe bakterier. Det betyr at et kulturmedium som inneholder en nitrogenkilde så som storfehjerne-hjerte-ekstrakter, forskjellige peptoner eller lignende; en vitaminkilde så som gjærekstrakt eller lignende;

et uorganisk salt så som natriumklorid eller lignende; en karbon-kilde så som glukose, laktose eller lignende; et reduksjons-middel så som L-cystin, natriumsulfitt, natriumtioglykolat

eller lignende, reguleres til pH 5 til 8,5, fortrinnsvis 6,5 til 7,5, med en vandig natriumhydroksydoppløsning, og bakteriene innpodes i kulturmediet, hvorefter en dyrkning i ro eller under omrøring foretas under anaerobe betingelser ved 30 til 4 5°C, fortrinnsvis 32 til 37°C, i 1 til 5 dager, fortrinnsvis 1 til 4 dager. Spesielt er det ønskelig å anvende kulturmediet beskrevet i tabell 1 (i det følgende betegnet som TF kultur-mediet). Hjerne-hjerte-infusjonen som er en storfe-hjerne-hjerte-ekstrakt er ikke alltid nødvendig som nitrogenkilde og kan erstattes med en hjerteinfusjon som er en storfe-hjerte-ekstrakt, en kjøttekstrakt, en fiskeekstrakt, en maisstøpevæske eller lignende. Blant de forskjellige peptoner er proteose-pepton og fyton-pepton ikke alltid nødvendig, og tryptikase-pepton kan erstattes -med poly-pepton.

Når agar ikke anvendes, er det ønskelig å benytte en

kultur under omrøring.

(II) Oppsamling av organismene fra kulturen

En væske på toppen fjernes fra kulturen oppnådd ovenfor

for å få organismene. For fjernelse av væsken på toppen kan man anvende en vanlig metode, f.eks. sentrifugering eller en filtreringsmetode hvor det anvendes et filtreringshjelpemiddel 6å Bom "Celite". De oppnådde organismer vaskes med fysiologisk saltvann og tørres derefter på vanlig måte, f.eks. ved lyofilisering eller vaskes med fysiologisk saltoppløsning og derefter med et hydrofilt, organisk oppløsningsmiddel så som etanol, aceton eller lignende, i kort tid, og tørres derefter på vanlig måte, så som

lufttørking eller lignende, for å oppnå de tørkede organismer. Hvis nødvendig pulveriseres de tørkede organismer for å oppnå det tørkede pulver.

(III) Ekstraksjonsprosess

Til de ovenfor oppnådde tørkede organismer settes et dialkylsulfoksyd, f.eks. dimetylsulfoksyd, dietylsulfoksyd eller lignende, fortrinnsvis dimetylsulfoksyd i en mengde på 10 til 50 ml pr. gram av de tørkede organismer. Ekstraksjons-behandlingen utføres under omrøring ved romtemperatur til 80°C

i 30 minutter til flere dager, fortrinnsvis ved ca. 65°C i 3 til 5 timer. Derefter fjernes uoppløselige bestanddeler på vanlig måte så som dekantering, sentrifugering, filtrering eller lignende. Til den oppnådde ekstrakt settes et hydrofilt organisk oppløsningsmiddel, f.eks. et keton så som aceton, dietylketon, metyletylketon eller lignende, eller en alkohol så som metanol, etanol, isopropanol eller lignende, i en mengde på mer enn 5 ganger mengden av ekstrakten (volum/volum) ved lav temperatur. Fortrinnsvis tilsettes det hydrofile organiske opp-løsningsmiddel under sure betingelser, f.eks. tilsettes aceton sammen med saltsyre, og den resulterende blanding får stå ved ca. 4°C i flere timer til flere dager.

Bunnfallet fraskilles på vanlig måte. Derefter underkastes det oppnådde bunnfall en deproteiniseringsbehandling eller ultrafiltreringsbehandling alene eller en kombinasjon av de to.

Når organismene vaskes med fysiologisk saltoppløsning og derefter tørkes ved lyofilisering, kan deproteiniseringsbehandlingen eller ultrafiltreringsbehandlingen ikke benyttes for å oppnå en carcinostatisk substans TF-500 eller et salt derav. (IV) Deproteinisering, ultrafiltrering og oppsamling av den ønskede substans.

