KR20140114269A - 표적화된 과가수분해효소 - Google Patents

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스콧 디. 커닝햄
스티븐 알. 파네스톡
타냐 마리아 그루버
마크 에스. 패인
피에르 에. 루비에르
린다 제인 솔로몬
홍 왕
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Abstract

효소에 의한 과산 생성을 표적 표면에 표적화시키기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 표적화된 과가수분해 효소에 의해 생성되는 과산 유익제는 다양한 응용, 예를 들어, 탈색, 미백, 소독, 탈염, 탈취 및 이들의 조합을 위해 사용할 수 있다. 구체적으로, 과가수분해 효소, 및 표적 표면(체표면 및 구강 관리 표면 제외)에 대하여 친화성을 갖는 적어도 하나의 펩티드 성분을 포함하는 융합 단백질은 적절한 기질 및 과산소원과 조합하여 사용하여, 표적 물질의 표면 상에서 또는 그 근처에서 과산을 효소에 의해 생성할 수 있다. 바람직한 태양에서, 표적 표면은 셀룰로스 물질이다.

Description

표적화된 과가수분해효소{TARGETED PERHYDROLASES}
관련-출원과의 상호 참조
본 출원은 전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 가특허 출원 제61/424,916호(출원일: 2010년 12월 20일)의 이익을 주장한다.
본 발명은 효소에 의한 과가수분해 및 표적화된 과산 생성의 분야에 관한 것이다. 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분에 결합된 과가수분해 효소를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 조성물 및 방법이 제공된다. 표적화된 효소에 의한 과산 생성을 위한 세탁 관리 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분에 결합된 과가수분해 효소를 포함하는 융합 단백질("표적화된 과가수분해효소")이 제공된다. 바람직한 태양에서, 표적화된 과가수분해효소는 과가수분해 활성을 갖는 CE-7 탄수화물 에스테라제를 포함한다.
퍼옥시카르복실산("과산")은 효과적인 항미생물제이다. 원치 않는 미생물 성장에 대하여 경질 표면, 식품, 살아있는 식물 조직 및 의료 장치를 세정하고/거나 소독하고/거나 위생처리하는 방법이 기재되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,545,047호; 미국 특허 제6,183,807호; 미국 특허 제6,518,307호; 미국 특허 제5,683,724호; 및 미국 특허 제6,635,286호). 또한, 과산은 세탁용 세제 응용을 위한 표백(bleaching) 조성물을 제조하는데 유용한 것으로 보고되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제3,974,082호; 미국 특허 제5,296,161호; 및 미국 특허 제5,364,554호).
과가수분해 효소를 사용하여 과산을 생성할 수 있다. 미국 특허 출원 공개 제2008-0176783 A1호; 제2008-0176299 A1호; 제2009-0005590 A1호; 및 제2010-0041752 A1호(디코시모(DiCosimo) 등)에는 카르복실산 에스테르 기질을 (적절한 과산소원, 예컨대 과산화수소의 존재 하에) 소독제 및/또는 탈색제로 사용하기에 충분한 농도로 과산으로 전환시키기 위한 상당한 과가수분해 활성을 특징으로 하는, 구조적으로 탄수화물 에스테라제의 CE-7 패밀리의 구성원으로 분류된 효소(즉, 세팔로스포린 C 데아세틸라제[CAH] 및 아세틸 자일란 에스테라제[AXE])가 개시되어 있다. 탄수화물 에스테라제의 CE-7 패밀리의 일부 구성원은 일단 반응 성분이 혼합되면, 알코올, 다이올 및 글리세롤의 아세틸 에스테르로부터 1분 내에 4000 내지 5000 ppm, 그리고 5분 내지 30분에 최대 9000 rpm의 퍼아세트산을 생성하기에 충분한 과가수분해 활성을 갖는 것으로 입증되었다(DiCosimo et al., 미국 특허 출원 공개 제2009-0005590 A1호). 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529 A1호에는 과가수분해 활성이 향상된 변이체 CE-7 효소가 기재되어 있다.
과산은 다양한 물질과 반응할 수 있는 강력한 산화제이다. 이와 같이, 비표적화된 물질의 산화가 바람직하지 않을 수 있는 응용에서 과산을 사용하는 경우에 주의를 해야 한다. 특정 과산 응용은 비표적화된 물질의 원치않는 산화의 최소화를 돕기 위한 표적 표면으로의 조절된 전달로부터 이익을 얻을 수 있다.
과산의 표적 표면으로의 전달을 조절하는 한가지 방법은 과산의 생성을 표적 표면 상에 또는 그 근처에 표적화/국소화시키는 것이다. 표적화된 과산 생성은 비-표적화된 물질의 원치않는 산화의 양을 감소시킬 수 있으며, 원하는 효과(예를 들어, 탈색, 탈염(destaining), 탈취, 살균(sanitizing), 소독(disinfecting) 및 세정)를 달성하는데 필요한 과산(또는 과가수분해효소를 포함하는 과산 생성 성분)을 양을 감소시킬 수 있다.
표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 친화성 물질(큰 펩티드 물질, 예를 들어, 항체, 항체 단편(Fab), 단쇄 융합된 가변 영역 항체(scFc), 카멜리대(Camelidae) 항체 및 스캐폴드(scaffold) 디스플레이 단백질)을 사용하여 유익제를 표적 표면에 지향시켰다. 전형적으로, 유익제는 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 물질에 직접 결합된다. 그러나, 이들 큰 펩티드 친화성 물질의 사용의 비용과 복잡성에 의해, 특정 응용에서의 사용에 대하여 그들이 배제될 수 있다.
유익제를 체표면에 표적화시키기 위한 체표면에 대하여 강력한 친화성을 갖는 더 짧은 펩티드의 이용이 기재되어 있다(미국 특허 제7,220,405호; 제7,309,482호 제7,285,264호 및 제7,807,141호; 미국 특허 출원 공개 제2005-0226839 A1호; 제2007-0196305 A1호; 제2006-0199206 A1호; 제2007-0065387 A1호; 제2008-0107614 A1호; 제2007-0110686 A1호; 제2006-0073111 A1호; 제2010-0158846호; 및 제2010-0158847호; 및 PCT 출원 공개 WO2008/054746호; WO2004/048399호 및 WO2008/073368호). 그러나, 과산 유익제의 생성을 위해 과가수분해 효소 촉매(즉, "표적화된 과가수분해효소")를 표면에 결합시키기 위한, 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 이러한 펩티드 물질의 용도는 기재된 적이 없다.
과산 처리로부터 이익을 얻을 수 있는 일부 표적 표면은 셀룰로스 물질로 이루어질 수 있다. 이와 같이, 셀룰로스 물질에 대하여 친화성을 갖는 물질은 표적화된 과산 처리에 유용할 수 있다. 셀룰로스-결합 도메인(CBD)은 통상 셀룰로스 분해와 관련이 있는 다수의 단백질에서 동정되었다. 톰(Tomme) 등(문헌[J. Chromatogr. B (1998) 7125: 283-296])은 13개 패밀리의 셀룰로스-결합 도메인 및 친화성 정제 응용에서의 그들의 용도를 개시하였다. EP1224270B1호에는 통상 길이가 30개 이하의 아미노산이며, 셀룰로스 물질에 대하여 강력한 친화성을 갖는 합성 "모방(mimic)" 셀룰로스-결합 도메인이 개시되어 있다. WO2005/042735 A1호에는 셀룰로스에 대하여 친화성을 갖는 글루코실 가수분해효소 패밀리 61로부터의 비-촉매적 탄수화물-결합 분자가 개시되어 있다. 한(Han) 등(문헌[Shengwu Huaxue Yu Shengwu Wuli Xuebao 30:263 266 (1998)])은 파지 디스플레이 방법을 사용하여 셀룰로스 매트릭스에 특이적으로 결합하는 펩티드의 동정을 기재한다. 이들 셀룰로스-결합 펩티드의 추정된 아미노산 서열은 보존된 방향족 잔기, 티로신 또는 페닐알라닌을 가지며, 이는 일부 셀룰로스-결합 단백질의 보통의 셀룰로스 결합 도메인과 유사하다.
세탁 관리 응용에서 유익제의 표적화된 전달을 위한 융합 단백질 및 키메라 펩티드 구축물의 생성에서의 셀룰로스-결합 도메인의 사용이 보고되어 있다. 미국 특허 제7,361,487호에는 데님 마무리에서 사용하기 위한 이종 셀룰로스 결합 도메인에 결합된 엔도글루카나제 코어(endoglucanase core)를 포함하는 셀룰라제 융합 단백질이 개시되어 있다. CN101591648A호에는 면 섬유 마무리를 위한 셀룰로스 결합 도메인에 융합된 큐티나제(cutinase)를 포함하는 융합 단백질이 개시되어 있다. 미국 특허 출원 공개 제2006-0246566호에는 멜라노카르푸스(Melanocarpus) 종의 중성의 셀룰라아제 코어 및 트리코데르마 리제이(Trichoderma reesei)의 산 셀로비오하이드롤라제(cellobiohydrolase) I의 링커/셀룰로스 결합 도메인으로 이루어진 테일을 포함하는 셀룰라제 융합 단백질이 개시되어 있다.
WO97/40229호 및 WO97/40127호에는 셀룰라제, 및 페놀 산화 효소 융합형 셀룰로스 결합 도메인을 포함하는 하이브리드 효소를 사용한 패브릭(fabric)의 처리 방법이 개시되어 있다. 미국 특허 제6,017,751호에는 α-아밀라제, 리파제, 퍼옥시다제 또는 라카제(laccase)에 융합된 셀룰로스-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질이 개시되어 있다.
미국 특허 제6,586,384호 및 미국 특허 제6,579,842호에는 패브릭 상에 사전-처리된 다중-특이적 결합 분자를 사용하여 사전결정된 활성을 가하는 것에 이어서, 사전-처리된 패브릭과 유익제를 접촉시키는 것을 위한, 유익제를 선택된 패브릭의 영역으로 전달하는 방법이 개시되어 있다. 결합 분자는 유익제에 대하여 친화성을 갖는 제2 부분에 융합된 셀룰로스-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
미국 특허 제6,919,428호에는 셀룰로스-결합 도메인 및 다른 리간드에 대하여 친화성을 갖는 단백질을 포함하는 융합 단백질, 및 이러한 융합 단백질을 포함하는 세제 조성물이 개시되어 있다. 미국 특허 제7,041,793호에는 다른 리간드에 대하여 친화성을 갖는 항체 또는 항체 단편에 결합된 셀룰로스-결합 도메인을 갖는 융합 단백질을 포함하는 세제 조성물이 개시되어 있다. 미국 특허 제6,410,498호에는 셀룰로스-결합 도메인을 포함하는 변형된 트랜스퍼라제를 포함하는 세탁 세제 및 패브릭 관리 조성물이 개시되어 있다. WO99/57250호에는 비-아미노산 링커를 통해 셀룰로스-결합 도메인을 포함하는 영역에 연결된 촉매적으로 활성인 아미노산 서열을 포함하는 변형된 효소가 개시되어 있다.
미국 특허 제6,465,410호에는 향상된 살균 이익을 위한, 셀룰로스-결합 도메인을 포함하는 아미노산 서열에 결합된 항미생물 펩티드 또는 단백질의 촉매적으로 활성인 아미노산 서열을 갖는 변형된 단백질을 포함하는 세탁 세제 및 패브릭 관리 조성물이 개시되어 있다. 미국 특허 제6,906,024호에는 비-아미노산 링커를 통하여 4개의 특이적 셀룰로스 결합 도메인 중 하나에 결합된 패브릭 유연화(fabric softening) 펩티드를 포함하는 패브릭 관리 조성물이 개시되어 있다.
WO2000/018865호 및 EP1115828B1호에는 세탁 관리 응용에서 사용하기 위한 화학 성분에 결합된 셀룰로스-결합 도메인을 포함하는 화학적 엔티티(entity)가 개시되어 있다. WO2005/051997호에는 진균류 효소로부터의 셀룰로스-결합 도메인 및 유익제를 캡슐화하기 위해 사용되는 멜라민-유형 폴리머 대하여 친화성을 갖는 도메인을 포함하는 융합 단백질이 개시되어 있다.
일부 직물 및 부직물은 합성 물질, 예를 들어, 폴리아미드, 나일론, 폴리우레탄, 폴리아크릴레이트, 폴리에스테르, 폴리올레핀, 폴리락티드 및 반합성 물질, 예를 들어, 셀룰로스 아세테이트로 이루어질 수 있다. 이와 같이, 텍스타일(textile)의 제조에 사용되는 이들 및 기타 합성 또는 반-합성 물질 중 임의의 것에 대하여 친화성을 갖는 펩티드-결합 도메인도 또한 과가수분해 효소의 표적화된 전달에 도움이 될 수 있다.
셀룰로스 및 비-셀룰로스 물질, 예를 들어, 면 패브릭, 폴리에스테르/면 혼방, 셀룰로스 아세테이트, 제지(paper), 폴리메틸 메타크릴레이트, 나일론, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리스티렌 및 폴리테트라플루오로에틸렌에 대하여 친화성을 갖는 바이오패닝된 펩티드가 보고되어 있다(미국 특허 제7,709,601호; 제7,700,716호; 제7,632,919호; 제7,858,581호; 제7,928,076호; 및 제7,906,617호; 및 미국 특허 출원 공개 제2005-0054752호; 제2010-0310495호; 제2010-0298231호; 제2010-0298240; 제2010-0298241호; 제2010-0298531호; 제2010-0298532호; 제2010-0298533호; 제2010-0298534; 및 제2010-0298535호). 표적화된 과산 생성을 위한 융합 단백질에서의 이러한 펩티드의 용도는 기재된 적이 없다.
WO 01/79479호(Estell et al.)에는 펩티드 라이브러리를 항-표적과 접촉시켜, 항-표적에 결합된 펩티드를 제거한 다음, 비-결합 펩티드를 표적과 접촉시키는 것을 포함하는 변형된 파지 디스플레이 스크리닝 방법이 개시되어 있다. 이러한 방법을 사용하여, 옷깃 오염(collar soil)에 결합하나 폴리에스테르/면에는 결합하지 않는 펩티드 서열 및 폴리우레탄에 결합하나 면, 폴리에스테르, 또는 폴리에스테르/면 패브릭에는 결합하지 않는 펩티드 서열을 동정하였다. 패브릭에 결합하는 펩티드 서열이 상기 개시내용에 보고되어 있지 않다.
해결해야 할 문제는 표적 표면에 과산 기반의 이익을 제공하기 위한 효소에 의한 과산 생성을 표적 물질의 표면에 표적화시키는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
효소에 의한 과산 생성을 표적 표면에 표적화시키기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 표적 물질의 표면에 대하여 친화성을 갖는 적어도 하나의 펩티드 성분에 결합된 과가수분해 활성을 갖는 효소를 포함하는 융합 단백질이 제공된다. 표적화된 표면은 과가수분해 활성을 갖는 융합 단백질과 접촉되며, 이에 의해, 과가수분해 효소가 표적 표면에 결합된다. 결합된 융합 단백질을 적절한 반응 성분과 배합하여, 표적 표면 상에서 또는 그 근처에서 과산을 효소에 의해 생성할 수 있다.
