CN109900838A - 一种铁皮石斛水溶性非淀粉多糖的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉公开了一种铁皮石斛水溶性非淀粉多糖的测定方法，包括以下过程：新鲜铁皮石斛枝条真空冷冻干燥，粉碎，过60目筛备用；按新版《中国药典》铁皮石斛含量测定方法，称定样品粉末0.3 g，加入蒸馏水200 mL，水浴回流2 h，趁热过滤，定容到250 mL，得到铁皮石斛总多糖提取液T，在总多糖提取液T中，加入等体积的Tris‑马来酸盐缓冲液进行“水提‑α淀粉酶处理‑一次醇沉”处理，其结果《中国药典》法比较，总多糖、葡萄糖、甘露糖含量分别下降了20.9%、58.8%、1.6%。说明本技术方案可有效去除淀粉，操作简单、重复性好，适用于铁皮石斛等含淀粉药材的特殊多糖含量测定，对指导优质药材的生产、加工具有重要的理论与应用价值。

Description

一种铁皮石斛水溶性非淀粉多糖的测定方法

技术领域

本发明涉及到一种铁皮石斛水溶性非淀粉多糖的测定方法，属生物技术领域。

背景技术

铁皮石斛（Dendrobium catenatum Lindl.）是一种传统的名贵药材，以新鲜或干燥茎入药，具有滋阴清热，益胃生津的功效。现代生物技术研究表明，以葡甘聚糖为主的铁皮石斛水溶性非淀粉多糖是铁皮石斛茎中的主要活性成分，具有抗氧化，免疫调节，抗肿瘤等作用，其降解产生的甘露糖通过抑制葡萄糖代谢从而抑制肿瘤细胞的生长已经得到科学验证。然而，铁皮石斛植物体中这种有效成份的含量，因其品种、栽培环境等因素的影响而具有明显的差异，从而导致铁皮石斛药效品质不同。铁皮石斛植株体中有效成份的含量，直接影响到铁皮石斛产品的品质，因此，在中药学方面就有道地药材之说。现有铁皮石斛的质量评估，多以铁皮石斛外观指标进行。2015年版《中国药典》采用水提醇沉法提取总多糖溶液并测定铁皮石斛多糖含量，提出了一种以铁皮石斛有效成份含量作为指标的质量评价指标。然而实践结果表明，这种水提醇沉法所得的结果包含了淀粉类多糖和铁皮石斛水溶性非淀粉多糖，影响了铁皮石斛质量的科学评价。因此有必要获得一种能减少淀粉干扰的铁皮石斛水溶性非淀粉多糖的测定方法。

发明内容

为解决现有铁皮石斛水溶性非淀粉多糖测定过程中淀粉干扰铁皮石斛水溶性非淀粉多糖含量测定的技术问题，本发明提出了一种新的测定方法。

本发明是通过下述方式实现的：一种铁皮石斛水溶性非淀粉多糖的测定方法，包括下述过程：

步骤1：取新鲜铁皮石斛枝条真空冷冻干燥，粉碎，过60目筛备用；

步骤2：按照2015年版《中国药典》铁皮石斛含量测定方法，每个单位精密称定样品粉末0.3 g，加入蒸馏水200 mL，水浴回流2 h，趁热过滤，定容到250 mL，得到铁皮石斛总多糖提取液T；

其特征在于还包括下述过程：

步骤3：吸取步骤2所得的总多糖提取液T 4 mL，加入等体积的10 mM Tris-马来酸盐缓冲液，静置30至35min后置于沸水浴中7至10min，冷却，于35至40 ℃水浴平衡10 min；

步骤4：加入100 U·mL-1 α-淀粉酶溶液0.4 mL ，40 ℃孵育1 h，再加入α-淀粉酶溶液0.2 mL ，40 ℃孵育0.5 h；

步骤5：加入4倍体积的无水乙醇，-20 ℃冷藏过夜，离心，上清液留用，沉淀加冷80%乙醇20 mL离心2次，沉淀加热水溶解，定容至50 mL，即制得铁皮石斛水溶性非淀粉多糖溶液S。

