JP2651288B2 - セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子および該遺伝子にコードされるタンパク質 - Google Patents
セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子および該遺伝子にコードされるタンパク質Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はセファロスポリン・アセ
チルハイドロラ−ゼ遺伝子、該遺伝子を大腸菌の宿主・
ベクタ−系で用いられるベクタ−に組込んだ組換えＤＮ
Ａ分子、該組換えＤＮＡ分子で形質転換された大腸菌、
該遺伝子によりコードされたアミノ酸配列を有するタン
パク質、該タンパク質の多量体、好ましくは４量体また
は８量体からなる酵素、および該タンパク質または該酵
素の製造法に関する。
チルハイドロラ−ゼ遺伝子、該遺伝子を大腸菌の宿主・
ベクタ−系で用いられるベクタ−に組込んだ組換えＤＮ
Ａ分子、該組換えＤＮＡ分子で形質転換された大腸菌、
該遺伝子によりコードされたアミノ酸配列を有するタン
パク質、該タンパク質の多量体、好ましくは４量体また
は８量体からなる酵素、および該タンパク質または該酵
素の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来から、セファロスポリン類、例えば
セファロスポリンＣや７アミノセファロスポラン酸（以
下７−ＡＣＡと略記）などは、その３位のヒドロキシメ
チル基に結合したアセチル基を除去する反応（以下脱ア
セチル化と略記）により、デアセチルセファロスポリン
Ｃやデアセチル７−ＡＣＡなどに誘導され、これらを出
発原料として種々のセファロスポリン系抗生物質が合成
され、医薬品として実用に供されている。セファロスポ
リン類の脱アセチル化の方法としては、化学的あるいは
酵素的方法があるが、中性に近いｐＨで、また常温で反
応が実施可能であり、副反応が少ない酵素法が有利であ
ると考えられており、既に幾つかの方法が開示されてい
る（特開昭５９−１０８７９０、特開昭４９−１３２２
９４および特開昭６１−６７４８９、米国特許第３３０
４２３６などが挙げられる）。
セファロスポリンＣや７アミノセファロスポラン酸（以
下７−ＡＣＡと略記）などは、その３位のヒドロキシメ
チル基に結合したアセチル基を除去する反応（以下脱ア
セチル化と略記）により、デアセチルセファロスポリン
Ｃやデアセチル７−ＡＣＡなどに誘導され、これらを出
発原料として種々のセファロスポリン系抗生物質が合成
され、医薬品として実用に供されている。セファロスポ
リン類の脱アセチル化の方法としては、化学的あるいは
酵素的方法があるが、中性に近いｐＨで、また常温で反
応が実施可能であり、副反応が少ない酵素法が有利であ
ると考えられており、既に幾つかの方法が開示されてい
る（特開昭５９−１０８７９０、特開昭４９−１３２２
９４および特開昭６１−６７４８９、米国特許第３３０
４２３６などが挙げられる）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは土壌より
分離したバシラス・サチリス(Bacillus subtilis)の一
菌株がセファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼを産
生し、セファロスポリン類を脱アセチル化してデアセチ
ルセファロスポリン類を効率良く生産することを見出し
た。このことから、セファロスポリン・アセチルハイド
ロラ−ゼのみを著量生産する菌株を造成すれば、工業的
に飛躍的に有利なデアセチルセファロスポリン類の製造
法が確立されるものと推定される。これまで、このよう
なセファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼのみを著
量生産する菌株は知られていなかった。
分離したバシラス・サチリス(Bacillus subtilis)の一
菌株がセファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼを産
生し、セファロスポリン類を脱アセチル化してデアセチ
ルセファロスポリン類を効率良く生産することを見出し
た。このことから、セファロスポリン・アセチルハイド
ロラ−ゼのみを著量生産する菌株を造成すれば、工業的
に飛躍的に有利なデアセチルセファロスポリン類の製造
法が確立されるものと推定される。これまで、このよう
なセファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼのみを著
量生産する菌株は知られていなかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、セファロ
スポリン・アセチルハイドロラ−ゼのみを著量生産する
菌株を得るために、鋭意研究を重ねた結果、土壌より新
たに分離したバシラス・サチリス(B. subtilis)の一菌
株よりセファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ遺伝
子を担うＤＮＡ断片を分離し、大腸菌でこれをクロ−ニ
ングすることに成功し、該ＤＮＡ断片をベクタ−に組込
んだ組換えＤＮＡで形質転換した大腸菌が著量のセファ
ロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼを生産することを
見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて本発
明を完成するに至った。
スポリン・アセチルハイドロラ−ゼのみを著量生産する
菌株を得るために、鋭意研究を重ねた結果、土壌より新
たに分離したバシラス・サチリス(B. subtilis)の一菌
株よりセファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ遺伝
子を担うＤＮＡ断片を分離し、大腸菌でこれをクロ−ニ
ングすることに成功し、該ＤＮＡ断片をベクタ−に組込
んだ組換えＤＮＡで形質転換した大腸菌が著量のセファ
ロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼを生産することを
見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて本発
明を完成するに至った。
【０００５】本発明のセファロスポリン・アセチルハイ
ドロラ−ゼ遺伝子を提供するバシラス・サチリス(B. su
btilis)の一菌株は１９９０年２月１５日から茨城県つ
くば市東１丁目１番３号(郵便番号３０５)に 「Bacillus
subtilis SHS0133」 受託番号微工研条寄第２７５５号
(ＦＥＲＭ ＢＰ−２７５５)としてブダペスト条約に基
づき、寄託されている。
ドロラ−ゼ遺伝子を提供するバシラス・サチリス(B. su
btilis)の一菌株は１９９０年２月１５日から茨城県つ
くば市東１丁目１番３号(郵便番号３０５)に 「Bacillus
subtilis SHS0133」 受託番号微工研条寄第２７５５号
(ＦＥＲＭ ＢＰ−２７５５)としてブダペスト条約に基
づき、寄託されている。
【０００６】以下、本発明をさらに詳しく説明する。バシラス・サチリス(B. subtilis)ＳＨＳ０１３３株の
諸性状 １．染色体ＤＮＡのｍｏｌ％(Ｇ＋Ｃ)：４３.４ ２．形態： グラム陽性の短桿菌で、その大きさは(０.７〜０.８)×
(１.８〜２.６)μｍであり、周毛を有する。好気的条件
下で良く生育するが、グルコ−スを含む天然培地では嫌
気的条件下でも弱い生育を示す。細胞の中央に胞子を形
成し、その大きさは０.８×(１.３〜１.７)μｍであ
る。 ３．培養所見 (1)肉汁寒天平板培地(３０℃、７日間) 形成の遅速：２４時間でコロニ−形成 形：不定状 表面の状態：ひだがある 周縁：波状 高さ：丘状 色調：クリ−ム色 光沢：鈍光 光学的性質：不透明 (2)肉汁寒天斜面培地(３０℃、７日間) 生育の良否：良好 形：糸線状 表面の状態：ひだがある 色調：クリ−ム色 光沢：鈍光 光学的性質：不透明 粘稠性：牛酪質 (3)肉汁液体培養(３０℃、７日間) 表面の生育状態：液面に厚膜ができる 濁度：少量 臭気：わずかな芳香 沈殿：粘稠 沈殿の量：僅少 (4)肉汁ゼラチン穿刺培養(２４℃、３０日間) 穿刺溝内の生育：穿刺線にそって一様に生育する。 菌層の形：糸線状 液化の状態と形：２４℃で７日目には地層状に０.５mm
液化する。 (5)リトマス・ミルク：リトマスを還元する。凝固する
ことなくカゼインは急速に消化される。
諸性状 １．染色体ＤＮＡのｍｏｌ％(Ｇ＋Ｃ)：４３.４ ２．形態： グラム陽性の短桿菌で、その大きさは(０.７〜０.８)×
(１.８〜２.６)μｍであり、周毛を有する。好気的条件
下で良く生育するが、グルコ−スを含む天然培地では嫌
気的条件下でも弱い生育を示す。細胞の中央に胞子を形
成し、その大きさは０.８×(１.３〜１.７)μｍであ
る。 ３．培養所見 (1)肉汁寒天平板培地(３０℃、７日間) 形成の遅速：２４時間でコロニ−形成 形：不定状 表面の状態：ひだがある 周縁：波状 高さ：丘状 色調：クリ−ム色 光沢：鈍光 光学的性質：不透明 (2)肉汁寒天斜面培地(３０℃、７日間) 生育の良否：良好 形：糸線状 表面の状態：ひだがある 色調：クリ−ム色 光沢：鈍光 光学的性質：不透明 粘稠性：牛酪質 (3)肉汁液体培養(３０℃、７日間) 表面の生育状態：液面に厚膜ができる 濁度：少量 臭気：わずかな芳香 沈殿：粘稠 沈殿の量：僅少 (4)肉汁ゼラチン穿刺培養(２４℃、３０日間) 穿刺溝内の生育：穿刺線にそって一様に生育する。 菌層の形：糸線状 液化の状態と形：２４℃で７日目には地層状に０.５mm
液化する。 (5)リトマス・ミルク：リトマスを還元する。凝固する
ことなくカゼインは急速に消化される。
【０００７】４．生化学的諸性状 (1)硝酸塩の還元：陽性 (2)脱窒反応：陽性 (3)ＭＲテスト：陰性 (4)ＶＰテスト：陽性 (5)インド−ルの生成：陰性 (6)Ｈ2Ｓの生成：酢酸鉛紙：陰性 ＴＳＩ：陰性 クリ−グラ−：陰性 (7)デンプンの加水分解：陽性 (8)クエン酸の利用：コ−ザ−：陽性 クリステンセン：陽性 (9)無機窒素源の利用：硝酸塩：陽性 アンモニウム塩：陽性 (10)色素の生成：茶色の色素を生成する。 (11)ウレア−ゼテスト：陽性 (12)オキシダ−ゼテスト：陽性 (13)カタラ−ゼテスト：陽性 (14)pＨ：生育範囲：１.５〜８.８ 至適：６.０〜８.８ (15)温度：生育範囲：１６.５℃〜５０.５℃ 至適：２６.０℃〜３６.０℃ (16)ＯＦテスト：Ｄ−グルコ−ス：発酵的に生酸するがガスは生成しない。 ラクト−ス：発酵的に生酸するがガスは生成しない。 (17)糖類からの酸およびガスの生成： 以下の糖類からは酸を生成するが、ガスは生成しない。 Ｌ−アラビノ−ス、Ｄ−キシロ−ス、Ｄ−グルコ−ス、Ｄ−マンノ−ス、Ｄ −フラクト−ス、マルト−ス、シュクロ−ス、トレハロ−ス、Ｄ−マンニト−ル 、グリセロ−ル、スタ−チ 以下の糖類からは、酸およびガスを生成しない。 Ｄ−ガラクト−ス、ラクト−ス、Ｄ−ソルビト−ル、イノシト−ル (18)栄養要求性：なし (19)ぺクチンの分解：陽性 (20)馬尿酸の分解：陰性 (21)レヴァンの生成(シュクロ−ス、ラフィノ−スから)：陽性 (22)アルギニン・ハイドロラ−ゼ：陰性 (23)レシチナ−ゼ：陰性 (24)嫌気下の生育：Ｄ−グルコ−スを含む天然培地で弱い生育を示す。
【０００８】以上の結果より、当該菌株の分類学的性質
をバ−ジ−ズ・マニュアル・オブ・システマティック・
バクテリオロジ−２巻[Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology Vol. 2 (1986)]の記載と対比することに
よってバシラス・サチリス(B. subtilis)の一菌株であ
ると同定し、本菌をバシラス・サチリス(B. subtilis)
ＳＨＳ０１３３(Bacillus subtilis SHS0133)と命名し
た。
をバ−ジ−ズ・マニュアル・オブ・システマティック・
バクテリオロジ−２巻[Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology Vol. 2 (1986)]の記載と対比することに
よってバシラス・サチリス(B. subtilis)の一菌株であ
ると同定し、本菌をバシラス・サチリス(B. subtilis)
ＳＨＳ０１３３(Bacillus subtilis SHS0133)と命名し
た。
【０００９】本発明は、図１に示されるアミノ酸配列を
コ−ドするＤＮＡ塩基配列、好ましくは図２および図３
(図中、***は終止コドンを示す)のＤＮＡ塩基配列を大