일 실시형태에서,
1) a) i) 구조
[X]mR5
(여기서, X는 화학식 R6C(O)O의 에스테르기이며,
R6은 하이드록실기 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티이고, R6은 C2 내지 C7인 R6에 대하여, 하나 이상의 에테르 결합을 임의로 포함하고;
R5는 하이드록실기로 임의로 치환된 C1 내지 C6 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티 또는 5-원 환형 헤테로방향족 모이어티, 또는 6-원 환형 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티이며; R5에서 각 탄소 원자는 각각 1개 이하의 하이드록실기 또는 1개 이하의 에스테르기 또는 카르복실산기를 포함하고; R5는 임의로 하나 이상의 에테르 결합을 포함하며;
m은 1 내지 R5에서의 탄소 원자수 범위의 정수이다)를 갖는 에스테르 - 상기 에스테르는 25℃에서 적어도 5 ppm의 수 용해도를 갖는다 - ;
ii) 구조
Figure pct00001
(여기서, R1은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R3 및 R4는 각각 H 또는 R1C(O)이다)를 갖는 글리세리드;
iii) 화학식
Figure pct00002
(여기서, R1은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R2는 C1 내지 C10 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴, (CH2CH2O)n 또는 (CH2CH(CH3)-O)nH이고, n은 1 내지 10이다)의 하나 이상의 에스테르; 및
iv) 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 및 아세틸화 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 아세틸화 당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기질;
b) 과산소원; 및
c) 일반 구조
PAH-[L]y-TSBD
또는
TSBD-[L]y-PAH
(여기서,
PAH는 과가수분해 활성을 갖는 효소이며;
TSBD는 표적 물질의 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이고; 표면은 체표면 또는 구강 표면이 아니며;
L은 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 임의의 펩티드 링커이며;
y는 0 또는 1이다)를 포함하는 과가수분해 활성을 갖는 융합 단백질을 포함하는 반응 성분의 세트를 제공하는 단계; 및
1) (1)의 반응 성분을 적절한 반응 조건 하에서 배합하는 단계 - 이에 의해,
a) 융합 단백질이 표적 표면에 결합하고;
b) 적어도 하나의 과산이 효소에 의해 생성되고, 표적 표면과 접촉하며; 이에 의해, 표적 표면에 표백(bleaching), 미백, 소독, 살균(sanitizing), 탈염(destaining), 탈취 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 과산 기반의 이익이 제공된다 - 를 포함하는 방법이 제공된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 과가수분해 활성을 갖는 효소는 프로테아제, 리파제, 에스테라제, 아실 트랜스퍼라제, 아릴 에스테라제, 탄수화물 에스테라제, 세팔로스포린 아세틸 가수분해효소, 아세틸 자일란 에스테라제 또는 그들의 임의의 조합이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 과가수분해 활성을 갖는 효소는 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처(signature) 모티프를 포함하는 탄수화물 에스테라제이며, 상기 시그니처 모티프는
i) 서열 번호 2의 위치 118 내지 120에 해당하는 위치에서 RGQ 모티프;
ii) 서열 번호 2의 위치 179 내지 183에 해당하는 위치에서 GXSQG 모티프; 및
iii) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함한다.
다른 실시형태에서, 하기의 일반 구조를 포함하는 융합 단백질이 제공된다:
PAH-[L]y-TSBD
또는
TSBD-[L]y-PAH
상기 식에서,
PAH는 과가수분해 활성을 갖는 효소이며;
TSBD는 표적 물질의 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이고; 표면은 체표면 또는 구강 표면이 아니며;
L은 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 임의의 펩티드 링커이고;
y는 0 또는 1이다.
일 실시형태에서, 과가수분해 활성을 갖는 융합 단백질의 효소 부분은 프로테아제, 리파제, 에스테라제, 아실 트랜스퍼라제, 아릴 에스테라제, 탄수화물 에스테라제, 세팔로스포린 아세틸 가수분해효소, 아세틸 자일란 에스테라제 또는 그들의 임의의 조합이다. 다른 실시형태에서, 과가수분해 활성을 갖는 효소 부분은 프로테아제가 아니다.
일 실시형태에서, 융합 단백질은 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 갖는 탄수화물 에스테라제를 포함하며, 상기 시그니처 모티프는
i) 서열 번호 2의 위치 118 내지 120에 해당하는 위치에서 RGQ 모티프;
ii) 서열 번호 2의 위치 179 내지 183에 해당하는 위치에서 GXSQG 모티프; 및
iii) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적 물질에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 항체, Fab 항체 단편, 단쇄 가변 단편(scFv) 항체, 카멜리대(Camelidae) 항체, 스캐폴드(scaffold) 디스플레이 단백질 또는 면역글로불린 폴드(fold)가 결여된 단쇄 폴리펩티드일 수 있다. 다른 실시형태에서, 표적 물질은 셀룰로스 물질로 이루어질 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 표적 물질에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 셀룰로스-결합 도메인 또는 셀룰로스 물질에 대하여 친화성을 갖는 단쇄 펩티드이다.
다른 실시형태에서,
a) i) 구조
[X]mR5
(여기서, X는 화학식 R6C(O)O의 에스테르기이며,
R6은 하이드록실기 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티이고, R6은 C2 내지 C7인 R6에 대하여, 하나 이상의 에테르 결합을 임의로 포함하고;
R5는 하이드록실기로 임의로 치환된 C1 내지 C6 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티 또는 5-원 환형 헤테로방향족 모이어티, 또는 6-원 환형 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티이며; R5에서 각 탄소 원자는 각각 1개 이하의 하이드록실기 또는 1개 이하의 에스테르기 또는 카르복실산기를 포함하고; R5는 임의로 하나 이상의 에테르 결합을 포함하며;
m은 1 내지 R5에서의 탄소 원자수 범위의 정수이다)를 갖는 에스테르 - 상기 에스테르는 25℃에서 적어도 5 ppm의 수 용해도를 갖는다 - ;
ii) 구조
Figure pct00003
(여기서, R1은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R3 및 R4는 각각 H 또는 R1C(O)이다)를 갖는 글리세리드;
iii) 화학식
Figure pct00004
(여기서, R1은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R2는 C1 내지 C10 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴, (CH2CH2O)n 또는 (CH2CH(CH3)-O)nH이고, n은 1 내지 10이다)의 하나 이상의 에스테르; 및
iv) 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 및 아세틸화 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 아세틸화 당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기질;
b) 과산소원; 및
c) 일반 구조
PAH-[L]y-TSBD
또는
TSBD-[L]y-PAH;
(여기서,
PAH는 과가수분해 활성을 갖는 효소이며; 과가수분해 활성을 갖는 상기 효소가 리파제, 프로테아제, 에스테라제, 아실 트랜스퍼라제, 아릴 에스테라제, 탄수화물 에스테라제, 세팔로스포린 아세틸 가수분해효소, 아세틸 자일란 에스테라제 또는 그들의 임의의 조합이고;
TSBD는 표적 물질의 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이고; 표면은 체표면 또는 구강 표면이 아니며;
L은 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 임의의 펩티드 링커이며;
y는 0 또는 1이다)를 포함하는 과가수분해 활성을 갖는 융합 단백질을 포함하는 반응 성분의 세트를 포함하는 과산 생성 시스템이 제공된다.
일 실시형태에서, 과산 생성 시스템의 융합 단백질 성분은 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 갖는 탄수화물 에스테라제를 포함하며, 상기 시그니처 모티프는
i) 서열 번호 2의 위치 118 내지 120에 해당하는 위치에서 RGQ 모티프;
ii) 서열 번호 2의 위치 179 내지 183에 해당하는 위치에서 GXSQG 모티프; 및
iii) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함한다.
다른 실시형태에서, 과산 생성 시스템의 융합 단백질 성분은 서열 번호 162에 대하여 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는 과가수분해 아릴 에스테라제를 포함한다.
다른 실시형태에서,
1) a) i) 구조
[X]mR5
(여기서, X는 화학식 R6C(O)O의 에스테르기이며,
R6은 하이드록실기 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티이고, R6은 C2 내지 C7인 R6에 대하여, 하나 이상의 에테르 결합을 임의로 포함하고;
R5는 하이드록실기로 임의로 치환된 C1 내지 C6 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티 또는 5-원 환형 헤테로방향족 모이어티, 또는 6-원 환형 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티이며; R5에서 각 탄소 원자는 각각 1개 이하의 하이드록실기 또는 1개 이하의 에스테르기 또는 카르복실산기를 포함하고; R5는 임의로 하나 이상의 에테르 결합을 포함하며;
m은 1 내지 R5에서의 탄소 원자수 범위의 정수이다)를 갖는 에스테르 - 상기 에스테르는 25℃에서 적어도 5 ppm의 수 용해도를 갖는다 - ;
ii) 구조
Figure pct00005
(여기서, R1은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R3 및 R4는 각각 H 또는 R1C(O)이다)를 갖는 글리세리드;
iii) 화학식
Figure pct00006
(여기서, R1은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R2는 C1 내지 C10 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴, (CH2CH2O)n 또는 (CH2CH(CH3)-O)nH이고, n은 1 내지 10이다)의 하나 이상의 에스테르; 및
iv) 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 및 아세틸화 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 아세틸화 당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기질;
b) 과산소원; 및
c) 일반 구조
PAH-[L]y-TSBD
또는
TSBD-[L]y-PAH
(여기서,
PAH는 과가수분해 활성을 갖는 효소이며;
TSBD는 표적 물질의 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이고; 표면은 체표면 또는 구강 표면이 아니며;
L은 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 임의의 펩티드 링커이며;
y는 0 또는 1이다)를 포함하는 과가수분해 활성을 갖는 융합 단백질을 포함하는 반응 성분의 세트를 제공하는 단계 - 여기서, 과가수분해 활성을 갖는 효소는 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 포함하며, 상기 시그니처 모티프는
i) 서열 번호 2의 위치 118 내지 120에 해당하는 위치에서 RGQ 모티프;
ii) 서열 번호 2의 위치 179 내지 183에 해당하는 위치에서 GXSQG 모티프; 및
iii) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함한다 - ;
2) 표적 표면과 과가수분해 활성을 갖는 융합 단백질을 접촉시키는 단계 - 이에 의해, 융합 단백질이 표적 표면에 결합한다 - ;
3) 임의로, 표적 표면을 헹구는 단계; 및
4) 결합된 융합 단백질을 갖는 표적 표면을 상기 적어도 하나의 기질 및 과산소원과 접촉시키는 단계 - 이에 의해, 적어도 하나의 과산이 융합 단백질에 의해, 효소에 의해 생성되고, 이에 의해, 표적 표면에 표백, 미백, 소독, 탈염(destaining), 탈취, 생물막(biofilm)의 감소 또는 제거 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 과산 기반의 이익이 제공된다 - 를 포함하는 방법이 제공된다.
바람직한 실시형태에서, 표적 표면은 셀룰로스 물질을 포함한다. 다른 실시형태에서, 셀룰로스 물질은 셀룰로스, 목재, 목재 펄프, 제지, 제지 펄프, 면, 레이온, 라이오셀(lyocell) 또는 그들의 임의의 조합을 포함한다.
다른 실시형태에서, 표적 표면은 표적 물질, 예를 들어, 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리프로필렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리스티렌, 셀룰로스 아세테이트 또는 그들의 임의의 조합을 포함한다.
상기의 많은 물질은 섬유, 실, 텍스타일(직물 및 부직물) 및 의류 물품의 제조에서 통상적으로 관찰되며, 여기서, 과산은 탈색, 미백, 세정, 살균, 소독, 탈염, 탈취 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 이익을 제공할 수 있다.
다른 실시형태에서, 하기의 일반 구조를 갖는 적어도 하나의 융합을 포함하는 세탁 관리 제품이 제공된다:
PAH-[L]y-TSBD
또는
TSBD-[L]y-PAH;
상기 식에서,
PAH는 과가수분해 활성을 갖는 효소이며;
TSBD는 표적 물질의 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이고; 표면은 체표면 또는 구강 표면이 아니며;
L은 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 임의의 펩티드 링커이고;
y는 0 또는 1이다.
다른 실시형태에서, 융합 단백질이 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 갖는 CE-7 탄수화물 에스테라제를 포함하는 세탁 관리 제품이 제공되며, 상기 시그니처 모티프는
i) 서열 번호 2의 위치 118 내지 120에 해당하는 위치에서 RGQ 모티프;
ii) 서열 번호 2의 위치 179 내지 183에 해당하는 위치에서 GXSQG 모티프; 및
iii) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함한다.
다른 실시형태에서, 셀룰로스 물질에 대하여 친화성을 갖는 적어도 하나의 펩티드 성분에 결합된 과가수분해 효소를 포함하는 융합 단백질의 생성 방법이 제공되며, 상기 방법은
a) 융합 단백질을 암호화하는 발현가능한 유전자 구축물을 포함하는 재조합 미생물 숙주 세포를 제공하는 단계 - 상기 융합 단백질은 셀룰로스 물질에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분에 결합된 과가수분해 활성을 갖는 효소를 포함한다 - ;
b) 재조합 미생물 숙주 세포를 적절한 조건 하에서 성장시키는 단계 - 이에 의해, 융합 단백질이 생성된다 - ; 및
c) 임의로, 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
상기 방법의 일 태양에서, 과가수분해 활성을 갖는 효소는 서열 번호 162와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
상기 방법의 다른 태양에서, 과가수분해 활성을 갖는 효소는 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 갖는 CE-7 탄수화물 에스테라제를 포함하며, 상기 시그니처 모티프는
i) 서열 번호 2의 위치 118 내지 120에 해당하는 위치에서 RGQ 모티프;
ii) 서열 번호 2의 위치 179 내지 183에 해당하는 위치에서 GXSQG 모티프; 및
iii) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함한다.
다른 태양에서, 표적 표면의 표백, 미백, 소독, 살균, 탈염 또는 탈취를 위해 유효 농도의 적어도 하나의 과산을 효소에 의해 생성하기 위한, 세탁 제품에서의 본 발명의 하나 이상의 융합 단백질의 용도도 또한 제공된다.
도면의 간단한 설명
도 1. 표적화된 과가수분해효소 및 비표적화된 과가수분해효소에 대한 패브릭 탈색 대 부가되는 효소의 양의 비교
생물학적 서열의 간단한 설명
하기의 서열들은 37 C.F.R. §§ 1.821-1.825("뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열 개시를 포함하는 특허출원에 관한 요건 - 서열 규정")를 따르며 세계지적재산권기구(World Intellectual Property Organization, WIPO) 표준 ST.25(2009), 및 유럽 특허 조약(EPC) 및 특허 협력 조약(PCT)의 서열 목록 요건(규정 5.2 및 49.5(a-bis)) 및 시행세칙의 섹션 208 및 부칙 C에 부합한다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 데이터에 사용된 기호 및 체제는 37 C.F.R. §1.822에 제시된 규정을 따른다.
