CN107655995A - 一种同时检测银杏叶中三种黄酮类化合物的方法 - Google Patents

一种同时检测银杏叶中三种黄酮类化合物的方法 Download PDF

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CN107655995A CN201710971230.6A CN201710971230A CN107655995A CN 107655995 A CN107655995 A CN 107655995A CN 201710971230 A CN201710971230 A CN 201710971230A CN 107655995 A CN107655995 A CN 107655995A
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Abstract

本发明公开了一种同时检测槲皮素‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖基(1‑2)‑α‑L‑鼠李糖苷、水仙苷、山萘酚‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖基(1‑2)‑α‑L‑鼠李糖苷的方法，属于分析检测技术领域。所述方法包括分别制备含有检测槲皮素‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖基(1‑2)‑α‑L‑鼠李糖苷、水仙苷、山萘酚‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖基(1‑2)‑α‑L‑鼠李糖苷的对照品和供试品，采用高效液相色谱法，检测波长为328nm‑378nm中的任意值。本发明提供的同时检测槲皮素‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖基(1‑2)‑α‑L‑鼠李糖苷、水仙苷、山萘酚‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖基(1‑2)‑α‑L‑鼠李糖苷的方法为银杏制剂质量控制的主要指标提供了便利。

Description

一种同时检测银杏叶中三种黄酮类化合物的方法
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种同时检测槲皮素、水仙苷和山奈酚的方法。
背景技术
银杏叶为银杏科植物银杏(Ginkgo biloba L.)的干燥叶，具有活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘、化浊降脂的功效。德国Schwabe公司最早利用溶剂萃取专利技术生产标准银杏叶提取物(EGb761)并开发Tebon in forte制剂。随后法国、日本开发了一系列银杏叶制剂。目前我国进口药品主要是德国Schwabe公司的金纳多和法国Beaufour-Ipsen公司的达纳康。据统计，国际上的银杏制品已达30多种，一直位居美国草药市场销售的前三位，全球银杏叶制剂的年销售额达50亿美元，已成为植物药制剂的全球冠军品种。
我国银杏叶提取物及其制剂的加工始于20世纪90年代。近20年来，各级地方政府高度重视银杏产业的发展，银杏种植面积逐年扩大，产量逐年上升，已占国际市场需求量的1/6。以银杏叶为原料加工成保健功能食品和药品，在中国已形成影响力较大的医药集团，国内零售市场上可监测到的植物药类心血管用药有300多种，银杏类制剂产品占据了近30％的市场份额。可见，银杏叶生物活性物质的研究和开发，在我国已成为一个巨大的产业。但我国银杏叶药品由于剂型单一，低水平重复产品较多，缺少高端品种，缺少国际竟争力，国际市场占有也在率逐年下降。因此，根据我国银杏产业的发展现状，急需有技术突破，对银杏叶及其深加工产品进行全面质量控制，提高银杏叶产品品质，提高国际竞争力。
银杏叶中含有的黄酮类成分有：银杏双黄酮(ginkgetin)、水仙苷、山柰素、槲皮素、异鼠李素(isorhamnetin)等；含白果醇(ginnol)、白果酮(ginnone)、廿九烷、廿八醇、α-已烯醛、β-谷甾醇、豆甾醇及维生素等成分，这些成分被作为银杏制剂质量控制的主要指标。因此，如能同时检测出银杏叶中的多种功效成分的方法，将为开发银杏叶深加工产品以及食品药品的全面质量控制提高产品质量，提供一定的便利。
为此，国内国际已有多篇文献，中国专利文献106153761A公开了同时检测银杏叶中某一种或几种成分的方法，但尚未发现同时检测“水仙苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷、山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷”的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中尚未发现同时检测“水仙苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷、山萘酚 -3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷”的方法的缺陷，从而提供一种同时检测槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷、水仙苷、山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷的方法。
为此，本发明的技术方案如下：
一种同时检测银杏叶中三种黄酮类化合物的方法，分别制备含有检测槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷、水仙苷、山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷的对照品溶液和供试品溶液，采用高效液相色谱法，检测波长为328nm-378nm中的任意值。
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱为固定相，以乙腈和磷酸水溶液的混合液为流动相，所述流动相中，磷酸水溶液的浓度为0.1-0.4％；或者，洗脱程序为梯度洗脱。
所述梯度洗脱的洗脱程序为：70分钟内，乙腈占流动相比例由15％增长到50％；洗脱流速为：每分钟0.5-1.5ml；柱温为20-40℃。
所述检测波长为346nm或250nm。
色谱条件如下：
流动相中，磷酸水溶液的浓度为0.4％；流速为每分钟1ml；柱温为30℃；洗脱程序为：
。
采用外标法，分别吸取对照品溶液及供试品溶液注入液相色谱仪进行测定，以峰面积或峰高计算相应成分其在供试品中的含量。
所述供试品溶液按如下方法制备：
步骤(1):取银杏叶，粉碎，用含有乙醇的水溶液提取，过滤，低温静置；
步骤(2):取下层液，加水冷藏，过滤，浓缩滤液，放至室温，加入乙醇溶液冷藏，过滤，浓缩,滤液，重复加乙醇过滤浓缩的步骤；
步骤(3):向浓缩液中加水，通过大孔吸附树脂进行吸附处理，收集流出液；
步骤(4):向流出液加入药学上可接受的辅料及水，即得供试品；
槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品、水仙苷对照品、山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品的浓度均为 0.01-0.1mg/ml。
步骤(1)中，所述含有乙醇的水溶液的用量为银杏叶重量的5-15倍；浓缩滤液至银杏叶重量的0.1-0.5倍；
步骤(2)中，加水至银杏叶重量的0.5-5倍；浓缩滤液至银杏叶重量的0.1-0.5倍；加入乙醇溶液的量为使乙醇含量至70％-90％；
步骤(3)中，向浓缩液中加水至银杏叶重量的0.5-5倍。
水仙苷对照品浓度＞山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品浓度＞槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品浓度。
对照品溶液按如下方法制备：
取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷、水仙苷、山萘酚 -3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷适量，称定，加甲醇制成每1ml 含0.05mg、0.07mg、0.06mg、的混合溶液即得。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.为银杏叶及其制剂质量控制指标的选取提供了便利。
2.为开发银杏叶深加工产品以及食品药品的全面质量控制、提高产品质量提供了研究基础、创造了有利条件。
3.符合药品质量控制办法的检测目的和要求，适用于含有银杏叶的药品在生产制造过程中样品的分析检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明专属性试验甲醇色谱图；
图2是本发明专属性试验纯水色谱图；
图3是本发明混合对照品色谱图；
图4是本发明供试品色谱图；
其中，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷浓度为 0.04330mg/ml、水仙苷浓度为0.07722mg/ml、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基 (1-2)-α-L-鼠李糖苷浓度为0.06029mg/ml；1为槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷；2为水仙苷；3为山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基 (1-2)-α-L-鼠李糖苷。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
本发明中只列举检测波长为246nm的方法学验证以及供试品测量的实验数据，本发明发明人于申请日前也做过检测波长为250nm的效果实验验证，结果与246nm的相当，在此不一一列举。
实施例1制备供试品溶液
1)银杏叶粉碎后，加70-95％乙醇回流提取1-5次，每次回流提取时间0.5-6小时，加入的乙醇量为银杏叶重量的5-15倍，过滤将滤液浓缩至银杏叶重量的0.1-0.5倍，冷藏12-120小时；
刮去浮油，取下层液。
加注射用水至银杏叶重量的0.5-5倍，冷藏12-120小时，过滤。滤液减压浓缩至银杏叶重量的0.1-0.5倍，放至室温，加85％-95％乙醇，使含醇量至70％-90％，将醇沉后的溶液依次进行冷藏、过滤和浓缩，重复进行1-5 次。
2)浓缩后的滤液加注射用水至银杏叶重量的0.5-5倍，通过树脂进行吸附处理。
3)吸附处理后的药液加入适量辅料及水，制得相应药品。
或取采用以上方法制备的如舒血宁注射液等药品，过滤，取续滤液，即供试品溶液。
实施例2.制备对照品溶液
槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品溶液的制备：取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品，精密称定17.55mg置10ml量瓶中，加甲醇超声溶解，并定容至刻度，即得，浓度为 1.6656mg/ml。
水仙苷对照品溶液的配制：取水仙苷对照品，精密称定17.28mg置10ml 量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，浓度为1.6934mg/ml。
山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品溶液的配制：取山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品，精密称定 17.87mg置10ml量瓶中，加甲醇超声溶解，并定容至刻度，即得，浓度为 1.7732mg/ml。
实施例3.配制混合对照品溶液
分别精密量取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品溶液(1.6656mg/ml)0.65ml、水仙苷对照品溶液(1.6934mg/ml)1.14ml、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品溶液 (1.7732mg/ml)0.85ml置同一25ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。混合对照品溶液中，槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基 (1-2)-α-L-鼠李糖苷浓度为0.04330mg/ml、水仙苷浓度为0.07722mg/ml、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷浓度为0.06029mg/ml。
实施例4.供试品中槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷、水仙苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷的含量测定方法及方法学验证
1.试验方法
高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性实验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈和0.4％磷酸的混合液为流动相，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为346nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；进样量为5μl。理论塔板数按槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷、水仙苷、山柰酚 -3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷峰计算均应不低于6000。
梯度洗脱顺序见表1.
