JP3431204B2 - ノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼ - Google Patents
ノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼInfo
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
- C12P41/004—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions by esterification of alcohol- or thiol groups in the enantiomers or the inverse reaction
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、（±）−エクソ−ノル
ボルナン型エステルを鏡像選択的に加水分解し、光学活
性なノルボルネオールを産生させる新規ノルボルナン型
エステル・ヒドロラーゼ、該ノルボルナン型エステル・
ヒドロラーゼの構造遺伝子；該遺伝子を含む発現ベクタ
ー；該発現ベクターを有する形質転換体；および該形質
転換体を用いたノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼ
の製造方法に関する。
ボルナン型エステルを鏡像選択的に加水分解し、光学活
性なノルボルネオールを産生させる新規ノルボルナン型
エステル・ヒドロラーゼ、該ノルボルナン型エステル・
ヒドロラーゼの構造遺伝子；該遺伝子を含む発現ベクタ
ー；該発現ベクターを有する形質転換体；および該形質
転換体を用いたノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼ
の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ノルボルネオールを製造する方法として
は、ノルボルネンを出発原料として有機酸と作用させ、
ノルボルナン型のエステル体を作成した後、このエステ
ル体を化学的に加水分解してノルボルネオールを得る化
学的合成法が知られている。このような化学的合成によ
る方法では、４種の立体異性体（（＋、−）−（エン
ド、エクソ）−ノルボルネオール）が生じるため、光学
活性なノルボルネオールを得るためには、さらに煩雑な
分割工程が必要となる。
は、ノルボルネンを出発原料として有機酸と作用させ、
ノルボルナン型のエステル体を作成した後、このエステ
ル体を化学的に加水分解してノルボルネオールを得る化
学的合成法が知られている。このような化学的合成によ
る方法では、４種の立体異性体（（＋、−）−（エン
ド、エクソ）−ノルボルネオール）が生じるため、光学
活性なノルボルネオールを得るためには、さらに煩雑な
分割工程が必要となる。
【０００３】ノルボルネオールの別の製造方法として、
生物学的製造法も知られている。これは、ノルボルネン
を出発原料として有機酸と作用させ、ノルボルナンのエ
ステル体を作成した後、このエステル体を微生物と接触
させるかあるいは酵素と反応させ、該エステルを加水分
解してノルボルネオールを得る方法である。この方法に
関連して、最近、オーバーハウセルらが、カンジダ シ
リンドラセアエ（Candida cylindraceae）由来のリパー
ゼを用いて（±）−ノルボルニルアセテートから（−）
−ノルボルネオールを製造する方法を報告している（T
h. Oberhauserら、Tetrahedron, 43, 3931-3941, 198
7）。しかし、このリパーゼを用いる方法では、選択性
が低く、光学純度の低いノルボルネオールしか得られて
いない。
生物学的製造法も知られている。これは、ノルボルネン
を出発原料として有機酸と作用させ、ノルボルナンのエ
ステル体を作成した後、このエステル体を微生物と接触
させるかあるいは酵素と反応させ、該エステルを加水分
解してノルボルネオールを得る方法である。この方法に
関連して、最近、オーバーハウセルらが、カンジダ シ
リンドラセアエ（Candida cylindraceae）由来のリパー
ゼを用いて（±）−ノルボルニルアセテートから（−）
−ノルボルネオールを製造する方法を報告している（T
h. Oberhauserら、Tetrahedron, 43, 3931-3941, 198
7）。しかし、このリパーゼを用いる方法では、選択性
が低く、光学純度の低いノルボルネオールしか得られて
いない。
【０００４】特開平２−２７３１９６には一般に、ラセ
ミ化合物の光学分割を目的として行う生物的触媒反応
で、鏡像異性体の一方の反応を選択的に阻害する阻害剤
を添加する光学分割方法が開示されており、このような
方法を光学活性なノルボルネオールの調製に使用するこ
とも可能である。しかし、光学活性なノルボルネオール
の選択に有効な阻害剤をスクリーニングで得る必要があ
るうえに、反応後の分取作業において阻害剤を除去しな
ければならず、操作が煩雑になる欠点を有する。
ミ化合物の光学分割を目的として行う生物的触媒反応
で、鏡像異性体の一方の反応を選択的に阻害する阻害剤
を添加する光学分割方法が開示されており、このような
方法を光学活性なノルボルネオールの調製に使用するこ
とも可能である。しかし、光学活性なノルボルネオール
の選択に有効な阻害剤をスクリーニングで得る必要があ
るうえに、反応後の分取作業において阻害剤を除去しな
ければならず、操作が煩雑になる欠点を有する。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来の
課題を解決するものであり、その目的は、光学活性なノ
ルボルネオールを高純度で産生し得る新規ノルボルナン
型エステル・ヒドロラーゼを提供することにある。本発
明の他の目的は、該ノルボルナン型エステル・ヒドロラ
ーゼをコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を有する発
現ベクター、該発現ベクターを有する形質転換体、およ
び該形質転換体を用いたノルボルナン型エステル・ヒド
ロラーゼの製造方法を提供することにある。
課題を解決するものであり、その目的は、光学活性なノ
ルボルネオールを高純度で産生し得る新規ノルボルナン
型エステル・ヒドロラーゼを提供することにある。本発
明の他の目的は、該ノルボルナン型エステル・ヒドロラ
ーゼをコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を有する発
現ベクター、該発現ベクターを有する形質転換体、およ
び該形質転換体を用いたノルボルナン型エステル・ヒド
ロラーゼの製造方法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】発明者らは、ノルボルナ
ン型のエステル体から高純度の光学活性なノルボルネオ
ールを得るために種々の検討を行った。その結果、アセ
トバクターパスツーリアヌス（Acetobacter pasteurian
us）ATCC 12873がノルボルナン型エステル・ヒドロラー
ゼを産生すること、この菌由来のノルボルナン型エステ
ル・ヒドロラーゼが、図１に示すように、（±）−エク
ソ−ノルボルニルアセテートを鏡像選択的に脱アセチル
化し、光学活性なノルボルネオールを高純度に産生させ
ることを見いだした。さらに、該菌株のゲノムＤＮＡ中
のノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼをコードする
ＤＮＡ配列を見いだし、本発明を完成するに至った。
ン型のエステル体から高純度の光学活性なノルボルネオ
ールを得るために種々の検討を行った。その結果、アセ
トバクターパスツーリアヌス（Acetobacter pasteurian
us）ATCC 12873がノルボルナン型エステル・ヒドロラー
ゼを産生すること、この菌由来のノルボルナン型エステ
ル・ヒドロラーゼが、図１に示すように、（±）−エク
ソ−ノルボルニルアセテートを鏡像選択的に脱アセチル
化し、光学活性なノルボルネオールを高純度に産生させ
ることを見いだした。さらに、該菌株のゲノムＤＮＡ中
のノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼをコードする
ＤＮＡ配列を見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】ここで、本明細書の用語「光学活性なノル
ボルネオール」とは、（＋）−ノルボルネオール、ある
いは（−）−ノルボルネオールのいずれかをいい、ここ
では特に、（−）−エクソ−ノルボルネオールが好まし
い光学活性なノルボルネオールである。「ノルボルナン
型エステル」とは、式（Ｉ）の定義から明らかなよう
に、ノルボルネオールエステルまたはその誘導体を指し
ていう。
ボルネオール」とは、（＋）−ノルボルネオール、ある
いは（−）−ノルボルネオールのいずれかをいい、ここ
では特に、（−）−エクソ−ノルボルネオールが好まし
い光学活性なノルボルネオールである。「ノルボルナン
型エステル」とは、式（Ｉ）の定義から明らかなよう
に、ノルボルネオールエステルまたはその誘導体を指し
ていう。
【０００８】本発明のノルボルナン型エステル・ヒドロ
ラーゼは、以下の性質を有する： （１）式（Ｉ）
ラーゼは、以下の性質を有する： （１）式（Ｉ）
【０００９】
【化４】
【００１０】（式中、Ｒはアシル基を、ＡおよびＢはそ
れぞれ独立して水素を表すかまたは一緒になって結合手
を表す）で示される（±）−エクソ−ノルボルナン型エ
ステルを、鏡像選択的に加水分解し、光学活性なノルボ
ルネオールを産生させる； （２）反応至適ｐＨ：約８；および （３）酵素安定ｐＨ範囲：約６〜約８。
れぞれ独立して水素を表すかまたは一緒になって結合手
を表す）で示される（±）−エクソ−ノルボルナン型エ
ステルを、鏡像選択的に加水分解し、光学活性なノルボ
ルネオールを産生させる； （２）反応至適ｐＨ：約８；および （３）酵素安定ｐＨ範囲：約６〜約８。
【００１１】本発明のノルボルナン型エステル・ヒドロ
ラーゼは、以下の性質を有する： （１）式（ＩＩ）
ラーゼは、以下の性質を有する： （１）式（ＩＩ）
【００１２】
【化５】
【００１３】で示される（±）−エクソ−ノルボルニル
アセテートを、鏡像選択的に脱アセチル化し、光学活性
なノルボルネオールを産生させる； （２）反応至適ｐＨ：約８；および （３）酵素安定ｐＨ範囲：約６〜約８。
アセテートを、鏡像選択的に脱アセチル化し、光学活性
なノルボルネオールを産生させる； （２）反応至適ｐＨ：約８；および （３）酵素安定ｐＨ範囲：約６〜約８。
【００１４】好適な実施態様では、上記ノルボルナン型
エステル・ヒドロラーゼは、アセトバクター属菌由来で
ある。
エステル・ヒドロラーゼは、アセトバクター属菌由来で
ある。
【００１５】好適な実施態様では、上記アセトバクター
属菌は、アセトバクター・パスツーリアヌスである。
属菌は、アセトバクター・パスツーリアヌスである。
【００１６】好適な実施態様では、上記アセトバクター
・パスツーリアヌスが、アセトバクター・パスツーリア
ヌスATCC 12873である。
・パスツーリアヌスが、アセトバクター・パスツーリア
ヌスATCC 12873である。
【００１７】本発明のノルボルナン型エステル・ヒドロ
ラーゼは、配列表の配列番号１の１位のMetから３８８
位のAlaまでのアミノ酸配列を含む。
ラーゼは、配列表の配列番号１の１位のMetから３８８
位のAlaまでのアミノ酸配列を含む。
【００１８】本発明のＤＮＡ配列は、上記アミノ酸配列
を含むノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼをコード
する。
を含むノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼをコード
する。
【００１９】好適な実施態様では、本発明のＤＮＡ配列
は、配列表の配列番号１の１位のＡから１１６４位のＣ
まででなる塩基配列を有する。
は、配列表の配列番号１の１位のＡから１１６４位のＣ
まででなる塩基配列を有する。
【００２０】本発明の発現ベクターは、上記ＤＮＡ配列
を有する。
を有する。
【００２１】本発明の形質転換体は、上記発現ベクター
を宿主に導入して得られる。
を宿主に導入して得られる。
【００２２】好適な実施態様によれば、上記宿主は、大
腸菌である。
腸菌である。
【００２３】本発明のノルボルナン型エステル・ヒドロ
ラーゼを製造する方法は、上記の形質転換体を培養する
工程、および生産されたノルボルナン型エステル・ヒド
ロラーゼを培養液から回収する工程を包含する。
ラーゼを製造する方法は、上記の形質転換体を培養する
工程、および生産されたノルボルナン型エステル・ヒド
ロラーゼを培養液から回収する工程を包含する。
【００２４】本発明の光学活性ノルボルネオールの製造
方法は、式（Ｉ）：
方法は、式（Ｉ）：
【００２５】
【化６】
【００２６】（式中、Ｒはアシル基を、ＡおよびＢはそ
れぞれ独立して水素を表すかまたは一緒になって結合手
を表す）で示される（±）−エクソ−ノルボルナン型エ
ステルに、上記のいずれかに記載のノルボルナン型エス
テル・ヒドロラーゼを接触させる工程を包含する。
れぞれ独立して水素を表すかまたは一緒になって結合手
を表す）で示される（±）−エクソ−ノルボルナン型エ
ステルに、上記のいずれかに記載のノルボルナン型エス
テル・ヒドロラーゼを接触させる工程を包含する。
【００２７】好適な実施態様によれば、上記製造方法で
は、前記式（Ｉ）中のＲがアセチル基であり、かつＡお
よびＢがそれぞれ水素である。