Bunnfallet oppnådd ovenfor underkastes deproteiniseringsbehandling og derefter ultrafiltreringsbehandling, eller deproteiniseringsbehandling alene eller ultrafiltreringsbehandling alene, for å oppnå en carcinostatisk substans TF-500 eller et salt derav.

For deproteiniseringsbehandlingen kan man anvende i og for seg kjente metoder. Når deproteiniseringen utføres ved behandling med et proteolytisk enzym, oppløses eller suspenderes det således oppnådde bunnfall i vann eller en bufferoppløsning, et proteolytisk enzym settes til den resulterende oppløsning eller suspensjon, og. enzymbehandlingen utføres på vanlig måte.

Som proteolytiske enzymer kan anvendes pronase, papain, trypsin, chemotrypsin og lignende. Pronase og trypsin foretrekkes. Det foretrekkes at før eller under enzymbehandlingen reguleres den vandige oppløsning til og holdes ved en pH på 7

til 8. For dette formål kan man anvende natriumhydroksyd, kaliumhydroksyd, natriumkarbonat, ammoniumkarbonat, natrium-hydrogenkarbonat og lignende. For å hindre forråtnelse av reaksjonsblandingen under enzymbehandlingen, er det ønskelig å tilsette en liten mengde av et organisk oppløsningsmiddel så

som kloroform, toluen eller lignende. Enzymet anvendes vanligvis i en mengde på ca. 1 til 4 vekt% basert på vekten av pulveret (fast stoff) som underkastes enzymbehandlingen.

Den ovennevnte enzymbehandling utføres vanligvis ved

30 til 40°C i 1 til 72 timer, fortrinnsvis 24 til 48 timer. Den kan også utføres ved at det først settes f.eks. ca. 1 til 2 vekt% av et enzym til et pulver (fast), og pulveret (fast) underkastes enzymbehandling i 1 til 24 timer og derefter tilsettes ca.

1 til 2 vekt% av enzymet igjen for videre enzymbehandling.

Efter den ovennevnte enzymbehandling fjernes eventuelt uoppløselige bestanddeler ved f.eks. sentrifugeiring, filtrering eller lignende, hvorefter man fra den vannoppløselige del som således oppnås, utvinner den carcinostatiske substans TF-500.

Oppsamling av TF-500 fra den vannoppløselige del kan

først utføres ved hjelp av minst én fraksjonering avhengig av pH, separat utfeining fra et hydrofilt, organisk oppløsningsmiddel, fraksjonering med en ionebytter og lignende, og derefter ved ultrafiltrering (behandlingen kan gjentas to ganger). Spesielt oppnås den carcinostatiske substans TF-500 ved å regulere pH-verdien i den ovennevnte vannoppløselige del til fortrinnsvis ikke mer enn 2,5 (hvis nødvendig kan trikloreddiksyre tilsettes), fjerne det resulterende bunnfall, sette til den oppløselige del

et hydrofilt organisk oppløsningsmiddel så som etanol slik at dets konsentrasjon blir 30 til 80%, fortrinnsvis 60 til 80%, efter volum, oppsamle det resulterende bunnfall som er fraksjonen med den ønskede substans, derefter behandles, hvis nødvendig, dette bunnfall med en anionebytterharpiks så som "Dowex" type 1,

"Amberlite" IRA-400, "DEAE-Sephadex", "DEAE-Cellulose" eller lignende (denne behandling kan utføres flere ganger) for å oppsamle uadsorberte fraksjoner, og derefter konsentrere og avsalte en vandig oppløsning av det oppnådde bunnfall eller de oppnådde fraksjoner ved ultrafiltrering (nominell molekylvekt-avbrytelse: 50.000-200.000), ved hjelp av f.eks. "Ultrafiltration

Membrane UK-50" (nominell molekylvektavbrytelse: 50.000), "Ultrafiltration Membrane UK-200" (nominell molekylvekt-avbrytelse: 200.000) eller lignende, og tørke det konsentrerte og avsaltede produkt. 0,2% vandig oppløsning av denne TF-500 (vekt/volum) er gjennomsiktig.

Som forklart ovenfor kan man istedenfor deproteiniseringsbehandlingen og påfølgende ultrafiltreringsbehandling utføre den ovenfor beskrevne deproteiniseringsbehandling eller ultrafiltreringsbehandling alene.

Den således oppnådde carcinostatiske substans TF-500 har

de følgende egenskaper, og kan omdannes til et farmasøytisk god-tagbart salt på vanlig måte. Spesielt omfatter farmasøytisk godtagbare salter f.eks. alkalimétallsalter så som natriumsalter, kaliumsalter og lignende, og jordalkalimetallsalter så som magnesiumsalter, kalsiumsalter og lignende.

