NO155697B

NO155697B - Fremgangsmaate for fremstilling av fysiologisk aktive forbindelser ved fermentering.

Info

Publication number: NO155697B
Application number: NO802499A
Authority: NO
Inventors: Kenzo Tamai; Isamu Saikawa; Takashi Yasuda; Shohachi Murakami; Toyoo Maeda; Hisatsugu Tsuda; Hiroshi Sakai; Masatoshi Sugita; Yoshiko Yamamoto; Hisashi Minami; Takaho Hori
Original assignee: Toyama Chemical Co Ltd
Priority date: 1979-08-24
Filing date: 1980-08-22
Publication date: 1987-02-02
Also published as: CA1174618A; ATA426480A; NO802499L; FR2463619A1; GB2059969A; FI802641A; AU6164680A; DK361680A; DK151639C; GB2059969B; IT1181595B; DK151639B; DE3031152C2; FI68080B; PT71730A; DE3031152A1; IT8049541A0; SE446406B; SE8005921L; NL8004759A

Description

Denne oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for frem-

stilling av nye karsinostatisk og immunostimulerende TF-

substanser som er TF-100, 110, 120, 130, (1316, 132a, 132b,

133a, 133b, 1323, 136), 140 og 150, hvorunder man dyrker Fusobacterium nucleatum TF-031 (ATCC 31647) under anaerobe

betingelser i et dyrkningsmedium som inneholder nitrogen-

kilder, karbonkilder, vitaminkilder, reduksjonsmidler og uor-

ganiske salter og eventuelt i tillegg agar og innstiller på

en pH-verdi fra 5 til 8,5, tilsetter kulturen- eller super-

natanten et hydrofilt organisk løsningsmiddel, skiller fra den derved dannede felling og så samler den vannløselige fraksjon av fellingen, hvoretter man eventuelt så foretar den følgende behandling (1), (2), (3) eller (4),

(1) dialyserer eller ultrafiltrerer den vannløselige

fraksjon og så isolerer en produktfraksjon fra den indre løsning og eventuelt, behandler denne produktfraksjon med en ionebytter og isolerer en adsorbert produktfraksjon eller en ikke-adsorbert produktfraksjon, eller tilsetter produkt-

fraksjonen som er isolert fra den indre løsning et kvarter-

nært ammoniumsalt, samler den dannede felling, deretter foretar en dissosiasjonsbehandling og isolerer en produktfraksjon fra den behandlede væske,

(2) behandler den vannløselige fraksjon med en ionebytter og

isolerer den adsorberte fraksjon eller den ikke-adsorberté

fraksjon,

(3) tilsetter den vannløselige fraksjon bariumioner

(hvorunder kulturen eller supernatanten kan anvendes istedenfor den vannløselige fraksjon), skiller fra det dannede bariumsalt,

fjerner bariumet fra saltet, deretter dialyserer eller ultrafil-

trerer den vannløselige fraksjon og isolerer en produkt-

fraks jon fra den indre løsning,

(4) tilsetter den vannløselige fraksjon et kvarternært

ammoniumsalt, samler den dannede felling, dissosiasjons-

behandler denne og så isolerer en produktfraksjon fra den be-

handlede væske.

I de senere år er det kommet til utstrakt anvendelse av, som et legemiddel for pasienter med forskjellige typer av cancer, et legemiddel som omfatter økende immunologisk funksjon av verten og oppnåelse av en karsinostatisk effekt med hjelp av den immunologiske funksjon. Som antitumor-midler anvendt for et slikt legemiddel, er det kjent komponenter oppnådd fra organismer av forskjellige bakterier eller kulturer av forskjellige bakterier eller polysakkarider oppnådd fra frukt-legemer av Basidiomycetes eller dyrkede sopp-legemer derfra. Disse antitumor-midler er imidlertid ikke ennå tilfredsstillende med hensyn til effekt, skadelige bivirkninger og fremstillings-metode.

På den annen side er det omtalt en organisme og et overflytende fluidum oppnådd ved å dyrke bakterier som tilhører slekten Fusobacterium, for eksempel Fusobacterium K031-3B, Fusobacterium fusifomis W-12, Fusobacterium girans 1012 og Fusobacterium nucleatum 1010 [Dental Surgery, 2_3' 322-333

(1974) og 21, 534-539 (1972) (japaner)]. Det har imidlertid ennå ikke blitt gjort noen undersøkelse med hensyn til kom-ponentene oppnådd fra en kultur, eller dens overflytende fluidum, fremstilt ved å dyrke bakterier som tilhører slekten Fusobacterium, og de farmakologiske aktiviteter til komponen-tene .

Nærværende oppfinnere har undersøkt den farmakologiske aktivitet til et overflytende fluidum oppnådd ved å dyrke bakterier som tilhører slekten Fusobacterium, og fjerne organismene fra kulturen, for å finne at en spesifikk komponent oppnådd fra det overflytende fluidum har en karsinostatisk aktivitet, at nevnte komponent i alt vesentlig ikke har noen virkning på inhibering av dannelsen av en koloni av cancer-celler ved en forsøksmetode med koloni-skumming, og at den ikke har noen karsinostatisk aktivitet til å drepe cancer-cellene, men en indirekte karsinostatisk aktivitet ved økning av den vert-formidlede antitumor-aktivitet eller immuniteten til verten og utnyttelse av hjelpen ved immuniteten, og at nevnte komponent har svært lav toksisitet og kan oppnås også ved behandling av kulturen.

Fordeler ved denne oppfinnelse vil fremgå av den følgende beskrivelse.

De bakteriologiske egenskaper til Fusobacterium nucleatum TF-031 er som følger:

(I) Form

(1) Form på cellene: spole-formede (fig. 1) (2) Polymorfisme på cellene: fraværende

(3) Mobilitet: fraværende

(4) Sporer: fraværende

(5) Gram-flekk: Gram-negativ

(6) Syre-bestandig: negativ

(II) Vekst-forhold i et kultur-medium

(1) TF - en agar-plate og skråkultur-medium Ytre form: en rund fasong

Størrelse: ca. 1 mm

Hevelse: halvkuleformet fasong Struktur: duggdråpe-lignende Overflate: glatt

Kanter: glatt

Farge: melkaktig gulaktig hvit Gjennomsiktighet: uklar

(2) TF - et flytende kulturmedium

Grad av vekst: kraftig

Grumsethet: koagulat

Utfeining: ingen

Vekst på overflate: ingen, ingen vekst inntil en

dybde på ca. 5 mm Gass: ingen

(III) Fysiologiske egenskaper

(1) Produksjon av hydrogensulfid: +

(2) Reduksjon av nitrater: -

(3) Produksjon av smørsyre: +

(4) Produksjon av indol: +

(5) Urease: -

(6) Katalase: -

(7) Hydrolyse av stivelse: -

(8) Oppførsel overfor oksygen: anaerobisk

(9) Produksjon av ammoniakk: +

(10) Produksjon av karbondioksyd.: +

(11) Vekst-område: pH 5-8,5, temperatur 30-45°C (12) Produksjon av gass fra sakkarider: L-arabinose (-), D-xylose (-), D-glukose (-), D-mannose (-), D-fruktose (-), D-galaktose (-), malt-sukker (-), sukrose (-), trehalose (-), sorbitol (-), mannitol (-), inositol (-),

glycerol (-), stivelse (-).

De nye TF-substanser i henhold til denne oppfinnelse fremstilles for eksempel på følgende måte.

Den ovennevnte produksjonsprosess illustreres på følg-ende måte:

(1) Dyrking av bakterier.

Dyrkingen av bakterier som tilhører slekten Fusobacterium utføres ved en vanlig metode for dyrking av anaerobe bakterier. Det vil si at et kultur-medium som inneholder en nitrogen-kilde, såsom kalve-hjerne-hjerte-ekstrakter, forskjellige peptoner eller lignende, en vitaminkilde, såsom gjær-ekstrakt eller lignende, et uorganisk salt, såsom natriumklorid eller lignende, en karbonkilde, såsom glukose, laktose eller lignende, et reduksjonsmiddel, såsom L-cystin, natriumsulfitt, tioglykollat eller lignende, justeres til en pH på 6 til 8,5, fortrinnsvis 7,2 til 8,2, og bakteriene innpodes på kultur-mediet, hvoretter dyrking med stødig tilstand utføres under anaerobe forhold ved 35 til 42°C, fortrinnsvis 36 til 38°C, i 1-5 dager, fortrinnsvis 24-72 timer. Det er spesielt ønskelig å anvende'kultur-mediet beskrevet i tabell 1 (heretter referert til som TF-kultur-medium). Imidlertid er det ikke alltid nødvendig med hjerne-hjerte-infusjonen, som er et kalve-hjerne-hjerte-ekstrakt, som karbon-kilde, og den kan erstattes med en hjerte-infusjon som er et kalve-hjerte-ekstrakt, et oksekjøtt-ekstrakt,.et fiske-ekstrakt, maisstøpevæske eller lignende. Blant de forskjellige peptoner, er proteose-pepton og fyton-pepton ikke alltid nødvendig, og trypticase-pepton kan erstattes med polypepton.

Når agar ikke anvendes, er det ønskelig å røre kulturen. (2) Innsamling av et overflytende fluidum fra kulturen (fjerning av organismene).

Organismene fjernes fra den ovenfor oppnådde kultur for

å få et overflytende fluidum. For fjerning av organismene kan det anvendes en konvensjonell metode, f.eks. sentri fugering og en filtreringsmetode ved anvendelse av et filter-hjelpe-middel, såsom Hyflo Super Cel, og spesielt er det fordelaktig med en sentrifugeringsmetode med henblikk på arbeidsoperasjoner, gard av fjerning av organismene og utbytte av det overflytende fluidum. Organismene blir fortrinnsvis fjernet i dette trinn, men de kan fjernes i det etterfølgende trinn (3).

(3) Innsamling av karsinostatisk substans TF-100.

Et hydrofilt organisk løsningsmiddel settes til det ovenfor oppnådde overflytende medium eller til kulturen, og den dannede utfeining innsamles. Ved dette tidspunkt blir det overflytende fluidum eller kulturen fordelaktig justert til en pH på 2 til 7. Det hydrofile organiske løsningsmiddel inn-betatter for eksempel alkoholer, såsom etanol, metanol og lignende, og ketoner, såsom aceton og lignende, selv om alkoholer, spesielt etanol, gir de beste; resultater. Det hydrofile organiske løsningsmiddel tilsettes slik at dets konsentrasjon kan bli 30 til 70 volum%, og spesielt 50 til 70 volum%. Etter tilsetningen av det hydrofile organiske løsningsmiddel, blir den resulterende blanding hensatt ved lav temperatur, fortrinnsvis ved ca. 5°C, i flere timer til flere dager for å fullføre dannelsen av utfelningen.

Den således dannede utfelning separeres ved vanlige fremgangsmåter, såsom dekantering, sentrifugering, filtrering og lignende.

Deretter tilsettes vann i en mengde på 10-15 ganger mengden for den ovenfor oppnådde utfelning, til utfelningen [vannet kan erstattes med en fosfatbuffer eller en natriumklorid-holdig fosfatbuffer når TF-120 eller 130 (1316, 132a, 132b, 133a, 133b, 1323 eller 136) er ment å oppnås som omtalt nedenfor] og det dannede vannuløselige materiale fjernes ved en vanlig metode, såsom sentrifugering, filtrering eller lignende, hvoretter den vannløselige fraksjon innsamles. Når kulturen anvendes, fjernes organismene ved de ovennevnte, fremgangsmåter. Den således oppnådde vannløselige fraksjon tørkes ved lyofilisering eller lignende for å oppnå en karsinostatisk substans TF-100.

Den således oppnådde TF-100 har egenskapene vist i tabell 2.