は、前記式（Ｉ）中のＲがアセチル基であり、かつＡお
よびＢがそれぞれ水素である。
【００２８】本発明に使用する（±）−エクソ−ノルボ
ルナン型エステルは、式（Ｉ）で表される。
ルナン型エステルは、式（Ｉ）で表される。
【００２９】
【化７】
【００３０】（式中、Ｒはアシル基を、ＡおよびＢはそ
れぞれ水素を表すかまたは一緒になって結合手を表
す。） 式（Ｉ）において、アシル基は、炭素数が２から１０個
の脂肪族アシル基であり、好ましくは、炭素数２から７
個の脂肪族アシル基、例えば、アセチル、プロピオニ
ル、ブチリル、イソブチリル、ペンタノイル、ヘキサノ
イル、特に好ましくは、ホルミル、アセチル、プロピオ
ニルまたはイソブチリルである。このアシル基はあるい
は炭素数４から１０個のシクロアルキルカルボニル基で
あってもよく、好ましくは、炭素数４から７個のシクロ
アルキルカルボニル基、例えば、シクロプロパンカルボ
ニル、シクロブタンカルボニル、シクロペンタンカルボ
ニル、シクロヘキサンカルボニルである。あるいはアリ
ールカルボニル基であり、好ましくは炭素数７から１１
個のアリールカルボニル基、例えば、ベンゾイル、ｐ−
トルオイル、ナフトイルをあげることができる。
れぞれ水素を表すかまたは一緒になって結合手を表
す。） 式（Ｉ）において、アシル基は、炭素数が２から１０個
の脂肪族アシル基であり、好ましくは、炭素数２から７
個の脂肪族アシル基、例えば、アセチル、プロピオニ
ル、ブチリル、イソブチリル、ペンタノイル、ヘキサノ
イル、特に好ましくは、ホルミル、アセチル、プロピオ
ニルまたはイソブチリルである。このアシル基はあるい
は炭素数４から１０個のシクロアルキルカルボニル基で
あってもよく、好ましくは、炭素数４から７個のシクロ
アルキルカルボニル基、例えば、シクロプロパンカルボ
ニル、シクロブタンカルボニル、シクロペンタンカルボ
ニル、シクロヘキサンカルボニルである。あるいはアリ
ールカルボニル基であり、好ましくは炭素数７から１１
個のアリールカルボニル基、例えば、ベンゾイル、ｐ−
トルオイル、ナフトイルをあげることができる。
【００３１】このような化合物は市販のものが使用され
得、あるいは化学合成によっても簡単に製造され得る。
例えば、ノルボルネンを酸触媒の存在下で適当な有機酸
（例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸等）と反応
させるか、または適当な有機酸のビニルエステルとシク
ロペンタジエンをディールス・アルダー（Diels-Alde
r）反応させることにより、所望の（±）−エクソ−ノ
ルボルナン型エステル（Ｉ）を高収率で得ることができ
る。
得、あるいは化学合成によっても簡単に製造され得る。
例えば、ノルボルネンを酸触媒の存在下で適当な有機酸
（例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸等）と反応
させるか、または適当な有機酸のビニルエステルとシク
ロペンタジエンをディールス・アルダー（Diels-Alde
r）反応させることにより、所望の（±）−エクソ−ノ
ルボルナン型エステル（Ｉ）を高収率で得ることができ
る。
【００３２】本発明のノルボルナン型エステル・ヒドロ
ラーゼは、アセトバクター属菌から生産される。特に好
ましくは、アセトバクター・パスツーリアヌス ATCC 1
2873株により生産される。本菌株は、アメリカンタイプ
カルチャーコレクション（ATCC）から入手できる。
ラーゼは、アセトバクター属菌から生産される。特に好
ましくは、アセトバクター・パスツーリアヌス ATCC 1
2873株により生産される。本菌株は、アメリカンタイプ
カルチャーコレクション（ATCC）から入手できる。
【００３３】（１）培養条件
上記菌株の培地は格別である必要なく、通常の培地が用
いられる。例えば、グルコース、ペプトン、酵母エキ
ス、各種塩類などを含有する培地が用いられる。培養ｐ
Ｈは５〜９、好ましくはｐＨ約７、培養温度は、２５〜
３０℃、好ましくは約２８℃であり、例えば好気的に攪
拌または振盪しながら培養を行う。本発明のノルボルナ
ン型エステル・ヒドロラーゼは、細胞内で産生される。
いられる。例えば、グルコース、ペプトン、酵母エキ
ス、各種塩類などを含有する培地が用いられる。培養ｐ
Ｈは５〜９、好ましくはｐＨ約７、培養温度は、２５〜
３０℃、好ましくは約２８℃であり、例えば好気的に攪
拌または振盪しながら培養を行う。本発明のノルボルナ
ン型エステル・ヒドロラーゼは、細胞内で産生される。
【００３４】（２）酵素の精製法
上記培養物からノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼ
を単離、精製するには、既知の方法が単独あるいは併用
して利用され得る。例えば、培養液を遠心分離し、菌体
を集め、この菌体の細胞を破砕して、さらに遠心分離し
た後、分離上清を粗酵素液として得る。これを適当な手
段で精製することにより、本発明のノルボルナン型エス
テル・ヒドロラーゼが得られる。例えば、上記粗酵素液
をDEAEセファロースクロマトグラフィーで分離した後、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、酵素活性を有
するバンドを単離することにより、本酵素を得る方法も
用いることができる。
を単離、精製するには、既知の方法が単独あるいは併用
して利用され得る。例えば、培養液を遠心分離し、菌体
を集め、この菌体の細胞を破砕して、さらに遠心分離し
た後、分離上清を粗酵素液として得る。これを適当な手
段で精製することにより、本発明のノルボルナン型エス
テル・ヒドロラーゼが得られる。例えば、上記粗酵素液
をDEAEセファロースクロマトグラフィーで分離した後、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、酵素活性を有
するバンドを単離することにより、本酵素を得る方法も
用いることができる。
【００３５】（３）酵素活性測定法
ノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼは、基質として
エクソ−ノルボルナン型エステル以外に、酢酸パラニト
ロフェニルにも作用して、呈色物質パラニトロフェノー
ルを生成する。このパラニトロフェノールは、分光光学
的に測定可能であるため、ノルボルナン型エステル・ヒ
ドロラーゼの簡易な活性測定法として、以下の酢酸パラ
ニトロフェニルを基質とする方法（pNPA法）を用いる。
エクソ−ノルボルナン型エステル以外に、酢酸パラニト
ロフェニルにも作用して、呈色物質パラニトロフェノー
ルを生成する。このパラニトロフェノールは、分光光学
的に測定可能であるため、ノルボルナン型エステル・ヒ
ドロラーゼの簡易な活性測定法として、以下の酢酸パラ
ニトロフェニルを基質とする方法（pNPA法）を用いる。
【００３６】０．０２％パラニトロフェニルおよび５ｍ
Ｍ塩化マグネシウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に酵素液を加えて３ｍｌとし、３０℃にて２０
分間反応させる。酵素反応により遊離する反応液中のパ
ラニトロフェノールの吸光度を400nmにて測定し、定量
する。１分間に１μmoleのパラニトロフェノールを精製
する酵素量を１ユニット（Ｕ）とする。
Ｍ塩化マグネシウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に酵素液を加えて３ｍｌとし、３０℃にて２０
分間反応させる。酵素反応により遊離する反応液中のパ
ラニトロフェノールの吸光度を400nmにて測定し、定量
する。１分間に１μmoleのパラニトロフェノールを精製
する酵素量を１ユニット（Ｕ）とする。
【００３７】（４）酵素の性質
本発明のノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼの酵素
的並びにタンパク化学的性質を以下に示す。
的並びにタンパク化学的性質を以下に示す。
【００３８】作用および基質特異性
各種（±）−エクソ−ノルボルナン型エステル（アシル
基としてホルミル、アセチル、プロピオニル、ノルマル
ブチリル、イソブチリル基）を基質として用い、酵素液
と接触させ、生成物を、等量のクロロホルムで抽出後、
光学分割用カラム（ジェイ・アンド・ダブリュー社製）
を用いたガスクロマトグラフィーによる分析を行ったと
ころ、いずれも（−）−ノルボルネオールが選択的に生
成していた。この結果から、本酵素は、（±）−エクソ
−ノルボルナン型エステルを光学鏡像選択的に加水分解
し、光学活性なノルボルネオールを産生させるノルボル
ナン型エステル・ヒドロラーゼであることが明らかであ
る。例えば、図１に示すように、（±）−エクソ−ノル
ボルニルアセテートのうち（＋）−（１Ｓ，２Ｓ，４
Ｒ）−エクソ−ノルボルニルアセテートは、本酵素によ
り加水分解されて対応する（−）−ノルボルネオールと
なる。得られた（−）−ノルボルネオールは、酸化によ
り（＋）−ｄ−ノルカンファーに変換され得る。残りの
（−）−（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−エクソ−ノルボルニル
アセテートは、アルカリにより加水分解されて対応する
（＋）−ノルボルネオールとなる。得られた（＋）−ノ
ルボルネオールは酸化により（−）−ｄ−ノルカンファ
ーに変換され得る。
基としてホルミル、アセチル、プロピオニル、ノルマル
ブチリル、イソブチリル基）を基質として用い、酵素液
と接触させ、生成物を、等量のクロロホルムで抽出後、
光学分割用カラム（ジェイ・アンド・ダブリュー社製）
を用いたガスクロマトグラフィーによる分析を行ったと
ころ、いずれも（−）−ノルボルネオールが選択的に生
成していた。この結果から、本酵素は、（±）−エクソ
−ノルボルナン型エステルを光学鏡像選択的に加水分解
し、光学活性なノルボルネオールを産生させるノルボル
ナン型エステル・ヒドロラーゼであることが明らかであ
る。例えば、図１に示すように、（±）−エクソ−ノル
ボルニルアセテートのうち（＋）−（１Ｓ，２Ｓ，４
Ｒ）−エクソ−ノルボルニルアセテートは、本酵素によ
り加水分解されて対応する（−）−ノルボルネオールと
なる。得られた（−）−ノルボルネオールは、酸化によ
り（＋）−ｄ−ノルカンファーに変換され得る。残りの
（−）−（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−エクソ−ノルボルニル
アセテートは、アルカリにより加水分解されて対応する
（＋）−ノルボルネオールとなる。得られた（＋）−ノ
ルボルネオールは酸化により（−）−ｄ−ノルカンファ
ーに変換され得る。
【００３９】至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲
基質として酢酸パラニトロフェニルを用い、上記（３）
項に記載の酵素活性測定を各種ｐＨ条件下で行ったとこ
ろ、反応の至適ｐＨは、８付近であることが判った。
項に記載の酵素活性測定を各種ｐＨ条件下で行ったとこ
ろ、反応の至適ｐＨは、８付近であることが判った。
【００４０】次に各種ｐＨ条件下で、本酵素を３０℃に
て１時間保持した後、活性測定法に準じて反応を行い、
残存活性を測定した。その結果、酵素安定ｐＨ範囲は、
約６〜約８であることがわかった。
て１時間保持した後、活性測定法に準じて反応を行い、
残存活性を測定した。その結果、酵素安定ｐＨ範囲は、
約６〜約８であることがわかった。
【００４１】至適温度および温度安定性
本酵素を上記（３）項記載の酵素活性測定を各種温度条
件下で行ったところ、反応の至適温度は５０℃付近であ
ることがわかった。
件下で行ったところ、反応の至適温度は５０℃付近であ
ることがわかった。
【００４２】次に本酵素をリン酸緩衝液中、ｐＨ７．０
にて各種温度条件下で２時間保持した後、活性測定法に
準じて反応を行い、残存活性を測定した。その結果、本
酵素は上記条件において４０℃まで安定であることがわ
かった。
にて各種温度条件下で２時間保持した後、活性測定法に
準じて反応を行い、残存活性を測定した。その結果、本
酵素は上記条件において４０℃まで安定であることがわ
かった。
【００４３】阻害剤の影響
本酵素を、各種阻害剤（５ｍＭ）を含むリン酸緩衝液
中、ｐＨ７．０にて２時間保持した後、活性測定法に準
じて反応を行い、残存活性を測定した。その結果、本酵
素は、フェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭ
ＳＦ）で完全に阻害されることがわかった。
中、ｐＨ７．０にて２時間保持した後、活性測定法に準
じて反応を行い、残存活性を測定した。その結果、本酵
素は、フェニルメチルスルフォニルフルオライド（ＰＭ
ＳＦ）で完全に阻害されることがわかった。
【００４４】分子量
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（第一化学薬品社製グラジエントゲ
ル、分子量マーカー：バイオラッド社製）により分子量
の測定を行った結果、本酵素の分子量は４３ｋＤと算出
された。
ル、分子量マーカー：バイオラッド社製）により分子量
の測定を行った結果、本酵素の分子量は４３ｋＤと算出
された。
【００４５】アミノ酸組成
本酵素をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、セミドライ・ブロ
ッティング装置（ミリポア社製）を用いて、PVDF膜（ミ
リポア社製）に転写した。クマシー・ブリリアントブル
ーで染色後、本酵素のバンドにあたる部分をカミソリで
切取り、ピコタグ・アミノ酸分析装置（ウォーターズ社
製）を用いて、アミノ酸分析を行った。その結果を表１
