CN106404685B - 一种保健酒中总皂苷含量的测定方法 - Google Patents

一种保健酒中总皂苷含量的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种保健酒中总皂苷含量的测定方法，包括以下步骤：S1校准溶液的制备和显色，S2酒样溶液的制备和显色，以及S3酒样中总皂苷的含量计算。其中S1校准溶液的制备和显色，S2酒样溶液的制备和显色操作过程中，首先将皂苷水解成苷元，消除了糖基对香草醛显色剂的干扰，采用液液萃取方式提取苷元的同时除去了酒样中的干扰色素。本发明方法具有线性关系良好、准确度高、精确度好、重复性效果良好等优点，因此非常适合用于保健酒中总皂苷含量的定量分析和质量控制。

Description

一种保健酒中总皂苷含量的测定方法
技术领域
本发明涉及食品测试技术领域，特别涉及一种保健酒中总皂苷含量的测定方法。
背景技术
保健酒已有数千年的历史，是中国医药科学的重要组成部分。中国的历代医药著作中几乎无一例外地有药酒治疾健身的记载。今天随着科学技术的进步，从中药浸酒的传统工艺的基础上已发展到利用萃取、浸提和生物工程等现代化手段，提取中药中的有效成份制成高含量的功能药酒。当人们的保健意识日趋增强，一些药物成为食用保健品时，保健酒这一新名词便开始出现。保健酒作为保健食品的一大类，是由基酒加中药配制而成，具有抗疲劳，调节免疫力之功效，免疫调节的功效。保健酒将中药功能与酒的作用有效结合，极大地增强了药物的效能与作用，药借酒势，酒助药威，迅速增强人体微循环(扩张毛细血管)，使有效成份直达病所，诸多症状可迅速缓解或消失。保健酒的生物活性成份通常来自传统中药，特别是有滋补作用的中药。全球市场上常见的保健酒有法国的廊酒(法语：Bénédictine)日本的养命酒，中国的劲酒和椰岛的鹿龟酒。它们的共同特征是配方复杂(采用数十种中药)，均声称有各样保健功效。然而，由于成份过于复杂，如何有效的对其活性成份进行定量和质量控制标准是保健酒业面临的巨大挑战。以鹿龟酒为例，它是由人参、枸杞、熟地黄、当归、黄精、砂仁、肉桂等多位中药材为原料经浸提、调配、陈酿、过滤等工艺精制而成。总皂苷作为保健酒中重要的功效成分，建立稳定的总皂苷含量测定方法是保障产品品质稳定的基础。“皂苷”是由甾体或三萜类化合物作为苷元与糖分子缩合而成的一类低聚糖苷，是一类广泛存在于植物细胞内的有机化合物，它具有调节肾脏功能，抗缺氧和抗疲劳、抗低温应激作用，抗脂质氧化作用，抗致突变作用及双向调节免疫的保健功能。
总皂苷的现有检测标准为2003版《保健食品检验与评价技术规范》，该法是针对保健食品中“总皂苷”含量测定的一个广泛方法，其采用香草醛显色剂测定总皂苷含量。但是，皂苷结构中的糖基本身可与香草醛发生显色反应，保健酒中含有多种不同糖基数的皂苷致使与香草醛出现显色结果差异。
发明内容
鉴以此，本发明的目的在于提出一种保健酒中总皂苷含量的测定方法，消除皂苷结构中的糖基对香草醛显色剂的干扰，从而达到准确检测保健酒样中总皂苷含量的目的。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种保健酒中总皂苷含量的测定方法，包括以下步骤：
S1：校准溶液的制备和显色
S101水解：往乙腈和盐酸的混合溶剂中加入人参皂苷Re甲醇溶液，混匀后于恒温水浴条件下进行水解；
S102萃取：水解产物冷却后加入二氯甲烷和去离子水，水洗分离去掉水层，经氮吹仪吹干有机相层；
S103校准溶液配制：将萃取吹干后的产物用乙腈溶解和定容，得到人参皂苷苷元校准溶液；
S104测定吸光度：取人参皂苷苷元校准溶液加入到香草醛硫酸显色中间溶液中，显色体系中人参皂苷苷元校准溶液的浓度记为C标，测定人参皂苷苷元校准溶液的吸光度值，该吸光度值记为A标；
S2：酒样溶液的制备和显色