由于本发明提出了“水提-α淀粉酶处理-一次醇沉”处理方法，在本实验中实测得0.3克的铁皮石斛中非淀粉多糖含量为374.4 mg·g^-1，与2015年版《中国药典》法比较，总多糖、葡萄糖、甘露糖含量分别下降了20.9%、58.8%、1.6%。建立的“水提-α-淀粉酶处理-一次醇沉”提取法与药典法相比，可以有效去除淀粉，操作简单、重复性好，适用于铁皮石斛等含淀粉药材的特殊多糖含量测定，对指导优质药材的生产、加工具有重要的理论与应用价值。

附图说明

图1 淀粉与铁皮石斛多糖碘-碘化钾显色试验；

图2 不同浓度的α-淀粉酶处理铁皮石斛样品后碘-碘化钾显色反应吸光度值；

图3铁皮石斛多糖中单糖组分的HPLC图。

图中：A. 2.5 mg·mL^-1淀粉；B. 铁皮石斛粉末；C. 药典法提取的多糖溶液； D.0.006 U·mL^-1 α-淀粉酶预处理制得的多糖溶液； E. 15U·mL^-1 α-淀粉酶预处理制得的多糖溶液；F蒸馏水。

1. 甘露糖；2. 鼠李糖；3. 葡萄糖醛酸； 4. 半乳糖醛酸； 5.葡萄糖； 6.半乳糖；7.木糖； 8.阿拉伯糖。

具体实施方式

实施方式1

实验仪器：

Agilent 1200 高效液相色谱系统（DAD检测器）；

光吸收酶标仪SpectraMax 190（美国 Molecular Devices）；

D-37520型高速离心机（德国 Heraeus）；

ALPHA 1-2 LD Plus冻干机（德国 Christ）。

实验试剂：

α-淀粉酶（批号：10080）购于美国 Sigma 公司；

D-甘露糖（批号：B21895）、L-鼠李糖（批号：B21172）、D-半乳糖醛酸（批号：B21894）、D-葡萄糖（批号：B21882）、D-木糖（批号：B21880）D-半乳糖（批号：YY91011）、D-阿拉伯糖（批号：YY91244）对照品均购于上海源叶生物科技有限公司；

D-葡萄糖醛酸（批号：140648-200602）对照品均购于中国药品生物制品检定所；

可溶性淀粉（直链淀粉 AR）（批号：20140714）购于国药集团化学试剂有限公司；

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）（批号：C10092148）购于上海麦克林生化科技有限公司；碘（批号：B1425040）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

碘化钾（批号：1206211）购于西陇化工股份有限公司；

水为去离子水，乙腈为色谱纯，其它试剂为分析纯。

供试材料：2018年5月9日采集浙江省临安市天目山镇横塘村麻泥角弄（东经119°26′11″，北纬30°20′30″，海拔280米）梨树附生的铁皮石斛C15品系茎（树木枝叶遮阴，遮阴度70%-80%，光强为3000 -5000 lx），真空冷冻干燥，粉碎，过60目筛备用。

实验方法：总多糖提取液制备：按照药典法铁皮石斛含量测定项下方法，精密称定样品粉末0.3 g，加入蒸馏水200 mL，水浴回流2 h，趁热过滤，定容至250 mL，以80%乙醇终浓度进行沉淀，沉淀定容至50 mL，制得总多糖提取液。

非淀粉多糖溶液制备：方法A（二次醇沉）：取总多糖提取液4 mL，加入等体积的10mM Tris-马来酸盐缓冲液，静置30 min后置于沸水浴中7 min，冷却，于40 ℃水浴平衡10min，加入100 U·mL^-1 α-淀粉酶溶液0.4 mL，40 ℃孵育1 h，再加入α-淀粉酶溶液0.2 mL，40 ℃孵育0.5 h；两次酶处理使其终浓度达15 U·mL^-1。加入4倍体积的无水乙醇，-20 ℃冷藏过夜，离心，沉淀加冷80%乙醇20 mL离心2次，沉淀加热水溶解，定容至50 mL，即制得非淀粉多糖溶液。

方法B（一次醇沉）：精密称定样品粉末0.3 g，加入蒸馏水200 mL，水浴回流2 h，趁热过滤，定容至250 mL，摇匀静置；吸取该水提液4 mL，自“加入等体积的10 mM Tris-马来酸盐缓冲液”起，同方法A。

基于葡萄糖的标准曲线制备：配制浓度为0.01~0.10 mg·mL^-1的葡萄糖标准液，采用苯酚-硫酸法显色，于488 nm处测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得其回归方程为Y=6.139 5X +0.003 0，R ²=0.999 0。