腸菌の宿主・ベクタ−系で用いられるベクタ−に組込
み、得られた組換えＤＮＡ分子で形質転換した組換え微
生物によりセファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ
を製造することを包含し、その方法は下記の工程からな
る。しかしながら、本発明によってセファロスポリン・
アセチルハイドロラーゼをコードするＤＮＡ塩基配列が
明らかになることにより、これら工程の一部を省略また
は簡略化できることは当業者の認めるところであろう。
コ−ドするＤＮＡ塩基配列、好ましくは図２および図３
(図中、***は終止コドンを示す)のＤＮＡ塩基配列を大
腸菌の宿主・ベクタ−系で用いられるベクタ−に組込
み、得られた組換えＤＮＡ分子で形質転換した組換え微
生物によりセファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ
を製造することを包含し、その方法は下記の工程からな
る。しかしながら、本発明によってセファロスポリン・
アセチルハイドロラーゼをコードするＤＮＡ塩基配列が
明らかになることにより、これら工程の一部を省略また
は簡略化できることは当業者の認めるところであろう。
【００１０】(１)バシラス・サチリス(B. subtilis)(Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−２７５５)を適当なセファロスポリン・ア
セチルハイドロラ−ゼ生産培地にて培養した培養液より
セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼを分離・精
製し、適当なタンパク質断片化に用いられるプロテア−
ゼを用いて消化し、各ペプチド断片を分離した後、一断
片のアミノ末端よりアミノ酸配列を決定する。
ＥＲＭ ＢＰ−２７５５)を適当なセファロスポリン・ア
セチルハイドロラ−ゼ生産培地にて培養した培養液より
セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼを分離・精
製し、適当なタンパク質断片化に用いられるプロテア−
ゼを用いて消化し、各ペプチド断片を分離した後、一断
片のアミノ末端よりアミノ酸配列を決定する。
【００１１】(２)得られたセファロスポリン・アセチル
ハイドロラ−ゼに由来するペプチド断片のアミノ酸配列
の一部分について、対応する遺伝子のＤＮＡ塩基配列を
推定し、適当な領域の配列をもつオリゴヌクレオチドの
混合物を化学合成し、５'末端を32Ｐで標識し、遺伝子
クロ−ニングのプロ−ブとして使用する。
ハイドロラ−ゼに由来するペプチド断片のアミノ酸配列
の一部分について、対応する遺伝子のＤＮＡ塩基配列を
推定し、適当な領域の配列をもつオリゴヌクレオチドの
混合物を化学合成し、５'末端を32Ｐで標識し、遺伝子
クロ−ニングのプロ−ブとして使用する。
【００１２】（３）バシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）（ＦＥＲＭＢＰ−２７５５）から染色体ＤＮ
Ａを抽出・精製し、各種制限酵素で消化したのち、アガ
ロースゲル電気泳動を行ない、分離したＤＮＡ断片をゲ
ルからニトロセルロース膜に移し取る。このニトロセル
ロース膜と上記工程（２）で調製した３２Ｐ標識プロー
ブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ない、プ
ローブと相補性を示すＤＮＡ断片を調べる。相補性を示
したＤＮＡ断片の中でセファロスポリン・アセチルハイ
ドロラーゼタンパク質の分子量から予想される遺伝子の
サイズよりやや大きいＤＮＡ断片を選択し、アガロース
ゲル上でそのＤＮＡ断片が含まれている領域を切り出し
ＤＮＡを抽出する。
ｉｌｉｓ）（ＦＥＲＭＢＰ−２７５５）から染色体ＤＮ
Ａを抽出・精製し、各種制限酵素で消化したのち、アガ
ロースゲル電気泳動を行ない、分離したＤＮＡ断片をゲ
ルからニトロセルロース膜に移し取る。このニトロセル
ロース膜と上記工程（２）で調製した３２Ｐ標識プロー
ブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ない、プ
ローブと相補性を示すＤＮＡ断片を調べる。相補性を示
したＤＮＡ断片の中でセファロスポリン・アセチルハイ
ドロラーゼタンパク質の分子量から予想される遺伝子の
サイズよりやや大きいＤＮＡ断片を選択し、アガロース
ゲル上でそのＤＮＡ断片が含まれている領域を切り出し
ＤＮＡを抽出する。
【００１３】(４)上記工程(３)のＤＮＡを大腸菌のクロ
−ニングベクタ−に組込み、大腸菌に導入したのち、寒
天培地上でコロニ−を形成させ、32Ｐ標識プロ−ブを用
いてコロニ−ハイブリダイゼ−ションを行わせる。プロ
−ブと相補性を示す大腸菌のコロニ−を選択・分離す
る。
−ニングベクタ−に組込み、大腸菌に導入したのち、寒
天培地上でコロニ−を形成させ、32Ｐ標識プロ−ブを用
いてコロニ−ハイブリダイゼ−ションを行わせる。プロ
−ブと相補性を示す大腸菌のコロニ−を選択・分離す
る。
【００１４】(５)選択された大腸菌の菌株より組換えプ
ラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素切断地図を作成した
後、セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ遺伝子
と無関係な領域を切断・除去するとともにベクタ−に組
込まれたバシラス・サチリス(B.subtilis)由来のＤＮＡ
断片の塩基配列を決定する。決定されたＤＮＡ塩基配列
から予測されるアミノ酸配列をセファロスポリン・アセ
チルハイドロラ−ゼのアミノ酸部分配列、分子量、末端
アミノ酸分析、アミノ酸組成分析と照合し、セファロス
ポリン・アセチルハイドロラ−ゼ構造遺伝子部分を決定
する。
ラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素切断地図を作成した
後、セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ遺伝子
と無関係な領域を切断・除去するとともにベクタ−に組
込まれたバシラス・サチリス(B.subtilis)由来のＤＮＡ
断片の塩基配列を決定する。決定されたＤＮＡ塩基配列
から予測されるアミノ酸配列をセファロスポリン・アセ
チルハイドロラ−ゼのアミノ酸部分配列、分子量、末端
アミノ酸分析、アミノ酸組成分析と照合し、セファロス
ポリン・アセチルハイドロラ−ゼ構造遺伝子部分を決定
する。
【００１５】(６)セファロスポリン・アセチルハイドロ
ラ−ゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片に適当な修飾を施した上
で、大腸菌由来のプロモ−タ−の後に構造遺伝子が結合
するように大腸菌の遺伝子発現ベクタ−に組込ませて発
現用組換えプラスミドを造成する。
ラ−ゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片に適当な修飾を施した上
で、大腸菌由来のプロモ−タ−の後に構造遺伝子が結合
するように大腸菌の遺伝子発現ベクタ−に組込ませて発
現用組換えプラスミドを造成する。
【００１６】(７)発現用組換えプラスミドを大腸菌宿主
に導入し、セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ
を産生する新規な大腸菌を造成する。
に導入し、セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ
を産生する新規な大腸菌を造成する。
【００１７】上記の工程中で、ＤＮＡの取り扱いに必要
な一般的な操作は当業者ならば容易に行なうことができ
るものであり、例えば、モレキュラ−・クロ−ニング(M
olecular Cloning)[T. Maniatisら、コ−ルド・スプリ
ング・ハ−バ−・ラボラトリ−(Cold Spring Harbor La
boratory)(1982)]のような実験操作書に従えば容易に実
施できる。使用される酵素、試薬類も全て市販の製品が
使用可能であり、特に断わらない限り、製品で指定され
た使用条件に従えば完全に目的を達成することができ
る。
な一般的な操作は当業者ならば容易に行なうことができ
るものであり、例えば、モレキュラ−・クロ−ニング(M
olecular Cloning)[T. Maniatisら、コ−ルド・スプリ
ング・ハ−バ−・ラボラトリ−(Cold Spring Harbor La
boratory)(1982)]のような実験操作書に従えば容易に実
施できる。使用される酵素、試薬類も全て市販の製品が
使用可能であり、特に断わらない限り、製品で指定され
た使用条件に従えば完全に目的を達成することができ
る。
【００１８】宿主として使用する大腸菌としては、エシ
ェリキア・コリ(Escherichia coli)Ｋ−１２系統のＨＢ
１０１株、ＤＨ１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０３株、ＪＭ
１０５株、ＪＭ１０９株などが使用可能である。また、
クロ−ニングに使用する大腸菌ベクタ−としてはｐＵＣ
１３、ｐＢＲ３２２、ｐＡＴ１５３などのプラスミドベ
クタ−、λｇｔ１０などのファ−ジベクタ−が挙げられ
る。上記のベクタ−および宿主は市販されており容易に
入手できる。
ェリキア・コリ(Escherichia coli)Ｋ−１２系統のＨＢ
１０１株、ＤＨ１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０３株、ＪＭ
１０５株、ＪＭ１０９株などが使用可能である。また、
クロ−ニングに使用する大腸菌ベクタ−としてはｐＵＣ
１３、ｐＢＲ３２２、ｐＡＴ１５３などのプラスミドベ
クタ−、λｇｔ１０などのファ−ジベクタ−が挙げられ
る。上記のベクタ−および宿主は市販されており容易に
入手できる。
【００１９】上記工程(１)においてタンパク質のアミノ
酸配列の決定法も公知である(例えば、市販のアミノ酸
配列自動シ−ケンサ−が使用できる)。上記工程(２)に
おいて特定の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドの混合
物の合成には市販のＤＮＡ合成機を用い、その操作手順
に従って実施できる。上記工程(５)におけるＤＮＡ塩基
配列の決定は公知のＭ１３ベクタ−系を用いた Sanger
らの方法[Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463-54
67 (1977)]により決定できる。
酸配列の決定法も公知である(例えば、市販のアミノ酸
配列自動シ−ケンサ−が使用できる)。上記工程(２)に
おいて特定の塩基配列を持つオリゴヌクレオチドの混合
物の合成には市販のＤＮＡ合成機を用い、その操作手順
に従って実施できる。上記工程(５)におけるＤＮＡ塩基
配列の決定は公知のＭ１３ベクタ−系を用いた Sanger
らの方法[Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463-54
67 (1977)]により決定できる。
【００２０】上記工程(６)において、目的の遺伝子を大
腸菌内で効率よく発現させるためのプラスミドを造成す
るためには、宿主内で機能する適切なプロモ−タ−(La
c、Tac、Trc、Trp、 PL など)とShine-Dalgarno (SD)
配列を有する発現ベクタ−(ｐＫＫ２２３−３、ｐＢ
Ｓ、ｐＤＲ５４０、ｐＰＬ−lambdaなど)や、さらに翻
訳開始コドンＡＴＧを備えたＡＴＧベクタ−(ｐＫＫ２
３３−２など)に目的のセファロスポリン・アセチルハ
イドロラ−ゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入すれば
よい。この発現プラスミドを適切な宿主(たとえば、E.
coli ＪＭ１０３株、ＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株、Ｃ
６００株など)に導入することにより、効率のよい発現
が可能になる。
腸菌内で効率よく発現させるためのプラスミドを造成す
るためには、宿主内で機能する適切なプロモ−タ−(La
c、Tac、Trc、Trp、 PL など)とShine-Dalgarno (SD)
配列を有する発現ベクタ−(ｐＫＫ２２３−３、ｐＢ
Ｓ、ｐＤＲ５４０、ｐＰＬ−lambdaなど)や、さらに翻
訳開始コドンＡＴＧを備えたＡＴＧベクタ−(ｐＫＫ２
３３−２など)に目的のセファロスポリン・アセチルハ
イドロラ−ゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を挿入すれば
よい。この発現プラスミドを適切な宿主(たとえば、E.