S201皂苷的提取：将保健酒酒样挥干乙醇和水，所得固体用水溶解，将该溶液进行固相萃取和洗脱，收集洗脱液，除去溶剂，所得固体用甲醇溶解，获得酒样皂苷甲醇溶液；
S202水解：往乙腈和盐酸的混合溶剂中加入酒样皂苷甲醇溶液，混匀后于恒温水浴条件下进行水解；
S203萃取：将水解产物冷却后加入二氯甲烷和去离子水，水洗分离去掉水层，经氮吹仪吹干有机相层；
S204酒样溶液的配制：将萃取吹干后的产物用乙腈溶解并定容至V1mL，得到酒样苷元乙腈溶液；
S205测定吸光度：吸取V2mL酒样苷元乙腈溶液加入到V3mL的香草醛硫酸显色中间溶液中，测定酒样苷元乙腈溶液的吸光度，该吸光度值记为A样；
S3：酒样中总皂苷的含量计算
计算公式为：
式中，X表示酒样中总皂苷的含量，单位为mg/100mL；A标表示紫外分光光度计测定的校准溶液的吸光度值；A样表示紫外分光光度计测定的样品吸光度值；C标表示显色体系中校准溶液的浓度，单位为μg/mL；946.55为人参皂苷Re的摩尔分子量，单位为g/mol；476.73为人参皂苷水解成苷元的摩尔分子量，单位为g/mol。
进一步的，步骤S101和S202的水解过程中，恒温水浴温度为70～90℃，时间为1～5小时。
进一步的，步骤S101和S202的水解过程中，乙腈和盐酸的体积比为1:1。
进一步的，步骤S101和S202的水解过程中使用的盐酸还可以用硫酸或硝酸代替。
进一步的，所述步骤S104的测定吸光度过程中，取人参皂苷苷元校准溶液加入到香草醛硫酸显色中间溶液中，涡旋混匀，得到校准显色组；同时吸取乙腈加入到香草醛硫酸显色中间溶液中，涡旋混匀，得到溶剂空白显色组；所得校准显色组和溶剂空白显色组水浴加热后迅速放入冰水中冷却，后检测溶液在最大吸收波长下的吸光度值。
进一步的，所述步骤S201皂苷的提取过程中，将保健酒酒样水浴挥干乙醇和水，所得固体用水溶解，将该溶液加入经激活的萃取小柱中萃取，然后用去离子水洗涤，保持1～2滴/秒的速度洗涤，再用甲醇进行洗脱，收集洗脱液，除去甲醇和水，所得固体用甲醇溶解，获得酒样皂苷甲醇溶液。
进一步的，所述步骤S205的测定吸光度过程中，取酒样苷元乙腈溶液加入到的香草醛硫酸显色中间溶液中，混合均匀，所得混合物水浴加热后迅速放入冰水中冷却，后检测溶液在最大吸收波长下的吸光度值。
进一步的，测定过程中所使用到的甲醇还可以替换为水饱和正丁醇。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提出的保健酒中总皂苷含量的测定方法采用皂苷酸水解显色法测定保健酒中的总皂苷含量，将保健酒中的皂苷水解成苷元，消除了皂苷糖基对香草醛显色剂的干扰，采用液液萃取方式提取苷元的同时除去了酒样中的干扰色素。且以水解后的人参皂苷苷元制备标准曲线，本发明方法具有线性关系良好的优点。本发明测定方法具有准确度高、精确度好、重复性效果良好等优点，因此非常适合用于保健酒中总皂苷含量的定量分析和质量控制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明实施例中人参皂苷苷元标准曲线图。
图中，横坐标为苷元标准曲线工作溶液显色体系中的浓度，纵坐标为吸光度。
具体实施方式
为对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，发明人结合实施例进行说明，但以下实施例所描述的仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
仪器与试剂：
莱伯泰科UV2000型紫外分光光度计；十万分之一分析天平(Mettler ToledoXS205DU)；万分之一天平(Mettler Toledo AL204-IC)；漩涡混悬器(VELPZX3)；固相萃取仪(supelco 12管路)；隔膜真空泵(Ameritech AVP-7120)；氮吹仪(上海安谱DC-12)；旋转蒸发仪(上海申顺生物科技R-201)。