表1
2.试验仪器与材料
仪器：
Agilent1260-1高效液相色谱仪；
TU-1901紫外可见分光光度计；
KQ5200DE型超声波清洗器(江苏昆山市淀山湖镇)；
METTLER XS205电子天平(瑞典)；
色谱柱：YMC-Pack ODS-A C18柱250*4.6mm。
对照品：
槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷(纯度94.90％)；
水仙苷：MUST-12021703(纯度98.00％)；
山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷(纯度99.23％)；
供试品：
采用本发明供试品溶液制备方法制备的供试品。
试剂：
乙腈：色谱纯(美国迪马)；
磷酸：分析纯(国药集团化学试剂有限公司20120904)；
水：纯净水(景田)。
3.方法学验证
(1)专属性试验
分别精密吸取蒸馏水、甲醇、混合对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱峰。结果显示，各主要色谱峰均能实现较好分离，同时系统无干扰。见下图1-4。
(2)线性范围考察
分别精密量取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品10.24mg、水仙苷对照品10.56mg、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品10.18mg，分别置10ml量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，摇匀，即得对照品母液。再分别精密量取各对照品母液2.5ml 置于25ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液，分别精密量取混合对照品溶液4ml、3ml、2.5ml、2ml、1ml、0.5ml置于5ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得一系列不同浓度的混合对照品溶液，分别进样5μl进行测定。分别以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L- 鼠李糖苷、水仙苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。以槲皮素-3-O-β-D- 葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品计，回归方程为y＝1163.6843x -1.8564，相关性r2＝0.9997；以水仙苷对照品计，回归方程为y＝1544.8237x +2.5922，相关性r2＝0.9996；以山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品计，回归方程为y＝1307.3691x+2.1586，相关性r2＝0.9996。结果表明：槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品在0.0486～0.4859μg进样质量范围内线性良好；水仙苷对照品在 0.05174～0.5174μg进样质量范围内线性良好；山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基 (1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品在0.05051～0.5051μg进样质量范围内线性良好。标准曲线如表3-5，图4。
表3：槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷线性关系试验结果
表4水仙苷线性关系试验结果
表5山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷线性关系试验结果
(3)检测限
取线性项下混合对照品溶液最小浓度(槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基 (1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品浓度0.009718mg/ml、水仙苷对照品浓度 0.01035mg/ml、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品浓度0.01010mg/ml)1mL，置于100mL的容量瓶中，加甲醇定容，按上述色谱条件测定，此浓度对照品峰高为相应噪音的3倍，所以槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷的检测限为0.4859ng；水仙苷的检测限为 0.5174ng；山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷的检测限为 0.5051ng。
(4)精密度实验
取供试品，照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依法进样六次，记录槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷、水仙苷、山柰酚 -3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷峰面积，分别计算其RSD值，结果见下6-8。
表6槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷精密度试验结果
表7水仙苷精密度试验结果
表8山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷精密度试验结果
实验结果表明：该方法精密度良好。
(5)稳定性实验
取供试品溶液，照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，分别于0、2、 4、6、8、10、12小时进样5μl，测定一次，记录槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷、水仙苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基 (1-2)-α-L-鼠李糖苷峰面积，计算RSD值。结果见表9-11
表9槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷稳定性实验结果
表10水仙苷稳定性实验结果
表11山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷稳定性实验结果
试验结果表明：该方法，供试品在12h内稳定性良好。
(6)重复性试验
取供试品溶液6份，照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，依法测定，计算槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷、水仙苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷含量，并计算6个结果的RSD 值。结果见表12-14。
