CN112697899A - 一种银杏黄酮醇苷的检测方法 - Google Patents

一种银杏黄酮醇苷的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种银杏黄酮醇苷的检测方法，该检测方法包含以下步骤：(1)配制对照品和供试品溶液：所述对照品为芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素‑3‑O‑2”‑葡萄糖鼠李糖苷、山奈酚‑3‑O‑β‑D‑芸香糖苷、水仙苷、丁香亭‑3‑O‑芸香糖苷、大波斯菊苷、槲皮素‑3‑O‑对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷和山奈酚‑3‑O‑对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷对照品；(2)检测；(3)建立标准指纹图谱；(4)计算步骤(3)建立的指纹图谱中共有峰的含量。该检测方法建立了特有的银杏黄酮醇苷的标准指纹图谱，可以准确检测银杏及其相关提取物、药物制剂中各主要黄酮醇苷的含量，准确度、精密度、重现性及稳定性均良好。

Description

一种银杏黄酮醇苷的检测方法
技术领域
本发明涉及一种银杏黄酮醇苷的检测方法，尤其涉及一种可以准确检测银杏及其相关提取物、药物制剂中各主要黄酮醇苷含量的银杏黄酮醇苷的检测方法。
背景技术
银杏叶为银杏科植物银杏(Ginkgo biloba L.)的干燥叶。栽培地区北至辽宁，南达广东，东起浙江，西达陕西、甘肃、西南到四川、贵州、云南等地。可用于瘀血阻络、胸痹心痛等症候。其提取物具有改善心脑血管循环、保护心脏、拮抗PAF、消除自由基等多种药理作用，常用于防治心脑血管疾病。银杏提取物的药理活性成分很多，主要有黄酮类、萜内酯类，还有有机酸、烷基酚、烷基酚酸和甾体化合物等。其中银杏黄酮醇苷类成分作为银杏叶的一种主要成分，在治疗心肌缺血、脑缺血方面具有良好的药理作用，已上市的银杏叶相关制剂剂型主要有片剂、丸剂、胶囊剂、注射液、口服液等。
目前，关于银杏叶及其制剂的质量已有不少的研究，胡蓉蓉等利用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱法建立了一种测定银杏叶提取物中黄酮类有效成分的方法，并通过多批样品的比较分析发现，不同批次的银杏叶提取物黄酮类含量差异较大。殷海利等对银杏叶药材中6种有机酸类成分进行了分析，采用HPLC-DAD技术建立了同时测定6种有机酸类成分的含量方法。
但是，现行质量标准仅控制了银杏叶片中的总黄酮醇苷含量，规定其含量不低于24％，未对具体黄酮醇苷类成分含量做具体要求，银杏叶制剂作为中成药，具有多成分多靶点的特点，以单一指标进行质量控制无法保证制剂的药效，多成分质控可更好的控制银杏叶片的产品质量。尚无较好的质量控制方法以准确地反映银杏叶片剂提取物、中间体及成品的质量状况，故而无法用于生产过程中的质量控制以及成品的质量控制。因此，建立银杏叶片剂提取物、中间体及其成品片剂黄酮醇苷的指纹图谱检测方法和标准指图谱具有非常重要的意义。
发明内容
发明目的：本发明旨在提供一种准确度、精密度、重现性及稳定性均良好的银杏黄酮醇苷的检测方法。
技术方案：本发明的银杏黄酮醇苷的检测方法包含以下步骤：
(1)配制对照品和供试品溶液：所述对照品为芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷、水仙苷、丁香亭-3-O-芸香糖苷、大波斯菊苷、槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷和山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷对照品；
(2)检测；
(3)建立标准指纹图谱；
(4)计算步骤(3)建立的标准指纹图谱中共有峰的含量。
其中，步骤(1)中各对照品溶液的浓度分别如下：
芦丁：8-100μg·mL-1，金丝桃苷：2-40μg·mL-1，异槲皮苷：2-40μg·mL-1，槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷：5-80μg·mL-1，山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷：5-80μg·mL-1，水仙苷：5-80μg·mL-1，丁香亭-3-O-芸香糖苷：0.5-15μg·mL-1，大波斯菊苷：1-30μg·mL-1，槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷：10-200μg·mL-1，山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷：10-200μg·mL-1。
进一步优选的各对照品溶液浓度分别如下：
芦丁：8-85μg·mL-1，金丝桃苷：2-30μg·mL-1，异槲皮苷：2-30μg·mL-1，槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷：5-55μg·mL-1，山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷：5-60μg·mL-1，水仙苷：5-50μg·mL-1，丁香亭-3-O-芸香糖苷：0.5-10μg·mL-1，大波斯菊苷：1-15μg·mL-1，槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷：10-150μg·mL-1，山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷：100-150μg·mL-1。
所述各对照品及供试品溶液的配制方法具体如下：
对照品溶液：
分别取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷、水仙苷、丁香亭-3-O-芸香糖苷、大波斯菊苷、槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷、山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷对照品，分别置于容量瓶中，加80％-100％甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，过滤即得。
供试品溶液：
取银杏叶提取物20-50mg，置于20-50mL容量瓶中，加80％-100％甲醇溶解定容至刻度线，摇匀，过滤即得；
取银杏叶中间体颗粒100-300mg，置于20-50mL容量瓶中，加80％-100％甲醇溶解定容至刻度线，摇匀，过滤即得；
取银杏叶素片10片，粉碎混匀，取所得粉末100-300mg，置于20-50mL容量瓶中，加80％-100％甲醇溶解定容至刻度线，摇匀，过滤即得；
取银杏叶包衣片10片，除去包衣，粉碎混匀，取所得粉末100-300mg，置于20-50mL容量瓶中，加80％-100％甲醇溶解定容至刻度线，摇匀，过滤即得。
取上述步骤(1)配制的对照品及供试品溶液，进行步骤(2)的检测，其检测方法具体如下：
色谱条件：
色谱柱：烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流速：0.8-1mL·min-1，检测波长：350nm-360nm，柱温：30-35℃，流动相A：5％-7％的异丙醇-乙腈溶液，流动相B：0.4％磷酸水溶液，进样量：8-10μL，梯度洗脱；
梯度洗脱条件：
时间：0-60min，流动相A：16％→34％，流动相B：84％→66％；时间：60-65min，流动相A：34％→37％，流动相B：66％→63％；时间：65-70min，流动相A：37％→37％，流动相B：63％→63％。