서열 번호 1은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ATCC(등록 상표) 31954(상표명)로부터의 세팔로스포린 X 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열이다.
서열 번호 2는 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 31954(상표명)로부터의 세팔로스포린 X 데아세틸라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 3은 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 균주 168로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열이다.
서열 번호 4는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 균주 168로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 5는 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 6633(상표명)으로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열이다.
서열 번호 6은 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 6633(상표명)으로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 7은 바실러스 리케니포르미스(B. licheniformis) ATCC(등록 상표) 14580(상표명)으로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열이다.
서열 번호 8은 바실러스 리케니포르미스 ATCC(등록 상표) 14580(상표명)으로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 추정된 아미노산 서열이다.
서열 번호 9는 바실러스 푸밀러스(B. pumilus) PS213으로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.
서열 번호 10은 바실러스 푸밀러스 PS213으로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 추정된 아미노산 서열이다.
서열 번호 11은 클로스트리듐 써모셀룸(Clostridium thermocellum) ATCC(등록 상표) 27405(상표명)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.
서열 번호 12는 클로스트리듐 써모셀룸 ATCC(등록 상표) 27405(상표명)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 추정된 아미노산 서열이다.
서열 번호 13은 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.
서열 번호 14는 써모토가 네아폴리타나로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 15는 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) MSB8로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.
서열 번호 16은 써모토가 마리티마 MSB8로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 17은 써모아나에로박테리움(Thermoanaerobacterium) 종 JW/SL YS485로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.
서열 번호 18은 써모아나에로박테리움 종 JW/SL YS485로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 추정된 아미노산 서열이다.
서열 번호 19는 바실러스 종 NRRL B-14911로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 핵산 서열이다. 진뱅크(GENBANK)(등록 상표) 수탁 번호 ZP_01168674에 보고된 바와 같이, 바실러스 종 NRRL B-14911로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열이 다른 세팔로스포린 C 데아세틸라제와의 서열 정렬, 및 보고된 길이(340개 아미노산) 대 다른 CAH 효소의 관찰된 길이(전형적으로, 길이가 318 내지 325개 아미노산; 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제US-2010-0087528-A1호 참조)의 비교에 기초하여, 아마도 부정확할 것 같은 15개 아미노산 N-말단 부가물을 암호화하는 것으로 보이는 것에 주의해야 한다. 이와 같이, 본 명세서에 보고된 바와 같은 핵산 서열은 진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 ZP_01168674 하에 보고된 N-말단 15개 아미노산이 없는 바실러스 종 NRRL B-14911로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제 서열을 암호화한다.
서열 번호 20은 서열 번호 19의 핵산 서열에 의해 암호화되는 바실러스 종 NRRL B-14911로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 추정된 아미노산 서열이다.
서열 번호 21은 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans) C-125로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열이다.
서열 번호 22는 바실러스 할로두란스 C-125로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 추정된 아미노산 서열이다.
서열 번호 23은 바실러스 클라우시이(Bacillus clausii) KSM-K16으로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열이다.
서열 번호 24는 바실러스 클라우시이 KSM-K16으로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 추정된 아미노산 서열이다.
서열 번호 25는 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 29233(상표명) 세팔로스포린 C 데아세틸라제(CAH)를 암호화하는 핵산 서열이다.
서열 번호 26은 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 29233(상표명) 세팔로스포린 C 데아세틸라제(CAH)의 추정된 아미노산 서열이다.
서열 번호 27은 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호(본 명세서에 그 전문이 참고로 포함)로부터의 써모토가 네아폴리타나 아세틸 자일란 에스테라제 변이체의 추정된 아미노산 서열(여기서, 위치 277에서의 Xaa 잔기는 Ala, Val, Ser 또는 Thr이다)이다.
서열 번호 28은 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호로부터의 써모토가 마리티마 MSB8 아세틸 자일란 에스테라제 변이체의 추정된 아미노산 서열(여기서, 위치 277에서의 Xaa 잔기는 Ala, Val, Ser 또는 Thr이다)이다.
서열 번호 29는 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호로부터의 써모토가 레틴가에(Thermotoga lettingae) 아세틸 자일란 에스테라제 변이체의 추정된 아미노산 서열(여기서, 위치 277에서의 Xaa 잔기는 Ala, Val, Ser 또는 Thr이다)이다.
서열 번호 30은 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호로부터의 써모토가 페트로필라(Thermotoga petrophila) 아세틸 자일란 에스테라제 변이체의 추정된 아미노산 서열(여기서, 위치 277에서의 Xaa 잔기는 Ala, Val, Ser 또는 Thr이다)이다.
서열 번호 31은 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호로부터의 "RQ2(a)" 유래의 써모토가 종 RQ2 아세틸 자일란 에스테라제 변이체의 추정된 아미노산 서열(여기서, 위치 277에서의 Xaa 잔기는 Ala, Val, Ser 또는 Thr이다)이다.
서열 번호 32는 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호로부터의 "RQ2(b)" 유래의 써모토가 종 RQ2 아세틸 자일란 에스테라제 변이체의 추정된 아미노산 서열(여기서, 위치 278에서의 Xaa 잔기는 Ala, Val, Ser 또는 Thr이다)이다.
서열 번호 33은 써모토가 레틴가에 아세틸 자일란 에스테라제의 추정된 아미노산 서열이다.
서열 번호 34는 써모토가 페트로필라 아세틸 자일란 에스테라제의 추정된 아미노산 서열이다.
서열 번호 35는 본 명세서에서 "RQ2(a)"로 기재된 써모토가 종 RQ2로부터의 제1 아세틸 자일란 에스테라제의 추정된 아미노산 서열이다.
서열 번호 36은 본 명세서에서 "RQ2(b)"로 기재된 써모토가 종 RQ2로부터의 제2 아세틸 자일란 에스테라제의 추정된 아미노산 서열이다.
서열 번호 37은 써모아네아로박테리움 사카롤리티쿰(Thermoanearobacterium saccharolyticum) 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열이다.
서열 번호 38은 써모아네아로박테리움 사카롤리티쿰 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 추정된 아미노산 서열이다.
서열 번호 39는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열(진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 EU255910)이다.
서열 번호 40은 락토코커스 락티스(진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 ABX75634.1)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 41은 메소리조비움 로티(Mesorhizobium loti)(진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 NC_002678.2)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.
서열 번호 42는 메소리조비움 로티(진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 BAB53179.1)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 43은 게오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus)(진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 AF038547.2)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.
서열 번호 44는 게오바실러스 스테아로써모필러스(진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 AAF70202.1)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 45는 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 대하여 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제(변이체 "A3"로 알려져 있는)를 암호화하는 핵산 서열이다: (F24I/S35T/Q179L/N275D/C277S/S308G/F317S).
서열 번호 46은 "A3" 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 47은 N275D/C277S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.
서열 번호 48은 N275D/C277S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 49는 C277S/F317S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.
서열 번호 50은 C277S/F317S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 51은 S35T/C277S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.
서열 번호 52는 S35T/C277S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 53은 Q179/C277S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.
서열 번호 54는 Q179L/C277S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 55는 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 대하여 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 843H9를 암호화하는 핵산 서열이다: (L8R/L125Q/Q176L/V183D/F247I/C277S/P292L).
서열 번호 56은 843H9 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 57은 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 대하여 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 843F12를 암호화하는 핵산 서열이다: K77E/A266E/C277S.
서열 번호 58은 843F12 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 59는 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 대하여 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 843C12를 암호화하는 핵산 서열이다: F27Y/I149V/A266V/C277S/I295T/N302S.
서열 번호 60은 843C12 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 61은 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 대하여 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 842H3을 암호화하는 핵산 서열이다: L195Q/C277S.
서열 번호 62는 842H3 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 63은 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 대하여 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 841A7을 암호화하는 핵산 서열이다: Y110F/C277S.
서열 번호 64는 841A7 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 65 내지 127은 다양한 폴리머 및 셀룰로스 물질에 대하여 친화성을 갖는 다양한 펩티드의 아미노산 서열이다. 서열 번호 65 내지 79는 폴리메틸 메타크릴레이트에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이고, 서열 번호 80 내지 86은 폴리프로필렌에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이며, 서열 번호 87 내지 95는 폴리테트라플루오로에틸렌에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이고, 서열 번호 96 내지 102는 폴리에틸렌에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이며, 서열 번호 103 내지 108은 폴리아미드(나일론)에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이고, 서열 번호 109 내지 111은 폴리스티렌에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이며, 서열 번호 112 내지 115는 셀룰로스 아세테이트에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이고, 서열 번호 116 및 117은 면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이며, 서열 번호 116 및 118은 폴리에스테르/면 혼방에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이고, 서열 번호 119 내지 121은 제지에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이며, 서열 번호 122 내지 127은 셀룰로스에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이다.
서열 번호 128 내지 140 및 143은 펩티드 링커/스페이서의 아미노산 서열이다.
서열 번호 141은 발현 플라스미드 pLD001의 핵산 서열이다.
서열 번호 142는 써모토가 마리티마 변이체 C277S("PAH")의 아미노산 서열이다.
서열 번호 143은 써모토가 마리티마 변이체 C277S를 결합 도메인 HC263에 연결시키는 가요성 링커의 아미노산 서열이다.
서열 번호 144는 융합 펩티드 C277S-HC263을 암호화하는 핵산 서열이다.
서열 번호 145는 융합 펩티드 C277S-HC263("PAH-HC263")의 아미노산 서열이다.
서열 번호 146은 모발-결합 도메인 HC263의 아미노산이다.
서열 번호 147은 융합 구축물 C277S-CIP를 암호화하는 핵산 서열이다.
서열 번호 148은 융합 펩티드 C277S-CIP의 아미노산 서열이다.
서열 번호 149는 C-말단 His 태그를 갖는 클로스트리듐 써모셀룸의 셀룰로스-결합 도메인 "CIP"의 아미노산 서열이다.
서열 번호 150은 가요성 링커를 통하여 클로스트리듐 셀룰로보란스 CBM17 셀룰로스-결합 도메인에, 그의 C-말단에서 융합된 써모토가 마리티마 변이체 C277S 과가수분해효소를 암호화하는 합성 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 151은 가요성 링커를 통하여 클로스트리듐 셀룰로보란스 CBM17 셀룰로스-결합 도메인에, 그의 C-말단에서 융합된 써모토가 마리티마 변이체 C277S 과가수분해효소의 아미노산 서열이다.
서열 번호 152는 C-말단 His 태그를 갖는 클로스트리듐 셀룰로보란스 CBM17 셀룰로스-결합 도메인의 아미노산 서열이다.
서열 번호 153은 가요성 링커를 통하여 바실러스 종 CBM28 셀룰로스-결합 도메인에, 그의 C-말단에서 융합된 써모토가 마리티마 변이체 C277S 과가수분해효소를 암호화하는 합성 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 154는 가요성 링커를 통하여 바실러스 종 CBM28 셀룰로스-결합 도메인에, 그의 C-말단에서 융합된 써모토가 마리티마 변이체 C277S 과가수분해효소의 아미노산 서열이다.
서열 번호 155는 C-말단 His 태그를 갖는 바실러스 종 CBM28 셀룰로스-결합 도메인의 아미노산 서열이다.
서열 번호 156은 가요성 링커를 통하여 써모토가 마리티마 CBM9-2 셀룰로스-결합 도메인에, 그의 C-말단에서 융합된 써모토가 마리티마 변이체 C277S 과가수분해효소를 암호화하는 합성 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 157은 가요성 링커를 통하여 써모토가 마리티마 CBM9-2 셀룰로스-결합 도메인에, 그의 C-말단에서 융합된 써모토가 마리티마 변이체 C277S 과가수분해효소의 아미노산 서열이다.
서열 번호 158은 써모토가 마리티마 CBM9-2 셀룰로스-결합의 아미노산 서열이다.
서열 번호 159는 가요성 링커를 통하여 칼디셀룰로시룹터 사카로라이티쿠스(Caldicellulosiruptor saccharolyticus) CBD1 셀룰로스-결합 도메인에, 그의 C-말단에서 융합된 써모토가 마리티마 변이체 C277S 과가수분해효소를 암호화하는 합성 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 160은 가요성 링커를 통하여 칼디셀룰로시룹터 사카로라이티쿠스 CBD1 셀룰로스-결합 도메인에 그의 C-말단에서 융합된 써모토가 마리티마 변이체 C277S 과가수분해효소의 아미노산 서열이다.
서열 번호 161은 칼디셀룰로시룹터 사카로라이티쿠스 CBD1 셀룰로스0결합의 아미노산 서열이다.
서열 번호 162는 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 아릴 에스테라제의 S54V 변이체의 아미노산 서열이다(미국 특허 제7,754,460호; WO2005/056782호; 및 EP1689859 B1호).
서열 번호 163은 슈도모나스 플루오레슨스 에스테라제의 L29P 변이체의 아미노산 서열이다(미국 특허 제7,384,787호).
서열 번호 164는 가요성 링커를 통하여 셀룰로스 결합 도메인 클로스트리듐 써모셀룸(CIP)에 그의 C-말단에 융합된 바실러스 푸밀러스로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 합성 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 165는 가요성 링커를 통하여 셀룰로스 결합 도메인 클로스트리듐 써모셀룸(CIP)에 융합된 바실러스 푸밀러스로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 166은 가요성 링커를 통하여 셀룰로스 결합 도메인 클로스트리듐 써모셀룸(CIP)에 그의 C-말단에서 융합된 락토코커스 락티스 아종 락티스로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 합성 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 167은 가요성 링커를 통하여 셀룰로스 결합 도메인 클로스트리듐 써모셀룸(CIP)에 융합된 락토코커스 락티스 아종 락티스로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 168은 가요성 링커를 통하여 셀룰로스 결합 도메인 클로스트리듐 써모셀룸(CIP)에 그의 C-말단에서 융합된 메소리조비움 로티로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 합성 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 169는 가요성 링커를 통하여 셀룰로스 결합 도메인 클로스트리듐 써모셀룸(CIP)에 융합된 메소리조비움 로티로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 170은 가요성 링커를 통하여 셀룰로스 결합 도메인 클로스트리듐 써모셀룸(CIP)에 그의 C-말단에서 융합된 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 아릴 에스테라제의 S54V 변이체로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 합성 유전자의 뉴레오티드 서열이다.
서열 번호 171은 가요성 링커를 통하여 셀룰로스 결합 도메인 클로스트리듐 써모셀룸(CIP)에 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 아릴 에스테라제의 S54V 변이체로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 172는 가요성 링커를 통하여 칼디셀룰로시룹터 사카로라이티쿠스 CBD1 셀룰로스-결합 도메인에 그의 C-말단에서 융합된 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 아릴 에스테라제의 S54V 변이체로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 합성 유전자의 뉴레오티드 서열이다.