苯酚硫酸法测定样品多糖含量：精密量取供试品溶液1 mL，照[0015]段所述的方法测定吸光度并计算多糖含量。

单糖组成及含量测定：采用PMP柱前衍生-HPLC法分析铁皮石斛多糖中单糖的组成和含量：分别吸取总多糖提取液和方法B所得的非淀粉多糖溶液1 mL，进行多糖酸水解及衍生化产物的制备。色谱条件为Venusil MP C18（4.6 × 300 mm，5 µm ）色谱柱；流动相0.02mol·L^-1乙酸铵-乙腈（17：83），柱温35 ℃，流速1.0 mL·min^-1，检测波长250 nm，进样量25µL。

淀粉标准曲线的制备：配制浓度为0.1~1.0 mg·mL^-1的淀粉标准液，采用碘-碘化钾显色法，于580 nm处测定吸光度，以淀粉浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得其回归方程为Y=1.237 1X +0.010 2，R ²=0.999 6。

方法学考察：精密度：取同一标准品溶液分别按[0015]、[0017]段所述方法操作，重复测定6次，测定的多糖含量、单糖色谱峰面积等RSD值均小于1 %，表明检测仪器的精密度良好。

重复性：称取同一样品6份按[0014] 段所述方法制备供试品溶液，按[0016]、[0017] 所述的方法操作，测定的非淀粉多糖含量、单糖色谱峰面积RSD值均小于2% ，表明方法重复性良好。

稳定性：（1）取同一供试样品溶液按[0016] 段所述方法操作，测定显色反应结束后0，20，40，60，90，120 min时的吸光度值，测定的多糖含量RSD值均小于1 %，表明供试品溶液在120 min内稳定。（2）取同一供试样品溶液按[0017] 段所述方法操作，测定单糖衍生物溶液在4 ℃存放条件下1 d、2 d、3 d、4 d、5 d后的色谱峰面积，其RSD值均小于1%，表明供试品溶液在5 d内稳定。

数据处理分析：试验中得到的数据采用Microsoft Office Excel 2010软件进行处理，利用SPSS 19.0软件、中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件进行统计分析。

结果与分析。α-淀粉酶前处理方法的优化：对铁皮石斛粉末、药典法和方法B（一次醇沉）多糖溶液进行碘-碘化钾显色反应，以2.5 mg·mL^-1淀粉水溶液为阳性对照，去离子水为阴性对照，结果见图1。淀粉、铁皮石斛粉末和药典法所得多糖溶液加入碘试剂均呈蓝色（图1 A、B、C），表明铁皮石斛粉末中含有淀粉，用药典法提取的多糖溶液中也包含了淀粉。低浓度α-淀粉酶（0.006 U·mL^-1）预处理后的多糖溶液也呈蓝色（图1D），但高浓度α-淀粉酶（15 U·mL^-1）预处理后的多糖溶液未见蓝色现象（图1E），表明α-淀粉酶浓度过低时不能完全除去铁皮石斛中的淀粉，方法B（一次醇沉）采用15 U·mL^-1 浓度的α-淀粉酶预处理可有效去除铁皮石斛多糖中的淀粉，获得非淀粉多糖溶液。

将样品与碘-碘化钾显色反应后的溶液在250~750 nm范围进行全波长扫描，测得最大吸收波长为580 nm，因此选用580 nm为铁皮石斛中淀粉含量测定的检测波长。用不同浓度α-淀粉酶预处理样品，在580 nm处测得吸光度值见图2。随着α-淀粉酶浓度的增加，淀粉消除效果增强，5~40 U·mL^-1浓度范围内稳定，与对照吸光度值相同。

三种处理方法铁皮石斛多糖含量比较：供试样品采用药典法、方法B、方法A提取后，测定的多糖含量分别为473.3 mg·g^-1、374.4 mg·g^-1、346.6 mg·g^-1（表1），两种α-淀粉酶预处理方法测得多糖含量与药典法相比均有下降：方法B多糖含量下降20.9%，方法A多糖含量下降26.7%；方法A（二次醇沉）多糖含量下降比方法B（一次醇沉）多5.8个百分点。上述结果表明，α-淀粉酶预处理除去了淀粉类多糖，但是二次醇沉可能损耗了非淀粉多糖，影响测定结果的准确性。

