DE2551438C2

DE2551438C2 - Verfahren zur Herstellung von β-1,3-Glucanderivaten

Info

Publication number: DE2551438C2
Application number: DE2551438A
Authority: DE
Inventors: Koichi Neyagawa Osaka Kato; Takeshi Tondabayashi Osaka Takahashi; Yoshio Toyonaka Osaka Yamazaki
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1974-11-26
Filing date: 1975-11-15
Publication date: 1986-04-03
Also published as: DE2551438A1; NL186243B; FR2292714A1; US4075405A; NL186243C; NL7513773A; FR2292714B1; DE2560532C2; GB1531498A

Description

Die Erfindung betrifft die Herstellung von/?-13-Glucanderivaten durch Umsetzung von in Wasser unlöslichen /0-13-Glucanen mit einem Cyanhalogenid.

Die Erfindviig stellt sich die Aufgabe, in Wasser unlösliche Träger von hoher Reaktionsfähigkeit, die sich zur Herstellung von in Wasser unlöslichen Enzymen und von Säulen für die Affiniiätschromatographie eignen, verfügbar zu machen.

Ein allgemeines Verfahren, bei dem ein Polysaccharid mit einem Cyanhalogenid aktiviert und ein Derivat erhalten wird, das sich kovalent an Substanzen zu binden vermag, die primäre oder sekundäre Aminogruppen enthalten, wird beispielsweise in Nature 214 (1967), 1302, und in der US-PS 36 45 852 beschrieben. Die Zahl der Veröffentlichungen, die sich mit der Verwendung unlöslicher Träger zur Hersteilung von in Wasser unlöslichen Enzymen und von ligandengebundenen stationären Phasen für die Affinitätsehromaiographie nach diesem allgemeinen Verfahren befassen, ist sehr groß. In keiner dieser Veröffentlichungen wird jedoch die Verwendung von ß-13-Glucanen als Träger erwähnt

Die Aktivierungsreaktion mit einem Cyanhalogenid wird im allgemeinen bei einem pH-Wert im alkalischen Bereich, insbesondere in der Nähe von pH 11 durchgeführt Die^-13-Glucane sind jedoch unter diesen pH-Bedingungen in einem solchen Maße, löslich, daß durch direkte Anwendung des bekannten allgemeinen Verfahrens als solchem nicht die gewünschten aktivierten, in Wasser unlöslichen ß-13-Glucane erhalten werden.

In eingehenden Untersuchungen über die Bedingungen der Aktivierungsreaktion von in Wasser unlöslichen /?-13-Glucanen mit einem Cyanhaiogenid gelang der Anmelderin die Aktivierung der /äM^-Glucane unter Aufrechterhaltung ihrer Form.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von /2-1,3-Glucanderivaten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in Wasser unlösliche/-13-Glucane in Gegenwart von Wasser unter Zusatz eines Alkalimetallhydroxids mit einem Cyanhalogenid umsetzt, wobei man das Alkalimetallhydroxid in Form eine,- wäßrigen Lösung zu dem in Wasser vorgelegten ^-13-Glucan und Cyanhalogenid so zugibt, daß die Auflösung des/^-13-GIucans verhindert wird.

Zu den in Wasser unlöslichen /-13-GIucanen, die für die Zwecke der Erfindung geeignet sind, gehören beispielsweise die Polysaccharide, die von Mikroorganismen der Gattung Alcaligenes oder Agrobacterium gebildet werden. Besonders zu erwähnen sind das Polysaccharid, das von Alcaligenes faecalis var. myxogenes 10C3K gebildet wird (Agricultural Biological Chemistry 30 (1966), 196 ff„ das nachstehend als PS-I bezeichnete Polysaccharid, das vom Mutantenstamm NTK-u (IFO 13140, ATCC 21680) von Alcaligenes faecalis var. myxogenes 10C3K gebildet wird (US-PS 37 54 925 und 38 22 250), das von Agrobacterium radiobacter (IFO 13127, ATCC 6466) oder seinem Mutantenstamm U-19 (IFO 13126, ATCC 21679) gebildete, nachstehend als PS-2 bezeichnete Polysaccharid (US-PS 37 54 925 und 38 22 250) und Pachyman, das in der als Poria cocos bekannten rohen Droge vorkommt (Agr. Biol.Chem„32[1968], 1261).
Die für die Aktivierungsreaktion gemäß der Erfindung verwendeten, in Wasser unlöslichen /?-13—Glucane