De farmakologiske virkninger av den carcinostatiske substans TF-500 er som følger: (I) Virkning av TF-substans på celle-levedyktighet (måling av kolonidannelse)

Basert på metoden ifølge Kim. J. H. et al [Cancer Res. 25, 698 (1965)], ble HeLa S-3 celler dyrket i Eagle's MEM supplementert med 10% kalveserum i 3 til 5 dager ved 37°C, hvorefter kulturen ble fjernet, og en PBS (-) oppløsning (en vandig oppløsning inneholdende 8,0 g/l natriumklorid, 0,2 g/l kaliumklorid, 1,15 g/l dinatriumhydrogenfosfat og 0,2 g/l kalium-dihydrogenfosfat) inneholdende 0,01 vekt% etylendiamintetra-eddiksyre og 0,1 vekt% trypsin ble tilsatt ved pipettering til det oppnådde celle lag for å danne en suspensjon. Den således oppnådde cellesuspensjon ble fortynnet med Eagle's MEM supplementert med 20% kalveserum slik at den inneholdt 300 celler pr. ml. 1 ml av denne cellesuspensjon ble dyrket ved 37°C i

24 timer i en C02-inkubator, og til den resulterende kultur ble derefter satt den carcinostatiske substans TF-500 som ble oppnådd i det nedenstående eksempel 1 slik at konsentrasjonen ble 250, 500 og 1000 pg/ml. To forsøk ble utført, hvor ett ble foretatt med tilsetning av serum (20% volum/yolum) til kulturen, og det annet uten tilsetning av serum. Efter behandling i 24 timer ble cellene vasket med serum-fri kultur, og til cellene ble derefter satt kulturen med tilsatt 20% kalveserum, hvorefter cellene ble dyrket i 6 dager i en C02-inkubator. Efter dyrkningen ble cellene fiksert med etanol og farvet med en Giemsa-farveoppløsning, og de resulterende kolonier ble tellet for å bestemme levedyktig-heten av cellene. De oppnådde resultater er vist i tabell 2, hvor cellenes levedyktighet ble bestemt ved hjelp av følgende ligning:

(II) Immunostimulerende aktivitet

Tre ICR-stammer av mus (hunnmus, 6 uker gamle) for hver gruppe ble anvendt. 5 pg, 50 pig og 500 Mg/kg av prøve forbinde Isen ble administrert intraperitonealt til musene. 24 timer efter administreringen ble 0,2 ml av en karbon-suspensjon fremstilt ved å blande 1 ml "Perikan Drawing Ink 17 Black" (fremstilt av Giinther-Wagner Co. Ltd.) med 2 ml fysiologisk saltoppløsning inneholdende 3 vekt% gelatin, injisert intravenøst i musens hale, og 1, 5, 10 og 15 minutter efter injeksjonen ble 0,02 ml blodprøve tatt fra øyehulen ved anvendelse av et hematocrit kapillar-rør belagt med heparin, og umiddelbart fortynnet og hemolysert med 1,6 ml av en 0,1 vekt% vandig natriumkarbonat-oppløsning. Denne suspensjon ble undersøkt ved kolorimetri ved 6 75 nm, og den fagocytotiske indeks, nemlig K-verdien, ble bestemt ved hjelp av ligningen ifølge Halpern et al.

Til musene i kontrollgruppen ble administrert 0,2 ml fysiologisk saltoppløsning.

hvor C o = konsentrasjonen av karbon i blodet ved tiden t u, og C = konsentrasjonen av karbon i blodet ved tiden t.

Resultatene er som vist i tabell 3.

(III) Antitumoraktivitet mot Sarcoma-180-celler

Sarcoma 180-celler ble transplantert subkutant til mus av ICR-stammen (hunnmus, 6 uker gamle) i armhulen i en mengde på

1 x 10 7 celler pr. mus. Derefter ble hver av prøveforbindelsene oppløst i en 5% vandig glukose-oppløsning, og 0,2 ml av hver av de resulterende oppløsninger ble administrert intravenøst til musene en gang daglig på den 10. og 12. dag efter transplanteringen av carcinoma-cellene. Til kontrollgruppen ble 0,2 ml av en 5% vandig glukose-oppløsning administrert på samme måte som ovenfor. Resultatene er vist i tabell 4.