移液枪；塑料离心管；50ml圆底烧瓶；巴氏吸管；固相萃取柱(bond Elut-C18OH，500mg 3ml，50/PK，Agilent Technologies)。
香草醛(基准试剂)二氯甲烷、甲醇、乙腈、硫酸、盐酸为分析纯。
77％硫酸溶液(v/v)；氯化氢水溶液(4mol/L)；70％甲醇水溶液(v/v)。
香草醛硫酸显色中间液：准确吸取8％香草醛甲醇溶液500μL加入3ml的77％硫酸溶液中，振荡混合均匀，冷却至室温，现配现用。
供试品：保健酒A：海南椰岛酒业发展有限公司提供。
对照品：人参皂苷Re：中国药品生物制品检定所。
本发明提出的一种保健酒中总皂苷含量的测定方法，包括以下步骤：
S1：校准溶液的制备和显色
S101水解：称取人参皂苷Re适量(精确至0.0001克)，用甲醇定容，配制成3.6mg/mL人参皂苷Re甲醇溶液，然后移取500μL的乙腈于塑料离心管中，加入500μL盐酸(4mol/L)，涡旋混匀得到水解溶剂，往水解溶剂中加入3.6mg/mL的人参皂苷Re甲醇溶液1mL，涡旋混匀后放入70～90℃恒温水浴1～5小时，优选为80℃恒温水浴3小时。该水解过程中使用的盐酸还可以用硫酸或硝酸等代替。
S102萃取：将上述水解产物冷却后加入5mL的二氯甲烷和3mL的去离子水，有机相分别用3mL水洗两遍，分离去掉水层(上层)，二氯甲烷有机相层经氮吹仪吹干。
S103校准溶液(苷元标准曲线工作溶液)配制：萃取后的产物用乙腈溶解和定容，得到浓度为0.068mg/mL、0.136mg/mL、0.272mg/mL、0.544mg/mL和0.907mg/mL的人参皂苷苷元校准溶液(苷元标准曲线工作溶液)，现配现用。
S104测定吸光度：分别吸取浓度为0.068mg/mL、0.136mg/mL、0.272mg/mL、0.544mg/mL和0.907mg/mL的苷元标准曲线工作溶液各0.5mL加入到4.5mL香草醛硫酸显色中间溶液中，该显色体系中人参皂苷苷元校准溶液的浓度记为C标，涡旋混匀，得到5组校准显色组；同时吸取0.5mL的乙腈加入到4.5mL的香草醛硫酸显色中间溶液中，涡旋混匀，得到溶剂空白显色组；所得校准显色组和溶剂空白显色组于70℃水浴加热10分钟后迅速放入冰水中冷却30秒，检测溶液在541nm(扫描最大吸收波长)波长下的吸光度,每个样品平行测定二次，求平均值(该吸光度为A标)。
S2：酒样溶液的制备和显色
S201皂苷的提取：吸取1.0mL保健酒A于瓷蒸发皿中，水浴挥干乙醇和水，所得固体用1mL水溶解，备用。将此样品溶液加入经激活的萃取小柱中，然后用6mL去离子水洗涤，保持1-2滴/秒的速度除去样品中的游离糖类等水溶性杂质，再分别用70％甲醇水溶液(6mL)和甲醇(10mL)进行洗脱，收集洗脱液于圆底烧瓶中，在旋转蒸发仪上旋去甲醇和水，所得固体用甲醇1mL溶解备用，称为酒样皂苷甲醇溶液。
S202水解：移取500μL的乙腈于15mL塑料离心管中，加入盐酸(4mol/L)500μL，涡旋混匀得到水解溶剂。加入上述酒样皂苷甲醇溶液1mL，涡旋混匀后放入80℃恒温水浴3小时。
S203萃取：将上述水解产物冷却至室温后加入5mL的二氯甲烷和3mL的去离子水，有机相分别用3mL水洗两遍，分离去掉水层(上层)，二氯甲烷有机相层经氮吹仪吹干。
S204酒样溶液的配制：将萃取吹干后的产物用乙腈溶解并定容至2mL，得到酒样苷元乙腈溶液；
S205测定吸光度：吸取0.5mL酒样苷元乙腈溶液加入到4.5mL的香草醛硫酸显色中间溶液中，混合均匀，所得混合物于70℃水浴加热10分钟后迅速放入冰水中冷却30秒，检测溶液在541nm(扫描最大吸收波长)波长下的吸光度，每个样品平行测定二次，求平均值(该吸光度为A样)。
S3：酒样中总皂苷的含量计算
计算公式为：
式中，
