CN106018642B

CN106018642B - 一种测定乐舒洗液中苦参碱含量的spe‑hplc法

Info

Publication number: CN106018642B
Application number: CN201610503155.6A
Authority: CN
Inventors: 毛桂福; 王麟; 曾定元; 周媛
Original assignee: Liuzhou Maternity and Child Healthcare Hospital
Current assignee: Liuzhou Maternity and Child Healthcare Hospital
Priority date: 2016-06-27
Filing date: 2016-06-27
Publication date: 2018-02-09
Anticipated expiration: 2036-06-27
Also published as: CN106018642A

Abstract

本发明涉及一种测定乐舒洗液中苦参碱含量的SPE‑HPLC法，包括以下步骤：A、对照品溶液的制备：称取苦参碱对照品，用甲醇定容，制成对照品储备液，将苦参碱对照品储备液逐级稀释，制备成系列浓度对照品工作液；B、供试品溶液的制备：采用固相萃取方法制备供试品溶液；C、液相色谱检测：D、标准曲线的建立；E、样品测定。本发明选用固相萃取法制备供试品溶液，可获得近100%的萃取率；并有效除去供试品溶液中的无机盐及有机杂质，减少杂质对测定的干扰，保证测定过程的连续性和测定结果的准确性；固相萃取法可批量处理样品，易于实现自动化，提高工作效率。具有操作简便，结果准确、重复性好，分析过程中杂质干扰少的优点。

Description

一种测定乐舒洗液中苦参碱含量的SPE-HPLC法

技术领域

本发明涉及一种测定乐舒洗液中苦参碱含量方法，特别涉及一种测定乐舒洗液中苦参碱含量的SPE-HPLC法。

背景技术

乐舒洗液是广西柳州市妇幼保健院专家根据中医理论，经过多年的临床实践而制成的中药制剂(批准文号：桂药制字Z02060005)，由百部、黄柏、苦参、鹤虱、白鲜皮、蛇床子等九味药物组成，10余年的临床应用表明，乐舒洗液对妇科外阴炎、阴道炎等生殖道感染有良好的疗效，但该制剂一直缺乏切实有效的质量控制方法。

近年来，分析工作者对中药质控方法进行了广泛的研究，建立了多种薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳法等对中药妇科洗剂中的某些成分进行定性、定量分析。目前公开有以下的相关文献：

1、王慧、毛春芹、周渊等的“HPLC同时测定舒乐洗剂中苦参碱和小聚碱”。

色谱条件： Hanbon Kromasil C18色谱柱 (5 μm，4.6X250mm)，流动相：流动相甲醇( A ) -乙腈( B ) -0.1%磷酸溶液(每100ml含十二烷基磺酸钠0.1g，C)梯度洗脱；柱温：30℃；紫外检测波长：230 nm；进样量为10μL。

表1 梯度洗脱程序

供试品溶液制备方法：精密移取本品5 mL，加入氨水2 mL，置分液漏斗中，用二氯甲烷振摇提取3次，每次20 mL，合并二氯甲烷液，置60℃水浴上挥干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即得。

结果：在0. 430 5～8. 61μg范围内，苦参碱的峰面积比与浓度呈良好的线性关系（r=1.0000），平均回收率分别为98.9%，精密度RSD为0.44%，重复性RSD为2.00%。

不足：舒乐洗剂与本院的乐舒洗液的组方和生产工艺不尽相同，制剂中有效成分或杂质也不同，因此该方法不能直接用于测定乐舒洗液的苦参碱。文献的供试品溶液制备方法为液-液萃取法，该方法操作繁琐，不能去除脂溶性杂质。

2、郭炎荣、符翠莉的“固相萃取-HPLC 同时测定润燥止痒胶囊中苦参碱和二苯乙烯苷的含量”。

色谱条件：色谱柱为 XTerra RP18 (3. 9 mm × 150 mm，5 μm) ，流速 1. 0mL·min^－1 ，乙腈-水(20∶ 80) 为流动相，检测波长为 320 nm，柱温：40℃。