(4) Innsamling av karsinostatisk substans TF-110.

Den vannløselige substans oppnådd i (3) ovenfor utsettes for dialyse eller ultrafiltrering, eller alternativt op<p>løses TF-100 i vann i en mengde som er 10-15 ganger den til TF-100 og den resulterende løsning utsettes for dialyse eller ultrafiltrering. Lavmolekylære substanser såsom aminosyrer og uorganiske materialer fjernes ved ovennevnte behandling. Den indre løsning oppnådd ved dialyse eller ultrasentrifugering innsamles og tørkes så for å oppnå en karsinostatisk substans TF-110.

Den således oppnådde TF-110 har egenskapene vist i tabell 2.

(5) Innsamling av karsinostatisk substans TF-120.

Den vannløselige fraksjon oppnådd i (3) ovenfor, eller, om nødvendig, den indre løsning ved utsettelse av den vann-løselige fraksjon for dialyse eller ultrafiltrering (den indre løsning oppnådd i (4) ovenfor), eller en løsning av et pulver av TF-110 i en liten mengde av vann, behandles med en ione-bytter. Som ione-bytter anvendes det fortrinnsvis en svakt basisk ione-bytter eller en svakt basis ione-bytter som har evne som molekylsil, og for eksempel anvendes passende dietylaminoetyl-Sephadex A-50 (registrert varemerke fra Pharmacia Co., Ltd.). En kolonne pakket med en ione-bytter blir brakt

i likevekt, for eksempel med en fosfat-buffer som har en ph på ca. 8, hvoretter den ovennevnte løsning som skal behandles, føres gjennom kolonnen, og den eluerte løsning innsamles og tørkes så ved lyofilisering eller lignende, eller alternativt anbringes den samme buffer som ovenfor og løsningen som skal behandles i et kar inneholdende en ione-bytter, og innholdene røres og filtreres så, hvoretter filtratet tørkes, og hermed kan det oppnås en karsinostatisk substans TF-120 som har de senere beskrevne egenskaper. TF-120 kan også oppnås ved av-salting av den eluerte løsningen eller filtratet, for eksempel ved dialyse ved anvendelse av et cellofan-rør eller lignende, ved anvendelse av Sephadex G-25 (registrert varemerke fra Pharmacia Co., Ltd.) eller ved ultrafiltrering, og så tørking av samme.

Den således oppnådde TF-120 har egenskapene vist i tabell 2.

(6) Innsamling av karsinostatisk substans TF-130.

En kolonne inneholdende de adsorbcrte komponenter, hvor-fra TF-120 er blitt fjernet ved behandlingen i (5) ovenfor, behandles med en fosfat-buffer, fortrinnsvis en fosfat-buffer som har en natriumklorid-konsentrasjon på 0,1 til 0,6 M og en pil på ca. 8 (heretter blir en fosfat-buf f er som har en natriumklorid-konsentrasjon på 0,1 til 0,6 M referert til som en 0,1-0,6 M natriumklorid-fosfat-buffer), eller alternativt blir den vannløselige fraksjon oppnådd i (3) ovenfor om nød-vendig utsatt for dialyse eller ultrafiltrering, og så for en behandling med en ione-bytter ved anvendelse av en 0,1 - 0,6 M natriumklorid-fosfat-buffer, for å oppnå en fraksjon som ikke elueres med en fosfat-buffer som er fri for natriumklorid, men elueres med en 0,1-0,6 natriumklorid-fosfat-buffer.

Denne fremgangsmåte kan utføres enten ved et kolonne-system eller ved et satsvis system. Den således oppnådde ønskede fraksjon som er eluert med natriumklorid-fosfat-bufferen, tørkes ved lyofilisering eller lignende for at det skal oppnås en karsinostatisk substans TF-130. Eluatet som inneholder den ønskede fraksjon som er eluert med den forannevnte natriumklorid-fosfat-buffer, kan for eksempel avsaltes ved dialyse ved anvendelse av et cellofan-rør, ved molekylar-siling ved anvendelse av Sephadex G-25 eller ved ultrafiltrering, og så tørkes.

Uttrykket "TF-130" anvendt her refererer kollektivt til ønskede eluerte fraksjoner oppnådd ved å behandle den vann-løselige fraksjon oppnådd i (3) ovenfor, eller om nødvendig den indre løsnings-komponent oppnådd ved å utsette den vann-løselige fraksjon for dialyse eller ultrafiltrering, med en ione-bytter, hvilke fraksjoner ikke er eluert med en fosfat-puffer fri for natriumklorid, men er eluert med en 0,1-0,6 -\ natriumklorid-fosfat-buffer. TF-130 inkluderer konkret for eksempel de følgende fraksjoner. (i) En fraksjon som ikke er blitt eluert med en fosfat-buffer som er fri for natriumklorid, men er blitt eluert med en 0,6 M natriumklorid-fosfat-buffer ved den ovennevnte ione-bytte-behandling [fraksjonen er betegnet som TF-1316]. (ii) En fraksjon som ikke er blitt eluert med en 0,1 M natriumklorid-fosfat-buffer, men er blitt eluert med en 0,2 M natriumklorid-fosfat-buffer ved den ovennevnte ione-bytte-behandling [fraksjonen er betegnet som TF-132a og b; TF-132a er oppnådd ved å vaske en ione-bytter inneholdende den forannevnte adsorberte komponent med en 0,1 M natriumklorid-fosfat-buf fer, behandle ione-bytteren med en 0,2 M natriumklorid-fosfat-buffer, og så innsamle fraksjonen eluert med 0,2 M natriumklorid-fosfat-bufferen; og'TF-132b er oppnådd ved behandling av den vannløselige fraksjon oppnådd i (3) ovenfor eller den indre løsnings-komponent (TF-110) oppnådd i (4) ovenfor, med en ione-bytter]. (iii) En fraksjon som ikke er blitt eluert med en 0,2 M natriumklorid-fosfat-buffer, men er blitt eluert med en 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer ved den ovennevnte ione-bytte-behandling [fraksjonen er betegnet TF-133a og b; a og b har de samme betydninger som definert for tilfellet med henholdsvis TF-132a og b]. (iv) En fraksjon som ikke er blitt eluert med en 0,1 M natriumklorid-fosfat-buffer, men er blitt eluert med en 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer ved den ovennevnte ione-bytte-behandling [fraksjonen betegnes TF-1323]. (v) En fraksjon som ikke er blitt eluert med en 0,5 M natriumklorid-fosfat-buffer, men er blitt eluert med en 0,6 M natriumklorid-fosfat-buffer ved den ovennevnte ione-bytte-behandling [fraksjonen betegnes TF-136].

Siden disse TF-1316, 132a, 132b, 133a, 133b, 1323 og

136 har felles egenskaper i de følgende henseender, blir substansene med felles egenskaper betegnet med TF-130. Det vil si at TF-130 oppnådd på den ovenfor beskrevne måte har de følgende egenskaper:

(a) Gråaktig hvitt - lysebrunt pulver.

(b) Den inhiberer proliferering av, på mus, Ehrlich-ascites-tumor, Ehrlich-faststoff-tumor og Sarcoma-180 carcinoma, og har en immunostimulerende aktivitet. (c) Den er løselig i vann og er uløselig i metanol, etanol, aceton, benzen, kloroform, etylacetat og dietyleter. (d) Den har ikke noe klart smeltepunkt, begynner å spaltes ved ca. 110°C, og spaltes bemerkelsesverdig over 200°C.

(c) Dens infrarøde absorpsjons-spektrum oppnådd med

en KBr-tablctt-metodc har absorpsjons-bånd i na-rheten av 3600-3200, 2960-2930, 1670-1640, 1550, 1440-1380, 1240, 1140-1000 og 820 cm<-1. >(f) Det ultrafiolette absorpsjons-spekter til dens vandige løsning viser en sterk absorpsjon ved absorpsjons-kanten, og viser en absorpsjons-spiss i nærheten av 256-280 nm. (g) Den er positiv ved Molisch-reaksjon, fenol-svovelsyre-reaksjon, antron-svovelsyre-reaksjon, indol-saltsyre-reaksjon og Lowry-Folin's reaksjon, og negativ ved ninhydrin-reaksjon.

(h) Elementær-analyse-verdier:

C: 27,5-39,8%, H: 3,2-5,7%, N: 2,8-6,3%. (i) Dens sakkarid-innhold målt ved en fenol-svovelsyre-metode er ca. 19,0 - ca. 64,0 vekt% (uttrykt ved glukose), og dens protein-innhold målt ved Lowry-Folin's metode er i nærheten av 6,0 - 28,0 vekt% (uttrykt ved kalse-serum-albumin).

Den ovennevnte ione-bytte-behandling er forklart mer spesifikt nedenfor. Som ione-bytter anvendt i de følgende fremgangsmåter, foretrekkes en svakt basisk ione-bytter eller en svakt basisk ione-bytter som har evne som molekylsikt,og dietylaminoetyl-Sephadex A-50 anvendt i (5) ovenfor blir for eksempel passende anvendt, og den følgende metode kan ut-føres ved satsvis system. (i) En 0,6 M natriumklorid-fosfat-buffer som fortrinnsvis har en pH på ca. 8, føres fjennom en kolonne av en ione-bytter som inneholder den adsorberte komponent som løsningen som skal behandles har passert gjennom ved (5) ovenfor, og den eluerte fraksjon innsamles, eventuelt konsentreres og avsaltes, ved dialyse, ultrafiltrering eller lignende, og deretter tørkes ved lyofilisering eller lignende for å oppnå"en karsinostatisk substans TF-1316.

Den således oppnådde TF-1316 har egenskapene vist i tabell 2. (ii)-l) En 0,1 M natr iumklorid-f osf at-buf f er som fortrinnsvis har en pH på ca. 8, føres gjennom en kolonne av en ione-bytter som inneholder den adsorberte komponent som løsningen som skal behandles har passert gjennom i (5) ovenfor, for å vaske kolonnen, hvoretter en 0,2 M natriumklorid-fosfat-buffer som fortrinnsvis har en pH på ca. 8 føres gjennom kolonnen, og den eluerte fraksjon innsamles, eventuelt konsentreres og avsaltes ved dialyse, ultrafiltrering eller lignende, og tørkes så ved lyofilisering eller lignende for å oppnå en karsinostatisk substans TF-132a.

Den således oppnådde TF-132a har egenskapene vist i tabell 2. (ii) -2) Fremgangsmåter for innsamling av fraksjonen som ikke er blitt eluert med en 0,1 M natriumklorid-fosfat-buffer, men er blitt eluert med en 0,2 M natriumklorid-fosfat-buffer ved ione-bytte-behandlingen, blir utført på følgende måte ved anvendelse av den vannløselige fraksjon oppnådd i (3) ovenfor eller den indre løsning i (4) ovenfor, for å oppnå TF-132b. Det vil si at kolonnen pakket med ione-bytteren blir brakt i likevekt med en 0,2-0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer som fortrinnsvis har en pH på ca. 8, hvoretter forannevnte 0,2-0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer i den vannløselige fraksjon oppnådd i (3) ovenfor eller den indre løsningskomponent oppnådd ved å utsette den vannløselige fraksjon for dialyse eller ultrafiltrering, føres gjennom kolonnen, og den eluerte løsning innsamles. Om nødvendig vaskes kolonnen med forannevnte 0,2-0,3 f4 natriumklorid-fosfat-buffer, og den eluerte løsning og vaskevæskene blir kombinert. Ione-bytte-behandlingen kan utføres flere ganger. Deretter føres en løsning, fremstilt ved for-tynning av den forannevnte eluerte løsning med en fosfat-buffer slik at natriumklorid-konsentrasjonen kan være 0,1 M, gjennom en kolonne i hvilken ione-bytteren er brakt i likevekt med 0,1 M natriumklorid-fosfat-buffer som fortrinnsvis har en pH på ca. 8, og den fraksjon som er blitt eluert med den forannevnte 0,1 II natriumklorid-fosfat-buffer, blir fjernet, hvoretter den forannevnte 0,2 M na triumklorid-fosfat-buffer føres gjennom kolonnen for å oppnå et eluat. Ved det konkrete eksempel på ovennevnte ione-bytte-behandling, blir en fraksjon som ikke er blitt adsorbert på en ione-bytter brakt i likevekt med forannevnte 0,2 M natriumklorid-fosfat-buffer, innsamlet, adsorbert på en ione-bytter brakt i likevekt med den forannevnte 0,1 M natriumklorid-fosfat-puffer, vasket med den forannevnte 0,1 M natriumklorid-fosfat-buffer og så eluert med den forannevnte 0,2 M natriumklorid-fosfat-buffer for å oppnå et eluat. Det kan også anvendes en fremgangsmåte hverved derimot den fraksjon som er blitt adsorbert på en ione-bytter brakt i likevekt med den forannevnte 0,1 M na triumklorid-fosfat-buffer, blir innsamlet, og hvor det deretter blir utført en fremgangsmåte for separering av nevnte fraksjon fra en fraksjon som er blitt adsorbert på en ione-bytter brakt i likevekt med forannevnte 0,2 M natriumklorid-fosfat-buffer, og en fraksjon som er blitt eluert med den forannevnte 0,2 H natriumklorid-fosfat-buffer, blir innsamlet.