に示す。表１には、本酵素のＤＮＡ配列（後述）から明
らかとなったアミノ酸配列をもとにして算出したアミノ
酸組成も併せて示す。
ッティング装置（ミリポア社製）を用いて、PVDF膜（ミ
リポア社製）に転写した。クマシー・ブリリアントブル
ーで染色後、本酵素のバンドにあたる部分をカミソリで
切取り、ピコタグ・アミノ酸分析装置（ウォーターズ社
製）を用いて、アミノ酸分析を行った。その結果を表１
に示す。表１には、本酵素のＤＮＡ配列（後述）から明
らかとなったアミノ酸配列をもとにして算出したアミノ
酸組成も併せて示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】（５）ノルボルナン型エステル・ヒドロラ
ーゼをコードするＤＮＡ配列の決定 本発明のノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼをコー
ドするＤＮＡを含むＤＮＡ断片の配列決定方法を以下に
例示する。このＤＮＡ断片の配列は、例えば、アセトバ
クター・パスツーリアヌス（Acetobacter pasteurianu
s）のゲノムＤＮＡを分析することにより、決定され得
る。
ーゼをコードするＤＮＡ配列の決定 本発明のノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼをコー
ドするＤＮＡを含むＤＮＡ断片の配列決定方法を以下に
例示する。このＤＮＡ断片の配列は、例えば、アセトバ
クター・パスツーリアヌス（Acetobacter pasteurianu
s）のゲノムＤＮＡを分析することにより、決定され得
る。
【００４８】（Ａ）ショットガン法によるクローニング
アセトバクター・パスツーリアヌス菌体を集菌後、ＳＤ
Ｓ処理を行い、得られた溶菌液から塩化セシウム−臭化
エチジウム平衡密度勾配超遠心分離により、染色体ＤＮ
Ａを調製し、この染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で切断
する。これを同種の制限酵素で切断処理したベクターＤ
ＮＡに挿入するか、あるいは他の適当な制限酵素で切断
処理したベクターにリンカーを介して挿入することによ
り、組換えプラスミドが構築される。ベクターとして
は、例えばpBR322（宝酒造社製）が用いられる。このよ
うにして構築された組換えプラスミドは、宿主細胞に導
入される。好ましくは、宿主細胞としては大腸菌、特に
大腸菌JM109株ATCC 53323が用いられ得る。組換えプラ
スミドは、例えばHanahanらの方法（J. Mol. Biol.,11
6, 557-580 (1983)）に従って、宿主細胞に導入され
る。
Ｓ処理を行い、得られた溶菌液から塩化セシウム−臭化
エチジウム平衡密度勾配超遠心分離により、染色体ＤＮ
Ａを調製し、この染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で切断
する。これを同種の制限酵素で切断処理したベクターＤ
ＮＡに挿入するか、あるいは他の適当な制限酵素で切断
処理したベクターにリンカーを介して挿入することによ
り、組換えプラスミドが構築される。ベクターとして
は、例えばpBR322（宝酒造社製）が用いられる。このよ
うにして構築された組換えプラスミドは、宿主細胞に導
入される。好ましくは、宿主細胞としては大腸菌、特に
大腸菌JM109株ATCC 53323が用いられ得る。組換えプラ
スミドは、例えばHanahanらの方法（J. Mol. Biol.,11
6, 557-580 (1983)）に従って、宿主細胞に導入され
る。
【００４９】（Ｂ）ノルボルナン型エステル・ヒドロラ
ーゼ遺伝子を有するクローンの選択 得られた形質転換体の中からのノルボルナン型エステル
・ヒドロラーゼ遺伝子を有するクローンの検出は、例え
ば以下のように行われ得る。まず、上記形質転換体を平
板培地上で培養する。生育したコロニーを濾紙に移し取
った後、エステルを加水分解する酵素を検出するための
エステラーゼ検出溶液（０．１％酢酸βナフチル、０．
０２％ファーストブルーBB、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０））を、濾紙に染み込ませる。この方法では、
エステラーゼを産生しているコロニーは、赤紫色の発色
を呈する。このような操作により、赤紫色に発色したコ
ロニーが検出される。
ーゼ遺伝子を有するクローンの選択 得られた形質転換体の中からのノルボルナン型エステル
・ヒドロラーゼ遺伝子を有するクローンの検出は、例え
ば以下のように行われ得る。まず、上記形質転換体を平
板培地上で培養する。生育したコロニーを濾紙に移し取
った後、エステルを加水分解する酵素を検出するための
エステラーゼ検出溶液（０．１％酢酸βナフチル、０．
０２％ファーストブルーBB、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０））を、濾紙に染み込ませる。この方法では、
エステラーゼを産生しているコロニーは、赤紫色の発色
を呈する。このような操作により、赤紫色に発色したコ
ロニーが検出される。
【００５０】これらのコロニーを培養し、１％（±）エ
クソ−ノルボルニルアセテートと反応させて、上記
（４）項に記載した方法で、生成物を光学分割ガスク
ロマトグラフィーにより分析し、（−）−ノルボルネオ
ールを生成したクローンをノルボルナン型エステル・ヒ
ドロラーゼ遺伝子を有するクローンであると判断する。
クソ−ノルボルニルアセテートと反応させて、上記
（４）項に記載した方法で、生成物を光学分割ガスク
ロマトグラフィーにより分析し、（−）−ノルボルネオ
ールを生成したクローンをノルボルナン型エステル・ヒ
ドロラーゼ遺伝子を有するクローンであると判断する。
【００５１】（Ｃ）挿入断片の塩基配列の決定
組換えプラスミドの挿入断片の塩基配列の決定は、例え
ば以下のように行われる。まず、挿入断片を該断片の内
部に存在する制限酵素部位を用いて切断し、それぞれの
ＤＮＡ断片を各々適当なシークエンスベクターにクロー
ニングする。次にクローニングした断片の塩基配列を例
えばSangerらの方法［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,
74, 5463-5467 (1977)］により決定する。これによ
り、断片全体の塩基配列が決定される。
ば以下のように行われる。まず、挿入断片を該断片の内
部に存在する制限酵素部位を用いて切断し、それぞれの
ＤＮＡ断片を各々適当なシークエンスベクターにクロー
ニングする。次にクローニングした断片の塩基配列を例
えばSangerらの方法［Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,
74, 5463-5467 (1977)］により決定する。これによ
り、断片全体の塩基配列が決定される。
【００５２】（６）ノルボルナン型エステル・ヒドロラ
ーゼ遺伝子を有する発現ベクターの構築 本発明のノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼ遺伝子
は、適当なベクター、pUC119、pBR322（宝酒造社製）に
組み込まれて、ノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼ
を発現させるための発現ベクターとされる。
ーゼ遺伝子を有する発現ベクターの構築 本発明のノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼ遺伝子
は、適当なベクター、pUC119、pBR322（宝酒造社製）に
組み込まれて、ノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼ
を発現させるための発現ベクターとされる。
【００５３】（７）形質転換体の作成およびノルボルナ
ン型エステル・ヒドロラーゼの製造 上記発現ベクターを例えば大腸菌、酵母、動物細胞など
の宿主細胞に導入することにより、形質転換体が作成さ
れる。この形質転換体を培養することにより、本発明の
ノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼが産生され得
る。
ン型エステル・ヒドロラーゼの製造 上記発現ベクターを例えば大腸菌、酵母、動物細胞など
の宿主細胞に導入することにより、形質転換体が作成さ
れる。この形質転換体を培養することにより、本発明の
ノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼが産生され得
る。
【００５４】上記の形質転換体を培養し、遠心分離で菌
体を回収し、緩衝液で洗浄する。得られた菌体を例えば
等量の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）に懸濁し、細
胞懸濁液が得られる。
体を回収し、緩衝液で洗浄する。得られた菌体を例えば
等量の０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ7.0）に懸濁し、細
胞懸濁液が得られる。
【００５５】次に、上記細胞懸濁液を例えば、機械的
に、あるいは超音波により細胞を破砕し、遠心分離によ
って、その上澄液を回収し、粗酵素液として利用され得
る。
に、あるいは超音波により細胞を破砕し、遠心分離によ
って、その上澄液を回収し、粗酵素液として利用され得
る。
【００５６】本発明のノルボルナン型エステル・ヒドロ
ラーゼは、種々の方法で精製し得る。例えば以下の方法
が用いられる。
ラーゼは、種々の方法で精製し得る。例えば以下の方法
が用いられる。
【００５７】まず、粗酵素液に硫酸アンモニウムを３０
％飽和になるまで加え、沈澱物を除いた後、さらに硫酸
アンモニウムを７０％飽和にし、ここで沈澱する沈澱物
を回収する。次に、この沈澱物の透析を行い、イオン交
換クロマトグラフィー（DEAEセファロース・ファースト
フロー）、続いて、ゲル濾過（セファクリルS-200）に
かけ、活性画分を集める。最後に調製用ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（マリソル産業社製）を行い、上記
（５）の（Ｂ）項記載の活性染色法により活性を示す部
分を切取り、細かく破砕した後、緩衝液中に溶出させ、
高純度の精製された酵素を得ることができる。
％飽和になるまで加え、沈澱物を除いた後、さらに硫酸
アンモニウムを７０％飽和にし、ここで沈澱する沈澱物
を回収する。次に、この沈澱物の透析を行い、イオン交
換クロマトグラフィー（DEAEセファロース・ファースト
フロー）、続いて、ゲル濾過（セファクリルS-200）に
かけ、活性画分を集める。最後に調製用ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（マリソル産業社製）を行い、上記
（５）の（Ｂ）項記載の活性染色法により活性を示す部
分を切取り、細かく破砕した後、緩衝液中に溶出させ、
高純度の精製された酵素を得ることができる。
【００５８】上記工程で得られる培養液、細胞懸濁液、
粗酵素、精製酵素はいずれも酵素反応に利用され得る。
粗酵素、精製酵素はいずれも酵素反応に利用され得る。
【００５９】（８）（±）−エクソ−ノルボルナン型エ
ステルの光学選択的加水分解 上記（７）項で得られた培養液、細胞懸濁液、粗酵素、
精製酵素を用いて、（±）−エクソ−ノルボルナン型エ
ステルの光学選択的加水分解反応を行う。反応は、例え
ば、（±）−エクソ−ノルボルナン型エステルと上記酵
素とを混合し、３０℃、１０分間行わせる。その後、反
応液にクロロホルムを等量加え、抽出を行い、抽出液を
例えば光学分割用カラム（ジェイ・アンド・ダブリュー
社製）を用いたガスクロマトグラフィーにより分析し、
光学活性なノルボルネオールが産生されていることを確
認する。
ステルの光学選択的加水分解 上記（７）項で得られた培養液、細胞懸濁液、粗酵素、
精製酵素を用いて、（±）−エクソ−ノルボルナン型エ
ステルの光学選択的加水分解反応を行う。反応は、例え
ば、（±）−エクソ−ノルボルナン型エステルと上記酵
素とを混合し、３０℃、１０分間行わせる。その後、反
応液にクロロホルムを等量加え、抽出を行い、抽出液を
例えば光学分割用カラム（ジェイ・アンド・ダブリュー
社製）を用いたガスクロマトグラフィーにより分析し、
光学活性なノルボルネオールが産生されていることを確
認する。
【００６０】
【実施例】本発明を以下の実施例によりさらに説明す
る。
る。
【００６１】〔実施例１〕
（ノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼの分離・精
製） 本発明のノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼは、ア
セトバクター・パスツーリアヌスATCC12873株により産
生され、以下のように分離および精製された。0.5 % グ
ルコース, 1.0 % ペプトン, 1.0 % 酵母エキス、0.5 %
グリセリン、1.0% 炭酸カルシウムの組成からなる培地
（pH 7.0）70 l を 100 l 容量ジャーファーメンターに
仕込み、滅菌後、あらかじめ 0.5 % グルコース、1.0 %
ペプトン、1.0 % 酵母エキス、0.5 % グリセリンの組
成からなる培地（pH 7.0）で前培養したアセトバクター
・パスツーリアヌス（Acetobacter pasteurianus）ATCC
12873 を 4 % になるように植菌した。28゜C で 48 時
間培養後、培養液を遠心分離し、菌体を集めた。0.1 M
