JP2013135663A - フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】クリプトコッカス属の微生物中で、特定の塩基配列またはそれと均等の範囲の塩基配列で表わされるFAD−GDH遺伝子の5′側に、特定の分泌シグナルペプチド配列が結合された融合DNAを発現させる工程を含むことを特徴とする、糖鎖結合量が少なくかつ均一であるFAD−GDHの生産方法。本発明の方法によれば、糖鎖を含んだ状態で75〜90kDaの分子量を有するFAD−GDHが得られる。
【選択図】図5
Description
(1)糖鎖結合量が少なくかつ均一であるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法であって、クリプトコッカス(Cryptococcus)属の微生物中で、以下の(A)または(B)の塩基配列で表わされるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の5′側に以下の(C)〜(H)からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列が結合された融合DNAを発現させる工程を含むことを特徴とする方法:
(A)配列番号8で示される塩基配列;
(B)配列番号8で示される塩基配列に対して90%以上相同な塩基配列であって、フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素活性を持つタンパク質をコードする塩基配列;
(C)配列番号9で示されるアミノ酸配列;
(D)配列番号10で示されるアミノ酸配列;
(E)配列番号11で示されるアミノ酸配列;
(F)配列番号12で示されるアミノ酸配列;
(G)配列番号13で示されるアミノ酸配列;
(H)配列番号14で示されるアミノ酸配列。
(2)微生物が、クリプトコッカスsp.S−2(Cryptococcus sp.S−2)(受託番号FERM BP−10961)であることを特徴とする(1)に記載の方法。
(3)(1)または(2)に記載の方法によって生産されるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素タンパク質であって、糖鎖を含んだ状態で75〜90kDaの分子量を有することを特徴とするタンパク質。
(4)グルコースを基質とする酵素として、(3)に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素タンパク質を使用することを特徴とする血糖自己測定用バイオセンサ。
(i)作用:電子受容体存在下でグルコースデヒドロゲナーゼ酵素活性を示す。
(ii)分子量:糖鎖を含んだ状態で75〜90kDaである。
(iii)安定pH範囲:pH3.5〜7.5である。
(iv)熱安定性:50℃15分間の熱処理後に90%以上の残存活性を有する。
<反応試薬>
下記のPIPES緩衝液15.6ml、DCPIP溶液0.2ml、D―グルコース溶液4mlを混合して反応試薬とする。
・ 50mM PIPES緩衝液pH6.5(0.1%TritonX−100を含む)
・ 6.8mM 2,6−ジクロロフェノールインドフェノール(DCPIP)溶液
・ 1M D−グルコース溶液
反応試薬3mlを37℃で5分間予備加温する。FAD−GDH溶液0.1mlを添加し、ゆるやかに混和後、水を対照にして37℃に制御された分光光度計で、600nmの吸光度変化を5分間記録し、直線部分から1分間あたりの吸光度変化(ΔOD TEST)を測定する。盲検はFAD−GDH溶液の代わりにFAD−GDHを溶解する溶媒を反応試薬に加えて同様に1分間あたりの吸光度変化(ΔOD BLANK)を測定する。これらの値から以下の式(I)に従ってGDH活性を求める。ここでGDH活性における1単位(U)とは、濃度200mMのD−グルコース存在下で1分間に1マイクロモルのDCPIPを還元する酵素量として定義される。
FAD−GDHの活性(U/ml)={−(ΔOD TEST−ΔOD BLANK)×3.1×希釈倍率}/{16.3×0.1×1.0}・・・(I)
特許文献3に記載のアスペルギルス属由来の改変型遺伝子のコドンユーセージの最適化は、クリプトコッカスsp−S−2.の既知の遺伝子であるαアミラーゼ遺伝子、クチナーゼ遺伝子、キシラナーゼ遺伝子のコドンユーセージを参考に行った。最適化された遺伝子配列を配列番号1に示す。
組換え宿主にはクリプトコッカスsp.S−2. U−5株を使用した。本菌株は、形質転換体の選択のために、クリプトコッカスsp.S−2を自然変異によりウラシル要求性にしたものであり、pCsUX2プラスミドと共に独立行政法人酒類総合研究所において取得されたものである。なお、クリプトコッカスsp.S−2からのウラシル要求性株の取得は、クリプトコッカスsp.S−2にUVを照射し、5−フルオロオロト酸を含む培地で培養し、生き残った株を選抜することにより容易に行うことができる。
2.で取得した形質転換体を、3ml液体培地(0.3%酵母エキス、0.3%麦芽エキス、0.5%ペプトン、1.0%グルコース)で25℃、230rpm、48時間培養し、前培養液とした。前培養液0.03mlを3ml液体培地(酵母エキス2%、キシロース5%)に植え継ぎ、25℃、230rpm、72時間培養し、FAD−GDH活性を確認した。
以上の結果から、上述する6つの分泌シグナルペプチド配列を用いることにより、FAD−GDHをクリプトコッカス属の微生物の細胞外に効率的に分泌生産することが可能である。
3.でFAD−GDH活性が最も高かったUXXs2AOm株形質転換体を、10L容ジャーファーメンターを用いて、培地(5%酵母エキス、5%キシロース、)で25℃、68時間培養した。培養菌体をろ過した後、培養上清を採取し、以下の実験で粗酵素溶液として用いた。
上記の粗酵素溶液から、以下のステップ(1)〜(3)により、FAD−GDH酵素タンパク質を単離精製した。
粗酵素溶液を分画分子量30000の限界濾過膜で濃縮し、20mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)に置換して、粗酵素濃縮液を得た。
活性画分を、60%硫酸アンモニウム飽和(pH6.0)になるように調整後、遠心分離し、上清を得た。60%飽和硫酸アンモニウムを含む50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)で予め平衡化させたPhenyl−sepharose FastFlowカラムにこの上清を通液して、酵素を吸着させた。カラムを同緩衝液で洗浄したのち、同緩衝液から50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。活性画分を分画分子量10000の限界濾過膜で濃縮し、50mMリン酸カリウム緩衝液に置換した。