서열 번호 173은 가요성 링커를 통하여 칼디셀룰로시룹터 사카로라이티쿠스 CBD1 셀룰로스-결합 도메인에 융합된 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 아릴 에스테라제의 S54V 변이체로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 174는 가요성 링커를 통하여 써모토가 마리티마 CBM9-2 셀룰로스-결합 도메인에 그의 C-말단에서 융합된 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 아릴 에스테라제의 S54V 변이체로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 합성 유전자의 뉴레오티드 서열이다.
서열 번호 175는 가요성 링커를 통하여 써모토가 마리티마 CBM9-2 셀룰로스-결합 도메인에 융합된 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 아릴 에스테라제의 S54V 변이체로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 176은 가요성 링커를 통하여 셀룰로스 결합 도메인 클로스트리듐 써모셀룸(CIP)에 그의 C-말단에서 융합된 슈도모나스 플루오레슨스로부터의 가수분해효소의 L29P 변이체로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 합성 유전자의 뉴레오티드 서열이다.
서열 번호 177은 가요성 링커를 통하여 셀룰로스 결합 도메인 클로스트리듐 써모셀룸(CIP)에 융합된 슈도모나스 플루오레슨스로부터의 가수분해효소의 L29P 변이체로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 178은 가요성 링커를 통하여 써모토가 마리티마 CBM9-2 셀룰로스 결합 도메인에, 그의 C-말단에서 융합된 슈도모나스 플루오레슨스로부터의 가수분해효소의 L29P 변이체로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 합성 유전자의 뉴레오티드 서열이다.
서열 번호 179는 가요성 링커를 통하여 써모토가 마리티마 CBM9-2 셀룰로스-결합 도메인에 융합된 슈도모나스 플루오레슨스로부터의 가수분해효소의 L29P 변이체로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.
서열 번호 180은 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 야생형 아릴 에스테라제의 아미노산 서열이다(미국 특허 제7,754,460호; WO2005/056782호; 및 EP1689859 B1호).
서열 번호 181은 슈도모나스 플루오레슨스 에스테라제의 아미노산 서열이다(미국 특허 제7,384,787호).
본 개시내용에서, 다수의 용어 및 약어가 사용된다. 하기의 정의는 특별히 다르게 언급되지 않는 한 적용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 요소 또는 성분 앞의 부정 관사("a", "an") 및 정관사("the")는 요소 또는 성분의 경우(즉, 발생)의 수에 관해서는 비제한적인 것으로 의도된다. 따라서, 부정 관사("a", "an") 및 정관사("the")는 하나 또는 적어도 하나를 포함하는 것으로 파악되어야 하며, 요소 또는 성분의 단수형은 그 수가 명백하게 단수임을 의미하는 것이 아니라면 복수형도 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는"은 특허청구범위에서 인용된 바와 같은 언급된 특징, 정수, 단계, 또는 성분의 존재를 의미하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 성분 또는 그의 그룹의 존재 또는 부가를 배제하지 않는다. 용어 "포함하는"은 용어 "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진"에 의해 포함되는 실시형태를 포함하고자 한다. 유사하게, 용어 "본질적으로 이루어진"은 용어 "이루어진"에 의해 포함되는 실시형태를 포함하고자 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 사용되는 성분 또는 반응물질의 양을 수식하는 용어 "약"은 예를 들어, 현장에서 농축물 또는 사용 용액을 제조하는 데 사용되는 전형적인 측정 및 액체 취급 절차를 통해; 이들 과정에서의 우발적인 오차를 통해; 조성물을 제조하거나 방법을 실행하기 위해 적용된 성분의 제조, 공급원 또는 순도의 차이 등을 통해 발생할 수 있는 수치 분량의 변이를 말한다. 용어 "약"은 또한 특정 초기 혼합물로부터 유발되는 조성물에 대한 상이한 평형 조건으로 인해 달라지는 양을 포함한다. 용어 "약"에 의한 수식 여부를 불문하고, 특허청구범위는 분량의 균등물을 포함한다.
모든 범위는 존재하는 경우 포괄적이며 조합가능하다. 예를 들어, "1 내지 5"의 범위가 기재되는 경우, 기재된 범위는 범위 "1 내지 4", "1 내지 3", "1 내지 2", "1 내지 2 및 4 내지 5", "1 내지 3 및 5" 등을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 "접촉"은 원하는 결과(표적 표면 결합, 과산 기반의 효과 등)를 달성하는데 충분한 기간 동안 조성물을 표적 표면과 접촉하게 배치하는 것을 말한다 조건부로, 표적 표면은 체표면(예를 들어, 모발, 네일, 피부 등) 및 구강 관리 표면(예를 들어, 잇몸, 치아 등)을 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, "접촉"은 원하는 결과를 달성하는데 충분한 기간 동안 유효 농도의 과산을 포함하는(또는 이를 생성할 수 있는) 조성물을 표적 표면과 접촉하게 배치하는 것을 말할 수 있다. 다른 실시형태에서, "접촉"은 또한 세탁 관리 조성물의 적어도 하나의 성분, 예를 들어, 효소에 의한 과가수분해에 사용되는 하나 이상의 반응 성분을 표적 표면과 접촉하게 배치하는 것을 말할 수 있다. 접촉은 유효 농도의 과산을 포함하는 과산 용액 또는 조성물, 유효 농도의 과산을 형성하는 용액 또는 조성물, 또는 유효 농도의 과산을 형성하는 조성물의 한 성분을 표적 표면으로의 분무, 처리, 침지, 플러싱(flushing), 그의 위 또는 안으로의 주입, 혼합, 조합, 페인팅, 코팅, 도포, 부착 및 다르게는 전달을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "기질", "적절한 기질" 및 "카르복실산 에스테르 기질"은 상호교환적으로, 구체적으로
(a) 구조
[X]mR5
(여기서,
X는 화학식 R6C(O)O의 에스테르기이며;
R6은 하이드록실기 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티이고, R6은 C2 내지 C7인 R6에 대하여, 하나 이상의 에테르 결합을 임의로 포함하고;
R5는 하이드록실기로 임의로 치환된 C1 내지 C6 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티 또는 5-원 환형 헤테로방향족 모이어티, 또는 6-원 환형 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티이며, R5에서 각 탄소 원자는 각각 1개 이하의 하이드록실기 또는 1개 이하의 에스테르기 또는 카르복실산기를 포함하고, R5는 임의로 하나 이상의 에테르 결합을 포함하며;
m은 1 내지 R5에서의 탄소 원자수 범위의 정수이다)를 갖는 에스테르 - 상기 하나 이상의 에스테르는 25℃에서 적어도 5 ppm의 수 용해도를 갖는다 - ; 또는
(b) 구조
Figure pct00007
(여기서, R1은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R3 및 R4는 각각 H 또는 R1C(O)이다)를 갖는 하나 이상의 글리세리드;
(c) 화학식
Figure pct00008
(여기서, R1은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R2는 C1 내지 C10 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴, (CH2CH2O)n 또는 (CH2CH(CH3)-O)nH이고, n은 1 내지 10이다)의 하나 이상의 에스테르; 또는
(d) 하나 이상의 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 또는 아세틸화 다당류; 또는
(e) (a) 내지 (d)의 임의의 조합을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "과산"은 퍼옥시산, 퍼옥시카르복실산, 퍼옥시산, 퍼카르복실산 및 퍼옥소산과 같은 의미이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "과아세트산"은 "PAA"로 약칭되며, 퍼옥시아세트산, 에탄퍼옥소산 및 CAS 등록 번호 79-21-0의 모든 다른 유의어와 같은 의미이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "모노아세틴"은 글리세롤 모노아세테이트, 글리세린 모노아세테이트 및 글리세릴 모노아세테이트와 같은 의미이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "다이아세틴"은 글리세롤 다이아세테이트; 글리세린 다이아세테이트, 글리세릴 다이아세테이트 및 CAS 등록 번호 25395-31-7의 모든 다른 유의어와 같은 의미이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "트라이아세틴"은 글리세린 트라이아세테이트; 글리세롤 트라이아세테이트; 글리세릴 트라이아세테이트, 1,2,3-트라이아세톡시프로판; 1,2,3-프로판트라이올 트라이아세테이트 및 CAS 등록 번호 102-76-1의 모든 다른 유의어와 같은 의미이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "모노부티린"은 글리세롤 모노부티레이트, 글리세린 모노부티레이트 및 글리세릴 모노부티레이트와 같은 의미이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "다이부티린"은 글리세롤 다이부티레이트 및 글리세릴 다이부티레이트와 같은 의미이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "트라이부티린"은 글리세롤 트라이부티레이트, 1,2,3-트라이부티릴글리세롤 및 CAS 등록 번호 60-01-5의 모든 다른 유의어와 같은 의미이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "모노프로피오닌"은 글리세롤 모노프로피오네이트, 글리세린 모노프로피오네이트 및 글리세릴 모노프로피오네이트와 같은 의미이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "다이프로피오닌"은 글리세롤 다이프로피오네이트 및 글리세릴 다이프로피오네이트와 같은 의미이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "트라이프로피오닌"은 글리세릴 트라이프로피오네이트, 글리세롤 트라이프로피오네이트, 1,2,3-트라이프로피오닐글리세롤 및 CAS 등록 번호 139-45-7의 모든 다른 유의어와 같은 의미이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "아세틸화 당" 및 "아세틸화 당류"는 적어도 하나의 아세틸기를 포함하는 단당류, 이당류 및 다당류를 말한다. 예에는, 글루코스 펜타아세테이트; 자일로스 테트라아세테이트; 아세틸화 자일란; 아세틸화 자일란 단편; β-D-리보푸라노스-1,2,3,5-테트라아세테이트; 트라이-O-아세틸-D-갈락탈; 및 트라이-O-아세틸-글루칼이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "하이드로카르빌", "하이드로카르빌기" 및 "하이드로카르빌 모이어티"는 단일, 이중 또는 삼중 탄소-탄소 결합 및/또는 에테르 결합으로 연결되고, 이에 따라 수소 원자로 치환된 직쇄, 분지쇄 또는 환형 배열의 탄소 원자를 의미한다. 이러한 하이드로카르빌기는 지방족 및/또는 방향족일 수 있다. 하이드로카르빌기의 예에는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, t-부틸, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 펜틸, 사이클로펜틸, 메틸사이클로펜틸, 헥실, 사이클로헥실, 벤질 및 페닐이 포함된다. 바람직한 실시형태에서, 하이드로카르빌 모이어티는 단일 탄소-탄소 결합 및/또는 에테르 결합으로 연결되고 이에 따라 수소 원자로 치환된 직쇄, 분지쇄 또는 환형 배열의 탄소 원자이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 1,2-에탄다이올; 1,2-프로판다이올; 1,3-프로판다이올; 1,2-부탄다이올; 1,3-부탄다이올; 2,3-부탄다이올; 1,4-부탄다이올; 1,2-펜탄다이올; 2,5-펜탄다이올; 2,5-펜탄다이올; 1,6-펜탄다이올; 1,2-헥산다이올; 2,5-헥산다이올; 1,6-헥산다이올 및 그들의 혼합물의 "모노에스테르" 및 "다이에스테르"는 화학식 RC(O)O(여기서, R은 C1 내지 C7 선형 하이드로카르빌 모이어티이다)의 적어도 하나의 에스테르기를 포함하는 상기 화합물을 말한다. 일 실시형태에서, 카르복실산 에스테르 기질은 프로필렌 글리콜 다이아세테이트(PGDA), 에틸렌 글리콜 다이아세테이트(EDGA) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로필렌 글리콜 다이아세테이트"는 1,2-다이아세톡시프로판, 프로필렌 다이아세테이트, 1,2-프로판다이올 다이아세테이트 및 CAS 등록 번호 623-84-7의 모든 다른 유의어와 같은 의미이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "에틸렌 글리콜 다이아세테이트"는 1,2-다이아세톡시에탄, 에틸렌 다이아세테이트, 글리콜 다이아세테이트 및 CAS 등록 번호 111-55-7의 모든 다른 유의어와 같은 의미이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "적절한 효소적 반응 혼합물", "과산의 동소 생성에 적절한 성분", "적절한 반응 성분", "적절한 수성 반응 혼합물", "반응 혼합물" 및 "과산-생성 성분"은 반응물질 및 과가수분해 효소 촉매가 접촉되는 물질 및 물을 말한다. 과산-생성 성분은 인간 또는 동물 체표면에 표적화되지 않고, 적어도 하나의 적절한 카르복실산 에스테르 기질, 과산소원 및 물(과산소원, 예를 들어, 과산화수소를 포함하는 수용액)인 융합 단백질의 형태의 적어도 하나의 과가수분해효소를 포함할 것이다. 바람직한 태양에서, 과가수분해효소는 비-체표면에 표적화된 융합 단백질의 형태의 CE-7 과가수분해효소이다. 바람직한 실시형태에서, 비-체표면은 세탁 관리 표면이다. 추가의 바람직한 태양에서, 표적 표면은 셀룰로스 및/또는 셀룰로스 물질을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "과가수분해"는 과산을 형성하기 위한 선택된 기질과 과산화물의 반응으로 정의된다. 전형적으로, 무기 과산화물은 촉매의 존재 하에 선택된 기질과 반응하여, 퍼옥시카르복실산을 생성한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "화학적 과가수분해"는 기질(퍼옥시카르복실산 전구체)을 과산화수소원과 배합하는 과가수분해 반응을 포함하며, 퍼옥시카르복실산은 효소 촉매의 부재 하에 형성된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "효소에 의한 과가수분해"는 카르복실산 에스테르 기질(과산 전구체)을 과산화수소원 및 물과 배합하여, 효소 촉매가 과산의 형성을 촉매작용시키는 과가수분해 반응을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "과가수분해효소 활성"은 단백질, 건조 세포 중량 또는 고정화된 촉매 중량의 단위 질량(예를 들어, 밀리그램)당 촉매 활성을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 "효소 활성 1 유닛" 또는 "활성 1 유닛" 또는 "U"는 특정 온도에서 분당 1 μmol의 퍼옥시카르복실산 생성물의 생성에 필요한 과가수분해효소 활성의 양으로 정의된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "효소 촉매" 및 "과가수분해효소 촉매"는 과가수분해 활성을 갖는 효소를 포함하는 촉매를 말하며, 온전한 미생물 세포, 투과화된(permeabilized) 미생물 세포(들), 미생물 세포 추출물의 하나 이상의 세포 성분, 부분 정제된 효소 또는 정제된 효소의 형태일 수 있다. 또한, 효소 촉매는 화학적으로 변형될 수 있다(예를 들어, 페길화(pegylation)에 의하여 또는 가교 결합 시약과의 반응에 의하여). 또한, 과가수분해효소 촉매는 당업자에게 널리 공지되어 있는 방법을 사용하여 용해성 또는 불용성 지지체 상에 고정화될 수 있으며; 예를 들어, 문헌[Immobilization of Enzymes and Cells; Gordon F. Bickerstaff, Editor; Humana Press, Totowa, NJ, USA; 1997]을 참조한다.