so können in Form von Pulver oder Formteilen vorliegen, die unter Ausnutzung der Tatsache hergestellt werden, |j daß in Wasser unlösliche /2-13-GIucane auf Grund ihrer speziellen physikalischen Eigesnchaften in die verschie-

'*'" densten Formen, z. B. Fasern, Folien, Perlen oder kleine Kugeln oder in die Form von Mikrokapseln durch

Auftragen des Glucans auf ein Kernmaterial gebracht werden können.

Die in Wasser unlöslichen/?-1,3-Glucane können nach beliebigen Verfahren, die allgemein auf diesem speziellen Gebiet angewandt werden, zu Formkörpern verarbeitet werden. Um beispielsweise Fasern herzustellen, kann man ein Verfahren anwenden, bei dem man ein in Wasser unlösliches /?-13-Glucan in einer wäßrigen Natriumhydroxydllösung löst und die erhaltene/?-1,3-Glucanlösung dann aus einer Düse in eine wäßrige Chlorwasserstofflösung spinnt und hierdurch die Lösung neutralisiert und Gelierung des Glucans bewirkt (US-PS 38 99 480).

Eine Folie kann aus einem solchen wasserunlöslichen /?-1,3-Glucan beispielsweise hergestellt werden, indem man das in Wasser unlösliche /-13-Glucan in einer wäßrigen Kaliumhydroxydlösung löst, die Lösung auf eine ebene Glasplatte in gleichmäßiger Dicke aufträgt und die beschichtete Glasplatte abschließend in eine wäßrige Chlorwasserstoff lösung taucht und hierdurch die Folie neutralisiert und Gelierung des Glucans bewirkt (US-PS 38 99 480).

Das /?-13-Glucan kann beispielsweise mit Hilfe der folgenden alternativen Verfahren zu Perlen geformt

Man führt ein Medium, das ein in Wasser unlösliches ß-U-Glucan enthält, durch Strangpressen, Tropfenlassen oder Sprühen in ein erhitztes Ölbad ein und bewirkt hierdurch Geliening des Glucans (japanische hrif 52 953/1973)

sen oder Sp

Offenlegungsschrift 52 953/1973); _lj .„,,.

2. man löst das in Wasser unlösliche /7-13-GIucan in einer wäßrigen Natriumhydroxydlosung und fuhrt die

erhaltene Lösung durch eine Tropfdüse in eine wäßrige Chlorwasserstofflösung ein und neutralisiert hierbei

das Glucan und bewirkt seine Gelierung (US-PS 38 99 480);
3 man dispergiert eine wäßrige Alkalilösung des in Wasser unlöslichen ^-U-GIucan in einem organischen

Lösungsmittel, das mit Wasser nicht leicht mischbar ist, und gibt zur erhaltenen Dispersion eine organische

4. nfan gibt ein Kernmaterial zu einer alkalischen wäßrigen Lösung des in Wasser unlöslichen /-13-GIucans und dispergiert das Gemisch in einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser nicht leicht mischbar ist worauf man der erhaltenen Dispersion eine organische Säure zusetzt »

(Die beiden letztgenannten Verfahren werden in der japanischen Patentanmeldung I 27 197/75 beschrieben.)

Als Cyanhalogenide, die abs Aktivierungsmittel dienen, eignen sich normalerweise die Brom-, Chlor- und Jodverbindungen oder Gemische dieser Verbindungen. _ .