Deretter blir eventuelt eluatet oppnådd på den ovenfor beskrevne måte konsentrert og avsaltet ved dialyse, ultra-

i

filtrerina eller lignende, og så tørket ved lyofilisering

eller lignende for å oppnå en karsinostatisk substans TF-132b.

Den således oppnådde TF-132b har egenskapene vist i tabell 2. (iii)-l) Den indre løsnings-komponent oppnådd i (4) ovenfor føres gjennom en kolonne av en ione-bytter som er brakt i likevekt med en fosfat-buffer som fortrinnsvis har en pH på ca. 8, og en 0,2 M natriumklorid-fosfat-buffer som fortrinnsvis har en pH på ca. 8 føres gejnnom nevnte kolonne for å vaske kolonnen, og så føres en 0,3 M natriumklorid-fosfat-buf f er som fortrinnsvis har en pH på ca. 8, gjennom nevnte kolonne, eller alternativt føres den forannevnte 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer gjennom den kolonne som er blitt behandlet i (ii)-l) ovenfor og fremdeles har den gjenværende adsorberte komponent. Den eluerte fraksjon innsamles, konsentreres eventuelt og avsaltes ved dialyse, ultrafiltrering eller lignende, og tørkes så ved lyofilisering eller lignende for å oppnå en karsinostatisk substans TF-133a.

Den således oppnådde TF-133a har egenskapene vist i tabell 2.

(iii)-2) Den fraksjon som ikke er blitt eluert med en 0,2 M natriumklorid-fosfat-buffer, men som er blitt eluert med en 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer ved ione-bytte-behandlingen, innsamles på den følgende måte, hvilken er den samme som i ovennevnte (ii)-2) for å oppnå TF-133b. Det vil si at kolonnen pakket med ione-bytteren blir brakt i likevekt med en 0,3 M natriumklorid-fosfat-buEfer som fortrinnsvis har en pli på ca. 8, hvoretter den forannevnte 0,3 M natriumklorid-fosf at-bu f fer i den-vannløselige fraksjon oppnådd i (3) ovenfor eller den indre løsnings-komponent oppnådd ved å utsette den vannløselige fraksjon for dialyse eller ultrafiltrering, blir ført gjennom kolonnen, og den eluerte løsning blir innsamlet. Om nødvendig blir kolonnen vasket med den forannevnte 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer, og den eluerte løsning og vaskevæskene blir kombinert. Ione-bytte-behandlingen kan ut-føres flere ganger. Deretter føres en løsning fremstilt ved å fortynne den forannevnte eluerte løsning med en fosfat-puffer slik at natriumklorid-konsentrasjonen kan bli 0,2 M, gjennom en kolonne i hvilken ione-bytteren er brakt i likevekt med en 0,2 M natriumklorid-fosfat-buffer som fortrinnsvis har en pH

på ca. 8, og fraksjonen som er blitt eluert med den foran-

nevnte 0,2 M natriumklorid-fosfat-buffer, blir fjernet, hvoretter den forannevnte 0,3 natriumklorid-fosfat-buffer føres gejnnom kolonnen for oppnåelse av eluatet. I det konkrete eksempel på ovennevnte ione-bytte-behandling, blir en fraksjon som ikke er blitt adsorbert på en ione-bytter brakt i likevekt med forannevnte 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer, innsamlet, adsorbert på en ione-bytter brakt i likevekt med forannevnte 0,2 M natriumklorid-fosfat-buffer, vasket med forannevnte 0,2M natriumklorid-fosfat-buffer, og så eluert med forannevnte 0,3M natriumklorid-fosfat-buffer for oppnåelse av et eluat. Det kan også anvendes en metode hvorved derimot en fraksjon som er blitt adsorbert på en ione-bytter brakt i likevekt med forannevnte 0,2 M natriumklorid-fosfat-buffer, blir innsamlet, og hvor det deretter blir utført en fremgangsmåte for separering av nevnte fraksjon fra en fraksjon som er blitt adsorbert på en ione-bytter som er brakt i likevekt med forannevnte 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer, og en fraksjon som er blitt eluert med forannevnte 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer blir innsamlet.

Deretter blir eventuelt det po den ovenfor beskrevne måte oppnådde eluat konsentrert og avsaltet ved dialyse, ultrafiltrering eller lignende, og så tørket ved lyofilisering eller lignende for å oppnå den ønskede karsinostatiske substans TF-133b.

Den således oppnådde TF-133b har egenskapene vist i

tabell 2.

(iv) Den vannløselige fraksjon oppnådd i (3) ovenfor

eller den indre løsnings-komponent oppnådd i (4) ovenfor, blir tildannet i en 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer som fortrinnsvis har en pH på ca. 8, og den oppnådde buffer føres gjennom en ione-byttcr-kolonnc som på forhånd or blitt brakt i likevekt med en 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer som fortrinnsvis har en pH på ca. 8. Den eluerte løsning blir justert ved tilsetning av en fosfat-buffer slik at natriumklorid-konsentrasjonen kan bli 0,1 M, og blir så ført gjennom en ione-bytter-kolonne som på forhånd er brakt i likevekt med en 0,1 M natriumklorid-fosf at-buf f er som fortrinnsvis har en pH på ca. 3, og deretter føres forannevnte 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer gjennom nevnte kolonne, hvoretter den eluerte fraksjon innsamles, eventuelt konsentreres og avsaltes ved dialyse, ultrafiltrering

eller lignende, og tørkes så ved lyofilisering eller lignende for å oppnå en karsinostatisk substans TF-1323.

Den således oppnådde TF-1323 har egenskapene vist i

tabell 2.

(v) Den indre løsnings-komponent oppnådd i (4) ovenfor føres gjennom en kolonne med en ione-bytter brakt i likevekt med en fosfat-buffer som fortrinnsvis har en pH på ca. 8, og en 0,5 M natriumklorid-fosfat-buffer som fortrinnsvis har en pH på ca. 8, føres gjennom nevnte kolonne for å vaske kolonnen, og så føres en 0,6 M natriumklorid-fosfat-buffer som fortrinnsvis har en pH på ca. 8, gjennom nevnte kolonne, eller alternativt føres forannevnte 0,5 M natriumklorid-fosfat-buffer gjennom kolonnen, hvilken er blitt behandlet i (ii)-2) ovenfor og fremdeles har den gjenværende adsorberte komponent, hvoretter forannevnte 0,6 M natriumklorid-fosfat-buffer føres gjennom nevnte kolonne. Den eluerte fraksjon innsamles, konsentreres eventuelt og avsaltes ved dialyse, ultrafiltrering eller lignende, og tørkes så ved lyofilisering eller lignende for å oppnå en karsinostatisk substans TF-136.

Den således oppnådde TF-136 har egenskapene vist i

tabell 2.

(7) Innsamling av karsinostatisk substans TF-140.

Barium-ioner settes til kulturen eller dens overflytende fluidum oppnådd i (1) eller (2) ovenfor eller til den vann-løselige fraksjon oppnådd i (3) ovenfor eller til løsningen oppnådd ved oppløsning av TF-100 i vann, for å danne et bariumsalt, hvoretter utfelningen innsamles, og så utsettes for en fremgangsmåte for fjerning av bariumet, og den vannløselige fraksjon innsamles, og utsettes så for dialyse eller ultrafiltrering for å oppnå TF-140. Spesifikt forklart blir en vandig bariumhydroksyd-løsning, fortrinnsvis en 0,1-0,5 1

vandig bariumhydroksyd-løsning, satt til kulturen eller dens overflytende fluidum oppnådd i (1) eller (2) ovenfor eller til den vannløselige fraksjon oppnådd i (3) ovenfor eller til en vandig løsning oppnådd ved å oppløse TF-100 i vann i en mengde av ca. 10-15 ganger den av TF-100, og pH i den resulterende blanding justeres fortrinnsvis til 10-13 for å danne et bariumsalt. En utfelning blir avsatt ved tilsetningen av en barium-

hydroksyd-løsning, og den tilsatte mengde av barium-ioner blir fortrinnsvis justert slik at konsentrasjonen av de totale barium-ioner i det endelige volum av blandingen kan være 0,005 til 0,1 M. Den således oppnådde blanding filtreres, og en fremgangsmåte for separering av bariumet fra det oppnådde bariumsalt utføres. Bariumet fjernes fortrinnsvis ved tilsetning av bariumsaltet til natriumsulfat, fortrinnsvis en 5-15%-ig vandig natriumsulfat-løsning, røring av den reuslter-ende blanding og så utførelse av en filtreringsprosess for å oppnå en løsning. Utfelningen som er blitt separert og fjernet, blir igjen vasket med en vandig natriumsulfatløsning, og vaskevæskene blir kombinert med ovennevnte løsning. Den således oppnådde løsning utsettes for dialyse, ultrafiltrering eller lignende, for å fjerne overskuddet av natriumsulfat eller lavmolekylære substanser, og den resulterende løsning tørkes ved lyofilisering eller lignende for å oppnå en karsinostatisk substans TF-140.

Den således oppnådde TF-140 har egenskapene vist i

tabell 2.

(8) Innsamling av karsinostatisk substans TF-150.