(IV) Akutt toksisitet

LDc„-verdi for mus (ICR-starame, hunndyr, 6 uker gamle, intravenøs administrering) av TF-500 er mer enn 10 mg/kg.

Som det fremgår av de ovenfor beskrevne farmakologiske

forsøk er substansen TF-500 fremstilt ifølge oppfinnelsen nyttig som carcinostatisk middel og kan ventes å ha aktivitet mot forskjellige kreft-sykdommer.

TF-500 substansen eller dens farmasøytisk godtagbare salt fremstilt ifølge oppfinnelsen kan anvendes efter tilberedning som forskjellige farmasøytiske former så som orale midler, injeksjonspreparater, stikkpiller eller lignende.

Når de anvendes som orale midler, kan de orale midler

inneholde forskjellige hjelpestoffer og kan være formet til kapsler, tabletter, pulvere eller granuler. Når de anvendes som injeksjonspreparater kan de være for subkutan, intramuskulær eller intravenøs injeksjon, og de anvendes i form av en suspensjon, en oppløsning eller et pulver som oppløses i fysiologisk saltvann eller en oppløsning inneholdende en glukose eller et lokalbedøvelsesmiddel før bruk. Dosen av TF-500

substansen eller dens farmasøytisk godtagbare salt velges avhengig av pasientens tilstand, selv om det vanligvis er ønskelig å

administrere substansen i en dose på 0,001 til 0,1 mg/kg en gang daglig eller flere ganger daglig til voksne, og når det gjelder administreringsmetoden, administreres midlene fortrinnsvis oralt eller ved subkutan, intramuskulær eller intravenøs injeksjon eller injeksjon i den angrepne del.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere under henvisning til eksemplene, fremstillingseksemplene og tegningene, hvor Figur 1 viser et mikroskop-fotografi som illustrerer formen på Fusobacterium nucleatum TF-031 som anvendes ifølge oppfinnelsen; Figur 2 viser et infrarødt absorpsjonsspektrum for TF-500 oppnådd i eksempel 1;

Figur 3 viser et ultrafiolett absorpsjonsspektrum for

nevnte substans;

Figur 4 viser et infrarødt absorpsjonsspektrum for TF-500 oppnådd i eksempel 2; Figur 5 viser et ultrafiolett absorpsjonsspektrum for nevnte substans; Figur 6 viser et infrarødt absorpsjonsspektrum for TF-500 oppnådd i eksempel 3; Figur 7 viser et ultrafiolett absorpsjonsspektrum for nevnte substans; Figur 8 viser et infrarødt absorpsjonsspektrum for TF-500 oppnådd i eksempel 4; og Figur 9 viser et ultrafiolett absorpsjonsspektrum av nevnte substans.

Eksempel 1

(1) I et 90 liter fermenteringskar (MSJ-U type, fremstilt av Marubishi Rika Kenkyusho) ble innført 70 liter av et TF-f kulturmedium inneholdende 1190 g trypticase-pepton, 1050 g hjerteinfusjon, 210 g gjærekstrakt, 525 g natriumklorid, 840 g glukose, 700 g laktose, 7 g natriumsulfitt, 35 g natriumtioglykolat og 175 g dikaliumhydrogenfosfat, og kulturmediet ble regulert til pH 7,5 med 4N vandig natriumhydroksyd-oppløsning. Kulturmediet ble sterilisert i 15 min. ved 118°C. Efter avkjøling av kultur-mediet ble nitrogengass ført gjennom dette med en hastighet på 250 ml/min. i 1 time. Inn i dette kulturmedium ble podet ca.

900 ml av en forhåndsdyrket oppløsning av Fusobacterium

nucleatum TF-031 (FERM-5077, ATCC-31647) som på forhånd var fremstilt ved å dyrke den i et TF-f kulturmedium med samme sammen-setning som ovenfor. Cellene ble dynket i 4 dager ved 33°C under omrøring (90 o.p.m.) mens nitrogengass ble innført i en mengde på 250 ml/min.