供试品溶液制备方法：取润燥止痒胶囊20粒，倾取内容物，研细，精密称取细粉1.0g置干燥锥形瓶中，加入甲醇适量，超声30 min，室温下过滤，滤液80℃水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10mL，摇匀，加于已处理好的sep-pakC微柱 (先用3mL甲醇，后用3 mL水洗，然后注入空气，尽量将柱挤干) 上收取所有流出液，浓缩至1～2 mL 作为供试品溶液。

结果：苦参碱的线性范围为0. 302 6～1. 513 g·L^－1，r = 0. 9997，平均回收率为98.65%，重复性RSD 1. 90%，精密度RSD为0.95%。

不足：该方法采用饱和流出式固相萃取方法制备供试品溶液，吸附强保留物质从而起到净化样品的作用，操作中有两个浓缩的步骤，因而操作仍然较为繁琐。该饱和流出式固相萃取方法不能有效去除水溶性杂质，而乐舒洗液中水溶性的无机盐及其它杂质较多，因而该方法不适用于制备乐舒洗液的供试品溶液。

3、毛桂福、欧人豪、黄玉玲等的“HPLC法同时测定乐舒洗液中苦参碱和蛇床子素”。

色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5.0μm）柱；柱温30℃；以乙腈-0.2%三乙胺（磷酸调节pH 7.0）为流动相梯度洗脱（0～5 min：28%乙腈，9～20 min：72%乙腈，23～28 min：28%乙腈）；流速1.0 mL·min^-1；检测波长：220 nm（0～10min）和320 nm（10～28min）；进样量为20 μL。

供试品溶液的制备：乐舒洗液超声30 min后过滤，精密量取4 mL续滤液置10 mL具塞玻璃试管中，加0.5 mL浓氨溶液，用4 mL乙酸乙酯振摇提取1 min，2000 r·min^-1离心1min，分取有机相至另一个10 mL离心管中置95℃ 水浴氮气吹干，共提取4次（每次4 mL）。精密加2 mL甲醇至离心管中，涡旋溶解残渣，用0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

结果：在225.0～1237.5μg·mL^-1范围内，苦参碱的峰面积比与浓度呈良好的线性关系（r=0.9998），平均回收率分别为100.4%，精密度RSD为1.1%，重复性RSD为2.8%。

不足：笔者先前建立的乐舒洗液中苦参碱的含量测定方法可用于测定乐舒洗液的苦参碱。但其供试品溶液制备方法为液-液萃取法，需重复提取4次才能达到满意的提取率，该方法操作繁琐，且不能有效去除脂溶性杂质。采用通用的低比例有机溶剂的流动相连续检测苦参碱，检测过程中将不定时地出现有机杂质峰，对检测结果将造成不可预见的干扰。

综上所述，由于中药制剂成分复杂、同类制剂组方不同或生产工艺不同等原因，各中药妇科洗剂的有效成分或杂质不一，因此文献报道的鉴别和含量测定方法不能直接用作乐舒洗液的质控方法，或者方法有一定的缺陷，需要进一步改进。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种测定乐舒洗液中苦参碱含量的SPE-HPLC法，该方法选用固相萃取法制备供试品溶液，可获得近100%的萃取率；并有效除去供试品溶液中的无机盐及有机杂质，减少杂质对测定的干扰，保证测定过程的连续性和测定结果的准确性，有利于延长色谱柱使用寿命；固相萃取法可批量处理样品，易于实现自动化，提高工作效率。本方法操作简便，结果准确、重复性好，分析过程中杂质干扰少。

解决上述技术问题的技术方案是：一种测定乐舒洗液中苦参碱含量的SPE-HPLC法，包括以下步骤：

A、对照品溶液的制备：称取苦参碱对照品，用甲醇定容，制成对照品储备液，将苦参碱对照品储备液逐级稀释，制备成系列浓度对照品工作液；

B、供试品溶液的制备：

B1、取乐舒洗液超声处理，摇匀，滤过，取滤液备用；

B2、取滤液过已活化的Bond Elut plexa PCX混合型强阳离子交换小柱，依次用0.5mol·L^-1盐酸、甲醇和体积浓度为50%甲醇溶液洗涤，弃去洗液，抽干，最后用氨水-甲醇溶液洗脱，氨水-甲醇溶液中氨水与甲醇的体积比为2∶8，控制流速在1～1.5 mL·min^-1，取洗脱液置于80～95℃水浴中空气吹干，精密加入流动相，涡旋震荡使溶解残渣，即得供试品溶液；