본 명세서에 사용되는 "표적화된 과가수분해효소" 또는 "표적화된 과가수분해 효소"는 적어도 과가수분해 활성을 갖는 효소를 갖는 제1 부분 및 조건부로, 인간 모발, 인간 피부, 인간 네일 또는 인간 구강 표면을 포함하지 않는 표적 물질의 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분을 포함하는 적어도 하나의 제2 부분을 포함하는 과가수분해 융합 단백질을 지칭할 것이다. 개인 관리 응용에서의 사용을 위한 표적화된 과가수분해효소에 관한 공동-계류 중인 출원(공동-소유의, 공동-계류 중인 미국 특허 출원(명칭: "ENZYMATIC PERACID GENERATION FOR USE IN ORAL CARE PRODUCTS" (대리인 문서 번호 CL5256) 및 "ENZYMATIC PERACID GENERATION FOR USE IN HAIR CARE PRODUCTS" (대리인 문서 번호 CL5175)))이 존재하기 때문에, 신체 및 구강 표면을 배제하는 상술된 조건을 포함시켰다. 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 효소에 의한 과산 생성을 표적 표면 상에 또는 그 근처에 국소화시키거나 표적화시키기 위해 선택된다. 일 실시형태에서, 표적 물질은 천연 섬유, 반합성 섬유 또는 합성 섬유 또는 섬유의 혼방을 포함하는 실, 섬유, 텍스타일 또는 패브릭이다. 다른 실시형태에서, 표적 표면은 셀룰로스 물질, 예를 들어, 셀룰로스, 목재, 목재 펄프, 제지, 제지 펄프, 면, 레이온 및 라이오셀(lyocell)을 포함한다. 다른 실시형태에서, 표적 물질은 셀룰로스 물질을 포함하는 섬유, 실, 텍스타일 또는 패브릭(직물 또는 부직물)의 형태이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "셀룰로스"는 셀룰로스를 포함하거나 이로부터 유래된 물질을 말한다. 본 명세서에 사용되는 "셀룰로스"는 통상 수백 내지 수천개의 유닛을 포함하는 선형 사슬 β(1→4) 연결된 D-글루코스 유닛으로 이루어진 다당류이다. 셀룰로스 물질의 예는 셀룰로스, 목재, 목재 펄프, 제지, 면, 레이온 및 라이오셀(유기 용매 방사 과정에 의해 수득되는 셀룰로스 섬유)을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "셀룰로스-결합 도메인"은 많은 셀룰로스 분해 효소에 존재하는 셀룰로스에 대하여 강력한 친화성을 갖는 자연 발생 결합 도메인을 말한다(상기 문헌[Tomme et al.]). 본 명세서에 기재된 비-표적화된 과가수분해 효소는 천연적으로 셀룰로스-결합 도메인을 함유하지 않는다. 이와 같이, 셀룰로스 물질에 대하여 친화성을 갖도록 고안된 표적화된 과가수분해효소는 과가수분해 효소 및 셀룰로스 물질에 대하여 친화성을 갖는 적어도 하나의 펩티드 성분을 포함하는 융합 단백질이다. 일 실시형태에서, 펩티드 성분은 셀룰로스-결합 도메인의 이용을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "아세틸 자일란 에스테라제"는 아세틸화 자일란 및 기타 아세틸화 당류의 탈아세틸화를 촉매작용시키는 효소(E.C. 3.1.1.72; AXE)를 말한다. 본 명세서에 예시된 바와 같이, 유의미한 과가수분해 활성을 갖는 아세틸 자일란 에스테라제로 분류되는 몇몇 효소가 제공된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "세팔로스포린 C 데아세틸라제" 및 "세팔로스포린 C 아세틸 가수분해효소"는 세팔로스포린, 예를 들어, 세팔로스포린 C 및 7-아미노세팔로스포란산의 탈아세틸화를 촉매작용시키는 효소(E.C. 3.1.1.41)를 말한다(문헌[Mitsushima et al., (1995) Appl . Env . Microbiol. 61(6):2224-2229]). 유의미한 과가수분해 활성을 갖는 몇몇 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 아미노산 서열이 본 명세서에 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 31954(상표명) "는 국제 기탁소 수탁 번호가 ATCC(등록 상표) 31954(상표명)인 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(ATCC)에 기탁된 박테리아 세포를 말한다. 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 31954(상표명)는 2 내지 8개 탄소 아실기를 갖는 글리세롤 에스테르, 특히 다이아세틴을 가수분해시킬 수 있는 에스테르 가수분해효소("다이아세티나제") 활성을 갖는 것으로 보고되었다(미국 특허 제4,444,886호; 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨). 본 명세서에 기재된 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 31954(상표명)로부터의 유의미한 과가수분해효소 활성을 갖는 효소는 서열 번호 2로 제공된다(미국 특허 출원 공개 제2010-0041752호 참조). 분리된 효소의 아미노산 서열은 진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 BAA01729.1에 의해 제공되는 세팔로스포린 C 데아세틸라제에 대하여 100% 아미노산 동일성을 갖는다(상기 문헌[Mitsushima et al.]).
본 명세서에 사용되는 용어 "써모토가 마리티마 MSB8"은 아세틸 자일란 에스테라제 활성을 갖는 것으로 보고된 박테리아 세포를 말한다(진뱅크(등록 상표) NP_227893.1; 미국 특허 출원 공개 제2008-0176299호 참조). 써모토가 마리티마 MSB8로부터의 과가수분해효소 활성을 갖는 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 16으로 제공되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "분리된 핵산 분자", "분리된 폴리뉴클레오티드" 및 "분리된 핵산 단편"은 상호호환적으로 사용될 것이며, 임의로 합성, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드 염기를 함유하는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 RNA 또는 DNA의 폴리머를 지칭할 것이다. DNA의 폴리머 형태인 분리된 핵산 분자는 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 하나 이상의 세그먼트로 이루어질 수 있다.
용어 "아미노산"은 단백질 또는 폴리펩티드의 기본 화학 구조 단위를 지칭한다. 하기의 약어는 특정 아미노산을 확인하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
Figure pct00009
예를 들어, 주어진 부위에 화학적으로 균등한 아미노산의 생성을 유발하면서 암호화된 단백질의 기능적 특성에 영향을 미치지 않는 유전자의 변경이 흔하다는 것은 당업계에 주지되어 있다. 본 발명의 목적상, 치환은 하기 5 개 그룹 중 하나의 그룹 내에서의 교환으로 정의된다:
1. 비극성 또는 약간 극성인 작은 지방족 잔기: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);
2. 극성의, 음성 하전된 잔기 및 그의 아미드: Asp, Asn, Glu, Gln;
3. 양으로 하전된 극성 잔기: His, Arg, Lys;
4. 비극성인 큰 지방족 잔기: Met, Leu, Ile, Val (Cys); 및
큰 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp.
따라서, 소수성 아미노산인 아미노산 알라닌에 대한 코돈은 소수성이 보다 낮은 다른 잔기(예를 들어, 글리신) 또는 소수성이 보다 높은 잔기(예를 들어, 발린, 류신 또는 아이소류신)를 암호화하는 코돈으로 치환될 수 있다. 마찬가지로, 음으로 하전된 하나의 잔기로 다른 하나를 치환하거나(예를 들어 글루탐산을 아스파르트산으로) 양으로 하전된 하나의 잔기로 다른 하나를 치환하는(예를 들어, 아르기닌을 라이신으로) 변화도 기능적으로 균등한 생성물을 생성시킬 수 있을 것으로 예상된다. 많은 경우에, 단백질 분자의 N-말단 및 C-말단 부분의 변경을 유발하는 뉴클레오티드 변화도 단백질의 활성을 변경하지 않을 것으로 예상된다. 각각의 제안된 변형은 당업계의 통상적 기술로 충분히 가능하며, 암호화된 생성물의 생물학적 활성의 보유를 결정하는 것도 그러하다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "시그니처 모티프" 및 "진단 모티프"는 정의된 활성을 갖는 효소의 패밀리 중에 공유되는 보존된 구조를 지칭한다. 시그니처 모티프를 사용하여, 정의된 기질의 패밀리에 대하여 유사한 효소 활성을 갖는 구조적으로 관련된 효소의 패밀리를 정의하고/거나 동정할 수 있다. 시그니처 모티브는 단일의 연속 아미노산 서열 또는 함께 시그니처 모티프를 형성하는 보존된 불연속 모티프의 집합일 수 있다. 전형적으로, 보존된 모티프(들)는 아미노산 서열로 나타낸다. 바람직한 태양에서, 시그니처 모티프는 "CE-7 시그니처 모티프", "과가수분해 활성"을 갖는 탄수화물 에스테라제 패밀리 7("CE-7 탄수화물 에스테라제")의 구성원에 공유되는 보존된 구조적 모티프이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "코돈 최적화된"은 그것이 다양한 숙주의 형질전환을 위한 핵산 분자의 유전자 또는 암호화 영역을 지칭하기 때문에, DNA가 암호화하는 폴리펩티드를 변경시키지 않고, 숙주 유기체의 전형적인 코돈 사용을 반영하기 위한 핵산 분자의 유전자 또는 암호화 영역에서의 코돈의 변경을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "합성 유전자"는 당업자에게 공지되어 있는 절차를 사용하여 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 빌딩 블록(building block)으로부터 조립될 수 있다. 이들 빌딩 블록을 라이게이션시키고 어닐링시켜, 유전자 세그먼트를 형성하고, 이어서, 이를 효소에 의해 조립하여 전체 유전자를 구축한다. DNA 서열에 관계된 바와 같은 "화학적으로 합성된"은 뉴클레오티드 성분이 시험관 내에서 조립되는 것을 의미한다. DNA의 수동의 화학적 합성은 널리 확립되어 있는 절차를 사용하여 달성될 수 있거나, 자동화된 화학적 합성은 다수의 상업적으로 입수할 수 있는 장치 중 하나를 사용하여 수행할 수 있다. 따라서, 유전자는 숙주 세포의 코돈 편향을 반영하기 위한 뉴클레오티드 서열의 최적화에 기초하여 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다. 당업자는 코돈 사용이 숙주가 선호하는 코돈에 편향된다면, 성공적인 유전자 발현이 가능함을 인식한다. 바람직한 코돈의 결정은 서열 정보를 이용할 수 있는 숙주 세포 유래의 유전자의 조사에 기초할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "유전자"는 암호화 서열에 앞서는 조절 서열(5' 비암호화 서열) 및 암호화 서열에 뒤따르는 조절 서열(3' 비암호화 서열)을 포함하는, 특정 단백질을 발현하는 핵산 분자를 말한다. "천연 유전자"는 그 자체의 조절 서열과 함께 자연에서 발견되는 유전자를 지칭한다. "키메라 유전자"는 자연에서 함께 발견되지 않는 조절 및 암호화 서열을 포함하는, 천연 유전자가 아닌 임의의 유전자를 지칭한다. 따라서, 키메라 유전자는 상이한 공급원 유래의 조절 서열과 암호화 서열, 또는 동일한 공급원 유래이지만, 자연에서 발견되는 것과 상이한 방식으로 배열된 조절 서열과 암호화 서열을 포함할 수 있다. "내인성 유전자"는 유기체의 게놈에서 그의 자연적 위치에 있는 천연 유전자를 지칭한다. "외래" 유전자는 숙주 유기체 내에서 정상적으로 발견되는 것이 아니라 유전자 전달에 의해 숙주 유기체 내로 도입된 유전자를 지칭한다. 외래 유전자는 비-천연 유기체 내로 삽입된 천연 유전자, 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다. "트랜스유전자(transgene)"는 형질전환 절차에 의해 게놈 내로 도입된 유전자이다.
