NL8004759A - Nieuwe stoffen met carcinostatische en immuno- stimulerende werking, werkwijze voor de bereiding daarvan en carcinostatische preparaten die deze stoffen bevatten. - Google Patents

Description

♦ * π

Nieuwe stoffen met carcinostatische en immunostimulerende werking, werkwijze voor de bereiding daarvan en carcinostatische preparaten die deze stoffen bevatten.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van nieuwe stoffen met carcinostatische en immunostimulerende werking, die bestaat uit het onder anaerobe omstandigheden kweken van TF-stof vormende bacteriën, die 5 behoren tot het Fusobacterium genus en het verzamelen van de gevormde stoffen uit de cultuur of de bovenstaande vloeistof daarvan (deze nieuwe stof wordt verder aangeduid als TF stof), en heeft betrekking op de verkregen TF stoffen /verder aangeduid TF-100, 110, 120, 130 (1316, 132a, 132b, 133a, 133b, 1323, 10 136), 1U0 en 1507 en heeft betrekking op een carcinostatisch preparaat, dat een dergelijke stof bevat.

Gedurende de laatste jaren wordt als geneesmiddel voor patiënten met verschillende soorten kanker op grote schaal een geneesmiddel gebruikt dat de immunologische werking van de 15 gastheer verhoogt en waarmee een carcinostatische werking wordt verkregen met behulp van de immunologische functie. Als anti-tumormiddelen die gebruikt worden voor een dergelijk geneesmiddel zijn bekende verbindingen verkregen uit organismen van verschillende bacteriën of culturen van verschillende bacteriën of poly-20 sacchariden verkregen uit vruchtlichamen van Basidiomycetes of gekweekte funguslichamen daarvan. Deze anti-tumormiddelen zijn echter nog niet bevredigend wat betreft hun werking, schadelijke nevenwerking en produktiewijze.

Anderzijds zijn er publikaties met betrekking tot an-25 organisme en een bovenstaande vloeistof die verkregen zijn door 8004759 2 bacteriën te kweken tot het Fusobacterium genus, b.v.

Fusobacterium K031-33, Fusobacterium fusiforais W-12, Fusobacterium girans 1012 en Fusobacterium nucleatum 1010 /Dental Surgery, 23, 322-333 (197*0 en 21_, 53^-539 (1972) (Japans)J. Er is echter nog 5 geen enkel onderzoek gericht op de bestanddelen die verkregen worden uit een cultuur of de bovenstaande vloeistof bereid door het kweken van bacteriën die behoren tot het Fusobacterium genus en de farmacologische werkingen van de bestanddelen.

Wij hebben nu de farmacologische werking onderzocht van 10 een bovenstaande vloeistof die verkregen is door het kweken van bacteriën die behoren tot het Fusobacterium genus en de organismen uit de cultuur verwijderd, waarbij wij gevonden hebben, dat een specifiek bestanddeel verkregen wordt uit de bovenstaande vloeistof, dat een carcinostatische werking bezit; genoemd 15 bestanddeel heeft nagenoeg geen werking op het inhiberen van de vorming van een kolonie van kankercellen in een kolonie-schuim-testmethode en bezit geen carcinostatische werking door doden van de kankercellen, maar een indirecte carcinostatische werking door verhoging van de via de gastheer overgedragen anti-tumorwerking 20 of de immuniteit van de gastheer en met gebruikmaking van het bevorderen van de immuniteit; ook hebben we gevonden, dat genoemd bestanddeel een zeer geringe toxiciteit bezit en ook verkregen kan worden door het behandelen van de cultuur.

De uitvinding heeft ten doel een werkwijze te ver-25 schaffen, die er uit bestaat, dat men bacteriën die behoren tot het Fusobacterium genus onder anaerobe omstandigheden kweekt en nieuwe TF stoffen met carcinostatische en immunostimulerende werking uit de verkregen cultuur of de bovenstaande vloeistof daarvan verzamelt.

30 Verder heeft de uitvinding ten doel genoemde TF stoffen te verschaffen.

Ook heeft de uitvinding ten doel een carcinostatisch preparaat te verschaffen dat genoemde TF stoffen bevat.

Als bacteriën die -gebruikt worden bij de uitvinding 35 kunnen alle TF stofvormende bacteriën die behoren tot het

Fusobacterium genus worden gebruikt en b.v. wordt Fusobacterium 8004759 ·* 3 * mieleatum "bij voorkeur gebruikt. In de praktijk hebben wij Fusobacterium nucleatum TP-031 (FARM 5077; ATCC 3104-7) en dergelijke gebruikt.

De bacteriologische eigenschapnen van Fusobacterium 5 nucleatum TF-Q31 zijn als volgt: (I) Vorm (1) Vorm van de cellen: staafvormig (fig. 1) (2) Polymorfisme van de cellen: afwezig (3) Motiliteit: afwezig 10 (U) Sporen: afwezig (5) Gramvlek: Gram-negatief (6) Zuurbestendigheid: negatief (II) Groeiomstandigheden in een kweekcultuurmedium (1) TF-a agarplaat en wigcultuurmedium 15 uitwendige vorm: een ronde vorm

Afmeting: ongeveer 1 mm Uitwas: halve bolvorm Struktuur: net als dauwdruppel Oppervlak: glad 20 Randen: glad

Kleur: melkachtig geelwit Doorzichtigheid: ondoorzichtig (2) TF-a vloeibaar cultuurmedium

Mate van de groei: krachtig 25 Troebelheid: coagulum

Weerslag: geen

Groei van oppervlak: geen, geen groei tot een diepte van 5 mm

Gas: geen 30 (lil) Fysiologische eigenschappen (1) Vorming van zwavelwaterstof: + (2) Reductie van nitraten: - (3) Vorming van boterzuur: + (U) Vorming van indol: + 35 (5) Urease: - (6) Catalase: - 8004759 u (T) Hydrolyse van zetmeel: - (3) Gedrag ten opzichte van zuurstof: anaëroob (9) Vorming van ammoniak: + (10) Vorming van kooldioxyde: + 5 (11) Traject van de groei: pH 5 - 3,5, temperatuur

30 - i+5°C

(12) Vorming van gas uit sacchariden: L-arabinose (-), D-xylose (-), D-glucose (-), D-mannose (-), D-fructose (-), D-galactose (-), 10 moutsuiker (-), sucrose (-), trehalose (-), sorbitol (-), mannitol (-), inositol (-), glycerol (-), zetmeel (-).

De nieuwe TF stoffen volgens de uitvinding worden b.v. op de volgende wijze bereid.

8004759 ♦ 5 r„

Cultuur van TF stof-vormende bacteriën die behoren tot het Fusobacterium genus -, "" >""" - Ί

Cultuur of de bovenstaande vloei- stof daarvan

Hydrofiel r-j organisch | Laten staan | oplosmiddel

Oplosbare - - Scheiding fractie x i——j | Neerslaan |

Fosfaatbuffer ^ (natriumchloride) of vater

Ononlosbare r-— . "~i fractie Γ-[Scheiding] \Drogen ]< Water-oplosbare f fractie —^ — TF-100---- --

Buitenste L·,___ * Dialyse of ’ I

oplossing P , ultrafiltratie , (Drogen]-- Binnenste * •-—I ] oplossing TF-110 — — _

Niet-geadsor- __~ * Behandeling met beerde fractie ionen uitwisselaar ——

Fosfaatbuffer __ (natriumchloride)

Ontzouten | Sluaat l I Drogen I l --;— | I Concentratie F - » , TF-120 Ontzouten

ZZCZI

Drogen

V

TF-130 (TF-131Ö, 132a, 132b, 133a, 133b, 1323, 136) 8004759 6

Cultuur of bovenstaande 26 vloeistof daarvan

Water-oolosbare r-- mr,

fractie -2—^DrogenJ—^ÏF-IOO

Ι·»Ι·Μ··^Μ^—————I ^ if ->| v°4iag T een 11""_|5^Mmea| bariumzout. ...................

Scheiding -> Oplossing \

Barium

Verwijdering van barium_

Scheiding .............................»Vaste stof

Oplossing

Dialyse of ultrafiltratie

Concentratie |

Drogen 'f TF-1U0 8004759 τ

Water-oplosbare * fractie_

Binnenste * ______

oplossing ^ » Drogen ->?F-11Q

Behandeling met een

Oplosbare fractie « ....... kwaternair ammoniumzout

Een kwaternair ^-Ψ ammonium complex

Oplossing met natriumchloride

Dissociatie behandeling

Wassingen

Oplosbare fractie

Hydrofiel organisch oplosmiddel

Oplosbare fractie ^—— „ Scheiding

Neerslag

Drogen

T

TF-150 8004759 > 8

De bovengenoemde bereidingswijze wordt als volgt toegelicht: (1) Cultuur van bacteriën.

De cultuur van bacteriën die behoren tot het 5 Fusobacterium genus wordt uitgevoerd met een gebruikelijke methode voor het kweken van anaerobe bacteriën. D.w.z. een cultuurmedium dat een stikstofbron bevat, zoals kalven hersen-hartextracten, verschillende peptonen of dergelijke; een vitaminebron, zoals een gistextract of dergelijke; een organisch zout, zoals natrium-10 chloride of dergelijke; een koolstofbron, zoals glucose, lactose of dergelijke; een reductiemiddel, zoals L-cystine, natriumsulfiet, thioglyco^laat of dergelijke, wordt ingesteld op een pH van 6 - 8,5, bij voorkeur 7,2 - 3,2 en de bacteriën worden op het cultuurmedium geënt, waarna een stabiele toestandcultuur wordt 15 uitgevoerd onder anaerobe omstandigheden bij 35 - ^2°C, bij voorkeur 36 - 38°C, gedurende 1 - 5 dagen, bij voorkeur 2k - 72 uur. In het bijzonder is het gewenst het in tabel A (verder aangè-duid als TF cultuurmedium) beschreven cultuurmedium te gebruiken. Het hersen-hart-infuus, dat een kalven hersen-hartextract is, 20 is echter niet altijd noodzakelijk als koolstofbron en kan worden vervangen door een hartinfuus dat een kalven hartextract, een runderextract, een visextract, een maisdrenkvloeistof of dergelijke is. Van de verschillende peptonen zijn proteosepepton en fytonpepton niet altijd noodzakelijk, en het trypticasepepton 25 kan worden vervangen door polypepton.

Wanneer geen agar wordt gebruikt is het gewenst de cultuur te roeren.

Tabel A

Bestanddelen van cultuur- TF_a TF_C

medium (g/l)

Trypticase-pepton 17 17 17

Fytonpepton 3 3 1,5

Proteosepepton 10 5 5

Hersen-hart-infuus 35 17,5 35 Hartinfuus - - 25

Gistextract 3 33 8004759 9 r

Ifatriumchloride 7,5 7,5 7,5

Glucose 666

Lactose 555 L-Cystine 0,25 0,5 0,5 5 Natriumsulfiet 0,1 0,1 0,1

Thioglycolaat 0,5 0,5 0,5

Agar 0 of 0,7 0 of 0,7 0 of 0,7 (2) Verzamelen van een bovenstaande vloeistof uit de cultuur (verwijdering van de organismen).

10 De organismen worden uit de hierboven verkregen cultuur verwijderd om een bovenstaande vloeistof te verkrijgen. Voor de verwijdering van de organismen kan een gebruikelijke methode, zoals b.v. centrifugeren of filtreren met behulp van een filtreer-hulpmiddel, zoals Hyflo Super Gel, worden gebruikt en in het 15 bijzonder verdient een centrifugeermethode de voorkeur uit het oogpunt van uitvoering, de mate van verwijdering van de organismen en de opbrengst aan bovenstaande vloeistof. De organismen worden bij voorkeur in deze trap verwijderd, maar zij kunnen ook in de daaropvolgende trap (3) worden verwijderd.

20 (3) Verzamelen van carcinostatische stof TF-100.

Een hydrofiel organisch oplosmiddel wordt aan de hierboven verkregen bovenstaande vloeistof of de cultuur toegevoegd en het gevormde neerslag wordt verzameld. Op dit tijdstip wordt de bovenstaande vloeistof of de cultuur bij voorkeur ingesteld op een 25 pH van 2-7· Het hydrofiele organische oplosmiddel bestaat b.v. uit een alcohol, zoals ethanol of methanol, een keton, zoals aceton, ofschoon alcoholen, in het bijzonder ethanol, de beste resultaten verschaffen. Het hydrofiele organische oplosmiddel wordt geschikt zodanig toegevoegd dat zijn concentratie 30 - J0 30 volin het bijzonder 50 - 70 vol.5, bedraagt. 'Ta de toevoeging van het hydrofiele organische oplosmiddel laat men het verkregen mengsel staan bij een lage temperatuur, bij voorkeur omstreeks 5°C gedurende verscheidene uren tot verscheidene dagen om de vorming van het neerslag te voltooien. Het aldus gevormde neer-35 slag wordt afgescheiden volgens gebruikelijke methoden, zoals decanteren, centrifugeren of filtreren.

8004759 10

Vervolgens wordt water in een hoeveelheid van 10 - 15 keer die van het hierboven verkregen neerslag toegevoegd aan het neerslag /het water kan worden vervangen door een fosfaatbuffer of een natriurnehloride bevattende fosfaatbuffer wanneer beoogd 5 wordt on TF-120 of 130 (131c, 132a, 132b, 133a, 133b, 1323 of 13(:) te verkrijgen, zoals hieronder genoemd7 en de gevormde water-onoplosbare materialen worden verwijderd volgens gebruikelijke methode, zoals centrifugeren of filtreren, waarna de wateroplosbare fractie wordt verzameld. Vanneer de cultuur wordt 10 gebruikt, worden de organismen verwijderd volgens de bovengenoemde methoden. De aldus verkregen water-oplosbare fractie wordt gedroogd , b.v. door lyofilisering, ten einde een carcino-statische stof TF-100 te verkrijgen.

Het aldus verkregen TF-100 heeft eigenschappen zoals 15 vermeld in tabel 3.

(¼) Verzamelen van carcinostatische stof TF-110.

De in trap (3) van de hierboven verkregen water-oplosbare fractie wordt onderworpen aan dialyse of uktrafiltratie; of in plaats daarvan wordt TF-100 opgelost in een 10 - 15 maal zo grote 20 hoeveelheid water en de verkregen oplossing wordt onderworpen aan dialyse of ultrafiltratie. Stoffen met laag mol.gew., zoals aminozuren en anorganische materialen, worden door de bovengenoemde behandeling verwijderd. De verkregen binnenste oplossing bij de dialyse of ultrafiltratie wordt verzameld en daarna gedroogd 25 ten einde een carcinostatische stof TF-110 te verkrijgen.

Het aldus verkregen FT-110 bezit eigenschappen die zijn vermeld in tabel B.

(5) Verzamelen van carcinostatische stof TF-120.

De in trap (3) verkregen water-oplosbare fractie of 30 zonodig de binnenste oplossing verkregen door de water-oplosbare fractie te onderwerpen aan dialyse of ultrafiltratie (de in trap(U) verkregen binnenste oplossing), of een oplossing van een poeder van TF-110 in een kleine hoeveelheid water, wordt behandeld met een ionenuitwisselaar. Als ionenuitwisselaar wordt bij voorkeur 35 een zwak· basische ionenuitwisselaar of een zwak basische ionenuitwisselaar met een moleculair-zeefvermogen bij voorkeur gebruikt, 8004759 11 en geschikt wordt b.v. diethylaminoethyl-Senhadex A-50 (geregistreerd handelsmerk) gebruikt. Een kolom, gepakt met een ionenuitwisselaar, wordt in evenwicht gebracht met b.v. een fosfaatbuffer met een pH van 8, waarna de bovengenoemde te behandelen onlossing door de 5 kolom wordt gevoerd en de geëlueerae oplossing wordt verzameld en daarna gedroogd door lyofilisering of dergelijke; of in plaats daarvan wordt dezelfde buffer als hierboven met de te behandelen oplossing in een vat gebracht dat een ionenuitwisselaar bevat en de inhoud wordt geroerd en daarna gefiltreerd, waarna het 10 filtraat wordt gedroogd; daardoor kan een carcinostatische stof TF-120 met de hieronder beschreven eigenschappen worden verkregen. TF-120 kan ook worden verkregen door de geëlueerde oplossing of het filtraat te ontzouten, b.v. door dialyse met behulp van een cellofaanbuis of dergelijke, met gebruik van Sephadex G-25 ' 15 (geregistreerd handelsmerk), of door ultrafiltratie en daarna drogen daarvan.

Het aldus verkregen TF-120 bezit de eigenschapnen als vermeld in tabel B.

(6) Verzameling van carcinostatische stof TF-130.

20 Een kolom die de geadsorbeerde bestanddelen bevat, waaruit TF-120 verwijderd is door de behandeling volgens trap (5) hierboven, wordt behandeld met een fosfaatbuffer, bij voorkeur een fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,1 - 0,6 mol en een pH van 8 (de fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcen-25 tratie van 0,1 - 0,6 mol. wordt verder aangeduid als een 0,1 - 0,6 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer); of in plaats daarvan wordt de water-oplosbare fractie uit trap (3) zonodig onderworpen aan dialyse of ultrafiltratie en daarna asm de behandeling met een ionenuitwisselaar door gebruik van een 0,1 - 0,6 molaire natrium-30 chloride-fosfaatbuffer, ten einde een fractie te verkrijgen die niet geëlueerd wordt met een fosfaatbuffer die vrij is van natriumchloride maar wel geëlueerd wordt met een 0,1 - 0,6 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer.

Deze methode kan worden uitgevoerd met ofwel een kolom-35 .systeem of volgens een discontinu systeem. De aldus verkregen gewenste fractie, die geëlueerd wordt met de natriumchloride- 8004759 * 12 fosfaatbuffer, wordt gedroogd door lyofiliseren of dergelijke, ten einde een carcinostatische stof TF-130 te verkrijgen. De eluaat bevattende gewenste fractie, die geëlueerd wordt net de bovengenoemde natriumchloride-fosfaatbuffer, kan worden ontzout, 5 b.v. door dialyse met behulp van een cellofaanbuis, met moleculair zeven door gebruik van Sephadex G-25 of door ultrafiltratie, en daarna worden gedroogd.

De hierin gebruikte uitdrukking "TF-130" heeft als verzamelnaam betrekking op gewenste geëlueerde fracties die ver-10 kregen worden door behandeling van de water oplosbare fractie die verkregen wordt in bovengenoemde trap (3) of zonodig het binnenste oplosaings= bestanddeel dat verkregen wordt door de water oplosbare fractie te onderwerpen aan dialyse of ultrafiltratie, met een ionenuitwisselaar, waarbij deze fracties niet 15 geëlueerd worden met een fosfaatbuffer die vrij is van natrium- chloride maar geëlueerd worden met een 0,1 - 0,6 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer. TF-130 omvat meer in het bijzonder b.v. de volgende fracties.

(i) Een fractie die niet geëlueerd is met een fosfaat-20 buffer vrij van natriumchloride maar geëlueerd is met een 0,6 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer in de bovengenoemde ionen-uitwisselaarbehandeling /de fractie wordt aangeduid als TF-13167.

(ii) Een fractie die niet geëlueerd wordt met een 0,1 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer maar geëlueerd is met een 25 0,2 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer in de bovengenoemde ionenuitwisselaarbehandeling /de fractie wordt aangeduid als TF-132a en b; de TF-132a wordt verkregen door wassen van een ionenuitwisselaar die het bovengenoemde geadsorbeerde bestanddeel bevat met een 0,1 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer, behande-30 len van de ionenuitwisselaar met een 0,2 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer en daarna verzamelen van de fractie die geëlueerd wordt met de 0,2 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer; en de TF-132b wordt verkregen door de water oplosbare fractie die verkregen wordt in bovengenoemde trap (3), of het binnenste 35 · oplossingsbestanddeel (TF-110) verkregen in bovengenoemde trap (U) te behandelen met een ionenuitwisselaar/.

8004759 13 r (iii) Sen fractie die niet geelueerd is met een 0,2 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer maar geelueerd is met een 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer in de bovengenoemde ionenuitwisselaarbehandeling /de fractie wordt aangeduid als 5 TF-133a en b; de a en b hebben dezelfde betekenis als gedefinieerd in het geval van resp. TF-132a en .

(iv) Een fractie die niet geelueerd is met een 0,1 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer maar geelueerd is met een 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer in de bovengenoemde 10 ionenuitwisselaarbehandeling /de fractie wordt aangeduid als TF-13237.

(v) Een fractie die niet geelueerd is met een 0,5 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer maar geelueerd is met een 0,6 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer in de bovengenoemde ionenuitwisselaar- 15 behandeling /de fractie wordt aangeduid als TF-136/.

Omdat deze fracties TF-1316, 132a, 132b, 133a, 133b, 1323 en 136 gemeenschappelijke eigenschappen bezitten in de onderstaande opzichten, worden de stoffen met de gemeenschappelijke eigenschappen aangeduid als TF-130. D.v.z. dat de TF-130 stoffen 20 die op de hierboven beschreven wijze verkregen zijn, de volgende eigenschappen bezitten: (a) Grijswit-lichtbruin poeder.

(b) Het inhibeert de proliferatie van muizen Ehrlich ascites tumor, Ehrlich vast tumor en Sarcoma-180 carcinomen en 25 heeft een immunostimulerende werking.

(c) Het is oplosbaar in water en is onoplosbaar in methanol, ethanol, aceton, benzeen, chloroform, ethylacetaat en diethylether.

(d) Het heeft geen scherp smeltpunt, begint te ontleden 30 bij 110°C en ontleedt duidelijk boven 200°C.

(e) Het infrarood absorptiespectrum dat verkregen wordt met een KBr tabletmethode toont absorptiebanden in de buurt van 3600-3200, 2960-2930, 1670-16U0, 1550, 1UUO-1380, 12U0, 111*0-1000 en 820 cm-1.

35 -(f) Het ultraviolet absorptiespectrum van de waterige oplossing vertoont een sterke absorptie bij de absorptierand en 8004759 11+ vertoont een absorptiepiek in de buurt van 256-280 nm.

(g) Het is positief in Molisch reactie, fenol-zwavelzuur-reactie, anthron-zwavelzuurreactie, indol-zoutzuurreactie en Lowry-Folin's reactie en negatief bij de ninhydrine reactie.

5 (h) Elementair analyse vaarden C 27,5 - 39,3/e; H 3,2 - 5 ,755; N 2,8 - 6 ,355.

(i) Het saccharidegehalte, gemeten volgens een fenol-zwavelzuurmethode, bedraagt ongeveer 19,0 - 61+,0 gev.% (uitgedrukt 10 in glucose) en het eiwitgehalte, gemeten volgens Lovry-Folin's methode ligt in de buurt van 6,0 - 28,0 gew..3 (uitgedrukt in kalven serum albumine).

De bovengenoemde ionenuitvisselaarbehandeling wordt hieronder nader toegelicht. Als ionenuitwisselaar wordt de voorkeur 15 gegeven aan een zwak basische ionenuitwisselaar of een zwak basische ionenuitwisselaar met moleculair zeefvermogen en zo wordt b.v. diethylaminoethyl-Fephadex Λ-50 in bovengenoemde trap (5) geschikt gebruikt en de onderstaande methode kan met een discontinu systeem worden uitgevoerd.