在上述检测方法中，所述色谱柱为C18色谱柱、C8色谱柱、苯基柱、氰基柱或氨基柱，柱长为30mm-250mm，色谱柱填料粒度为1.6-5μm。
通过测定10批以上供试品，分别将所测得的供试品指纹图谱导入国家药典委员会研制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版本)”软件，生成对照指纹图谱，进一步以芦丁为参照峰建立标准指纹图谱。所建立标准指纹图谱共有峰20个，分别标记为1号峰-20号峰，其中6号峰为芦丁、7号峰为金丝桃苷、8号峰为异槲皮苷、9号峰为槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷、10号峰为山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷、11号峰为水仙苷、12号峰为丁香亭-3-O-芸香糖苷、14号峰为大波斯菊苷、16号峰为槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷、17号峰为山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷；所有共有峰保留时间依次为：12.701-12.997min，13.890-14.167min，15.160-15.456min，16.521-16.851min，16.939-17.275min，19.591-19.889min，20.896-21.214min，21.893-22.185min，24.912-25.212min，25.830-26.131min，27.178-27.487min，27.775-28.085min，28.387-28.677min，29.613-29.891min，31.843-32.157min，36.874-37.181min，43.414-43.757min，49.638-49.955min，53.391-53.715min及64.571-64.801min。且共有峰面积占比大于总峰面积的90％，相似度不低于90％。
当所述供试品为银杏叶提取物时，所述标准指纹图谱中各共有峰相对参照峰的相对保留时间分别为：0.648-0.653，0.708-0.712，0.773-0.777，0.843-0.847，0.865-0.869，1.000，1.067，1.115-1.117，1.268-1.272，1.314-1.319，1.382-1.388，1.412-1.418，1.442-1.450，1.503-1.512，1.617-1.626，1.869-1.882，2.199-2.215，2.512-2.530，2.701-2.721及3.208-3.240。
当所述供试品为银杏叶中间体颗粒时，所述标准指纹图谱中各共有峰相对参照峰的相对保留时间分别为：0.671-0.673，0.727-0.729，0.789-0.792，0.839-0.858，0.873-0.880，1.000，1.060-1.062，1.113-1.114，1.249-1.252，1.293-1.296，1.374-1.383，1.418-1.426，1.472-1.479，1.566-1.572，1.616-1.629，1.788-1.796，2.083-2.095，2.349-2.359，2.508-2.522及3.046-3.059。
当所述供试品为银杏叶素片时，所述标准指纹图谱中各共有峰相对参照峰的相对保留时间分别为：0.648-0.653，0.708-0.712，0.773-0.777，0.841-0.847，0.861-0.870，1.000，1.067-1.068，1.115-1.119，1.267-1.275，1.313-1.321，1.384-1.390，1.413-1.422，1.447-1.450，1.502-1.513，1.616-1.629，1.867-1.884，2.172-2.221，2.510-2.541，2.699-2.736及3.216-3.249。
当所述供试品为银杏叶包衣片时，所述标准指纹图谱中各共有峰相对参照峰的相对保留时间分别为：0.645-0.660，0.704-0.716，0.771-0.780，0.843-0.849，0.863-0.871，1.000，1.067-1.070，1.113-1.117，1.265-1.273，1.310-1.320，1.377-1.389，1.407-1.420，1.436-1.452，1.495-1.511，1.607-1.624，1.855-1.873，2.181-2.200，2.487-2.513，2.674-2.703及3.166-3.215。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
(1)建立了有关银杏黄酮醇苷类物质全新的标准指纹图谱，共有峰20个，其中指认共有峰10个，并选取出峰时间适中、峰面积较大的芦丁作为参照峰，共有峰面积占比大于总峰面积的90％，相似度不低于90％，可以准确、有效地反映银杏叶提取物、中间体以及成品的质量状况；
(2)方法操作简便，可以准确检测银杏及其相关提取物、药物制剂中间体及成品中各主要黄酮醇苷的含量，准确度(线性r值大于0.999，回收率为95％-105％且RSD小于5％)、精密度(RSD小于5％)、重现性(RSD小于5％)及稳定性(对照品及供试品在室温下24h内均稳定)均良好；
(3)适应性强，可用于银杏叶制剂全过程的质量控制，同时也可用于银杏叶成品制剂的质量控制。
附图说明
图1A为银杏叶提取物的HPLC色谱图；
图1B为混合对照品的HPLC色谱图；
图2为银杏叶提取物的HPLC指纹图谱；
图3为银杏叶提取物的HPLC标准指纹图谱；
图4为银杏叶中间体颗粒的HPLC指纹图谱；
图5为银杏叶中间体颗粒的HPLC标准指纹图谱；
图6为银杏叶素片的HPLC指纹图谱；
图7为银杏叶素片的HPLC标准指纹图谱；
图8为银杏叶包衣片的HPLC指纹图谱；
图9为银杏叶包衣片的HPLC标准指纹图谱；
图10为对比例1供试品的HPLC色谱图；
图1、图3、图5、图7、图9中，各标记色谱峰分别为：1、芦丁，2、金丝桃苷，3、异槲皮苷，4、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷，5、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷，6、水仙苷，7、丁香亭-3-O-芸香糖苷，8、大波斯菊苷，9、槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷，10、山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1：银杏叶提取物指纹图谱的建立
(1)仪器与试药
岛津2010A(HT)高效液相色谱仪，LC solution色谱工作站，银杏叶提取物共17批由扬子江药业集团有限公司提供，供试品信息见表1。
表1银杏叶提取物供试品信息
Figure BDA0002820510890000051
(2)色谱条件
色谱柱为PRAZIS Absolute C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)，柱温为30℃，检测波长为360nm，流动相A为5％的异丙醇-乙腈溶液，流动相B为0.4％磷酸水溶液，流量流速为1.0mL·min-1，分析时间70min。
梯度洗脱条件为0-60min，流动相A：16％→34％，流动相B：84％→66％；60-65min，流动相A：34％→37％，流动相B：66％→63％；65-70min，流动相A：37％→37％，流动相B：63％→63％。
(3)对照品溶液的制备