본 명세서에 사용되는 "암호화 서열"은 특정 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열을 말한다. "적절한 조절 서열"은 암호화 서열의 상류(5' 비-암호화 서열), 암호화 서열의 내부 또는 암호화 서열의 하류(3' 비-암호화 서열)에 위치하고, 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성 또는 연계된 암호화 서열의 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 서열(translation leader sequence), RNA 프로세싱 부위, 이펙터(effector) 결합 부위 및 스템-루프 구조(stem-loop structure)를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "작동가능하게 연결된"은 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받게 하는 단일의 핵산 분자 상의 핵산 서열의 회합을 말한다. 예를 들어, 프로모터는 그것이 암호화 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우, 다시 말하면, 암호화 서열이 프로모터의 전사적 제어 하에 있는 경우, 그 암호화 서열과 작동가능하게 연결된다. 암호화 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "발현"은 본 발명의 핵산 분자로부터 유래된 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 말한다. 또한, 발현은 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 말할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "형질전환"은 핵산 분자가 숙주 유기체의 게놈으로 전달되어, 유전적으로 안정한 유전성이 야기되는 것을 말한다. 본 발명에서, 숙주 세포의 게놈은 염색체 및 염색체외(예를 들어, 플라스미드) 유전자를 포함한다. 형질전환된 핵산 분자를 포함하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉", "재조합" 또는 "형질전환된" 유기체로 지칭된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "플라스미드", "벡터" 및 "카세트"는 통상 원형 이중 가닥 DNA 분자의 형태이며, 전형적으로 세포의 중추 대사의 일부가 아닌 유전자를 지니는 염색체외 요소를 말한다. 이러한 요소는 임의의 공급원으로부터 유래되는 자체적으로 복제하는 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열, 선형 또는 환형의 단일- 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 여기서, 다수의 뉴클레오티드 서열은 세포 내로 적절한 3' 미번역 서열과 함께, 프로모터 단편 및 선택된 유전자 산물을 위한 DNA 서열을 도입할 수 있는 독특한 구축물로 결합되거나 재조합된다. "형질전환 카세트"는 외래 유전자를 함유하며, 외래 유전자에 더하여, 특정 숙주 세포의 형질전환을 가능하게 하는 요소를 갖는 특정 벡터를 말한다. "발현 카세트"는 외래 유전자를 함유하며, 외래 유전자에 더하여, 외래 숙주에서 외래 유전자의 발현이 증가되게 하는 요소를 갖는 특정 벡터를 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "서열 분석 소프트웨어"는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 분석하는데 유용한 임의의 컴퓨터 알고리듬 또는 소프트웨어 프로그램을 지칭한다. "서열 분석 소프트웨어"는 상업적으로 입수할 수 있거나 독립적으로 개발할 수 있다. 통상적인 서열 분석 소프트웨어는 GCG 프로그램 모음(위스콘신 패키지 버전 9.0, 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(GCG: Genetics Computer Group)), BLASTP, BLASTN, BLASTX(문헌[Altschul et al., J. Mol Biol. 215:403-410 (1990)]) 및 DNASTAR(미국 위스콘신주 53715 파크 스트리트 매디슨 1228 S 소재의 디엔에이스타, 인포레이티드(DNASTAR, Inc.)), 클러스털더블유(예를 들어, 버전 1.83; 문헌[Thompson et al ., Nucleic Acids Research , 22(22):4673-4680 (1994)]) 및 스미스 워터만 알고리듬(Smith-Waterman algorithm)이 통합된 FASTA 프로그램(문헌[W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res ., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Publisher: Plenum, New York, NY]), 벡터(Vector) NTI (미국 메릴랜드주 베데스다 소재의 인포맥스(Informax)) 및 시퀀처(Sequencher) v. 4.05를 포함할 것이나 이들에 한정되지 않는다. 본 출원과 관련하여, 서열 분석 소프트웨어가 분석을 위해 사용된 경우에는, 그 분석 결과가 달리 명시되지 않는 한, 참조한 프로그램의 "디폴트 값"에 기초할 것임을 이해할 것이다. 본 명세서에서 사용된 "디폴트 값"은 최초 초기화할 때에 소프트웨어에 원래 로딩된 소프트웨어 제조처에 의해 설정된 임의의 수치 또는 파라미터의 세트를 의미할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적 오염물질"은 미생물, 포자, 바이러스, 프리온(prion) 및 그들의 혼합물을 포함하나 이들에 한정되지 않는 하나 이상의 원치않고/거나 병원성 생물학적 엔티티(entity)를 지칭한다. 일 실시형태에서, 생물학적 오염물질을 줄이고/거나 그의 존재를 제거하는데 유용한 유효 농도의 적어도 하나의 과산을 효소에 의해 생성하는 방법이 제공된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "소독한다"는 생물학적 오염물질의 파괴 또는 그의 성장의 방지 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "소독제"는 생물학적 오염물질을 파괴하거나, 중화시키거나 그의 성장을 억제함으로써 소독하는 제제를 말한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "소독"은 소독 행위 또는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "보존제"는 질환-운반형(disease-carrying) 미생물의 성장을 억제하는 화학적 제제를 말한다. 일 태양에서, 생물학적 오염물질은 병원성 미생물이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "위생적인"은 전형적으로 건강에 해로울 수 있는 제제를 제거하거나, 방지하거나 조절함에 의한, 건강의 회복 또는 유지를 의미하거나 그와 관련이 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "살균하다"는 위생적이게 만드는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "살균제"는 살균시키는 제제를 말한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "살균"은 살균 행위 또는 과정을 말한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "살생물제"는 미생물을 불활성화시키거나 파괴시키는 전형적으로 광범위의 화학적 제제를 말한다. 미생물을 불활성화시키거나 파괴하는 능력을 나타내는 화학적 제제는 "살생물" 활성을 갖는 것으로 기재된다. 과산은 살생물 활성을 가질 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적절할 수 있는 당업계에 공지되어 있는 대안의 전형적인 살생물제는 예를 들어, 염소, 이산화염소, 클로로아이소시아누레이트, 차아염소산염, 오존, 아크롤레인, 아민, 염화 페놀 화합물, 구리 염, 유기-황 화합물 및 4차 암모늄 염을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 어구 "최소 살생물 농도"는 생존가능한 표적화된 미생물의 집단에서 소정의 접촉 시간 동안 목적하는 치사의 비가역적인 감소가 생기게 할 살생물제의 최소 농도를 말한다. 유효성은 처리 후에 생존가능한 미생물의 log10 감소로 측정될 수 있다. 일 태양에서, 처리 후의 생존가능한 미생물의 표적화된 감소는 적어도 3-log10 감소, 더욱 바람직하게는 적어도 4-log10 감소, 가장 바람직하게는 적어도 5-log10 감소이다. 다른 태양에서, 최소의 살생물 농도는 생존가능한 미생물 세포의 적어도 6-log10 감소이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "과산소원" 및 "과산소의 공급원"은 과산화수소, 과산화수소 부가물(예를 들어, 우레아-과산화수소 부가물(카르바미드 퍼옥시드)), 과붕산염 및 과탄산염을 포함하나 이들에 한정되지 않는, 수용액에 존재하는 경우 약 1 mM 이상의 농도로 과산화수소를 제공할 수 있는 화합물을 말한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 수성 반응 제형 중의 과산소 화합물에 의해 제공되는 과산화수소의 농도는 반응 성분의 배합시에 초기에는 적어도 0.1 mM 또는 그 이상이다. 일 실시형태에서, 수성 반응 제형 중의 과산화수소 농도는 적어도 0.5 mM이다. 다른 실시형태에서, 수성 반응 제형 중의 과산화수소 농도는 적어도 10 mM이다. 다른 실시형태에서, 수성 반응 제형 중의 과산화수소 농도는 적어도 100 mM이다. 다른 실시형태에서, 수성 반응 제형 중의 과산화수소 농도는 적어도 200 mM이다. 다른 실시형태에서, 수성 반응 제형 중의 과산화수소 농도는 500 mM 이상이다. 또 다른 실시형태에서, 수성 반응 제형 중의 과산화수소 농도는 1000 mM 이상이다. 수성 반응 제형 중의 과산화수소 대 효소 기질, 예를 들어, 트라이글리세리드, (H2O2:기질)의 몰비는 약 0.002 내지 20, 바람직하게는 약 0.1 내지 10, 가장 바람직하게는 약 0.5 내지 5일 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "올리고당"은 글리코시드 결합에 의해 결합되는 2 내지 적어도 24개의 단당류 단위를 함유하는 화합물을 말한다. 용어 "단당류"는 실험식 (CH2O)n(여기서, n은 3 이상이고, 탄소 골격은 비분지형이며, 하나의 탄소 원자를 제외한 각 탄소 원자는 하이드록실기를 함유하고, 나머지 탄소 원자는 탄소 원자 1에서 알데히드 또는 케톤이다)의 화합물을 지칭한다. 또한, 용어 "단당류"는 세포내 환형 헤미아세탈 또는 헤미케탈 형태를 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "부형제"는 제형 중의 활성 성분에 대한 담체로 사용되는 불활성 물질을 말한다. 부형제를 사용하여 활성 성분의 저장 안정성과 같이, 제형 중의 활성 성분을 안정화시킬 수 있다. 또한, 부형제는 때때로 활성 성분을 함유하는 제형의 부피를 늘리기 위해 사용된다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 "활성 성분"은 전형적으로 과가수분해 효소에 의해 생성되는 과산이다. 일부 실시형태에서, 활성 성분은 과가수분해 활성을 갖는 효소, 적절한 반응 조건 하에서 과가수분해 효소에 의해 생성되는 과산 또는 그들의 조합일 수 있다.
용어 "실질적으로 물이 없는"은 카르복실산 에스테르에 존재하는 경우 효소 또는 효소 분말의 저장 안정성에 해로운 영향을 주지 않는 제형 중의 물의 농도를 지칭할 것이다. 카르복실산 에스테르는 매우 낮은 농도의 물을 함유할 수 있으며, 예를 들어, 트라이아세틴은 전형적으로 180 ppm 내지 300 ppm의 물을 갖는다. 일 실시형태에서, 과가수분해 효소는 실질적으로 물이 없는 카르복실산 에스테르 기질 중에 저장된다. 추가의 실시형태에서, "실질적으로 물이 없는"은 효소(또는 효소 분말) 및 카르복실산 에스테르를 포함하는 제형 중의 2000 ppm 미만, 바람직하게는 1000 ppm 미만, 더욱 바람직하게는 500 ppm 미만, 더더욱 바람직하게는 250 ppm 미만의 물을 의미할 수 있다. 일 실시형태에서, 과가수분해 효소는 효소가 수용액(예를 들어, 저장 동안 효소에 의해 가수분해될 수 있는 상당한 농도의 카르복실산 에스테르 기질을 함유하지 않는 용액) 중에 안정적이도록 생성 시스템이 고안된다면, 수용액 중에 저장될 수 있다. 일 실시형태에서, 과가수분해 효소는 물 및 하나 이상의 완충제(예를 들어, 바이카르보네이트, 시트레이트, 아세테이트, 포스페이트, 피로포스페이트, 메틸포스포네이트, 석시네이트, 말레이트, 푸마레이트, 타르트레이트 및 말레에이트의 나트륨 및/또는 칼륨 염)가 실질적으로 없는 카르복실산 에스테르 기질을 포함하는 혼합물 중에 저장될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "유익제"는 유용한 이점, 바람직한/목적하는 효과 또는 혜택을 촉진시키거나 증진시키는 물질을 말한다. 본 발명의 표적화된 과가수분해효소 기반의 조성물 및 방법을 사용하여 생성되는 과산 유익제는 표적 물질(경질 표면, 목재 펄프, 제지, 제지 펄프, 섬유, 실, 텍스타일 및 패브릭뿐 아니라, 섬유를 생성하기 위해 사용되는 폴리머 및 코폴리머)에 혜택, 예를 들어, 표적 물질이 인간 또는 동물 체표면(모발, 피부, 네일)뿐 아니라 구강 내의 표면이 아닌 조건과 함께, 소독, 살균, 탈색, 미백, 탈염, 탈취 및 그들의 임의의 조합을 제공한다. 일 실시형태에서, 과산 유익제가 텍스타일 또는 의류 물품 상에서 표적화된 과가수분해효소에 의해 효소적으로 생성되어, 목적하는 혜택, 예를 들어, 소독, 살균, 탈색, 탈염, 탈취 및 그들의 임의의 조합을 달성하는 방법이 제공된다.
과가수분해 활성을 갖는 효소
과가수분해 활성을 갖는 효소는 효소가 본 발명의 하나 이상의 기질에 대하여 과가수분해 활성을 갖는 한, 리파제, 프로테아제, 에스테라제, 아실 트랜스퍼라제, 아릴 에스테라제, 탄수화물 에스테라제 및 조합으로 분류된 일부 효소를 포함할 수 있다. 예에는 과가수분해 프로테아제(서브틸리신 칼스버그(subtilisin Carlsberg) 변이체; 미국 특허 제7,510,859호), 과가수분해 아릴 에스테라제(슈도모나스 플루오레슨스; 서열 번호 163[L29P 변이체]; 및 181[야생형]; 미국 특허 제7,384,787호), 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 과가수분해 아릴 에스테라제/아실 트랜스퍼라제(서열 번호 162[S54V 변이체] 및 180[야생형]; 미국 특허 제7,754,460호; WO2005/056782호; 및 EP1689859 B1호) 및 과가수분해 탄수화물 에스테라제가 포함될 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 바람직한 태양에서, 과가수분해 탄수화물 에스테라제는 CE-7 탄수화물 에스테라제이다. 다른 실시형태에서, 과가수분해 효소는 조건부로, 과가수분해 프로테아제를 포함하지 않는다.
일 실시형태에서, 적절한 과가수분해효소는 본 명세서에 기재된 임의의 아미노산 서열에 대하여 적어도 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효소를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 적절한 과가수분해효소는 서열 번호 162, 163, 180 및 181에 대하여 적어도 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효소를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 과가수분해 효소는 서열 번호 162에 대하여 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
다른 실시형태에서, 실질적으로 유사한 과가수분해 효소는 매우 엄격한 혼성화 조건(0.1× SSC, 0.1% SDS, 65℃, 및 2× SSC, 0.1% SDS로의 세정에 이은, 0.1× SSC, 0.1% SDS, 65℃의 최종 세정) 하에서 본 발명의 임의의 과가수분해 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 포함할 수 있다.
CE-7 과가수분해효소
일 실시형태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 구조적으로 효소의 탄수화물 패밀리 에스테라제 패밀리 7(CE-7 패밀리)의 구성원으로 분류되는 과가수분해 활성을 갖는 적어도 하나의 과가수분해 효소를 갖는 적어도 하나의 융합 단백질을 포함한다(문헌[Coutinho, P.M., Henrissat, B. "Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach" in Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering, H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat and B. Svensson eds., (1999) The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12] 참조). 효소의 CE-7 패밀리는 과산소원과 배합되는 경우 다양한 카르복실산 에스테르 기질로부터 퍼옥시카르복실산을 생성하는데 특히 효과적인 것으로 증명되었다(WO2007/070609호 및 미국 특허 출원 공개 제2008-0176299호, 제2008-176783호, 제2009-0005590호, 제2010-0041752호 및 제2010-0087529호뿐 아니라, 미국 특허 출원 제12/571702호 및 미국 가특허 출원 제61/318016호(DiCosimo et al.); 각각은 본 명세서에 참고로 포함된다).
CE-7 패밀리의 구성원은 세팔로스포린 C 데아세틸라제(CAH; E.C. 3.1.1.41) 및 아세틸 자일란 에스테라제(AXE; E.C. 3.1.1.72)를 포함한다. CE-7 에스테라제 패밀리의 구성원은 보존된 시그니처 모티프를 공유한다(문헌[incent et al., J. Mol. Biol., 330:593-606(2003)]). CE-7 시그니처 모티프를 포함하는 과가수분해효소("CE-7 과가수분해효소") 및/또는 실질적으로 유사한 구조는 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법에서 과가수분해 융합 펩티드("표적화된 과가수분해효소")로서의 제조 및 이용에 적절하다. 실질적으로 유사한 생물학적 분자를 동정하는 수단은 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 서열 정렬 프로토콜, 핵산 혼성화 및/또는 보존된 시그니처 모티프의 존재; 조건부로, 과가수분해 효소를 암호화하거나 이와 관련이 있는 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 표적화된 도메인이 없는 과가수분해 효소와 관련이 있는 서열을 사용하여 동정한다). 일 태양에서, 과가수분해효소는 CE-7 시그니처 모티프, 및 본 명세서에 기재된 서열 중 하나에 대하여 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 33%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 42%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 동일성을 포함하는 효소를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 어구 "효소는 구조적으로 CE-7 효소로 분류된다", "CE-7 과가수분해효소" 또는 "구조적으로 탄수화물 에스테라제 패밀리 7 효소로 분류된"은 구조적으로 CE-7 탄수화물 에스테라제로 분류된 과가수분해 활성을 갖는 효소를 지칭하기 위해 사용될 것이다. 효소의 패밀리는 시그니처 모티프의 존재에 의해 정의될 수 있다(상기 문헌[Vincent et al.]). CE-7 에스테라제에 대한 시그니처 모티프는 3가지 보존된 모티프를 포함한다(서열 번호 2의 참조 서열에 대한 잔기 위치 넘버링; 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 31954(상표명)로부터의 CE-7 과가수분해효소):
a) Arg118-Gly119-Gln120;
b) Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183; 및
c) His298-Glu299.
전형적으로, 아미노산 잔기 위치 180에서의 Xaa는 글리신, 알라닌, 프롤린, 트립토판 또는 트레오닌이다. 촉매 트라이아드에 속하는 3개의 아미노산 잔기 중 2개를 볼드체로 나타내었다. 일 실시형태에서, 아미노산 잔기 위치 180에서의 Xaa는 글리신, 알라닌, 프롤린, 트립토판 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
CE-7 탄수화물 에스테라제 패밀리 내의 보존된 모티프의 추가의 분석에 의해, CE-7 탄수화물 에스테라제 패밀리에 속하는 과가수분해효소를 추가로 정의하기 위해 사용될 수 있는 추가의 보존된 모티프(서열 번호 2의 아미노산 위치 267 내지 269에서의 LXD)의 존재가 나타난다. 추가의 실시형태에서, 상기 정의된 시그니처 모티프는 하기로 정의된 추가의(제4) 보존된 모티프를 포함할 수 있다:
Leu267-Xaa268-Asp269.