coli ＪＭ１０３株、ＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株、Ｃ
６００株など)に導入することにより、効率のよい発現
が可能になる。
【００２１】発現されたセファロスポリン・アセチルハ
イドロラ−ゼは従来の精製法に従い、遠心分離、カラム
クロマトグラフィ−などを適当に組合わせて精製すれば
よい。
イドロラ−ゼは従来の精製法に従い、遠心分離、カラム
クロマトグラフィ−などを適当に組合わせて精製すれば
よい。
【００２２】以下、実施例により本発明をより詳細に説
明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものでは
ない。実施例１ １．セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼの分離
・精製およびアミノ酸配列の部分決定 （１）セファロスポリン・アセチルレハイドロラーゼの
分離・精製 ２．５％グルコース、０．７５％コーン・スティープ・
リカー、１．０％アミノ酸混合物、０．３％ＫＨ２ＰＯ
４、０．８ｐｐｍＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏの組成からなる
培地（ｐＨ７．０）２０Ｌを３０Ｌ容量ジャーファーメ
ンターに仕込み、滅菌後、あらかじめ０．５％グルコー
ス、０．７５％コーン・スティープ・リカー、０．５％
アミノ酸混合物、０．０２％ＫＨ２ＰＯ４の組成からな
る培地（ｐＨ７．０）で前培養したバシラス・サチリス
（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７５
５）を６％になるように植菌した。２８℃で４８時間培
養後、培養液に１％の活性炭を添加し、２時間撹拌し
た。その後、濾過し、濾液を粗酵素液とした。粗酵素液
に０．７％となるように、ＤＥＡＥセファデックスＡ−
５０（ファルマシア社製）を添加し、２Ｎ水酸化ナトリ
ウムを用いてｐＨ８．０に調節後、１時間撹拌した。濾
過後、セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ活性
の吸着したＤＥＡＥセファデックスＡ−５０を４Ｌの
０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０）で洗浄し、次に０．４Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む同緩衝液で活性を溶出させた。限外濾過装置
（東ソー社製）を用いて濃縮・脱塩後、あらかじめ同緩
衝液で平衡化したＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（フ
ァルマシア社製）を充填したカラムに活性を吸着させ
た。同緩衝液および０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む同
緩衝液で洗浄後、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝
液で活性を溶出させた。限外濾過濃縮・脱塩後、高速液
体カラムクロマトグラフィーによる精製を行なった。カ
ラムはＤＥＡＥトヨパールパック６５０Ｍ（東ソー社
製）を用いた。溶出は塩濃度を連続的に上昇させてゆく
濃度勾配溶出法によった。即ち、０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む同緩衝液を使用し、塩化ナトリウム濃度を最
終濃度０．５Ｍまで上昇させた。溶出された活性画分を
集め、限外濾過濃縮後、分子ふるいカラムを使用した高
速液体カラムクロマトグラフィーによる精製を行なっ
た。カラムは、ＴＳＫ−Ｇ３０００（東ソー社製）を用
い、移動相には、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
を用いた。溶出された活性画分を集め、限外濾過濃縮
後、逆相カラムを使用した高速液体カラムクロマトグラ
フィーにより精製した。カラムは、マイクロボンダパッ
クＣ１８（ウォーターズ社製）を用い、溶出はアセトニ
トリル濃度を連続的に上昇させてゆく濃度勾配溶出法に
よった。即ち、０．１％トリフルオロ酢酸を含む水系を
使用し、アセトニトリル濃度を最終濃度９８％まで上昇
させた。溶出されたセファロスポリン・アセチルハイド
ロラーゼ画分を５０℃で、減圧濃縮した後、６Ｍ塩酸グ
アニジンを含む０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）に溶かし、２ｍＭになるようにＥＤＴＡ（エチレン
ジアミン四酢酸）を添加し、さらにセファロスポリン・
アセチルハイドロラーゼの２００倍モル量の２−メルカ
プトエタノールを添加後、窒素気流下、３７℃で４時間
還元処理した。その後、セファロスポリン・アセチルハ
イドロラーゼの１９０倍モル量のヨード酢酸ナトリウム
を添加し、３７℃、１０分間遮光下で反応させ還元カル
ボキシメチル化した。次に再び、前述の方法に従って逆
相カラムを使用した高速液体カラムクロマトグラフィー
による精製を行なった。得られたセファロスポリン・ア
セチルハイドロラーゼ画分をＬａｅｍｍｌｉの方法［Ｎ
ａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５（１９７０）］に
従い、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）で分析したところ分子量３５ｋＤの位置に
単一バンドを認め、均一に精製されていることを確認し
た。また、本精製セファロスポリン・アセチルハイドロ
ラーゼを７Ｍ尿素を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）に溶かした後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）を用いて１０倍希釈することにより再活性化す
ること、および先に示した高速液体カラムクロマトグラ
フィーを用いた分子ふるいカラムクロマトグラフィーで
分子量２８０ｋＤの位置に活性が溶出されることから、
セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼは天然型で
は均一サブユニットからなる８量体であると推定され
た。一方、Ｈｅｄｒｉｃｋ らの方法［Ａｒｃｈ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１２６，１５５−１６
４（１９６８）］を用いて分子量を測定したところ約１
５０ｋＤとなり、またこの位置に活性を認めることから
４量体でも活性があると考えられた。本精製セファロス
ポリン・アセチルハイドロラーゼをエドマン分解法およ
びヒドラジン分解法により末端分析したところ、アミノ
末端はメチオニン、カルボキシル末端はグリシンと同定
された。
明するが、本発明は下記の実施例に限定されるものでは
ない。実施例１ １．セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼの分離
・精製およびアミノ酸配列の部分決定 （１）セファロスポリン・アセチルレハイドロラーゼの
分離・精製 ２．５％グルコース、０．７５％コーン・スティープ・
リカー、１．０％アミノ酸混合物、０．３％ＫＨ２ＰＯ
４、０．８ｐｐｍＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏの組成からなる
培地（ｐＨ７．０）２０Ｌを３０Ｌ容量ジャーファーメ
ンターに仕込み、滅菌後、あらかじめ０．５％グルコー
ス、０．７５％コーン・スティープ・リカー、０．５％
アミノ酸混合物、０．０２％ＫＨ２ＰＯ４の組成からな
る培地（ｐＨ７．０）で前培養したバシラス・サチリス
（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７５
５）を６％になるように植菌した。２８℃で４８時間培
養後、培養液に１％の活性炭を添加し、２時間撹拌し
た。その後、濾過し、濾液を粗酵素液とした。粗酵素液
に０．７％となるように、ＤＥＡＥセファデックスＡ−
５０（ファルマシア社製）を添加し、２Ｎ水酸化ナトリ
ウムを用いてｐＨ８．０に調節後、１時間撹拌した。濾
過後、セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ活性
の吸着したＤＥＡＥセファデックスＡ−５０を４Ｌの
０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０）で洗浄し、次に０．４Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む同緩衝液で活性を溶出させた。限外濾過装置
（東ソー社製）を用いて濃縮・脱塩後、あらかじめ同緩
衝液で平衡化したＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（フ
ァルマシア社製）を充填したカラムに活性を吸着させ
た。同緩衝液および０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む同
緩衝液で洗浄後、０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む同緩衝
液で活性を溶出させた。限外濾過濃縮・脱塩後、高速液
体カラムクロマトグラフィーによる精製を行なった。カ
ラムはＤＥＡＥトヨパールパック６５０Ｍ（東ソー社
製）を用いた。溶出は塩濃度を連続的に上昇させてゆく
濃度勾配溶出法によった。即ち、０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む同緩衝液を使用し、塩化ナトリウム濃度を最
終濃度０．５Ｍまで上昇させた。溶出された活性画分を
集め、限外濾過濃縮後、分子ふるいカラムを使用した高
速液体カラムクロマトグラフィーによる精製を行なっ
た。カラムは、ＴＳＫ−Ｇ３０００（東ソー社製）を用
い、移動相には、０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
を用いた。溶出された活性画分を集め、限外濾過濃縮
後、逆相カラムを使用した高速液体カラムクロマトグラ
フィーにより精製した。カラムは、マイクロボンダパッ
クＣ１８（ウォーターズ社製）を用い、溶出はアセトニ
トリル濃度を連続的に上昇させてゆく濃度勾配溶出法に
よった。即ち、０．１％トリフルオロ酢酸を含む水系を
使用し、アセトニトリル濃度を最終濃度９８％まで上昇
させた。溶出されたセファロスポリン・アセチルハイド
ロラーゼ画分を５０℃で、減圧濃縮した後、６Ｍ塩酸グ
アニジンを含む０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）に溶かし、２ｍＭになるようにＥＤＴＡ（エチレン
ジアミン四酢酸）を添加し、さらにセファロスポリン・
アセチルハイドロラーゼの２００倍モル量の２−メルカ
プトエタノールを添加後、窒素気流下、３７℃で４時間
還元処理した。その後、セファロスポリン・アセチルハ
イドロラーゼの１９０倍モル量のヨード酢酸ナトリウム
を添加し、３７℃、１０分間遮光下で反応させ還元カル
ボキシメチル化した。次に再び、前述の方法に従って逆
相カラムを使用した高速液体カラムクロマトグラフィー
による精製を行なった。得られたセファロスポリン・ア
セチルハイドロラーゼ画分をＬａｅｍｍｌｉの方法［Ｎ
ａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５（１９７０）］に
従い、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）で分析したところ分子量３５ｋＤの位置に
単一バンドを認め、均一に精製されていることを確認し
た。また、本精製セファロスポリン・アセチルハイドロ
ラーゼを７Ｍ尿素を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）に溶かした後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）を用いて１０倍希釈することにより再活性化す
ること、および先に示した高速液体カラムクロマトグラ
フィーを用いた分子ふるいカラムクロマトグラフィーで
分子量２８０ｋＤの位置に活性が溶出されることから、
セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼは天然型で
は均一サブユニットからなる８量体であると推定され
た。一方、Ｈｅｄｒｉｃｋ らの方法［Ａｒｃｈ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，１２６，１５５−１６
４（１９６８）］を用いて分子量を測定したところ約１
５０ｋＤとなり、またこの位置に活性を認めることから
４量体でも活性があると考えられた。本精製セファロス
ポリン・アセチルハイドロラーゼをエドマン分解法およ
びヒドラジン分解法により末端分析したところ、アミノ
末端はメチオニン、カルボキシル末端はグリシンと同定
された。
【００２３】(２)セファロスポリン・アセチルハイドロ
ラ−ゼのアミノ酸配列の部分決定 精製したセファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ１
mgを１mlの２Ｍ尿素を含む０.１Ｍトリス塩酸緩衝液(p
Ｈ８.８)に溶かした後、０.０１mgのリシルエンドペプ
チダ−ゼを添加し、３７℃で４時間反応させた。反応物