分别取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷、水仙苷、丁香亭-3-O-芸香糖苷、大波斯菊苷、槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷、山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷对照品适量，精密称定，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，配制成2.046mg·mL-1、2.235mg·mL-1、2.150mg·mL-1、1.875mg·mL-1、1.968mg·mL-1、2.080mg·mL-1、1.972mg·mL-1、2.312mg·mL-1、2.155mg·mL-1、2.540mg·mL-1的对照品储备液。
精密量取芦丁200μL、金丝桃苷50μL、异槲皮苷60μL、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷150μL、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷150μL、水仙苷120μL、丁香亭-3-O-芸香糖苷20μL、大波斯菊苷30μL、槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷320μL、山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷200μL于5mL容量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，配制成分别含有上述10种成分81.84μg·mL-1、22.35μg·mL-1、25.80μg·mL-1、52.50μg·mL-1、55.10μg·mL-1、49.92μg·mL-1、7.89μg·mL-1、13.87μg·mL-1、137.92μg·mL-1、101.60μg·mL-1的混合对照品溶液。
(4)供试品溶液的制备
精密称定银杏叶提取物粉末25mg，加入甲醇超声提取20min定容至25mL摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
(5)以芦丁为参照峰的标准指纹图谱的制定
测定17批银杏叶提取物溶液的指纹图谱，将指纹图谱导入国家药典委员会研制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版本)”软件，生成标准指纹图谱，并指认共有峰20个，记为1号峰-20号峰，其中6号峰为芦丁、7号峰为金丝桃苷、8号峰为异槲皮苷、9号峰为槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷、10号峰为山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷、11号峰为水仙苷、12号峰为丁香亭-3-O-芸香糖苷、14号峰为大波斯菊苷、16号峰为槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷、17号峰为山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷，以芦丁为参照峰计算其相对保留时间分别为0.648-0.653，0.708-0.712，0.773-0.777，0.843-0.847，0.865-0.869，1.000，1.067，1.115-1.117，1.268-1.272，1.314-1.319，1.382-1.388，1.412-1.418，1.442-1.450，1.503-1.512，1.617-1.626，1.869-1.882，2.199-2.215，2.512-2.530，2.701-2.721及3.208-3.240；RSD小于0.3％。
(6)相似度评价
将银杏叶提取物指纹图谱导入国家药典委员会研制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版本)”软件，设定S1样品的指纹图谱作为参照谱图，采用中位数法，多点校正，自动匹配色谱峰，生成标准指纹图谱，分别计算17批银杏叶提取物指纹图谱与标准指纹图谱之间的相似度，结果见表2。
表2银杏叶提取物指纹图谱相似度
Figure BDA0002820510890000071
由表2可见，使用本申请的检测方法，所得银杏叶提取物的指纹图谱与标准指纹图谱共有峰相似度均不低于0.940，可以有效检测银杏叶提取物中的各黄酮醇苷物质的含量。
实施例2：银杏叶中间体颗粒指纹图谱的建立
(1)仪器与试药
岛津2010A(HT)高效液相色谱仪，LC solution色谱工作站，银杏叶中间体颗粒共15批由扬子江药业集团有限公司提供，供试品信息见表3。
表3银杏叶中间体颗粒供试品信息
Figure BDA0002820510890000072
Figure BDA0002820510890000081
(2)色谱条件
色谱柱为PRAZIS Absolute C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)，柱温为35℃，检测波长为350nm，流动相A为5％的异丙醇-乙腈溶液，流动相B为0.4％磷酸水溶液，流量流速为0.8mL·min-1，分析时间70min。
梯度洗脱条件为0-60min，流动相A：16％→34％，流动相B：84％→66％；60-65min，流动相A：34％→37％，流动相B：66％→63％；65-70min，流动相A：37％→37％，流动相B：63％→63％。
(3)对照品溶液的制备
分别取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷、水仙苷、丁香亭-3-O-芸香糖苷、大波斯菊苷、槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷、山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷对照品适量，精密称定，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，配制成2.046mg·mL-1、2.235mg·mL-1、2.150mg·mL-1、1.875mg·mL-1、1.968mg·mL-1、2.080mg·mL-1、1.972mg·mL-1、2.312mg·mL-1、2.155mg·mL-1、2.540mg·mL-1的对照品储备液。
精密量取芦丁200μL、金丝桃苷50μL、异槲皮苷60μL、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷150μL、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷150μL、水仙苷120μL、丁香亭-3-O-芸香糖苷20μL、大波斯菊苷30μL、槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷320μL、山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷200μL于5mL容量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，配制成分别含有上述10种成分81.84μg·mL-1、22.35μg·mL-1、25.80μg·mL-1、52.50μg·mL-1、55.10μg·mL-1、49.92μg·mL-1、7.89μg·mL-1、13.87μg·mL-1、137.92μg·mL-1、101.60μg·mL-1的混合对照品溶液。