(2) En 12 liter porsjon av den således oppnådde kultur ble underkastet sentrifuger ing (4 x 10"<*> o.p.m., 10 min.) for å oppsamle organismene, og organismene ble vasket med 1 liter fysiologisk saltoppløsning og derefter avfettet og vasket med 1 liter etanol og 1 liter aceton i denne rekkefølge, og derefter tørket for å oppnå 14,2 g av organismene. Organismene ble suspendert i 300 ml dimetylsulfoksyd og underkastet ekstraksjon med omrøring i 4 timer under oppvarmning av suspensjonen ved 65°C. Derefter ble suspensjonen filtrert ved sugning for å gi et filtrat. Til dette filtrat ble satt 2 liter aceton og 8 ml konsentrert saltsyre, og den resulterende blanding fikk derefter stå i 2 dager for å ;felle og elde det resulterende bunnfall. Dette bunnfall ble oppsamlet ved sentrifugering (4 x 10 o.p.m., 10 min.) (748 mg). (3) Det således oppnådde bunnfall på 748 mg ble oppløst i 15 ml vann, og den resulterende oppløsning ble regulert til pH 7,8-8,0 med ammoniumkarbonat. Til denne oppløsning ble satt to 7,5 mg porsjoner av "Pronase E" (Kaken Kagaku; 1.000.000 tyrosin-enheter/g) med 30 minutters mellomrom, og flere dråper toluen ble derefter tilsatt, hvorefter den resulterende blanding ble underkastet enzym-behandling ved 37°C i 24 timer. Til den således behandlede blanding ble satt saltsyre for å regulere pH til 1, ;og etanol ble derefter tilsatt slik at etanolkonsentrasjonen ble 80 volum%. Den resulterende blanding ble underkastet sentrifugering (4 x 10"* o.p.m., 10 min.), og det resulterende bunnfall ble oppsamlet (288,6 mg).

(4) Det således oppnådde bunnfall på 288,6 mg ble oppløst i

50 ml vann, og den resulterende oppløsning ble konsentrert til

5 ml ved ultrafiltrering under anvendelse av "Ultrafiltration Membrane UK-50", og 45 ml vann ble satt til den således oppnådde konsentrerte oppløsning, hvorefter den således fortynnede opp-løsning igjen ble konsentrert til 5 ml ved ultrafiltrering under anvendelse av "Ultrafiltration Membrane UK-50". Denne konsentrerte oppløsning ble filtrert gjennom et "Millipore" filter med en porediameter på 0,2 \ im, og ble derefter frysetørket for å gi 264 mg av den frysetørkede, carcinostatiske substans TF-500.

Den således fremstilte carcinostatiske substans TF-500

hadde de ovenfor angitte egenskaper, og det infrarøde absorpsjonsspektrum vist på Figur 2 og det ultraviolette absorpsjonsspektrum vist på Figur 3.

Eksempel 2

(1) Fra 70 liter av kulturen oppnådd i eksempel 1-(1) ble organismene oppsamlet ved filtrering gjennom "Hyflo Super Cel", og den resulterende blanding av organismene med "Hyflo Super Cel" ble vasket med 20 liter fysiologisk saltoppløsning og derefter avfettet og vasket med 3 liter etanol og 2 liter aceton i denne rekkefølge for å oppnå 3,2 kg tørket blanding. En 320 g porsjon av denne blanding ble suspendert i 400 ml dimetylsulfoksyd, og den resulterende suspensjon ble underkastet ekstraksjon med omrøring i 4 timer under oppvarmning ved 65°C. Derefter ble suspensjonen filtrert med sugning for å oppsamle et filtrat, og 2,5 liter aceton og 10 ml konsentrert saltsyre ble tilsatt, hvorefter den resulterende blanding fikk stå ved 4°C i 2 dager for å utfelle og elde bunnfallet. Bunnfallet ble oppsamlet ved sentrifugering (4 x IO3 o.p.m., 10 min.) (94 mg). (2) I 50 ml vann ble oppløst 94 mg av det således oppnådde bunnfall, og den resulterende oppløsning ble konsentrert til 5 ml ved ultrafiltrering under anvendelse av "Ultrafiltration Membrane UK-50", og 45 ml vann ble satt til den således oppnådde konsentrerte oppløsning, hvorefter den således fortynnede opp-løsning igjen ble konsentrert til 5 ml ved ultrafiltrering under anvendelse av "Ultrafiltration Membrane UK-50".

Den således konsentrerte oppløsning ble filtrert gjennom

et "Millipore" filter med en porediameter på 0,2 nm og derefter frysetørket for å gi 62,6 mg av den frysetørkede carcinostatiske substans TF-500.

Den således oppnådde carcinostatiske substans TF-500 hadde de ovenfor angitte egenskaper og hadde det infrarøde absorpsjonsspektrum vist på Figur 4 og det ultrafiolette absorpsjonsspektrum vist på Figur 5.