を高速液体カラムクロマトグラフィ−を用いて分離し
た。カラムはマイクロボンダパックＣ18 (ウォ−タ−ズ
社製)を用い、溶出はアセトニトリル濃度を連続的に上
昇させていく濃度勾配溶出法によった。即ち、０.１％
トリフルオロ酢酸を含む水系を使用し、アセトニトリル
濃度を最終濃度９８％まで上昇させた。なお検出は２１
４nmで行なった。分離された各ピ−クのうち、滞留時間
が長く明瞭な画分を分取し、再度、同逆相カラムを用い
て精製後、気相式自動アミノ酸配列シ−ケンサ−(アプ
ライド・バイオシステム社製)を用いてアミノ酸配列を
解析し、図４に示されるペプチド断片のアミノ末端から
３４番目までのアミノ酸配列を決定した。
ラ−ゼのアミノ酸配列の部分決定 精製したセファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ１
mgを１mlの２Ｍ尿素を含む０.１Ｍトリス塩酸緩衝液(p
Ｈ８.８)に溶かした後、０.０１mgのリシルエンドペプ
チダ−ゼを添加し、３７℃で４時間反応させた。反応物
を高速液体カラムクロマトグラフィ−を用いて分離し
た。カラムはマイクロボンダパックＣ18 (ウォ−タ−ズ
社製)を用い、溶出はアセトニトリル濃度を連続的に上
昇させていく濃度勾配溶出法によった。即ち、０.１％
トリフルオロ酢酸を含む水系を使用し、アセトニトリル
濃度を最終濃度９８％まで上昇させた。なお検出は２１
４nmで行なった。分離された各ピ−クのうち、滞留時間
が長く明瞭な画分を分取し、再度、同逆相カラムを用い
て精製後、気相式自動アミノ酸配列シ−ケンサ−(アプ
ライド・バイオシステム社製)を用いてアミノ酸配列を
解析し、図４に示されるペプチド断片のアミノ末端から
３４番目までのアミノ酸配列を決定した。
【００２４】２．ＤＮＡプローブの合成および末端標識 上記工程１で得られたアミノ酸配列中から図４の下線で
示される箇所の配列を選択し、これらのアミノ酸配列か
ら推定される遺伝子上の可能なＤＮＡ塩基配列全てを含
むオリゴヌクレオチド混合物を図５に示すように合成し
た。即ち、可能なオリゴヌクレオチドを４群に分けて合
成して混合物をつくり、これらをＤＮＡプローブＣＡＨ
−ＲＭ１、ＣＡＨ−ＲＭ２、ＣＡＨ−ＲＭ３およびＣＡ
Ｈ−ＲＭ４と称した。オリゴヌクレオチドの合成は全て
日本ゼオン社製の全自動型ＤＮＡ合成機ＺＥＯＮ−ＧＥ
ＮＥＴ Ａ−ＩＩを用いて行なった。得られたＤＮＡプ
ローブの５’末端をＷａｌｌａｃｅらの方法［Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，６，３５４３−３５５
７（１９７９）］に従ってＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼと［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いて標識した。
示される箇所の配列を選択し、これらのアミノ酸配列か
ら推定される遺伝子上の可能なＤＮＡ塩基配列全てを含
むオリゴヌクレオチド混合物を図５に示すように合成し
た。即ち、可能なオリゴヌクレオチドを４群に分けて合
成して混合物をつくり、これらをＤＮＡプローブＣＡＨ
−ＲＭ１、ＣＡＨ−ＲＭ２、ＣＡＨ−ＲＭ３およびＣＡ
Ｈ−ＲＭ４と称した。オリゴヌクレオチドの合成は全て
日本ゼオン社製の全自動型ＤＮＡ合成機ＺＥＯＮ−ＧＥ
ＮＥＴ Ａ−ＩＩを用いて行なった。得られたＤＮＡプ
ローブの５’末端をＷａｌｌａｃｅらの方法［Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，６，３５４３−３５５
７（１９７９）］に従ってＴ４ポリヌクレオチドキナー
ゼと［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いて標識した。
【００２５】３．バシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）からの染色体ＤＮＡの抽出・精製とサザンハイ
ブリダイゼーション Ｈａｒｒｉｓ−Ｗａｒｒｉｃｋらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７２，２２
０７−２２１１（１９７５）］に従い、バシラス・サチ
リス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７
５５）の菌体をリゾチーム処理、次いでＮ−ラウロイル
サルコシン酸ナトリウム処理を行ない、得られた溶菌液
から塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配超遠心
分離により、染色体ＤＮＡを抽出・精製した。このＤＮ
Ａ１μｇあたり各種制限酵素約１０ユニットを至適条件
下で反応させ、反応液を０．８％アガロースゲル電気泳
動に供し、制限酵素切断パターンを分析後、Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎらの方法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，５０
３−５１７（１９７５）］に従い、ハイブリダイゼーシ
ョンに供した。ゲルを０．５Ｎ水酸化ナトリウムを含む
１．５Ｍ塩化ナトリウム溶液中、室温で１時間アルカリ
変性させ、さらに１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む１Ｍト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、室温で１時間中和処
理した後、ニトロセルロース膜を密着させ、ＤＮＡをゲ
ルから膜へ移行させた。移行後のニトロセルロース膜を
用いて、標識したプローブによるハイブリダイゼーショ
ンを実施した。ハイブリダイゼーションは４倍濃度のＳ
ＳＣ（１×ＳＳＣ：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０
１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、１０倍濃度
のＤｅｎｈａｒｄｔ溶液（１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液：
０．０２％ フィコール、０．０２％ポリビニルピロリ
ドン、０．０２％牛血清アルブミン）、標識したプロー
ブ約１×１０６ｃｐｍ／ｍｌを用いて３８℃で一晩行な
い、４倍濃度のＳＳＣにより室温で数回洗浄後、膜をオ
ートラジオグラフィーに供した。さらに、膜の洗浄温度
を段階的に上昇させ、そのつどオートラジオグラフィー
に供する操作を繰り返した。４８℃、５３℃の洗浄後で
も明らかにポジティブシグナルを示すＤＮＡバンドを確
認した。その結果、使用制限酵素の種類によりハイブリ
ダイズするバンドのサイズは異なっており、目的遺伝子
の推定ＤＮＡ鎖長１ｋｂよりサイズが大きく、かつ、ク
ローニングに支障をきたさない程度のものとしてはＤｒ
ａＩ切断による２．５〜３ｋｂ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断に
よる４〜４．５ｋｂの断片が見出された。
ｌｉｓ）からの染色体ＤＮＡの抽出・精製とサザンハイ
ブリダイゼーション Ｈａｒｒｉｓ−Ｗａｒｒｉｃｋらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７２，２２
０７−２２１１（１９７５）］に従い、バシラス・サチ
リス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７
５５）の菌体をリゾチーム処理、次いでＮ−ラウロイル
サルコシン酸ナトリウム処理を行ない、得られた溶菌液
から塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密度勾配超遠心
分離により、染色体ＤＮＡを抽出・精製した。このＤＮ
Ａ１μｇあたり各種制限酵素約１０ユニットを至適条件
下で反応させ、反応液を０．８％アガロースゲル電気泳
動に供し、制限酵素切断パターンを分析後、Ｓｏｕｔｈ
ｅｒｎらの方法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，５０
３−５１７（１９７５）］に従い、ハイブリダイゼーシ
ョンに供した。ゲルを０．５Ｎ水酸化ナトリウムを含む
１．５Ｍ塩化ナトリウム溶液中、室温で１時間アルカリ
変性させ、さらに１．５Ｍ塩化ナトリウムを含む１Ｍト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、室温で１時間中和処
理した後、ニトロセルロース膜を密着させ、ＤＮＡをゲ
ルから膜へ移行させた。移行後のニトロセルロース膜を
用いて、標識したプローブによるハイブリダイゼーショ
ンを実施した。ハイブリダイゼーションは４倍濃度のＳ
ＳＣ（１×ＳＳＣ：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０
１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、１０倍濃度
のＤｅｎｈａｒｄｔ溶液（１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液：
０．０２％ フィコール、０．０２％ポリビニルピロリ
ドン、０．０２％牛血清アルブミン）、標識したプロー
ブ約１×１０６ｃｐｍ／ｍｌを用いて３８℃で一晩行な
い、４倍濃度のＳＳＣにより室温で数回洗浄後、膜をオ
ートラジオグラフィーに供した。さらに、膜の洗浄温度
を段階的に上昇させ、そのつどオートラジオグラフィー
に供する操作を繰り返した。４８℃、５３℃の洗浄後で
も明らかにポジティブシグナルを示すＤＮＡバンドを確
認した。その結果、使用制限酵素の種類によりハイブリ
ダイズするバンドのサイズは異なっており、目的遺伝子
の推定ＤＮＡ鎖長１ｋｂよりサイズが大きく、かつ、ク
ローニングに支障をきたさない程度のものとしてはＤｒ
ａＩ切断による２．５〜３ｋｂ、ＨｉｎｄＩＩＩ切断に
よる４〜４．５ｋｂの断片が見出された。
【００２６】４．セファロスポリン・アセチルハイドロ
ラ−ゼ遺伝子のクロ−ニング (１)遺伝子ライブラリ−の作成 上記工程３で抽出・精製したバシラス・サチリス(B. su
btilis)染色体ＤＮＡ１２μgに制限酵素ＤｒａＩ約１２
０ユニットを加え、３７℃で９０分反応させた後、反応
液を等量のフェノ−ルで抽出し、得られた水層にエタノ
−ルを添加してＤＮＡを沈殿させた。得られたＤＮＡを
６０μlのＴＥ緩衝液(１０mＭトリス塩酸、１mＭ ＥＤ
ＴＡ、pＨ８.０)で溶解後、０.８％アガロ−スゲル電気
泳動に供し、２〜４ｋｂのサイズに相当する領域を切り
出した。市販のキット(バイオ１０１社製、GENECLEAN)
を使用し、ゲルからＤＮＡ断片を溶出・回収し、３０μ
lのＴＥ緩衝液に溶解した。他方、遺伝子ライブラリ−
作成用のベクタ−として、ｐＵＣ１３を使用した。ｐＵ
Ｃ１３(１０μg)に制限酵素ＳｍａＩ約１００ユニット
を加え、３７℃で１４０分反応させた後、６５℃で１０
分インキュベ−トし、アルカリホスファタ−ゼ(ＢＡＰ)
約２０ユニットを加え、さらに６５℃で８０分反応させ
た。前述の方法に従って、フェノ−ル抽出を行なった
後、ＤＮＡをエタノ−ルで沈殿させ、最終的に５０μl
のＴＥ緩衝液に溶解した。上記のバシラス・サチリス
(B. subtilis)染色体のＤｒａＩ切断断片溶液７.５μl
とベクタ−ｐＵＣ１３のＳｍａＩ−ＢＡＰ処理溶液２.
５μlを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガ−ゼを用いて６℃で約
２０時間反応させ、両者を連結させ、組換えＤＮＡを形
成させた。この組換えＤＮＡを用いて、Hanahanらの方
法[J. Mol. Biol., 166, 557-580 (1983)]に従い、エシ
ェリキア・コリ(E. coli)ＨＢ１０１株を形質転換し
た。次に、アンピシリン４０μg/mlを含むＬブロス[１
％バクトトリプトン、０.５％酵母エキス、０.５％塩化
ナトリウム(pＨ７.３)]寒天培地上に密着させたニトロ
セルロ−ス膜上でコロニ−を形成させた。これらのコロ
ニ−をバシラス・サチリス(B.subtilis)の遺伝子ライブ
ラリ−と称した。
ラ−ゼ遺伝子のクロ−ニング (１)遺伝子ライブラリ−の作成 上記工程３で抽出・精製したバシラス・サチリス(B. su
btilis)染色体ＤＮＡ１２μgに制限酵素ＤｒａＩ約１２
０ユニットを加え、３７℃で９０分反応させた後、反応
液を等量のフェノ−ルで抽出し、得られた水層にエタノ
−ルを添加してＤＮＡを沈殿させた。得られたＤＮＡを
６０μlのＴＥ緩衝液(１０mＭトリス塩酸、１mＭ ＥＤ
ＴＡ、pＨ８.０)で溶解後、０.８％アガロ−スゲル電気
泳動に供し、２〜４ｋｂのサイズに相当する領域を切り
出した。市販のキット(バイオ１０１社製、GENECLEAN)
を使用し、ゲルからＤＮＡ断片を溶出・回収し、３０μ
lのＴＥ緩衝液に溶解した。他方、遺伝子ライブラリ−
作成用のベクタ−として、ｐＵＣ１３を使用した。ｐＵ
Ｃ１３(１０μg)に制限酵素ＳｍａＩ約１００ユニット
を加え、３７℃で１４０分反応させた後、６５℃で１０
分インキュベ−トし、アルカリホスファタ−ゼ(ＢＡＰ)
約２０ユニットを加え、さらに６５℃で８０分反応させ
た。前述の方法に従って、フェノ−ル抽出を行なった
後、ＤＮＡをエタノ−ルで沈殿させ、最終的に５０μl
のＴＥ緩衝液に溶解した。上記のバシラス・サチリス
(B. subtilis)染色体のＤｒａＩ切断断片溶液７.５μl
とベクタ−ｐＵＣ１３のＳｍａＩ−ＢＡＰ処理溶液２.