リン酸緩衝液（pH 7.0）で２回洗浄後、同緩衝液 1.1 l
に懸濁した。懸濁液を加圧型細胞破砕装置（ゴーリン
コーポレーション社製、マントンゴーリン）による処理
を３回実施し、細胞破砕し、その遠心分離上清を回収し
た。
製） 本発明のノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼは、ア
セトバクター・パスツーリアヌスATCC12873株により産
生され、以下のように分離および精製された。0.5 % グ
ルコース, 1.0 % ペプトン, 1.0 % 酵母エキス、0.5 %
グリセリン、1.0% 炭酸カルシウムの組成からなる培地
（pH 7.0）70 l を 100 l 容量ジャーファーメンターに
仕込み、滅菌後、あらかじめ 0.5 % グルコース、1.0 %
ペプトン、1.0 % 酵母エキス、0.5 % グリセリンの組
成からなる培地（pH 7.0）で前培養したアセトバクター
・パスツーリアヌス（Acetobacter pasteurianus）ATCC
12873 を 4 % になるように植菌した。28゜C で 48 時
間培養後、培養液を遠心分離し、菌体を集めた。0.1 M
リン酸緩衝液（pH 7.0）で２回洗浄後、同緩衝液 1.1 l
に懸濁した。懸濁液を加圧型細胞破砕装置（ゴーリン
コーポレーション社製、マントンゴーリン）による処理
を３回実施し、細胞破砕し、その遠心分離上清を回収し
た。
【００６２】この遠心分離の上清に 30 % 飽和となるよ
うに硫酸アンモニウムを加え、氷浴上で１時間攪拌した
後、遠心分離により上清を分離した。さらに、70 % 飽
和となるように硫酸アンモニウムを加え、氷浴上で１時
間攪拌した後、遠心分離により沈澱部分を集めた。この
沈澱部分を 0.1 Mリン酸緩衝液（pH 7.0）320 ml に溶
解した後、0.01 M 燐酸緩衝液（pH 7.0）を外液とし
て、8 ゜C で一晩透析した。
うに硫酸アンモニウムを加え、氷浴上で１時間攪拌した
後、遠心分離により上清を分離した。さらに、70 % 飽
和となるように硫酸アンモニウムを加え、氷浴上で１時
間攪拌した後、遠心分離により沈澱部分を集めた。この
沈澱部分を 0.1 Mリン酸緩衝液（pH 7.0）320 ml に溶
解した後、0.01 M 燐酸緩衝液（pH 7.0）を外液とし
て、8 ゜C で一晩透析した。
【００６３】透析した後の液に、1リットルの蒸留水を
加えた後、DEAE セファロース・ファーストフロー（フ
ァルマシア社製）250 g を添加し、室温で１時間攪拌し
た。この混合物を、2リットルの0.01 M リン酸緩衝液
（pH 7.0）で洗浄し、カラムに充填した。次に0.3 M 塩
化ナトリウムを含む 0.01 M リン酸緩衝液（pH 7.0）で
活性画分を溶出させた。限外濾過装置（東ソー社製）を
用いてこの溶出された画分を濃縮した後、濃縮液を、あ
らかじめ 50 mM トリス塩酸緩衝液で平衡化しておいた
セファクリル S-200（ファルマシア社製）を充填したカ
ラムに注入し、50mMトリス塩酸緩衝液で溶出した。溶出
された活性画分を集め、限外濾過により濃縮した。
加えた後、DEAE セファロース・ファーストフロー（フ
ァルマシア社製）250 g を添加し、室温で１時間攪拌し
た。この混合物を、2リットルの0.01 M リン酸緩衝液
（pH 7.0）で洗浄し、カラムに充填した。次に0.3 M 塩
化ナトリウムを含む 0.01 M リン酸緩衝液（pH 7.0）で
活性画分を溶出させた。限外濾過装置（東ソー社製）を
用いてこの溶出された画分を濃縮した後、濃縮液を、あ
らかじめ 50 mM トリス塩酸緩衝液で平衡化しておいた
セファクリル S-200（ファルマシア社製）を充填したカ
ラムに注入し、50mMトリス塩酸緩衝液で溶出した。溶出
された活性画分を集め、限外濾過により濃縮した。
【００６４】次に濃縮液を 10 % ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（マリソル産業社製）に供した。泳動終了
後、ゲルを Higerd と Spizizen の方法〔J. Bacterio
l. 114,1184-1192（1973）〕によるエステラーゼ活性染
色法に供した。すなわち、10 mg 酢酸βナフチルおよび
10 mg ファーストブルー RR を含む 20 ml の 0.1 Mリ
ン酸緩衝液（pH 7.0）にゲルを浸し、赤紫色の呈色によ
り活性部分を検出した。呈色した部分をゲルから切り取
り、細かく破砕した後、100 ml の 0.1 M トリス塩酸緩
衝液中に、4 ゜C、一晩浸漬し、活性を有するタンパク質
を溶出させた。この操作を 10 回繰り返し、得られた溶
出液 1リットルを限外濾過により 10 mlにまで濃縮し
た。
ル電気泳動（マリソル産業社製）に供した。泳動終了
後、ゲルを Higerd と Spizizen の方法〔J. Bacterio
l. 114,1184-1192（1973）〕によるエステラーゼ活性染
色法に供した。すなわち、10 mg 酢酸βナフチルおよび
10 mg ファーストブルー RR を含む 20 ml の 0.1 Mリ
ン酸緩衝液（pH 7.0）にゲルを浸し、赤紫色の呈色によ
り活性部分を検出した。呈色した部分をゲルから切り取
り、細かく破砕した後、100 ml の 0.1 M トリス塩酸緩
衝液中に、4 ゜C、一晩浸漬し、活性を有するタンパク質
を溶出させた。この操作を 10 回繰り返し、得られた溶
出液 1リットルを限外濾過により 10 mlにまで濃縮し
た。
【００６５】〔実施例２〕
（ノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼの活性測定お
よび酵素の性質） ノルボルナン型エステル・ヒドロラ
ーゼは基質として（±）エクソ−ノルボルナン型エステ
ル以外に酢酸パラニトロフェニルにも作用して、呈色物
質パラニトロフェノールを生成する。パラニトロフェノ
ールは分光光学的に測定可能であるため、ノルボルナン
型エステル・ヒドロラーゼの簡易活性測定法として、酢
酸パラニトロフェニルを基質とする方法（pNPA法）を用
いた。反応は、0.02 % 酢酸パラニトロフェニル、5 mM
塩化マグネシウムを含む 0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.
0）および実施例１で得られた酵素液からなる反応液3 m
l 中で、30 ゜C で行い、分光光度計を用いて、400 nmの
吸光度を測定することにより、遊離パラニトロフェノー
ルを定量した。１分間に 1 μmole のパラニトロフェノ
ールを生成する酵素量を１ユニット（U）と定めた。そ
の結果、実施例１で精製された酵素の活性は 38.7 U/ml
であった。さらに、タンパク質量を蛋白測定キット
（バイオラッド社製）により測定したところ、0.25 mg/
ml であった。
よび酵素の性質） ノルボルナン型エステル・ヒドロラ
ーゼは基質として（±）エクソ−ノルボルナン型エステ
ル以外に酢酸パラニトロフェニルにも作用して、呈色物
質パラニトロフェノールを生成する。パラニトロフェノ
ールは分光光学的に測定可能であるため、ノルボルナン
型エステル・ヒドロラーゼの簡易活性測定法として、酢
酸パラニトロフェニルを基質とする方法（pNPA法）を用
いた。反応は、0.02 % 酢酸パラニトロフェニル、5 mM
塩化マグネシウムを含む 0.1 M リン酸緩衝液（pH 7.
0）および実施例１で得られた酵素液からなる反応液3 m
l 中で、30 ゜C で行い、分光光度計を用いて、400 nmの
吸光度を測定することにより、遊離パラニトロフェノー
ルを定量した。１分間に 1 μmole のパラニトロフェノ
ールを生成する酵素量を１ユニット（U）と定めた。そ
の結果、実施例１で精製された酵素の活性は 38.7 U/ml
であった。さらに、タンパク質量を蛋白測定キット
（バイオラッド社製）により測定したところ、0.25 mg/
ml であった。
【００６６】次に、得られた精製酵素を、Laemmliの方
法〔Nature, 227, 680-685（1970）〕に従い、SDS ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）（第一化学薬
品社製グラジエントゲル、分子量マーカー：バイオラッ
ド社製）で分析したところ、分子量 43 kD の位置にメ
インバンドが認められた。さらに、分子量測定用カラム
（ウォーターズ社製、PROTEINPAK-300）によるHPLC分析
（オリエンタル酵母社製、HPLC用分子量マーカーを使
用）でも、43 kD の位置に活性が溶出されることから、
ノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼは、単量体で存
在していると推定された。
法〔Nature, 227, 680-685（1970）〕に従い、SDS ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）（第一化学薬
品社製グラジエントゲル、分子量マーカー：バイオラッ
ド社製）で分析したところ、分子量 43 kD の位置にメ
インバンドが認められた。さらに、分子量測定用カラム
（ウォーターズ社製、PROTEINPAK-300）によるHPLC分析
（オリエンタル酵母社製、HPLC用分子量マーカーを使
用）でも、43 kD の位置に活性が溶出されることから、
ノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼは、単量体で存
在していると推定された。
【００６７】この酵素の主な性状を調べたところ、以下
のようであった。
のようであった。
【００６８】（１）反応至適温度および反応至適ｐＨ
基質として酢酸パラニトロフェニルを用い、実施例２に
記載の酵素活性測定を各種ｐＨ条件下で行ったところ、
反応の至適ｐＨは、８付近であった。また、実施例２に
記載の酵素活性測定を各種温度条件下で行ったところ、
反応の至適温度は、５０℃付近であることがわかった。
記載の酵素活性測定を各種ｐＨ条件下で行ったところ、
反応の至適ｐＨは、８付近であった。また、実施例２に
記載の酵素活性測定を各種温度条件下で行ったところ、
反応の至適温度は、５０℃付近であることがわかった。
【００６９】（２）耐熱性、酵素安定pH
０．１Ｍリン酸緩衝液（pH７．０）を含む酵素液１ｍｌ
を各種温度条件下で２時間保持した後、実施例２記載の
活性測定法に準じて反応を行い、残存活性を測定した。
その結果、本酵素は上記条件において４０℃まで安定で
あることがわかった。また、各種ｐＨに調整した緩衝液
（０．１Ｍ）を含む酵素液１ｍｌを３０℃にて１時間保
持した後、実施例２記載の活性測定法に準じて反応を行
い、残存活性を測定した。その結果、本酵素はｐＨ６〜
８で安定であることがわかった。 （３）阻害剤の影響 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、各種阻害剤
（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、フェニルメチ
ルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、Ｎ−トシル
−Ｌ−フェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣ
Ｋ）、Ｎ−トシル−Ｌ−リシルクロロメチルケトン（Ｔ
ＬＣＫ）、ジイソプロピルフルオロフォスフェート（Ｄ
ＦＰ）、Ｎ−エチルマレイミド、ヨード酢酸；各５ｍ
Ｍ）を含む酵素液０．５ｍｌを３０℃で２時間保持した
後、実施例２記載の活性測定法に準じて反応を行い、残
存活性を測定した。その結果、本酵素はＰＭＳＦで完全
に活性が阻害されることがわかった。
を各種温度条件下で２時間保持した後、実施例２記載の
活性測定法に準じて反応を行い、残存活性を測定した。
その結果、本酵素は上記条件において４０℃まで安定で
あることがわかった。また、各種ｐＨに調整した緩衝液
（０．１Ｍ）を含む酵素液１ｍｌを３０℃にて１時間保
持した後、実施例２記載の活性測定法に準じて反応を行
い、残存活性を測定した。その結果、本酵素はｐＨ６〜
８で安定であることがわかった。 （３）阻害剤の影響 ０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、各種阻害剤
（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、フェニルメチ
ルスルフォニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、Ｎ−トシル
−Ｌ−フェニルアラニルクロロメチルケトン（ＴＰＣ
Ｋ）、Ｎ−トシル−Ｌ−リシルクロロメチルケトン（Ｔ
ＬＣＫ）、ジイソプロピルフルオロフォスフェート（Ｄ
ＦＰ）、Ｎ−エチルマレイミド、ヨード酢酸；各５ｍ
Ｍ）を含む酵素液０．５ｍｌを３０℃で２時間保持した
後、実施例２記載の活性測定法に準じて反応を行い、残
存活性を測定した。その結果、本酵素はＰＭＳＦで完全
に活性が阻害されることがわかった。
【００７０】（４）溶媒中での酵素安定性
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に３０％濃度の
各種溶媒（エタノール、メタノール、アセトニトリル、
アセトン、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド、１，４−ジオキサン、酢酸
エチル、トリクロロメタン）を含む酵素液０．２ｍｌを
３０℃で１時間保持した後、実施例２記載の活性測定法