아미노산 잔기 위치 268에서의 Xaa는 전형적으로, 아이소류신, 발린 또는 메티오닌이다. 제4 모티프는 촉매 트라이아드(Ser181-Asp269-His298)에 속하는 아스파르트산 잔기(볼드체)를 포함한다.
표적화된 CE-7 과가수분해효소는 적어도 하나의 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 적어도 하나의 펩티드 성분을 갖는 융합 단백질이다. 일 실시형태에서, 표적화된 과가수분해효소(융합 단백질)가 CE-7 시그니처 모티프를 포함하는지 결정하기 위해 사용되는 정렬은 체표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이 없는 과가수분해 효소의 아미노산 서열에 기초할 것이다.
많은 널리 공지된 전반적인 정렬 알고리듬(즉, 서열 분석 소프트웨어)을 사용하여 과가수분해효소 활성을 갖는 효소를 대표하는 둘 이상의 아미노산 서열을 정렬하여, 효소가 CE-7 시그니처 모티프로 이루어지는지 결정할 수 있다. 정렬된 서열(들)을 참조 서열(서열 번호 2)과 비교하여, 시그니처 모티프의 존재를 결정한다. 일 실시형태에서, 참조 아미노산 서열을 사용하는 클러스털(CLUSTAL) 정렬(예를 들어, 클러스털더블유)(본 명세서에 사용되는 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 31954(상표명)로부터의 과가수분해효소 서열(서열 번호 2))을 사용하여 CE-7 에스테라제 패밀리에 속하는 과가수분해효소를 동정한다. 보존된 아미노산 잔기의 상대적 넘버링은 참조 아미노산 서열의 잔기 넘버링에 기초하여, 정렬된 서열 내의 작은 삽입 또는 결실(예를 들어, 전형적으로 5개 이하의 아미노산)을 설명한다.
(참조 서열에 비하여) CE-7 시그니처 모티프를 포함하는 서열을 동정하기 위해 사용될 수 있는 다른 적절한 알고리듬의 예에는 니들만(Needleman) 및 분쉬(Wunsch)(문헌[J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970)]; 전체 정렬 도구) 및 스미스-워터만(Smith-Waterman)(문헌[J. Mol. Biol. 147:195-197 (1981)]; 국소 정렬 도구)이 포함될 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 일 실시형태에서, 스미스-워터만 정렬은 디폴트 파라미터를 사용하여 이행된다. 적절한 디폴트 파라미터의 예에는 블로섬(BLOSUM)62 스코어링 매트릭스(scoring matrix)의 사용이 포함되며, 갭 개방 페널티(GAP open penalty)는 10이고, 갭 연장 페널티(GAP extension penalty)는 0.5이다.
서열 번호 2에 대하여 상대적으로 낮은 전체 아미노산 동일성을 갖는(CE-7 시그니처 모티프를 보유하면서) 효소는 유의미한 과가수분해효소 활성을 나타낼 수 있다. 일 실시형태에서, 적절한 과가수분해효소는 CE-7 시그니처 모티프, 및 서열 번호 2에 대하여 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 동일성을 포함하는 효소를 포함할 수 있다.
과가수분해 활성을 갖는 적절한 CE-7 탄수화물 에스테라제의 예에는 아미노산 서열 예를 들어, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 및 64를 갖는 효소가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 일 실시형태에서, 효소는 14, 16, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 및 64로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "CE-7 변이체", " 변이체 과가수분해효소" 또는 "변이체"는 CE-7 시그니처 모티프 및 관련 과가수분해 활성이 유지되는 한, 변이체가 유래되는 해당하는 효소(전형적으로 야생형 효소)에 비하여, 적어도 하나의 아미노산 부가, 결실 및/또는 치환을 야기하는 유전자 변형을 갖는 CE-7 과가수분해효소를 지칭할 것이다. 또한, CE-7 변이체 과가수분해효소는 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다. CE-7 변이체의 예는 서열 번호 27, 28, 29, 30, 31, 32, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 및 64로 제공된다. 일 실시형태에서, 변이체는 서열 번호 27, 28, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 및 64를 포함할 수 있다.
당업자는 실질적으로 유사한 CE-7 과가수분해효소 서열(시그니처 모티프 보유)이 또한 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있음을 인식한다. 일 실시형태에서, 실질적으로 유사한 서열은 매우 엄격한 조건 하에서 본 명세서에 예시된 서열과 관련된 핵산 분자와 혼성화하는 그들의 능력에 의해 정의된다. 다른 실시형태에서, 서열 정렬 알고리듬을 사용하여, 본 명세서에 제공되는 DNA 또는 아미노산 서열에 대한 동일성 백분율에 기초하여 실질적으로 유사한 효소를 정의할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 핵산 분자는 제1 분자의 단일의 가닥이 적절한 온도 및 용액 이온 세기의 조건 하에서 다른 분자에 어닐링될 수 있는 경우, 다른 핵산 분자, 예를 들어, cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA에 "혼성화가능하다". 혼성화 및 세정 조건은 널리 공지되어 있으며, 문헌[Sambrook, J. and Russell, D., T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001)]에 예시되어 있다. 온도 및 이온 세기 조건은 혼성화의 "엄격성(stringency)"을 결정한다. 엄격성 조건을 조정하여, 관계가 먼 유기체로부터의 상동 서열과 같은 중등으로 유사한 분자 내지 밀접하게 관련된 유기체로부터의 기능성 효소를 중복시키는 유전자와 같은 고도로 유사한 분자를 스크리닝할 수 있다. 혼성화 후 세정이 전형적으로 엄격성 조건을 결정한다. 한 세트의 바람직한 조건은 실온에서 15분 동안 6× SSC, 0.5% SDS로 시작한 다음, 45℃에서 30분 동안 2× SSC, 0.5% SDS로 반복한 다음, 50℃에서 30분 동안 0.2× SSC, 0.5% SDS로 2회 반복한 일련의 세정을 사용한다. 더욱 바람직한 세트의 조건은 더 높은 온도를 사용하며, 여기서, 세정은 0.2× SSC, 0.5% SDS에서의 최종 2회의 30분 세정의 온도가 60℃로 증가된 것을 제외하고 상기와 동일하다. 다른 바람직한 세트의 고도로 엄격한 혼성화 조건은 0.1× SSC, 0.1% SDS, 65℃이며, 2× SSC, 0.1% SDS로 세정하고, 0.1× SSC, 0.1% SDS, 65℃의 최종 세정으로 이어진다.
혼성화의 엄격성에 따라 염기 간의 미스매치가 가능하지만, 혼성화를 위해서는 2개의 핵산이 상보적 서열을 함유하는 것이 요구된다. 혼성화되는 핵산에 대해 적절한 엄격성은, 당업계에 주지된 변수인 핵산의 길이 및 상보성의 정도에 의존한다. 2개 뉴클레오티드 서열 사이의 유사성 또는 상동성의 정도가 클수록, 이들 서열을 가진 핵산의 하이브리드에 대한 Tm의 값이 커진다. 핵산 혼성화의 상대적 안정성(높은 Tm에 상응함)은 하기의 순서로 감소한다: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 100개 뉴클레오티드 길이를 초과하는 하이브리드에 대하여, Tm을 계산하는 수학식이 유도되었다(상기 문헌[Sambrook and Russell]). 더 짧은 핵산, 즉, 올리고뉴클레오티드의 혼성화에 있어서는 미스매치의 위치가 더욱 중요해지며 올리고뉴클레오티드의 길이가 그의 특이성을 결정한다(상기 문헌[Sambrook and Russell]). 일 태양에서, 혼성화가능한 핵산의 길이는 적어도 약 10개 뉴클레오티드이다. 바람직하게는, 혼성화가능한 핵산의 최소의 길이는 적어도 약 15개 뉴클레오티드 길이, 더욱 바람직하게는 적어도 약 20개 뉴클레오티드 길이, 더더욱 바람직하게는 적어도 30개 뉴클레오티드 길이, 더더욱 바람직하게는 적어도 300개 뉴클레오티드 길이, 가장 바람직하게는 적어도 800개 뉴클레오티드 길이이다. 또한, 프로브의 길이와 같은 인자에 따라 필요한 경우에 온도 및 세정 용액 염 농도를 조정할 수 있음을 당업자는 인식할 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "동일성 백분율"은 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계로서, 서열을 비교함으로써 결정된다. 당업계에서, "동일성"은 또한 경우에 따라서, 서열의 스트링(string) 간의 매치에 의해 결정되는, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 간의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성" 및 "유사성"은 문헌[Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988)]; 문헌[Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993)]; 문헌[Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994)]; 문헌[Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987)]; 및 문헌[Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991)]. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공중에게 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 명시되어 있다. 레이저진(LASERGENE) 바이오인포매틱스 컴퓨팅 스위트(bioinformatics computing suite)(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 디엔에이스타 인코포레이티드)의 멕얼라인(Megalign) 프로그램, 벡터 NTI v. 7.0(미국 메릴랜드주 베데스다 소재의 인포맥스, 인코포레이티드)의 얼라인엑스(AlignX) 프로그램, 또는 엠보스 오픈 소프트웨어 스위트(EMBOSS Open Software Suite)(EMBL-EBI; 문헌[Rice et al., Trends in Genetics 16, (6):276-277 (2000)])를 사용하여 서열 정렬 및 동일성 백분율 계산을 수행할 수 있다. 서열의 다중의 정렬은 디폴트 파라미터와 함께 클러스털 정렬 방법(예를 들어, 클러스털더블유; 예를 들어, 버전 1.83)(문헌[Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989)]; 문헌[Higgins et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-4680 (1994)]; 및 문헌[Chenna et al., Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500 (2003)], 유럽 바이오인포매틱스 연구소(European Bioinformatics Institute)를 통하여 유럽 분자 생물학 실험실로부터 입수가능함)을 사용하여 수행할 수 있다. 클러스털더블유 단백질 정렬에 적절한 파라미터는 갭 존재 페널티(GAP Existence penalty)=15, 갭 연장=0.2, 매트릭스=고넷(Gonnet)(예를 들어, 고넷250), 단백질 엔드갭(ENDGAP)=-1, 단백질 갭디스트(GAPDIST)=4, 및 KTUPLE=1을 포함한다. 일 실시형태에서, 고속 또는 저속 정렬은 디폴트 설정으로 사용되며, 저속 정렬이 바람직하다. 대안적으로, 클러스털더블유 방법(예를 들어, 버전 1.83)을 사용하는 파라미터는 또한 KTUPLE=1, 갭 페널티=10, 갭 연장=1, 매트릭스=블로섬(예를 들어, 블로섬64), 윈도우(WINDOW)=5 및 탑 디아고날 세이브드(TOP DIAGONALS SAVED)=5를 사용하여 변경될 수 있다.
일 태양에서, 적절한 분리된 핵산 분자는 본 명세서에 기재된 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화한다. 다른 태양에서, 적절한 분리된 핵산 분자는 본 명세서에 기재된 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하되; 단, 폴리펩티드는 CE-7 시그니처 모티프를 보유한다. 적절한 핵산 분자는 상기 상동성을 가질 뿐 아니라, 또한 전형적으로 약 300 내지 340개 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 310 내지 약 330개 아미노산, 가장 바람직하게는 약 318 내지 약 325개 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드를 암호화하며, 각 폴리펩티드는 과가수분해 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 단쇄 펩티드
표적 표면에 결합할 수 있는 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 펩티드는 "표적 표면-결합 펩티드"로 지칭되며, 예를 들어, 임의의 표적 표면에 결합하는 펩티드를 포함할 수 있으며, 조건부로, 표적 표면은 인간 모발, 인간 피부, 인간 네일 또는 인간 구강 표면(예를 들어, 치아 에나멜, 치아 균막, 잇몸 등)을 포함하지 않는다.
적어도 하나의 체표면에 대하여 강력한 친화성을 갖는 짧은 펩티드 또는 유익제가 보고되어 있다(미국 특허 제7,220,405호; 제7,309,482호; 제7,285,264호 및 제7,807,141호; 미국 특허 출원 공개 제2005-0226839호; 제2007-0196305호; 제2006-0199206호; 제2007-0065387호; 제2008-0107614호; 제2007-0110686호; 제2006-0073111호; 제2010-0158846호 및 제2010-0158847호; PCT 출원 공개 WO2008/054746호; WO2004/048399호, 및 WO2008/073368호). 이들 펩티드를 사용하여, 주로 미용 응용에 사용하기 위한, 유익제를 표적 체표면에 결합시킬 수 있는 펩티드계 시약을 구축하였다.
다양한 천연 및 합성 폴리머 물질, 예를 들어, 면 패브릭, 폴리에스테르/면 혼방, 셀룰로스 아세테이트, 제지, 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리에스테르, 예를 들어, 나일론, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리스티렌 및 폴리테트라플루오로에틸렌에 대하여 친화성을 갖는 바이오패닝된 펩티드가 보고되어 있다(미국 특허 제7,709,601호; 제7,700,716호; 및 제7632919호; 및 미국 특허 출원 공개 제2005-0054752호; 제2007-0265431호; 제2007-0264720호; 제2007-0141628호; 및 제2010-0158823호 및 미국 특허 출원 제12/785694호; 제12/778167호; 제12/778169호; 제12/778174호; 제12/778178호; 제12/778180호; 제12/778186호; 제12/778194호; 및 제12/778199호).
다양한 안료, 폴리머, 셀룰로스 물질 및 인쇄 매체에 대하여 친화성을 갖는 짧은 펩티드도 또한 이중 블록(diblock) 또는 삼중 블록(triblock) 분산제의 생성에서 보고되어 있다(미국 특허 출원 공개 제2005-0054752호). 그러나, 과산 유익제의 생성을 위해 활성 과가수분해효소를 표적 물질 표면에 결합시키기 위한(다시 말하면, "표적화된 과가수분해효소") 이들 펩티드의 이용은 기재된 적이 없다. 바람직한 태양에서, 과산 유익제의 생성을 위해 표적 물질의 표면에 표적화된 CE-7 과가수분해효소의 이용은 기재된 적이 없다.
일부 실시형태에서, 표적 표면-결합 도메인은 길이가 최대 약 60개 아미노산인 표적 표면-결합 펩티드로 이루어진다. 일 실시형태에서, 표적 표면-결합 펩티드는 길이가 5 내지 60개 아미노산이다. 다른 실시형태에서, 표적 표면-결합 펩티드는 길이가 7 내지 50개 아미노산이거나, 길이가 7 내지 30개 아미노산이다. 또 다른 실시형태는 길이가 7 내지 27개 아미노산인 표적 표면-결합 펩티드이다.