X表示酒样中总皂苷的含量，单位为mg/100mL；
A标表示紫外分光光度计测定的校准溶液的吸光度值；
A样表示紫外分光光度计测定的样品吸光度值；
C标表示显色体系中校准溶液的浓度，单位为μg/mL；
946.55为人参皂苷Re的摩尔分子量，单位为g/mol；
476.73为人参皂苷水解成苷元的摩尔分子量，单位为g/mol；
V1为步骤S204酒样溶液的配制过程中酒样苷元乙腈溶液的定容体积，单位为mL；
V2为步骤S205测定吸光度过程中吸取酒样苷元乙腈溶液的体积，单位为mL；
V3为步骤S205测定吸光度过程中香草醛硫酸显色中间溶液的体积，单位为mL。
即，上述实施例中酒样A的计算公式为：
此外，上述测定方法在测定过程中使用到的甲醇溶剂还可以替换为水饱和正丁醇溶剂。
方法学验证
(1)线性关系考察
步骤S104中的苷元标准曲线工作溶液显色体系中，不同浓度的苷元标准曲线工作溶液的吸光度如表1所示：
表1线性关系试验结果
以步骤S104中的苷元标准曲线工作溶液显色体系中的浓度(6.8μg/mL、13.6μg/mL、27.2μg/mL、54.4μg/mL、90.7μg/mL)为横坐标，测定的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，实验结果如图1人参皂苷苷元标准曲线所示。
实验结果表明，人参皂苷苷元在6.8～90.7μg/mL浓度内呈良好线性关系。线性回归方程为y＝0.011x+0.012，线性相关系数R为0.9996，R为标准曲线的线性相关系数，相关系数越接近于1，线性相关性质越好，根据数据描点画出的函数-自变量图线越趋近于一条平直线，拟合的直线与描点所得图线也更接近。
(2)精密度考察
吸取0.136mg/mL的人参皂苷苷元溶液500μL，按照步骤S205操作显色并测定吸光度(显色液中苷元浓度为13.6μg/mL)，重复测定6次，测定相对标准偏差(RSD值)，精密度试验结果如表2所示：
表2精密度试验结果(n＝6)
由表2精密度试验结果可见，6次测定的相对标准偏差RSD值为0.579％，说明酸水解皂苷显色法测定皂苷含量精密度较好。
(3)重复性考察
取试样1.0毫升保健酒A，按照步骤S201至步骤S205处理及显色，平行处理6份测定吸光度，测定RSD值，测验结果如表3所示：
表3重复性试验结果(n＝6)
由表3重复性试验结果可见，平行处理6份样品测定皂苷含量，相对标准偏差RSD值为2.25％，说明酸水解皂苷显色法测定总皂苷含量方法重复性较好。
(4)稳定性考察
吸取0.136mg/ml的苷元标准曲线工作溶液500μl，按照步骤S205操作显色，在指定时间间隔下(30min)观察吸光度值的变化，测定RSD值，测验结果如表4所示：
表4稳定性试验结果(n＝10)
由表4稳定性试验结果可见，供试样品10次测定吸光度值的相对标准偏差RSD值为0.634％，说明供试品在0.5h内较稳定。
(5)加标回收试验
取保健酒A1.0mL，按照步骤S201至步骤S205操作处理和显色测定，测定保健酒A中总皂苷的含量，平行测定2次，即对照样品1和2。
吸取人参皂苷Re标准溶液(3.6mg/mL)1.5mL于10mL的容量瓶中，用保健酒A定容至刻度，获得加标样品，吸取3份加标样品1mL于100ml的瓷蒸发皿中，水浴挥干乙醇和水，用1mL去离子水溶解，按照步骤S201至步骤S205操作处理和显色测定，平行测定2次。
测定加标样品的总皂苷含量并计算加标回收率(加标样品的测量值减去样品的测定值再除以加标量，即加标回收率)，加标回收试验结果如表5所示：
表5加标回收试验结果
由表5加标回收试验结果可见，加标样品平行处理6份，测定平均加标回收率为99.15％，相对标准偏差RSD值为1.91％，说明酸水解皂苷显色法测定皂苷含量的准确度较好。