に準じて反応を行い、残存活性を測定した。その結果、
本酵素は３０％メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチルに対
して８０％以上の残存活性を有していた。
各種溶媒（エタノール、メタノール、アセトニトリル、
アセトン、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，
Ｎ−ジメチルホルムアミド、１，４−ジオキサン、酢酸
エチル、トリクロロメタン）を含む酵素液０．２ｍｌを
３０℃で１時間保持した後、実施例２記載の活性測定法
に準じて反応を行い、残存活性を測定した。その結果、
本酵素は３０％メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチルに対
して８０％以上の残存活性を有していた。
【００７１】（５）ノルボルナン型エステルに対する光
学選択的加水分解 １％の各種（±）−エクソ−ノルボルナン型エステル
（アシル基としてホルミル、アセチル、プロピオニル、
ノルマルブチリル、イソブチリル基）を基質として上記
工程で得た精製酵素と接触させ、３０℃、３０分反応さ
せた後、等量のクロロホルムで抽出を行い、光学分割用
カラム（ジェイ・アンド・ダブリュー社製）を用いたガ
スクロマトグラフィーにより分析したところ、表２に示
すようにいずれも（−）−ノルボルネオールが鏡像選択
的に生成していた。
学選択的加水分解 １％の各種（±）−エクソ−ノルボルナン型エステル
（アシル基としてホルミル、アセチル、プロピオニル、
ノルマルブチリル、イソブチリル基）を基質として上記
工程で得た精製酵素と接触させ、３０℃、３０分反応さ
せた後、等量のクロロホルムで抽出を行い、光学分割用
カラム（ジェイ・アンド・ダブリュー社製）を用いたガ
スクロマトグラフィーにより分析したところ、表２に示
すようにいずれも（−）−ノルボルネオールが鏡像選択
的に生成していた。
【００７２】
【表２】
【００７３】〔実施例３〕
（アセトバクター・パスツーリアヌス（Acetobacter pa
steurianus）からのノルボルナン型エステル・ヒドロラ
ーゼ遺伝子のクローニング） （１）ショットガン法によるクローニング アセトバクター・パスツーリアヌス（Acetobacter past
eurianus）菌体を集菌後、1 % SDS 処理を行い、得られ
た溶菌液から塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾
配超遠心分離により、染色体DNAを抽出・精製した。得
られたDNA10 μgに対し制限酵素 BamHIを約100ユニット
加え、37 ゜C で 120分間反応させた。70゜C、5 分間イン
キュベートし、制限酵素を失活させた後、エタノール沈
澱を行い、DNAを回収した。このBamHI消化 DNA を10 μ
l の TE 緩衝液（10 mM トリス塩酸、1 mM EDTA、pH 8.
0）に溶解した。
steurianus）からのノルボルナン型エステル・ヒドロラ
ーゼ遺伝子のクローニング） （１）ショットガン法によるクローニング アセトバクター・パスツーリアヌス（Acetobacter past
eurianus）菌体を集菌後、1 % SDS 処理を行い、得られ
た溶菌液から塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾
配超遠心分離により、染色体DNAを抽出・精製した。得
られたDNA10 μgに対し制限酵素 BamHIを約100ユニット
加え、37 ゜C で 120分間反応させた。70゜C、5 分間イン
キュベートし、制限酵素を失活させた後、エタノール沈
澱を行い、DNAを回収した。このBamHI消化 DNA を10 μ
l の TE 緩衝液（10 mM トリス塩酸、1 mM EDTA、pH 8.
0）に溶解した。
【００７４】クローニングベクターとしては、pBR322
（宝酒造社製）を使用した。5 μg のpBR322 に対し制
限酵素 BamHI 約 50 ユニットを加え、37 ゜C で 2 時間
反応させた。DNA をエタノール沈澱させた後、緩衝液
（50 mM トリス塩酸、1 mM 塩化マグネシウム、pH 8.
0）に溶解し、アルカリフォスファターゼ（BAP）約 20
ユニットを加え、37 ゜C、1 時間反応させた。反応液を
等量のフェノール溶液で抽出し、得られた水層にエタノ
ールを添加し、DNA を沈澱させ回収し、10 μl のTE 緩
衝液に溶解した。
（宝酒造社製）を使用した。5 μg のpBR322 に対し制
限酵素 BamHI 約 50 ユニットを加え、37 ゜C で 2 時間
反応させた。DNA をエタノール沈澱させた後、緩衝液
（50 mM トリス塩酸、1 mM 塩化マグネシウム、pH 8.
0）に溶解し、アルカリフォスファターゼ（BAP）約 20
ユニットを加え、37 ゜C、1 時間反応させた。反応液を
等量のフェノール溶液で抽出し、得られた水層にエタノ
ールを添加し、DNA を沈澱させ回収し、10 μl のTE 緩
衝液に溶解した。
【００７５】上記のアセトバクター・パスツーリアヌス
（Acetobacter pasteurianus）染色体のBamHI切断断片
を含む溶液5 μlとベクター pBR322のBamHI-BAP処理溶
液 1μlを混合して、市販のキット（宝酒造、DNA ライ
ゲーションキット）により連結させ、組換えDNAを作成
した。この組換えDNAを用いて、Hanahanらの方法〔J.Mo
l. Biol., 166, 557-580（1983）〕に従い、大腸菌JM10
9 ATCC 53323 を形質転換した。次にアンピシリン 50
μg/ml を含むＬ寒天培地〔1 % バクトトリプトン、0.5
% 酵母エキス、0.5 % 塩化ナトリウム（pH 7.3）1.8%
寒天〕上にコロニーを形成させた。
（Acetobacter pasteurianus）染色体のBamHI切断断片
を含む溶液5 μlとベクター pBR322のBamHI-BAP処理溶
液 1μlを混合して、市販のキット（宝酒造、DNA ライ
ゲーションキット）により連結させ、組換えDNAを作成
した。この組換えDNAを用いて、Hanahanらの方法〔J.Mo
l. Biol., 166, 557-580（1983）〕に従い、大腸菌JM10
9 ATCC 53323 を形質転換した。次にアンピシリン 50
μg/ml を含むＬ寒天培地〔1 % バクトトリプトン、0.5
% 酵母エキス、0.5 % 塩化ナトリウム（pH 7.3）1.8%
寒天〕上にコロニーを形成させた。
【００７６】（２）クローンの選択
上記（１）項で得たコロニーからエステラーゼ活性を有
するコロニーを得るため、実施例１に記載の活性染色法
を用いた。すなわち、Ｌ寒天培地上に形成させたコロニ
ーを濾紙に移し取った後、エステラーゼ検出溶液〔0.1
% 酢酸βナフチル、0.02 % ファーストブルーBB、50 mM
リン酸緩衝液（pH 7.0）〕を濾紙に染み込ませ、エステ
ラーゼ活性を持つ赤紫色の発色コロニーを得た。この操
作により、約7800個のコロニーから、17個の赤紫色に発
色したコロニーが検出され、単離された。
するコロニーを得るため、実施例１に記載の活性染色法
を用いた。すなわち、Ｌ寒天培地上に形成させたコロニ
ーを濾紙に移し取った後、エステラーゼ検出溶液〔0.1
% 酢酸βナフチル、0.02 % ファーストブルーBB、50 mM
リン酸緩衝液（pH 7.0）〕を濾紙に染み込ませ、エステ
ラーゼ活性を持つ赤紫色の発色コロニーを得た。この操
作により、約7800個のコロニーから、17個の赤紫色に発
色したコロニーが検出され、単離された。
【００７７】これらのコロニーをアンピシリン50μg/ml
を含むＬブロス5 mlを用いて一晩培養し、1 % エクソ−
ノルボルニルアセテートと反応させたところ、ノルボル
ネオールを生成したので、これらがノルボルナン型エス
テル・ヒドロラーゼ遺伝子を有するクローンであること
が判った。
を含むＬブロス5 mlを用いて一晩培養し、1 % エクソ−
ノルボルニルアセテートと反応させたところ、ノルボル
ネオールを生成したので、これらがノルボルナン型エス
テル・ヒドロラーゼ遺伝子を有するクローンであること
が判った。
【００７８】これらの培養液からプラスミドを調製〔Bi
rnboim らの方法：Nucleic AcidsRes., 7, 1513-1523
（1979）〕し、制限酵素（BamHI、EcoRI、HindIII、Pst
I）で切断し、アガロースゲル電気泳動で組換えプラス
ミドを分析した結果、すべて4.5 kb の断片が同じ方向
で挿入されていることがわかった。これらのうち一つを
選び、pBNA21と命名した。
rnboim らの方法：Nucleic AcidsRes., 7, 1513-1523
（1979）〕し、制限酵素（BamHI、EcoRI、HindIII、Pst
I）で切断し、アガロースゲル電気泳動で組換えプラス
ミドを分析した結果、すべて4.5 kb の断片が同じ方向
で挿入されていることがわかった。これらのうち一つを
選び、pBNA21と命名した。
【００７９】（３）プラスミドの制限酵素地図の作製と
プラスミドの小型化 組換えプラスミド pBNA21 を各種制限酵素で切断し、制
限酵素地図を作製した。図２に pBNA21 の制限酵素地図
を示した。ここで、図中の略字は、以下の制限酵素部位
を示す。E：EcoRI、H：HindIII、EV：EcoRV、B：BamH
I、P：PstI、Nc：NcoI、Af：AflII、S：SalI。
プラスミドの小型化 組換えプラスミド pBNA21 を各種制限酵素で切断し、制
限酵素地図を作製した。図２に pBNA21 の制限酵素地図
を示した。ここで、図中の略字は、以下の制限酵素部位
を示す。E：EcoRI、H：HindIII、EV：EcoRV、B：BamH
I、P：PstI、Nc：NcoI、Af：AflII、S：SalI。
【００８０】さらにノルボルナン型エステル・ヒドロラ
ーゼをコードする遺伝子の位置を決定するために、BamH
I、HindIII、AflII、NcoI、SalI を用いて、4.5 kb 外
来DNA断片の欠失、およびフレームシフト変異を作製
し、上記（２）項に記載のエスキラーゼ活性検出法によ
りノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼ活性の有無を
調べた。その結果、2.4 kb の AflII-SalI 断片を欠失
させたプラスミドのみが活性を失うことが判明した。こ
の結果より、本発明のノルボルナン型エステル・ヒドロ
ラーゼ遺伝子は 2.4 kb の AflII- SalI 断片のうちベ
クター由来の 0.3 kbBamHI-SalI 間を除いた 2.1 kb Af
lII-BamHI 間に存在することがわかった。
ーゼをコードする遺伝子の位置を決定するために、BamH
I、HindIII、AflII、NcoI、SalI を用いて、4.5 kb 外
来DNA断片の欠失、およびフレームシフト変異を作製
し、上記（２）項に記載のエスキラーゼ活性検出法によ
りノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼ活性の有無を
調べた。その結果、2.4 kb の AflII-SalI 断片を欠失
させたプラスミドのみが活性を失うことが判明した。こ
の結果より、本発明のノルボルナン型エステル・ヒドロ
ラーゼ遺伝子は 2.4 kb の AflII- SalI 断片のうちベ
クター由来の 0.3 kbBamHI-SalI 間を除いた 2.1 kb Af
lII-BamHI 間に存在することがわかった。
【００８１】そこで、pBNA21 を AflII で切断後、T4 D
NA ポリメラーゼにより平滑末端化し、次いで BamHI で
切断した。この DNA 溶液をアガロース・ゲル電気泳動
にかけた後、市販のキット（BIO101 社製、GENECLEAN）
を用いて 2.1 kb の DNA 断片を抽出した。
NA ポリメラーゼにより平滑末端化し、次いで BamHI で
切断した。この DNA 溶液をアガロース・ゲル電気泳動
にかけた後、市販のキット（BIO101 社製、GENECLEAN）
を用いて 2.1 kb の DNA 断片を抽出した。
【００８２】一方、ベクターpUC119（宝酒造社製）を、
lacZ遺伝子内のマルチクローニングサイトにある BamH
I、HincII部位で切断し、上記で得られた 2.1 kb DNA
断片をpUC119のlacプロモーターと同じ向きになるよう
に連結させた。なお、HincII部位と平滑化した AflII
部位との連結により、AflII 部位が再生した。得られた
DNA 溶液を用いて大腸菌JM109 を形質転換し、ノルボル
ナン型エステル・ヒドロラーゼ活性を持つコロニーを得
た。この操作により、得られた組換えプラスミドを pUN
A221（図３）と命名した。
lacZ遺伝子内のマルチクローニングサイトにある BamH
I、HincII部位で切断し、上記で得られた 2.1 kb DNA
断片をpUC119のlacプロモーターと同じ向きになるよう
に連結させた。なお、HincII部位と平滑化した AflII
部位との連結により、AflII 部位が再生した。得られた
DNA 溶液を用いて大腸菌JM109 を形質転換し、ノルボル
ナン型エステル・ヒドロラーゼ活性を持つコロニーを得
た。この操作により、得られた組換えプラスミドを pUN
A221（図３）と命名した。
【００８３】〔実施例４〕
（ノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼ遺伝子の塩基