20 (i) Een 0,6 molaire natriurachloride-fosfaatbuffer met bij voorkeur een pH van ongeveer 3 wordt door een kolom gevoerd van een ionenuitwisselaar die het geadsorbeerde bestanddeel bevat, waar de te behandelen oplossing in bovengenoemde tran (5) is doorgevoerd, en de geeelueerde fractie wordt verzameld, desgewenst 25 geconcentreerd en ontzout door dialyse of ultrafiltratie en daarna gedroogd door lyofiliseren of dergelijke, ten einde een carcino-statische stof TF—1316 te verkrijgen.

De aldus verkregen TF—1316 bezit de eigenschappen als vermeld in tabel B.

30 (ii)-l) Een 0,1 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer met bij voorkeur een pH van ongeveer 3 wordt door een kolom gevoerd van een ionenuitwisselaar die het geadsorbeerde bestanddeel bevat, waar' de-te behandelen oplossing in voorgaande tran (5) is doorgevoerd, om de kolom te wassen, waarna een 0,2 molaire natrium-35 chloride-fosfaatbuffer met bij voorkeur een pH van ongeveer 8 door de kolom wordt gevoerd en de geëlueerde fractie wordt ver- 8004759 4 * r 15 zaneld, desgewenst geconcentreerd 5n ontzout door dialyse, ultrafiltratie of dergeiijke en daarna wordt gedroosd door lyofilisatie of dergeiijke ten einde een carcinostatische stof TF-132a te verkrijgen.

^ De aldus verkre~en PF—132a bezit de eifrenschar,pen als weergegeven in tabel B.

(ii)-2) Methoden voor het verzamelen va.n de fractie die niet geëlueerd is net een 0,1 nolaire natriumchloride-fosfaat-buffer maar geëlueerd is net een 0,2 nolaire natriunchloride-1Q fosfaatbuffer in de ionenuitwisselaarbehandeling worden uitgevoerd op de volgende wijze door gebruik van de in bovengenoemde trap (3) verkregen water oplosbare fractie of de in bovengenoemde trap (10 verkregen binnenste oplossing te gebruiken om TF-132b te verkrijgen.

15 D.w.z. dat de met de ionenuitwisselaar gepakte kolom in evenwicht wordt gebracht met een 0,2 - 0,3 molaire natrium-chloride- fosfaatbuffer net bij voorkeur een pïï van 3, waarna de bovengenoemde 0,2 - 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer van de in bovengenoemde trap (3) verkregen water oplosbare fractie 20 of het binnenste oplossingsbestanddeel, verkregen door de water oplosbare fractie te onderwerpen aan dialyse of ultrafiltratie, door de kolom wordt gevoerd en de geëlueerde oplossing wordt verzameld. Zonodig wordt de kolom gewassen met de bovengenoemde 0,2 - 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer en de geëlueerde 25 oplossing en de wassingen worden gecombineerd. De ionenuitwisselaar-behandeling kan verscheidene keren worden uitgevoerd. Daarna wordt een oplossing die bereid is door de bovengenoemde geëlueerde oplossing te verdunnen met een fosfaatbuffer, zodat het natrium-chlorideconcentratie 0,1 molair is, door een kolom gevoerd waarin 30 de ionenuitwisselaar in evenwicht is gebracht met een 0,1 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer met bij voorkeur een pH van ongeveer 8, en de fractie die geëlueerd is met de bovengenoemde 0,1 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer wordt verwijderd, waarna de bovengenoemde 0,2 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer door de kolom 35 wordt gevoerd om een eluaat te verkrijgen. In het betreffende voorbeeld van de bovengenoemde ionenuitwisselaarbehandeling wordt 8004759 16 een fractie die niet geadsorbeerd is on een ionenuitwisselaar die in evenwicht gebracht is met de bovengenoemde 0,2 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer verzameld, geadsorbeerd on een ionenuitwisselaar die in evenwicht is gebracht met de bovenge-5 noemde 0,1 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer, gewassen met de bovengenoemde 0,1 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer, en daarna geëlueerd met de bovengenoemde 0,2 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer om een eluaat te verkrijgen. Men kan ook een methode gebruiken waarin omgekeerd de fractie die geadsorbeerd is op een 10 ionenuitwisselaar die in evenwicht is gebracht met de boven genoemde 0,1 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer verzameld wordt, en daarna een methode voor het scheiden van deze fractie van een fractie die geadsorbeerd is op een ionenuitwisselaar die in evenwicht is gebracht met de bovengenoemde 0,2 molaire natrium-15 chloride-fosfaatbuffer wordt uitgevoerd en een fractie die geëlueerd is met de bovengenoemde 0,2 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer wordt verzameld.

Vervolgens wordt het op de hierboven beschreven wijze verkregen eluaat desgewenst geconcentreerd en ontzout door 20 dialyse, ultrafiltratie of dergelijke en daarna gedroogd door lyofilisatie of dergelijke om carcinostatische stof TF-132b te verkrijgen.

Het aldus verkregen TF-132b bezit de eigenschappen als vermeld in tabel B.

25 ( iii)—1) Het binnenste oplossingsbestanddeel dat ver kregen is in voorgaande trap (U) wordt door een kolom gevoerd van een ionenuitwisselaar die in evenwicht is gebracht met een fosfaatbuffer met bij voorkeur een pH van ongeveer 8, en een 0,2 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer met bij voorkeur een 30 pH van ongeveer 8 wordt door deze kolom gevoerd om de kolom uit te wassen en daarna wordt een 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer met bij voorkeur een pH van ongeveer 3 door die kolom gevoerd of in plaats daarvan wordt de bovengenoemde 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer door de kolom gevoerd die behandeld 35 is in voorgaande trap (ii)-l) en nog het resterende geadsorbeerde bestanddeel bevat. De geëlueerde fractie wordt verzameld, desge- 8004759 17 Λ * r wenst geconcentreerd en ontzout door dialyse, ultrafiltratie of dergelijke en daarna gedroogd door lyofilisatie of dergelijke ten einde een carcinostatische stof T?-133a te verkrijgen.

Het aldus verkregen TF-133a bezit de eigenschappen als 5 weergegeven in tabel B.

(iii)-2) De fractie die niet geëlueerd is net een 0,2 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer naar geëlueerd is net een 0,3 nolaire natriumchloride-fosfaatbuffer in de ionenuitwisselaar-behandeling wordt verzameld op de volgende wijze, die dezelfde is 10 als in bovengenoemde trap (ii)-2) voor het verkrijgen van TF-133b.

D.w.z. dat de kolom die net de ionenuitwisselaar geuakt is, in evenwicht wordt gebracht met een 0,3 nolaire natriumchloride-fosfaatbuffer net bij voorkeur een pH van ongeveer 8, waarna de bovengenoemde 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer van de 15 in bovengenoemde trap (3) verkregen water onlesbare fractie of het binnensts oplossingsbestanddeel, verkregen door de water oplosbare fractie te onderwerpen aan dialyse of ultrafiltratie, door de kolon wordt gevoerd en de geëlueerde oplossing wordt verzameld. Zonodig wordt de kolom gewassen net de bovengenoemde 20 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer, en de geëlueerde oplossing en de wassingen worden gecombineerd. De ionenuitwisse-laarbehandeling kan verscheidene keren worden uitgevoerd. Vervolgens wordt een oplossing die bereid is door de bovengenoemde geëlueerde oplossing te verdunnen met een fosfaatbuffer zodanig 25 dat de natriumchlorideconcentratie 0,2 molair is, door een kolom gevoerd, waarin de ionenuitwisselaar in evenwicht is gebracht met een 0,2 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer met bij voorkeur een pH van ongeveer 8, en de fractie die geëlueerd is net de bovengenoemde 0,2 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer wordt 30 verwijderd, waarna de bovengenoemde 0,3 nolaire natriumchloride-fosfaatbuffer door de kolom wordt gevoerd om een eluaat te verkrijgen. In het betreffende voorbeeld van de bovengenoemde ionen-uitvisselaarbehandeling wordt een fractie die niet geadsorbeerd is op een ionenuitwisselaar die in evenwicht gebracht is met de 35 bovengenoemde 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer verzameld, geadsorbeerd op een ionenuitwisselaar die in evenwicht is gebracht 8004759 13 met de bovengenoemde 0,2 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer, gewassen met de bovengenoemde 0,2 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer en daarna geëlueerd met de bovengenoemde 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer om een eluaat te verkrijgen. Men kan 5 ook een methode gebruiken waarbij omgekeerd een fractie die geadsorbeerd is op een ionenuitwisselaar die in evenwicht is gebracht met de bovengenoemde 0,2 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer verzameld wordt, en daarna een methode voor het scheiden van deze fractie van een fractie die geadsorbeerd is op een ionen-10 uitwisselaar die in evenwicht is gebracht met de bovengenoemde 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer uitvoert, en een fractie die geëlueerd is met de bovengenoemde 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer wordt verzameld.

Vervolgens wordt het op de hierboven beschreven wijze 15 verkregen eluaat desgewenst geconcentreerd en ontzout door dialyse, ultrafiltratie of dergelijke en daarna gedroogd door lyofilisatie of dergelijke ten einde de gewenste carcinostatische stof TF-I33b te verkrijgen.

Het aldus verkregen TF-133b bezit de eigenschappen als 20 vermeld in tabel B.

(iv) De water oplosbare fractie, verkregen in bovengenoemde trap (3) of het inwendige oplossingsbestanddeel, verkregen in bovengenoemde trap {h} wordt gevormd in een 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer met bij voorkeur een pH van ongeveer 25 8 en de verkregen buffer wordt door een ionenuitwisselaarkolom gevoerd die vooraf in evenwicht is gebracht met een 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer met bij voorkeur een pH van ongeveer 8. De geëlueerde oplossing wordt ingesteld door toevoeging van een fosfaatbuffer zodanig, dat de natriumchlorideconcentratie 30 0,1 molair bedraagt en daarna door een ionenuitwisselaarkolom gevoerd die vooraf in evenwicht is gebracht met een 0,1 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer die bij voorkeur een pH van ongeveer 8 heeft en vervolgens wordt de bovengenoemde 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer door die kolom gevoerd, waarna de geëlueer-35 de fractie wordt verzameld, desgewenst wordt geconcentreerd en ontzout door dialyse, ultrafiltratie of dergelijke en daarna wordt 8004759 19 r gedroogd door lycfiiisatie of dergelifke ten einde een carcino-statische stof TF-1323 te verkrijgen.

riet aldus verkregen TF-1323 bezit de eigenschapen als vermeld in tabel B.

5 (v) Het binnenste opiossingsbestanddeel, verkregen in bovengenoemde trap (H) wordt door een kolom gevoerd van een ionenuitwisselaar die in evenwicht is gebracht met een fosfaat-buffer die bij voorkeur een pH van ongeveer 8 bezit en een 0,5 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer die bij voorkeur een pH van 10 ongeveer 8 bezit, wordt door die kolom gevoerd om de kolom uit te wassen en daarna wordt een 0,6 molaire natriumchloride-fosfaat-buffer die bij voorkeur een pK van ongeveer 8 bezit, door die kolom gevoerd, of in plaats daarvan wordt de bovengenoemde 0,5 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer door de kolom gevoerd, 15 die behandeld is in bovengenoemde trap (ii)-2) en nog het resterende geabsorbeerde bestanddeel bevat, waarna de bovengenoemde 0,6 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer door de kolom wordt gevoerd. De geëlueerde fractie wordt verzameld, desgewenst geconcentreerd en ontzout door dialyse, ultrafiltratie of dergelijke 20 en daarna gedroogd door lyofilisatie of dergelijke ten einde een carcinostatische stof TF-136 te verkrijgen.

Het aldus verkregen TF-136 bezit de eigenschapnen als vermeld in tabel B.

(7) Verzamelen van carcinostatische stof TF-1U0.

25 Bariumionen worden aan de cultuur of de bovenstaande vloeistof daarvan als verkregen in bovenstaande trap (1) of (2), of aan de water oplosbare fractie verkregen in bovenstaande trap (3) of aan de oplossing verkregen door TF-100 op te lossen in water, toegevoegd ten einde een bariumzout te vormen, waarna 30 het neerslag wordt verzameld en daarna wordt onderworpen aan een methode voor het verwijderen van het barium en de water oplosbare fractie wordt verzameld en daarna onderworpen aan dialyse of ultrafiltratie ten einde TF-lUO te verkrijgen. Meer in het bijzonder wordt een waterige bariumhydroxydeoplossing, bij voorkeur 35 een 0,1 - 0,5 molaire waterige bariumhydroxydeoplossing, aan de cultuur of de bovenstaande vloeistof daarvan als verkregen in 8004759 20 bovenstaande trap (1) of (2) of de water oplosbare fractie als verkregen in bovenstaande trap (3) of aan een waterige oplossing die verkregen is door TF-100 op te lossen in een 10 - 15 keer zo grote hoeveelheid water, toegevoegd en de pH van het verkregen 5 mengsel wordt bij voorkeur ingesteld op 10 - 13 ten einde een bariumzout te vormen. Er zet zich een neerslag af door toevoeging van een bariumhydroxydeoplossing en de toegevoegde hoeveelheid bariumionen wordt bij voorkeur zo ingesteld, dat de concentratie van de totale bariumionen tot het eindvolume van het mengsel 10 0,005 - 0,1 molair bedraagt. Het aldus verkregen mengsel wordt afgefiltreerd en een methode voor het afscheiden van het barium uit het verkregen bariumzout wordt uitgevoerd. Het barium wordt bij voorkeur verwijderd door toevoegen van het bariumzout aan natriumsulfaat, bij voorkeur een 5- 15^'ige waterige natrium-15 sulfaatoplossing, roeren van het verkregen mengsel en daarna uitvoeren van een filtratiemethode om een oplossing te verkrijgen. Het neerslag dat zich heeft afgescheiden en verwijderd is, wordt opnieuw gewassen met een waterige natriumsulfaatoplossing en de wassingen worden gecombineerd met de bovengenoemde oplossing. De 20 aldus verkregen oplossing wordt onderworpen aan dialyse, ultrafiltratie of dergelijke ten einde de overmaat natriumsulfaat of lager moleculaire stoffen te verwijderen en de verkregen oplossing wordt daarna gedroogd door lyofilisatie of dergelijke ten einde een carcinostatische stof TF-lko te verkrijgen.

25 Het aldus verkregen TF-lkO bezit de eigenschappen als vermeld in tabel B.

(3) Verzameling van carcinostatische stof TF-150.

De water oplosbare fractie als verkregen in bovenstaande trap (3) of de binnenste oplossing als verkregen in bovenstaande 30 trap (k) wordt behandeld met een kwaternair ammoniumzout en het gevormde neerslag wordt verzameld en daarna onderworpen aan een dissociatieproces waarbij een oplossing wordt gebruikt die natriumchloride bevat, waarna een hydrofiel organisch oplosmiddel aan de oplosbare fractie wordt toegevoegd en het aldus gevormde 35 neerslag wordt verzameld en daarna gedroogd ten einde TF-150 te verkrijgen. Als een kwaternair ammoniumzout dat hierbij gewoon- 8004759 21 lijk kan worden gebruikt, lean ieder complex net een polysaccharide zijn, en voorbeelden daarvan waaraan in het bijzonder de voorkeur wordt gegeven, zi.jn cetyl-pvridiniunchloride, cetyl-trimethylammoniumbronide. De behandeling net een kvaternair 5 ammoniumzout wordt bi.j voorkeur uitgevoerd in aanwezigheid van een buffer, zoals een boraatbuffer. De benadere beschrijving van de bovengenoemde behandeling met een kwaternair ammoniumzout en de dissociatiemethode met behulp van een oplossing die natrium-chloride bevat is als volgt. Een waterige oplossing van een 10 kwaternair ammoniumzout wordt b.v. drupnelsgewijze toegevoegd aan de water oplosbare fractie als verkregen in bovengenoemde trap (3) of de binnenste oplossing als verkregen in bovengenoemde trap (k) terwijl de pH zwak basisch wordt gehouden en het ver-kregen mengsel wordt 10 mm. tot verscheidene uren bi:] 0 - 50 C 15 geroerd, waarna het afgezette neerslag irordt verzameld. Het neerslag wordt verscheidene keren met een buffer, bij voorkeur een 0,1#'ige boraatbuffer, die 0,1 molair natriumchloride en een geringe hoeveelheid van een kwaternair ammoniumzout bevat, gewassen, en daarna gedissocieerd met een buffer, bij voorkeur een 20 0,1#'ige boraatbuffer die 0,5 molair natriumchloride en een geringe hoeveelheid van een kwaternair ammoniumzout bevat, ten einde een oplosbare fractie te verkrijgen, en daarna wordt de oplosbare fractie bij voorkeur ingesteld op pH 2 - 6. Vervolgens wordt een hydrofiel organisch oplosmiddel, bij voorkeur een 25 alcohol, aan de oplosbare fractie toegevoegd, zodat de concentratie daarvan tenslotte 50 - 90 vol.#, bij voorkeur 70 - 90 vol.# bedraagt en het aldus verkregen mengsel laat men verscheidene uren tot 90 uur bij 0 -30°C staan, waarna het afgezette neerslag wordt verzameld ten einde een carcinostatische stof 30 TF-150 te verkrijgen.

Het aldus verkregen TF-150 bezit de eigenschappen als vermeld in tabel B.

8004759 22 I ' j \

" I

Ρ Λ I H

t i Ρ β H H

•H +3 -r-C 0 » >s X

(I) p Ρ Ρ X X

X Js P P o x p P P x! ο ρ ·η cd p cd +J n Ό cd ·Η X Ο d Λ X ω ο 6 Ρ ω (η ο "X !η 4! Ο Ρ Η Η Ο - = ε = Η cd Ρ- Ο " ft +3 Ρ: X ο Ρ p Ο Cd · C ra Ρ Ρ ο Ρ Ρ Ρ ο ο X -ρ ο -ρ ai Η X Ρ Η Ο X ft Ρ Ρ Ο X Ο χ ο ο ε Ρ u Ρ ο

<D

'ϋ ρ ο cd cd ai ai o ρ 03 C Ti Ό Ρ Ό co Ό xxaic xcai x>— pp bs o o u o ρ u o x aio icdcd

P *β .H x p P np.rCNp fl.H x cd P

•H Ρ Η X O O Ρ Η ·Η S Ρ H O g Ρ P

X O p P N X # 3·Η Ρ Ρ X O Ρ X

Pi Ρ X X ·η P Ρ X Ε X Ρ X X U N P

ai χ W M p g X W w χ (Η Ρ Ρ ·Η E

£ ·Η Η ·Η ·Η ·>-3 O ·Η X Hi 3 Ή X Ρ Ρ -Ρ X Ρ X Ρ £ Ρ W β g Ρ cd PP<D"-3W ρ cd χ ρ pcd ra X X > X Ο X t* Ε X > * β,Γ3 Ο ο ρ χ ρ ρ s = ρ ρ χ ρ ra poop ο ο ο χ ο ο ο χ Ρ = •Η X *Η g Ρ g *Η X Ε ·Η X g ρ ε χ to χ χ 3 ο Ε χ χ Ρ ρ χ χ 3 ο ρ ε ο ο cd χ Ε ·Η ο cd χ ο ci d ρ g φ ·η η η cd ρ 3 · ρ Ρι ο · ρ ρ 3 ε ρ ο ρ ο w χ ρ bo ρ ο ra be ρ ο ra χ ο ρ bo X Ο ft ft Ο PP ft ft Ο X Ρ ft ft O Ρ O Ρ Ρ Ρ ·Η X Ρ Ρ ·Η X X Cd X «Η X Ρ X Ρ ·Η

CH Ε 1) Η ·Η ρ X Ο Η X X X Ο Η X X Ο X

Ρ Ν Ο Ο Μ X Ρ NOU Ρ NOUraPXP

Ρ ppraPPp ρ Ρ ra ρ ρ ppraPPPP

ft Q ft d ^ ί Ω pi d «I ρ Ω ft Cd !> U X > Ρ X X ·Η *1 0 ·Η Ρ •Η |3 Ρ Η 1 X Ρ ρ ra χ ρ Ο X X ζ ε ε ε X ·Η Ο Ρ •Η Ρ ·Η Ο X Ο Η Ρ, Ρ Ρ ft &

X

ο ω Ρ Ρ ω ρ \ο ρ •Η ·Η Ο Ο Ο «- CV1

Μ X Ο >- CM CX CO

ü r— r— t“ r— r—

PI lil I

P ft ft ft ft ft ft Eh E^ E-I EH E-1 8004759

/ I

< 23 o u w ρ. o +3 c ·

m ·Η 4) bS

tj o m c W M-t 4j cd Ti Λ! fö cd ^ u & xi v a (do ^ <u ·η ö H ^ H <U «} λ\ ·Η ^ 'Ö η Λ Α Ö α

'S Ö W 0) V

Cj ·ι-Ί £h “ d ·Η (1) t£= = = = = ω 2? 2 d = h d ^ s 2

o +3 E

S O D'Tr( U HS ·Η ·Η +3 o -p ^ μ

> l·! aj O

(ü <U O 2 N 'h Ë Ë <u ·η 3 E

O H +3 ·Η fit a fii cn „ _ !M on on cj vo o o co on on on on -3· ir\ I- Γ" r- r- r- <— r—

I I I I I I I

fiL &L fc fc k h P=H

IPi IH H EH EH ^ EH

8004759 2k j i j

si I a I

3 1) I <D I 4) 4) I

in ·Η Ο Λ ·Η Ο Λ ·Η Ο " 4J +J Ο Ο +3000 +300 ο α,ΛΟ-ίΐ- ftvo-=ro ftvo-d-

φ ρ rovo ρΓγοό ο Pi COO

ρ. θ'- Ο t- r- O '- w wei-· well to e I « · 4J t— P CÖ O O'- ioo flip o*-

•h I cö i> ¢-.4- I cö > ¢--=1- «J > £-·£ I

+3 s vaw E O’- ocjE

Cl ü 4_3 CJ +Ϊ -P Γ- r- 4J +D r— x— O

M •Sm^ ζτΗ in ^ S-l ^ 0 <D 3 * «Ό <D 0 * Λ <v 0 * ** Ο

02^ φ 2 O O C\] (1)000 <D 0 Ο O CVJ

0 (u xj^oncoco iJr^onvo & & rococo

CjJtJ Ο 0Π O Cn o? 0 gojoj'-c Stuw»- gajcM^c ϋ Λ B-diiaj r 3·ϋιι p ti ι ι 4) O +J Ρι Ο O p< o o u o o o ai |3 ÖV04 0 +3 eve« · +3Cvc:.~ro

Is s U.H Cs-4- O O ·Η ON COr- O ·Η 0-4-0 Π5 <U OJ'-O 4) 04«-! 0J ° 1(^ p, c i— P- Ö d Cl fl *—

S-i 23 W (U " * I K 4) *« « O W 4) " " I

c y TdOCO TJCO -Ö o o o (—| —- +3 C O Lf\-4· +3CCLAC -P C O LTN-d- 4> cd cm m <- 4) cd cj l/n cm 4Jujojirv«- s ,a ro T- i- te fl: co — co S+3COT-»- v ö 'd ca <u -ö O)

Η 4) 4) O

4J Η H O

& +3 +3 O

cö a c o

E-( O O OJ

bC II m h H +3 4) 4) o <u > a o >

Pi 0 0 4) 4) 600 tt t> +3 4) d § ^ ° P, 4) Pl Ό ~ ~ = m ·Η 4) ·Η

bO +3 4> P

c o > •H (o 4) 05

Tl Pi bD ·Η 4) tw C +3 Η O Λ +3 4) o e n ·ι-3 tö

O 4)Ή P

flflx c 4) ft & Λ

O

ü)

S 4) 'd O

bo -h o ° o rz w

•H +> o r- CM co CO

w S 7 7 7 J J

Ê £ iï IS S & 8004759 25 ί I ; I i

I I

I I

i pa

iH

£ Ο) 4) 13 a -ο ΰ -n =; a) χ} <υ ^ ^ rs <u · o

hi! 4) 4) O 4) 4) CP

,_j r-1 Η Ο *H Ή O

O .p .p O 4-3 4-> O

^ £3 Cj CO £h CJ ’Ό

£ Ο O <M O O CJ

> a) a *h «U a ^ +j <a <u -p <v <v t) ¢) Ö O > Ö C' > 0 0 4) 0 0 4)

b£> O b3 to O isO

0) >- 0 0) «- C

P CJ O ,0--0 0) Jh ·Ό <1) S-i *»-= ♦H 4) ·Η ·Η 4) ·Η -p 4) Ρ +) ί) ί Ο > 4) >

Cd 4) to cd 4) tü

— — — — — £-i tC ·Η in tC-H

dn a -P 4-1 O +5 ο Λ o si 4) O 4) 4) n cd ί) ·π d 4) ·Η f-l 4) ·Η Sh Ο ,α fi p!