C、液相色谱检测：待仪器状态稳定后，用步骤A制备的对照品工作液进样，液相色谱检测，在此基础上，对步骤B制备的供试品溶液进行液相色谱检测；

液相色谱柱选用Diamonsil-C₁₈柱，5.0 μm，250 mm×4.6 mm；

检测条件：

柱温30℃；

测定波长：220 nm；

进样量：20μL；

流动相：0.3%三乙胺-四氢呋喃-乙腈溶液，其中0.3%三乙胺、四氢呋喃、乙腈的体积比为78∶2∶20，所述的0.3%三乙胺用磷酸调pH值为6.9；

流速：1.0 mL·min^-1；

D、标准曲线的建立：以对照品工作液的进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；

E、样品测定：将测定的供试品溶液的苦参碱的峰面积，代入标准曲线方程，计算得到供试品溶液中的苦参碱含量。

本发明的进一步技术方案是：步骤B1中，超声处理的条件为功率400W，频率40kHz，超声处理的时间为25～35min。

步骤B2中，Bond Elut plexa PCX混合型强阳离子交换小柱规格为500 mg，6 mL，其活化是先后用10 mL甲醇、5 mL 0.5mol·L^-1 盐酸溶液冲洗。

步骤B2中，0.5mol·L^-1盐酸、甲醇和体积比50%甲醇溶液的用量分别为10～15mL；氨水-甲醇溶液的用量为18～25 mL。

步骤D中，对照品工作液的浓度为76.5μg·mL^-1、102.0μg·mL^-1、153.0μg·mL^-1、204.0μg·mL^-1、306.0μg·mL^-1、408.0μg·mL^-1。

步骤A中，对照品储备液的浓度为200～5000μg·mL^-1。

由于乐舒洗液中含明矾较多，直接对其滤液进行色谱分析，无机盐容易析出，使柱效迅速降低，柱压快速升高，造成堵塞流路系统。选用液-液萃取法制备供试液，不能有效除去供试品中的有机杂质，采用通用的低比例有机溶剂的流动相连续检测样品中的苦参碱，检测过程中将不定时地出现有机杂质峰，对检测结果将造成不可预见的干扰。选用固相萃取法制备供试液，可获得近100%的萃取率；并有效除去供试品中的无机盐及有机杂质，减少杂质对测定的干扰，保证测定过程的连续性和测定结果的准确性；固相萃取法可批量处理样品，易于实现自动化，提高工作效率。本方法操作简便，结果准确，重复性好，分析过程中杂质干扰少。

本发明采用固相萃取法、高效液相色谱法等现代分析手段，建立乐舒洗液制剂中苦参碱的定量分析方法，为提高该制剂质量提供科学的技术方法，为建立同类中药制剂质控方法提供参考依据。

下面，结合附图和实施例对本发明之一种测定乐舒洗液中苦参碱含量的SPE-HPLC法的技术特征作进一步的说明。

附图说明

图1：苦参碱对照品工作液的色谱图。

图2：固相萃取法制备的苦参碱供试品溶液的色谱图（专属性考察）。

图3：固相萃取法制备的缺苦参的阴性样品溶液的色谱图。

图4：固相萃取法制备的苦参碱供试品溶液的色谱图（对比试验）。

图5：液-液萃取法制备的苦参碱供试品溶液的色谱图。

图中1为苦参碱。

具体实施方式

1、仪器及试剂

岛津LC-20AT四元梯度高效液相色谱系统（LC-20AT泵，Rheodyne7725i型进样阀，SPD-20A紫外检测器，CTO-20A柱温箱，DGu-20A在线脱气机，日本岛津），固相萃取装置（武汉恒信世纪科技有限公司），Bond Elut Plexa PCX 混合型强阳离子交换固相萃取小柱(Agilent公司，500 mg，6 mL)， PHS-3C型PH剂（上海精密科学仪器有限公司），KQ-300DB型数控超声波清洗器（昆山市超生仪器有限公司），HANGPINGFA1004型电子天平（上海天平仪器厂）