Als Alkaliverbindungen eignen sich für die Zwecke der Erfindung beispielsweise Ätzalkalien, z. B. Natnumhydroxyd und Kaliumhydroxyd. Bevorzugt werden normalerweise wäßrige In- bis 5n-Lösungen. Das Alkalihydroxid wird zweckmäßig bis zu einem pH-Wert von 9 bis 13 zugesetzt, wobei ein pH-Wert von etwa 11 besonders bevorzugt wird. Das Alkalihydroxid wird allmählich so zugesetzt, daß Auflösung des in Wasser unlöslichen /2-13-Gliican verhindert wird. Die Zugabe ^rfolgt vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit im BereiA von 0,2 bis 03 pH-Einheiten/Min.

Nachstehend wird die Aktivierungsreaktion eines in Wasser unlöslichen^-lß-Glucans mit einem Cyanhalogenid als spezielles Beispiel beschrieben.

In 20 Raumteilen Wasser wurde 1 Teil eines pulverförmiger in Wasser unlöslichen ß- 13-Glucans suspendiert Zur Suspension wurden 20 Raumteile Wasser gegeben, das 0,1 bis 3 Teile eines Cyanhalogenids enthielt Unter Rühren bei einer beliebigen Temperatur von 0 bis 50⁰C wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches durch tropfenweise Zugabe einer 2n-Natriumhydroxydlösung mit einer Geschwindigkeit bei der keine Auflösung des Glucans stattfindet (etwa 0,4 pH-Einheiten/Min.) auf 11 erhöht Das Reaktionsgemisch wurde dann 15 Minuten bei pH 11 gehalten, wodurch die Aktivierungsreaktion zur Vollendung gebracht wurde. Nach der Reaktion wurde die feste Fraktion abfiltriert und mit 100 Rauniteilen Wasser gespült Hierbei wurde ein pulverförmiges aktiviertes/?-13-Glucan erhalten. Dieses aktivierte ^-13-Glucan ist in Wasser und Alkalilösungen unlöslich. Es ist thermisch nicht gelierbar und hydrophil. Es besteht aus Teilchen, die eine solche Größe und Festigkeit haben, daß sie ausreichend fließfähig sind, wenn sie in Kolonnen gefüllt werden. Dieses/f-13-Glucan kann daher in Verfahren zur Herstellung wasserunlöslicher Enzyme, die ausgezeichnete Eigesnchaften aufweisen, oder von Träger-Ligand-Produkten, die sich für die Affinitätschromatographie eignen, verwendet werden, tin solches wasserunlösliches Enzym oder Träger-Ligand-Produkt für die Affinitätschromatographie wird beispielsweise durch Umsetzung des in der beschriebenen Weise aktivierten ß-\ 3-Glucans mit einer Substanz, die primäre^der Sekunda, s Aminogruppen enthält, z. B. einem Enzym, Protein, Peptid, einer Aminosäure, einem Enzymsubstrat oder Inhibitor, Antigen, Antikörper oder Hormon, vorzugsweise in schwach alkalischer wäßriger Lösung bei einer beliebigen Temperatur im Bereich von etwa 0 bis 50° C hergestellt

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert:

Beispiel 1

in ein 500-ml-Becherglas wurden 10 g weißes PS-1-Pulver gewogen. Nach Zugabe von 200 ml destilliertem Wasser wurde die Suspension mit einem Magnetrührer gerührt, bis das PS-I genügend gequollen war. Dann wurden 200 ml einer 5 g Cyanbromid pro 100 ml enthaltenden wäßrigen Lösung zugesetzt Unter ständigem Rühren bei 25° C wurde eine 2n-Natriumhydroxydlösung mit einem automatischen Titriergerät so zugesetzt, daß der pH-Wert der Suspension mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,5 pH-Einheiten/Min. stieg, bis ein pH-Wert von 11 erreicht war. Die Suspension wurde nach etwa 15 Stunden bei diesem pH-Wert gehalten, wodurch dir Reaktion zur Vollendung gebracht wurde.