(4)供试品溶液的制备
精密称定银杏叶中间体颗粒150mg，加入甲醇超声提取20min定容至25mL摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
(5)以芦丁为参照峰的标准指纹图谱的制定
测定22批银杏叶中间体颗粒的指纹图谱，将指纹图谱导入国家药典委员会研制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版本)”软件，生成标准指纹图谱，并指认共有峰20个，记为1号峰-20号峰，其中6号峰为芦丁、7号峰为金丝桃苷、8号峰为异槲皮苷、9号峰为槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷、10号峰为山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷、11号峰为水仙苷、12号峰为丁香亭-3-O-芸香糖苷、14号峰为大波斯菊苷、16号峰为槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷、17号峰为山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷，以芦丁为参照峰计算其相对保留时间分别为0.671-0.673，0.727-0.729，0.789-0.792，0.839-0.858，0.873-0.880，1.000，1.060-1.062，1.113-1.114，1.249-1.252，1.293-1.296，1.374-1.383，1.418-1.426，1.472-1.479，1.566-1.572，1.616-1.629，1.788-1.796，2.083-2.095，2.349-2.359，2.508-2.522及3.046-3.059；RSD小于0.2％。
(6)相似度评价
将银杏叶中间体颗粒指纹图谱导入国家药典委员会研制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版本)”软件，设定S1样品的指纹图谱作为参照谱图，采用中位数法，多点校正，自动匹配色谱峰，生成标准指纹图谱，分别计算22批银杏叶中间体颗粒指纹图谱与对标准纹图谱之间的相似度，结果见表4。
表4银杏叶中间体颗粒指纹图谱相似度
Figure BDA0002820510890000091
Figure BDA0002820510890000101
由表4可见，使用本申请的检测方法，所得银杏叶中间体颗粒的指纹图谱与标准指纹图谱共有峰相似度均不低于0.920，可以有效检测银杏叶中间体颗粒中的各黄酮醇苷物质的含量。
实施例3：银杏叶中间体素片指纹图谱的建立
(1)仪器与试药
岛津2010A(HT)高效液相色谱仪，LC solution色谱工作站，银杏叶中间体素片共13批由扬子江药业集团有限公司提供，供试品样品信息见表5。
表5银杏叶素片供试品样品信息
Figure BDA0002820510890000102
(2)色谱条件
色谱柱为PRAZIS Absolute C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)，柱温为30℃，检测波长为360nm，流动相A为7％的异丙醇-乙腈溶液，流动相B为0.4％磷酸水溶液，流量流速为1.0mL·min-1，分析时间70min。
梯度洗脱条件为0-70min，流动相A：16％→34％，流动相B：84％→66％；60-65min，流动相A：34％→37％，流动相B：66％→63％；65-70min，流动相A：37％→37％，流动相B：63％→63％。
(3)对照品溶液的制备
分别取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷、水仙苷、丁香亭-3-O-芸香糖苷、大波斯菊苷、槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷、山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷对照品适量，精密称定，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，配制成2.046mg·mL-1、2.235mg·mL-1、2.150mg·mL-1、1.875mg·mL-1、1.968mg·mL-1、2.080mg·mL-1、1.972mg·mL-1、2.312mg·mL-1、2.155mg·mL-1、2.540mg·mL-1的对照品储备液。
精密量取芦丁200μL、金丝桃苷50μL、异槲皮苷60μL、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷150μL、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷150μL、水仙苷120μL、丁香亭-3-O-芸香糖苷20μL、大波斯菊苷30μL、槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷320μL、山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷200μL于5mL容量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，配制成分别含有上述10种成分81.84μg·mL-1、22.35μg·mL-1、25.80μg·mL-1、52.50μg·mL-1、55.10μg·mL-1、49.92μg·mL-1、7.89μg·mL-1、13.87μg·mL-1、137.92μg·mL-1、101.60μg·mL-1的混合对照品溶液。
(4)供试品溶液的制备
取银杏叶片中间体素片10片，粉碎混匀后精密称定所得粉末150mg，加入甲醇超声提取20min定容至25mL摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
(5)以芦丁为参照峰的标准指纹图谱的制定
测定13批银杏叶中间体素片的指纹图谱，将指纹图谱导入国家药典委员会研制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版本)”软件，生成标准指纹图谱，并指认共有峰20个，记为1号峰-20号峰，其中6号峰为芦丁、7号峰为金丝桃苷、8号峰为异槲皮苷、9号峰为槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷、10号峰为山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷、11号峰为水仙苷、12号峰为丁香亭-3-O-芸香糖苷、14号峰为大波斯菊苷、16号峰为槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷、17号峰为山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷，以芦丁为参照峰计算其相对保留时间分别为0.648-0.653，0.708-0.712，0.773-0.777，0.842-0.848，0.870-0.889，1.000，1.066-1.068，1.114-1.117，1.268-1.276，1.314-1.323，1.382-1.394，1.412-1.426，1.443-1.454，1.502-1.515，1.6056-1.633，1.864-1.890，2.186-2.231，2.488-2.519，2.699-2.736及3.216-3.249；RSD小于0.4％。
(6)相似度评价