苦参碱对照品（批号110805-200508，含量≥98%，中国食品药品检定研究院）。甲醇、乙腈为国产HPLC级试剂，水为重蒸馏水，其他使用试剂均为分析纯试剂，乐舒洗液样品（柳州市妇幼保健院制剂室，批号：2015121501，2015121502，2015121503，2016042001，2016042002 ）。

2、对照品溶液的制备

精密称取苦参碱对照品20.40mg置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，即得苦参碱对照品储备液2040 μg·mL^-1。苦参碱对照品储备液置于﹣20℃冰箱保存。临用前，再精密量取一定量的苦参碱对照品储备液，加甲醇定容，依次配制浓度分别为76.5μg·mL^-1，102.0μg·mL^-1，153.0μg·mL^-1，204.0μg·mL^-1，306.0μg·mL^-1，408.0μg·mL^-1苦参碱对照品工作液。

3、供试品溶液的制备

取密封的500mL乐舒洗液超声处理(功率400 W，频率40kHz)30min，摇匀，滤过，取滤液约30 mL备用。取上述滤液2.0 mL过已活化的Bond Elut plexa PCX混合型强阳离子交换小柱（先后用10 mL甲醇、5 mL 0.5mol·L^-1 盐酸溶液冲洗活化），依次用0.5mol·L^-1盐酸、甲醇和体积浓度为50%的甲醇溶液各12mL洗涤，弃去洗液，抽干1min；最后用20 mL氨水-甲醇溶液（2∶8，体积比）洗脱，控制流速在1～1.5 mL·min^-1。取20 mL洗脱液置90℃水浴中空气吹干，精密加入2 mL流动相，涡旋震荡使溶解残渣，即得供试品溶液。

4、阴性样品溶液的制备

另按乐舒洗液处方比例称取缺苦参的药材，按照乐舒洗液制备工艺制备缺苦参的阴性样品，再按“3、供试品溶液的制备”项下方法操作制备缺苦参的阴性样品溶液。

5、色谱条件

色谱柱Diamonsil-C₁₈柱（5.0μm，250 mm×4.6 mm）；柱温30℃；流动相为0.3%三乙胺（磷酸调PH 6.9）-四氢呋喃-乙腈（78∶2∶20，体积比）；流速1.0 mL·min^-1；检测波长220nm，进样量为20 μL。

6、专属性考察

分别量取阴性样品溶液、苦参碱对照品溶液与供试品溶液各20 μL进行检测，记录色谱图，结果见图1～图3。从色谱图可见，阴性样品溶液在与供试品溶液的色谱图中的苦参碱吸收峰位置上无色谱峰出现，表明阴性样品中其他杂质对测定无干扰。

7、标准曲线建立

分别量取系列浓度的对照品工作液进样，测定苦参碱的峰面积。以对照品工作液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。所得的标准曲线回归方程为Y = 17288X+ 124288，r = 0.999 9。结果表明苦参碱在76.5 ～ 408.0 μg·mL^-1范围内线性关系良好。

8、精密度试验

精密量取含苦参碱204.0μg·mL^-1的对照品溶液连续进样6次。苦参碱峰面积的RSD为1.13%（n = 6），表明仪器精密度良好。

9、重复性试验

精密量取同一批号样品6份，按“3、供试品溶液的制备”项方法制备供试品溶液，进样测定含量。结果，苦参碱含量的RSD为1.22%（n = 6），表明该方法重复性良好。

10、稳定性试验

精密量取同一供试品溶液，室温下放置，分别于0、2、4、6、8 h进样，测定苦参碱色谱峰8h内的峰面积，计算苦参碱的RSD为0.57%，结果表明供试品溶液室温放置8 h内稳定。