配列決定、およびノルボルナン型エステル・ヒドロラー
ゼ構造遺伝子の同定）上記実施例３で得た、組換えプラ
スミドpUNA221中の2.1 kb AflII-BamHI 断片のＤＮＡ塩
基配列を、Sangerらの方法〔Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 74, 5463-5467（1977）〕に従って決定した。
その結果、翻訳開始コドン ATG の規定するメチオニン
を含む、388 個のアミノ酸残基からなるタンパク質をコ
ードするオープンリーディングフレーム（ORF）が存在
することが判明した。
配列決定、およびノルボルナン型エステル・ヒドロラー
ゼ構造遺伝子の同定）上記実施例３で得た、組換えプラ
スミドpUNA221中の2.1 kb AflII-BamHI 断片のＤＮＡ塩
基配列を、Sangerらの方法〔Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 74, 5463-5467（1977）〕に従って決定した。
その結果、翻訳開始コドン ATG の規定するメチオニン
を含む、388 個のアミノ酸残基からなるタンパク質をコ
ードするオープンリーディングフレーム（ORF）が存在
することが判明した。
【００８４】さらに制限酵素 HinfI を用いて、上記の
2.1kb断片を切断し、ノルボルナン型エステル・ヒドロ
ラーゼをコードすると思われる上記ORFを含む1.5 kb の
断片を抽出し、pUC119 の Hinc II 部位にlac プロモー
ターと同じ向きになるように挿入してプラスミドpUNA−
Hfを作製した。
2.1kb断片を切断し、ノルボルナン型エステル・ヒドロ
ラーゼをコードすると思われる上記ORFを含む1.5 kb の
断片を抽出し、pUC119 の Hinc II 部位にlac プロモー
ターと同じ向きになるように挿入してプラスミドpUNA−
Hfを作製した。
【００８５】このプラスミドで大腸菌JM109株を形質転
換し、得られた形質転換体を実施例３の（２）項記載の
方法によりエステラーゼ活性を調べるとコロニーが赤紫
色に発色し、エステラーゼ活性を持つことが確認され
た。次にこの形質転換体を１％（±）−エクソ−ノルボ
ルニルアセテートと３０℃、１０分間反応させた後、実
施例２の（５）項に記載の方法で生成物を調べたとこ
ろ、（−）−エクソ−ノルボルネオールが１．６８ｍｇ
／ｍｌ、（＋）−エクソ−ノルボルネオールが０．１５
ｍｇ／ｍｌ生成していることがわかり、実施例１で得ら
れたアセトバクター・パスツーリアヌス由来の酵素と同
等の光学選択性を有することが確認された。
換し、得られた形質転換体を実施例３の（２）項記載の
方法によりエステラーゼ活性を調べるとコロニーが赤紫
色に発色し、エステラーゼ活性を持つことが確認され
た。次にこの形質転換体を１％（±）−エクソ−ノルボ
ルニルアセテートと３０℃、１０分間反応させた後、実
施例２の（５）項に記載の方法で生成物を調べたとこ
ろ、（−）−エクソ−ノルボルネオールが１．６８ｍｇ
／ｍｌ、（＋）−エクソ−ノルボルネオールが０．１５
ｍｇ／ｍｌ生成していることがわかり、実施例１で得ら
れたアセトバクター・パスツーリアヌス由来の酵素と同
等の光学選択性を有することが確認された。
【００８６】〔実施例５〕
（大腸菌におけるノルボルナン型エステル・ヒドロラー
ゼの発現） （１）ノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼの発現 実施例４に記載のプラスミドpUNA-Hfを大腸菌JM103 ATC
C 39403中に導入し、形質転換体JM103/pUNA-Hfを作成し
た。
ゼの発現） （１）ノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼの発現 実施例４に記載のプラスミドpUNA-Hfを大腸菌JM103 ATC
C 39403中に導入し、形質転換体JM103/pUNA-Hfを作成し
た。
【００８７】アンピシリン 50 μg/ml を含むＬブロス
50 ml（500 ml 容フラスコ）に、あらかじめこの培地で
前培養しておいたJM103／pUNA-Hfを、1 % 植菌し、37 ゜
C で振盪培養した。OD660＝0.2 の時に 1 mM IPTG（イ
ソプロピル-β-D-ガラクトピラノサイド）を添加した。
そのまま培養を続け、６時間後に培養液を採取し、一晩
凍結後融解し、活性測定の試料とした。pNPA 法により
活性を求めたところ、培養液あたり 68 U/ml であっ
た。対照として pUC119 のみを保持する株も上記と同様
に培養し、活性を求めたところ、0.2 U/ml であった。
50 ml（500 ml 容フラスコ）に、あらかじめこの培地で
前培養しておいたJM103／pUNA-Hfを、1 % 植菌し、37 ゜
C で振盪培養した。OD660＝0.2 の時に 1 mM IPTG（イ
ソプロピル-β-D-ガラクトピラノサイド）を添加した。
そのまま培養を続け、６時間後に培養液を採取し、一晩
凍結後融解し、活性測定の試料とした。pNPA 法により
活性を求めたところ、培養液あたり 68 U/ml であっ
た。対照として pUC119 のみを保持する株も上記と同様
に培養し、活性を求めたところ、0.2 U/ml であった。
【００８８】（２）エクソ−ノルボルニルアセテートの
光学選択的脱アセチル化 基質として（±）−エクソ−ノルボルニルアセテートを
用い、プラスミドpUNA-Hfを保持する大腸菌JM103 によ
る光学選択的脱アセチル化反応を行った。反応は、上記
方法により増殖させた大腸菌JM103／pUNA-Hfの培養液を
遠心分離により集菌後、等量の0.1 M リン酸緩衝液（pH
7.0）に懸濁し、この懸濁液1.5 mlに1%（±）−エクソ
−ノルボルニルアセテートを添加し、30 ゜Cで15分間反
応させた。この反応液を実施例２の（５）項に記載の方
法で分析したところ、（-）−エクソ−ノルボルネオー
ルを1.91 mg/ml、（+）−エクソ−ノルボルネオールを
0.15 mg/ml含むことが判った。
光学選択的脱アセチル化 基質として（±）−エクソ−ノルボルニルアセテートを
用い、プラスミドpUNA-Hfを保持する大腸菌JM103 によ
る光学選択的脱アセチル化反応を行った。反応は、上記
方法により増殖させた大腸菌JM103／pUNA-Hfの培養液を
遠心分離により集菌後、等量の0.1 M リン酸緩衝液（pH
7.0）に懸濁し、この懸濁液1.5 mlに1%（±）−エクソ
−ノルボルニルアセテートを添加し、30 ゜Cで15分間反
応させた。この反応液を実施例２の（５）項に記載の方
法で分析したところ、（-）−エクソ−ノルボルネオー
ルを1.91 mg/ml、（+）−エクソ−ノルボルネオールを
0.15 mg/ml含むことが判った。
【００８９】
【発明の効果】本発明によれば、このように、（±）−
エクソ−ノルボルナン型エステルを選択的に加水分解
し、光学活性なノルボルネオールを産生させる、ノルボ
ルナン型エステル・ヒドロラーゼ、アセトバクター・パ
スツーリアヌス由来のノルボルナン型エステル・ヒドロ
ラーゼ構造遺伝子、該遺伝子を有する発現ベクター、該
発現ベクターを有する形質転換体、および該形質転換体
を用いたノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼの製造
方法が提供される。
エクソ−ノルボルナン型エステルを選択的に加水分解
し、光学活性なノルボルネオールを産生させる、ノルボ
ルナン型エステル・ヒドロラーゼ、アセトバクター・パ
スツーリアヌス由来のノルボルナン型エステル・ヒドロ
ラーゼ構造遺伝子、該遺伝子を有する発現ベクター、該
発現ベクターを有する形質転換体、および該形質転換体
を用いたノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼの製造
方法が提供される。
【００９０】本発明のノルボルナン型エステル・ヒドロ
ラーゼによって得られる光学活性なノルボルネオールの
利用方法を以下の参考例に示す。
ラーゼによって得られる光学活性なノルボルネオールの
利用方法を以下の参考例に示す。
【００９１】参考例１
実施例１で得た酵素を用い、実施例２（５）項の方法に
従って（−）−（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）−エクソ−ノルボ
ルネオールを得た。この（−）−（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）
−エクソーノルボルネオール２．８ｇ（０．０２５モ
ル）を塩化メチレン５６ｍｌに溶解し、ピリジニウムク
ロロクロメイト（ＰＰＣ）８．１ｇ（１．５モル比）モ
レキュラシーブ４Ａ１ｇを加え２５〜３０℃で１時間反
応した。反応液をトルエン５６ｍｌで希釈後、シリカゲ
ル２８ｇのカラム中を通し不溶物を除去する。流出液を
濃縮乾固すると粗製の（＋）−ノルカンファーが白色の
結晶製粉末として得られる。得られた（＋）−ノルカン
ファーをテトラヒドロフラン４５ｍｌに溶解し、リチウ
ムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）（１．１モル比）の
テトラヒドロフラン３０ｍｌ溶液中に−１０〜−１５℃
で滴下する。同温度で２０分間反応後、アリルブロマイ
ド３．３ｇ（１．１モル比）を０℃以下で滴下し、室温
で３時間反応する。反応液を氷水７０ｍｌ中に流入し、
希塩酸水で酸性にした後、トルエン５０ｍｌで２回抽出
を行う。トルエン層を水洗後、溶媒を減圧下留去すると
粗製の（＋）−エクソ−３−（２−プロペニル）−ビジ
クロ［２，２．１］ヘプタン−２−オンが油状残渣とし
て得られる。これを減圧蒸留にて、沸点範囲９２〜１０
３℃／１０〜１２ｍｍＨｇの留分を集めることにより、
精製した。収量３．０７ｇ（収率８２％）、化学純度
（ＧＣ）９８．６％、エンド異性体０．４％、光学純度
（ＨＰＬＣ）９０％ｅｅ、比旋光度［α］25Ｄ＋８４．
６°（Ｃ＝１．０、ＣＨＣｌ3）。
従って（−）−（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）−エクソ−ノルボ
ルネオールを得た。この（−）−（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）
−エクソーノルボルネオール２．８ｇ（０．０２５モ
ル）を塩化メチレン５６ｍｌに溶解し、ピリジニウムク
ロロクロメイト（ＰＰＣ）８．１ｇ（１．５モル比）モ
レキュラシーブ４Ａ１ｇを加え２５〜３０℃で１時間反
応した。反応液をトルエン５６ｍｌで希釈後、シリカゲ
ル２８ｇのカラム中を通し不溶物を除去する。流出液を
濃縮乾固すると粗製の（＋）−ノルカンファーが白色の
結晶製粉末として得られる。得られた（＋）−ノルカン
ファーをテトラヒドロフラン４５ｍｌに溶解し、リチウ
ムジイソプロピルアミド（ＬＤＡ）（１．１モル比）の
テトラヒドロフラン３０ｍｌ溶液中に−１０〜−１５℃
で滴下する。同温度で２０分間反応後、アリルブロマイ
ド３．３ｇ（１．１モル比）を０℃以下で滴下し、室温
で３時間反応する。反応液を氷水７０ｍｌ中に流入し、
希塩酸水で酸性にした後、トルエン５０ｍｌで２回抽出
を行う。トルエン層を水洗後、溶媒を減圧下留去すると
粗製の（＋）−エクソ−３−（２−プロペニル）−ビジ
クロ［２，２．１］ヘプタン−２−オンが油状残渣とし
て得られる。これを減圧蒸留にて、沸点範囲９２〜１０
３℃／１０〜１２ｍｍＨｇの留分を集めることにより、
精製した。収量３．０７ｇ（収率８２％）、化学純度
（ＧＣ）９８．６％、エンド異性体０．４％、光学純度
（ＨＰＬＣ）９０％ｅｅ、比旋光度［α］25Ｄ＋８４．
６°（Ｃ＝１．０、ＣＨＣｌ3）。
【００９２】参考例２実施例５の工程を大スケールで行い、主要量の（−）−
（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）−エクソ−ノルボルネオールと微
量の（＋）−（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−エクソ−ノルボル
ネオールとを含む反応液を得た。これを 用いて参考例１
と全く同様に反応後処理を行った。粗生成物を減圧蒸留
にて精製し、沸点範囲７４〜８６℃／３〜４ｍｍＨｇの
溜分を集めて目的の（＋）−エクソ−３−（／３〜４ｍ
ｍＨｇの溜分を集めて目的の（＋）−エクソ−３−（２
−プロペニル）−ビシクロ［２，２，１］ヘプタン−２
−オンを得た。収量１．３８ｇ（収率７８％）、化学純
度（ＧＣ）９８．８％、エンド異性体０．９％、光学純
度（ＨＰＬＣ）９８％ｅｅ、比旋光度［α］25Ｄ＋８９
°（Ｃ＝１．２８６、ＣＨＣｌ3）、ＩＲ（Ｆｉｌｍ）
３０６０、１７４０、１６４０、１４６０、１４４０、
１３１０、１０９０ｃｍ-1。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
δ１．３０−２．００（ｍ，８Ｈ）、２．５−２．６
（ｍ，３Ｈ）δ４．９０−５．２０（ｍ，２Ｈ）、５．
７−５．９（ｍ，１Ｈ）上記参考例により得られた化合
物は例えば、文献記載に方法（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．
３１（９），１８４７−１８５４（１９８８））によ
り、医薬として有用なＴＸＡ2レセプターアンタゴニス
トに導くことができる。
（１Ｓ，２Ｓ，４Ｒ）−エクソ−ノルボルネオールと微
量の（＋）−（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−エクソ−ノルボル