表1铁皮石斛总多糖与非淀粉多糖含量（mg·g^-1）

三种处理方法多糖中各组成单糖的差异分析：铁皮石斛多糖主要由甘露糖和葡萄糖组成，并含有少量葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、木糖和阿拉伯糖，α-淀粉酶预处理后多糖中单糖种类没有变化，但主要单糖含量发生明显变化（表2和图3），药典法、方法B、方法A甘露糖与葡萄糖峰面积比分别为2.1、5.0、4.9。药典法总多糖中甘露糖与葡萄糖的含量分别为120.60 mg·g^-1、71.23 mg·g^-1；α-淀粉酶预处理后葡萄糖含量明显下降，方法A与方法B分别下降67.7%、58.8%；方法A甘露糖含量下降23.6%，方法B下降仅1.6%。上述结果表明，方法A （二次醇沉）α-淀粉酶预处理除去淀粉中葡萄糖的同时也损失了部分葡甘聚糖类多糖，其损耗可能是二次醇沉操作造成的；方法B（一次醇沉）在去除淀粉的同时，非淀粉多糖损耗很小。

表2铁皮石斛多糖中单糖组成（mg·g^-1）

铁皮石斛淀粉含量测定与α-淀粉酶处理非淀粉多糖的损耗：

表3 淀粉含量与α-淀粉酶处理后多糖减少量（mg·g^-1）

用碘-碘化钾测定铁皮石斛样品中淀粉含量为92.6mg·g^-1；α-淀粉酶处理后，方法B（一次醇沉）多糖减少98.9 mg·g^-1，方法A（二次醇沉）多糖减少126.7 mg·g^-1，非淀粉多糖损失分别损失1.3%、7.2%。上述结果表明，方法B（一次醇沉）α-淀粉酶处理有效除去了铁皮石斛茎中的淀粉，损失极少量的非淀粉多糖；方法A由于二次醇沉，在操作过程中损失较多的非淀粉多糖。

结论与讨论：本研究建立了“水提-α-淀粉酶处理-一次醇沉”处理方法，于铁皮石斛水提取溶液中加入α-淀粉酶使其终浓度达15 U·mL^-1，可有效去除样品中的淀粉，该方法与2015年版《中国药典》法比较，总多糖、葡萄糖、甘露糖含量分别下降了20.9%、58.8%、1.6%，与方法A（二次醇沉）比较，非淀粉多糖少损耗27.7 mg·g^-1。与药典法相比，可以有效去除淀粉，较准确的测定葡甘聚糖等非淀粉类活性多糖；与方法A（二次醇沉）提取法比较，铁皮石斛非淀粉多糖损失较少，有效的提高了测定结果准确性，操作简单、重复性好，适用于铁皮石斛等含淀粉药材的非淀粉多糖含量测定，对优质药材的生产、加工与评价具有重要的理论与应用价值。

实施方式2

实验仪器与实验材料与实施方式1相同。步骤3：吸取步骤2所得的总多糖提取液T 4mL，加入等体积的10 mM Tris-马来酸盐缓冲液，静置35 min后置于沸水浴中10 min，冷却，于40 ℃水浴平衡10 min。其他过程同实施例1，其实验效果与实施例1基本相同。

Claims (1)

1.一种铁皮石斛水溶性非淀粉多糖的测定方法，包括下述过程：

步骤1：取新鲜铁皮石斛枝条真空冷冻干燥，粉碎，过60目筛备用；

步骤2：按照2015年版《中国药典》铁皮石斛含量测定方法，每个单位精密称定样品粉末0.3 g，加入蒸馏水200 mL，水浴回流2 h，趁热过滤，定容到250 mL，得到铁皮石斛总多糖提取液T；

其特征在于还包括下述过程：

步骤3：吸取步骤2所得的总多糖提取液T 4 mL，加入等体积的10 mM Tris-马来酸盐缓冲液，静置30至35min后置于沸水浴中7至10min，冷却，于35至40 ℃水浴平衡10 min；

步骤4：加入100 U·mL-1 α-淀粉酶溶液0.4 mL ，40 ℃孵育1 h，再加入α-淀粉酶溶液0.2 mL ，40 ℃孵育0.5 h；

步骤5：加入4倍体积的无水乙醇，-20 ℃冷藏过夜，离心，上清液留用，沉淀加冷80%乙醇20 mL离心2次，沉淀加热水溶解，定容至50 mL，即制得铁皮石斛水溶性非淀粉多糖溶液S。