５μlを混合し、Ｔ４ＤＮＡリガ−ゼを用いて６℃で約
２０時間反応させ、両者を連結させ、組換えＤＮＡを形
成させた。この組換えＤＮＡを用いて、Hanahanらの方
法[J. Mol. Biol., 166, 557-580 (1983)]に従い、エシ
ェリキア・コリ(E. coli)ＨＢ１０１株を形質転換し
た。次に、アンピシリン４０μg/mlを含むＬブロス[１
％バクトトリプトン、０.５％酵母エキス、０.５％塩化
ナトリウム(pＨ７.３)]寒天培地上に密着させたニトロ
セルロ−ス膜上でコロニ−を形成させた。これらのコロ
ニ−をバシラス・サチリス(B.subtilis)の遺伝子ライブ
ラリ−と称した。
【００２７】(２)コロニ−ハイブリダイゼ−ションによ
るセファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ・ポジテ
ィブクロ−ンの選択 上記工程(１)でニトロセルロ−ス膜上に形成させたコロ
ニ−をもう一つのニトロセルロ−ス膜にレプリカした。
このレプリカ膜をアンピシリン４０μg/mlを含むＬブロ
ス寒天培地上に密着させ、３７℃で３時間インキュベ−
トした後、さらにクロラムフェニコ−ル２５０μg/mlを
含むＬブロス寒天培地上に移し、３７℃で一晩インキュ
ベ−トした。次いで、基本的には、Grunstein らの方法
[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 72, 3961-3965 (197
5)]に従い、コロニ−ハイブリダイゼ−ションを実施し
た。即ち、膜を０.５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で処理し
(１０〜１５分)、コロニ−の溶菌、ＤＮＡのアルカリ変
性を行なった後、１Ｍトリス塩酸緩衝液(pＨ７.２)にて
中和(５〜１０分)し、さらに１.５Ｍ塩化ナトリウムを
含む１Ｍトリス塩酸緩衝液(pＨ８.０)で処理(１０〜１
５分)した。８０℃で２時間、減圧下でベ−キングを行
なってＤＮＡを膜に固定した後、固定化ＤＮＡを標識プ
ロ−ブＣＡＨ−ＲＭ２とハイブリダイズさせた。反応は
４倍濃度のＳＳＣ、１０倍濃度の Denhardt 溶液および
約２×１０6cpm/mlの標識したプロ−ブを含む溶液中、
３８℃で１６時間行った。その後、４倍濃度のＳＳＣで
３〜４回、室温で洗浄後、３８℃で２分間洗浄し、オ−
トラジオグラフィ−に供した(感光条件：−８０℃、３
時間)。洗浄温度とオ−トラジオグラフィ−上のシグナ
ルの強弱との関係を見るため、さらに洗浄温度を段階的
に高め、そのつどオ−トラジオグラフィ−に供した。洗
浄は４３℃、４８℃、５３℃で各々２分間処理した。
るセファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ・ポジテ
ィブクロ−ンの選択 上記工程(１)でニトロセルロ−ス膜上に形成させたコロ
ニ−をもう一つのニトロセルロ−ス膜にレプリカした。
このレプリカ膜をアンピシリン４０μg/mlを含むＬブロ
ス寒天培地上に密着させ、３７℃で３時間インキュベ−
トした後、さらにクロラムフェニコ−ル２５０μg/mlを
含むＬブロス寒天培地上に移し、３７℃で一晩インキュ
ベ−トした。次いで、基本的には、Grunstein らの方法
[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 72, 3961-3965 (197
5)]に従い、コロニ−ハイブリダイゼ−ションを実施し
た。即ち、膜を０.５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で処理し
(１０〜１５分)、コロニ−の溶菌、ＤＮＡのアルカリ変
性を行なった後、１Ｍトリス塩酸緩衝液(pＨ７.２)にて
中和(５〜１０分)し、さらに１.５Ｍ塩化ナトリウムを
含む１Ｍトリス塩酸緩衝液(pＨ８.０)で処理(１０〜１
５分)した。８０℃で２時間、減圧下でベ−キングを行
なってＤＮＡを膜に固定した後、固定化ＤＮＡを標識プ
ロ−ブＣＡＨ−ＲＭ２とハイブリダイズさせた。反応は
４倍濃度のＳＳＣ、１０倍濃度の Denhardt 溶液および
約２×１０6cpm/mlの標識したプロ−ブを含む溶液中、
３８℃で１６時間行った。その後、４倍濃度のＳＳＣで
３〜４回、室温で洗浄後、３８℃で２分間洗浄し、オ−
トラジオグラフィ−に供した(感光条件：−８０℃、３
時間)。洗浄温度とオ−トラジオグラフィ−上のシグナ
ルの強弱との関係を見るため、さらに洗浄温度を段階的
に高め、そのつどオ−トラジオグラフィ−に供した。洗
浄は４３℃、４８℃、５３℃で各々２分間処理した。
【００２８】その結果、高温の洗浄温度においても、ポ
ジティブシグナルを示したのは約３００００個のコロニ
−のうち３個であった。これらのコロニ−についてアン
ピシリン４０μg/mlを含むＬブロス５mlを用いて３７℃
で一晩液体培養し、組換えプラスミドを調製した[Birnb
oim らの方法：Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523 (19
79)]。これらのプラスミドをベクタ−ＤＮＡであるｐＵ
Ｃ１３に切断部位を持つ制限酵素(ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎ
ｄIII、ＰｖｕIIなど)で切断し、断片化したのち、アガ
ロ−スゲル電気泳動を行ない、標識したプロ−ブとサザ
ンハイブリダイゼ−ションを行なった。その結果、三つ
のうち二つの組換えプラスミドがＤＮＡプロ−ブと明ら
かにハイブリダイズする制限酵素切断断片を保有してい
ることが見出された。ポジティブを示した二つのプラス
ミドでハイブリダイズする断片のサイズが相違してお
り、ベクタ−ＤＮＡに挿入されたＤＮＡ断片が異なって
いることが考えられたので、それぞれの組換えプラスミ
ドをｐＣＡＨ０１およびｐＣＡＨ０２と命名し、両者を
区別した。
ジティブシグナルを示したのは約３００００個のコロニ
−のうち３個であった。これらのコロニ−についてアン
ピシリン４０μg/mlを含むＬブロス５mlを用いて３７℃
で一晩液体培養し、組換えプラスミドを調製した[Birnb
oim らの方法：Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523 (19
79)]。これらのプラスミドをベクタ−ＤＮＡであるｐＵ
Ｃ１３に切断部位を持つ制限酵素(ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎ
ｄIII、ＰｖｕIIなど)で切断し、断片化したのち、アガ
ロ−スゲル電気泳動を行ない、標識したプロ−ブとサザ
ンハイブリダイゼ−ションを行なった。その結果、三つ
のうち二つの組換えプラスミドがＤＮＡプロ−ブと明ら
かにハイブリダイズする制限酵素切断断片を保有してい
ることが見出された。ポジティブを示した二つのプラス
ミドでハイブリダイズする断片のサイズが相違してお
り、ベクタ−ＤＮＡに挿入されたＤＮＡ断片が異なって
いることが考えられたので、それぞれの組換えプラスミ
ドをｐＣＡＨ０１およびｐＣＡＨ０２と命名し、両者を
区別した。
【００２９】５．ポジティブクロ−ンの同定と塩基配列
決定 (１)ポジティブクロ−ンの同定 組換えプラスミドｐＣＡＨ０１およびｐＣＡＨ０２につ
いて、各種制限酵素で切断し、制限酵素切断地図の作成
を試みたが、その過程でプラスミドｐＣＡＨ０１は二つ
の異なるＤｒａＩ切断断片が、プラスミドｐＣＡＨ０２
は少なくとも３つの異なるＤｒａＩ切断断片がベクタ−
ＤＮＡのＳｍａＩ部位に挿入されており、そのうち一つ
のＤｒａＩ切断断片上にＤＮＡプロ−ブがハイブリダイ
ズすることが明らかになった。そこで今後は組換えプラ
スミドｐＣＡＨ０１を使用することにした。図６にプラ
スミドｐＣＡＨ０１の制限酵素切断地図およびＤＮＡプ
ロ−ブがハイブリダイズする位置を示した。プラスミド
ｐＣＡＨ０１は外来のバシラス・サチリス(B. subtili
s)染色体ＤＮＡ由来のＤｒａＩ断片を二つ含んでおり
(１.８ｋｂおよび２.５ｋｂ)、２.５ｋｂ断片にのみＤ
ＮＡプロ−ブがハイブリダイズすることから１.８ｋｂ
のＤｒａＩ断片を除去することにした。プラスミドｐＣ
ＡＨ０１からこの２.５ｋｂ断片を含む２.６ｋｂのＤｒ
ａＩ−ＰｓｔＩ断片を取り出し、ベクタ−プラスミドｐ
ＵＣ１３のＳｍａＩ−ＰｓｔＩ間に挿入することにより
小型化された組換えプラスミドｐＣＡＨ０３(５.３ｋ
ｂ)を得た。組換えプラスミドｐＣＡＨ０３の制限酵素
切断地図を図７に示した。
決定 (１)ポジティブクロ−ンの同定 組換えプラスミドｐＣＡＨ０１およびｐＣＡＨ０２につ
いて、各種制限酵素で切断し、制限酵素切断地図の作成
を試みたが、その過程でプラスミドｐＣＡＨ０１は二つ
の異なるＤｒａＩ切断断片が、プラスミドｐＣＡＨ０２
は少なくとも３つの異なるＤｒａＩ切断断片がベクタ−
ＤＮＡのＳｍａＩ部位に挿入されており、そのうち一つ
のＤｒａＩ切断断片上にＤＮＡプロ−ブがハイブリダイ
ズすることが明らかになった。そこで今後は組換えプラ
スミドｐＣＡＨ０１を使用することにした。図６にプラ
スミドｐＣＡＨ０１の制限酵素切断地図およびＤＮＡプ
ロ−ブがハイブリダイズする位置を示した。プラスミド
ｐＣＡＨ０１は外来のバシラス・サチリス(B. subtili
s)染色体ＤＮＡ由来のＤｒａＩ断片を二つ含んでおり
(１.８ｋｂおよび２.５ｋｂ)、２.５ｋｂ断片にのみＤ
ＮＡプロ−ブがハイブリダイズすることから１.８ｋｂ
のＤｒａＩ断片を除去することにした。プラスミドｐＣ
ＡＨ０１からこの２.５ｋｂ断片を含む２.６ｋｂのＤｒ
ａＩ−ＰｓｔＩ断片を取り出し、ベクタ−プラスミドｐ
ＵＣ１３のＳｍａＩ−ＰｓｔＩ間に挿入することにより
小型化された組換えプラスミドｐＣＡＨ０３(５.３ｋ
ｂ)を得た。組換えプラスミドｐＣＡＨ０３の制限酵素
切断地図を図７に示した。
【００３０】（２）塩基配列決定 組換えプラスミドｐＣＡＨ０３より、ＤＮＡプローブが
ハイブリダイズする０．２４ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片を取り出し、Ｓａｎｇｅｒらの方法［Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７
４，５４６３−５４６７（１９７７）］に従って、ＤＮ
Ａ塩基配列を決定した。その結果、上記工程１で得られ
たセファロスポリン・アセチルハイドロラーゼの部分的
なアミノ酸配列に一致する塩基配列が見出され、この断
片がセファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子
の一部を含むことが明らかになった。次いで、プラスミ
ドｐＣＡＨ０３の制限酵素切断地図に基づき、０．３８
ｋｂのＤｒａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ間、１．４５ｋｂのＥ
ｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ間の塩基配列を決定することによ
り、図８および図９（図中、＊＊＊は終止コドンを示
す）に示されるように約２ｋｂのＤｒａＩ−ＥｃｏＲＩ
間の塩基配列が明らかになった。その結果、翻訳開始コ
ドンＡＴＧの規定するメチオニンを含む３１８個のアミ
ノ酸残基よりなるタンパク質をコードする塩基配列が存
在することが判明した。また、セファロスポリン・アセ
チルハイドロラーゼタンパク質の分子量、アミノ末端お
よびカルボキシル末端のアミノ酸、リシルエンドペプチ
ダーゼ消化断片のアミノ酸組成との照合でも、よい一致
を示すことから、上記の塩基配列にコードされるタンパ
ク質がセファロスポリン・アセチルハイドロラーゼであ
ると推定された。このようにして、プラスミドｐＣＡＨ
０３中のバシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
由来のＤＮＡ断片中に、セファロスポリン・アセチルハ
イドロラーゼ構造遺伝子が完全に含まれていることが明
らかになった。
ハイブリダイズする０．２４ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ断片を取り出し、Ｓａｎｇｅｒらの方法［Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７
４，５４６３−５４６７（１９７７）］に従って、ＤＮ
Ａ塩基配列を決定した。その結果、上記工程１で得られ
たセファロスポリン・アセチルハイドロラーゼの部分的
なアミノ酸配列に一致する塩基配列が見出され、この断
片がセファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子
の一部を含むことが明らかになった。次いで、プラスミ
ドｐＣＡＨ０３の制限酵素切断地図に基づき、０．３８
ｋｂのＤｒａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ間、１．４５ｋｂのＥ
ｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ間の塩基配列を決定することによ
り、図８および図９（図中、＊＊＊は終止コドンを示
す）に示されるように約２ｋｂのＤｒａＩ−ＥｃｏＲＩ
間の塩基配列が明らかになった。その結果、翻訳開始コ
ドンＡＴＧの規定するメチオニンを含む３１８個のアミ
ノ酸残基よりなるタンパク質をコードする塩基配列が存
在することが判明した。また、セファロスポリン・アセ
チルハイドロラーゼタンパク質の分子量、アミノ末端お
よびカルボキシル末端のアミノ酸、リシルエンドペプチ
ダーゼ消化断片のアミノ酸組成との照合でも、よい一致
を示すことから、上記の塩基配列にコードされるタンパ
ク質がセファロスポリン・アセチルハイドロラーゼであ
ると推定された。このようにして、プラスミドｐＣＡＨ
０３中のバシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
由来のＤＮＡ断片中に、セファロスポリン・アセチルハ
イドロラーゼ構造遺伝子が完全に含まれていることが明
らかになった。
【００３１】６．発現用プラスミドの造成 プラスミドｐＣＡＨ０３上のクロ−ン化されたバシラス
・サチリス(B. subtilis)由来のＤＮＡ断片中にはセフ
ァロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ遺伝子以外の領
域も含まれており、遺伝子の形質発現に無関係と考えら