Eksempel 3

(1) En 7,2 liter porsjon av kulturen oppnådd i eksempel 1-(1)

ble underkastet sentrifugering (5 x 10 3 o.p.m., 10 min.) for å oppsamle organismene, og de ble frysetørket. En 3,5 g porsjon av de således frysetørkede organismer ble suspendert i 100 ml fysiologisk saltoppløsning, og den resulterende suspensjon ble regulert til pH 8,0 med 2N vandig natriumhydroksydoppløsning, omrørt i 3 timer, fikk derefter stå i 24 timer og ble derefter underkastet sentrifugering (5 x IO<3> o.p.m., 10 min.) for å fjerne væsken på toppen. Til det oppnådde bunnfall ble satt 100 ml fysiologisk saltoppløsning, og den resulterende blanding ble regulert til pH 8,0 med 2N vandig natriumhydroksydoppløsning. Blandingen ble omrørt i 2 timer og ble derefter underkastet sentrifugering (5 x IO<3> o.p.m., 10 min.) for å fjerne væsken på toppen. Derefter ble det oppnådde bunnfall vasket med tre 50 ml porsjoner etanol, én 50 ml porsjon aceton og én 50 ml porsjon dietyleter i denne rekkefølge (fjernelse av vaskevæskene ble utført ved sentrifugering (5 x 10 3 o.p.m-, 10 min.)), og ble derefter tørket for å oppnå tørkede organismer. Organismene ble pulverisert for å oppnå et pulver derav. Til pulveret ble satt 70 ml dimetylsulfoksyd, og den resulterende blanding ble underkastet ekstraksjon med omrøring ved 63-65°C i 4 timer og ble derefter sugefiltrert for å oppsamle et filtrat. Til dette filtrat ble satt 536 ml aceton og 1 ml konsentrert saltsyre, og den resulterende blanding fikk stå ved 4°C i 24 timer for å felle og elde bunnfallet. Bunnfallet ble oppsamlet ved sentrifugering

(5 x lo 3 o.p.m., 10 min.) (269 mg).

(2) Til de således oppnådde 269 mg av bunnfallet ble satt

2,7 ml vann, og den resulterende blanding ble regulert til pH 8,0 med IN vandig natriumhydroksydoppløsning, hvorefter vann ble tilsatt for å regulere sluttvolumet til 4 ml. Til blandingen ble satt 2,7 mg "Pronase E" (1.000.000 tyrosinenheter/g), og den resulterende blanding ble underkaste enzym-behandling ved 37°C

i 1 time. Derefter ble 2,7 mg "Pronase E" og flere dråper toluen tilsatt, og den resultrende blanding ble underkastet enzym-behandling ved 37°C i 24 timer. Uoppløselige bestanddeler ble fjernet fra den således behandlede blanding ved sentrifugering

(5 x IO<3> o.p.m., 10 min.), og til den oppnådde oppløsning ble satt 2N saltsyre for å regulere oppløsningens pH til 1,0,

hvorefter etanol ble tilsatt slik at etanol-konsentrasjonen ble

80 volum%. Det således oppnådde bunnfall ble oppsamlet ved sentrifugering (5 x IO<3> o.p.m., 10 min.) (78,5 mg). (3) Til de således oppnådde 78,5 mg bunnfall ble satt 20 ml vann, og den resulterende blanding ble regulert til pH 7 med IN vandig natriumhydroksyd-oppløsning. Derefter ble den resulterende blanding konsentrert til 5 ml ved ultrafiltrering under anvendelse av "Ultrafiltration Membrane UK-50", og 45 ml vann ble satt til den således oppnådde konsentrerte oppløsning, hvorefter den således fortynnede oppløsning igjen ble konsentrert til 5 ml ved ultrafiltrering under anvendelse av "Ultrafiltration Membrane UK-50". Til den således oppnådde konsentrerte oppløsning ble satt 4 5 ml vann, og den således fortynnede oppløsning ble konsentrert til 5 ml ved ultrafiltrering under anvendelse av "Ultrafiltration Membrane UK-50". Dette konsentrat ble filtrert gjennom et membranfilter med en porediameter på 0,2 ym (Toyo Roshi Kabushiki Kaisha TM-4), og ble derefter frysetørket for å gi 65 mg fryse-tørket carcinostatisk substans TF-500.