J3 Cd ,£> CO

CM CO CO CJ Ό O O

CO CO CO CO CO _3- LTN

T T I I I I ,1

i=i t) &H

EH Eh Eh Eh Eh Eh Eh 8004759 *

2C

\ / \ i c~

CM

n T j P o K C C P co C C P s Cl la P o C 3 ·

I ^ X- rC I

Ο -P -P O · C H

c i'« a > «- g X <3 S VO P Pt

O CO

ρ c ί a td M !> 4) Pt

P

P------- 4) in » : o o p o o ! £ p Pt t~ o c o I pt

3 · "CO

O £! > o

VO · on C H

CJ O > 1Λ β Ë

P I

C O O O * G ro co c t— H > Pt CO 00 jr è _ •η Ρ ή Ρ Ρ Ρ

Η +5 C CC C C

4) ρ. i) cc CC CC CC CC

,ο Ρ ίο ρ c cc cc cc cc CO-H 4J > CJ !> 4> > 4) !> 4) > E~* MP ·η ·η ·η ή ·η ,a !) pp pp pp pp pp fe£ C P Ρ, P CC Ρ. P p. c c- c r-ι c ccs ccs ccs ccs ces

OPS:-'-' OCG OCG OCC OCG OCC

> u—«-> S tc p wp ui jz d p ω p

CH OC PO P O P CM PO PO

cosc'-' cd o vo cco cd ω c- cd ai vo cd a> co

> .-I 3 Ή P CU P CV! P 0J P CJ P CM

t» Ρ Μ X 4! O <U 42 Φ

C P n C PCI PCI PCI PCI PCI

C o o S ·γ—! ·»-ί »f-i »c ·α

P 42 H _ C VO C VO C CO CVP CO

H pj C-ι o- cd C LA cd C la CCVD dl C 1Λ CCt—

O W O <aj 4) CM < 5) CM < 41 CM < 42 CM < 42 CM

I CM I CM «- IC- I VD

0J " CM" O " CV " CO"

CVi "LTV "IXV "CO "LA "CO

<l) —^ _=r Pt CM pr CM

P S

c------ C I CM I CM I LA 1-3· I t— p Cd ^ CM" IA" LA" 00" LA"

.-J £ Vï. "LA "LA "LA "PT " LA

cd --- Pd" -3" Pf CO Pt

POP

JH JQ --------- -||>.- - ll I................. ............. I' "" II I I " .............

Ot> IIP IO I CM IO ICO

SH"" VO" CV" <— " O" 00" ® tj H "LA »1— "O "Pt " σ\

HG'—- O ΓΟ LAPt LA-3- O CO Pt CO

33 Cd O CO COCO CO CO

_

O

P.

P.

cd

P

o

Ui c

0) O VO O

bO ·Η O O O — CM

Η P O *- CM CO CO

S3 O i— t— r— <— r— cd i ll i I i

Gh pL4 pti E-* EH EH Eh ^ 8004759 i 27 i i i i j

+3 -P

u u s s " 2 "2 T3 Ό Jc Φ & Τ3

S S Ö S S C S

S S S S S o> So SS S S SC

ft S S S S u r) SO S S S S S ® <u > o os o g <u> o > a> > H —1 ·Η ·Η S C ·Η S C ·Η ·Η ·Ρ O -P +3 -P+1 +3.Η -Ρ ·Η -Ρ-Ρ +-3+1 Ρ> -Ρ ,α & s ft S _ ft ο ft o p< u f. S F-’ b =

S SSS SSS S S co S S co J-.3S SSS S S S

£h OSS OSS O ®CJ O <1> CM OSS OSS OSS

CflrQ ta S3 W T) M'S WrQ U3 .Ω 01 & tc^o ,g cm +3 s I -gsi rO c β° -5 -, .9

H di ¢¢0 S <D Ό SO SO S <D VO S 0) VC S JU VO

O S CM Ό OJ xi O χ| in Ό CM Ό CM Ό OJ

>0) 4! <D O t— Ο O VO OJ S3 j ®

S t) S I ϋ s I Ό M CM "Swcj Td s I TiSI 'SSI

<U ·Η ·Η *H *ri ·Η r· S m SCO SSS SSS S VO C m S S VO SStA SOS S <D S S S in B S 1Λ S S in

<3 d) CM < <U CM «ΙΟί» <3 <u > < o CM <3 0) CM «3 <U CM

(γ*\ I h_ j3* I I m I CM

• Pi JL « J- « CO» C " O " CO "

CO " “ivo "in -VO -VO

W,|A J· m CM m irv ^ _ I ηι I Vf) I Ο I in I -S’ I VO JL „ Λ " σ\ « CM" O" I O " "IA "in -Pi -co i r·*

^ prj 0O CO CO CO

•—T {

Iir, I Ό I in I +f I VO I ° i lin ο » *- * ON" in" Ο" O " 00 nvn "CO "On "CM "CO "-S’ -o\ con t—n on n t·— co cmcm n. co

into n CM CM CM CO

m S XI CO

oo co n cm vo ο o i- η n co n -s· in I i— r— T— 1— t—

ii I I I j I I

PH ft ft pt, fc ft E-t E+ c-ι EH &-1 £* 8004759 i 23 4) Ό f\ « *· χ Ο Ο +3 OJ cvi

<υ ιη LTS

Β C I C I C

cd o cd ο ö J· ί> CM ι—I > CM Η Ι> ο -* ε -a· ε c CG +3+3 +3 4) CM ^ Λ Ο Μ "Ο h Η to 3 OM) 3 OVO 3 Ο ε ι os cxd t— 3® t- 3-3· a itn ι ο ο ι ο η o ο ε ο o co hS 0) I CM 4) I CM 0) I ΙΛ

χ; 'Ö · MO 'Ö · MO Ό · I

+3 O > > > O

a cm c · c c · c c · -3·

< VO M t> 4) M > « M !> OO

♦I 0 * K 'Ö c

00 CM O C

ox: in co co CM +3 I -3Γ 1Λ 14) CO Cl C Cl O Ë eö *- CO cd cdo > -=t rH > VO ι-M t» > -3" Η X ,3· 8 00e h O ε fC α) O +3 ·* +3 +>8+3

Td CG h O O h " O h h'O

H cd CM CcO M3 3 ova Co Coo (0X1 to 3 00 t— 3 VC C- C VO 3 -3· C\ Ό α I Ê X) l X co 1 χ <- χ oo 1

cd 4) H C I O O O

EnCGO 4)00 4)1«- 4)1 4) I CM

co X · VD T3 · LTV X · X · t— bC 4) CTs > > > >

Η 1¾ -3" C * C C · C c · c · C

O M > 4) M !> o m > m > 4) > u ï o o § a § § § o

t» 4) >· C !> >OH

g 4) H VO H

a +3 » +3 +3 ε +3

h O H Sh * H U U - O

0 3 co ε 3 ΙΑ g 30 3 O 00

VO COO C CM 3 vo C-3CO

CM XiO X 0Π ΙΛ X<- X 00 I

I CM C— O

0» CTn 4) I co 4) I 4) I CM

X · I X · I X · X · t— >0 t> (A l> 3»

C · O C · t- G · G · C

___M i> VO__I—I t> 3—__M >__M !> 4)

C

4) & S’

X

0 to

G

4) 4) VO cd

bD ·Η O o 0 »- CM

•H +3 O CM 00 00 1¾ o r- t- »- >- ^

cd ι I I I I

M fc fc fe &4

Em Eh Eh Eh 8004759 29 j 0 ö ·Η ra +> > ρ,

Η U

Ρ g Ο

Ρ W

2° & Ρ OJ (6 ρ-ί <υ 0 ι be -d · c > ·Η Ti c · ip c Μ !» rara O P3 c

0 IA

H 00 SS S c p ci c cd cd cd cd ft cd o h cd > > r* i> P ί> ΙΛ g >

Η H H H O \p H

^,PË PS PS Ρ β ra PO ρ E

B P P U U & p »o p po PO PO PO cd POO Pc

HP LA p CM PlA P LA p O >- p LA

0 P2 P2 -3" pi *- pi ·- 0) p LA I P2 ·-

B ÜO O

Cd 0 I (Dl (Dl (Dl C (DIIA 01

Eh Ti ♦ Τί· Ti · Ti ♦ .h p Ti · cO Ti· . „ _ > > > !>PC > > ö .· ö · ö · C * 0 cd c · C c · Η H i> H > H!> M > O P2 M > 0 M >

O

> u $ t* o o o S S S c e ö i ö ra ra ra ra ra ra o h ra

> > h > , ί> , > t> o s > P

S H H LA 0 PB p Ρ β Ρ β p po p

_ b "° h P »H H p "O Th " H

po pop- po po ps Poo ρ o g

PLA Ρ O C\ Pt— p Ό P PO>- PO

P2 *“ P (Π I P3 *- P *“ p O pi OO I pir-O

o on o vo 01 HI I 01 01 01 0O\ 0IO 0 I «—

Ti· Ti«vo tJ· O· Til τί·σ\ τί·ι . > _ ί» _ _ > > o > > o c · c · c c · c· c -ra· c*c c · o H> H > 0 H > H > H LA H > 0 Η > t- & ra pi ro cj co oo oj vo o o on on on on on la f— »” t"“ t— r“* r·

1 J I I I I I

fe fe B B B

E-* E-* Eh E-ι En E-( En 8004759

V

30 * i r λ λ f*

P P -P P

c c c c 0 0 0 0 p p p p ft C—I <i—i C—»

r*H M M pH

03 03 03 03 'ti τ) x! t) Ό τΡ Ό Ό •ι-i ·Η ·Ρ ·Η

Ë B B E

CO 03 CO CO

Ο Ο ο ο

r—I H rH H

B ft P P. p.

CO O 0 0 OP -P -P +3 VO 03 α)φφ CM Si · Λ JC Si c K C ft c c c +! cd S = «d si si ·

•K > > · > · > C

E la C C ft

co p vc p ft p ft -P B

P P PE PE P

to CC C C 3 ΙΛ O C 03 PO PC Pvc

p ο o VO P Ό rC

ed " IIC

E (DO 03 CO 030 (DO) 0 Ό V0 p I « si c co cc cc ccm

U M (A H 0) MO) HVO

ft -f r> ψ> φ>

OP -P P -P

-PC C C C

(0 ο ο 0 O

a ·η p p p p 0) ft ft ft ft

ιΗ Ο I—I I—I ft I—I

0) ft 03 03 03 03 Ο ^ 'Ο τΡ Ό Ό ed Ό τ3 Ό Ό

Eh C ·η ft ft ft

03 B E E E

b£ bO cn co co co

ft O E O O O O

O E C ft ft ft ft > P ft ft ft Pi

P 03 Ο Ο Ο Ο O

03 > CM

t> CM -P -P -P PC

tsD 03 03 03 43 ft

Ο Λ · si si si E

O c = K C ft C C C in ed B «3 si ed Ό > > · > · >

LA C C C

P VO P ft p ft P 03

P P B P E P

3c c c co C 03 CO CO Cvo

ο o VO Si VO Si I

" I I CO

030 03 CO 030 (DC1'")

Tp VO Tp CO Tp pT Ό I *

C CO C C CC CO

MOO 1—1 03 M 03 MCA

C

0) ft &

-C

C3

CO

C

03

M

ft 03 VO ed

ft ft Ο Ο Ο 1- CM

P O'- CM CA CA

S3 «- *- *- *- «-

Cd II I I I

P ft ft ft 1 ft ft ft Eh Eh Eh Eh Eh 8004759 I · i' 31 ί i ι Λ Λ Λ ft Λ

JJ +3 +3 -P -P -P -P

P C P C P C C

o o o o o o o in U U f* }* ^ .5-1 4-i in <U 4-1 4h <+-i *i-<

Η H f—I Η Η ι—I M

(U (1) I) P P P P

d τί Ό d) Ό Ό Ό *0 >d 'd di τ2 τ3 t?

• H ·(-* ·Η ·Η -Η *H

s s e s s s s w to m h w m ca ο ο ο ο ο o o rH ί—I ί—1 ί—I <—! <—! r~i P. P- P P p· p £- o o o o o o o • -PG-P +3 -P +3 4-3 4-3

0)-H(U P P P P P

42 S 42 · 42 · 42 42 42 -P· cc p Ö W Ρ m Ρ ·Η P P c c '5

cd la cj s PS eo · cd cd PS

>ι ί> > >c > · > τ >_

LA CJ CJ Ö PC

4J_d- +3 O +3 ΙΛ -PS 4-3 · Η -Ρ ·Η -P LA

P U U P PS PS pi cqpp g P pp go g g Λ 2¾ d P d P d P d LA PO d O d -3- M 42 42 42 42 42 O 42 0 42

¢) « * » P ( I P

42 <UC\ (DO 4)0 Ρ P 4) CJ 4)0 4)0) ö tj tn -do d) co -d "d -s· di -3· "d

Eh ί ί I **

POJ PO pco Po PP PP P£J

by M CO 1-4 0 MOO Η η M 4) M4) MOO

rH

____________ ^ A A A A Λ ft ft

p 4-3 -P +3 +3 P P -P

(UP P P P p P P

>0 o o o o o o P P P P P p ,54 (p ip O-ι Oh 4-, ip (p Μ H t—I Μ M r—I ί i 4) 0) 4) 4) 4) 4) 4) di >0 d! 43 di dl dl di di di 'd di d) 'd • Η ·Ρ ·Η ·Η ·γ4 ·Η ·Η s s ε s ε s s μ ω η tn κ w w Ο ο Ο ο ο ο ο Μ ί—! Μ Μ Μ Μ Μ

Pi CU Pi Pi Pf ΡρΡ- Ο ο ο ο ο ο ο Ρ·Ρ ρ Ρ ΡΡΡ Ρ 4) Ρ 4) 4) 4) 4) ·Ρ 4) 4) 42 ·Η 42 42 42 β· 42S 42 42 ^ Ρ Ρ Ρ Ρ·Η Ρ Ο Ρ Ρ·Ρ

cd Ο cd · cd PS PO P PS

i> crs > P i> · > >1 > · >

I ·Η Ρ O CJ Ρ O

poo PS Ρ·Η -P LA pp· p-p p ia f4p U U £ PI P PS 21 d do d d co dp d d co

dp d la do d p do do dP

42P ο 42 (a 42 42 420 42 p 1 p « i p

4)t— PP p Os PP PO PO PP

df co d) "dp to "dp dp Ό I A A I ft

PO pco PP PO pco PP PCJ

MiO HCO HP M CO MCJ MP MCO

Έ cd 42 co CU to ¢0 CJ 0 0 0 CO <0 CO CO CO P LA 1 8004759

I II I I I

&i pti fe fc, [ii fc ^ EH E-C El S-ciE-i

. I

32 , ί

i I

c

•H

ί—I

0

fe (U

1 *H

P + + + + + > d 0 (1) J h

rH

O

E 0) i rH +5 Ο ϋ + + + + +

El d ö <u

Hi £·(

cT

(—· 7 a o Ο Ή

P

DEO + + + + + • h p d

pD P CJ QJ

U < u rH d a) <u , u ------- d i-ι _+

E- 2 C

<D K

fcC H OJ

H « K 0 O I ·Η

> HP

U Ο O

(I) d d + + + + + > <U 0)

Jh

Λ <D

CJ "H

W P

•HO + + + + + H d O 0) '

S U

ω c

•H

SH 0 E Ή

!>> H

Λ O + I 1 I I

d d

•Η O

a u_____ c'e o a & a o m

C

a> <u Ό d

fee ·η o o o r- CJ

•Hp o «- cj n ro HO r- t- «- r- r-

d I ί I ί I

>-i Η Η Η H

Ch Eh Eh E-ι Eh Eh 8004759 +- 33 + + + + + + + + + + + + + +

P3 I—I

0) + + + + + + + s

M

0-----

U

<U

> + + + + + + + + + + + + + +

I I I I I 1 I

fi> «3 & co CJ on on c\j ό o o tn on on on on jt ir> 1 8004759

I I I I I I

fc fc fe (i, fri E-ι E-» E-< E-ι £-i 3k ---,- 1' ^ ö 0) +3 Vï. ΐβ α> — >—1 S cd <u oj fa2 Ό P O ^

3 O) P

!h a « _ «'HE o o o c o

<13 P A A A A A

a 3 to on oj co co co

4J.D- cvj oj r- CM OJ

•Hi—I £ 3 cd *h · · · · · H cd (d cd cd cd 0) S 0 ü O V V ü p 3 &.

ri a I t I I t I

Cd G) fa"; £ a in co o o ¢) 15 » «» o ·> * faOCO O CO ·* C co 4J ¢) w OJ <- ON <~ •H > tZ Η P · · · · · h cd oj cd cd cd cd ® a ϋ g u υ ο ο o

rH

<u §

EH P

tS

w d I—I £-i

O Tj -P

> a> <u ·—

Sh 63 6¾¾.

d) P '—^ ί> Ή 0 3(1)(1) c o o o o

J 1 A A A A A

(uoo vo cn on o pr p ε λ ho· vo t- tfv vo

H 0) P

cd bO 0) · · · · · ,Ü ë cd cd «3 cd cd 0) ·* o u o o o b3 G) πΙ-

0) cn O I I I I I

ΐ o to • H U CM o o o c o a a a a a

cd I—I I Ο O VO LA LTV

xi fcfl rl Pf ΓΟ tA CO LA

Ü o o w ö · · · · " cd H a> cd td ed cd cd CQCdO-l o o o o o ö a) (¾ 8* Λ

O

tfl 0 0) 0) vo cd

fafl ·Η O O O *- OJ

• H P Ο Γ- cm CO CO

w u

cd I I I I I

h [xj Pp Ip fe &h EH Eh E"1 E-< 8004759 35 Ο ο σ\ o o o o λ λ η « " Λ CO ¢0 CM t— CM OJ -3- CM CM CM »“ *“ m • · · · · · : cö tö cö cö cd cd ® u o o o ' u u o i i l l I l 1 IA o o o o o

Λ Λ Λ r» O

IA CM CM *- ^ JTJ ^ T- CM i- *“ CM r~ tö Cö cö cö ώ o-ίο 0 Ü O o CJ o u ffl I—I a> 3 --------- Μ r—i

O

£ la O LA o O O ° tvi ft P λ »> Λ "

> IA IA -=! ITt O LTV LA

P _d- CO CM CM CO *- LA

cö cö aJ cö tö cd co 5 o O O o o o

1 I i I I I I

vo o o o o o o

CO \C CN ON ON LA O

CM CM *- >“ ·“ ·* ...···· cd cd cd cd cd cö oj 0 o o o a o o ,a cö . & rn Λ _ CM CO ; CO CM vo o o co CO CO CO CO J- A 1 8004759 i\ έ έ fe έ é Λ'“

V

36

In tabel B werd voor de Sephadex G-50, aangeduid met een kolom van 50 mm doorsnede x 600 mm gebruikt en gedestilleerd water als elutiemiddel; voor de Sephadex G-200 (handelsmerk), aangeduid met "*i", werd een Uit mm doorsnede x 500 mm kolom 5 gebruikt voor TF-110, 120, 132a, 133a, 136 en 1k0, en een 21 mm doorsnee x b00 mm kolom voor TF-1316, 132b, 133b, 1323 en 150, en als elutiemiddel werd voor allen een 0,1 molaire fosfaatbuffer met een pH van 7 gebruikt en voor het verkrijgen van het hoog vermogen vloeistof chromatogram aangeduid met "**i" werd een 10 7,9 mm doorsnee x 600 mm x 2 kolom van TSK-GEL G300SW (handelsnaam) gebruikt en de elutie werd uitgevoerd bij kamertemperatuur met een stroomsnelheid van 0,8 ml/min. door een 0,1 molaire fosfaatbuffer met een pH van 7 als elutiemiddel te gebruiken.

De farmacologische werking van de onderhavige carcino-15 statische stoffen TF-100, TF-110, TF-120, TF-1316, ?F-132a, TF-132b, TF-133a, TF-133b, TF-1323, TF-1U0 en TF-150 zijn als volgt: (I) Werking van TF-stoffen on cel levensvatbaarheid (kolonievormingtest).

Op basis van de methode van J.H. Kim c.s. /Cancer Res.

20 25, 698 (1965 )J, werden HeLa S-3 cellen gekweekt in Eagle’s MEM, aangevuld met 10# kalvenserum, gedurende 3-5 dagen bij 37°C, COg-incubator, waarna de cultuur werd verwijderd en een PBS(-) oplossing (een waterige oplossing die 8,0 g/1 natriumchloride, 0,2 g/1 kaliumchloride, 1,15 g/1 eenbasisch natriumfosfaat en 25 0,2 g/1 tweebasisch kaliumfosfaat bevat) waarin 0,01 gew.# ethyleendiaminetetraazijnzuur en 0,1 gew.# trypsine, werd toegevoegd aan de aan het glas hechtende cellen. De cellen werden van het glasoppervlak van de cultuurfles verwijderd en gedissocieerd tot afzonderlijke cellen door pipetteren en daarna werd het aantal 30 cellen microscopisch geteld. De cellensuspensie werd verdund met

Eagle's MEM, aangevuld met 20# kalvenserum, zodat dit 200 cellen/ml kan bevatten. 1 ml Van de celsuspensie werd geënt op Petrischalen en gekweekt in een C02 incubator bij 37°C gedurende 2b uur, waarna de verkregen bovenstaande vloeistof uit voorbeeld I(1), die 35 hieronder wordt beschreven, aan de celsuspensie werd toegevoegd, zodat de concentratie 1/16 - 1/128 werd. Aan ieder van de 1 ml 8004759 f 37 hoeveelheden van de celsuspensie die 2h uur bij 3T°C waren gekweekt werd ieder van de proefverbindingen toegevoegd en de HeLa cellen werden in elk van de gevallen 7 dagen gekweekt, 'ia het kweken werd het cultuurmedium verwijderd, waarna de kweekschaier.

5 gewassen werden met Hank's oplossing en de cellen gefixeerd werden met ÏOgew.Jj'ige ethanol en daarna gewassen werden met 100 gew..1'ige ethanol. Nadat de ethanol verwijderd was, werden de cellen gekleurd met een C-imsa kleurop los sing, waarna de kolonies werden geteld en de cel levensvatbaarheid werd berekend.

10 De resultaten zijn vermeld in tabel 0 en tabel D. De cel levensvatbaarheid in de tabellen werd berekend met de volgende vergelijking. De cel levensvatbaarheid van iedere nroefsto? wordt weergegeven als een gemiddelde waarde van 5 herhalingen.