综上所述，本发明将保健酒A中的皂苷水解成苷元，消除了糖基对香草醛显色剂的干扰，采用液液萃取方式提取苷元的同时除去了酒样中的干扰色素，采用皂苷酸水解显色法测定保健酒A中的总皂苷含量，以水解后的人参皂苷苷元制备标准曲线。本发明测定方法具有范围线性范围良好、准确度高、精确度好、重复性效果良好等优点，因此非常适合用于保健酒中总皂苷含量的定量分析和质量控制，适合于保健酒产业领域推广。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种保健酒中总皂苷含量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：校准溶液的制备和显色
S101水解：往乙腈和盐酸的混合溶剂中加入人参皂苷Re甲醇溶液，混匀后于恒温水浴条件下进行水解；
S102萃取：水解产物冷却后加入二氯甲烷和去离子水，水洗分离去掉水层，经氮吹仪吹干有机相层；
S103校准溶液配制：将萃取吹干后的产物用乙腈溶解和定容，得到人参皂苷苷元校准溶液；
S104测定吸光度：取人参皂苷苷元校准溶液加入到香草醛硫酸显色中间溶液中，显色体系中人参皂苷苷元校准溶液的浓度记为C标，测定人参皂苷苷元校准溶液的吸光度值，该吸光度值记为A标；
S2：酒样溶液的制备和显色
S201皂苷的提取：将保健酒酒样挥干乙醇和水，所得固体用水溶解，将该溶液进行固相萃取和洗脱，收集洗脱液，除去溶剂，所得固体用甲醇溶解，获得酒样皂苷甲醇溶液；
S202水解：往乙腈和盐酸的混合溶剂中加入酒样皂苷甲醇溶液，混匀后于恒温水浴条件下进行水解；
S203萃取：将水解产物冷却后加入二氯甲烷和去离子水，水洗分离去掉水层，经氮吹仪吹干有机相层；
S204酒样溶液的配制：将萃取吹干后的产物用乙腈溶解并定容至V1mL，得到酒样苷元乙腈溶液；
S205测定吸光度：吸取V2mL酒样苷元乙腈溶液加入到V3mL的香草醛硫酸显色中间溶液中，测定酒样苷元乙腈溶液的吸光度，该吸光度值记为A样；
S3：酒样中总皂苷的含量计算
计算公式为：
式中，X表示酒样中总皂苷的含量，单位为mg/100mL；A标表示紫外分光光度计测定的校准溶液的吸光度值；A样表示紫外分光光度计测定的样品吸光度值；C标表示显色体系中校准溶液的浓度，单位为μg/mL；946.55为人参皂苷Re的摩尔分子量，单位为g/mol；476.73为人参皂苷水解成苷元的摩尔分子量，单位为g/mol；
步骤S101和S202的水解过程中，恒温水浴温度为80℃，时间为3小时；
步骤S101和S202的水解过程中，乙腈和盐酸的体积比为1:1；
其中，所述步骤S104的测定吸光度过程中，取人参皂苷苷元校准溶液加入到香草醛硫酸显色中间溶液中，混匀得到校准显色组；同时吸取乙腈加入到香草醛硫酸显色中间溶液中，混匀得到溶剂空白显色组；所得校准显色组和溶剂空白显色组于70℃水浴加热10分钟后迅速放入冰水中冷却，后检测溶液在最大吸收波长下的吸光度值；
所述步骤S201皂苷的提取过程中，将保健酒酒样水浴挥干乙醇和水，所得固体用水溶解，将该溶液加入经激活的萃取小柱中萃取，然后用去离子水洗涤，保持1～2滴/秒的速度洗涤，再分别用70％甲醇水溶液和甲醇进行洗脱，收集洗脱液，除去甲醇和水，所得固体用甲醇溶解，获得酒样皂苷甲醇溶液；
所述步骤S205的测定吸光度过程中，取酒样苷元乙腈溶液加入到的香草醛硫酸显色中间溶液中，混合均匀，所得混合物于70℃水浴加热10分钟后迅速放入冰水中冷却，后检测溶液在最大吸收波长下的吸光度值。
2.根据权利要求1所述的保健酒中总皂苷含量的测定方法，其特征在于，步骤S101和S202的水解过程中使用的盐酸还可以用硫酸或硝酸代替。
3.根据权利要求1或2所述的保健酒中总皂苷含量的测定方法，其特征在于，测定过程中所使用到的甲醇还可以替换为水饱和正丁醇。
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