Den vannløselige fraksjon oppnådd i (3) ovenfor eller

den indre løsning oppnådd i (4) ovenfor blir behandlet med et kvartært ammoniumsalt, og den dannede utfelning innsamles, og utsettes så for en dissosiasjons-prosess ved anvendelse av en løsning inneholdende natriumklorid, hvoretter et hydrofilt organisk løsningsmiddel tilsettes til den løselige fraksjon,

og den således dannede utfelning innsamles og tørkes så for å oppnå TF-150. Som kvartært ammoniumsalt som kan anvendes her, kan det vanligvis anvendes hvilket som helst kompleks med et polysakkarid, og spesielt foretrukne eksempler derav innbe-fatter cetyl-pyridinium-klorid, cety1-trimetyl-ammoniumbromid, etc. Behandlingen med et kvartært ammoniumsalt utføres fortrinnsvis i nærvær av en buffer såsom en borat-buffer eller lignende. En konkret beskrivelse av den ovennevnte behandling med et kvartært ammoniumsalt og dissosiasjons-prosessen ved anvendelse av en løsning inneholdende natriumklorid, er som følger. For eksempel blir en vandig løsning av et kvartært ammoniumsalt dråpevis satt til den vannløselige fraksjon opp-

nådd i (3) ovenfor eller den indre løsning oppnådd i (4) ovenfor mens pH holdes svakt basisk, og den resulterende blanding røres ved 0-50°C i 10 minutter til flere timer, hvoretter den avsatte utfelning innsamles. Utfelningen vaskes flere ganger med en buffer, fortrinnsvis en 0,1% borat-buffer, inneholdende 0,1 M av natriumklorid og en liten mengde av et kvartært ammoniumsalt, og dissosieres så med en buffer, fortrinnsvis en 0,1% borat-buffer, inneholdende 0,5 M med natriumklorid og en liten mengde av et kvartært ammoniumsalt for å oppnå en løselig fraksjon, og så justeres fortrinnsvis den løselige fraksjon til en pH på 2-6. Deretter tilsettes et hydrofilt organisk løsningsmiddel, fortrinnsvis en alkohol, til den løselige fraksjon slik at dens konsentrasjon til sist kan bli 50 til 90 volum?, fortrinnsvis 70 til 90 volum%, og den således oppnådde blanding hensettes ved 0 til 30°C i flere timer til 90 timer, hvoretter den avsatte utfelning innsamles for å oppnå en karsinostatisk substans TF-150.

Den således oppnådde TF-150 har egenskapene vist i tabell 2.

I tabell 2 ble det for Sephadex G-50 merket " *" anvendt en kolonne på 50mmø x 600 mm og destillert vann som elueringsmiddel; for Sephadex G-200 (registrert varemerke for Pharmacia Co., Ltd.) merket "<**>" ble det anvendt en kolonne på 44 mmø x 500 mm for TF-110, 120, 132a, 133a, 136 og 140, og en kolonne på 21 mmø x 400 mm for TF-1316, 132b, 133b, 1323 og 150, og som elueringsmiddel ble det anvendt en 0,1 M fosfatpbuffer med en pH på 7 for alle sammen, og ved oppnåelse av et flytende kromatogram, merket ''<***>" med høy ytelse ble det anvendt en kolonne på 7,9 mmø x 600 mm x 2 av TSK-GEL G300SW (varenavn fra Toyo Soda Co., Ltd.), og elueringen ble utført ved romtemperatur med en strømningshastighet på 0,8 ml/min. ved anvendelse av 0,1 M fosfat-buffer med en pH på 7 som elueringsmiddel.

De farmakologiske aktiviteter til nærværende karsinostatiske substanser TF-100, TF-110, TF-120, TF-1316, TF-132a, TF-132b, TF-133a, TF-133b, TF-1323, TF-140 og TF-150 er som følger: (I) ' Effekt av TF-substanser på celle-vaibilitet (koloni-dannelse-forsøk).

Basert på metoden til Kim. J. H. et al. [Cancer Res. 25, 698 (1965)], ble HeLa S-3 celler dyrket i ørn' s MEM supplert med 10% kalve-serum i 3-5 dager ved 37°C, C02~inkubator, hvoretter kulturen ble fjernet, og en PBS(-)løsning (en vandig løsning inneholdende 8,0 g/l med natriumklorid, 0,2 g/l med kaliumklorid, 1,15 g/l med natriumfosfat, monobasis, og 0,2 g/l med kaliumfosfat, dibasisk) inneholdende 0,01 vekt% etylen-diamintetra-eddiksyre og 0,1 vekti trypsin ble tilsatt til de glass-tilklebende celler. Cellene ble strippet fra glass-overflaten på kultur-flasken, og ble dissosiert til enkle celler ved pipettering, og så ble celle-antallet opptelt med mikroskop. Celle-suspensjonen ble fortynnet med ørn's MEM supplert med 20% kalve-serum slik at den kunne inneholde 200 celler pr. ml. Etter at 1 ml av celle-suspensjonen var innpodet på petri-skåler og var dyrket i CC^-inkubator ved 37°C

i 24 timer, ble det overflytende fluidum oppnådd i eksempel 1 (1), som omtales senere, tilsatt til celle-suspensjonen slik at konsentrasjonen ble 1/16 til 1/128. Og til hver av 1 ml's porsjoner av celle-suspensjonen dyrket ved 37°C i 24 timer,

ble hver av test-substansene tilsatt, og HeLa-cellene ble i hvert tilfelle dyrket i 7 dager. Etter dyrkingen ble kultur-mediet fjernet, hvoretter kultur-skålene ble vasket med Hank's løsning, og cellene ble fiksert med 70 vekt% etanol, og så vasket med 100 vekt% etanol. Etter at etanolen var fjernet ble cellene flekket med en Gimsa flekkeløsning, hvoretter koloniene ble opptelt, og celleviabiliteten ble beregnet.

Resultatene er. vist i tabellene 3 og 4. Celle-viabili-teten i tabellene ble beregnet fra den følgende ligning. Celleviabiliteten for hver test-substans er angitt med en gjennom-snittlig verdi av 5 reproduksjoner.

Som det klart fremgår av dette eksempel, gir de heri fremstilte TF-substansene svært lav cytoksidal effekt på

HeLa cellene, sammenlignet med det overflytende fluidum.

(II) Immunostimulerende aktivitet.

Det ble anvendt fire mus av ICR-stamme i hver gruppe. Hver av testsubstansene ble oppløst i 0,2 ml av en fysiologisk saltløsning, og ble så administrert intraperitonealt til musene. 24 timer etter administreringen ble 0,2 ml av en karbon-suspensjon fremstilt ved å blande 1 ml av Perikan tegne-blekk 17 svart (fremstilt av Gunter-WagnerCo., Ltd.) og 2 ml av en fysiologisk saltløsning inneholdende 3 vekt% gelatin, intravenøst injisert i musehalen, og 1, 5, 10 og 15 minutter etter injiseringen ble 0,02 ml av blodet innsamlet fra øye-hulen ved anvendelse av et hematokritt kapillar belagt med heparin, og ble øyeblikkelig fortynnet og hemolysert med 1,6 ml av en 0,1 vekt% vandig natriumkarbonatløsning. Denne suspensjon ble utsatt for kolorimetri ved 675 nm, og den fago-cytotiske indeks, nemlig K-verdien, ble bestemt fra ligningen til Halpern et al.

Til musene i sammenligningsgruppen ble det administrert 0,2 ml av en fysiologisk saltløsning.

hvor CQ = karbon-pulver-innhold i blod ved tiden t , og C = karbon-pulver-innhold i blod ved tiden t.

Resultetene er vist i tabellene 5 til 7.

Som det tydelig fremgår av tabellene 5-7, fremviste

de grupper hvortil hver av de fremstilte TF-substansene ble administrert, aktiveringen av reticuloendotelial makrofager sammenlignet med sammenligningsgruppen, og den cellulære immunitet til de normale mus ble øket.

(III) Karsinostatisk aktivitet.

(a) Antitumor-aktivitet mot Ehrlich-ascites-tumor.

Ehrlich-ascites-tumor-celler ble intraperitonealt innpodet i mus (hunner, 6 uker gamle) av ICR-stamme i en mengde av 1 x <1>0^ celler pr. mus. Deretter ble hver av test-substansene oppløst i 0,2 ml av en fysiologisk saltløsning, og så administrert intraperitonealt til musene én gang om dagen gjentatt i 7- dager fra den første dag etter innpodingen av tumor-cellene, eller én gang om dagen på den første dag og fra dert tredje dag til den syvende dag i tilsammen seks dager. Når det dreier seg om test-substansene, i tabell 9, ble hver av dem administrert til musene én gang om dagen på den første dag og fra den tredje dag til den syvende dag i tilsammen seks dager etter innpodingen av tumor-cellene. Til sammenligningsgruppen ble det administrert 0,2 ml av en fysiologisk salt-løsning på samme måte som ovenfor.

Resultatene er som vist i tabellene 8 og 9.

Som det fremgår av tabellene 8 og 9, foregikk det med

den gruppe hvortil hver av de fremstilte TF-substansene ble administrert, en liv-forlengende effekt, i forhold til sammenligningsgruppen.

(b) Antitumor-aktivitet mot Ehrlich--f aststof f-tumor .

(1) Ehrlich-tumor-celler ble subkutant transplantert ved armhulen på mus av ICR-stamme (hunner, 6 uker gamle) i en mengde på 4 x 10 cceller pr. mus. Deretter ble hver av test-substansene administrert til musene én gang om dagen gjentatt i 7 dager fra den første dag etter transplantasjonen av tumor-cellene, eller én gang om dagen på den første dag og fra den tredje dag til den syvende dag i ialt 6 dager. Til sammenligningsgruppen ble administrert 0,2 ml av en fysiologisk salt-løsning på samme måte som beskrevet ovenfor. Vektene av tumorene ble bestemt på den 11. eller 14. dag etter transplantasjonen av tumor-cellene. Vektene av tumorene ble bestemt ved å måle den lengste diameter (a) mm og den korteste diameter (b) mm ved hjelp av krumpassere, og foreta beregning fra den følgende ligning:

Resultatene er vist i tabell 10..

(2) Ehrlich-tumor-celler ble transplantert subkutant ved armhulen på mus av ICR-stamme (hunner, 6 uker gamle) i en mengde på o 4 x 10 6celler pr. mus. Deretter ble hver av test-substansene administrert til musene som var oppdelt i grupper for intravenøs administrasjon, intraperitoneal administrasjon, subkutan administrasjon og intramuskulær administrasjon, med en dose på 10 mg/kg eller 20 mg/kg én gang om dagen på den første dag og fra den tredje dag til den syvende dag, i alt i 6 dager, etter transplantasjonen av tumor-cellene. Til sammenligningsgruppen ble administrert 0,2 ml av en fysiologisk salt-løsning på samme måte som ovenfor. Vektene av tumorene ble bestemt på den 13. dag etter transplatasjonen av tumor-cellene.

Resultatene er vist i tabell 11.

Som det klart fremgår av tabellene 10 og 11, iakttas

det en tumor-vekst-inhiberende effekt i de grupper hvortil hver av de fremstilte TF-substansene var administrert.

(c) Antitumor-aktivitet mot Sarcoma-180 carcinoma. Sarcoma-180 carcinoma ble transplantert intraperitonealt til mus av ICR-stamme (hunner, 6 uker gamle) i en mengde på 1 x 10~* celler pr. mus. Deretter ble hver av test-substansene administrert intraperitonealt til musene med en dose på 1 mg/ kg, 5 mg/kg eller 10 mg/kg én gang om dagen gjentatt fra den første dag til den syvende dag, i alt 7 dager, etter transplantasjonen av tumor-cellene, eller én gang om dagen nå den første dag og fra den tredje dag til den syvende dag, i alt 6 dager. Til sammenligningsgruppen ble det administrert 0,2 ml av en fysiologisk salt-løsning på samme måte som ovenfor.

Resultatene er vist i tabell 12.

Som det klart fremgår av tabell 12, hadde de grupper hvortil hver av de fremstilte TF-substansene var administrert, antitumor-aktiviteter, sammenlignet med sammenligningsgruppen.

(d) Antitumor-aktivitet mot B-16 melanoma.

(1) B-16 melanoma tumor-celler ble transplantert subkutant ved armhulen på mus av BDF,-stamme (hanner, 7 uker gamle) i en mengde på 1 x 10 celler pr. mus. Deretter ble det intraperitonealt administrert TF-133a til musene i en dose på 5 mg/ kg eller 10 mg/kg én gang om dagen på den første dag og fra den tredje dag til den syvende dag, i alt 6 dager, etter transplantasjonen av tumor-cellene. På samme måte som ovenfor ble det administrert 0,2 ml av en dysiologisk salt-løsning til sammenligningsgruppen, og 20 mg/kg av 5-FU til gruppen for 5-FU administrasjon.

Resultatene er vist i tabell 13.