15 Aantal koloniën in het geval

Cel levensvatbaarheid . PVf. f °eÏ~ ,· * 100

Aantal Kolomen in het geval

van een onbehandelde groep Tabel C

Werking van de bovenstaande vloeistof 20 op cel levensvatbaarheid____

Cel levensvatbaarheid {%)

Verdunning (ml/ml) -1—1——p—~— - 1;8 uur 72 uur 96 uur 1/128 79,6 66,h 80,1; 25 1/61; 30,0 7,9 5,8 1/32 000 1/16 000

Vergelijking 100 100 100 _,_____J__ 4.

8004759 38

Tabel D

Werking van de TF stoffen op cel levens vatb aarhe i d

Stof Concentratie Cel levensvatbaarheid __(^ug/al)__(J)_ 10 99,!+ TF-100 50 97,!+ __100__95^9_ 10 9^,5 TF-110 50 38,9 __100__87^3_ 10 98,8 TF-120 50 91,2 __100__83,3_ 10 96,7 TF-132a 50 97,^ __100__21*9_ 10 96,9 TF-133a 50 95,!+ __100__88j8_ 10 95,9 TF-136 50 96,!+ __100 I_9iii±_ i 10 98,5 ! 50 98,6 TF-11+0 | 100 98,6 | 200 I 96,8 i 500 93,!+ _j_i_ 8004759 f 39

Zoals uit deze proef blijkt, hebben de TF stoffen een zeer geringe cytoxyde werking op HeLa cellen in vergelijking met de bovenstaande vloeistof.

(ïl) Immunostimulerende werking.

5 Vier ICR stammuizen werden voor iedere groep gebruikt. Sik van de proefstoffen werd opgelost in 0,2 ml van een fysiologische zoutoplossing en daarna intraperitonaal aan de muizen toegediend.

2b Uur na de toediening werd 0,2 ml van een koolstofsuspensie, bereid door 1 ml Perikan Drawing Ink 17 Black te vermengen met 2 ml 10 van een fysiologische zoutoplossing die 3 gew.is gelatine bevat, intraveneus geïnjecteerd in de staart van de muizen en 1, 5» 10 en 15 min. na de injectie werden 0,02 ml bloed uit de baan verwijderd door gebruikmaking van een hematocriet capillair, bekleed met heparine en onmiddellijk verdund en gehemolyseerd met 1,6 ml van 15 een 0,1 gew.^’ige waterige natriumcarbonaatoplossing. Deze suspensie werd onderworpen aan colorimetrie bij 675 nm en de fagocyten-index, n.l. K waarde, werd bepaald met de vergelijking van Halpern c.s..

Aan de muizen in de vergelijkingsgroep werd alleen maar 20 een 0,2 ml fysiologische zoutoplossing toegediend.

log C. - log C

K--f—j—

t - tQ

waarin = koolstofpoedergehalte in bloed ten tijde tQ, en C = 25 koolstofgehalte in bloed ten tijde t.

De resultaten zijn als vermeld in de tabellen E, F en G.

8004759 bo

Tabel E

Stof Dosering Gemiddelde van K waarden (mg/kg) 10 0,035 1 + 0,01)+5 T”-100 x ' 50 0,0o05 + 0,0302 5 0,0901 + 0,0213 TF_11° 20 0,1025+0,0025 5 0,0718 + 0,0152 TP-120 20 0,0559 + 0,0197 5 0,0832 + 0,0193 TF‘1316 20 0,1001 + 0,02b6 5 0,1102 + 0,0203 TT?— 1 0 20 0,0809 + 0,0296 5 0,0351 + 0,0057 ^ 20 0,0769 + 0,017)+ 5 0,0959+0,0087 TF_13ü 20 0,1027 ± 9,015)+

Vergelijking - 0,0300 + 0,002H

8004759 hi

Tabel F

Stof Dosering Gemiddelds van K vaarden _______(ng/kg)______ TF_132b 5 0,1190 + 0,0051 20 0,1073+0,0031 5 0,0550+0,0020

rnF_ 10TL

J 20 0,1099 + 0,0075 5 0,1399+0,0011 πητ_iςη J 20 0,0577+0,0098 5 0,1^00 + 0,0075 TF"1323 20 0,0665 + 0,0126

Vergelijking - 0,0236 + 0,0035

Tabel G

Stof Dosering Gemiddelde van K vaarden (mg/kg) 1 0,0691 + 0,0156 TF-H0 5 0,09116 + 0,0139 20 0,0815+0,0200

Vergelijking - 0,0379 + 0,001*8

Zoals blijkt uit de tabellen E, F en G, vertonen de groepen, waaraan ieder van de TF stoffen volgens de uitvinding werd toegediend, de aktivering van retieuloendothele macrofagen in vergelijking met de vergelijkingsgroep en de celimmuniteit van 5 de normale muizen werd verhoogd.

(lil) Carcinostatische werking.

(a) Anti-tumorwerking tegen Ehrlich ascites tumor.

Ehrlich ascites tumor cellen werden intraperitonaal ingeënt in ICR stammuizen (vrouwelijke, 6 weken oud) in een hoeveel-10 heid van 1 x 10^ cellen per muis. Vervolgens werd ieder van de 8004759 1*2 proefstoffen opgelost in 0,2 ml van een fyiologische zoutoplossing en daarna intraperitonaal toegediend aan de rauizen eens per dag herhaald gedurende J dagen vanaf de eerste dag na de inenting met de tumorcellen, of eens per dag op de eerste dag en 5 vanaf de derde tot de zevende dag gedurende 6 dagen in totaal.

In het geval van de proefstoffen uit tabel J, werd elk daarvan toegediend aan de muizen eens per dag op de eerste dag en vanaf de derde tot en met de zevende dag gedurende 6 dagen in totaal na de inenting met de tumorcellen. Aan de vergelijkingsgroep 10 werd op dezelfde wijze als hierboven beschreven 0,2 ml van een fysiologische zoutoplossing toegediend.

De resultaten zijn vermeld in tabel H en J.

Aantal overlevingsdagen van de muizen in een groep waaraan de 15 T/c _ stof werd toegediend_χ 1Q0 / ~ Aantal overlevingsdagen van de muizen in de vergelijkingsgroep 8004759

1 A

43 ü 0) I μ 0) ·Η be a _ g τ— τ— τ— r- ^ Η Ή * -Κ * * CJ 0) Ρ Ρ

§ S WW ΙΛ ΙΑ ΙΑ VO VO VO SO VG VO VO VO

< P

'l\N ^ ^ ^ ^ a; on o w on o wwo «- o «- o on j- on o > ί ο ö o r-1 ’O Cβ Ö +3 0) C > «5 0) < H *

WO W AA O J-OOO «— VO IA O — E— WO

O^ Ό O _=} Os O Λ ^ O W o ΓΟ o VOOC— O

T—T— r- t— T—1* r— r— T— r— τ— r— t— r— t— t— t—

E-< ^ /\ Λ A /SA .A A A A A

H Ö : (Ö 4) ρ ω

§0 T- CA ° Os ΓΟ on w CM 00 W CO W CO VO CO W

rrj (Q « « Ο ” Λ " " " " " " " " " " " aa so·—' cor- r-w«- o\ os w c— j- oo w t— os vo w h H-Htd +| +| +| +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +! +1 +1

Jo ·§ §j *3 ·— vo o ia ο λ M co co on on w w co t— w

qJ Tj (H A Λ Λ A A AAA A Λ Λ *1 AAAA

EH.Hfc oco -g- W VO c— t— t— o co on c·- comost-

So on r- won’- w w *- W’-W’- w w w «- $ g A A aA a Λ Λ Λ Λ Η 63 Λ! to ö Β ω — Ρ ίώ cö G (30 Ρ ·Η rt ö Ö

ΐ 8.3 * V t LAO ^ ^ ^ VO VO VO

£ ρ ο * 1 * * XXI χ χ χ , χχχ, 00)00 00 00 „ Q ,Ο Ρ t— ί— ΙΑ Τ- ΙΑ ΙΑ Ο *“ ΙΑ Ο r- r— ί cö π) Ο Ο ο ! w οη Ο *4 w ί on οη Ιη «— r~ τ— Ο I I ι . ι · Ρ !χ< Pl, j jF< CQ Eh EH E-f E-< : 8004759 )+1+ cvi

«- r- CM CM -K

* * * * o o o c VO VO VO Ό ΙΛ ΙΛ ΙΛ in in in in c c

v x v N.\\N, VX ,-4 H

•—I I—I

r- cn t~ o ocjo cj-^rc <—coojo.p-covco <u <u o u u d ^00 N 4J -P 0) c cj cj _ cj oc ή tz c c t: g ά • H —* ^ T5 .g- vc m 0 t- t— 0 vc 00 0 co vo in c 00 vo c c u c; <u CO f— ,G O CV1CCC CO T- 0 CJf— COO t-* PJ Ο O r-4 ·Η t+

,— ,— f— ,— t— ,— ,— 1— CJ ’— «- 1— *— *— '— CJ CJ ’— I—i+J-P

/\ AA A A A AAA AAA g $ c d c cö d

tg 0 r—· H

d P, P.

r-4 Cd Cfi W

cj ^ 5 S

ςΗ G d d

C_| CJ -P -P

be cj on r- m co ο η ο; ί)

HinvD(MOJCj',ovcOLnoj ·» « " cj » m ·» >- cj τί Ό Q λλλλ λ f* n e* w* r— fj O λΟ λγ— * 4-^

> VO in CO OJ in >” *“ CV -i Cl «- t— >— CJ ,— CO r— 1— <H G G

0 +! +1 +1 +1 +1 +1 +! +! +! +1 +1 +1 +1 +! +1 +1 +1 +1 m ^ ^ o co o c\i o co m 0000 o cj co co -G -g o o dcö ·,*,·.* *>«,#. ^ o - " » ** « g ό ό cioint— CMOJt— inoco j rc p co on co _g c-· <u CMmojr- OJ CO r— PO ,G <- CJ CO CO >- (VI Μ r- 11 4) o

A AA A AA A A A A AA

G LTV C

aj co _g Ό

O CJ CJ Cd Ό 'C

r*

r—I

p. P· G O O CJ

Ό to hO

-----add CJ ·Η ·Η ί» Η Η CJ CJ CJ r-l Ό Ό d d d

VO O VO VD VO OO VO VO VO C— C— t— CJOO

>00

«««I ««I X X I : X X X I XXX I O CJ CJ

I 3 £> 1— mo mo mo t »- in 0 *-ino cj

«— CVI 0 »— *— Η O CJ

P- I H a Q

-----1 «- CvJ

VO J3 , JD i CO HK ·*«!-*<: VO <- OJ ί 00 I CJ * CO CO CO ' CO i 00

T— r— <— t— I r- -P

1 > 1 1 ; I O

lx, fe &H t*. 1 c

Eh Eh Eh &H j EH 3 8004759 !,c

'"J

j j : j ί ; c

<D I tsS

a> ·η bij 3 ε ί-ί cd cd -Ρ -Ρ ^ C G Κ C ΙΑ ΙΑ CÖfDCÖ ir\ <— I— LA >— ΙΛ ΙΛ ΙΛ ΙΛ < -Ρ ό \ <D \ ^ ^ ^ I \-Ρ OLACMPtCtiPtOCOCALAO ^ > η ° C „ ~ Η 'ê' ο ^ ρ ¢) Si

β > S

cd Φ £.

< Η ^ * to

'C

CD -—« CO Ο CO CO Ο C‘ OC Μ O 4J

_^T t“"* C\ t*·* O i-O Ό CO O f“-

r- j s_, ,_ f— ,— ,— t— «— f—· r— *—· p-J

A A A A /S A A 0 β __ cd o 2 2 g g c β ►- cd C _, cd co ---^ co β bDbO η ιλ h “ -ί Pt t— Ai Ο nj a ί " »> « pt η «ί·.

1-3 Η ·Η Ό C\ ί— «Ν'— CA LA Pt Ο *“ κ ί-I 'S φ +! +1 +1 +1 +1 +ΐ +! +! +1 +ί Ο Ό ί—I "" -.ρβ M3 C LA Pt C% V3COCJ Ο e g 4) *> " " " Λ " " " " w

Eh(U> r^t-'-cOLA Ο CM ΙΑ CA Cd co CM CM CO CM CO CO CO i- A λ A A A A A g o to --- β <u * 5

to S

,¾ -0 SC β β ' ε S ω —' H b£‘ VOOVOVO ΌΌνο Ό td β β to -ρ ·ρ « « « « ί x * x ί α> β β β ^ Η β 0) ΙΑ «— ΙΑ Ο ΙΑ Ο Ο Ο β Cd ·Η *> >“ Τ-ΙΑ Η ο Td ο ^ CT +3 Ο 2? ο ο ο > β ,β ·ρ ο Ο)

rH

r—! < -1-- * ο ο

Pt ΙΑ <η τ- *- -ρ ° i rI ο +3 El, Bh ο

00 tH s-c S

8004759 t /- 40

Zoals blijkt uit tabel H en J onderging de groet waaraan ook van de ïF-stoffen volgens de uitvinding werd toegediend de levensverlengende werking in vergelijking met de vergelijkings-groep.

5 (b) Anti-tumorwerking tegen Ehrlich vaste tumor.

(1) Ehrlich tumor cellen werden subcutaan getransplanteerd in de oksel van ICR stammuizen (vrouwelijke, 6 weken oud) in een hoeveelheid van U x 10^ cellen per muis. Vervolgens werd ieder van de proefstoffen 1 keer per dag aan de muizen toegediend ge-10 durende 7 dagen vanaf de eerste dag na de transplantatie van de tumorcellen of 1 keer per dag op de eerste dag en vanaf de derde tot de zevende dag met in totaal 6 dagen. Aan de vergelijkingsgroep werden 0,2 ml van een fysiologische zoutoplossing op dezelfde manier toegediend als hierboven beschreven. De gewichten van de 15 tumoren werden op de 11de of lUde dag na de transplantatie van de tumorcellen bepaald. De gewichten van de tumoren werden bepaald door de grootste middellijn (a) mm en de kleinste middellijn (b) mm met behulp van krompassers, en berekenen uit de volgende vergelijking: 20 a χ ,2

Gew, van de tumor = —-- (mg)

De resultaten zijn vermeld in tabel K.

8004759 h7 i i

τ— '— CJ

M *K CM * «-O’-ο VO ΙΑ O CM -3- CO O r O ~ 2

CM on CM O 0--3-0 VO -3- -3- O t— VO —« O

1— *— «— «—

-P

Λ

U

tl ·Η H £

«Ö {£·—. 0-,0-0 3 ont--3- r-OCMVO VC Ο O VC

«Ö !h fjC «— C\ «— IA VO IA -3- VO O on O —« -3" o o Q___ η η o >, t. r. Λ l> » « « “ " " " g g t— 1— ,— Ln cm «— on LT\ -3" -3" G\ VO 3V -3" CT, ¢) 3 o -p

X

ω

Al ^ w to 'c S (U -ί «-Ή b3

0 tóCVQVOVO VOVO VO VO VO VOVOVO

'tóö’ë’ö xxi xxxi XX. xi EH ‘H CÖ 0 „ _ in Cd ·Η O O O CMC «- LA O «-ir\o 0 -3 la ο o «- K -P 0 «- «-

0 0 0 Q Λ -P

bO

Ö

•H

Ö

•Η Η H

3 Cd Cd ® 0 cd cd 5 O Ö c g +j m Ο O tn 0

3 4J -P 3 -P

3 0 «Η 3 «3 ω ’Γ1

cd 3 ^ <d U 3 M

> 0 0 cd 0 0 0 > ft -P ft > ft 0 cd cd 3 cd cd o N fn p O Ih U k ·«-= -P -P A -p -p +j •Η 3 3 3 3 3 3

3: Η H CQ Μ M H

vo ^ g o «— cj on o on on on l·) «- «— «— 7

01 I I I

+3 ft ft ft ft

CO EH EH eh EH I

8004759

Jt ί+8 CM oj cu +(+( +( OJ CO Ο t— ΙΛ VO o CO O VO Ο -3 CO O O co ΙΛ Ο A .3 CO Ο 1— 1— t— • ·

__ G G

“ O 0 rH rO i—I r—I 0 0 ü O U h O O g g CO t— CO 00 00 CV CO IA*-OVO 03 -3 co a co <- vo cu vc co o +3 p

Λ Λ i» A fi A P ri ft ft «V

rococo A -3- (O A A CO CO O', 0 0 T3 Ό

ft CC

0 0} H > > 0 O 0 0 0 ·Η ·Η

EH +3 P

0 C

bC PP

H C C

o 3 d ^ ,—1 i—i fH ft ft 0 ω ω

ï> CC

cd c c u P +3 C— t— VOVOVO \£> VO Ό 00

O O

KXIXXKIXXXI

cd cd

AO »- A O t-AO CC

*” *” bC tjC

0 0 O O

----(U 0)

O O

H -- -rr 0 0 C 0 0

O m m O O

+3 0 0 •H 0 0 ft ft C C 0 0 0 0 0

ft > ?* O O

0 0 0 i—t i—1 ?H k h 0 0 +3 +3 +3 0 0 C G C ft ft Μ Μ M 0 0 m w

«- CM

<0 & +< tt CO VO co co co co

*“ v— t— 4J

II I o ft ft ft o

&c E-ι I E-ι S

8004759 «te i 1*9 (2) Ehrlich tumorcellen werden subcutaan getransplanteerd in de oksel van ICR stammuizen (vrouwelijke, 6 weken oud) in een hoeveelheid van U x 10 cellen per muis. Vervolgens werd elk van de proefstoffen aan de muizen toegediend» die verdeeld waren in 5 groepen voor intraveneuze toediening, intraperitonale toediening, subcutane toediening en intramusculaire toediening, in een dosering van 10 mg/kg of 20 mg/kg eens ner dag op de eerste dag en van de derde tot de zevende dag gedurende 6 dagen in totaal, na de transplantatie van de tumorcellen. Aan de vergelijkings-10 groep werden 0,2 ml toegediend van een fysiologische zoutoplossing op dezelfde wijze als hierboven beschreven. De gewichten van de tumoren werden bepaald op de 13de dag na de transplantatie van de tumorcellen.

De resultaten zijn zoals vermeld in tabel L.

8004759 50 &S.

O t— O MO MO O M3 <- *- t— MO O

\ -a-ο c\iw-iwin-ï\oj-o

Eh t- u 0 a 3 -P -~- bG Td ^ f—i a; -p co «- >- -=f cj cm t- vc m cm e··

3 i CO *“ CCCCCCCOIACOMOCMCM

•η .η co co <- <- cm >- co cm -a· co mo £ £ <u <u c te te E! --h H tO 5h &

0) S O! OOCOOOOO

,JmbO T- t-CNJ'-OJ'-CM'-rjl O 8 H d'-' <ü

.O

Cd £h to c

•H

Ö <u

•H H

Ό cd Jh φ cd ·Η o e cd

•P m en o H

3 0 -P 3 c φ Φ ·η c o cd ö ö k cd en i > <u φ Φ cd 3 > > o* -p ε Φ cd cd cd El cd N ^ Sh O in

O +3 -P -p & -P

•H ö ö ö 3 ö

OS W Μ M CO M

cd cd

CM CO

co <o <tH «— i- O 1 1 -p CO EH Eh 8004759 ♦ *

Zoals blijkt uit tabel Z en L wordt een tumor stroei-belemmerende werking waargenomen in ds groeien waarin ieder van de TF-sboffen volgens de uitvinding werd toegediend.

(c) Anti-tumorwerking teren Sarcoma-13l carcinomen.

5 Sarcoma-l20 carcinomen werden intraneritcnaai getransplan teerd bij ICR stamnuizen (vrouwelijke, 6 weken oud) in een hoeveelheid van 1 x 105 cellen per muis. Vervolgens werd ieder van de proefstoffen intraperitonaal aan de muizen toegediend in een dosering van 1 mg/kg, 5 mg/kg of 10 ng/kg een keer oer dag van de 10 eerste dag tot de zevende dag herhaald gedurende in totaal 7 dagen, na de transplantatie van de tumorcellen of eens per dag on de eerste dag en van de derde dag tot en met de zevende dag gedurende in totaal 6 dagen. Aan de vergelijkingsgroen werden 0,2 ml van een fysiologische zoutoplossing op dezelfde wijze als hierboven 15 beschreven toegediend. De resultaten ziïn weergegeven in tabel M.

8004759 52 e o

I N

0) .r- t: 3 H £

cd Φ -K * * -K

-P P

C m in cd<U VO VO VO VO VO VO VO VO VO VO VO VO in m *- < +3

l\ X V ^ X X V ^ X ^ V N X V

I-1 A

<u c\i«-oo p- on *- o on on cm o in u\ c >

0 C Φ H

cd c P 0)

C !> cö <U

< H

* O ^ C Ο v- C CO on CM O t- cm vo ο O Q o

T- »- c in p- *- c in p- p- o c o C

C-( <—^ t— 1— 1— v— t— r— τ— i— r— T-* *— r— 0^ ΓΟ ’—

A A A A A AA A AA

d ö ed a) p to on d (d * cö ό ο o on id ta ,,, tö'-' +! +1 +! rrj £* Η ·η rf co cm on cm on m a cj cm on o cm ο ο o ^71 (jj ^ f\ *s n a η λ is f> r is Λ is r> fs λ ^ d ΰ m -- c\ o c— »- cs o c— co c\ cj (\i p γΜ-οη cm cm cm <- on cm cm >- on cm cm - p- p- *-

“ S Φ ^ A A A A AAA A A

a3 1) >

Eh Ο O

........11"" ...................·* *

00 I

p ο \ o to -p g

— H

td Ö VO VO VO VO MO VO VOVOVO C— Ρ ω P 0)

C C ίώ K K * I «««I K X * I ««I

, J j $ £* i-i cd ·η o in *- o in <— o in *- on Φ a *- *- — ^ w P a>

O (U -H

Q λ n cd cd cd p CM on vo cm on on on on

o 7 7 I I

P P=, CO Eh Eh Eh Eh 8004759 53 OJ <-

* CVJ HK OJ

+: +:

O O O IA O Q O

t— t— t— t-1-τ- LA LA LA

'n \ X V. ^ V \ V N \ N \ X

O O t— O VO LA O LA l3- O -3-1-0 r· «— d c ¢) © 'ö

r-H rH d Η Η CÖ Φ Φ P COW

d d Φ Ο Ο Ο

_ +3 Ρ C

φ 0) Φ Ν Ό Ό Φ d - d C Φ

VC VC VO Ο ΙΑ Ο C τ- VC Ο <- t— Ο CÖCÖtC

CO CC VD Ο LA -3-0 Ο >- σ t— C— Ο r-i» CM C! CM r- CJ pj - CM OJ »- CM «- *- fc£ A A* A A A A A A A .«S .¾ 3

P -P Φ cö d H

SI P 4j H

d d 0 I—I Cti CÖ > C - ------ ί—! —1 rO i—t Ï-U d CÖ W W ·Η =H LA CO d d COCO VO VO VO " ΙΛ A ON λ LA CÖ d d

Λ * ΛΛΛ Γ- Λ Λ Λ £\J Λ ^ Ét GJ

η o o vo co omen <- a oi co >- oj ρ ρ τί > +1 +| +] +! +1 +! +! +1 +1 +! +1 +i +1 φ φ φ d Ό Τί > Φ Ο Ο CO Ο Ό CO C\ C0 Ο 03 Ο Φ

ί\ Λ ** ί> Λ *» *» Λ •'•'«'CÖCÖl—I

OOt— -3- 3· CJ Μ CO Ο -3* C3 -3--3- d G d -3- -3- CO v- CO CO »- CM CO»- 00 CM *- Φ A A A A A A A A .A $ $ §

Tl Ti Φ φ Φ Ό P P W W C LA Ο Φ CO -3- d £0 φ Φ > T) T5

____OJ

& c- + 0 0 w ta μ h d ö cö

•H -H

f—I r-i »— t— t— t— t-t— t—t— VO VO ΦΦ + Ό Tj

XXXI XXI X X I XXI d d H

Ο Ο Φ O LA «- LA *— LA »~ LA»- 0 0 is

r- Φ φ O

& JO N

wed „____Q Q 1-3

«- CM

£> CO VO * «

CO CJ «- VO

CO 00 00 CO

I— 1— ,— ,— 4-3 I I I 10

lx, Pl lx, fc O

Eh Eh Eh Eh 5 8004759

Zoals blijkt uit tabel M bezaten de groepen waaraan de TF stoffen volgens de uitvinding waren toegediend, anti-tumor werking, in vergelijking met de vergelijkingsgroep.