れる領域を図１０に示す工程に従い削除した。一般的
に、大腸菌内で異種遺伝子を高発現させるためには、発
現効率の高いプロモ−タ−、ＳＤ配列および翻訳開始コ
ドンＡＴＧからなる配列の直後に目的の構造遺伝子を連
結させた発現プラスミドを造成するのが効果的である。
そこで、セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼを
大腸菌で著量生産させるために、プロモ−タ−、ＳＤ配
列、ＡＴＧを含むベクタ−を用いて、図１１に示される
工程に従い発現用プラスミドを造成した。なお、セファ
ロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ構造遺伝子は以下
のように調製できる。該遺伝子が完全に含まれる領域を
Ｍ１３ｍｐ系ベクタ−にクロ−ニングすることにより、
一本鎖ＤＮＡを取得し、セファロスポリン・アセチルハ
イドロラ−ゼのアミノ酸配列上２番目のアミノ酸から数
個のアミノ酸を規定するオリゴヌクレオチドをプライマ
−として、いわゆるプライマ−伸長法によりセファロス
ポリン・アセチルハイドロラ−ゼ構造遺伝子部分のみが
二本鎖となったＤＮＡ断片を得る。図１２に、図１１で
得られた発現プラスミドのコピ−数を増大させ、かつ、
薬剤耐性マ−カ−をアンピシリン耐性(Ａｐr)からテト
ラサイクリン耐性(Ｔｃr)に変えた改良型の発現プラス
ミド造成の工程を示した。
・サチリス(B. subtilis)由来のＤＮＡ断片中にはセフ
ァロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ遺伝子以外の領
域も含まれており、遺伝子の形質発現に無関係と考えら
れる領域を図１０に示す工程に従い削除した。一般的
に、大腸菌内で異種遺伝子を高発現させるためには、発
現効率の高いプロモ−タ−、ＳＤ配列および翻訳開始コ
ドンＡＴＧからなる配列の直後に目的の構造遺伝子を連
結させた発現プラスミドを造成するのが効果的である。
そこで、セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼを
大腸菌で著量生産させるために、プロモ−タ−、ＳＤ配
列、ＡＴＧを含むベクタ−を用いて、図１１に示される
工程に従い発現用プラスミドを造成した。なお、セファ
ロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ構造遺伝子は以下
のように調製できる。該遺伝子が完全に含まれる領域を
Ｍ１３ｍｐ系ベクタ−にクロ−ニングすることにより、
一本鎖ＤＮＡを取得し、セファロスポリン・アセチルハ
イドロラ−ゼのアミノ酸配列上２番目のアミノ酸から数
個のアミノ酸を規定するオリゴヌクレオチドをプライマ
−として、いわゆるプライマ−伸長法によりセファロス
ポリン・アセチルハイドロラ−ゼ構造遺伝子部分のみが
二本鎖となったＤＮＡ断片を得る。図１２に、図１１で
得られた発現プラスミドのコピ−数を増大させ、かつ、
薬剤耐性マ−カ−をアンピシリン耐性(Ａｐr)からテト
ラサイクリン耐性(Ｔｃr)に変えた改良型の発現プラス
ミド造成の工程を示した。
【００３２】以下に各工程を詳述する。 (１)小型化プラスミドの造成 図１０に示したように、セファロスポリン・アセチルハ
イドロラーゼ(図中でＣＡＨと略記)構造遺伝子の下流域
を短縮するため、プラスミドｐＣＡＨ０３をＥｃｏＲＶ
とＢａｍＨＩで切断し、得られる約４.１ｋｂのＤＮＡ
断片を精製した後、ＤＮＡポリメラーゼクレノウ断片を
用いて両端が平滑化されたＤＮＡを調製した。さらに精
製後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応を行ない、
セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子全域
を含んだ小型化プラスミドｐＣＡＨ１０を造成した。
イドロラーゼ(図中でＣＡＨと略記)構造遺伝子の下流域
を短縮するため、プラスミドｐＣＡＨ０３をＥｃｏＲＶ
とＢａｍＨＩで切断し、得られる約４.１ｋｂのＤＮＡ
断片を精製した後、ＤＮＡポリメラーゼクレノウ断片を
用いて両端が平滑化されたＤＮＡを調製した。さらに精
製後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結反応を行ない、
セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子全域
を含んだ小型化プラスミドｐＣＡＨ１０を造成した。
【００３３】(２)発現用プラスミド造成のための一本鎖
ＤＮＡの調製 上記工程(１)で調製した小型化プラスミドｐＣＡＨ１０
をＳａｃＩとＳａｌＩで切断し、得られる約１.５ｋｂ
断片を精製し、ＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片として回収し
た。一方ファージＭ１３ｍｐ１１の二本鎖ＤＮＡをＳａ
ｃＩとＳａｌＩで切断した後、これに上記のＳａｃＩ−
ＳａｌＩ断片を加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結させて
セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子全域
を組込んだファージＭ１３−ＣＡＨの二本鎖ＤＮＡを造
成した。次いで Messing の方法[Methods in Enzymolog
y, 101, 20-78 (1983)]に従って一本鎖ＤＮＡを調製し
た。
ＤＮＡの調製 上記工程(１)で調製した小型化プラスミドｐＣＡＨ１０
をＳａｃＩとＳａｌＩで切断し、得られる約１.５ｋｂ
断片を精製し、ＳａｃＩ−ＳａｌＩ断片として回収し
た。一方ファージＭ１３ｍｐ１１の二本鎖ＤＮＡをＳａ
ｃＩとＳａｌＩで切断した後、これに上記のＳａｃＩ−
ＳａｌＩ断片を加え、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結させて
セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子全域
を組込んだファージＭ１３−ＣＡＨの二本鎖ＤＮＡを造
成した。次いで Messing の方法[Methods in Enzymolog
y, 101, 20-78 (1983)]に従って一本鎖ＤＮＡを調製し
た。
【００３４】（３）プライマー伸長 基本的には、Ｇｏｅｄｄｅｌらの方法［Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８，４０５７−４０７４（１
９８０）］に従い、セファロスポリン・アセチルハイド
ロラーゼタンパク質合成開始部位（ＡＴＧ）よりも上流
にあるバシラス・サチリス（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由
来のタンパク質非コード領域を削除したセファロスポリ
ン・アセチルハイドロラーゼ構造遺伝子が含まれる領域
を調製した。プライマー伸長法に使用するプライマーと
してセファロスポリン・アセチルハイドロラーゼのアミ
ノ酸配列上２番目のグルタミンから７番目のプロリンに
対応する塩基配列をもつオリゴヌクレオチドを合成し、
ＣＡＨ−Ｐ１と命名した。次いで上記工程（２）で調製
したファージＭ１３−ＣＡＨ一本鎖ＤＮＡ７．５μｇに
３ｐｍｏｌｅのプライマーＣＡＨ−Ｐ１を加え、６０℃
で２０分間加熱した後、室温になるまで放置した。次い
で、これにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
（各０．２５ｍＭ）、ＤＮＡポリメラーゼクレノウ断片
（２ユニット）を加え、７ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）、７ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、２０ｍＭ塩化ナトリウムの反応液２０μｌ中、３
７℃で２時間プライマー伸長反応をさせた。反応後、フ
ェノール抽出・エタノール沈殿の操作を行なった後、Ｄ
ＮＡを少量の蒸留水に溶解し、４ユニットのＳ１ヌクレ
アーゼを加え、３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．
６）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ硫酸亜鉛の反
応液４０μｌ中、３７℃で３０分間反応させて、一本鎖
部分を分解した。得られた二本鎖ＤＮＡ断片を含む溶液
をフェノール抽出後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、
さらに末端部の修復反応を行なわせるため、前述の方法
によりＤＮＡポリメラーゼクレノウ断片処理を行なっ
た。
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，８，４０５７−４０７４（１
９８０）］に従い、セファロスポリン・アセチルハイド
ロラーゼタンパク質合成開始部位（ＡＴＧ）よりも上流
にあるバシラス・サチリス（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由
来のタンパク質非コード領域を削除したセファロスポリ
ン・アセチルハイドロラーゼ構造遺伝子が含まれる領域
を調製した。プライマー伸長法に使用するプライマーと
してセファロスポリン・アセチルハイドロラーゼのアミ
ノ酸配列上２番目のグルタミンから７番目のプロリンに
対応する塩基配列をもつオリゴヌクレオチドを合成し、
ＣＡＨ−Ｐ１と命名した。次いで上記工程（２）で調製
したファージＭ１３−ＣＡＨ一本鎖ＤＮＡ７．５μｇに
３ｐｍｏｌｅのプライマーＣＡＨ−Ｐ１を加え、６０℃
で２０分間加熱した後、室温になるまで放置した。次い
で、これにｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ
（各０．２５ｍＭ）、ＤＮＡポリメラーゼクレノウ断片
（２ユニット）を加え、７ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）、７ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、２０ｍＭ塩化ナトリウムの反応液２０μｌ中、３
７℃で２時間プライマー伸長反応をさせた。反応後、フ
ェノール抽出・エタノール沈殿の操作を行なった後、Ｄ
ＮＡを少量の蒸留水に溶解し、４ユニットのＳ１ヌクレ
アーゼを加え、３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．
６）、１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ硫酸亜鉛の反
応液４０μｌ中、３７℃で３０分間反応させて、一本鎖
部分を分解した。得られた二本鎖ＤＮＡ断片を含む溶液
をフェノール抽出後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、
さらに末端部の修復反応を行なわせるため、前述の方法
によりＤＮＡポリメラーゼクレノウ断片処理を行なっ
た。
【００３５】(４)発現用プラスミドの造成 本実施例に用いる発現用プラスミド造成のためのベクタ
ーであるｐＫＫ２３３−２(アンピシリン耐性)はファル
マシア社で市販されているもので、Ｔｒｃプロモーター
を有し、制限酵素ＮｃｏＩによる切断および末端修復に
よりＡＴＧ直後で平滑化されるＡＴＧベクターの一種で
ある。図１１に示すように、まず、上記工程(３)で得た
セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼのアミノ末
端に相当する部分が平滑化されたＤＮＡ断片をＰｓｔＩ
で切断し、これにより１.２７ｋｂのＤＮＡ断片を分離
・精製した。一方、Ｔｒｃプロモーターを含むｐＫＫ２
３３−２をＮｃｏＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼクレ
ノウ断片処理した後、ＰｓｔＩで切断し、約４.６ｋｂ
のＤＮＡ断片を得た。次いで上記の２つの断片を混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結反応を行なわせた後、エ
シェリキア・コリ(E.coli)ＪＭ１０３株を形質転換し、
アンピシリン４０μg/mlを含むＬブロス寒天培地上で生
育してくるコロニーを選択した。これらのコロニーにつ
いてＬブロスで一晩液体培養を行ない、集菌後、菌体よ
りプラスミドＤＮＡを抽出し、ＡＴＧベクターとセファ
ロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子を含む断片
との連結部分の塩基配列を決定した。その結果、目的通
りにＡＴＧコドンの直後にセファロスポリン・アセチル
ハイドロラーゼのアミノ末端メチオニンを除く構造遺伝
子が連結された発現用プラスミドが得られ、これをｐＣ
ＡＨ２１と命名した。また、この発現用プラスミドを保
有する大腸菌をエシェリキア・コリ(E. coli)ＪＭ１０
３/ｐＣＡＨ２１と命名した。発現用プラスミドｐＣＡ
Ｈ２１の複製系はｐＢＲ３２２由来のものであり、プラ
スミドコピ−数をさらに増大させ、大腸菌内での発現レ
ベルを上昇させる目的で、複製開始領域(ｏｒｉ)をｐＡ
Ｔ１５３由来のものに変更することにした。また同時に
薬剤耐性マ−カ−をアンピシリン耐性(Ａｐr)よりテト
ラサイクリン耐性(Ｔｃr)に変更することにした。図１
２にプラスミド改変手順を示した。まず、ｐＣＡＨ２１
をＢａｍＨＩで切断し、ＤＮＡポリメラ−ゼクレノウ断
片処理した後、ＳｃａＩで切断することにより、Ｔｒｃ
プロモ−タ−、セファロスポリン・アセチルハイドロラ
−ゼ遺伝子および５Ｓリボゾ−ムＲＮＡのＴ1Ｔ2 タ−
ミネ−タ−(５ＳｒｒｎＢＴ1Ｔ2)を含む約２.４ｋｂの
ＤＮＡ断片を得た。他方、ベクタ−プラスミドとしては
市販のｐＡＴ１５３を使用した。ｐＡＴ１５３をＥｃｏ
ＲＩで切断し、ＤＮＡポリメラ−ゼクレノウ断片で処理
した後、ＤｒａＩで切断した。さらにベクタ−自身の閉
環を防止する目的でアルカリホスファタ−ゼ処理を行な
い、ｐＡＴ１５３複製領域およびテトラサイクリン耐性
遺伝子を含む約２.５ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。次
いで上記２つのＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガ−
ゼで連結反応を行なわせた後、エシェリキア・コリ(E.