Som det klart fremgår av tabell 13, hadde de grupper hvortil TF-133a var administrert, en tydelig tumor-vekst-inhiberende aktivitet, i forhold til sammenligningsgruppen, og de grupper hvortil hver av 5 mg/kg og 10 mg/kg av TF-133a var administrert, hadde henholdsvis lik og mer bemerkelsesverdig tumor-vekst-inhiberende aktivitet, sammenlignet med den gruppe hvortil 5-FU var administrert.

(2) Transplantasjonen av B-16 melanoma tumor-celler og administreringen av TF-132a, TF-133a, 5-FU og en fysiologisk salt-løsning ble utført på samme måte som i (1) ovenfor. På den 21. dag etter transplantasjonen av tumor-cellene, ble

musene dissekert, og metastasien for melanoma tumor-cellene på lungene ble observert.

Resultatene er vist i tabell 14.

Som det klart fremgår av tabell 14, var, i de grupper hvortil hver av TF-132a og TF-133a var administrert, meta-stasisen av B-16 melanoma tumor-celler bemerkelsesverdig inhibert, sammenlignet med gruppen hvortil 5-FU var administrert .

(IV) Akutt toksisitet.

LD,.„ for mus er vist i tabell 15.

50

Som det klart fremgår av de ovenfor omtalte farmako-forsøk, er de fremstilte TF-substansene

nyttige som karsinostatiske midler, de kan forventes å ha aktiviteter mot forskjellige cancerøse sykdommer og kan forventes å ha bemerkelsesverdige aktiviteter mot spesielt faststoff-cancere. Alle TF-substansene i henhold til denne oppfinnelse har utmerkede virkninger, selv om TF-130, spesielt, 132a, 132b, 133a, 133b og 1323 er foretrukket når forskjellige punkter betraktes.

TF-substansene som her fremstilles, kan an-

vendes etter at de er formet til forskjellige farmasøytiske former såsom orale medikamenter, injeksjoner, suppositorier eller lignende, selv om de fortrinnsvis anvendes i form av en farmasøytisk injeksjon. Når de anvendes som orale medikamenter, kan de orale medikamenter inneholde forskjellige inerte form-givningsmidler, og kan være formet som kapsler, tabletter, pulvere eller granuler. Når de anvendes som injeksjoner, kan de være hvilken som helst av subkutane injeksjoner, intramusku-lære injeksjoner og intravenøse injeksjoner, og de kan anvendes i form av en suspensjon, en løsning eller et pulver som blir oppløse ved anvendelse. Injeksjonene kan inneholde et lokalt bedøvelsesmiddel.

Dosen av de fremstilte TF-substansene

velges riktig i avhengighet av tilstanden til pasienten, selv om det vanligvis er ønskelig å administrere dem i en dose for en voksen på 0,01 til 50 mg/kg én gang om dagen eller flere ganger om dagen, og med hensyn til administrasjonsmåte, så administreres den fortrinnsvis ved subkutan, intramuskulær eller intravenøs injeksjon eller ved injeksjon i den angrepne del.

Denne oppfinnelse blir ytterligere forklart nedenfor idet det vises til eksempler og de medfølgende tegninger, hvor fig.

1 viser et mikroskopisk fotografi som viser den form av Fusobacterium nucleatum TF-031 som anvendes ved denne op<p>finnelse, fig. 2 viser et infrarødt absorpsjonsspektrum av den karsinostatiske substans TF-100, fig. 3 viser et ultrafiolett absorpsjonsspektrum av nevnte substans, fig. 4 viser et elusjonsmønster oppnådd når nevnte substans var utsatt for gel-filtrering ved anvendelse av Sephadex G-50, fig. 5 viser et væske-kromatogram med høy ytelse, fig. 6 viser et infrarødt absorpsjonsspektrum av den karsinostatiske substans TF-110, fig. 7 viser et ultrafiolett absorpsjonsspektrum av nevnte substans, fig. 8 viser et elusjonsmønster oppnådd når nevnte substans var utsatt for gel-filtrering ved anvendelse av Sephadex G-200, fig. 9 viser et væske-kromatogram med høy ytelse av nevnte substans, fig. 10 viser et infrarødt absorpsjonsspektrum av den karsinostatiske substans TF-120, fig. 11 viser et ultrafiolett adsorpsjons-spektrum av nevnte substans, fig. 12 viser et elusjonsmønster oppnådd når nevnte substans ble utsatt for gel-filtrering ved anvendelse av Sephadex G-200, fig. 13 viser et væske-kromatogram med høy ytelse av nevnte substans, fig. 14 viser et infra-rødt absorpsjonsspektrum av den karsinostatiske substans TF-1316, fig. 15 viser et ultrafiolett absorpsjonsspektrum av nevnte substans, fig. 16 viser et elusjonsmønster oppnådd når nevnte substans ble utsatt for gel-filtrering ved anvendelse av Sephadex G-200, fig. 17 viser et væske-kromatogram med høy ytelse av nevnte substans, fig. 18 viser et infrarødt absorpsjonsspektrum av den karsinostatiske substans TF-132a, fig. 19 viser et ultrafiolett absorpsjonsspektrum av nevnte substans, fig. 20 viser et elusjonsmønster oppnådd når nevnte substans ble utsatt for gel-filtrering ved anvendelse av Sephadex G-200, fig. 21 viser et væske-kromatogram med høy ytelse av nevnte substans, fig. 22 viser et infrarødt absorpsjonsspektrum av den karsinostatiske substans TF-132b, fig. 23 viser et ultrafiolett absorpsjonsspektrum av nevnte substans, fig. 24 viser et elusjonsmønster oppnådd når nevnte substans ble utsatt for gel-filtrering ved anvendelse av Sephadex G-200, fig. 25 viser et væske-kromatogram med høy ytelse av nevnte substans, fig. 26 viser et infrarødt absorpsjonsspektrum av den karsinostatiske substans TF-133a, fig. 27 viser et ultrafiolett absorpsjons-spektrum av nevnte substans, fig. 28 viser et elusjonsmønster oppnådd når nevnte substans ble utsatt for gel-filtrering ved anvendelse av Sephadex G-200, fig. 29 viser et væske-kromatogram med høy ytelse av nevnte substans, fig. 30 viser et infrarødt absorpsjonsspektrum av den karsinostatiske substans TF-133b, fig. 31 viser et ultrafiolett absorpsjons-spektrum av nevnte substans, fig. 32 viser et elusjonsmønster oppnådd når nevnte substans ble utsatt for gel-filtrering ved

anvendelse av Sephadex G-200, fig. 33 viser et væske-kromatogram med høy ytelse av nevnte substans, fig. 34 viser et infra-rødt absorpsjonsspektrum av den.karsinostatiske substans TF-1323, fig. 35 viser et ultrafiolett absorpsjonsspektrum av nevnte substans, fig. 36 viser et elusjonsmønster oppnådd på nevnte substans ble utsatt for gel-filtrering ved anvendelse av Sephadex-200, fig. 37 viser et væske-kromatogram med høy ytelse for nevnte substans, fig. 38 viser et infrarødt absorpsjonsspektrum av den karsinostatiske substans TF-136, fig. 39 viser et ultrafiolett absorpsjonsspektrum av nevnte substans, fig. 40 viser et elusjonsmønster oppnådd når nevnte substans ble utsatt for gel-filtrering ved anvendelse av Sephadex G-200, • fig. 41 viser et væske-kromatogram med høy ytelse av nevnte substans, fig. 42 viser et infrarødt absorpsjonsspektrum av den karsinostatiske substans TF-140, fig. 43 viser et ultrafiolett absorpsjonsspektrum av nevnte substans, fig. 44 viser et elusjonsmønster oppnådd når nevnte substans ble utsatt for gel-filtrering ved anvendelse av Sephadex G-200, fig. 45 viser et væske-kromatogram med høy ytelse av nevnte substans, fig. 46 viser et infrarødt absorpsjonsspektrum av den karsinostatiske substans TF-150, fig. 47 viser et ultrafiolett absorpsjons-spektrum av nevnte substans, fig. 48 viser et elusjonsmønster oppnådd når nevnte substans ble utsatt for gel-filtrering ved anvendelse av Sephadex G-200 og fig. 49 viser et væske-kromatogram med høy ytelse av nevnte substans.

Eksempel 1

(1) I hver av 15 to-liters kulturflasker som hver var for-synt med en skrukork, ble det anbrakt 2 liter av et kultur-medium inneholdende 34 g trypticase-pepton, 6 g fyton-pepton, 20 g proteose-pepton, 70 g hjerne-hjerte-infusjon, 6 g gjær-ekstrakt, 15 g natriumklorid, 12 g glukose, 10 g laktose,

0,5 g L-cystin, 0,2 g natriumsulfitt, 1,0 g natriumtioglykolat og 1,4 g agar og kulturmediet ble justert til en pH på 7. Kulturmediet ble sterilisert under 1,2 atm. ved 120°C i 15 minutter, ble varmet i kokende vannbad i 20 minutter, og deretter umiddelbart vannavkjølt, hvoretter en forkultur-lrtsning av Fusobacterium nucleatum TF-031, på forhånd fremstilt ved dyrking i et kulturmedium med den samme sammensetning som

ovenfor, ble innpodet i det ovennevnte vannavkjølte kultur-medium under sterile forhold i en mengde av 100 ml pr. kulturflaske, og ble utsatt for stabil dyrking i en inkubator ved 37°C i 48 timer. Etter at dyrkingen var fullført, ble kulturen sentrifugert for fjerning av organismer ved 4000 o.p.m. ved 5°C i 20 minutter. Den oppnådde mengde med overflytende fluidum, var ca. 27 liter. (2) Til det overflytende fluidum oppnådd i (1) ovenfor ble det satt 40 liter etanol under omrøring ved 5°C, og den resulterende blanding ble hensatt ved lav romtemperatur inntil den amorfe utfelling var fullstendig avsatt. Deretter ble blandingen sentrifugert ved 6000 o.p.m. ved 5°C i 15 minutter, og utfelningen ble innsamlet, vasket med etanol og så tørket under redusert trykk for å oppnå ca. 60 g med urenset pulver. (3) I 120 ml vann ble det oppløst 20 g av det urensede pulver oppnådd i (2) ovenfor, og de vannuløselige materialer som ble dannet ved denne tid, ble fjernet ved sentrifugering ved 7500 o.p.m. i 10 minutter, hvoretter den således oppnådde vannløselige fraksjon ble kombinert med vaskevæskene oppnådd ved å vaske de vannuløselige materialer to ganger med 60 ml's porsjoner av vann, og den resulterende løsning ble tørket under redusert trykk for å oppnå 14 g av gråaktig hvitt-lysebrunt pulver av TF-100.

Eksempel 2

Løsningen beskrevet i eksempel l-(3), som var fremstilt ved å kombinere den vannløselige fraksjon fri fra de vann-uløselige materialer med vaskevæskene oppnådd ved å vaske de vannuløselige materialer, ble utsatt for ultrafiltrering ved anvendelse av et hulfibertype-ultrafiltreringssystem (membran nr. HI-1: fremstilt av Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha), og den indre løsning ble utsatt for lyofilisering

for å oppnå 10 g med gråaktig hvitt-lysebrunt pulver av TF-110.

Eksempel 3

I en liten mengde vann ble det o<p>pløst 10 g av pulveret oppnådd i eksempel 2, og den resulterende løsning ble satt til en kolonne fylt med dietylaminoetyl-Sephadex A-50 brakt i likevekt med en 0,025 M fosfat-buffer med en pH på 8, og den eluerte løsning ble innsamlet. Videre ble 2,5 liter av den samme fosfat-buffer som ovenfor, ført gjennom kolonnen, og den eluerte løsning som ble oppnådd ble kombinert med den tidligere innsamlede eluerte løsning, hvoretter den resulterende løsning ble avsaltet ved anvendelse av et hulfibertype-ultrafiltreringssystem (membran nr. HI-1), konsentrert under redusert trykk og så utsatt for lyofilisering for å oppnå

470 mg med gråaktig hvitt-lysebrunt pulver av TF-120.