(3)DEAEセファロース(GEヘルスケア社製)による精製
50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)で予め平衡化させたDEAE−sepharose FastFlowカラムに粗酵素濃縮液を通液して、透過活性画分を回収した。精製酵素の比活性は、約400U/mgであり、酵素の精製倍率は、粗精製酵素の約20倍であった。
上記5.で単離した、クリプトコッカスを宿主として組換え生産したアスペルギルス・オリゼ由来の改変型FAD−GDH(以下、クリプトコッカス組換え改変型FAD−GDHと称する)の精製酵素の特性を評価した。また、対照として、アスペルギルス・オリゼを宿主として組換え生産した、特許文献3に記載のアスペルギルス・オリゼ由来の改変型FAD−GDH(以下、アスペルギルス・オリゼ組換え改変型FAD−GDHと称する)の精製酵素についても同様に特性を評価した。
各精製酵素を、50mMリン酸緩衝液(pH6.0)で100U/ml濃度に調製し、20℃〜65℃の温度で15分間処理し、残存活性を算出した。その結果を図3に示す。図3から明らかなように、アスペルギルス・オリゼ組換え改変型FAD−GDH及びクリプトコッカス組換え改変型FAD−GDHはいずれも50℃まで90%以上の活性を維持していた。
各精製酵素を、100mM酢酸緩衝液(pH3.5〜5.5)、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0〜8.0)、100mMPIPES―NaOH緩衝液(pH6.5−7.5)、100mMTris−HCl緩衝液(pH7.5〜9.0)、で20U/ml濃度に調製し、25℃で16時間処理し、残存活性を算出した。その結果を図4に示す。図4から明らかなように、アスペルギルス・オリゼ組換え改変型FAD−GDH及びクリプトコッカス組換え改変型FAD−GDHはいずれもpH3.5〜7.5の範囲で90%以上の活性を維持していた。
Nu−PAGE 4−12% Bis−Tris Gel(Invitrogen社製)を用いたSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、各精製酵素の分子量を求めた。結果を図5に示す。泳動サンプルは以下の通りである。
レーン1:分子量マーカー(Invitrogen社製、Novex(登録商標) Sharp Unstained Protein Standard)
レーン2:分子量マーカー(Invitrogen社製、Benchmark Protein ladder)
レーン3:クリプトコッカス組換え改変型FAD−GDH精製酵素。
レーン4:アスペルギルス・オリゼ組換え改変型FAD−GDH精製酵素。
レーン5:分子量マーカー(Invitrogen社製、Benchmark Protein ladder)
レーン6:分子量マーカー(Invitrogen社製、Novex(登録商標) Sharp Unstained Protein Standard)
レーン1:分子量マーカー(Invitrogen社製、Mark12)
レーン2:クリプトコッカス組換え改変型FAD−GDH精製酵素。
レーン3:脱糖鎖処理後のクリプトコッカス組換え改変型FAD−GDH精製酵素。
レーン4:アスペルギルス・オリゼ組換え改変型FAD−GDH精製酵素。
レーン5:脱糖鎖処理後のアスペルギルス・オリゼ組換え改変型FAD−GDH精製酵素。
凍結乾燥されたアスペルギルス・オリゼ組換え改変型FAD−GDH及びクリプトコッカス組換え改変型FAD−GDHを使用して、フェノール硫酸法により、酵素タンパク質あたりの糖鎖結合量を測定した。凍結乾燥したFAD―GDH粉末をイオン交換水で0.2g/Lに溶解し、FAD−GDH溶液を調製した。次に、このFAD−GDH溶液0.5mlと、5%(w/v)フェノール溶液0.5mlと、97%硫酸2.5mlを混合し、室温に冷却した後、490nmの吸光度を測定した。0−200mg/LのD−マンノース標準液で検量線を作成し、酵素粉末重量あたりの糖鎖結合量を測定した。その結果、アスペルギルス・オリゼ組換え改変型FAD−GDHの糖鎖結合量は40%であるのに対し、クリプトコッカス組換え改変型FAD−GDHの糖鎖結合量は18%であった。
Claims (4)
- 糖鎖結合量が少なくかつ均一であるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼの生産方法であって、クリプトコッカス(Cryptococcus)属の微生物中で、以下の(A)または(B)の塩基配列で表わされるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子の5′側に以下の(C)〜(H)からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列が結合された融合DNAを発現させる工程を含むことを特徴とする方法:
(A)配列番号8で示される塩基配列;
(B)配列番号8で示される塩基配列に対して90%以上相同な塩基配列であって、フラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素活性を持つタンパク質をコードする塩基配列;
(C)配列番号9で示されるアミノ酸配列;
(D)配列番号10で示されるアミノ酸配列;
(E)配列番号11で示されるアミノ酸配列;
(F)配列番号12で示されるアミノ酸配列;
(G)配列番号13で示されるアミノ酸配列;
(H)配列番号14で示されるアミノ酸配列。 - 微生物が、クリプトコッカスsp.S−2(Cryptococcus sp.S−2)(受託番号FERM BP−10961)であることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 請求項1または2に記載の方法によって生産されるフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素タンパク質であって、糖鎖を含んだ状態で75〜90kDaの分子量を有することを特徴とするタンパク質。
- グルコースを基質とする酵素として、請求項3に記載のフラビンアデニンジヌクレオチド結合型グルコースデヒドロゲナーゼ酵素タンパク質を使用することを特徴とする血糖自己測定用バイオセンサ。
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