coli)ＪＭ１０３株を形質転換し、テトラサイクリン２
０μg/mlを含むＬブロス寒天培地で生育してくるコロニ
−を選択した。これらのコロニ−についてＬブロスで一
晩液体培養を行ない、集菌後、菌体よりプラスミドＤＮ
Ａを抽出し、制限酵素切断による分析を行なったとこ
ろ、連結方向の異なる二種の組換えプラスミドが得られ
た。セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ遺伝子
とテトラサイクリン耐性遺伝子の方向が同じプラスミド
をｐＣＡＨ２１１、逆方向に挿入されたプラスミドをｐ
ＣＡＨ２１２と命名した。また、これらの組換え発現用
プラスミドを保有する大腸菌をそれぞれエシェリキア・
コリ(E. coli)ＪＭ１０３/ｐＣＡＨ２１１、エシェリキ
ア・コリ(E. coli)ＪＭ１０３/ｐＣＡＨ２１２と命名し
た。
ーであるｐＫＫ２３３−２(アンピシリン耐性)はファル
マシア社で市販されているもので、Ｔｒｃプロモーター
を有し、制限酵素ＮｃｏＩによる切断および末端修復に
よりＡＴＧ直後で平滑化されるＡＴＧベクターの一種で
ある。図１１に示すように、まず、上記工程(３)で得た
セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼのアミノ末
端に相当する部分が平滑化されたＤＮＡ断片をＰｓｔＩ
で切断し、これにより１.２７ｋｂのＤＮＡ断片を分離
・精製した。一方、Ｔｒｃプロモーターを含むｐＫＫ２
３３−２をＮｃｏＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼクレ
ノウ断片処理した後、ＰｓｔＩで切断し、約４.６ｋｂ
のＤＮＡ断片を得た。次いで上記の２つの断片を混合
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結反応を行なわせた後、エ
シェリキア・コリ(E.coli)ＪＭ１０３株を形質転換し、
アンピシリン４０μg/mlを含むＬブロス寒天培地上で生
育してくるコロニーを選択した。これらのコロニーにつ
いてＬブロスで一晩液体培養を行ない、集菌後、菌体よ
りプラスミドＤＮＡを抽出し、ＡＴＧベクターとセファ
ロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子を含む断片
との連結部分の塩基配列を決定した。その結果、目的通
りにＡＴＧコドンの直後にセファロスポリン・アセチル
ハイドロラーゼのアミノ末端メチオニンを除く構造遺伝
子が連結された発現用プラスミドが得られ、これをｐＣ
ＡＨ２１と命名した。また、この発現用プラスミドを保
有する大腸菌をエシェリキア・コリ(E. coli)ＪＭ１０
３/ｐＣＡＨ２１と命名した。発現用プラスミドｐＣＡ
Ｈ２１の複製系はｐＢＲ３２２由来のものであり、プラ
スミドコピ−数をさらに増大させ、大腸菌内での発現レ
ベルを上昇させる目的で、複製開始領域(ｏｒｉ)をｐＡ
Ｔ１５３由来のものに変更することにした。また同時に
薬剤耐性マ−カ−をアンピシリン耐性(Ａｐr)よりテト
ラサイクリン耐性(Ｔｃr)に変更することにした。図１
２にプラスミド改変手順を示した。まず、ｐＣＡＨ２１
をＢａｍＨＩで切断し、ＤＮＡポリメラ−ゼクレノウ断
片処理した後、ＳｃａＩで切断することにより、Ｔｒｃ
プロモ−タ−、セファロスポリン・アセチルハイドロラ
−ゼ遺伝子および５Ｓリボゾ−ムＲＮＡのＴ1Ｔ2 タ−
ミネ−タ−(５ＳｒｒｎＢＴ1Ｔ2)を含む約２.４ｋｂの
ＤＮＡ断片を得た。他方、ベクタ−プラスミドとしては
市販のｐＡＴ１５３を使用した。ｐＡＴ１５３をＥｃｏ
ＲＩで切断し、ＤＮＡポリメラ−ゼクレノウ断片で処理
した後、ＤｒａＩで切断した。さらにベクタ−自身の閉
環を防止する目的でアルカリホスファタ−ゼ処理を行な
い、ｐＡＴ１５３複製領域およびテトラサイクリン耐性
遺伝子を含む約２.５ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。次
いで上記２つのＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガ−
ゼで連結反応を行なわせた後、エシェリキア・コリ(E.
coli)ＪＭ１０３株を形質転換し、テトラサイクリン２
０μg/mlを含むＬブロス寒天培地で生育してくるコロニ
−を選択した。これらのコロニ−についてＬブロスで一
晩液体培養を行ない、集菌後、菌体よりプラスミドＤＮ
Ａを抽出し、制限酵素切断による分析を行なったとこ
ろ、連結方向の異なる二種の組換えプラスミドが得られ
た。セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ遺伝子
とテトラサイクリン耐性遺伝子の方向が同じプラスミド
をｐＣＡＨ２１１、逆方向に挿入されたプラスミドをｐ
ＣＡＨ２１２と命名した。また、これらの組換え発現用
プラスミドを保有する大腸菌をそれぞれエシェリキア・
コリ(E. coli)ＪＭ１０３/ｐＣＡＨ２１１、エシェリキ
ア・コリ(E. coli)ＪＭ１０３/ｐＣＡＨ２１２と命名し
た。
【００３６】７．セファロスポリン・アセチルハイドロ
ラーゼ遺伝子の大腸菌における発現 （１）セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝
子の発現 エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３／ｐＣ
ＡＨ２１１もしくはエシェリキア・コリ（Ｅ・ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０３／ｐＣＡＨ２１２をテトラサイクリン２
０μｇ／ｍｌを含む２倍濃度のＬブロス５０ｍｌ（０．
５Ｌ容フラスコ）に植菌し、３７℃で２４時間振盪培養
した。培養液０．５ｍｌを取り、遠心分離により集菌
後、０．５ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
に懸濁した。超音波破砕装置で細胞を破砕後、これを遠
心分離し、得られる上清を酵素液とした。また、上記工
程１で得られたバシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７５５）の培養液を遠心分
離して得られる上清を比較のための酵素液とした。セフ
ァロスポリン・アセチルハイドロラーゼは基質としてセ
ファロスポリンＣや７−ＡＣＡ以外に酢酸パラニトロフ
ェニル（以下ｐＮＰＡと略記）にも作用して、呈色物質
パラニトロフェノール（以下ｐＮＰと略記）を生成す
る。ｐＮＰは分光光学的に測定可能であり、セファロス
ポリン・アセチルハイドロラーゼの簡易活性測定法とし
てｐＮＰＡを基質とする方法を採用した。反応は、０．
０２％ｐＮＰＡ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．
８）、および酵素液からなる３ｍｌの溶液中、３０℃で
行ない、分光光度計を用いて４００ｎｍでの光学密度を
測定することにより酵素活性を定量した。３０℃、ｐＨ
６．８の条件下で、１分間に１μｍｏｌｅのｐＮＰを生
成する酵素量を１ユニット（Ｕ）と定めた。その結果、
エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３／ｐＣ
ＡＨ２１１およびエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
ＪＭ１０３／ｐＣＡＨ２１２の培養液あたりの酵素活性
は、９．９Ｕ／ｍｌおよび１２．４Ｕ／ｍｌであった。
これに対し、バシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）の酵素活性は０．３６Ｕ／ｍｌであった。発現用プ
ラスミドｐＣＡＨ２１１のＴｒｃプロモーターおよびＳ
Ｄ−ＡＴＧ間の配列を大腸菌トリプトファン・オペロン
由来のＴｒｐプロモーターとＳＤ−ＡＴＧ間の配列に置
換したプラスミドを造成し、これをエシェリキア・コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株に導入し、得られた形質
転換体を上記と同様の方法で培養したところ、培養液あ
たりの酵素活性は７５．５Ｕ／ｍｌであった。これらの
発現用プラスミドを保有する大腸菌をスケールアップし
た培養装置、例えばジャーファーメンターなどを用い
て、適切な培地・培養条件で増殖させることにより、セ
ファロスポリン・アセチルハイドロラーゼの生産量を増
大させることができる。
ラーゼ遺伝子の大腸菌における発現 （１）セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝
子の発現 エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３／ｐＣ
ＡＨ２１１もしくはエシェリキア・コリ（Ｅ・ｃｏｌ
ｉ）ＪＭ１０３／ｐＣＡＨ２１２をテトラサイクリン２
０μｇ／ｍｌを含む２倍濃度のＬブロス５０ｍｌ（０．
５Ｌ容フラスコ）に植菌し、３７℃で２４時間振盪培養
した。培養液０．５ｍｌを取り、遠心分離により集菌
後、０．５ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）
に懸濁した。超音波破砕装置で細胞を破砕後、これを遠
心分離し、得られる上清を酵素液とした。また、上記工
程１で得られたバシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）（ＦＥＲＭ ＢＰ−２７５５）の培養液を遠心分
離して得られる上清を比較のための酵素液とした。セフ
ァロスポリン・アセチルハイドロラーゼは基質としてセ
ファロスポリンＣや７−ＡＣＡ以外に酢酸パラニトロフ
ェニル（以下ｐＮＰＡと略記）にも作用して、呈色物質
パラニトロフェノール（以下ｐＮＰと略記）を生成す
る。ｐＮＰは分光光学的に測定可能であり、セファロス
ポリン・アセチルハイドロラーゼの簡易活性測定法とし
てｐＮＰＡを基質とする方法を採用した。反応は、０．
０２％ｐＮＰＡ、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．
８）、および酵素液からなる３ｍｌの溶液中、３０℃で
行ない、分光光度計を用いて４００ｎｍでの光学密度を
測定することにより酵素活性を定量した。３０℃、ｐＨ
６．８の条件下で、１分間に１μｍｏｌｅのｐＮＰを生
成する酵素量を１ユニット（Ｕ）と定めた。その結果、
エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３／ｐＣ
ＡＨ２１１およびエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
ＪＭ１０３／ｐＣＡＨ２１２の培養液あたりの酵素活性
は、９．９Ｕ／ｍｌおよび１２．４Ｕ／ｍｌであった。
これに対し、バシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉ
ｓ）の酵素活性は０．３６Ｕ／ｍｌであった。発現用プ
ラスミドｐＣＡＨ２１１のＴｒｃプロモーターおよびＳ
Ｄ−ＡＴＧ間の配列を大腸菌トリプトファン・オペロン
由来のＴｒｐプロモーターとＳＤ−ＡＴＧ間の配列に置
換したプラスミドを造成し、これをエシェリキア・コリ
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株に導入し、得られた形質
転換体を上記と同様の方法で培養したところ、培養液あ
たりの酵素活性は７５．５Ｕ／ｍｌであった。これらの
発現用プラスミドを保有する大腸菌をスケールアップし
た培養装置、例えばジャーファーメンターなどを用い
て、適切な培地・培養条件で増殖させることにより、セ
ファロスポリン・アセチルハイドロラーゼの生産量を増
大させることができる。
【００３７】（２）セファロスポリンＣおよび７−ＡＣ
Ａの脱アセチル化 基質としてセファロスポリンＣあるいは７−ＡＣＡを用