Eksempel 4

I 24 ml vann ble det oppløst 2 g av pulveret oppnådd i eksempel l-(2), og de vannuløselige materialer ble fjernet ved sentrifugering ved 7500 o.p.m. i 10 minutter. Den vann-løselige fraksjon ble dialysert natten over mot destillert vann ved 5°C ved anvendelse av et cellofanrør, og den indre løsning ble konsentrert under redusert trykk. Deretter ble den konsentrerte løsning satt til en kolonne fylt med 150 ml dietylaminoetyl-Sephadex A-50, som på forhånd var brakt i likevekt med en 0,025 M fosfat-buffer med en pH på 8, og kolonnen ble vasket ved å føre gjennom den 600 ml av en 0,025 M fosfat-buffer med en pH på 8, hvoretter en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,6 M og en pH

på 8 ble ført gjennom kolonnen for å oppnå et eluat. Eluatet ble konsentrert under redusert trykk til ca. 100 ml, dialysert mot destillert vann ved 5°C, igjen konsentrert under redusert trykk, avsaltet ved anvendelse av en kolonne med Sephadex G-25, og så utsatt for lyofilisering for å oppnå 470 med gråaktig hvitt-lysebrunt TF-1316.

Eksempel 5

Løsningen beskrevet i eksempel l-(3) som ble fremstilt ved å kombinere den vannløselige fraksjon som var fri for vannuløselige materialer, og vaskevæskene oppnådd ved å vaske de vannuløselige materialer, ble dialysert natten over mot destillert vann ved 5°C ved anvendelse av et cellofanrør, og den indre løsning ble konsentrert under redusert trykk. Den konsentrerte løsning ble så tilsatt til en kolonne fylt med 50 g dietylaminoetyl-Sephadex A-50, som på forhånd var brakt

1 likevekt med en 0,025 M fosfat-buffer med en pH på 8, og

2 liter av en 0,025 M fosfat-buffer med en pH på 8 og 2,5

liter av en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,1 M og en pH på 8, ble suksessivt ført gjennom kolonnen, hvoretter 2,5 liter av en 0,025 M fosfat-

buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,2 og en pH på 8 ble ført gjennom kolonnen for å eluere den aktive substans adsorbert på kolonnen, og den oppnådde eluerte løsning ble avsaltet ved anvendelse av et hulfibertype-ultrafiltreringssystem (membran nr. HI-1), og så utsatt for lyofilisering for å oppnå 600 mg med gråaktig hvitt-lysebrunt pulver av TF-132a.

Eksempel 6

I 1,2 liter av en 0,025 M fosfat-buffer med en natrium-klor id-konsentras jon på 0,3 M og en pH på 8, ble det oppløst 44,2 g av pulveret oppnådd i eksempel l-(2), og de suspenderte uløselige materialer ble fjernet ved filtrering ved anvend-

else av Hyflo Super Cel, hvoretter det oppnådde filtrat ble tilført til en kolonne med diameter på 33 cm som var fylt med 500 ml dietylamino-etyl-Sephadex A-50, som på forhånd var brakt i likevekt med en 0,025 .M f osfat-buf f er med en natriumklorid-konsentras jon på 0,3 M og en pH på 8, og den eluerte løsning ble innsamlet. Kolonnen ble vasket med en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,3 M pg en pH på 8, og vaskevæskene ble kombinert med den ovennevnte eluerte løsning for å oppnå 1,67 liter av en løsning. Løs-

ningen ble igjen tilført til en kolonne med diameter på 8 cm som var fylt med 400 ml dietylaminoetyl-Sephadex A-50, som på forhånd var brakt i likevekt med en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,3 M og en pH på 8 for å oppnå 1,68 liter av en eluert løsning. Kolonnen ble vasket med en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,3 M og en pH på 8 for å oppnå 1,64 liter med vaskevæsker.

Den eluerte løsning og vaskevæskene ble kombinert, og en

0,025 M fosfat-buffer med en pH på 8 ble satt dertil for å

oppnå 4,98 liter av en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentras jon på 0,2 M og en pH på 8. Den således oppnådde buffer-løsning ble påført på en kolonne med en diameter på

8 cm som var fylt med 500 ml dietylaminoetyl-Sephadex A-50, som på forhånd var brakt i likevekt med en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,2 M og en pH

på 8, og kolonnen ble vasket med 2 liter av en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,2 M og en pH på 8. Til 7 liter av en løsning fremstilt ved å kombinere vaskevæskene med den eluerte løsning, ble det satt en 0,025 M fosfat-buffer med en pH på 8 for å oppnå 14 liter av en 0,025

M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,1 M

og en pH på 8. Den således oppnådde eluerte løsning ble til-ført til en kolonne med en diameter på 8 cm som var fylt med 500 ml dietylaminoetyl-Sephadex A-50, som på forhånd var brakt i likevekt med en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentras jon på 0,1 M og en pH på 8, og den eluerte løsning ble fjernet. Kolonnen ble vasket med 2 liter av en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,1 fl og en pH på 8, hvoretter 2 liter av en 0,025 fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,2 M og en pH på 8 ble ført gjennom kolonnen, og den eluerte løsning ble innsamlet. Den eluerte løsning ble konsentrert og avsaltet ved anvendelse av et ultrafiltreringssystem (anvendt filter: Toyo Ultrafilter UK-10), videre avsaltet ved anvendelse av en Sephadex G-25 kolonne, avfarget med aktivt karbon og så utsatt for lyofilisering for å oppnå 880 mg av gråaktig hvitt-lysebrunt pulver av TF-132b.

Eksempel 7

I en liten mengde vann ble det oppløst 10 g av pulveret oppnådd i eksempel 2, og den resulterende løsning ble tilfrtrt til en kolonne fylt med dietyl-aminoetyl-Sephadex A-50 som på forhånd var blitt brakt i likevekt med 0,025 M fosfat-buffer med en pH på 8. Deretter ble 5 liter av en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,2 M og en pH

på 8 ført gjennom kolonnen, hvoretter 2,5 liter av en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,3 M og en pH på 8 ble ført gjennom kolonnen for å eluere den aktive substans adsorbert på kolonnen, og den oppnådde eluerte løsning ble konsentrert under redusert trykk. Den konsentrerte løsning ble avsaltet ved anvendelse av et cellofanrør, ble fullstendig avsaltet ved anvendelse av Sephadex G-25 og så utsatt for

lyofilisering for å oppnå 600 mg med gråaktig hvitt-lysebrunt pulver av TF-133a.

Eksempel 8

I 1,2 liter av en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentras jon på 0,3 M og en pH på 8, ble det oppløst 44,2 g av pulveret oppnådd i eksempel l-(2), og de suspenderte uløselige materialer ble fjernet ved filtrering ved anvendelse av Hyflo Super Cel, hvoretter det oppnådde filtrat ble tilført til en kolonne med en diameter på 3 3 cm som var fylt med 500 ml dietylaminoetyl-Sephadex A-50, som på forhånd var brakt i likevekt med en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentras jon på 0,3 M og eh pH på 8, og den eluerte løsning ble innsamlet. Kolonnen ble vasket med en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,3 M og en pH

på 8, og vaskevæskene ble kombinert med den forannevnte eluerte løsning for å oppnå 1,67 liter av en løsning. Løs-ningen ble igjen tilført til en kolonne med diameter på 8 cm som var fylt med 40 ml dietylaminoetyl-Sephadex A-50 som på forhånd var brakt i likevekt med en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,3 M og en pH på 8, for å oppnå 1,68 liter av en eluert løsning. Kolonnen ble vasket med en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,3 M og en pH på 8 for å oppnå 1,64 liter med vaskevæsker. Den eluerte løsning og vaskevæskene ble kombinert, og en 0,025 M fosfat-buffer med en pH på 8 ble satt dertil for å oppnå 4,98 liter av en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentras jon på 0,2 M og en pH på 8. Den eluerte løsning som således ble oppnådd ble tilført til en kolonne med en diameter på 8 cm som var fylt med 500 ml dietylamino-etyl-Sephadex A-50 som på forhånd var brakt i likevekt med en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,2 M og en pH på 8, og kolonnen ble vasket med en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,2 M og en pH på 8, hvoretter 2 liter av en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,3 M og pH på 8 ble ført gjennom kolonnen, og den eluerte løsning ble innsamlet. Den eluerte løsning ble konsentrert og avsaltet ved anvendelse av et ultrafiltreringssystem (anvendt filter: Toyo Ultrafilter

UK-10), videre avsaltet ved anvendelse av en Sephadex G-25 kolonne, avfarget med aktivt karbon og så utsatt for lyofilisering for å oppnå 590 mg med gråaktig hvitt-lysebrunt pulver av TF-133b.

Eksempel 9

(1) I 120 ml vann ble det oppløst 20 g av det urensede pulver oppnådd i eksempel l-(2), og de ved denne tid dannede uløse-lige materialer ble fjernet ved sentrifugering ved 7500 o.p.m. i 10 minutter, hvoretter den således oppnådde vannløselige fraksjon og vaskevæskene oppnådd ved å vaske de vannuløselige materialer to ganger med 60 ml's porsjoner med vann, ble kombinert, og så utsatt for ultrafiltrering ved anvendelse av et hulfibertype-ultrafiltreringssystem (membran nr. HI-1), og den indre løsning ble utsatt for lyofilisering for å oppnå

10 g med gråaktig hvitt-lysebrunt pulver.

(2) I 1 liter av en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentras jon på 0,3 M og en pH på 8 ble det oppløst 25 g av pulveret oppnådd ved behandlingen i (1) ovenfor, og den resulterende løsning ble tilført til en kolonne med en diameter på 33 cm som var fylt med 500 ml dietylaminoetyl-Sephadex A-50 som på forhånd var brakt i likevekt med en

0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,3 M og en pH på 8. Kolonnen ble på lignende måte vasket med en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,3 M og en pH på 8, og den eluerte løsning og vaskevæskene ble kombinert for å oppnå 1,6 liter av en blanding. Blandingen ble tilført til en kolonne med diameter på 8 cm

som var fylt med 400 ml dietyl-aminoetyl-Sephadex A-50 som på samme måte var brakt i likevekt med en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,3 M og en pH på 8

for å oppnå 1,65 liter av en eluert løsning. Den eluerte løsning ble kombinert med 1,7 liter av vaskevæskene oppnådd ved å vaske kolonnen med en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,3 M og en pH på 8, og den resulterende blanding ble fortynnet med en 0,025 M fosfat-buffer med en pH på 8 for å fremstille 10,35 liter av en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,1 M og en pH på 8.

Deretter ble den således oppnådde buffer-løsning påført på en kolonne med diameter på 8 cm som var fylt med 500 ml dietylaminoetyl-Sephadex A-50 som på forhånd var brakt i likevekt med en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentras jon på 0,1 M og en pH på 8, og kolonnen ble vasket med 2 liter av en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentras jon på 0,1 M og en pH på 8, hvoretter 2 liter av en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på 0,3 M og en pH på 8 ble ført gjennom kolonnen, og de eluerte løsninger ble innsamlet. Den oppnådde eluerte løsning ble avsaltet og konsentrert ved anvendelse av et ultrafiltreringssystem (anvendt filter: Toyo Ultrafilter UK-10), og videre avsaltet på Sephadex G-25, avfarget med aktivt karbon, og så utsatt for lyofilisering for å oppnå 1,65 g med gråaktig hvitt-lysebrunt pulver av TF-1323.