将银杏叶中间体素片指纹图谱导入国家药典委员会研制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版本)”软件，设定S1样品的指纹图谱作为参照谱图，采用中位数法，多点校正，自动匹配色谱峰，生成标准指纹图谱，分别计算13批银杏叶中间体素片指纹图谱与标准指纹图谱之间的相似度，结果见表6。
表6银杏叶中间体素片指纹图谱相似度
Figure BDA0002820510890000121
由表6可见，使用本申请的检测方法，所得银杏叶中间体素片的指纹图谱与标准指纹图谱共有峰相似度均不低于0.950，可以有效检测银杏叶中间体素片中的各黄酮醇苷物质的含量。
实施例4：银杏叶包衣片指纹图谱的建立
(1)仪器与试药
岛津2010A(HT)高效液相色谱仪，LC solution色谱工作站，银杏叶包衣片共16批由扬子江药业集团有限公司提供，供试品样品信息见表7。
表7银杏叶包衣片供试品样品信息
供试品编号 供试品批号 供试品编号 供试品批号
S1 19082941 S9 19091541
S2 19101542 S10 19041341
S3 19092741 S11 19102841
S4 19102241 S12 19062041
S5 19082041 S13 19081241
S6 19100641 S14 19112141
S7 19061541 S15 19120542
S8 19041141 S16 19120241
(2)色谱条件
色谱柱为PRAZIS Absolute C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)；柱温为35℃，检测波长为360nm，流动相A为5％的异丙醇-乙腈溶液，流动相B为0.4％磷酸水溶液，流量流速为1mL·min-1，分析时间70min。
梯度洗脱条件为0-60min，流动相A：16％→34％，流动相B：84％→66％；60-65min，流动相A：34％→37％，流动相B：66％→63％；65-70min，流动相A：37％→37％，流动相B：63％→63％。
(3)对照品溶液的制备
分别取芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷、水仙苷、丁香亭-3-O-芸香糖苷、大波斯菊苷、槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷、山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷对照品适量，精密称定，置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，配制成2.046mg·mL-1、2.235mg·mL-1、2.150mg·mL-1、1.875mg·mL-1、1.968mg·mL-1、2.080mg·mL-1、1.972mg·mL-1、2.312mg·mL-1、2.155mg·mL-1、2.540mg·mL-1的对照品储备液。
精密量取芦丁200μL、金丝桃苷50μL、异槲皮苷60μL、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷150μL、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷150μL、水仙苷120μL、丁香亭-3-O-芸香糖苷20μL、大波斯菊苷30μL、槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷320μL、山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷200μL于5mL容量瓶中，加甲醇稀释定容至刻度，配制成分别含有上述10种成分81.84μg·mL-1、22.35μg·mL-1、25.80μg·mL-1、52.50μg·mL-1、55.10μg·mL-1、49.92μg·mL-1、7.89μg·mL-1、13.87μg·mL-1、137.92μg·mL-1、101.60μg·mL-1的混合对照品溶液。
(4)供试品溶液的制备
取各批次银杏叶片10片，除去包衣，粉碎混匀后精密称定所得粉末150mg，加入甲醇超声提取20min定容至25mL摇匀滤过，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
(5)以芦丁为参照峰的标准指纹图谱的制定
测定16批银杏叶片溶液的指纹图谱，将指纹图谱导入国家药典委员会研制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版本)”软件，生成标准指纹图谱，并指认共有峰20个，记为1号峰-20号峰，其中6号峰为芦丁、7号峰为金丝桃苷、8号峰为异槲皮苷、9号峰为槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷、10号峰为山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷、11号峰为水仙苷、12号峰为丁香亭-3-O-芸香糖苷、14号峰为大波斯菊苷、16号峰为槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷、17号峰为山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷，以芦丁为参照峰计算其相对保留时间分别为0.645-0.660，0.704-0.716，0.771-0.780，0.843-0.849，0.863-0.871，1.000，1.067-1.070，1.113-1.117，1.265-1.273，1.310-1.320，1.377-1.389，1.407-1.420，1.436-1.452，1.495-1.511，1.607-1.624，1.855-1.873，2.181-2.200，2.487-2.513，2.674-2.703及3.166-3.215；RSD小于0.4％。
(6)相似度评价
将银杏叶包衣片指纹图谱导入国家药典委员会研制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版本)”软件，设定S1样品的指纹图谱作为参照谱图，采用中位数法，多点校正，自动匹配色谱峰，生成标准指纹图谱，分别计算16批银杏叶包衣片指纹图谱与标准指纹图谱之间的相似度，结果见表8。
表8银杏叶包衣片指纹图谱相似度
Figure BDA0002820510890000141
由表8可见，使用本申请的检测方法，所得银杏叶包衣片的指纹图谱与标准指纹图谱共有峰相似度均不低于0.960，可以有效检测银杏叶包衣片中的各黄酮醇苷物质的含量。
实施例5：稳定性验证
精密称取表1中编号S2的银杏叶提取物25mg，按照实施例1中的方法制备供试品溶液并进行高效液相检测，分别在0h、2h、4h、8h、12h及24h测定HPLC色谱图，计算出各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，以及芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷、水仙苷、丁香亭-3-O-芸香糖苷、大波斯菊苷、槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷、山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷的峰面积RSD值，结果见表9-1、表9-2及表9-3。
表9-1稳定性验证——相对峰面积及其RSD值
Figure BDA0002820510890000151
表9-2稳定性验证——相对保留时间及其RSD值
Figure BDA0002820510890000152