(d) Anti-tumorverking tegen 3-16 melanomen. p (1) B—16 Meianoom tumorcellen werden subcutaan getransplan teerd in de oksel bij BDF stammuizen (mannelijke, 7 weken oud) in o een hoeveelheid van 1 x 10 cellen per muis. Vervolgens werd TF-133a intraperitonaal toegediend aan de muizen in een dosering van 5 mg/kg of 10 mg/kg eenmaal daags op de eerste dag en vanaf 10 de derde dag tot en met de zevende dag gedurende in totaal 6 dagen, na de transplantatie van de tumorcellen. Op dezelfde wijze als hierboven werden 0,2 ml van een fysiologische zoutoplossing aan de vergelijkingsgroep toegediend en 20 mg/kg 5-FU aan de groep voor de 5-FU toediening.

15 De resultaten zijn vermeld in tabel N.

Tabel N

Stof Dosering (mg/kg x Gemiddeld tumor T/C {%) het aantal toe- gewicht (g) _dieningen_______________ 5x6 U,0? 70 20 TF-133a 10 x 6 2,52 i*3 5-FU ! 20 x 6 U,21 72 i

Vergelijking - 5j8^ 100 25 ___:--

Zoals blijkt uit tabel N bezaten de groepen waaraan TF-133a was toegediend, een blijkbare tumor groei-belemmerende werking, in vergelijking met de vergelijkingsgroep en de groepen waaraan 5 mg/kg en 10 mg/kg TF-133a was toegediend bezaten gelijke of 30 meer uitgesproken tumor groei-belemmerende werking in vergelijking met de groep waaraan 5-FU was toegediend.

(2) De transplantatie van B—16 meianoom tumorcellen en de toediening van TF-132a, TF-133a, 5-FU en een fysiologische zoutoplossing werden uitgevoerd op dezelfde wijze als hierboven in 35 (1). Op de 21ste dag na de transplantatie van de tumorcellen wer den de muizen ontleed en de metastase van de meianoom tumorcellen 8004759 55 * naar de longen werd beoordeeld.

De resultaten zijn vermeld in tabel 0.

Tabel 0

Stof Dosering (mg/kg x Gemiddeld aan- Percentage het aantal toe- tal metastase metastase dieningen inhibitie(5) 5x6 16,0 h8 TF-132a 10 x 6 9,36 69 10 5x6 9,3 70 TF-133a 10 x 6 6,7 73 5-FU 20 x 6 2U,8 20 15 Vergelijking - 31,0 0 j

Zoals blijkt uit tabel 0 was in de groepen waaraan TF-132a en TF-133a was toegediend de metastase van B-16 melanoom tumorcellen opmerkelijk belemmert, in vergelijking met de groen waaran 20 5-FU was toegediend.

(IV) Acute toxiciteit.

LD^ voor muizen is weergegeven in tabel P.

80 0 4 759 - r po

Tabel ?

Stof λτ1 jze van toediening LD wjï-z) TT-100 Lntraperitonaal 500 TF-110 Intraveneus >250 lntraperitonaal >1000

Intraveneus >250 TF-120 lntraperitonaal >1000

Intraveneus 300 lntraperitonaal > 500

Intraveneus 300 133a lntraperitonaal > 500

Intraveneus 300 lntraperitonaal >500 TF-132b Intraveneus >100 TF-133b Intraveneus >200 TF-lk0 Intraveneus >100 TF-150 Intraveneus >200 TF-1323 Intraveneus >200 TF-131Ö Intraveneus >200 ___!_ 8004759 I 4 4 51

Zoals uit de bovengenoemde farmacologische proeven blijkt, zijn de TF stoffen volgens de uitvinding bruikbaar als carcino-statische middelen, waarvan men mag verwachten, dat ze werken tegen verschillende kankerachtige aandoeningen en het valt te ver-5 wachten dat ze aanmerkelijke werking bezitten tegen bepaalde vaste typen kanker. Alle TF stoffen volgens de uitvinding hebben uitstekende werking, ofschoon TF-130, in het bijzonder 132a, 132b, 133a, 133b en 1323 de voorkeur verdienen uit hoofde van verschillende redenen.

10 De TF stoffen volgens de uitvinding kunnen worden gebruikt nadat ze verwerkt zijn in verschillende farmaceutische prenaraten, zoals orale geneesmiddelen, injecties, zetoillen of dergelijke, ofschoon ze bij voorkeur gebruikt worden in de farmaceutische vorm van een injectie. Wanneer ze gebruikt worden als orale genees-15 middelen, kunnen de orale geneesmiddelen verschillende excipiënten bevatten en gevormd zijn tot capsules, tabletten, poeders of korrels. Wanneer ze gebruikt worden als injecties, kunnen de injecties iedere subcutane injectie, intramusculaire injectie of intraveneuze injectie zijn en ze worden gebruikt in de vorm van een 20 suspensie, een oplossing of een poeder, dat bij gebruik wordt opgelost. De injecties kunnen een locaal verdovingsmiddel bevatten.

De dosering van de TF stoffen volgens de uitvinding wordt geschikt gekozen afhankelijk van de omstandigheden van een patiënt, ofschoon het in het algemeen gewenst is om ze toe te dienen in 25 een dosering voor een volwassene van 0,01 - 50 mg/kg eenmaal daags of verscheidene keren per dag en wat betreft de wijze van toediening worden ze bij voorkeur toegediend door subcutane, intramusculaire of intraveneuze injectie of injectie in het aangetaste deel.

30 De uitvinding wordt nader toegelicht in onderstaande voorbeelden en de bijgaande tekening, waarvan fig. 1 een microscopische foto vertoont die de vorm weergeeft van Fusobacterium nucleatum TF-031, gebruikt bij de uitvinding, fig. 2 een infrarood absorptiespectrum geeft van de carcinostatische stof TF-100, 35 met langs de horizontale as het golf-*getal in cm-1 en langs de vertikale as de lichtdoorlating in %\ fig. 3 toont een ultraviolet 8004759 58 ♦.

absorptiespectrum van die stof met langs de horizontale as de eenheden in nm; fig. U geeft een elutienatroon dat verkregen is vanneer die stof onderworpen wordt aan gelfiltratie met gebruik van Sephadex G-50 met langs de horizontale as het aantal volume-5 eenheden in ml en langs de vertikale as (O.D 260 nm^20nm^ X ^ en in de grafiek .-. O.D 2Ê0 nm weergeeft en x - x O.D 620 nm weergeeft, fig. 5 toont een hoog vermogen vloeistof chromatogram met langs de horizontale as de tijd in min. waarin de getrokken lijn UV 220 nm is en de stippellijn IJV 2Ö0 nm is; fig. 6 toont 10 een infrarood absorptiespectrum van de carcinostatische stof TF-110 met langs de horizontale as het golf .getal in cm ^ en langs de vertikale as de lichtdoorlating in fig. 7 toont een ultraviolet absorptiespectrum van die stof met langs de horizontale as de eenheden in nm; fig. 8 toont een elutiepatroon dat 15 verkregen wordt wanneer die stof wordt onderworpen aan gelfiltratie met behulp van Sephadex G-200 met langs de vertikale as aan de linkerzijde (O.D U90 -^^gQnra^ en aan rec“terkant langs de vertikale as (O.D 2c0 nm) en langs de horizontale as het aantal ml waarbij in de grafiek x-x-x O.D 260 nm is, O.D

20 ^90nm is en 0-0-0 O.D 620 nm weergeeft; fig. 9 toont een hoog vermogen vloeistof chromatogram van die stof met langs de horizontale as de tijd in min. waarin de getrokken lijn UV 220 nm weergeeft en de stippellijn UV 260 nm; fig. 10 toont een infrarood absorptiespectrum van de carcinostatische stof TF-120, 25 waarin langs de horizontale as het golf-getal in cm 1 en langs de vertikale as de lichtdoorlating in % is weergegeven; fig. 11 toont een ultraviolet absorptiespectrum van die stof met langs de horizontale as het aantal eenheden in nm; fig. 12 toont een elutiepatroon dat verkregen werd wanneer die stof werd onder-30 worpen aan gelfiltratie met gebruikmaking van Sephadex G-200 met langs de linker vertikale as (O.D ^90 nin£20nm^ sn rechter vertikale as (O.D 2fc0 nm) en langs de horizontale as het aantal ml waarbij in de grafiek x-x-x O.D 260 nm is, .-.-. O.D U90 nm is en 0-0-0 Ö.D 620 nm is; fig. 13 toont een hoog vermogen vloei-35 stof chromatogram van die stof waarin langs de horizontale as de tijd in min. is uitgezet en de getrokken lijn UV 220 nm en de 8004759 59 * stippellijn UV 2Ê0 nm weergeeft; fig. 1^+ toont een infrarood absorptiespectrum van de carcinostatische stof TF-316 met langs de horizontale as het golf'.getal in cn“1 en langs de vertikale as de lichtdoorlating in f?; fig. 15 toont een ultraviolet 5 absorptiespectrum van die stof net langs de horizontale as het aantal eenheden in nm; fig. 16 toont een elutiepatroon dat verkregen werd wanneer die stof werd onderwomen aan gelfiltratie met gebruikmaking van Sephadex G-200 met langs de vertikale as de linkerzijde (O.D bpO nm260nnP en lan®s de horizon-fcale as het 10 aantal ml waarbij x-x-x O.D 260 nm en O.D 390 nm is; fig.17 toont een hoog vermogen vloeistof chromatogram van die stof met langs de horizontale as de tijd in min. waarbij de getrokken lijn UV 220 nm en de stippellijn UV 260 nm is; fig. 18 toont een infrarood absorptiespectrum van de carcionostatische stof TF-132a 15 met langs de horizontale as het ;.-golfgetal in cm”1 en langs de vertikale as de lichtdoorlating in %·, fig. 19 toont een ultraviolet absorptiespectrum van die stof met langs de horizontale as het aantal eenheden in nm; fig. 20 toont een elutiepatroon dat verkregen werd wanneer die stof werd onderworpen aan gelfiltratie 20 met gebruikmaking van Sephadex G-200 met langs de vertikale as de linkerzijde (O.D 1+90 ^ggQnm^ en de rechterzi.jde langs de vertikale as (O.D 260 nm), langs de horizontale as het aantal ml waarbij in de grafiek x-x-x O.D 260 nm is, O.D 1+90 nm is en

o-o-o O.D 620 nm is; fig. 21 toont een hoog vermogen vloeistof 25 chromatogram van die stof met langs de horizontale as de tijd in min. waarbij de getrokken lijn UV 220 nm en de stippellijn UV 260 nm is; fig. 22 toont een infrarood absorptiespectrum van de carcinostatische stof TF-132b met langs de horizontale as het ' .gol'fgetal in cm-1 en langs de vertikale as de lichtdoorlating 30 in %·, fig. 23 toont een ultraviolet absorptiespectrum van die stof met langs de horizontale as de eenheden in nm; fig. 2b toont een elutiepatroon dat verkregen werd wanneer die stof werd onderworpen aan gelfiltratie met gebruikmaking van Sephadex G-200 met langs de horizontale as het aantal ml en langs de 35 vertikale as (O.D 260 h^pg^) waarbij in de grafiek x-x-x O.D

260 nm en O.D 1+90 nm is; fig. 25 is een hoog vermogen vloei- 8004759 6o

stof chromatogram van die stof met langs de horizontale as de tijd in min. waarbij de getrokken lijn LP/ 220 nm en de stippellijn UV 26o nm weergeeft; fig. 26 toont een infrarood absorptiespectrum van de carcinostatische stof TF-133a met langs de horizontale as het golf-getal in 0111-1 en langs de vertikale as de lichtdoorlating in %\ fig. 27 toont een ultraviolet absorptiespectrum van die stof met langs de horizontale as de eenheden in nm; fig. 28 toont een elutiepatroon dat verkregen werd wanneer die stof werd onderworpen aan gelfiltratie met gebruikmaking van Sephadex G-200 met langs de horizontale as het aantal ml en langs de linker vertikale as (0.D 1+90 nng20nm^ en ^an®s rec5:lter vertikale as 0.D 260 nm waarbij x-x 0.D 260 nm, .-. O.D. 1+90 nm en 0-0 O.D 620 nm in de grafieken weergeeft; fig. 29 een hoog vermogen vloeistof chromatogram van die stof weergeeft met langs de horizontale as de tijd in min. waarbij dé getrokken lijn üV 220 nm en de stippellijn UV 260 nm voorstelt; fig. 30 een infrarood absorptiespectrum van de carcinostatische stof TF-133b weergeeft met langs de horizontale as het golf-getal in cm-* en langs de vertikale as de lichtdoorlating in %\ fig. 31 toont een ultraviolet absorptiespectrum van de stof met langs de horizontale as de eenheden in nm; fig. 32 toont een elutiepatroon dat verkregen werd wanneer de stof werd onderworpen aan gelfiltratie met gebruikmaking van Senhadex G-200 met langs de horizontale as het aantal ml en langs de vertikale as O.D 26θητη en U90 nm waarbij in de grafiek x-x-x O.D 260 nm en O.D

1+90 nm is; fig. 33 toont een hoog vermogen vloeistof chromatogram van de stof met langs de horizontale as de tiid in min. waarbij de getrokken lijn UV 220 nm en de stinpellijn TTV 269 nm is; fig. 3*+ toont een infrarood absorptiespectrum van de carcinostatische stof TF-1323 waarbij langs de horizontale as het golf-getal in cm”1 en langs de vertikale as de lichtdoorlating in % is afgezet; fig. 35 toont een ultraviolet absorptiespectrum van de stof met langs de horizontale as het aantal eenheden in nm; fig.

36 toont een elutiepatroon dat verkregen werd wanneer de stof onderworpen werd aan gelfiltratie net gebruikmaking van Sephadex G-200 met langs de horizontale as het aantal ml en langs de 8004759 4 6ι vertikale as O.D 2o0 ma en I90 nm waarbij in de grafiek x-x-x O.D 260 ma en O.D I90 nm is; fig. 3T toont een hoog ver mogen vloeistof chromatogram van de stof met langs de horizontale as de tijd in min. waarbij de getrokken lijn UV 220 nm en de 5 stippellijn UV 260 nm is; fig. 33 toont een infrarood absorptie- spectrum van de carcinostatische stof TF-136 met langs de horizontale as het golfgetal in cm-1 en langs de vertikale as de lichtdoorlating in %; fig. 39 toont een ultraviolet absorptiespectrum van de stof met langs de horizontale as de eenheden in nm; fig.lO 10 toont een elutiepatroon dat verkregen werd wanneer de stof onderworpen wordt aan gelfiltratie met gebruikmaking van Sephadex G-200 met langs de horizontale as het aantal ml en langs de linker vertikale as O.D. I90 nm en 620 nm en langs de rechter vertikale as O.D 260 nm waarbij in de grafiek x-x O.D 260 nm, .-. O.D 190 nm 15 en 0-0 O.D 620 nm weergeven; fig. 11 toont een hoog vermogen vloeistof chromatogram van de stof met langs de horizontale as de tijd in min. waarbij de getrokken lijn UV 220 nm en de stippellijn UV 260 nm is; fig. 12 toont een infrarood absorptiespectrum van de carcinostatische stof TF-ll0 met langs de horizontale as 20 het golfgetal cm"*1 en langs de vertikale as de lichtdoorlating in %\ fig. 13 toont een ultraviolet absorptiespectrum van de stof met langs de horizontale as de eenheden in nm; fig. 11 toont een elutiepatroon dat verkregen werd wanneer de stof werd onderworpen aan gelfiltratie met gebruikmaking van Sephadex G-200 25 met langs de linker vertikale as O.D I90 nm en langs de rechter vertikale as O.D 260 nm, langs de horizontale as het aantal ml waarbij in de grafiek x-x-x O.D 260 nm en .-.-. O.D I90 nm is; fig. I5 een hoog vermogen vloeistof chromatogram van de stof weergeeft met langs de horizontale as de tijd in min. waarbij de 30 getrokken lijn UV 220 nm en de stippellijn UV 260 nm is; fig. 16 toont een infrarood absorptiespectrum van de carcinostatische . * -1 stof TF-150 met langs de horizontale as het golfgetal cm en langs de vertikale as de lichtdoorlating in %\ fig. 1? toont een ultraviolet absorptiespectrum van de stof met langs de horizontale 35 as het aantal eenheden in nm; fig. 18 toont een elutiepatroon dat verkregen werd wanneer de stof onderworpen werd aan gelfiltratie 8004759 62

net gebruikmaking van Sephadex G-200 met langs de horizontale eenheden het aantal ml en langs de vertikale as O.D 260 nm en 1*90 nm waarbij in de grafiek x-x-x O.D 260 nm en O.D

il-90 nm is; en fig. 1+9 toont een hoog vermogen vloeistof chromato-5 gram met langs de horizontale as tijd in min. waarbij de getrokken lijn UV 220 nm en de stippellijn UV 260 nm is.

Voorbeeld I

(1) In elk van 15 2 1 cultuurflessen, ieder voorzien van een schroef dop, werden 2 1 gebracht in een cultuurmedium dat 3I+ g 10 trypticase peton, 6 g fyton pepton, 20 g proteose pepton, 70 g van een hersen-hart-infuus, 6 g gistextract, 15 g natriumchloride, 12 g glucose, 10 g lactose, 0,5 g L-cystine, 0,2 g natriumsulfiet, 1,0 g natriumthioglycolaat en 1,U g agar bevat en het cultuurmedium wordt ingesteld op een pH van 7. Het cultuurmedium werd 15 onder een druk van 1,2 at. gedurende 15 min. bij 120°C gesteriliseerd, gedurende 20 min. in een kokend waterbad opgewarmd en daarna onmiddellijk met water gekoeld, waarna een ^recnltuur-oplossing van Fusobacterium nucleatum TF-031, die van te voren bereid was door deze in een cultuurmedium te kweken met dezelfde 20 samenstelling als hierboven, in het bovengenoemde met water gekoelde cultuurmedium geënt werd onder steriele omstandigheden in een hoeveelheid van 100 ml per cultuurfles en ondervormen aan een stabiele toestand kweek in een incubator bij 37°C gedurende 1+8 uur. ila voltooiing van de kweek werd de culture gecentrifugeerd 25 ter verwijdering van organismen gedurende 20 min. bij 5°C met een snelheid van 1+000 rpm. De hoeveelheid van de verkregen bovenstaande vloeistof bedroeg omstreeks 27 1.

(2) Aan de onder (1) verkregen bovenstaande vloeistof werden 1+0 1 ethanol onder roeren bij 5°C toegevoegd en het ver- 30 kregen mengsel liet men in een kamer bij lage temperatuur staan tot het amorfe neerslag volledig was uitgezakt. Vervolgens werd het mengsel gecentrifugeerd gedurende 15 min. bij 5°C en 6000 rpm en het neerslag werd verzameld, gewassen met ethanol en daarna onder verlaagde druk gedroogd waardoor 60 g ruw poeder werden 35 verkregen.

(3) 20 g Van het onder (2) verkregen ruwe poeder werden opge- 8004759 < 4 63 lost in 120 ml water en de op dit tijdstip gevormde water onoplosbare materialen werden door centrifugeren gedurende 10 min. bij 7500 rpm verwijderd, waarna de aldus verkregen water oplosbare fractie gecombineerd werd met de wassingen die verkregen waren door 5 de water onoplosbare materialen twee keer te wassen met steeds 60 ml water en de verkregen oplossing werd onder verlaagde druk gedroogd waardoor ik g grijswit-lichtbruin poeder van TF-100 werden verkregen.

Voorbeeld II

10 De in voorbeeld I (3) verkregen onlossing, die bereid werd door de water oplosbare fractie, vrij van de water onoplosbare materialen, te combineren met de wassingen, verkregen door de water onoplosbare materialen te wassen, werd onderworpen aan ultrafiltratie door een holle vezeltype ultrafiltratie-systeem 15 (membraan nr. HI-l) te gebruiken, en de binnenste oplossing werd onderworpen aan lyofilisatie waardoor 10 g grijswit-lichtbruin poeder van TF-110 werden verkregen.

Voorbeeld III

In een kleine hoeveelheid water werden 10 g opgelost van het 20 poeder dat verkregen werd in voorbeeld II en de verkregen oplossing werd aangebracht op een kolom die gevuld was met diethylamino-ethyl-Sephadex A-50, die in evenwicht was gebracht met een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een pH van 8 en de geëlueerde oplossing werd verzameld. Verder werden 2,5 1 van dezelfde fosfaatbuffer 25 als hierboven door de kolom gevoerd en de verkregen geëlueerde oplossing werd gecombineerd met de eerder verzamelde geëlueerde oplossing, waarna de verkregen oplossing werd ontzout met gebruikmaking van een holle vezeltype ultrafiltratiesysteem (membraan nr.

HI-1), werd geconcentreerd onder verlaagde druk en daarna werd' 30 onderworpen aan lyofilisatie waardoor VfO mg van een grijswit-lichtbruin poeder van TF-T20 werden verkregen.

Voorbeeld IV

In 2k ml water werden 2 g opgelost van het poeder dat verkregen werd in voorbeeld 1(2), en de water onoplosbare materialen 35 werden door centrifugeren gedurende 10 min. bij 7500 rpm verwijderd.

De water oplosbare fractie werd een nacht lang gedialyseerd tegen 8004759 6b gedestilleerd water bij 5°C met gebruikmaking van een cellofaan-buis en de binnenste oplossing werd onder verlaagde druk geconcentreerd. Vervolgens werd de geconcentreerde onlossing aangebracht op een kolom die gepakt was met 150 ml diethylaminoethyl-5 Sephadex A-50, die vooraf in evenwicht was gebracht met een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een pH van 8, en de kolom werd gewassen door 600 ml van een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een pH van 8 daardoor te leiden, waarna een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van Q,c mol en een pH 10 van 8, door de kolom werd gevoerd om een eluaat te verkrijgen. Het eluaat werd onder verlaagde druk geconcentreerd tot ongeveer 100 ml, gedialyseerd tegen gedestilleerd water bij 5°C, opnieuw geconcentreerd onder verlaagde druk, ontzout met gebruikmaking van een kolom van Sephadex G-25 en daarna onderworpen aan lyofilisatie 15 waardoor 1+70 mg grijswit-lichtbruin TF—1316 werden verkregen.