Eksempel 10

I en liten mengde vann ble det oppløst 10 g av pulveret oppnådd i eksempel 2, og den resulterende løsning ble påført på en kolonne som var fylt med dietylaminoetyl-Sephadex A-50 som på forhånd var blitt brakt i likevekt med en 0,025 M fosfat-buffer med en pH på 8. Deretter ble 6 liter av en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentrasjon på

0,5 M og en pH på 8 ført gjennom kolonnen, hvoretter 2,5

liter av en 0,025 M fosfat-buffer med en natriumklorid-konsentras jon på 0,6 M og en pH på 8 ble ført gjennom kolonnen for å eluere den aktive substans adsorbert på kolonnen, og den oppnådde gjennomgangsløsning ble avsaltet ved anvendelse av et hulfibertype-ultrafiltreringssystem (membran nr. HI-1), konsentrert under redusert trykk og så utsatt for lyofilisering for å oppnå 130 mg med gråaktig hvitt-lysebrunt pulver av TF-136.

Eksempel 11

I 200 ml vann ble det oppløst 15 g av det urensede pulver oppnådd i eksempel l-(2), og de vannuløselige materialer ble fjernet ved sentrifugering ved 7500 o.p.m. i 10 minutter, hvoretter den således oppnådde vannløselige fraksjon ble justert til pH 10 ved dråpevis tilsetning dertil av en 0,2 M vandig bariumhydroksyd-løsning. Hvit utfelning ble avsatt ved tilsetningen av den vandige bariumhydroksyd-løsning. Barium-ioner ble tilsatt slik at den totale konsentrasjon av barium-ioner i det endelige volum var 0,01 M, hvoretter løs-ningen ble rørt i 30 minutter og utfelningen ble innsamlet ved filtrering. Den således oppnådde utfelning av bariumsalt ble suspendert i 10 ml av en 10 vekt% vandig natriumsulfat-løsning, ble tilstrekkelig omrørt og så filtrert og filtratet ble innsamlet. Utfelningen ble igjen suspendert, rørt og så filtrert på samme måte som ovenfor, én gang med 10 ml av en 10 vekt% vandig natriumsulfat-løsning og to ganger med 5 ml's porsjoner av nevnte løsning og hvert filtrat ble innsamlet. Videre ble den gjenværende utfelning basket to ganger med

10 ml's porsjoner av vann og så filtrert for å oppnå vaskevæskene. Det ovennevnte innsamlede filtrat og vaskevæskene ble kombinert, dialysert mot destillert vann, konsentrert unde redusert trykk og så utsatt for lyofilisering for å oppnå

0,45 g med gråaktig hvitt-lysebrunt pulver av TF-140.

Eksempel 12

I 450 ml vann ble det oppløst 32 g av pulveret oppnådd

i eksempel l-(2), og de suspenderte uløselige materialer ble fjernet ved filtrering ved anvendelse av Hyflo Super Cel, hvoretter det oppnådde filtrat ble dialysert natten over mot rennende vann ved anvendelse av et cellofan-rør. Til den dialyserte løsning ble det dråpevis satt 80 ml av en 20 vekt% vandig cetylpyridiniumklorid-løsning under omrøring mens det dertil ble satt 200 ml av en 10 vekt% borat-buffer (pH 9,0), og den resulterende blanding ble rørt ved romtemperatur i 30 minutter, hvoretter utfelningen ble innsamlet ved filtrering. Utfelningen ble suspendert i 150 ml av en 0,1 vekt% borat-buff<

(pH 9,0) inneholdende 0,1 M natriumklorid og 0,2 vekt% cetylpyridiniumklorid, og den resulterende suspensjon ble rørt i 30 minutter. Deretter ble utfelningen innsamlet fra suspensjonen ved filtrering, og igjen suspendert i 150 ml av en borat-buffer (pH 9,0) av den ovennevnte sammensetning, og den således oppnådde suspensjon ble rørt i 30 minutter, hvoretter utfelningen ble innsamlet ved filtrering. Den innsamlede utfelning ble suspendert i 150 ml av en 0,1 vekt% borat-buffer (pH 9,0) inneholdende 0,5 M natriumklorid og 0,2% cetylpyridinJ

klorid, og den resulterende suspensjon ble rørt og dissosiert i 30 minutter. Deretter ble utfelningen separert fra suspensjonen ved filtrering for å oppnå en løselig fraksjon. Videre ble den ved filtrering separerte utfelning igjen utsatt for den samme dissosiasjonsprosess som ovenfor for å oppnå en løselig fraksjon. De to løselige fraksjoner ble kombinert, og den resulterende løselige fraksjon ble justert til pH 3-4 med 10% saltsyre, hvoretter etanol ble satt dertil slik at dens endelige konsentrasjon kan bli 80 voluml. Den resulterende løsning ble hensatt natten over ved 5°C, og den dannede utfelning ble innsamlet ved filtrering for å oppnå 5,6 g med gråaktig hvitt-lysebrunt pulver av TF-150.

Claims

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av nye karsinostatiske eller imunostimulerende TF-substanser som er TF-100, TF-110, TF-120, TF-130, TF-1316, TF-132a, TF-132b, TF-133a, TF-133b, TF-1323, TF-136, TF-140 og TF-150, karakterisert ved at man dyrker Fusobacterium nucleatum TF-031 (ATCC 31647) under anaerobe betingelser i et dyrkningsmedium som inneholder nitrogenkilder, karbonkilder, vitaminkilder, reduksjonsmidler og uorganiske salter og eventuelt i tillegg agar og innstiller på en pH-verdi fra 5 til 8,5, tilsetter kulturen eller supernatanten et hydrofilt organisk løsningsmiddel, skiller fra den derved dannede felling og så samler den vannløselige fraksjon av fellingen, hvoretter man eventuelt så foretar den følgende behandling (1), (2), (3) eller (4),

(1) dialyserer eller ultrafiltrerer den vannløselige fraksjon og så isolerer en produktfraksjon fra den indre løsning og eventuelt behandler denne produktfraksjon med en ionebytter og isolerer en adsorbert produktfraksjon eller en ikke-adsorbert produktfraksjon, eller tilsetter produkt-fraksjonen som er isolert fra den indre løsning et kvarternært ammoniumsalt, samler den dannede felling, deretter foretar en dissosiasjonsbehandling og isolerer en produktfraksjon fra den behandlede væske,

(2) behandler den vannløselige fraksjon med en ionebytter og isolerer den adsorberte fraksjon eller den ikke-adsorberte fraksjon,

(3) tilsetter den vannløselige fraksjon bariumioner (hvorunder kulturen eller supernatanten kan anvendes istedenfor den vannløselige fraksjon), skiller fra det dannede bariumsalt, fjerner bariumet fra saltet, deretter dialyserer eller ultrafiltrerer den vannløselige fraksjon og isolerer en produktfraksjon fra den indre løsning,

(4) tilsetter den vannløselige fraksjon et kvarternært ammoniumsalt, samler den dannede felling, dissosiasjons-behandler denne og så isolerer en produktfraksjon fra den behandlede væske.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 til fremstilling av TF-100, TF-110, TF-120, TF-130,TF-1316, TF-132a, TF-132b, TF-133b, TF-1323 og TF-136, karakterisert ved at man dyrker Fusobacterium nucleatum TF-031 (ATCC 31647) under anaerobe betingelser i et dyrkningsmedium som inneholder nitrogenkilder, karbonkilder, vitaminkilder, reduksjonsmiddel og uorganiske salter og eventuelt i tillegg agar, og innstiller pH-verdien på 5 til 8,5, tilsetter kulturen eller supernatanten et hydrofilt organisk løsningsmiddel, som derved skiller fra den dannede felling, og så samler den vannløselige fraksjon av fellingen, hvoretter man eventuelt foretar den følgende behandling (1) eller (2): (1) dialyserer eller ultrafiltrerer den vannløselige fraksjon, isolerer en produktfraksjon fra den indre løsning og eventuelt behandler denne produktfraksjon med en ionebytter og isolerer en adsorbert produktfraksjon eller en ikke-adsorbert produktfraksjon, (2) behandler den vannløselige fraksjon med en ione-bytter og isolerer en adsorbert produktfraksjon eller en ikke-adsorbert produktfraksjon.

3. Fremgangsmåte i henhold til krav 2 til fremstilling av TF-100, karakterisert ved at den vannløselige fraksjon av utfellingen tas ut fra utfellingen og så tørkes.

4. Fremgangsmåte i henhold til krav 2 til fremstilling av TF-110, karakterisert ved at den dannede utfelling isoleres; den vannløselige fraksjon av utfellingen dialyseres eller ultrafiltreres og de substanser som har karsinostatiske og immunostimulerende aktiviteter isoleres fra den indre løsning.

5. Fremgangsmåte i henhold til krav 2 til fremstilling av TF-120, karakterisert ved at den dannede utfelling isoleres; den vannløselige fraksjon av utfellingen, om nød-vending, dialyseres eller ultrafiltreres, og behandles så med en ionebytter; og den uadsorberte fraksjon isoleres.

6. Fremgangsmåte i henhold til krav 2 til fremstilling av TF-130,TF-1316, TF-132a, TF-132b, TF-133b, TF- 1323 og TF-136, karakterisert ved at den dannede utfelling isoleres; den vannløselige fraksjon av utfellingen, om nød-vendig, dialyseres eller ultrafiltreres, og så behandles fraksjonen som er isolert fra den indre løsning med en ionebytter og den adsorberte produktfraksjon isoleres.

7. Fremgangsmåte i henhold til krav 6 til fremstilling av TF-1316, karakterisert ved at den adsorberte fraksjon behandles med en 0,6 M natriumklorid-fosfat-buffer; og den eluerte fraksjon oppsamles.

8. Fremgangsmåte i henhold til krav 6 til fremstilling av TF-132a og TF-132b, karakterisert ved at en fraksjon som ikke er blitt eluert med en 0,1 M natriumklorid-fosfat-buffer, men som er blitt eluert med en 0,2 M natriumklorid-fosfat-buffer, isoleres fra den adsorberte fraksjon.

9. Fremgangsmåte i henhold til krav 6 til fremstilling av TF-133a og TF-133b, karakterisert ved at en fraksjon som ikke er blitt eluert med en 0,2 M natriumklorid-buffer, men er blitt eluert med en 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer, isoleres.

10. Fremgangsmåte i henhold til krav 6 til fremstilling av TF-1323, karakterisert ved at en fraksjon som ikke er blitt eluert med en 0,1 M natriumklorid-fosfat-buffer, men er blitt eluert med en 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer, isoleres.

11. Fremgangsmåte i henhold til krav 6 til fremstilling av TF-136, karakterisert ved at en fraksjon som ikke er blitt eluert med en 0,5 M natriumklorid-fosfat-buffer, men er blitt eluert med en 0,6 M natriumklorid-fosfat-buffer, isoleres.

12. Fremgangsmåte i henhold til krav 2 til fremstilling av TF-132b, karakterisert ved at den dannede utfelling isoleres; den vannløselige fraksjon, om nødvendig, dialyseres eller ultrafiltreres, det fremstilles en 0,2 M natriumklorid-fosfat-buffer av den vannløselige fraksjon av utfellingen eller en 0,2 M natriumklorid-fosfat-buffer av den indre løsningskomponent oppnådd ved dialysen eller ultrafiltreringen, og den behandles så med en ione-bytter; det isoleres en fraksjon som er ført gjennom ione-bytteren; denne eluerte løsning justeres så slik at dens natriumklorid-konsentrasjon blir 0,1 M, og behandles deretter med en ione-bytter brakt i likevekt med en 0,1 M natriumklorid-fosfat-buffer for å bli adsorbert derpå; og deretter isoleres en fraksjon som adsorberer ved en 0,1 M natrium-fosfat-buffer, men er blitt eluert med en 0,2 M natriumklorid-fosfat-buffer.