11、固相萃取回收率试验

精密量取一定量的已知浓度苦参碱对照品溶液，按“3、供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，分别测定苦参碱的含量，与加入量比较计算回收率。结果见下表。

表2 苦参碱的固相萃取回收率试验结果（n = 10）

12、加样回收率试验

将已知苦参碱含量的样品密闭超声20 min，精密吸取1mL样品共9份，分3组，分别加入一定量苦参碱对照品溶液，按“3、供试品溶液的制备”项下方法制备供试品溶液，测定苦参碱的含量并计算回收率。结果见下表。

表3 苦参碱的加样回收率试验结果（n = 9）

13、样品含量测定

取5批乐舒洗液样品，按“3、供试品溶液的制备”项下方法制备各供试品溶液，分别量取各溶液20μL进样分析并计算其含量。结果见下表。

表4 乐舒洗液中苦参碱的含量测定结果(n=2)

14、固相萃取与液-液萃取方法的对比试验

1）色谱条件

色谱柱Diamonsil-C₁₈柱（5.0 μm，250 mm×4.6 mm）；柱温30℃；以0.3%三乙胺（磷酸调PH 6.9，A）-四氢呋喃（B）-乙腈（C）为流动相梯度洗脱；流速1.0 mL·min^-1；检测波长220 nm，进样量为20μL。

表5 梯度洗脱程序

2）供试液制备方法（液-液萃取）

乐舒洗液超声30 min后过滤，精密量取2 mL续滤液置10 mL具塞玻璃试管中，加0.2 mL浓氨溶液，用4 mL乙酸乙酯振摇提取1 min，3000 r·min^-1离心1 min，分取有机相至另一个10 mL离心管中置90℃ 水浴氮气吹干，共提取4次（每次4 mL）。精密加2 mL流动相至离心管中，涡旋溶解残渣，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

3）固相萃取与液-液萃取方法除杂效果比较

精密量取同批次的乐舒洗液，分别按实施例下的“供试液制备方法”（固相萃取）及对比试验项下的“供试液制备方法”（液-液萃取）制备供试液，分别量取20μL进行液相色谱分析，记录色谱图，结果见图4、图5。从色谱图可见，在液-液萃取方法制备的供试液的色谱图中，苦参碱色谱峰后仍然有不少的脂溶性杂质峰，而固相萃取方法制备的供试液的色谱图中几乎没有脂溶性杂质峰。如果使用通用的有机相比例较低的流动相连续检测样品，检测过程中将不定时地出现脂溶性杂质峰，对检测结果将造成不可预见的干扰。

Claims

1.一种测定乐舒洗液中苦参碱含量的SPE-HPLC法，其特征在于：包括以下步骤：

B、供试品溶液的制备：

B1、取乐舒洗液超声处理，摇匀，滤过，取滤液备用；

液相色谱柱选用Diamonsil-C₁₈柱，5.0 μm，250 mm×4.6 mm；

检测条件：

柱温30℃；

测定波长：220 nm；

进样量：20 μL；

流速：1.0 mL·min^-1；

E、样品测定：将测定的供试品溶液的苦参碱的峰面积，代入标准曲线方程，计算得到供试品溶液中的苦参碱含量；

步骤B1中，超声处理的条件为功率400W，频率40kHz，超声处理的时间为25～35min；

2.根据权利要求1所述的一种测定乐舒洗液中苦参碱含量的SPE-HPLC法，其特征在于：步骤B2中，Bond Elut plexa PCX混合型强阳离子交换小柱规格为500 mg，6 mL，其活化是先后用10 mL甲醇、5 mL 0.5mol·L^-1 盐酸溶液冲洗。

3.根据权利要求1所述的一种测定乐舒洗液中苦参碱含量的SPE-HPLC法，其特征在于：步骤D中，对照品工作液的浓度为76.5μg·mL^-1、102.0μg·mL^-1、153.0μg·mL^-1、204.0μg·mL^-1、306.0μg·mL^-1、408.0μg·mL^-1。

4.根据权利要求1所述的一种测定乐舒洗液中苦参碱含量的SPE-HPLC法，其特征在于：步骤A中，对照品储备液的浓度为5000μg·mL^-1。