Nach der Reaktion wurden die PS-I-Teilchen vom Reaktionsgemisch abfiltriert und mit 11 destilliertem Wasser gespült. Hierbei wurden 10,05 g (Trockengewicht) aktiviertes PS-I erhalten.

Beispiel 2

Auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise wurden 10 g weißes PS-2-Pub'sr mit Cyanbromid aktiviert, wobei 10,08 g (Trockengewicht) aktiviertes PS-2 erhalten wurden.

60 Beispiel 3

Zu 1 g PS-I wurden 20 ml Wasser gegeben. Nachdem das Polysaccharid genügend gequollen war, wurden 20 ml einer wäßrigen Lösung, die 5 g Cyanbromid pro 100 ml enthielt, zugesetzt Unter Rühren bei Raumtemperatur wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches unter Verwendung eines automatischen Titriergerätes (pH-Stat.) mit einer Geidiwindigkeit von 0,2 bis 0,5 pH-Einheiten/Min, auf 11 erhöht. Die Reaktion wurde 15 Minuten bei einem konstanten pH-Wert von 11 fortgesetzt Nach dieser Zeit wurde die feste Fraktion abfiltriert und mit destilliertem Wasser gut gespült. In dieser Weise wurde ein pktiviertes PS-I erhalten.

Beispiel 4

Zu 125 ml PS-I in Form von Perlen (Teilchendurchmesser 50 bis 200 μ) (entsprechend 5 g PS-I als Trockengewicht) wurden 100 ml Wasser und 100 ml 5%iges (Gew.-/Vol.) Cyanbromid gegeben. Bei 25"C wurde unter Rühren eine 2n-Natriumhydroxydlösung mit einem automatischen Titriergerät in solchen Mengen zugetropft, daß der pH-Wert allmählich mit einer Geschwindigkeit von etwa 03 pH-Einheiten/Min, stieg, bis ein End-pH-Wert von U erreicht war. Das Gemisch wurde etwa 15 Minuten bei diesem pH-Wert gehalten, wodurch die Reaktion zur Vollendung geführt wurde. Nach dieser Reaktion wurde der Feststoff abfiltriert und mit 500 ml destilliertem Wasser gespült. In der beschriebenen Weise wurde aktiviertes perlförmiges PS-I erhalten (Trokkengewicht 5,1 g).

Beispiel 5

Auf die in Beispiel 4 beschriebene Weise wurden 5 g faserförmiges PS-2 (Durchmesser etwa 0,2 bis 0.3 mm. Länge etwa 10 cm) gewogen und behandelt. Hierbei wurde ein faserförmiges aktiviertes PS-2 erhalten (Trockengewicht 5,15g).

Beispiel 6

Auf die in Beispiel 4 beschriebene Weise wurden 5 g PS-I in Form einer Folie (Dicke etwa 0,2 mm) behandelt. Hierbei wurde ein aktiviertes folienförmiges PS-I erhalten (Trockengewicht 4.95 g).

Das pulverförmige PS-I, das perlförmige PS-I. das faserförmige PS-2 und das folienförmige PS-I, die mit Cyanbromid auf die in den Beispielen 1 und 4 bis 6 beschriebene Weise aktiviert worden waren, hatten die folgenden Eigenschaften:

1.Form

Das unbehandelte pulverförmige PS-I nahm beim Quellen in destilliertem Wasser eine Form ähnlich einem schlaffen, entleerten Gummiball mit einem Durchmesser von 20 bis 500 μηι an, wobei der größte mittlere Durchmesser etwa 50 μηι betrug. Es wurde gefunden, daß das aktivierte puiverförmige PS-I in Form und Teilchengröße im wesentlichen identisch mit unbehandeltem pulverförmigem PS-I war.