ネオールとを含む反応液を得た。これを 用いて参考例１
と全く同様に反応後処理を行った。粗生成物を減圧蒸留
にて精製し、沸点範囲７４〜８６℃／３〜４ｍｍＨｇの
溜分を集めて目的の（＋）−エクソ−３−（／３〜４ｍ
ｍＨｇの溜分を集めて目的の（＋）−エクソ−３−（２
−プロペニル）−ビシクロ［２，２，１］ヘプタン−２
−オンを得た。収量１．３８ｇ（収率７８％）、化学純
度（ＧＣ）９８．８％、エンド異性体０．９％、光学純
度（ＨＰＬＣ）９８％ｅｅ、比旋光度［α］25Ｄ＋８９
°（Ｃ＝１．２８６、ＣＨＣｌ3）、ＩＲ（Ｆｉｌｍ）
３０６０、１７４０、１６４０、１４６０、１４４０、
１３１０、１０９０ｃｍ-1。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
δ１．３０−２．００（ｍ，８Ｈ）、２．５−２．６
（ｍ，３Ｈ）δ４．９０−５．２０（ｍ，２Ｈ）、５．
７−５．９（ｍ，１Ｈ）上記参考例により得られた化合
物は例えば、文献記載に方法（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．
３１（９），１８４７−１８５４（１９８８））によ
り、医薬として有用なＴＸＡ2レセプターアンタゴニス
トに導くことができる。
【００９３】
【００９４】
【配列番号：１】
配列の長さ：1167
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Genomic DNA
起源
生物名：アセトバクター パスツーリアヌス（Acetobac
ter pasteurianus）ＡＴＣＣ１２８７３ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：1..1164 特徴を決定した方法：S 配列 ATG TCC AAC ACC ATT ACA GCA CTC ACC ATG CCC AAG TTC GGT TTG GCC 48 Met Ser Asn Thr Ile Thr Ala Leu Thr Met Pro Lys Phe Gly Leu Ala 1 5 10 15 ATG ACA GAA GGC AAG CTG GCA TCA TGG ACA GTA TCT GTT GGC CAG AGC 96 Met Thr Glu Gly Lys Leu Ala Ser Trp Thr Val Ser Val Gly Gln Ser 20 25 30 GTG CAG CAG GGT GAT GAA CTG GCG GAT ATT GAA ACC ACC AAA ATT ACC 144 Val Gln Gln Gly Asp Glu Leu Ala Asp Ile Glu Thr Thr Lys Ile Thr 35 40 45 AGC AGT TAT GAA AGC CCC GCC GCA GGT GTG CTG CGC AAA CAG GTG GCC 192 Ser Ser Tyr Glu Ser Pro Ala Ala Gly Val Leu Arg Lys Gln Val Ala 50 55 60 GAG GCG GGG GAA ACC CTG CCC GTG GGC GCA CTG ATT GGT GTT TTG GCA 240 Glu Ala Gly Glu Thr Leu Pro Val Gly Ala Leu Ile Gly Val Leu Ala 65 70 75 80 GAT GCC GAA ACG CCA GAT GTG GAT ATT GAA GCC TTT ATC AAA AAC TTT 288 Asp Ala Glu Thr Pro Asp Val Asp Ile Glu Ala Phe Ile Lys Asn Phe 85 90 95 CAT GCA GAA AAC CCA CAG GAT GCG GCT GCA ACA GAA GAT GCC TCT GCC 336 His Ala Glu Asn Pro Gln Asp Ala Ala Ala Thr Glu Asp Ala Ser Ala 100 105 110 GGG GAA CCC AAG CAG GTT ACG GTA GGC GAA CAC ACG CTA AAT GTG CGT 384 Gly Glu Pro Lys Gln Val Thr Val Gly Glu His Thr Leu Asn Val Arg 115 120 125 GAT GTT GGC ACG CAG GAG GGC ACG CCC ATT GTG CTG GTG CAC GGT TTT 432 Asp Val Gly Thr Gln Glu Gly Thr Pro Ile Val Leu Val His Gly Phe 130 135 140 GGC GGA GAT ATC AGC AAC TGG CTG CTC ACA CAG GAT GCC TTG GCC GCA 480 Gly Gly Asp Ile Ser Asn Trp Leu Leu Thr Gln Asp Ala Leu Ala Ala 145 150 155 160 GAA AGG CGC GTA ATT GCG TTT GAT CTG CCG GGG CAT GGG GCT TCC TCT 528 Glu Arg Arg Val Ile Ala Phe Asp Leu Pro Gly His Gly Ala Ser Ser 165 170 175 AAA AAC GTG GGC ACA GGC ACG CTG GCG TTT TTG GCC GGT GTG GTA AGC 576 Lys Asn Val Gly Thr Gly Thr Leu Ala Phe Leu Ala Gly Val Val Ser 180 185 190 GAA TTG CTG CAA ACC CTT AAA ATA GAA AAA GCC CAT GTG GTG GGC CAT 624 Glu Leu Leu Gln Thr Leu Lys Ile Glu Lys Ala His Val Val Gly His 195 200 205 TCT TTG GGG GGC GGC ATT GCC CTG ACC CTG CTG CGA GAT CAC CCT GAT 672 Ser Leu Gly Gly Gly Ile Ala Leu Thr Leu Leu Arg Asp His Pro Asp 210 215 220 CAG GTT GCC AGC CTG AAC CTT TTG GCC CCA GCC GGG TTG GGT AAG GAT 720 Gln Val Ala Ser Leu Asn Leu Leu Ala Pro Ala Gly Leu Gly Lys Asp 225 230 235 240 GTG AAT GCA GAT TTT ATC AGC GCA TTT GTG GAT AGT GAA AGC AGC CGC 768 Val Asn Ala Asp Phe Ile Ser Ala Phe Val Asp Ser Glu Ser Ser Arg 245 250 255 GAT ATG AAG GCT GTT TTG CAA ATG CTG GTG TAT AAC AAA GCC CTA GTG 816 Asp Met Lys Ala Val Leu Gln Met Leu Val Tyr Asn Lys Ala Leu Val 260 265 270 GGC CGT AAG ATG GTG GAT GCC GTG CTG CGT GCA CGT AGG CTA GAT GGC 864 Gly Arg Lys Met Val Asp Ala Val Leu Arg Ala Arg Arg Leu Asp Gly 275 280 285 GCG CGG GAT GCC CTG CAC GTT ATT GCT AAA GCG TGC TTC CCC AAC GGG 912 Ala Arg Asp Ala Leu His Val Ile Ala Lys Ala Cys Phe Pro Asn Gly 290 295 300 CAT CAG GCG GAT GAT CTG CAC TCG GTG CTA GCT GGG GCG GAA ACA CCT 960 His Gln Ala Asp Asp Leu His Ser Val Leu Ala Gly Ala Glu Thr Pro 305 310 315 320 ACC CAG ATT TTC TGG GGC AAG GAA GAT GAA ATT CTT TCT GTC TCC AAC 1008 Thr Gln Ile Phe Trp Gly Lys Glu Asp Glu Ile Leu Ser Val Ser Asn 325 330 335 GCC GCT GGC CTG CCA GAT GTC ATC CCC GTG ACA GTG TAT GAA GAA ACA 1056 Ala Ala Gly Leu Pro Asp Val Ile Pro Val Thr Val Tyr Glu Glu Thr 340 345 350 GGC CAT CTG CCG CAG CTT GAA CAT GCA ACA GAT GTG AAC AAA GCC ATT 1104 Gly His Leu Pro Gln Leu Glu His Ala Thr Asp Val Asn Lys Ala Ile 355 360 365 GCC CTG TTT GTA AAA GAC CCC GAA GCC GCG CTG AGC ATG GCC CGG ATG 1152 Ala Leu Phe Val Lys Asp Pro Glu Ala Ala Leu Ser Met Ala Arg Met 370 375 380 GAC GCG ACA GCC TAA 1167 Asp Ala Thr Ala 385
ter pasteurianus）ＡＴＣＣ１２８７３ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：1..1164 特徴を決定した方法：S 配列 ATG TCC AAC ACC ATT ACA GCA CTC ACC ATG CCC AAG TTC GGT TTG GCC 48 Met Ser Asn Thr Ile Thr Ala Leu Thr Met Pro Lys Phe Gly Leu Ala 1 5 10 15 ATG ACA GAA GGC AAG CTG GCA TCA TGG ACA GTA TCT GTT GGC CAG AGC 96 Met Thr Glu Gly Lys Leu Ala Ser Trp Thr Val Ser Val Gly Gln Ser 20 25 30 GTG CAG CAG GGT GAT GAA CTG GCG GAT ATT GAA ACC ACC AAA ATT ACC 144 Val Gln Gln Gly Asp Glu Leu Ala Asp Ile Glu Thr Thr Lys Ile Thr 35 40 45 AGC AGT TAT GAA AGC CCC GCC GCA GGT GTG CTG CGC AAA CAG GTG GCC 192 Ser Ser Tyr Glu Ser Pro Ala Ala Gly Val Leu Arg Lys Gln Val Ala 50 55 60 GAG GCG GGG GAA ACC CTG CCC GTG GGC GCA CTG ATT GGT GTT TTG GCA 240 Glu Ala Gly Glu Thr Leu Pro Val Gly Ala Leu Ile Gly Val Leu Ala 65 70 75 80 GAT GCC GAA ACG CCA GAT GTG GAT ATT GAA GCC TTT ATC AAA AAC TTT 288 Asp Ala Glu Thr Pro Asp Val Asp Ile Glu Ala Phe Ile Lys Asn Phe 85 90 95 CAT GCA GAA AAC CCA CAG GAT GCG GCT GCA ACA GAA GAT GCC TCT GCC 336 His Ala Glu Asn Pro Gln Asp Ala Ala Ala Thr Glu Asp Ala Ser Ala 100 105 110 GGG GAA CCC AAG CAG GTT ACG GTA GGC GAA CAC ACG CTA AAT GTG CGT 384 Gly Glu Pro Lys Gln Val Thr Val Gly Glu His Thr Leu Asn Val Arg 115 120 125 GAT GTT GGC ACG CAG GAG GGC ACG CCC ATT GTG CTG GTG CAC GGT TTT 432 Asp Val Gly Thr Gln Glu Gly Thr Pro Ile Val Leu Val His Gly Phe 130 135 140 GGC GGA GAT ATC AGC AAC TGG CTG CTC ACA CAG GAT GCC TTG GCC GCA 480 Gly Gly Asp Ile Ser Asn Trp Leu Leu Thr Gln Asp Ala Leu Ala Ala 145 150 155 160 GAA AGG CGC GTA ATT GCG TTT GAT CTG CCG GGG CAT GGG GCT TCC TCT 528 Glu Arg Arg Val Ile Ala Phe Asp Leu Pro Gly His Gly Ala Ser Ser 165 170 175 AAA AAC GTG GGC ACA GGC ACG CTG GCG TTT TTG GCC GGT GTG GTA AGC 576 Lys Asn