表12槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷重复性试验结果
表13水仙苷重复性试验结果
表14山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷重复性试验结果
试验结果表明：该方法重复性良好。
(7)回收率试验
混合对照品溶液的配制：分别精密称取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基 (1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品5.12mg、水仙苷对照品8.33mg、山柰酚 -3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品6.54mg置同一100ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液，浓度分别为 0.04859mg/ml，0.08163mg/ml，0.06490mg/ml。
加样回收供试品溶液的配制：取已知含量的供试品溶液(槲皮素 -3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷含量0.05176mg/ml、水仙苷含量 0.08381mg/ml、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷含量 0.06111mg/ml)6份，每份精密量取1.0ml，分别置2ml量瓶中，同时精密吸取混合对照品溶液(槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷浓度为0.04859mg/ml、水仙苷浓度为0.08163mg/ml、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷浓度为0.06490mg/ml)1.0ml，分别加入上述6 个量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得。
按含量测定方法测定，计算回收率。试验结果见表15-17。
表15槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷回收率试验结果
表16水仙苷回收率试验结果
表17山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷回收率试验结果
试验结果表明：该方法回收率良好。
4.供试品含量测定
照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，取三个不同批次的供试品溶液，进样5μl，测定，计算，含量测定结果见表18。
表18三批样品中三个化合物含量测定结果
通过上述方法学考察，实验数据证明本发明提供的方法符合检测的目的和要求，能够用于含有银杏叶的药品在生产制造过程中样品的分析检测。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种同时检测银杏叶中三种黄酮类化合物的方法，其特征在于，分别制备含有待测槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷、水仙苷、山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷的对照品溶液和供试品溶液，采用高效液相色谱法，检测波长为328nm-378nm中的任意值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱为固定相，以乙腈和磷酸水溶液的混合液为流动相，所述流动相中，磷酸水溶液的浓度为0.1-0.4％；或者，
洗脱程序为梯度洗脱。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的洗脱程序为：70分钟内，乙腈占流动相比例由15％增长到50％；洗脱流速为：每分钟0.5-1.5ml；柱温为20-40℃。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述检测波长为346nm或250nm。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，色谱条件如下：
流动相中，磷酸水溶液的浓度为0.4％；流速为每分钟1ml；柱温为30℃；洗脱程序为：
。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用外标法，分别吸取对照品溶液及供试品溶液注入液相色谱仪进行测定，以峰面积或峰高计算相应成分在供试品中的含量。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述供试品溶液按如下方法制备：
步骤(1)：取银杏叶，粉碎，用含有乙醇的水溶液提取，过滤，低温静置；
步骤(2)：取下层液，加水冷藏，过滤，浓缩滤液，放至室温，加入乙醇溶液冷藏，过滤，浓缩,滤液，重复加乙醇过滤浓缩的步骤；
步骤(3)：向浓缩液中加水，通过大孔吸附树脂进行吸附处理，收集流出液；
步骤(4)：向流出液加入药学上可接受的辅料及水，即得供试品；或者，所述对照品溶液按如下方法制备：
取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品、水仙苷对照品、山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品配置成浓度为0.01-0.1mg/ml的甲醇溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
步骤(1)中，所述含有乙醇的水溶液的用量为银杏叶重量的5-15倍；浓缩滤液至银杏叶重量的0.1-0.5倍；
步骤(2)中，加水至银杏叶重量的0.5-5倍；浓缩滤液至银杏叶重量的0.1-0.5倍；加入乙醇溶液的量为使乙醇含量至70％-90％；
步骤(3)中，向浓缩液中加水至银杏叶重量的0.5-5倍。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
水仙苷对照品浓度＞山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品浓度＞槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷对照品浓度。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，对照品溶液按如下方法制备：
称取槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷、水仙苷、山萘酚-3-O-β-D-葡萄糖基(1-2)-α-L-鼠李糖苷适量，分别加甲醇制成每1ml含0.05mg、0.07mg、0.06mg的混合溶液即得。
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