Figure BDA0002820510890000161
表9-3稳定性验证——10种物质的峰面积及其RSD值
成分 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD
芦丁 333661 334987 329798 331042 335814 339307 334101.58 0.78％
金丝桃苷 108454 107155 104003 106214 110229 115261 108552.72 2.57％
异槲皮苷 126137 127098 123259 126295 129213 131977 127329.74 1.71％
槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷 156587 155789 152814 158504 159206 159195 157015.69 1.24％
山奈酚-3-O-芸香糖苷 208700 206860 206582 210160 207817 209919 208339.71 0.60％
水仙苷 217909 212869 213401 215582 217144 217908 215802.09 0.86％
丁香亭-3-O-芸香糖苷 25482 23662 23732 22885 23532 24152 23907.33 2.54％
大波斯菊苷 57544 58711 59778 60501 57862 59842 59039.64 1.70％
槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷 283283 277971 282144 277582 289227 276928 281189.20 1.31％
山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷 198108 198274 197835 207379 210829 203982 202734.55 2.30％
由表9-1、表9-2及表9-3可见，在24h内，供试品中各共有峰和相对保留时间、相对峰面积的RSD值均小于5％；芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷、水仙苷、丁香亭-3-O-芸香糖苷、大波斯菊苷、槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷及山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷色谱峰峰面积的RSD值均小于3％；符合指纹图谱要求，表明经本申请的检测方法处理后的对照品和供试品在室温条件下24h内稳定。
实施例6：精密度验证
精密称取表1中编号S2的银杏叶提取物25mg，按照实施例1中的方法制备供试品溶液并进行高效液相检测，在不同的高效液相仪器上，分别连续进样6针测定HPLC色谱图，以芦丁峰的保留时间和色谱峰面积为参照，计算出各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表10-1-1、表10-1-2、表10-1-3、表10-2-1、表10-2-2及表10-2-3。
表10-1-1精密度验证——相对峰面积及其RSD值(仪器一)
Figure BDA0002820510890000171
表10-1-2精密度验证——相对保留时间及其RSD值(仪器一)
Figure BDA0002820510890000172
Figure BDA0002820510890000181
表10-1-3精密度验证——10种物质的峰面积及其RSD值(仪器一)
成分 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD
芦丁 275941 274698 274108 275203 276671 272014 274772 0.42％
金丝桃苷 85887 83009 83260 83057 88491 83835 84590 2.05％
异槲皮苷 117818 110377 109826 117513 116128 115471 114522 2.57％
槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷 154758 150776 150106 155957 153609 151091 152716 1.35％
山奈酚-3-O-芸香糖苷 162908 160543 160272 165266 161226 159474 161615 1.02％
水仙苷 161984 160918 160550 162865 158894 158827 160673 0.78％
丁香亭-3-O-芸香糖苷 16275 17673 17457 18540 17604 17593 17524 2.50％
大波斯菊苷 53880 54310 54259 53850 53064 50978 53390 1.71％
槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷 313142 313570 304419 301327 310837 303725 307837 1.52％
山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷 212234 213910 205733 211056 207405 204379 209120 1.57％
表10-2-1精密度验证——相对峰面积及其RSD值(仪器二)
Figure BDA0002820510890000182
Figure BDA0002820510890000191
表10-2-2精密度验证——相对保留时间及其RSD值(仪器二)
Figure BDA0002820510890000192
表10-2-3精密度验证——10种物质的峰面积及其RSD值(仪器二)
成分 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD
芦丁 307383 307212 301324 306363 306296 301960 305090 0.75％
金丝桃苷 101153 100160 97540 99397 99032 98832 99352 0.89％
异槲皮苷 108269 109491 105417 110677 108024 105379 107876 1.53％
槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷 143330 141636 141418 141231 140380 138298 141049 0.81％
山奈酚-3-O-芸香糖苷 183095 176969 179097 177053 176726 173737 177780 1.24％
水仙苷 185858 179603 183118 181745 177237 175909 180578 1.66％
丁香亭-3-O-芸香糖苷 20744 19200 20889 20405 19975 19674 20148 2.64％
大波斯菊苷 52016 53917 51544 51900 52111 49331 51803 1.76％
槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷 338582 339366 334974 325442 321970 319106 329907 2.34％
山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷 231974 230660 230077 233656 234340 227679 231398 0.83％