いて、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３
／ｐＣＡＨ２１２の酵素液による脱アセチル化を行っ
た。反応は、１０ｍＭの基質を含む０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）１．０ｍｌに酵素液０．２ｍｌを加
え、３７℃で４０分間行ない、１．２ｍｌの０．２Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ４．０）の添加により停止させた。反応
終了液を高速液体カラムクロマトグラフィーに供し、生
成物であるデアセチルセファロスポリンＣあるいはデア
セチル７−ＡＣＡを定量した。カラムはコスモシール
（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ）５Ｃ８（ナカライテスク社製）を
用い、溶出はメタノール濃度を連続的に上昇させてゆく
濃度勾配溶出法によった。即ち、２０ｍＭリン酸二水素
ナトリウム、５ｍＭテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム−
ヒドロキシド（ＴＢＡＨ）を含む溶液を使用し、メタノ
ール濃度を最終濃度２０％まで上昇させた。また、生成
物の検出は２５４ｎｍで行なった。セファロスポリン・
アセチルハイドロラーゼの活性は、３７℃、ｐＨ７．０
の条件下で、１分間に１μｍｏｌｅの生成物を与える酵
素量を１ユニット（Ｕ）とした。その結果、セファロス
ポリンＣあるいは７−ＡＣＡに対するエシェリキア・コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３／ｐＣＡＨ２１２の酵素
液の培養液あたりの活性はともに７．Ｕ／ｍｌであっ
た。
Ａの脱アセチル化 基質としてセファロスポリンＣあるいは７−ＡＣＡを用
いて、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３
／ｐＣＡＨ２１２の酵素液による脱アセチル化を行っ
た。反応は、１０ｍＭの基質を含む０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．０）１．０ｍｌに酵素液０．２ｍｌを加
え、３７℃で４０分間行ない、１．２ｍｌの０．２Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ４．０）の添加により停止させた。反応
終了液を高速液体カラムクロマトグラフィーに供し、生
成物であるデアセチルセファロスポリンＣあるいはデア
セチル７−ＡＣＡを定量した。カラムはコスモシール
（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ）５Ｃ８（ナカライテスク社製）を
用い、溶出はメタノール濃度を連続的に上昇させてゆく
濃度勾配溶出法によった。即ち、２０ｍＭリン酸二水素
ナトリウム、５ｍＭテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム−
ヒドロキシド（ＴＢＡＨ）を含む溶液を使用し、メタノ
ール濃度を最終濃度２０％まで上昇させた。また、生成
物の検出は２５４ｎｍで行なった。セファロスポリン・
アセチルハイドロラーゼの活性は、３７℃、ｐＨ７．０
の条件下で、１分間に１μｍｏｌｅの生成物を与える酵
素量を１ユニット（Ｕ）とした。その結果、セファロス
ポリンＣあるいは７−ＡＣＡに対するエシェリキア・コ
リ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＪＭ１０３／ｐＣＡＨ２１２の酵素
液の培養液あたりの活性はともに７．Ｕ／ｍｌであっ
た。
【００３８】(３)組換えセファロスポリン・アセチルハ
イドロラーゼの形状 大腸菌で生産されたセファロスポリン・アセチルハイド
ロラーゼのサブユニットおよび活性型の分子量を測定し
た結果、上記工程１で得られたものと同じ結果を得たこ
とから、組換えセファロスポリン・アセチルハイドロラ
ーゼも天然型セファロスポリン・アセチルハイドロラー
ゼと同じく８量体で存在すると考えられる。また、組換
えセファロスポリン・アセチルハイドロラーゼを逆相カ
ラムを使用した高速液体カラムクロマトグラフィーによ
り精製した後、エドマン分解法およびヒドラジン分解法
により末端分析したところ、天然型と同じくアミノ末端
はメチオニン、カルボキシル末端はグリシンであった。
さらに、自動アミノ酸配列シーケンサーを用いてアミノ
末端メチオニンからの配列を調べた結果、決定された２
５番目までのアミノ酸配列が構造遺伝子から推定される
配列(図２)と完全に一致していた。
イドロラーゼの形状 大腸菌で生産されたセファロスポリン・アセチルハイド
ロラーゼのサブユニットおよび活性型の分子量を測定し
た結果、上記工程１で得られたものと同じ結果を得たこ
とから、組換えセファロスポリン・アセチルハイドロラ
ーゼも天然型セファロスポリン・アセチルハイドロラー
ゼと同じく８量体で存在すると考えられる。また、組換
えセファロスポリン・アセチルハイドロラーゼを逆相カ
ラムを使用した高速液体カラムクロマトグラフィーによ
り精製した後、エドマン分解法およびヒドラジン分解法
により末端分析したところ、天然型と同じくアミノ末端
はメチオニン、カルボキシル末端はグリシンであった。
さらに、自動アミノ酸配列シーケンサーを用いてアミノ
末端メチオニンからの配列を調べた結果、決定された２
５番目までのアミノ酸配列が構造遺伝子から推定される
配列(図２)と完全に一致していた。
【００３９】
【発明の効果】実施例において詳述したように、本発明
者らは、バシラス・サチリス(B. subtilis)ＳＨＳ０１
３３株が生産するセファロスポリン・アセチルハイドロ
ラーゼの遺伝子を含む領域をクローニングし、大腸菌中
で発現可能なベクターを用いて組換えプラスミドを造成
することによって、セファロスポリン・アセチルハイド
ロラーゼ生産の飛躍的な増大と、その広範な応用の前提
条件を与えることができた。また、クローン化されたセ
ファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子を含む
ＤＮＡ断片は、セファロスポリン・アセチルハイドロラ
ーゼの機能を有益に利用するための極めて強力な手段を
提供するものである。
者らは、バシラス・サチリス(B. subtilis)ＳＨＳ０１
３３株が生産するセファロスポリン・アセチルハイドロ
ラーゼの遺伝子を含む領域をクローニングし、大腸菌中
で発現可能なベクターを用いて組換えプラスミドを造成
することによって、セファロスポリン・アセチルハイド
ロラーゼ生産の飛躍的な増大と、その広範な応用の前提
条件を与えることができた。また、クローン化されたセ
ファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子を含む
ＤＮＡ断片は、セファロスポリン・アセチルハイドロラ
ーゼの機能を有益に利用するための極めて強力な手段を
提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ
のアミノ酸配列を示す配列図である。
のアミノ酸配列を示す配列図である。
【図２】 セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ
遺伝子の塩基配列(下段)およびそれから推定されるアミ
ノ酸配列(上段)を示す配列図である(前半部)。
遺伝子の塩基配列(下段)およびそれから推定されるアミ
ノ酸配列(上段)を示す配列図である(前半部)。
【図３】 セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ
遺伝子の塩基配列(下段)およびそれから推定されるアミ
ノ酸配列(上段)を示す配列図である(後半部)。
遺伝子の塩基配列(下段)およびそれから推定されるアミ
ノ酸配列(上段)を示す配列図である(後半部)。
【図４】 セファロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ
の部分決定された３４個のアミノ酸配列を示す配列図で
ある。
の部分決定された３４個のアミノ酸配列を示す配列図で
ある。
【図５】 図４中に下線を施したアミノ酸配列から推定
される遺伝子上可能なＤＮＡ塩基配列全てを含む４種の
合成オリゴヌクレオチドプロ−ブを示す配列図である。
される遺伝子上可能なＤＮＡ塩基配列全てを含む４種の
合成オリゴヌクレオチドプロ−ブを示す配列図である。
【図６】 組換えプラスミドｐＣＡＨ０１の制限酵素切
断地図およびＤＮＡプロ−ブがハイブリダイズする位置
を示す模式図である。
断地図およびＤＮＡプロ−ブがハイブリダイズする位置
を示す模式図である。
【図７】 組換えプラスミドｐＣＡＨ０３の制限酵素切
断地図を示す模式図である。
断地図を示す模式図である。
【図８】 クロ−ン化されたセファロスポリン・アセチ
ルハイドロラ−ゼ遺伝子近辺のＤＮＡ配列を示す配列図
である(前半部)。
ルハイドロラ−ゼ遺伝子近辺のＤＮＡ配列を示す配列図
である(前半部)。
【図９】 クロ−ン化されたセファロスポリン・アセチ
ルハイドロラ−ゼ遺伝子近辺のＤＮＡ配列を示す配列図
である(後半部)。
ルハイドロラ−ゼ遺伝子近辺のＤＮＡ配列を示す配列図
である(後半部)。
【図１０】 組換えプラスミドｐＣＡＨ０３からセファ
ロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ遺伝子より下流に
ある領域を削除した小型化プラスミドｐＣＡＨ１０の造
成図である。
ロスポリン・アセチルハイドロラ−ゼ遺伝子より下流に
ある領域を削除した小型化プラスミドｐＣＡＨ１０の造
成図である。
【図１１】 大腸菌での発現用プラスミドｐＣＡＨ２１
の造成図である。
の造成図である。
【図１２】 大腸菌での発現用プラスミドｐＣＡＨ２１
１およびｐＣＡＨ２１２の造成図である。
１およびｐＣＡＨ２１２の造成図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:125）
Claims (10)
- 【請求項１】 図１に示されるアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡ。 - 【請求項２】 請求項１記載のＤＮＡを大腸菌の宿主・
ベクター系で用いられるベクターに組込んだ組換えＤＮ
Ａ分子。 - 【請求項３】 請求項２記載の組換えＤＮＡ分子で形質
転換された大腸菌。 - 【請求項４】 図１に示されるアミノ酸配列を有するタ
ンパク質。 - 【請求項５】 図１に示されるアミノ酸配列のアミノ末
端にさらにメチオニンを有するアミノ酸配列を有するタ
ンパク質。 - 【請求項６】 請求項３記載の大腸菌により産生される
請求項４または５に記載のタンパク質。 - 【請求項７】 請求項４、５または６のいずれかに記載
のタンパク質の多量体からなる酵素。 - 【請求項８】 該酵素が該タンパク質の４量体または８
量体である請求項７記載の酵素。 - 【請求項９】 請求項３に記載の大腸菌を培養し、培養
液から請求項４または５のいずれかに記載のタンパク質
を採取することを特徴とする該タンパク質の製造法。 - 【請求項１０】 請求項３に記載の大腸菌を培養し、培
養液から請求項７または８のいずれかに記載の酵素を採
取することを特徴とする該酵素の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3095166A JP2651288B2 (ja) | 1990-04-27 | 1991-04-25 | セファロスポリン・アセチルハイドロラーゼ遺伝子および該遺伝子にコードされるタンパク質 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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