Voorbeeld V

De oplossing als beschreven in voorbeeld 1(3), die bereid werd door de water oplosbare fractie vrij van water ononlosbare materialen te combineren met de wassingen, verkregen door de 20 water onoplosbare materialen te wassen, werd een nacht lang gedialyseerd tegen gedestilleerd water bij 5°0 met gebruikmaking van een cellofaanbuis en de binnenste onlossing werd onder verlaagde druk geconcentreerd. De geconcentreerde oplossing werd daarna aangebracht op een kolom die gemakt was met 50 g diethyl-25 aminoethyl-Sephadex A-50, die vooraf in evenwicht was gebracht met een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een piï van 8 en 2 1 van een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een pH van 8 en 2,5 1 van een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,1 molair en een pH van 8 werden achtereenvolgens door de 30 kolom gevoerd, waarna 2,5 1 van een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,2 mol. en een pH van 3 door de kolom werd gevoerd ten einde de op de kolom geadsorbeerde aktieve stof te elueren en de verkregen geëlueerde oplossing werd ontzout met gebruikmaking van een holle vezeltype ultrafiltratie-35 systeem (membraan nr, HI-1) en daarna onderworpen aan lyofilisatie, waardoor 600 mg grijswit-lichtbruin poeder van TF-132a werden ver- 8004759 65 kregen.

Voorbeeld VI

In 1,2 1 van een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,3 mol. en een pH van 3 werden 5 HU,2 g opgelost van het in voorbeeld 1(2) verkregen noeder en de gesuspendeerde onoplosbare materialen werden door filtratie verwijderd met gebruikmaking van Hyflo Super Cel, waarna het verkregen filtraat werd aangebracht op een kolom met een middellijn van 33 cm, gepakt met 500 ml diethylaminOethyl-Sephadex A-50, die 10 van te voren in evenwicht was gebracht met een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,3 mol. en een pH van S en de geëlueerde oplossing werd verzameld. De kolom werd gewassen met een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,3 mol. en een pH van 8 en de wassingen 15 werden gecombineerd met de hierboven genoemde geëlueerde oplossing waardoor 1,6j 1 oplossing werden verkregen. De onlossing werd opnieuw op een kolom met een middellijn van 8 cm, genakt met HOO ml diethylaminoethyl-Sephadex A-50, die vooraf in evenwicht was gebracht met een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natrium-20 chlorideconcentratie van 0,3 mol. en een pH van 8, aangebracht waardoor 1,63 1 geëlueerde oplossing werden verkregen. De kolom werd gewassen met een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,3 mol. en een pH van 8 waardoor 1,6H 1 wassingen werden verkregen. De geëlueerde oplossing en de wassingen 25 werden gecombineerd en een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een pH van 8 werd daaraan toegevoegd waardoor H,98 1 van een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,2 mol. en een pH van 8 werden verkregen. De aldus verkregen bufferoplossing werd aangebracht op een kolom met een middellijn van 30 8 cm, gepakt met 500 ml diethylaminoethyl-Senhadex A-50, die voor af in evenwicht was gebracht met een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,2 mol. en een pH van 8, en de kolom werd gewassen met 2 1 van een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,2 mol. en een 35 pH van 8, Aan 7 1 oplossing, bereid door de wassingen te combineren met de geëlueerde oplossing, werd een 0,025 molaire fosfaat- 8004759 66 buffer met een pH van 3 toegevoegd waardoor 1U 1 werden verkregen van een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natrium-chlorideconcentratie van 0,1 mol. en een υΗ van 8. De aldus verkregen geëlueerde oplossing werd aangebracht on een kolom met 5 een middellijn van 8 cm, gepakt met 500 ml diethvlaminoethyl-Sephadex A-50, die vooraf in evenwicht was gebracht met een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriurachlorideconcentratie van 0,1 mol. en een pH van 8, en de geëlueerde oplossing werd verwijderd. De kolom werd gewassen met 2 1 van een 0,025 molaire 10 fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,1 mol. en een pH van 3, waarna 2 1 van een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,2 mol. en een pH van 8 door de kolom werden gevoerd en de geëlueerde oplossing werd verzameld. De geëlueerde oplossing werd geconcentreerd en ontzout met be-15 hulp van een ultrafiltratiesysteem (gebruikt filter: Toyo

Ultrafilter UK-10), verder ontzout met behulp van een Sephadex G-25 kolom, ontkleurd met aktieve koolstof en daarna ondervormen aan lyofilisatie, waardoor 330 mg grijswit-lichtbruin noeder van TF-132b werden verkregen.

20 Voorbeeld VII

In een kleine hoeveelheid water werden 10 g van het in voorbeeld II verkregen poeder cpgelost en de verkregen oplossing werd aangebracht op een kolom die genakt was met diethylanino-ethyl-Sephadex A-50, die vooraf in evenwicht was gebracht met een 25 0,025 molaire fosfaatbuffer met een pH van 3, Vervolgens werden 5 1 van een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,2 mol. en een pH van 8 door de kolom gevoerd, waarna 2,5 1 van een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,3 mol. en een πίί van 8 door de kolom 30 wordt gevoerd ten einde de op de kolom geadsorbeerde aktieve stof te elueren, en de verkregen geëlueerde oplossing werd onder verlaagde druk geconcentreerd. De geconcentreerde oplossing werd ontzout met behulp van een cellofaanbuis, volledig ontzout met behulp van Sephadex G-25 en daarna onderworpen aan lyofilisatie 35 waardoor 600 mg grijswit-lichtbruin poeder van TF-133a werden verkregen.

8004759 67

Voorbeeld VIII

In 1,2 1 van een 0,025 molaire fosfaatbuffer net een natriumchlorideconcentratie van 0,3 mol. en een nH van 8 werden bh,2 g van het in voorbeeld 1(2) verkregen noeder opgelost en de 5 gesuspendeerde onoplosbare materialen werden door filtratie net behulp van Hyflo Super Cel verwijderd, waarna het verkregen filtraat werd aangebracht op een kolom van 33 cm middellijn, gepakt met 500 ml diethylaminoethyl-Sephadex A-50, die van te voren in evenwicht was gebracht met een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een 10 natriumchlorideconcentratie van 0,3 mol. en een pH van 3, en de geëlueerde oplossing werd verzameld. De kolom werd gewassen met een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,03 mol.en een pH van 8, en de wassingen werden gecombineerd met de bovengenoemde geëlueerde oplossing waardoor 1,67 1 oplossing 15 werden verkregen. De oplossing werd opnieuw aangebracht op een kolom met een middellijn van 8 cm, gepakt met bo ml diethylaminoethyl-Sephadex A-50, die vooraf in evenwicht was gebracht met een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,3 mol. en een pH van 3, waardoor 1,68 1 geëlueerde oplossing 20 werden verkregen. De kolom werd gewassen met een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,3 mol. en een pH van 8, waardoor 1,6h 1 wassingen werden verkregen. De geëlueerde oplossing en de wassingen werden gecombineerd en een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een pH van 8 werd daaraan toege-25 voegd, waardoor 1+,98 1 werden verkregen van een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,2 mol. en een pH van 8. De aldus verkregen geëlueerde oplossing werd aangebracht op een kolom met een middellijn van 8 cm, gepakt met 500 ml diethylaminoethyl-Sephadex A-50, die vooraf in evenwicht was ge-30 bracht met een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,2 mol. en een pH van 3, en de kolom werd gewassen met een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,2 mol. en een pH van 8, waarna 2 1 van een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 35 0,3 mol. en een pH van 8 door de kolom werden gevoerd en de ge- elueerde oplossing werd verzameld. De geëlueerde oplossing werd 8004759 63 geconcentreerd en ontzout met behulp van een ultrafiltratie-systeem (gebruikt filter: Toyo Ultrafilter UK-10), verder ontzout met behulp van een Sep'nadex G-25 kolom, ontkleurd met aktieve koolstof en daarna onderworpen aan lyofilisatie waardoor 5 590 mg van een grijswit-liehtbruin poeder van TF-133b werden verkregen.

Voorbeeld IX

(1) In 120 ml water werden 20 g opgelost van het ruwe poeder dat verkregen werd in voorbeeld 1(2), en de gevormde 10 water onoplosbare materialen op dit tijdstip werden verwijderd door 10 min. centrifugeren bij 7500 rpn, waarna de aldus verkregen water oplosbare fractie en wassingen, verkregen door de water onoplosbare materialen twee keer te wassen met 60 ml water, gecombineerd werden, en daarna werden onderworpen aan ultrafiltra-15 tie met behulp van een helle vezeltype ultrafiltraties”·^teem (membraan nr. HI-1) en de binnenste oplossing werd ondervormen aan lyofilisatie waardoor 10 r. griiswit-lichtbruin moeder werden verkregen.

(2) In 1 1 van een 0,325 nolaire fosfaatbuffer met een 20 natriumchlorideconcentratie van 0,3 mol. en een oH van 3 werden 25 g opgelost van een poeder verkregen door de hierboven onder (1) beschreven behandeling en de verkregen oplossing werd aanre-bracht op een kolom met een middellijn van 33 cm, gepakt met 500 ml diethylaminoethvl-Sephadex A-50, die vooraf in evenwicht 25 was gebracht met een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriun-chlorideconcentratie van 0,3 mol. en een pH van 3. De kolom werd op overeenkomstige wijze gewassen met een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,3 mol. en een pH van 8, en de geëlueerde oplossing en de wassingen werden 30 gecombineerd waardoor 1,6 1 mengsel werden verkregen. Het mengsel werd aangebracht op een kolom met een middellijn van 3 cm, genakt met UOO ml diethylaminoethyl-Sephadex A-50, die op overeenkomstige wijze in evenwicht was gebracht met een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,3 mol. en een 35 pH van 8, waardoor 1,65 1 geëlueerde oplossing werden verkregen.

De geëlueerde oplossing werd gecombineerd met 1,7 1 wassingen, ver- 8004759

V

£9 J.

kregen door de kolom te wassen met een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie wan 0,3 mol. en een pH van 3, en het verkregen mengsel werd verdund met 0,025 molaire fosfaatbuffer met een pH van 8 ten einde 10,35 1 te bereiden van 5 een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,1 mol. en een pH van 8.

Vervolgens werd de aldus verkregen bufferoplossing aangebracht op een kolom met een middellijn van 8 cm, gepakt met 500 ml diethylaminoethyl-Sephadex A-50, die vooraf in evenwicht 10 was gebracht met een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,1 mol. en een pH van 8, en de kolom werd gewassen met 2 1 van een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,1 mol. en een pH van 8, waarna 2 1 van een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchloride-15 concentratie van 0,3 mol. en een pH van 8 door de kolom werd gevoerd en de geëlueerde oplossingen werden verzameld. De aldus verkregen geëlueerde oplossing werd ontzout en geconcentreerd met behulp van een ultrafiltratiesysteem (gebruikt filter: Toyo Ultrafilter UK-10) en verder ontzout op Sephadex G-25, ontkleurd 20 met aktieve koolstof en daarna onderworpen aan lvofilisatie waardoor 1,65 g grijswit-lichtbruin poeder van TF-1323 werden verkregen.

Voorbeeld X

In een kleine hoeveelheid water werden 10 g opgelost van 25 het in voorbeeld II verkregen poeder en de verkregen oplossing werd aangebracht op een kolom, gepakt met diethylaminoethyl-Sephadex A-50, die van te voren in evenwicht was gebracht met een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een pH van 8. Vervolgens werden 6 1 van een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natrium-30 chlorideconcentratie van 0,5 mol. en een pH van 3 door de kolom gevoerd, waarna 2,5 1 van een 0,025 molaire fosfaatbuffer met een natriumchlorideconcentratie van 0,6 mol. en een ?H van 8 door de kolom werd gevoerd ten einde de op de kolom geadsorbeerde aktieve stof te elueren, en de verkregen doorgegane oplossing 35 werd ontzout met behulp van een holle vezeltype ultrafiltratiesysteem (membraan nr. HI-1), onder verlaagde druk geconcentreerd 8004759 το en daarna onderworpen aan lyofilisatie waardoor 130 mg grijs-wit-lichtbruin poeder van TF-136 werden verkregen.

Voorbeeld XI

In 200 ml water werden 15 g opgelost van het ruwe poeder 5 dat verkregen werd in voorbeeld 1(2) en de water onoplosbare materialen werden verwijderd door 10 min. centrifugeren bij 7500 rpm, waarna de aldus verkregen water oplosbare fractie werd ingesteld op pH 10 door een 0,2 molaire waterige barium-hydroxydeoplossing druppelsgewijze daaraan toe te voegen. Er 10 ontstond een wit neerslag door de toevoeging van de waterige bariumhydroxydeoplossing. Eariumionen werden toegevoegd, zodat de concentratie van de totale bariumionen in het eindvolume 0,01 mol, bedroeg, waarna de oplossing 30 min. werd geroerd en het neerslag werd door filtreren verzameld. Het aldus verkregen 15 neerslag van een bariumzout werd gesuspendeerd in 10 ml van 10 gew.i'ige waterige natriumsulfaatonlossing, voldoende geroerd en daarna afgefiltreerd en het filtraat werd verzameld. Het neerslag werd opnieuw gesuspendeerd, geroerd en daarna op dezelfde wijze gefiltreerd als hierboven, een keer met 10 ml van een 20 10 gew.;T'ige waterige natriumsulfaatonlossing en twee keer met 5 ml hoeveelheden van die oplossing en ieder filtraat werd verzameld. Daarna werd het achterblijvende neerslag twee keer gewassen met steeds 10 ml water en daarna gefiltreerd ten einde wassingen te verkrijgen. Het bovengenoemde verzamelde filtraat en 25 de wassingen werden gecombineerd, gedialyseerd tegen gedestilleerd water, geconcentreerd onder verlaagde druk en daarna onderworpen aan lyofilisatie, waardoor 0,^5 g grijswit-lichtbruin poeder van TF-1U0 werden verkregen.

Voorbeeld XII

30 In U50 ml water werden 32 g opgelost van het poeder als verkregen in voorbeeld 1(2) en de gesuspendeerde ononlosbare materialen werden verwijderd door filtratie met gebruikmaking van Hyflo Super Cel, waarna het verkregen filtraat een nacht lang gedialyseerd werd tegen stromend water met gebruikmaking van een 35 cellofaanbuis. Aan de gedialyseerde oplossing werd een druppelsgewijs 80 ml van een 20 gew.^'ige waterige cetylpvridiniumchloride- 8004759

V

oplossing toegevoegd onder roeren, terwijl daaraan 200 ml worden toegevoegd van een 10 gew.%'ige boraatbuffer (?H 9>0) en het verkregen mengsel werd 30 min. bij kamertemperatuur geroerd, waarna het neerslag werd verzameld door filtratie. Het neerslag 5 werd gesuspendeerd in 150 ml van een 0,1 gew. 5' i ge boraatbuffer (pH 9,0) die 0,1 mol. natriumchloride en 0,2 gew.^’ige cetyl-pyridiniumchloride bevatte en de verkregen suspensie werd 30 min. geroerd. Vervolgens werd het neerslag verzameld uit de suspensie door filtratie en opnieuw gesuspendeerd in 150 ml van een boraat-10 buffer (pH 9,0) van de bovengenoemde samenstelling en de aldus verkregen suspensie werd 30 min. geroerd, waarna het neerslag door filtratie werd verzameld. Het verzamelde neerslag werd gesuspendeerd in 150 ml van een 0,1 gew.^'ige boraatbuffer (pïï 9,0) die 0,5 mol. natriumchloride en 0,25'ige cetylpyridinium-15 chloride bevatte en de verkregen suspensie werd geroerd en gedissocieerd gedurende 30 min.. Vervolgens werd het neerslag afgescheiden uit de suspensie door filtratie ten einde een oplosbare fractie te verkrijgen. Daarna werd het door filtratie afgescheiden neerslag opnieuw onderworpen aan dezelfde dissociatie-20 methode als hierboven tén einde een oplosbare fractie te verkrijgen. De twee oplosbare fracties werden gecombineerd en de verkregen oplosbare fractie werd ingesteld op een pH van 3 - ^ met 10?»'ig zoutzuur, waarna ethanol daaraan werd toegevoegd, zodat de concentratie ervan tenslotte 30 vol. bedroeg. De verkregen 25 oplossing liet men een nacht lang bij 5°C staan en het gevormde neerslag werd verzameld bij filtratie waardoor 5,6 g grijswit-lichtbruin poeder van TF-150 werden verkregen.

Bereidingsvoorbeelden.

Bereidingsvoorbeeld 1 30 Iedere flacon werd gevuld met 1 mg of 5 mg van een van de poeders van TF-100, 110 en 120 als verkregen in voorbeelden I, II en III. De poeders worden opgelost in een gesteriliseerde fysiologische zoutoplossing, een oplossing die 0,5* lidocaïne of dergelijke bevat bij gebruik, en dan als injecties gebruikt.

35 Bereidingsvoorbeeld 2

Iedere flacon werd gevuld met 1 mg of 5 mg van een van de 8004759 72 poeders van 27-1316, 132a en 132b als verkregen in voorbeelden 17, 7 en 71. De poeders worden opgelost in een gesteriliseerde fyiologische zoutoplossing, een oplossing die 3,5$ lidocaine bevat, of dergelijke bi.j gebruik en daarna als injecties gebruikt.

5 Bereidingsvcorbeeld 3

Een flacon werd gevuld met 1 mg of 5 mg van het poeder van TF-133a, als verkregen in voorbeeld VII. Het noeder wordt opgelost in een gesteriliseerde fysiologische zoutoplossing, een oplossing die 0,5$ lidocaine bevat of dergeli.jke, bij gebruik en 10 daarna als een injectie gebruikt.

Bereidingsvoorbeeld h

Een flacon werd gepakt met 1 mg of 5 mg van het poeder van ÏF-133b als verkregen in voorbeeld VIII. Het poeder wordt opgelost in een gesteriliseerde fysiologische zoutoplossing, een oplossing 15 die 0,5% lidocaine bevat, of dergelijke, bij gebruik en daarna als een injectie gebruikt.

Bereidingsvoorbeeld 5

Een flacon werd gepakt met 1 mg of 5 mg van het poeder van TF-1323 als verkregen in voorbeeld IX. Het poeder wordt opgelost 20 in een gesteriliseerde fysiologische zoutoplossing, een oplossing die 0,5$ lidocaine bevat of dergelijke, bij gebruik en daarna als een injectie gebruikt.

Bereidingsvoorbeeld 6

Iedere flacon werd gepakt met 1 mg of 5 mg van een van de 25 poeders TF-136, lbo en 150, verkregen in voorbeelden X, XI en XII. De poeders worden opgelost in een gesteriliseerde fysiologische zoutoplossing, een oplossing die 0,5$ lidocaine bevat, of dergelijke, bij gebruik en vervolgens als injecties gebruikt.

8004759

Claims (46)

1. Werkwijze voor de bereiding van stoffen net carcinostatische en immunostimulerende werking, net het kenmerk, dat men onder anaerobe omstandigheden TF-stof vormende bacteriën die 5 behoren tot het Fusobacterium genus, kweekt en de stoffen uit de cultuur of de bovenstaande vloeistof daarvan verzamelt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men de TF-stof vormende bacteriën die behoren tot het Fusobacterium genus kweekt onder anaerobe omstandigheden en een 10 hydrofiel organisch oplosmiddel aan de cultuur of de bovenstaande vloeistof daarvan toevoegt, waarna men de genoemde stoffen met carcinostatische en immunostimulerende werking uit het gevormde neerslag afscheidt.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat 15 men de water oplosbare fractie van het neerslag uit het neerslag verwijdert en vervolgens droogt. Werkwijze volgens conclusie 2 of 3, met het kenmerk, dat men het gevormde neerslag verzamelt, de water oplosbare fractie van het neerslag onderwerpt aan dialyse of ultrafiltratie en de 20 stoffen met carcinostatische en immunostimulerende werking wint uit de binnenste oplossing.

5. Werkwijze volgens conclusie 2 of 3, net het kenmerk, dat men het gevormde neerslag verzamelt, de water oplosbare fractie van het neerslag zonodig onderwerpt aan dialyse of ultrafiltratie 25 en daarna behandelt met een ionenuitwisselaar en de niet geadsorbeerde fractie verzamelt.

6. Werkwijze volgens conclusie 2 of 3, net het kenmerk, dat men het gevormde neerslag verzamelt, de water oplosbare fractie van het neerslag zonodig onderwerpt aan dialyse of ultrafiltratie 30 en daarna behandelt met een ionenuitwisselaar en de stoffen met carcinostatische en immunostimulerende werking isoleert uit de geadsorbeerde fractie.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat men de geadsorbeerde fractie behandelt met een 0,6 molaire natrium-35 chloride-fosfaatbuffer en de geëlueerde fractie verzamelt.

8. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat men 8004759 een fractie die niet geëlueerd is met een 0,1 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer maar geëlueerd is met een 0,2 noiaire natriumchloride-fosfaatbuffer verzamelt uit de geadsorbeerde fractie. 5 9· Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat men een fractie die niet geëlueerd is met een 0,2 molaire natriumchloride-fosfaafbuffer, maar geëlueerd is met een 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer, verzamelt.

10. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat 10 sen een fractie, die niet geëlueerd is met een 0,1 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer, maar geëlueerd is met een 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer, verzamelt.

11. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat men een fractie, die niet geëlueerd is met een 0,5 molaire 15 natriumchloride-fosfaatbuffer, maar geëlueerd is met een 0,6 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer, verzamelt.

12. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat men het gevormde neerslag verzamelt, zonodig de water oplosbare fractie van het neerslag onderwerpt aan dialyse of ultrafiltratie, 20 een 0,2 - 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer van de water oplosbare fractie van het neerslag of een 0,2 - 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer van het binnenste oplossings-bestanddeel, verkregen door dialyse of ultrafiltratie, bereidt en daarna behandelt met een ionenuitwisselaar die in evenwicht is 25 gebracht met een 0,2 - 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer; een fractie die door de ionenuitwisselaar is gegaan, verzamelt; deze geëlueerde oplossing dan instelt zodanig dat de natrium-chlorideconcentratie daarvan 0,1 mol. bedraagt en vervolgens behandelt met een ionenuitwisselaar die in evenwicht is gebracht 30 met een 0,1 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer, om daarop geadsorbeerd te worden; en vervolgens een fractie die niet ge-elueerd is met een 0,1 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer, maar geëlueerd is met een 0,2 - 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer, verzamelt.

13. Werkwijze volgens conclusie 2 of 3, met het kenmerk, dat men het neerslag verzamelt, zonodig de water oplosbare fractie 8004759 van het neerslag onderwerpt aan dialyse of ultrafiltratie, een 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer van de water oplosbare fractie van het neerslag of een 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer van het binnenste oplossingsbestanddeel, verkregen 5 door dialyse of ultrafiltratie, bereidt en daarna behandelt met een ionenuitwisselaar die in evenwicht is gebracht met een 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer; een fractie die door de ionenuitwisselaar is gegaan, verzamelt; de natriumchloride-concentratie van deze geëlueerde oplossing vervolgens instelt op 10 0,2 mol. en de oplossing daarna behandelt met een ionenuitwisse laar die in evenwicht is gebracht met een 0,2 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer om daarop te worden geabsorbeerd, en vervolgens een fractie die niet geëlueerd is met een 0,2 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer, maar geëlueerd is met 0,3 molaire 15 natriumchloride-fosfaatbuffer, verzamelt. 1¾. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men bariumionen aan de cultuur of de bovenstaande vloeistof daarvan toevoegt ten einde een bariumzout te vormen, een hydrofiel organisch oplosmiddel aan de cultuur of de bovenstaande vloei-20 stof daarvan toevoegt en het gevormde neerslag verzamelt en vervolgens bariumionen toevoegt aan de water oplosbare fractie van het aldus verzamelde neerslag, of bariumionen toevoegt aan een oplossing van een poeder dat verkregen is door drogen van de water oplosbare fractie van het neerslag, ten einde een barium-25 zout te vormen; het gevormde bariumzout verzamelt en vervolgens daaruit barium verwijdert; en de water oplosbare fractie verzamelt en onderwerpt aan dialyse of ultrafiltratie.

15. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men een hydrofiel organisch oplosmiddel toevoegt aan de cultuur 30 of de bovenstaande vloeistof daarvan; het gevormde neerslag verzamelt; de water oplosbare fractie van het neerslag, of het binnenste oplossingsbestanddeel, verkregen door de water oplosbare fractie te onderwerpen aan dialyse of ultrafiltratie, behandelt met een kwatemair ammoniumzout, het gevormde neerslag verzamelt 35 en dan onderwerpt aan een dissociatiemethode met gebruikmaking van een oplossing die natriumchloride bevat; een hydrofiel or- 8004759 Tc ganisch oplosmiddel toevoegt aan ia verkregen onloshare fractie on een neerslag te vormen, en het aldus gevormde neerslag verzamelt .

16. Werkwijze volgens een of neer van de voorgaande conclu- 5 sïes, met het kenmerk., dat nen een cultuurnedium gebruikt voor het kweken van de bacteriën, dat stikstofbronnen, koolstofbronnen, vitaminebronnen, reductiemiddelen en anorganische zouten, en desgewenst ook agar bevat.

17. Merkwijze volgens een of neer van de conclusies 1-15, 10 net het kenmerk, dat nen een cultuurnedium gebruikt voor het kweken van bacteriën dat trypticasepenton, iytonpepton, proteose-pepton, een hersen hart-infuus ( of hart-infuus), gistsxtract, natriumchloride, glucose, lactose, L-cystine, natriunsulfiet en thioglycolaat, en desgewenst ook agar, bevat.

18. Werkwijze volgens een of neer van de voorgaande conclu sies, net het kenmerk, dat nen de kweek uitvoert bij 35 - ^2°C gedurende 1 - 5 dagen in een cultuuraediun dat is ingësteld θ’-een pH van 6,0 - 3,5.

19. Werkwijze volgens conclusie 13, net het kenmerk, dat 20 men de kweek uitvoert bij een temperatuur van 36 - 38°C gedurende 1 - 3 dagen in een cultuurnedium dat is ingestêld op een pH van 7,2 - 8,2.

20. Werkwijze volgens een of neer van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat men als bacteriën die behoren tot het

25 Fusobacterium genus gebruikt Fusobacterium nucleatum.

21. Werkwijze volgens een of meer van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat men als hydrofiel organisch oplosmiddel dat asm de cultuur of de bovenstaande vloeistof wordt toegevoegd, een alcohol gebruikt.

22. Werkwijze volgens een of meer van de voorgaande conclu sies, met het kenmerk, dat men het hydrofiele organische oplosmiddel aan de cultuur of de bovenstaande vloeistof toevoegt in een oplosmiddelconcentratie van 30 - 70 mol.%.

23. Werkwijze volgens een of meer van de conclusies 6-22, 35 met het kenmerk, dat men een ionenuitwisselaar gebruikt die een zwak basische ionenuitwisselaar of een zwak basische ionenuit- 8004759 < *· wisselaar met een moleculair zeefvermogen, gebruikt. 2h. Werkwijze volgens een of meer van de conclusies 6-23, met het kenmerk, dat men een 0,1 - 0,6 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer gebruikt voor het elueren van de op de ionenuit-5 wisselaar geadsorbeerde fractie.

25. Werkwijze volgens een of meer van de conclusies 7 - 2k, met het kenmerk, dat men de pH van de fosfaatbuffer die natrium-chloride bevat, en die gebruikt wordt voor het behandelen van de geadsorbeerde fractie, op 3 instelt.

26. Werkwijze volgens een of meer van de conclusies J - 2k, met het kenmerk, dat men de fractie die onderworpen is aan de ionenuitwisselaarbehandeling, concentreert, ontzout en droogt.

27· Werkwijze volgens een of meer van de conclusies 15 - 26, met het kenmerk, dat men als kwaternair ammoniumzout cetyl-15 pyridiniumchloride gebruikt.

28. Werkwijze volgens een of meer van de conclusies 15 - 27, met het kenmerk, dat men de behandeling met het kvaternaire ammoniumzout uitvoert in aanwezigheid van een boraatbuffer,

29. Werkwijze volgens een of meer van de conclusies 15 - 28, 20 met het kenmerk, dat men als natriumchloride bevattende oplossing een boraatbuffer gebruikt die natriumchloride en een kwaternair ammoniumzout bevat.

30. Werkwijze volgens een of meer van de conclusies 6-29, met het kenmerk, dat men Fusobacterium nucleatum ent in een 25 cultuurmedium dat is ingesteld op een pH 7»2 - 8,2 en trypticase-pepton, fytonpepton, proteosepenton, een hersen-hart-infuus (of een hart-infuus), gistextract, natriumchloride, glucose, lactose, L-cystine, natriumsulfiet en thioglycolaat bevat en desgewenst ook agar, en daarna kweekt onder anaerobe omstandig-30 heden bij 36 - 38°C gedurende 1 - 3 dagen; een alcohol aan de kweek of de bovenstaande vloeistof toevoegt in een concentratie van 50 - 70 vol.$; het gevormde neerslag verzamelt, de water oplosbare fractie van het neerslag zonodig onderwerpt aan dialvse of ultrafiltratie en daarna behandelt met een zwak basische 35 ionenuitwisselaar of een zwak basische ionenuitwisselaar met moleculair zeefvermogen, ten einde de niet geadsorbeerde fractie 8004759 •A te verwijderen; een fractie die geëlueerd is niet een 0,1 of 0,2 molaire natriumchloride-fos faatbuffer, uit de geadsorbeerde fractie verwijdert; en daarna een fractie die geëlueerd is net een 0,3 molaire natriunchloride-fcsfaatbuffer verzamelt, concen-5 treert, onzout an dan droogt.

31. Werkwijze volgens een of neer van de conclusies 6 - 29, met het kenmerk, dat men Fusobacterium nucleatun ent on een cultuurmedium ingesteld op 7,2 - 3,2, dat trynticasenenton, fytonpepton, proteosepepton, een hersen-hart-infuus (of een 10 hartinfuus), gistextract, natriumchloride, glucose, lactose, L-cystine, natriumsulfiet en thioglycolaat bevat en desgewenst agar, en daarna kweekt onder anaerobe omstandigheden bij 36 -38°C gedurende 1 - 3 dagen; een alcohol aan de cultuur of de bovenstaande vloeistof daarvan toevoegt in een concentratie van 15 50 - 70 vol.;*; het gevormde neerslag verzamelt, zonodig de water oplosbare fractie van het neerslag onderwerpt aan dialyse of ultrafiltratie en daarna een 0,2 - 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer van de water oplosbare fractie van het neerslag of een 0,2 - 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer van het 20 binnenste oplossingsbestanddeel, verkregen door dialyse of ultrafiltratie, behandelt met een zwak basische ionenuitwisselaar of een zwak basische ionenuitwisselaar met moleculair zeefver-mogen, die in evenwicht is gebracht met een 0,2 - 0,3 molaire natriumchloride-fosfaatbuffer; de fractie die door de ionen-25 uitwisselaar is gegaan, verzamelt; deze geëlueerde oplossing instelt op een natriumchlorideconcentratie van 0,1 - 0,2 mol. en daarna behandelt met een zwak basische ionenuitwisselaar of een zwak basische ionenuitwisselaar met een moleculair zeefvermogen, die in evenwicht is gebracht met een 0,1 - 0,2 molaire natrium-30 chloride-fosfaatbuffer, om daarop te worden geabsorbeerd; en een fractie die geëlueerd is met een 0,2 - 0,3 molaire natriumchloride-fos faatbuf fer uit de geadsorbeerde fractie verzamelt, concentreert, ontzout en daarna droogt.

32. Werkwijze volgens een of meer van de conclusies 20, 30 35 of 31, met het kenmerk, dat men als Fusobacterium nucleatum een stam van TF-031 gebruikt. 8004759 Λ .A-

33. Carcinastatische stof TF-100 met de volgende eigenschappen: (a) grijswit-liehtbruin poeder, (h) het belemmert de verstrooiing van muizen Ehrlich 5 ascites tumor en Ehrlich vaste tumor en heeft een immuno-stimulerende verhing, (c) het is oplosbaar in water en is onoplosbaar in methanol ethanol, aceton, benzeen, chloroform, ethylacetaat en diethylether, 10 (d) het heeft geen scherp smeltpunt, begint te ontleden bij ongeveer 110°C en ontleedt uitgesproken boven 200°C, (e) het infrarood absorptiespectrum verkregen met een KBr tabletmethode vertoont absorptiehanden in de buurt van 3é00-3200, 2960-2930, 1670-161*0, 1550, 1 MO-1330, 121*0, 111*0-1000 15 en 820 cm”\ (f) het ultraviolet absorptiespectrum van de waterige oplossing ervan vertoont een sterke absorptie bij de absorptie-rand en vertoont een absorptiepiek in de buurt van 256 - 260 nm, (g) bij een fractionerende gelfiltratie (kolom : 50 mm 20 doorsnee x 600 mm, elutiemiddel: gedestilleerd water) met behulp van Sephadex G-50 (geregistreerd handelsmerk), bezit het absomtie-banden bij de elutievolumina in de buurt van het lege volume -1*00, 1*30 - 530, 700 - 300 en 81*0 - 370 ml bij de ultraviolet absorptiemeting bij 260 nm, en bij de elutievolumina in de buurt 25 van het lege volume - 390 en 1*10 - 1*30 ml bij de absorptiemeting bij 620 nm volgens een anthron-zwavelzuurmethode, (h) het hoge vermogen vloeistof chromatogram (elutiemiddel: 0,1 molaire fosfaatbuffer met een pH van 7, stroomsnelheid: 0,8 ral/min., bij kamertemperatuur) verkregen met gebruikmaking 30 van TSK-GEL G300 Svi (handelsnaam, kolom: 7,9 mm doorsnee x 600 mm x 2) vertoont pieken in de buurt van het oplosmiddelfront, 38 -60 en 65 min. bij de ultraviolet absomtiemeting bij 220 nm en 260 nm, (i) het is positief in Molisch reactie, fenol-zwavelzuur- 35 reactie, anthron-zwavelzuurreactie, indol-zoutzuurreactie, Lowry- Folin's reactie en ninhydrine reactie, 8004759 33 (,j) elementair analyse vaarden: n on oc; 7^· ττ 1· Ο ^ θ<*. η ^ ο - ζ '/ ^0 5"- *“ -32 3 · /“' 3 “♦·)»- J yC.,-1 y *« χ 3— - 1 (k) het saccharidegehalte, gemeten net een fenol-zwavel-zuurmethode "bedraagt Ιϋ,Ο - 1C,3 gev.",, uitgedrukt als glucose, 5 en het eiwitgehalte, gemeten volgens Lovr,'p-r'olin's methode bedraagt 20,0 - 23,0 gew.,i, uitgedrukt als kalven serum albunine. 3l. Carcinostatische stof TF—110 met de volgende eigenschappen: (a) gri.jsvit-lichtbruin poeder, 10 (b) het belemmert de uitzaaiing van muizen Shrlich ascites tumor en heeft een immunostimulerende werking, (c) het is oplosbaar in water en is onoplosbaar in methanol, ethanol, aceton, benzeen, chloroform, ethvlacetaat en di-ethylether, 15 (d) het heeft geen scherp smeltpunt, begint te ontleden . , o . o bij 110 C en ontleedt uitgesproken boven 200 C, (e) het heeft een infrarood absomtiespectrum, verkregen met een K3r tabletmethode met absorptiebanden in de buurt van 3600-3200, 2960-2930, 1670-16I0, 1550, 1110-1380, 1210, nlO-1000 20 en 820 cm ^ , (f) het ultraviolet absorptiespectrum van de waterige oplossing vertoont sterke absorptie bij de absorptierand en vertoont een absorptiepiek in de buurt van 256 - 260 nm, (g) wanneer het gefractioneerd wordt door gelfiltratie 25 (kolom: ll...mm doorsnee x 500 mm, elutiemiddel: een 0,1 molaire fosfaatbuffer met een pH van 7) met gebruik van Sephadex G-200 (geregistreerd handelsmerk), bezit het absorptiebanden bij de elutievolumina in de buurt van het lege volume - 380 en 600 -920 ml bij de ultraviolet absorptiemetint bij 260 nm, bij de 30 elutievolumina in de buurt van het lege volume - 380, 120 - 520 en 630 - 760 ml voor de afcsorptiemeting bij I90 nm met een fenol-zwavelzuurmethode en bij de elutievolumina in de buurt van het lege volume - 380, 120 - 520 en 620 - 760 ml bij de absorptie-meting bij 620 nm met een anthron-zwavelzuurmethode, 35 (h) het hoge vermogen vloeistof chromatogram (elutiemiddel: 0,1 molaire fosfaatbuffer met een pH van 7, stroomsnelheid: 8004759 0,8 ml/min. bij kamertemperatuur) verkregen met gebruikmaking van TSK-GEL G30Q SW (handelsnaam, kolom: 7,9 mm doorsnee x 600 mm x 2) vertoont pieken in de buurt van het oolosmiddeifront, 38 - 60 en 65 min. bij de ultraviolet absorptiemeting bij 220 nn 5 en 260 nm, (i) het is positief in Molisch reactie, fenol-zwavelzuur-reactie, anthron-zwavelzuurreactie, indol-zoutzuurreactie en Lowry-Folin's reactie en negatief in ninhydrine reactie, (j) elementair analyse waarden

10 C 35,9 - 1+1,0%;H U,5 - 5,2%; N U,2 - 5,2%, (k) het saccharidegehalte, gemeten met een fenol-zwavelzuur-methode bedraagt 30,0 - 69,0 gew.%, uitgedrukt als glucose, en het eiwitgehalte, gemeten met een Lowry-Folin1s methode bedraagt 18,0 - 22,0 gew./l, uitgedrukt als kalven serum albumine.

35. Carcinostatische stof TF-120 met de volgende eigen schappen: (a) grijswit-lichtbruin poeder, (b) het belemmert de uitzaaiing van muizen Ehrlich ascites tumor en heeft een immunostinulerende werking, 20 (c) het is oplosbaar in water en is onoplosbaar in methanol, ethanol, aceton, benzeen, chloroform, ethylacetaat en diethylether, (d) het heeft geen scherp smeltpunt, begint te ontleden bij 110°C en ontleedt uitgesproken boven 200°C, 25 (e) het heeft een infrarood absorptiespectrum, verkregen met een KBr tabletmethode met absorptiebanden in de buurt van 3600-3200, 2960-2930, 1670-16^0, 1550, 1380-1360, 1lUo-1000 en 820 cm-^, (f) het ultraviolet absorptiespectrum van zijn waterige 30 oplossing vertoont sterke absorptie bij de absomtierand en vertoont een absorptiepiek in de buurt van 263 - 272 nm, (g) bij fractioneren door gelfiltratie (kolom: hk mm doorsnee x 500 mm, elutiemiddel: een 0,1 molaire fosfaat-buffer met een pH van 7) met gebruikmaking van Sephadex G-200 35 vertoont het absorptiebanden bij de elutievolumina in de buurt van het lege volume - 325 en 775 - 875 ml bij de ultraviolet 8004759 32 absorptiemeting bij 26θ nm; bij de elutievolumina in de buurt van het lege volume - 360, 3'6θ - U3o en 510 - JoO ml bij de absorptiemeting bij U90 nm met een fenol-zwavelzuurnethode;en bij de elutievolumina in de buurt van het lege volume - 380, 5 b20 - 520 en 620 - ?60 ml bij de absorptiemeting bij 620 nm met een anthrcn-zwavelzuurmethode, (h) zijn hoog vermogen vloeistof chromatogram (elutie-middel: een 0,1 molaire fosfaatbuffer met een pH van 7, stroomsnelheid: 0,3 ml/min. bij kamertemperatuur) verkregen met 10 gebruikmaking van TSK-GEL G300 SW (kolom: 7,9 mm doorsnee x 600 mm x 2) vertoont pieken in de buurt van het onlosmiddelfront, 38 - 60 min. bij de ultraviolet absorotiemeting bij 220 nm en 260 nm, (i) het bezit een positieve ’folische reactie, fenol- 15 zvavelzuurreactie, anthronzvavelzuurreactie, indol-zoutzuur- reactie en lovry-^olin's reactie en een negatieve ninhvdrine yn«pf1 λ * -· — 'x' i (j) elementair analyse vaarden: c 35,1 - ^0,20; H h ,5 - 5,56; 7 2,9 - 3,16, 20 (k) het saccharidegehalte, gemeten met een fenol-zvavel- zuurmethode bedraagt 5c,0 - 73,0$ gew.$, uitgedrukt als glucose en het eiwitgehalte, gemeten met Lowry-Folin's methode bedraagt 9,0 - 13,0 gew.$, uitgedrukt als kalven serum albunine.

36. Carcinostatische stof TF-130 met de volgende eigen-25 schappen: (a) grijswit-lichtbruin poeder, (b) het belemmert de uitzaaiing van muizen Ehrlich ascites tumor, Ehrlich vaste tumor en Sarcoraa-130 carcinomen en heeft een immunostimulerende werking, 30 (c) het is oplosbaar in water en het is onoplosbaar in methanol, ethanol, aceton, benzeen, chloroform, ethylacetaat en diethylether, (d) het heeft geen scherp smeltpunt, begint te ontleden bij 110°C en ontleedt uitgesproken boven 200°C, 35 (e) het infrarood absorptiespectrum, verkregen met een KBr tabletmethode vertoont absorptiebanden in de buurt van 8004759 33 3cQ0-3200, 296Ο-293Ο, ΙόΤΟ-Ιο^Ο, 1550, lUl+Q-T 3β0, 12to, 11 to-1000 en 320 cm-1, (f) het ultraviolet absorptiespectrum van ziin waterige oplossing vertoont een sterke.absorptie bi.j de absorptierand en 5 vertoont een absorptiepiek in de buurt van 256 - 280 na, (g) het heeft een positieve 'lolisch reactie, fenol-zwavel-zuurreactie, ant’nronzwavelzuurreactie, indol-zoutzuurreactie en Lowry-Folin's reactie en een negatieve ninhydrine reactie, (h) elementair analyse waarden:

10 C 27,5 - 39>3$; H 3,2 - 5,72; :i 2,3 - 6,35, (i) het saccharidegehalte, gemeten met een fenol-zwavelzuur-methode, bedraagt 19,0 - 6b,0 gew.5, uitgedrukt als glucose en het eiwitgehalte, gemeten met Lowry-Folin's methode bedraagt 6,0 - 28,0 gew.5, üitgedrukt als kalven serum albumine. 15 37· Carcinostatische stof TF-1316 met de volgende eigen schappen: (a) grijswit-lichtbruin poeder, (b) het belemmert de uitzaaiing van muizen Ehrlich ascites tumor, Ehrlich vaste tumor en Sarcoma-130 carcinomen en heeft 20 een immunostimulerende werking, (c) het is oplosbaar in water en het is onoplosbaar in methanol, ethanol, aceton, benzeen, chloroform, ethvlacetaat en diethylether, (d) het heeft geen scherp smeltrmnt, begint te ontleden 25 bij 110°C en ontleedt uitgesproken boven 200°C, (e) het infrarood absorptiespectrum, verkregen met een KBr tabletmethode vertoont absorptiebanden in de buurt van 36ΟΟ-32ΟΟ, 296Ο-293Ο, 1670-16^0, 1550, 1UU0-13S0, 12to, 11to-1000 en 820 cm”^, 30 (f) het ultraviolet absorptiesnectrum van zijn waterige oplossing vertoont een sterke absorptie bij de absorptierand en vertoont een absorptiepiek in de buurt van 256 - 260 run, (g) bij fractioneren door gelfiltratie (kolom: 21 mm doorsnee x too ml; elutiemiddel: een 0,1 molaire fosfaatbuffer met 35 een pH van 7) met gebruikmaking van Sephadex C—200, bezit het een absorptieband bij de elutievolumina in de buurt van het lege 8004759 -Λ 31+ volume - IcO ml bij de ultraviolet absorptiemeting bij 2Ö0 nm; en een absorptieband bij de elutievolumina in de buurt van het lege volume - 160 ml bij de absomtiemeting bij I+90 nm met een fenol-zwavelzuurnethode, 5 (h) zijn hocg vermogen vloeistof chromatogram (elutie- middel: een 0,1 molaire fosfaatbuffer met een pH van T, stroomsnelheid: 0,8 ml/min. bij kamertemperatuur) verkregen met gebruikmaking van TSK-GEL G30Q SW (kolom:7,9 mm doorsnee x 600 ram x 2) vertoont pieken in de buurt van het oplosmiddelfront en 10 1+0 - Co min. bij de ultraviolet absorptiemeting bij 220 nm en in de buurt van het oplosmiddelfront en 1+0 - 60 min. bij de ultraviolet absorptiemeting bij 260 nm, (i) het heeft een positieve Molisch reactie, fenol-zwavel-zuurreactie, anthron-zwavelzuurreactie, indol-zoutzuurreactie en

15 Lowry-Folin's reactie en negatieve ninhydrine reactie, (j) elementair analyse waarden: C 30,0 - 3I+ ,3/i; H 3,3 - 1+,1+fS; M !+,? - 5,1%, (k) het saccharidegehalte, gemeten met een fenol-zvavelzuur-methode bedraagt 35,0 - 50,0 gew.3, uitgedrukt als glucose en 20 het eiwitgehalte, gemeten met Lowry-Folin's methode bedraagt 10,0 - 23,0 gew.3 uitgedrukt als kalven serum albumine.