Val Gly Thr Gly Thr Leu Ala Phe Leu Ala Gly Val Val Ser 180 185 190 GAA TTG CTG CAA ACC CTT AAA ATA GAA AAA GCC CAT GTG GTG GGC CAT 624 Glu Leu Leu Gln Thr Leu Lys Ile Glu Lys Ala His Val Val Gly His 195 200 205 TCT TTG GGG GGC GGC ATT GCC CTG ACC CTG CTG CGA GAT CAC CCT GAT 672 Ser Leu Gly Gly Gly Ile Ala Leu Thr Leu Leu Arg Asp His Pro Asp 210 215 220 CAG GTT GCC AGC CTG AAC CTT TTG GCC CCA GCC GGG TTG GGT AAG GAT 720 Gln Val Ala Ser Leu Asn Leu Leu Ala Pro Ala Gly Leu Gly Lys Asp 225 230 235 240 GTG AAT GCA GAT TTT ATC AGC GCA TTT GTG GAT AGT GAA AGC AGC CGC 768 Val Asn Ala Asp Phe Ile Ser Ala Phe Val Asp Ser Glu Ser Ser Arg 245 250 255 GAT ATG AAG GCT GTT TTG CAA ATG CTG GTG TAT AAC AAA GCC CTA GTG 816 Asp Met Lys Ala Val Leu Gln Met Leu Val Tyr Asn Lys Ala Leu Val 260 265 270 GGC CGT AAG ATG GTG GAT GCC GTG CTG CGT GCA CGT AGG CTA GAT GGC 864 Gly Arg Lys Met Val Asp Ala Val Leu Arg Ala Arg Arg Leu Asp Gly 275 280 285 GCG CGG GAT GCC CTG CAC GTT ATT GCT AAA GCG TGC TTC CCC AAC GGG 912 Ala Arg Asp Ala Leu His Val Ile Ala Lys Ala Cys Phe Pro Asn Gly 290 295 300 CAT CAG GCG GAT GAT CTG CAC TCG GTG CTA GCT GGG GCG GAA ACA CCT 960 His Gln Ala Asp Asp Leu His Ser Val Leu Ala Gly Ala Glu Thr Pro 305 310 315 320 ACC CAG ATT TTC TGG GGC AAG GAA GAT GAA ATT CTT TCT GTC TCC AAC 1008 Thr Gln Ile Phe Trp Gly Lys Glu Asp Glu Ile Leu Ser Val Ser Asn 325 330 335 GCC GCT GGC CTG CCA GAT GTC ATC CCC GTG ACA GTG TAT GAA GAA ACA 1056 Ala Ala Gly Leu Pro Asp Val Ile Pro Val Thr Val Tyr Glu Glu Thr 340 345 350 GGC CAT CTG CCG CAG CTT GAA CAT GCA ACA GAT GTG AAC AAA GCC ATT 1104 Gly His Leu Pro Gln Leu Glu His Ala Thr Asp Val Asn Lys Ala Ile 355 360 365 GCC CTG TTT GTA AAA GAC CCC GAA GCC GCG CTG AGC ATG GCC CGG ATG 1152 Ala Leu Phe Val Lys Asp Pro Glu Ala Ala Leu Ser Met Ala Arg Met 370 375 380 GAC GCG ACA GCC TAA 1167 Asp Ala Thr Ala 385
３
【図１】本発明のノルボルナン型エステル・ヒドロラー
ゼによる（±）−エクソ−ノルボルニルアセテートの鏡
像選択的な脱アセチル化を示す図である。
ゼによる（±）−エクソ−ノルボルニルアセテートの鏡
像選択的な脱アセチル化を示す図である。
【図２】本発明のノルボルナン型エステル・ヒドロラー
ゼ構造遺伝子を含むプラスミドpBNA21の制限酵素地図で
ある。
ゼ構造遺伝子を含むプラスミドpBNA21の制限酵素地図で
ある。
【図３】本発明のノルボルナン型エステル・ヒドロラー
ゼ構造遺伝子を含むプラスミドpUNA221の制限酵素地図
である。
ゼ構造遺伝子を含むプラスミドpUNA221の制限酵素地図
である。
フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 9/16
C12N 15/00
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
Claims (13)
- 【請求項１】以下の性質を有する、ノルボルナン型エス
テル・ヒドロラーゼ： （１）式（Ｉ） 【化１】 （式中、Ｒは炭素数が２から１０個の脂肪族アシル基、
炭素数４から１０個のシクロアルキルカルボニル基また
は炭素数７から１１個のアリールカルボニル基であり、
ＡおよびＢはそれぞれ独立して水素を表すかまたは一緒
になって結合手を表す）で示される（±）−エクソ−ノ
ルボルナン型エステルを、鏡像選択的に加水分解し、光
学活性なノルボルネオールを産生させる； （２）反応至適ｐＨ：約８； （３）酵素安定ｐＨ範囲：約６〜約８； （４）分子量：約４３ｋＤ；および （５）由来：アセトバクター属菌 。 - 【請求項２】以下の性質を有する、ノルボルナン型エス
テル・ヒドロラーゼ： （１）式（ＩＩ） 【化２】 で示される（±）−エクソ−ノルボルニルアセテート
を、鏡像選択的に脱アセチル化し、光学活性なノルボル
ネオールを産生させる； （２）反応至適ｐＨ：約８； （３）酵素安定ｐＨ範囲：約６〜約８（４）分子量：約４３ｋＤ；および （５）由来：アセトバクター属菌 。 - 【請求項３】前記アセトバクター属菌が、アセトバクタ
ー・パスツーリアヌスである、請求項１または２に記載
のノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼ。 - 【請求項４】前記アセトバクター・パスツーリアヌス
が、アセトバクター・パスツーリアヌスATCC 12873であ
る、請求項３に記載のノルボルナン型エステル・ヒドロ
ラーゼ。 - 【請求項５】配列表の配列番号１の１位のMetから３８
８位のAlaまでのアミノ酸配列または１もしくは数個の
アミノ酸の置換、付加および／もしくは欠失を含むアミ
ノ酸配列を含むノルボルナン型エステル・ヒドロラー
ゼ。 - 【請求項６】請求項５に記載のノルボルナン型エステル
・ヒドロラーゼをコードする塩基配列を有する核酸分
子。 - 【請求項７】配列表の配列番号１の１位のＡから１１６
４位のＣまででなる塩基配列を有する、請求項６に記載
の核酸分子。 - 【請求項８】請求項６に記載の核酸分子を有する発現ベ
クター。 - 【請求項９】請求項８に記載の発現ベクターを宿主に導
入して得られる形質転換体。 - 【請求項１０】前記宿主が大腸菌である、請求項９に記
載の形質転換体。 - 【請求項１１】請求項９に記載の形質転換体を培養する
工程、および生産されたノルボルナン型エステル・ヒド
ロラーゼを培養液から回収する工程を包含する、ノルボ
ルナン型エステル・ヒドロラーゼの製造方法。 - 【請求項１２】式（Ｉ）： 【化３】 （式中、Ｒは炭素数が２から１０個の脂肪族アシル基、
炭素数４から１０個のシクロアルキルカルボニル基また
は炭素数７から１１個のアリールカルボニル基であり、
ＡおよびＢはそれぞれ独立して水素を表すかまたは一緒
になって結合手を表す）で示される（±）−エクソ−ノ
ルボルナン型エステルに、請求項１〜５のいずれかに記
載のノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼを接触させ
る工程を包含する、光学活性ノルボルネオールの製造方
法。 - 【請求項１３】前記式（Ｉ）中のＲがアセチル基であ
り、かつＡおよびＢがそれぞれ水素である、請求項１２
に記載の製造方法。
Priority Applications (14)
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|---|---|---|---|
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| NZ260310A NZ260310A (en) | 1993-04-22 | 1994-04-14 | Norbornane type ester hydrolase, its production and use in producing optically active norborneol |
| AU59485/94A AU679487B2 (en) | 1993-04-22 | 1994-04-18 | Norbornane type ester hydrolase |
| AT94302834T ATE206461T1 (de) | 1993-04-22 | 1994-04-21 | Norbornan-ester-hydrolase |
| SI9430394T SI0623678T1 (en) | 1993-04-22 | 1994-04-21 | Norbornane type ester hydrolase |
| DE69428478T DE69428478T2 (de) | 1993-04-22 | 1994-04-21 | Norbornan-Ester-Hydrolase |
| PT94302834T PT623678E (pt) | 1993-04-22 | 1994-04-21 | Hidrolase de esteres do tipo norbornano |
| ES94302834T ES2164087T3 (es) | 1993-04-22 | 1994-04-21 | Ester de hidrolasa tipo norbornane. |
| EP94302834A EP0623678B1 (en) | 1993-04-22 | 1994-04-21 | Norbornane type ester hydrolase |
| DK94302834T DK0623678T3 (da) | 1993-04-22 | 1994-04-21 | Norbornantype-ester-hydrolase |
| KR1019940008540A KR100306008B1 (ko) | 1993-04-22 | 1994-04-22 | 노르보르난형에스테르가수분해효소 |
| US08/232,519 US5484725A (en) | 1993-04-22 | 1994-04-22 | Norbornane type ester hydrolase from Acetobacter pasteurianus |
| US08/456,956 US5686285A (en) | 1993-04-22 | 1995-06-01 | Norbornane type ester hydrolase |
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|---|---|---|---|
| JP09628693A JP3431204B2 (ja) | 1993-04-22 | 1993-04-22 | ノルボルナン型エステル・ヒドロラーゼ |
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|---|---|
| JPH06303972A JPH06303972A (ja) | 1994-11-01 |
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|---|---|---|---|
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| JP (1) | JP3431204B2 (ja) |
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| DE (1) | DE69428478T2 (ja) |
| DK (1) | DK0623678T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5274300A (en) * | 1988-10-26 | 1993-12-28 | Sepracor, Inc. | Enzymatic hydrolysis of glycidate esters in the presence of bisulfite anion |
| JPH02273196A (ja) * | 1989-03-08 | 1990-11-07 | Wisconsin Alumni Res Found | ラセミ化合物の生体触媒分割のエナンチオ選択性の改良法 |
| JP2844224B2 (ja) * | 1989-10-09 | 1999-01-06 | チッソ株式会社 | 光学活性モノエステル化合物およびその製造法 |
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