由表10-1-1、表10-1-2、表10-1-3、表10-2-1、表10-2-2及表10-2-3可见，供试品中各共有峰的相对保留时间、相对峰面积的RSD值均小于5％；芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷、水仙苷、丁香亭-3-O-芸香糖苷、大波斯菊苷、槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷及山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷色谱峰峰面积的RSD值均小于3％；符合指纹图谱要求，表明本申请的检测方法精密度良好。
实施例7：重复性验证
精密称取表1中编号S2的银杏叶提取物25mg共6份，按照实施例1中的方法制备供试品溶液6份并进行高效液相检测，以芦丁峰的保留时间和色谱峰面积为参照，计算出各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表11-1、表11-2及表11-3。
表11-1重复性验证——相对峰面积及其RSD值
Figure BDA0002820510890000201
表11-2重复性验证——相对保留时间及其RSD值
Figure BDA0002820510890000211
表11-3重复性验证——10种物质的峰面积-称重量比值及其RSD值
成分 1 2 3 4 5 6 平均值 RSD
芦丁 5056.85 5241.25 5273.29 5242.22 5185.34 5354.42 5225.56 1.33％
金丝桃苷 1539.95 1634.04 1616.51 1609.50 1629.17 1646.97 1612.69 1.57％
异槲皮苷 2118.75 2212.74 2109.77 2168.28 2277.31 2254.51 2190.23 2.65％
槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷 2929.12 2943.46 2961.60 2963.13 2903.41 3042.98 2957.28 1.08％
山奈酚-3-O-芸香糖苷 3122.36 3094.73 3118.30 3108.23 3020.65 3231.33 3115.93 1.33％
水仙苷 3106.30 3030.45 3063.38 3061.15 2986.73 3142.64 3065.11 1.29％
丁香亭-3-O-芸香糖苷 361.32 330.06 347.20 331.42 336.67 334.18 340.14 2.77％
大波斯菊苷 1141.95 1071.56 1066.41 1057.45 1046.82 1107.16 1081.89 2.63％
槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷 5849.05 5988.74 5917.99 5921.68 5812.01 6185.48 5945.83 1.58％
山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷 3861.35 4114.00 4155.38 4030.08 4080.97 4081.48 4053.88 1.78％
由表11-1、表11-2及表11-3可见，供试品中各共有峰的相对保留时间、相对峰面积的RSD值均小于5％；芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷、水仙苷、丁香亭-3-O-芸香糖苷、大波斯菊苷、槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷及山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷色谱峰峰面积-称重量比值的RSD值均小于3％；符合指纹图谱要求，表明本申请的检测方法重复性良好。
实施例8：线性验证
精密吸取混合对照品储备溶液加入无水甲醇稀释成一系列梯度浓度溶液，按实施例1中的色谱条件进行测定，以混合对照品溶液质量浓度(mg·mL-1)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷、水仙苷、丁香亭-3-O-芸香糖苷、大波斯菊苷、槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷、山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷的标准曲线，结果见表12。
表12银杏叶提取物中10种成分的标准曲线
成分 回归方程 r 线性范围/mg·mL<sup>-1</sup>
芦丁 y＝15392745.56x-3544.59 0.9997 0.0082-0.0818
金丝桃苷 y＝19827012.84x-1099.36 0.9999 0.0022-0.0224
异槲皮苷 y＝22080126.56x-1808.78 0.9998 0.0026-0.0258
槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷 y＝14401981.11x-1299.24 1.0000 0.0053-0.0525
山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷 y＝17654747.81x-2396.26 0.9999 0.0055-0.0551
水仙苷 y＝17381595.94x-1127.74 0.9999 0.0050-0.0499
丁香亭-3-O-芸香糖苷 y＝14901544.38x+1830.56 0.9995 0.0008-0.0079
大波斯菊苷 y＝22940195.24x-972.87 0.9999 0.0014-0.0139
槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷 y＝9478117.17x-2349.58 0.9999 0.0138-0.1379
山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷 y＝10638276.920x-2660.91 0.9998 0.0102-0.1016
由表12可见，各银杏黄酮醇苷的线性系数均大于0.999，符合指纹图谱要求，表明在本申请的检测方法中，各成分线性关系良好。
实施例9：准确性验证
精密称取表1中编号S2的银杏叶提取物25mg共9份，按照实施例1中方法制备9份供试品溶液，分别加入按已知含量的50％、100％和150％3个水平加入对照品溶液，下分别测定HPLC色谱图，计算算芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷、水仙苷、丁香亭-3-O-芸香糖苷、大波斯菊苷、槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷、山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷的回收率以及RSD值，结果见表13。
表13准确性验证
Figure BDA0002820510890000221
Figure BDA0002820510890000231
由表13可见，供试品在不同浓度水平的回收率为95％-105％，RSD均小于3％，符合指纹图谱要求，表明本申请的检测方法准确性良好。
对比例1
与实施例1的区别在于，色谱条件如下：