Den således oppnådde carcinostatiske substans TF-500 hadde

de ovenfor angitte egenskaper og hadde det infrarøde absorpsjonsspektrum vist på Figur 6 og det ultrafiolette absorpsjonsspektrum vist på Figur 7.

Eksempel 4

(1) En 10 liter porsjon av kulturen oppnådd i eksempel 1-(1)

ble sentrifugert (5 x IO<3> o.p.m., 10 min.) for å oppsamle organismene. Til organismene ble satt 500 ml fysiologisk salt-oppløsning, og den resulterende blanding ble omrørt i 30 minutter og derefter sentrifugert (5 x 10<3> o.p.m., lo min.) for å oppsamle bunnfallet. Denne prosess ble gjentatt to ganger. Til det således oppnådde bunnfall ble satt 500 ml fysiologisk salt-oppløsning, og den resulterende blanding ble omrørt i 30 minutter, derefter regulert til pH 8,0 med IN vandig natriumhydroksyd-oppløsning og derefter omrørt i 30 minutter. Blandingen ble så sentrifugert (5 x IO<3> o.p.m., 10 min.), og avfettet og vasket med 500 ml fysiologisk saltoppløsning. Derefter ble blandingen.

sentrifugert (5 x IO<3> o.p.m., 10 min.) for å oppnå bunnfallet.

Det oppnådde bunnfall ble vasket med én 500 ml porsjon fysiologisk, saltoppløsning, én 300 ml porsjon etanol og én 300 ml porsjon aceton i denne rekkefølge (fjernelse av vaskevæskene ble utført ved sentrifugering (5 x IO<3> o.p.m., 10 min.)) og ble derefter tørket for å oppnå de tørre organismer. De således oppnådde organismer ble pulverisert for å oppnå et pulver derav. Til dette pulver ble satt 160 ml dimetylsulfoksyd, og den resulterende blanding ble underkastet ekstraksjon med omrøring ved 63-65°C i 4 timer. Derefter ble blandingen filtrert ved sugning for å gi et filtrat, og til filtratet ble satt 1,2 liter aceton og 4,2 ml konsentrert saltsyre, hvorefter den resulterende blanding fikk stå ved 4°C i 24 timer for å felle og elde bunnfallet. Dette bunnfall ble sentrifugert (5 x IO<3> o.p.m., 10 min.) for å oppsamle bunnfallet (5 x 10 3 o.p.m., 10 min.) for å oppsamle bunnfallet (246 mg) . (2) Til de således oppnådde 246 mg av bunnfallet ble satt 5 ml vann, og den resulterende blanding ble regulert til pH 7,8 med IN vandig natriumhydroksydoppløsning. Til blandingen ble satt 5 mg "Pronase E" (1.000.000 tyrosin-enheter/g), og blandingen ble underkastet enzymbehandling ved 37°C i 30 minutter, hvorefter IN vandig natriumhydroksyd-oppløsning ble satt til blandingen for å regulere pH-verdien til 7,8, hvorefter 5 mg "Pronase E" og flere dråper toluen igjen ble tilsatt. Den resulterende blanding ble underkastet enzym-behandling ved 37°C i 24 timer. Til den behandlede blanding ble satt IN saltsyre for å regulere pH-verdien til 1,0, og den resulterende blanding fikk stå i 2 timer og ble derefter sentrifugert (5 x IO<3> o.p.m., 10 min.) for å gi en væske på toppen. Til den oppnådde væske på toppen ble sått etanol slik at etanolkonsentrasjonen ble 80 volum%. Den resulterende blanding fikk stå i 2 timer og ble sentrifugert (5 x IO<3> o.p.m., 10 min.), hvorefter det utfelte bunnfall ble oppsamlet (98 mg). (3) Til de således oppnådde 98 mg bui^ifall ble satt 20 ml vann, og den resulterende blanding ble regulert til pH 7 med IN vandig natriumhydroksydoppløsning. Derefter ble den resulterende blanding konsentrert til 5 ml ved ultrafiltrering under anvendelse av "Ultrafiltration Membrane UK-50", og 45 ml vann ble satt til den således oppnådde konsentrerte oppløsning, hvorefter den således fortynnede oppløsning igjen ble konsentrert til 5 ml ved ultrafiltrering under anvendelse av "Ultrafiltration Membrane UK-50". Til den således oppnådde konsentrerte oppløsning ble satt 4 5 ml vann, og den således fortynnede oppløsning ble konsentrert til 5 ml ved ultrafiltrering under anvendelse av "Ultrafiltration Membrane UK-50". Det oppnådde konsentrat ble filtrert gjennom et membranfilter med en porediameter på 0,2 pm (Toyo Roshi Kabushiki Kaisha TM-4), og ble derefter frysetørket for å gi

83 mg av den frysetørkede, carcinostatiske substans TF-500.