3-S. Carcinostatische stof 7?-132a met de volgende eigenschappen: (a) grijswit-lichtbruin poeder, 25 (b) het belemmert de uitzaaiing van muizen Ehrlich ascites tumor, Ehrlich vaste tumor en Sarcoma-130 carcinomen en heeft een immunostimulerende werking, (c) het is oplosbaar in water en het is onoplosbaar in methanol, ethanol, aceton, benzeen, chloroform, ethylacetaat en 30 diethylether, (d) het heeft geen scherp smeltount, begint te ontleden bij 110°C en ontleedt uitgesproken boven 200°C, (e) het infrarood absorptiespectrum, verkregen met een XBr tabletmethode vertoont absorptiebanden in de buurt van 35 3600-3200, 2960-2930, 1670-16I+0, 1550, 11+1+0-1380, 121+0, tl 1*0-1000 en 820 on-1, 8004759 2 / 3c (f) het ultraviolet absorptiespectrum van si .in waterige oplossing vertoont een sterke absorptie bij de absorptierand en vertoont een absorptiepiek in de buurt van 270 - 2B0 nm, (g) bij fractioneren door gelfiltratie (kolom: 1+1+ mm door-5 snee x 500 mm; elutiemiddel: een 0,1 molaire fosfaatbuffer met een pH van 7) met gebruikmaking van Sephadex G-200, vertoont het absorptiebanden bij de elutievolumina in de buurt van het lege volume - 3^0, 600 - 700 en 720 - 880 ml bij de ultraviolet absorptiemeting bij 2βθ nm; bij de elutievolumina in de buurt 10 van het lege volume - 3l+0, 3^0 - 530 en 720 - 900 ml bij de absorptiemeting bij 1+90 nm met een fenol-zwavelzuurmethode; en bij de elutievolumina in de buurt van het lege volume - 3^0, en 3I+O - 58Ο ml bij de absorptiemeting bij 620 nm met een anthron-zwavelzuurmethode, 15 (h) zijn hoog vermogen vloeistof chromatogram (elutiemiddel: een 0,1 molaire fosfaatbuffer met een pH van 7» stroomsnelheid: 0,8 ml/min. bij kamertemperatuur) verkregen met gebruikmaking van TSK-GEL G300 SW (kolom: 7,9 mm doorsnee x 600 mm x 2) vertoont pieken in de buurt van het oplosmiddelfront, 30, 38 - 60 en 65 min. 20 bij de ultraviolet absorptiemeting bij 220 nm en in de buurt van het oplosmiddelfront, 62 en 65 min. bij de ultraviolet absorptiemeting bij 260 nm, (i) het heeft een positieve Molisch reactie, fenol-zwavel-zuurreactie, anthron-zwavelzuurreactie, indol-zoutzuurreactie en

25 Lowry-Folin's reactie en negatieve ninhydrine reactie, (j) elementair analyse vaarden: C 34,8 - 39,8%; H i+,5 - 5,75; N 2,8 - 3,65, (k) het saccharidegehalte, gemeten met een fenol-zwavel-zuurmethode bedraagt 55,0 - 61+,0 gew.5 uitgedrukt als glucose en 30 het eiwitgehalte, gemeten met Lowry-Folin*s methode bedraagt 18,0 - 28,0 gew.5, uitgedrukt als kalven serum albumine.

39· Carcinostatische stof TF-132b met de volgende eigenschappen: (a) grijswit-lichtbruin poeder, 35 (b) het belemmert de uitzaaiing van muizen Ehrlich ascites tumor, Ehrlich vaste tumor en Sarcoma-180 carcinomen en heeft 8004759 36 een immunostimulerende werking, (c) het is oplosbaar in water en het is onoplosbaar in methanol, ethanol, aceton, benzeen, chloroform, ethvlacetaat en diethylether, 5 (d) het heeft geen scherp smeltpunt, begint te ontleden bi.j 110°C en ontleedt uitgesproken boven 200°C, (e) het infrarood absorptiespectrum, verkregen met een KBr tabletmethode vertoont absorptiebanden in de buurt van 3600-3200, 2960-2930, 1670-161*0, 1550, 11*1*0-1380, 121*0, 10 111*0-1000 en 820 cm-1, (f) het ultraviolet absorptiespectrum van zijn waterige oplossing vertoont een sterke absorptie bij de absorptierand en vertoont een absorptiepiek in de buurt van 265 - 280 nm, (g) wanneer het gefractioneerd wordt door gelfiltratie 15 (kolom: 21 mm doorsnee x 1*00 ram; elutiemiddel: een 0,1 moiaire fosfaatbuffer met een pH van 7) met gebruikmaking van Oephadex G-200, vertoont het een zwakke absorptieband bij de 'elutie-volumina in de buurt van het lege volume - 150 ml hij de ultraviolet absorptieneting bij 260 nm en een absorptieband bij de 20 elutievolumina in de buurt van het lege volume - 150 ml bij de absorptieneting bij 1+90 nm met een fenol-zwavelzuurmethode, (h) zijn hoog vermogen vloeistof chromatogram (elutiemiddel: een 0,1 moiaire fosfaatbuffer met een pH van 7; stroomsnelheid: 0,3 ml/min. bij kamertemperatuur) verkregen met behulp 25 van TSK-GEL G300 SW (kolom: 7,9 mm doorsnee x 600 mm x 2) ver toont pieken in de buurt van het oplosmiddelfront,36-37 en 1*3 - 50 min. bij de ultraviolet absorptieneting bij 220 nm en heeft zeer lage pieken in de buurt van het oplosmiddelfront, 32 - 39 en 1*5 - 52 min. bij de ultraviolet absorptiemeting met 30 260 nm, (i) het heeft een positieve Molisch reactie, fenol-zvavel-zuurreactie, anthron-zvavelzuurreactie, indol-zoutzuurreactie en Lowry-Folin's reactie en een negatieve ninhydrine reactie, (j) elementair analyse waarden:

35 C 35,3 - 39,52; H l+,5 - 5,62; N 2,8 - 5,^2, 8004759 37 (k) het saccharidegehalte, gemeten "iet een fenol-zvavslzuur-methode bedraagt 23,6 - 1+5,5 %ev.% uitgedrukt als glucose en het eiwitgehalte, gemeten net Lowry-Folir.1 s methode "bedraagt 15,5 - 28,0 gew.f?, uitgedrukt als kalven serum albumine. 5 bO. Carcinostatische stof FF-133a net de volgende eigen schappen: (a) grijswit-lichtbruin poeder, (b) het belemmert de uitzaaiing van muizen Ehrlich ascites tumor, Ehrlich vaste tumor en Sarcoma-180 carcinomen en heeft 10 een immunostimulerende werking, (c) het is oplosbaar in water en het is onoplosbaar in methanol, ethanol, aceton, benzeen, chloroform, ethvlacetaat en diethylether, (d) het heeft geen scherp smeltpunt, begint te ontleden 15 bij 110°C en ontleedt uitgesproken boven 200°C, (e) het infrarood absorptiespectrura, verkregen met een KBr tabletmethode vertoont absorptiebanden in de buurt van 3600-3200, 2960-2930, 1o70-16U0, 1550, lUU0-13S0, 12Uo, 11U0-1000 en 820 cm-1, 20 (f) het ultraviolet absorptiesneetram van zijn waterige oplossing vertoont een sterke absorptie bij de absomtierand en vertoont een absorptiepiek in de buurt van 253 - 262 nn, (g) wanneer het gefractioneerd wordt door gelfiltratie (kolom: bb mm doorsnee x 500 mm; elutiemiddel: een 0,1 molaire 25 fosfaatbuffer met een pH van 7) met gebruikmaking van Sephadex G-200, bezit het absorptiebanden bij de elutievolumina in de buurt van het lege volume - 300 en 630 - 9^0 ml bij de ultraviolet absorptiemeting bij 260 nm; een absorptieband bij de elutievolumina in de buurt van het lege volume - U20 ml bij de 30 absorptiemeting bij ^90 nm met een fenol-zwavelzuurmethode; en een absorptieband bij de elutievolumina in de buurt van het lege volume - b20 ml bij de absorptiemeting bij 620 nm met een anthron-zwavelzuurmethode, (h) zijn hoog vermogen vloeistof chromatogram (elutiemiddel: 35 een 0,1 molaire fosfaatbuffer met een pH van 7, stroomsnelheid: 0,8 ml/min. bij kamertemperatuur) verkregen met gebruikmaking van 8004759 38 TSK-GEL G300 SW (kolom: 7,9 mm doorsnee x ÓOO mm x 2) vertoont pieken in de buurt van het oplosmiddelfront, 38 en 50 min. bij de ultraviolet absorptieneting bij 220 nm en in de buurt van het oplosmiddelfront, 50 - 60 en 62 min. bij de ultraviolet 5 absorptiemeting bij 260 nm, (i) het heeft positieve Molisch reactie, fenol-zwavelzuur-reactie, anthron-zwavelzuurreactie, indol-zoutzuurreactie en Lowry-Folin's reactie en negatieve in ninhydrine reactie, (j) elementair analyse waarden:

10 C 28,0 - 36,6$; H 3,5 * 5,1$; N H,5 - 6,33, (k) het saccharidegehalte, gemeten met een fenol-zwavelzuur-methode, bedraagt 26,0 - 35-0 gew.3, uitgedrukt als glucose, en het eiwitgehalte, gemeten met Lowry-Folin's methode bedraagt 22,0 - 28,0 gew.3, uitgedrukt als kalven serum albumine.

15 Ui. Carcinostatische stof TF-133b met de volgende eigen schappen: (a) grijswit-lichtbruin poeder, (b) het belemmert de uitzaaiing van muizen Ehrlich ascites tumor, Ehrlich vaste tumor en Sarcoma-180 carcinomen en heeft 20 een immunostimulerende werking, (c) het is oplosbaar in water en het is onoplosbaar in methanol, ethanol, aceton, benzeen, chloroform, ethylacetaat en diethylether, (d) het heeft geen scherp smeltpunt, begint te ontleden 25 bij 110°C en ontleedt uitgesproken boven 200°C, (e) het infrarood absorptiespectrum, verkregen met een KBr tabletmethode vertoont absorotiebanden in de buurt van 36ΟΟ-32ΟΟ, 296Ο-293Ο, 1670-16UO, 1550, 1UU0-1380, 12U0, 11HO-1000 en 820 cm"1, 39 (f) het ultraviolet absorptiespectrum van zijn waterige oplossing vertoont een sterke absorptie bij de absorptierand en vertoont een absorptiepiek in de buurt van 270 - 280 nm, (g) wanneer het gefractioneerd wordt met gelfiltratie (kolom: 21 mm doorsnee x H00 mm; elutiemiddel: een 0,1 molaire 35 fosfaatbuffer met een pH van 7) met gebruikmaking van Senhadex G-200, bezit het een absorptieband bij de elutievolumina in de 8004759 t. t 39 buurt van het lege volume - 173 ml bij de ultraviolet absomtis-meting bij 260 nm en een absontieband bij de elutievolumina in de buurt van het lege volume - 153 ml bij de absorntiemeting bij 1+90 nn met een fenol-zwavelzuurnethode, 5 (h) zijn hoog vermogen vloeistof remat o''ram (slutieniddel: een 0,1 molairè fosfaatbuffer met een nH van 7; stroomsnelheid 0,8 ml/min. bij kamertemperatuur), verkregen met gebruikmaking van TSK-GEL G300 GW (kolom: J,9 mm doorsnee x ÓQO mm x 2) vertoont pieken in de buurt van het oplosmiddelfront, l+Q - 50 min. bij de 10 ultraviolet absorptiemeting bij 220 nn; en in de buurt van het oplosmiddelfront 33 - 39 en 52 min. bij de ultraviolet absomtie-meting net 260 nn, (i) het heeft een positieve Molisch reactie, fenol-zvavel-zuurreactie, anthron-zwavelzuurreactie, indol-zoutzuurreactie en

15 Lovry-Folin’s reactie en negatieve ninhydrine reactie, (j) elementair analyse waarden: C 31,1 - 33,5/¾; H 3,9 - 5,2S; II 3,1+ - 1+,7^, (k) het saccharidegehalte, gemeten met een fenol-zwavelzuur-methode bedraagt 19,0 - 2l+,5 gew.5, uitgedrukt als glucose en het 20 eiwitgehalte, gemeten met Lovry-Folin’s methode bedraagt 12,9 - 22,9 gev.J», uitgedrukt als kalven serum albumine. 1+2, Carcinostatische stof TF-1323 met de volgende eigenschappen: (a) grijswit-lichtbruin poeder, 25 (b) het belemmert de uitzaaiing van muizen Ehrlich ascites tumor, Ehrlich vaste tumor en Sarcoma-180 carcinomen en heeft een immunostimulerende werking, (c) het is oplosbaar in water en het is onoolosbaar in methanol, ethanol, aceton, benzeen, chloroform, ethylacetaat en 30 diethylether, (d) het heeft geen scherp smeltpunt, begint te ontleden bij 110°C en ontleedt uitgesproken boven 200°C, (e) het infrarood absorptiespectrum, verkregen met een KBr tabletmethode vertoont absorptiebanden in de buurt van 35 3600-3200, 2960-2930, 1670-161+0, 1550, 11+1+0-1380, 121+0, 1140-1000 en 820'cm"1, 8004759 Λ (f) het ultraviolet absorptiesoectrum van zijn waterige oplossing vertoont een sterke absorptie bij de absorptierand en vertoont een absorptiepiek in de buurt van 265 - 280 na, (g) wanneer het gefractioneerd wordt door gelfiltratie 5 (kolom: 21 mm doorsnee x 1*00 mm; elutieraiddel: een 0,1 molaire fosfaatbuffer met een pH van 7) met gebruikmaking van Senhadex G-200, vertoont het een zwakke absorptieband bij de elutie-volumina in de buurt van het lege volume - 16Ο ml bij de ultraviolet absorptiemeting bij 260 nm en een absorptieband bij de 10 elutievolumina in de buurt van het lege volume - 150 ral bij de absorptiemeting bij 1*90 nm met een fenol-zwavelzuurmethode, (h) zijn hoog vermogen vloeistof chromatogram (elutieraiddel: een 0,1 molaire fosfaatbuffer met een pH van 7; stroomsnelheid: 0,8 ml/min. bij kamertemperatuur) verkregen met gebruikmaking 15 van TSK-GEL G300 SW (kolom: 7,9 mm doorsnee x 600 mm x 2) vertoont pieken in de buurt van het oplosmiddelfront, 36,en 1*3 - 50 min. bij de ultraviolet absorptiemeting bij 220 nm; en pieken in de buurt van het oplosmiddelfront, 36 en 50 min. bij de ultraviolet absorptiemeting bij 260 nm, 20 (i) het heeft positieve Molisch reactie, fenol-zwavelzuur- reactie, anthron-zwavelzuurreactie, indol-zoutzuurreactie en Lowry-Folin's reactie en negatieve ninhydrine reactie, (j) elementair analyse waarden: C 29,9 - 39 Λ*} H 3,9 - 5,6*; N 2,8 - 5,W, 25 (k) het saccharidegehalte, gemeten met een •'fenol-zwavelzuur methode bedraagt 19,0 - 25,0 gewuitgedrükt als glucose en het eiwitgehalte, gemeten met Lowry-Folin's methode bedraagt 11,0 — 17,0 gev.$, uitgedrukt als kalven serum albumine. 1*3. Carcinostatische stof TF-136 met de volgende eigen-30 schappen: (a) grijswit-lichtbruin poeder, (b) het belemmert de uitzaaiing van muizen Ehrlich ascites tumor, Ehrlich vaste tumor en Sarcoma-180 carcinomen en heeft een immunostimulerende werking, 35 (c) het is oplosbaar in water en het is onoplosbaar in methanol, ethanol, aceton, benzeen, chloroform, ethvlacetaat en 8004759 ✓ diethylether, (d) het heeft geen scherp smeltount, begint te ontleden bij 110°C en ontleedt uitgesproken boven 200°C, (e) het infrarood absorptiespectrum, verkregen Tiet een

5 KBr tabletmethode vertoont absorptiebanden in de buurt van 3600-3200, 2960-2930, 16TO-16UO, 1550, 11+40-1330, 12^0, 11^0-1000 en 320 ca”1, (f) het ultraviolet absorptiespectrum van ziin waterige oplossing vertoont een sterke absorptie bij de absorptierand en 10 vertoont een absorptiepiek in de buurt van 25c - 2c0 nm, (g) bij fractioneren door gelfiltratie (kolom: h-k mm doorsnee x 500 ram; elutiemiddel: een 0,1 molaire fosfaatbuffer met een pH van 7) met gebruikmaking van Senhadex 0-200, vertoont het absorptiebanden bij de elutievolumina in de buurt van 5'*9 - 930 ml 15 bij de ultraviolet absorptiemeting bij 260 nn en alle fracties bezitten een geringe absorptieband bij de absorptiemeting bij k'-)0 nm met een fenol-zwavelzuurmethode en bij de absorptiemeting bij c20 nm met een anthron-zwavelzuurmethode, (h) zijn hoog vermogen vloeistof chromatogram (elutiemiddel: 20 een 0,1 molaire fosfaatbuffer met een pK van 7; stroomsnelheid: 0,3 ml/min. bij kamertemperatuur) verkregen met gebruikmaking van TSK-GEL G30Q 3W (kolom: 7,9 mm doorsnee x 600 mm x 2) vertoont pieken in de buurt van het oplosmiddelfront, 23 - bQ en ^2 - 60 min. bij de ultraviolet absorptiemeting bij 220 nm en pieken in de 25 buurt van het oplosmiddelfront en ^2 - 60 min. bij de ultraviolet absorptiemeting bij 260 nm, (i) het heeft een positieve Molisch reactie, fenol-zwavel-zuurreactie, anthron-zwavelzuurreactie, indol-zoutzuurreactie en Lowry-Folin1s reactie en negatieve inhydrine reactie, 30 (j) elementair analyse waarden: C 27,5 - 32,6$; H 3,2 - k ,0$; N 5,0 - 6,1$, (k) het saccharidegehalte, gemeten met een fenol-zwavelzuur-methode, bedraagt 19,0 - 30,0 gew.$, uitgedrukt als glucose en het eiwitgehalte, gemeten met Lowry-Folin's methode bedraagt 6,0 -35 12,0 gew.$, uitgedrukt als kalven serum albumins. 8004759 1+1+. Carcinostatische stof TF-1++0 net de volgende eigenschappen: (a) grijswit-lichtbruin poeder, (b) het belemmert de uitzaaiing van muizen Ehrlich ascites 5 tumor en heeft een immunostinulerende werking, (c) het is oplosbaar in water en het is onoplosbaar in methanol, ethanol, aceton, benzeen, chloroform, ethvlacetaat en diethylether, (d) het heeft geen scherp smeltpunt, begint te ontleden bij 10 210°C en ontleedt uitgesproken boven 280°C, (e) het infrarood absorptiespectrum, verkregen met een KBr tabletmethode vertoont absoroptiebanden in de buurt van 36OO-3200, 2960-2930, 1670-161+0, 1550, 1U0-1380, 121+0, 111+0-1000 en 320 cm-1, 15 (f) het ultraviolet absorptiespectrum van zijn waterige oplossing vertoont een sterke absorptie bij de absorptierand en vertoont een absorptiepiek in de buurt van 255 - 260 m, (g) bij fractioneren door gelfiltratie (kolom: 1+1+ mm doorsnee x 500 ml; elutiemiddel: 0,1 molaire fosfaatbuffer met een 20 pH van 7) met gebruikmaking van Sephadex G-200, vertoont het absorptiebanden bij de elutievolumina in de buurt van het lege volume - 300, 520 - 900 en 900 - 1000 ml bij de ultraviolet absorptiemeting bij 260 nm en bij de elutievolumina in de buurt van het lege volume - 500, 650 - 850 en 850 - 1000 ml bij de 25 absorptiemeting bij 1+90 nm met een fenol-zvavelzuurmethode, (h) zijn hoog vermogen vloeistof chromatogram (elutiemiddel: een 0,1 molaire fosfaatbuffer met een pH van 7; stroomsnelheid: 0,8 ml/min, bij kamertemperatuur) verkregen met gebruikmaking van TSK-GEL G300 SW (kolom: 7,9 mm doorsnee x 600 ram x 2) vertoont 30 pieken in de buurt van het oplosmiddelfront en 1+0 - 60 min. bij de ultraviolet absorptiemeting bij 220 m en 260 nm, (i) het heeft een positieve 'lolisch reactie, fenol-zwavel-zuurreactie, anthron-zwavelzuurreactie, indol-zoutzuurreactie en Lowry-Folin's reactie en negatieve ninhydrine reactie, 35 (j) elementair analyse waarden: C 22,0 - 28,0$; H 3,0 - 3,5$; N 5,0 - 6,5*, 8004759 (k) het saccharidegehalte,gemeten net een fenol-zwavei-zuurmethode bedraagt 5,0 - 15,0 gew.?5, uitgedrukt als glucose, en het eiwitgehalte, gemeten met Lowry-Folin's methode bedraagt 23,0 - 32,0 gew.*, uitgedrukt als kalven serum albumine. 5 1+5. Carcinostatische stof TF-159 net de volgende eigen schappen : (a) gri.jswit-lichtbruin poeder, (b) het belemmert de uitzaaiing van muizen Ehrlich ascites tumor en heeft een immunostimulerende werking, 10 (c) het is oplosbaar in water en het is onoplosbaar in methanol, ethanol, aceton, benzeen, chloroform, ethvlacetaat en diethylether, (d) het'heeft geen scherp smeltpunt, begint te ontleden bij 11Q°C en ontleedt uitgesproken boven 200°C, 15 (e) het ultraviolet absorptiespectrum van de waterige oplossing vertoont een sterke absorptie bi.i de absorptierand en vertoont een absorptiepiek in de buurt van 255 - 2·?9 nm, (f) het infrarood absorptiesnectrun, verkregen met een KBr tabletmethode, vertoont a’csorptiebanden in de buurt van 20 3600-3200, 2960-2930, 167Q-16.-0, 1550, 1U0-13S0, 121+9, 111+0-1000 en 820 cm-1, (g) bij fractioneren door gelfiltratie (kolom: 21 mm doorsnee x 1+00 mm; elutiemiddel: een 0,1 molaire fosfaatbuffer met een pH van 7,0) met gebruikmaking van Be^hadex 0—200, bezit het 25 absorptiebanden bij de elutievolumina in de buurt van het lege volume - 100 en 100 - l£o ml bij de ultraviolet absorptie-meting bij 260 nm en een absorptieband bij de elutievolumina in de buurt van het lege volume - 150 ml bi.i de absorotiemeting bij 1+90 nm met een fenol-zwavelzuurmethode, 30 (h) zi.jn hoog vermogen vloeistof chromatogram (elutiemiddel: een 0,1 molaire fosfaatbuffer met een mïï van 7,0; stroomsnelheid: 0,8 ml/min. bij kamertemperatuur), verkregen met gebruikmak! ns^/an TSK-GEL G3GQ SW (kolom: 7,9 nin doorsnee x 600 mm x 2) vertoont pieken in de buurt van het oplosmiddelfront, 32 en 1+8 - 50 min. 35 bij de ultraviolet absorptiameting bij 220 nm en in de buurt van het oplosmiddelfront, 32 en 1+8 - 50 min. bij de ultraviolet 8004759 v V 'i *· Oh absorptieneting bij 26o nm, (i) het heeft een positieve Molisch reactie, fenol-zwavel-zuurreactie, anthron-zwavelzuurreactie, indol-zoutzuurreactie en Lowry-Folin's reactie en negatieve ninhydrine reactie, 5 (j) elementair analyse waarden: C 31,0 - 3^,055; E 4,0 - 4,42; N 2,8 - 3,2%, (k) het saccharidegehalte, gemeten met een fenol-zwavel-zuurmethode, bedraagt 1+0,0 - 55,0 gew.2, uitgedrukt als glucose en het eiwitgehalte, gemeten met Lovry-Folin's methode bedraagt 10 7,0-14 gev.2, uitgedrukt als kalven serum albumine.

46. Carcinostatisch preparaat, met het kenmerk, dat het een carcinostatische stof TF-100, 110, 120, 130, 1316, 132a, 132b, 133a, 133b, 1323, 136, 140 en 150 volgens conclusies 33, 34, 35, 36, 37, 33, 39, 40, 41, 42, 43, 44 of 45, in voor toediening 15 geschikte vorm bevat.

47. Carcinostatisch preparaat volgens conclusie 46, met het kenmerk, dat de carcinostatische stof bestaat uit ?F-132a, 132b, 133a, 133b of 1323 volgens resp. conclusie 38, 39, ^0, 41 of 42.

48. Werkwijze voor het behandelen van kanker bij een 20 warmbloedig zoogdier met inbegrip van de mens, net het kenmerk, dat men een carcinostatisch preparaat volgens conclusie 47 gebruikt. ' - 8004759