13. Fremgangsmåte i henhold til krav 2 til fremstilling av TF-1323, karakterisert ved at den dannede utfelling innsamles; den vannløselige fraksjon av utfellingen, om nød-vendig, dialyseres eller ultrafiltreres, det fremstilles en 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer av den vannløselige fraksjon av utfellingen eller en 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer av indre løsnings-komponent oppnådd ved dialysen eller ultrafiltreringen, og den behandles så med en ione-bytter som er brakt i likevekt med en 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer; det isoleres en fraksjon som er ført gjennom ione-bytteren; natriumklorid-konsentrasjonen til denne eluerte løsning justeres så til 0,1 M, og løsningen behandles deretter med en ione-bytter som er brakt i likevekt med en 0,1 M natriumklorid-f osf at-buf f er for å adsorberes derpå; og deretter innsamles en fraksjon som adsorberer ved en 0,1 M natriumklorid-f osfat-buffer, men elueres med en 0,3 M natriumklorid-f osf at-buf fer .

14. Fremgangsmåte i henhold til krav 2 til fremstilling av TF-133b, karakterisert ved at den dannede utfelling innsamles; den vannløselige fraksjon av utfellingen, om nød-vendig, dialyseres eller ultrafiltreres, det fremstilles en 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer av den vannløselige fraksjon av utfellingen eller en 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer av indre løsnings-komponent oppnådd ved dialysen eller ultra filtreringen, og den behandles så med en ione-bytter som er brakt i likevekt med en 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer; det isoleres en fraksjon som er ført gjennom ione-bytteren; natriumklorid-konsentrasjonen til denne eluerte løsning justeres så til 0,2 M, og løsningen behandles deretter med en ione-bytter som er brakt i likevekt med en 0,2 m natriumklorid-f osf at-buf f er for å adsorberes derpå; og deretter innsamles en fraksjon som adsorberer ved en 0,2 M natriumklorid-f osf at-buf fer , men elueres med en 0,3 M natriumklorid-f osf at-buf fer .

15. Fremgangsmåte i henhold til krav 1 til fremstilling av TF-140, karakterisert ved at barium-ioner settes til kulturen eller dens ovenstående væske for å danne et bariumsalt, eller et hydrofilt organisk løsningsmiddel settes til kulturen eller dens ovenstående væske, og den dannede utfelling isoleres, og så settes barium-ioner til den vannløselige fraksjon av utfellingen som således er isolert, det dannede bariumsalt isoleres, og deretter behandler man for fjerning av barium, og den vannløselige fraksjon blir oppsamlet og dialysert eller ultrafiltrert.

16. Fremgangsmåte i henhold til krav 1 til fremstilling av TF-150, karakterisert ved at et hydrofilt organisk løsningsmiddel settes til kulturen eller dens ovenstående væske; den dannede utfelling isoleres, den vannløselige fraksjon av utfellingen, eller den indre løsnings-komponent oppnådd ved å dialysere eller ultrafiltrere den vannløselige fraksjon behandles med et kvartært ammoniumsalt; den dannede utfelling isoleres og utsettes så for en dissosiasjons-prosess ved anvendelse av en løsning inneholdende natriumklorid; et hydrofilt organisk løsningsmiddel settes til den oppnådde løselige fraksjon for å danne en utfelling, og den således dannede utfelling isoleres.

17. Fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av kravene 1 - 16, karakterisert ved at kulturmediet som anvendes for dyrking av bakteriene, omfatter trypticase-pepton, fyton-pepton, proteose-pepton, en hjerne-hjerte-infusjon (eller hjerte-infusjon), gjær-ekstrakt, natriumklorid, glukose, laktose, L-cystin, natriumsulfitt og tioglykollat, og eventuelt agar.

18. Fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av kravene 1-16, karakterisert ved at dyrkingen utføres ved 36 til 38°C i 1 - 3 dager i et kultur-medium som er justert til pH 7,2 - 8,2.

19. Fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av kravene 2-16, karakterisert ved at det hydrofile organiske løsningsmiddel som settes til kulturen eller dens overflytende fluidum, er en alkohol.

20. Fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av kravene 2-16, karakterisert ved at det hydrofile organiske løsningsmiddel settes til kulturen eller dens overflytende fluidum i en løsningsmiddel-konsentrasjon på 30 - 70 volum%.

21. Fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av kravene 6-14, karakterisert ved at ione-bytteren er en svakt basisk ione-bytter eller en svakt basisk ione-bytter med molekylsiktvirkning.

22. Fremgangsmåte i henhold til krav 6, karakterisert ved at en 0,1 - 0,6 M natriumklorid-f osf at-buf f er anvendes til å eluere fraksjonen adsorbert på ione-bytteren.

23. Fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av kravene 7 - 14 eller krav 22, karakterisert ved atpHi fosfat-bufferen inneholdende natriumklorid som anvendes for behandling av den adsorberte fraksjon, er ca. 8.

24. Fremgangsmåte i henhold til hvilket som helst av kravene 7-14 eller krav 22, karakterisert ved at den fraksjon som er behandlet med ione-bytter,konsentreres,avsaltes og tørkes.

25. Fremgangsmåte i henhold til krav 16, karakterisert ved at det som kvartær ammon-iumforbindelse anvendes cetylpyridiniumklorid.

26. Fremgangsmåte i henhold til krav 15, karakterisert ved at behandlingen med det kvarternære ammoniumsalt foretas i nærvær av en boratbuffer.

27. Fremgangsmåte i henhold til krav 15, karakterisert ved at det som løsning inneholdende natriumklorid, anvendes en boratbuffer inneholdende natriumklorid og et kvartært ammoniumsalt.

28. Fremgangsmåte i henhold til krav 6 til fremstilling av TF-133a, karakterisert ved at Fusobacterium nucleatum TF-031 (ATCC 31647) inokuleres i et kulturmedium som er justert til pH 7,2 - 8,2 og som omfatter trypticase-pepton, fyton-pepton, proteose-pepton, en hjerne-hjerte-infusjon (eller en hjerte-infusjon), gjærekstrakt, natriumklorid, glukose, laktose, L-cystin, natriumsulfitt og tioglykollat og eventuelt agar, og dyrkes så under anaerobe forhold ved 36-38°C i 1 - 3 dager; en alkohol settes til kulturen eller dens ovenstående væske i en konsentrasjon på 50 - 70 volum%: den dannede utfelling isoleres; den vannløselige fraksjon av utfellingen, om nødvendig, dialyseres eller ultrafiltreres, og behandles så med en svakt basisk ione-bytter eller en svakt basisk ione-bytter med molekylsiktvirkning for å fjerneden uadsorberte fraksjon; en fraksjon som er blitt eluert med en 0,2 M natrium-fosfat-buffer fjernes fra den adsorberte fraksjon; og deretter isoleres en fraksjon som er blitt eluert med en 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer, konsentrert, avsaltet og så tørket.

29. Fremgangsmåte i henhold til krav 6 til fremstilling av TF-1323, karakterisert ved at Fusobacterium nucleatum TF-031 (ATCC 31647) inokuleres i et kulturmedium som er justert til pH 7,2 - 8,2 og som omfatter trypticase-pepton, fyton-pepton, proteose-pepton, en hjerne-hjerte-infusjon (eller en hjerte-infusjon), gjærekstrakt, natriumklorid, glukose, laktose, L-cystin, natriumsulfitt og tioglykollat og eventuelt agar, og dyrkes så under anaerobe forhold ved 36-38°C i 1 - 3 dager; en alkohol settes til kulturen eller dens ovenstående væske i en konsentrasjon på 50 - 70 volum%: den dannede utfelling isoleres; den vannløselige fraksjon av utfellingen, om nødvendig, dialyseres eller ultrafiltreres, og behandles så med en svakt basisk ione-bytter eller en svakt basisk ione-bytter med molekylsiktvirkning for å fjerne den uadsorberte fraksjon; en fraksjon som er blitt eluert med en 0,1 M natrium-fosfat-buffer fjernes fra den adsorberte fraksjon; og deretter isoleres en fraksjon som er blitt eluert med en 0,3 M natriumklorid-f osf at-buf fer , konsentrert, avsaltet og så tørket.

30. Fremgangsmåte i henhold til krav 6 til fremstilling av TF-132b, karakterisert ved at Fusobacterium nucleatum innpodes i et kulturmedium som er justert til pH 7,2 - 8,2 og som omfatter trypticase-pepton, fyton-pepton, protease-pepton, en hjerne-hjerte-infusjon (eller en hjerte-infusjon), gjærekstrakt, natriumklorid, glukose, laktose, L-cystin, natriumsulfitt og tioglykollat, eller i et kulturmedium som omfatter slike og agar, og dyrkes så under anaerobe forhold ved 36 - 38°C i 1 - 3 dager; en alkohol settes til kulturen eller den overflytende væske i en konsentrasjon på 50 - 70 volum%; den dannede utfelling isoleres; den vannløselige fraksjon av utfellingen, om nødvendig, dialyseres eller ultrafiltreres, og så behandles med en 0,2 M natriumklorid-fosfat-buffer av den vannløselige fraksjon av utfellingen eller en 0,2 M natriumklorid-fosfat-buffer av den indre løsnings-komponent oppnådd ved dialyse eller ultrafiltrering, med en svakt basisk ione-bytter eller en svakt basisk ione-bytter som kan virke som molekylsikt, brakt i likevekt med en 0,2 M natriumklorid-fosfat-buffer; den fraksjon som er ført gjennom ione-bytteren, innsamles; denne eluerte løsning justeres til en natriumklorid-konsentrasjon på 0,1 M, og behandles så med en svakt basisk ione-bytter eller en svakt basisk ione-bytter som har evne som molekylsikt og er brakt i likevekt med en 0,1 M natriumklorid-fosfat-buffer, for å bli adsorbert derpå; og en fraksjon som er blitt eluert med en 0,2 M natriumklorid-fosf at-buf fer , isoleres fra den adsorberte fraksjon, konsentreres, avsaltes og tørkes så.

31. Fremgangsmåte i henhold til krav 6 til fremstilling av TF-133b, karakterisert ved at Fusobacterium nucleatum innpodes i et kulturmedium som er justert til pH 7,2 - 8,2 og som omfatter trypticase-pepton, fyton-pepton, protease-pepton, en hjerne-hjerte-infusjon (eller en hjerte-infusjon), gjærekstrakt, natriumklorid, glukose, laktose, L-cystin, natriumsulfitt og tioglykollat, eller i et kulturmedium som omfatter slike og agar, og dyrkes så under anaerobe forhold ved 36 - 38°C i 1 - 3 dager; en alkohol settes til kulturen eller den overflytende væske i en konsentrasjon på 50 - 70 volum%; den dannede utfelling isoleres; den vannløselige fraksjon av utfellingen, om nødvendig, dialyseres eller ultrafiltreres, og så behandles med en 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer av den vannløselige fraksjon av utfellingen eller en 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer av den indre løsnings-komponent oppnådd ved dialyse eller ultrafiltrering, med en svakt basisk ione-bytter eller en svakt basisk ione-bytter som kan virke som molekylsikt, brakt i likevekt med en 0,3 M natriumklorid-fosfat-buffer; den fraksjon som er ført gjennom ione-bytteren, innsamles; denne eluerte løsning justeres til en natriumklorid-konsentrasjon på 0,2 m, og behandles så med en svakt basisk ione-bytter eller en svakt basisk ione-bytter som har evne som molekylsikt og er brakt i likevekt med en 0,2 m natriumklorid-fosfat-buffer, for å bli adsorbert derpå; og en fraksjon som er blitt eluert med en 0,3 M natriumklorid-fosf at-buf fer , isoleres fra den adsorberte fraks'jon, konsentreres, avsaltes og tørkes så.