色谱柱为PRAZIS Absolute C18色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)，柱温为30℃，检测波长为360nm，流动相A为以乙腈为溶剂的3.5％异丙醇溶液，流动相B为0.5％枸橼酸水溶液，流量流速为1.0mL·min-1，分析时间65min。
梯度洗脱条件为0-34min，流动相A：18％→28％，流动相B：82％→72％；时间：34-35min，流动相A：28％→29％，流动相B：72％→71％；时间：35-65min，流动相A：29％→36％，流动相B：71％→64％；检测结果见图10。
由图10可见，采用上述对比例检测方法进行检测时，共有峰出峰17个，并且部分共有峰无法完全分离并且存在拖尾现象，说明本申请的检测方法是经过筛选优化得到的。

Claims (10)

1.一种银杏黄酮醇苷的检测方法，其特征在于，所述检测方法包含以下步骤：
(1)配制对照品和供试品溶液：所述对照品为芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷、山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷、水仙苷、丁香亭-3-O-芸香糖苷、大波斯菊苷、槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷和山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷对照品；
(2)检测；
(3)建立标准指纹图谱；
(4)计算步骤(3)建立的标准指纹图谱中共有峰的含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中各对照品溶液的浓度分别如下：
芦丁：8-100μg·mL-1，金丝桃苷：2-40μg·mL-1，异槲皮苷：2-40μg·mL-1，槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷：5-80μg·mL-1，山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷：5-80μg·mL-1，水仙苷：5-80μg·mL-1，丁香亭-3-O-芸香糖苷：0.5-15μg·mL-1，大波斯菊苷：1-30μg·mL-1，槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷：10-200μg·mL-1，山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷：10-200μg·mL-1。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中各对照品溶液的浓度分别如下：
芦丁：8-85μg·mL-1，金丝桃苷：2-30μg·mL-1，异槲皮苷：2-30μg·mL-1，槲皮素-3-O-2”-葡萄糖鼠李糖苷：5-55μg·mL-1，山奈酚-3-O-β-D-芸香糖苷：5-60μg·mL-1，水仙苷：5-50μg·mL-1，丁香亭-3-O-芸香糖苷：0.5-10μg·mL-1，大波斯菊苷：1-15μg·mL-1，槲皮素-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷：10-150μg·mL-1，山奈酚-3-O-对香豆酰基鼠李糖葡萄糖苷：100-150μg·mL-1。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)的检测方法如下：
色谱条件：
色谱柱：烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流速：0.8-1mL·min-1，检测波长：350nm-360nm，柱温：30-35℃，流动相A：5％-7％的异丙醇-乙腈溶液，流动相B：0.4％磷酸水溶液，进样量：8-10μL，梯度洗脱；
梯度洗脱条件：
时间：0-60min，流动相A：16％→34％，流动相B：84％→66％；时间：60-65min，流动相A：34％→37％，流动相B：66％→63％；时间：65-70min，流动相A：37％→37％，流动相B：63％→63％。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为C18色谱柱、C8色谱柱、苯基柱、氰基柱或氨基柱，柱长为30mm-250mm，色谱柱填料粒度为1.6-5μm。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)以芦丁为参照峰建立标准指纹图谱。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，当所述供试品为银杏叶提取物时，所述标准指纹图谱中各共有峰相对参照峰的相对保留时间分别为：0.648-0.653，0.708-0.712，0.773-0.777，0.843-0.847，0.865-0.869，1.000，1.067，1.115-1.117，1.268-1.272，1.314-1.319，1.382-1.388，1.412-1.418，1.442-1.450，1.503-1.512，1.617-1.626，1.869-1.882，2.199-2.215，2.512-2.530，2.701-2.721及3.208-3.240。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，当所述供试品为银杏叶中间体颗粒时，所述标准指纹图谱中各共有峰相对参照峰的相对保留时间分别为：0.671-0.673，0.727-0.729，0.789-0.792，0.839-0.858，0.873-0.880，1.000，1.060-1.062，1.113-1.114，1.249-1.252，1.293-1.296，1.374-1.383，1.418-1.426，1.472-1.479，1.566-1.572，1.616-1.629，1.788-1.796，2.083-2.095，2.349-2.359，2.508-2.522及3.046-3.059。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，当所述供试品为银杏叶素片时，所述标准指纹图谱中各共有峰相对参照峰的相对保留时间分别为：0.648-0.653，0.708-0.712，0.773-0.777，0.841-0.847，0.861-0.870，1.000，1.067-1.068，1.115-1.119，1.267-1.275，1.313-1.321，1.384-1.390，1.413-1.422，1.447-1.450，1.502-1.513，1.616-1.629，1.867-1.884，2.172-2.221，2.510-2.541，2.699-2.736及3.216-3.249。
10.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，当所述供试品为银杏叶包衣片时，所述标准指纹图谱中各共有峰相对参照峰的相对保留时间分别为：0.645-0.660，0.704-0.716，0.771-0.780，0.843-0.849，0.863-0.871，1.000，1.067-1.070，1.113-1.117，1.265-1.273，1.310-1.320，1.377-1.389，1.407-1.420，1.436-1.452，1.495-1.511，1.607-1.624，1.855-1.873，2.181-2.200，2.487-2.513，2.674-2.703及3.166-3.215。
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