Den således oppnådde carcinostatiske substans TF-500 hadde de ovenfor angitte egenskaper og hadde det infrarøde absorpsjonsspektrum vist på Figur 8 og det ultrafiolette absorpsjonsspektrum vist på Figur 9.

Claims (5)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en carcinostatisk substans TF-500 med de følgende egenskaper: (a) Gråaktig, lysebrunt pulver, (b) Carcinostatisk og immunostimulerende aktivitet, (c) Løselighet i vann, men uløselig i metanol, etanol, aceton, benzen, kloroform, etylacetat og dietyleter, ' (d) Ikke noe klart smeltepunkt, og begynner og spaltes ved ca. 180°C og spaltes tydelig over 195°C, (e) Infrarødt absorpsjonsspektrum erholdt ved KRr-metoden med absorpsjonsbånd ved 3500-3200, 2920, 2850, 1660-1600, 1580-1520, 1460-1400, 1380-1360, 1120-1100, 1080-1000, 970 og 840-800 cm"<1>, (f) Ultrafiolett absorpsjonsspektrum i vandig løsning med en pH på 7,0 med en sterk absorpsjon ved absorpsjonskanten, og en absorpsjonstopp ved 246-280 nm, (g) Positiv i Molisch-reaksjon, fenolsvovelsyre-reaksjon, antronsvovelsyre-reaksjon, indol-saltsyre-reaksjon og Lowry-Folin's reaksjon, men negativ i ninhydrin-reaksjon, (h) Elementæranalyse-verdier C: 38-47 %, H: 5-7 %, N :1-4 %, (i) Sakkaridinnhold bestemt ved en fenolsvovelsyre-metode på ca. 12-30 vekt% uttrykt som glukose, og protein-innhold ved Lowry-Folin's metoden på ca. 10 vekt% eller mindre uttrykt som bovinserumalubmin,

   eller salt derav,

   karakterisert ved(A) å ekstrahere anaerobt dyrkede mikroorganismestammer av Fusobacterium nucleatum TF-030 (FERM 5077, ATCC 31647) eller mutanter derav med et di-lavere alkylsulfoksyd, tilsette et hydrofilt organisk løsningsmiddel til det resulterende ekstrakt, ultrafiltrere den oppnådde felling og samle substansen, eller (B) ekstrahere anaerobt dyrkede mikroorganismestammer av Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077, ATCC 31647) eller mutanter derav med et di-lavere alkylsulfoksyd, tilsette et hydrofilt organisk løsningsmiddel til det resul

   terende ekstrakt, underkaste den oppnådde felling en deproteiniseringsbehandling, ultrafiltrere den oppnådde felling og oppsamle den oppnådde substans, eller (C) Anaerobt dyrkede mikroorganismestammer av Fusobacterium nucleatum TF-031 (FERM 5077, ATCC 31647) organismene ekstraheres med et di-lavere alkylsulfoksyd; et hydrofilt organisk løsnings-middel tilsettes under sure betingelser til det resulterende ekstrakt i en større mengde enn 5 ganger ekstraktets (volum/- volum);

   den dannende felling underkastes deproteiniseringsbehandling med en pronase;

   den vannløselige del med pH 2,5 eller lavere tilsettes en

   alkohol, slik at alkoholkonsentrasjonen blir 30 til 60 volum-prosent ;

   den dannende felling oppsamles og ultrafUtreres og membran-filtreres deretter; og deretter

   frysetørkes filtratet og gir den carcinostatiske substans.
2. 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,

   karakterisert ved at det som hydrofilt organisk løsningsmiddel anvendes aceton.
3. 3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,

   karakterisert ved at proteiniserings-behandlingen utføres som en enzymbehandling med et proteolytisk enzym.
4. 4. Fremg.angsmåte ifølge krav 3 ,

   karakterisert vedat det som proteolytisk enzym anvendes en pronase.
5. 5. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-4, karakterisert ved at ultrafiletrerings-behandlingen utføres med et ultrafilter med en nominell molekylvektavskjæring på 50.000 - 200.000.