In jedem Fall des perlförmigen PS-I, des faserförmigen PS-2 und des folienförmigen PS-I wurde praktisch keine Veränderung der Form zwischen dem nicht aktivierten Glucan und dem aktivierten Glucan festgestellt.

2. Thermische Gelierbarkeit

Im Gegensatz zu den entsprechenden nicht aktivierten Glucanen fehlte den aktivierten Glucanen völlig die Fähigkeit, thermisch zu gelieren. Selbst nach Erhitzen für 15 Minuten in siedendem Wasser fand keine Gelierung statt.

3. Löslichkeit

Im Gegensatz zu den nicht aktivierten Glucanen konnten die aktivierten Glucane in wäßrigen Lösungen von starken Alkalien, Dimethylsulfoxyd und in konzentrierten Harnstofflösungen (8molar) überhaupt nicht gelöst werden.

4. Analyse auf Stickstoff

Die Bestimmung auf N durch Elementaranalyse ergab, daß die durch die Aktivierungsbehandlung eingefüh-ten Zahlen (Durcnschnitt) von Stickstoffatomen 0,43 pro Glucoserest im Falle von PS-1-Pulver, 0,45 für PS-1-Perlen, 036 für faserförmiges PS-2 und 0,29 für PS-I-Folien betrug.

5. Infrarot-Absorptionsspektren (KBr)

Das Infrarotspektrum von unbehandeltem pulverformigem PS-I ist in F i g. 1 und das entsprechende Spektrum von aktiviertem PS-I in F i g. 2 dargestellt Ein Vergleich der beiden Spektren ergab neue Absorptionsbanden bei 1730, 1625 und 780 cm-' im Falle von aktiviertem pulverförmigem PS-I. Offensichtlich waren die Absorption bei 1730 cm -' auf das Carboxyamid und die Absorptionen bei 1625 und 780 cm -' auf das Imidocarbonat zurückzuführen.

Das perlförmige PS-I, das faserförmige PS-2 und das folienförmige PS-I zeigten außerdem stets Absorptionsmaxima, die fürCarboxyamide {1730 cm-') und Imidocarbonate (1625 cm-¹,780 cm-¹) charakteristisch sind.

6. Färbbarkeit

Die Färbbarkeit dieser aktivierten Glucane wurde unter Verwendung von wasserlöslichen Farbstoffen nach der Methode von Nakanishi und Mitarbeitern (Carbohydrate Research 32 [1974], 47—52) ermittelt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 genannt

Tabelle 1 Färbbarkcitstest

Probe

Farbstoff	Brillant	Trypan-	Kongo	Toluidin-	Methylen
Anilin	blau	blau	rot	blauO	blau
blau

PS-1 -Pulver (unbehandelt) PS-I-Pulver (aktiviert) PS-1-Perlen (unbehandelt) PS-1-Perlen (aktiviert) PS-2-Fasern (unbehandelt) PS-2-Fasern (aktiviert) PS-1 - Folie (unbehandelt) PS-I-Folie (aktiviert)

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von/"-13-GIucanderivaten, dadurch gekennzeichnet, daß man in Wasser unlösliche /2-1,3-Glucane in Gegenwart von Wasser unter Zusatz eines Alkalimetallhydroxids mit einem Cyanhalogenid umsetzt, wobei man das Alkalimetallhydroxid in Form einer wäßrigen Lösung zu dem in Wasser vorgelegten ^-13-GIucan und Cyanhalogenid so zugibt, daß die Auflösung des ^-1,3-Glucans verhindert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Alkalimetallhydroxidlösung so zugibt, daß sich der pH-Wert des Reaktionsgemisches um etwa 0,2 bis 0,5 pH-Einheiten/min erhöht

3. Verfahren nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das in Wasser unlösliche ^-13-GIucan in Form von Fasern, Folien oder Perlen einsetzt.