일부 실시형태에서, 다수의 표적 표면-결합 펩티드의 사용에 의해, 임의의 개별 표적 표면-결합 펩티드보다 더욱 내구성 있는 펩티드 성분(표적 표면-결합 "도메인")을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 표면-결합 도메인은 2 내지 약 50개, 바람직하게는 2 내지 약 25개, 더욱 바람직하게는 2 내지 약 10개, 가장 바람직하게는 2 내지 약 5개의 표적 표면-결합 펩티드를 포함한다.
다중 펩티드 결합 요소는 함께 직접적으로 결합되거나 또는 하나 이상의 펩티드 스페이서/링커를 사용하여 함께 결합될 수 있다. 소정의 펩티드 스페이서는 길이가 1 내지 100개 또는 1 내지 50개 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 펩티드 스페이서는 길이가 약 1 내지 약 25개, 3 내지 약 40개, 또는 3 내지 약 30개 아미노산이다. 다른 실시형태에서, 스페이서는 길이가 약 5 내지 약 20개 아미노산이다. 펩티드 링커의 예는 아미노산 서열 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140 및 143에 의해 제공된다. 펩티드 스페이서 링커는 최대 10회 반복될 수 있다.
추가의 표적 표면-결합 도메인 및 그들을 구성하는 더 짧은 표적 표면-결합 펩티드는 예를 들어, 임의의 공지되어 있는 바이오패닝 기술, 예를 들어, 파지 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 효모 디스플레이, 리보솜 디스플레이, mRNA 디스플레이 및 그들의 조합을 비롯한 당업계에 공지되어 있는 많은 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 전형적으로, 펩티드의 무작위 또는 실질적인 무작위(사건에서 편향이 존재) 라이브러리를 표적 표면에 대하여 바이오패닝하여, 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 라이브러리 내의 펩티드를 확인한다. 짧은 표적 표면-결합 펩티드 및/또는 표적 표면-결합 도메인은 또한 표적 표면에 대한 정전기적 친화성을 갖도록 실험에 의해 생성될 수 있다.
펩티드의 무작위 라이브러리의 생성은 널리 공지되어 있으며, 박테리아 디스플레이(문헌[Kemp, D.J.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78(7):4520-4524 (1981)] 및 문헌[Helfman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80(1):31-35, (1983)), 효모 디스플레이(문헌[Chien et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 88(21):9578-82 (1991)]), 조합 고체상 펩티드 합성(미국 특허 제5,449,754호, 미국 특허 제5,480,971호, 미국 특허 제5,585,275호, 미국 특허 제5,639,603호) 및 파지 디스플레이 기술(미국 특허 제5,223,409호, 미국 특허 제5,403,484호, 미국 특허 제5,571,698호, 미국 특허 제5,837,500호); 리보솜 디스플레이(미국 특허 제5,643,768호; 미국 특허 제5,658,754호; 및 미국 특허 제7,074,557호),및 mRNA 디스플레이 기술(프로퓨젼(상표명); 미국 특허 제6,258,558호; 제6,518,018호; 제6,281,344호; 제6,214,553호; 제6,261,804호; 제6,207,446호; 제6,846,655호; 제6,312,927호; 제6,602,685호; 제6,416,950호; 제6,429,300호; 제7,078,197호; 및 제6,436,665호 참조)을 포함하는 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다.
표적화된 과가수분해효소
본 명세서에 사용되는 용어 "표적화된 과가수분해효소" 및 "과가수분해 활성을 갖는 표적화된 효소"는 표적 물질의 표면에 대하여 친화성을 갖는 적어도 하나의 펩티드 성분에 융합/결합된 적어도 하나의 과가수분해 효소(야생형 또는 그의 변이체)를 포함하는 융합 단백질을 지칭할 것이며; 여기서, 표면은 체표면 또는 구강 표면이 아니다. 바람직한 태양에서, 표적 표면은 하기에 기재된다.
표적화된 과가수분해효소 내의 과가수분해 효소는 임의의 과가수분해 효소일 수 있으며, 효소가 본 발명의 하나 이상의 기질에 대하여 과가수분해 활성을 갖는 한, 리파제, 프로테아제, 에스테라제, 아실 트랜스퍼라제, 아릴 에스테라제, 탄수화물 에스테라제 및 조합물을 포함할 수 있다. 예에는 과가수분해 프로테아제(서브틸리신 변이체; 미국 특허 제7,510,859호), 과가수분해 에스테라제(슈도모나스 플루오레슨스; 미국 특허 제7,384,787호; 서열 번호 163 및 181) 및 과가수분해 아릴 에스테라제(마이코박테리움 스메그마티스; 미국 특허 제7,754,460호; WO2005/056782호; 및 EP1689859 B1호; 서열 번호 162[S54V 변이체] 및 180[야생형])가 포함될 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "펩티드 성분", "표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분" 및 "TSBD"는 펩티드 결합에 의해 결합된 둘 이상의 아미노산의 적어도 하나의 폴리머를 포함하는 과가수분해 효소의 부분이 아닌 융합 단백질의 성분을 지칭할 것이며; 여기서, 성분은 표적 물질의 표면에 대하여 친화성을 가지며; 여기서, 표면은 체표면 또는 구강 표면이 아니다.
일 실시형태에서, 표적 물질은 목재, 목재 펄프, 섬유, 실, 천연 섬유로부터 제작된 텍스타일 또는 의복, 반합성 섬유, 합성 섬유 또는 섬유 혼방의 표면이다. 일 실시형태에서, 표적 물질은 셀룰로스 물질, 예를 들어, 셀룰로스, 목재, 목재 펄프, 제지, 제지 펄프, 면, 레이온 및 라이오셀(유기 용매 방사 과정에 의해 수득되는 셀룰로스 섬유)이다. 다른 실시형태에서, 표적 물질은 제지, 섬유, 실, 텍스타일(직물 또는 부직물) 또는 의복에 사용될 수 있는 셀룰로스 물질, 폴리머 또는 코폴리머이다. 이들 물질의 예에는 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리프로필렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리아미드(나일론), 폴리스티렌, 셀룰로스 아세테이트, 면, 폴리에스테르/면 혼방, 목재 퍼프, 제지 및 셀룰로스가 포함될 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
펩티드 성분은 셀룰로스 물질에 대하여 친화성을 가질 수 있다. 이와 같이, 펩티드 성분은 자연 발생 셀룰로스-결합 도메인(상기 문헌[Tomme et al.]), 자연 발생 셀룰로스-결합 도메인으로부터 유래된 표적-결합 도메인 또는 모방체 셀룰로스 결합 도메인(EP1224270B1)일 수 있다. 셀룰로스-결합 도메인의 예는 다양한 분류 및 패밀리(문헌[Guillen et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2010) V85 pp. 1241-1249])에 속할 수 있다. 이들은 클로스트리듐 써모셀룸, 클로스트리듐 셀룰로보란스, 바실러스 종, 써모토가 마리티마 및 칼디셀룰로시룹터 사카로라이티쿠스를 포함하나 이들에 한정되지 않는 다양한 미생물로부터 수득될 수 있다. 일 실시형태에서, 셀룰로스-결합 도메인은 클로스트리듐 써모셀룸("CIP", 셀룰로스 결합 도메인의 분류 3 슈퍼패밀리; CBD3), 클로스트리듐 셀룰로보란스(CBM17, 탄수화물 결합 도메인 슈퍼패밀리 17), 바실러스 종(CBM28, 탄수화물 결합 모티프 슈퍼패밀리 28), 써모토가 마리티마(CBM9-2, 셀룰로스 결합 도메인 분류 9; CBM9) 또는 칼디셀룰로시룹터 사카로라이티쿠스(CBD1, 셀룰로스 결합 도메인의 분류 3 슈퍼패밀리; CBD3)로부터 수득된다. 일 실시형태에서, 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 셀룰로스-결합 도메인 패밀리 CBM9, CBM17, CBM28 또는 CBD3에 속하는 셀룰로스-결합 도메인이다. 추가의 실시형태에서, 셀룰로스-결합 도메인은 서열 번호 149, 152, 155, 158 및 161로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하며; 서열 번호 149, 152, 155, 158 및 161은 임의로, 그들의 C-말단 펩티드 링커 및/또는 헥사-his 태그 상에 포함되지 않을 수 있다.
일 실시형태에서, 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 항체, targetFab 항체 단편, 단쇄 가변 단편(scFv) 항체, 카멜리대 항체(문헌[Muyldermans, S., Rev. Mol. Biotechnol. (2001) 74:277-302]), 비-항체 스캐폴드 디스플레이 단백질(다양한 스캐폴드-보조 방법의 검토를 위한 문헌[Hosse et al., Prot. Sci. (2006) 15(1): 14-27 and Binz, H. et al. (2005) Nature Biotechnology 23, 1257-1268]) 또는 면역글로불린 폴드(immunoglobulin fold)가 결여된 단쇄 폴리펩티드일 수 있다. 다른 태양에서, 표적 표면(여기서, 표면은 체표면 또는 구강 표면이 아니다)에 대하여 친화성을 갖는 "펩티드 성분"은 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 펩티드(다시 말하면, 표적 표면-결합 펩티드 또는 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 적어도 하나의 표적 표면-결합 펩티드를 포함하는 표적 표면-결합 도메인; 여기서, 표면은 체표면 또는 구강 표면이 아니다)이이다. 바람직한 실시형태에서, 펩티드 성분은 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 하나 이상의 표적 표면-결합 펩티드를 포함하는 단쇄 펩티드이다.
표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 임의의 펩티드 링커에 의해 과가수분해 효소로부터 분리될 수 있다. 소정의 펩티드 링커/스페이서는 길이가 1 내지 100개 또는 1 내지 50개 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 펩티드 스페이서는 길이가 약 1 내지 약 25개, 3 내지 약 40개, 또는 3 내지 약 30개 아미노산이다. 다른 실시형태에서, 스페이서는 길이가 약 5 내지 약 20개 아미노산이다. 다수의 펩티드 링커가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 펩티드 링커가 존재하며, 최대 10번 반복될 수 있다.
일 실시형태에서, 표적화된 과가수분해효소는 하기의 일반 구조를 포함하는 과가수분해 활성을 갖는 융합 단백질이다:
PAH-[L]y-TSBD
또는
TSBD-[L]y-PAH
상기 식에서,
PAH는 과가수분해 활성을 갖는 효소이며;
TSBD는 표적 물질의 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이고; 표면은 체표면 또는 구강 표면이 아니며;
L은 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 임의의 펩티드 링커이고;
y는 0 또는 1이다.
바람직한 태양에서, 표적 물질은 목재, 목재 펄프, 섬유, 실, 천연 섬유로부터 제작된 텍스타일 또는 의복, 반합성 섬유, 합성 섬유 또는 섬유 혼방의 것이다. 일 실시형태에서, 표적 물질은 셀룰로스 물질, 예를 들어 셀룰로스, 목재, 목재 펄프, 제지, 면, 레이온 및 라이오셀(유기 용매 방사 과정에 의해 수득되는 셀룰로스 섬유)이다. 다른 실시형태에서, 표적 물질은 제지, 섬유, 실, 텍스타일(직물 또는 부직물) 또는 의복에 사용될 수 있는 셀룰로스 물질, 폴리머 또는 코폴리머이다.
다양한 물질에 대하여 친화성을 갖는 예시적인 단쇄 펩티드는 이전에 기재된 적이 있다. 예를 들어, 서열 번호 65 내지 127은 다양한 폴리머 및 셀룰로스 물질에 대하여 친화성을 갖는 다양한 펩티드의 아미노산 서열이다. 서열 번호 65 내지 79는 폴리메틸 메타크릴레이트에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이고, 서열 번호 80 내지 86은 폴리프로필렌에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이며, 서열 번호 87 내지 95는 폴리테트라플루오로에틸렌에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이고, 서열 번호 96 내지 102는 폴리에틸렌에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이며, 서열 번호 103 내지 108은 폴리아미드(나일론)에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이고, 서열 번호 109 내지 111은 폴리스티렌에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이며, 서열 번호 112 내지 115는 셀룰로스 아세테이트에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이고, 서열 번호 116 및 117은 면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이며, 서열 번호 116 및 118은 폴리에스테르/면 혼방에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이고, 서열 번호 119 내지 121은 제지에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이며, 서열 번호 122 내지 127은 셀룰로스에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이다.
표적 물질의 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 임의의 펩티드 링커에 의해 과가수분해효소로부터 분리될 수 있다. 소정의 펩티드 링커/스페이서는 길이가 1 내지 100개 또는 1 내지 50개 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 펩티드 스페이서는 길이가 약 1 내지 약 25개, 3 내지 약 40개, 또는 3 내지 약 30개 아미노산이다. 다른 실시형태에서, 스페이서는 길이가 약 5 내지 약 20개 아미노산이다. 다수의 펩티드 링커가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 펩티드 링커가 존재하며, 최대 10번 반복될 수 있다. 이와 같이, 표적화된 과가수분해효소의 예에는 표적 물질의 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분에 결합된 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 162, 163, 180 및 181로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 임의의 과가수분해효소가 포함될 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
다른 실시형태에서, 표적화된 과가수분해효소는 하나 이상의 셀룰로스-결합 도메인에 결합된 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 162, 163, 180 및 181로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 태양에서, 표적화된 과가수분해효소는 서열 번호 149, 152, 155, 158 및 161로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 셀룰로스-결합 도메인에 결합된 서열 번호 162, 163, 180 및 181로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 비-CE-7 과가수분해효소를 포함한다. 또 다른 태양에서, 표적화된 과가수분해효소는 서열 번호 148, 151, 154, 157, 160, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177 및 179로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 태양에서, 표적화된 과가수분해효소는 서열 번호 171, 173, 175, 177 및 179로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
표적화된 CE-7 과가수분해효소
일 실시형태에서, 표적화된 과가수분해효소는 CE-7 과가수분해효소이다. 본 명세서에 사용되는 용어 "표적화된 CE-7 과가수분해효소" 및 "표적화된 CE-7 탄수화물 에스테라제"는 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 적어도 하나의 펩티드 성분에 융합/결합된 적어도 하나의 CE-7 과가수분해효소(야생형 또는 변이체 과가수분해효소)를 포함하는 융합 단백질을 지칭한다.
일 실시형태에서, 하기의 일반 구조를 포함하는 융합 펩티드가 제공된다:
PAH-[L]y-TSBD
또는
TSBD-[L]y-PAH;
상기 식에서,
PAH는 과가수분해 활성을 갖는 CE-7 탄수화물 에스테라제이며; PAH는 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 갖고, 상기 시그니처 모티프는
i) 서열 번호 2의 아미노산 잔기 118 내지 120과 정렬되는 RGQ 모티프;
ii) 서열 번호 2의 아미노산 잔기 179 내지 183과 정렬되는 GXSQG 모티프; 및
iii) 서열 번호 2의 아미노산 잔기 298 및 299와 정렬되는 HE 모티프를 포함하며,
TSBD는 표적 물질 상의 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이고; 여기서, 표적 물질은 인간 모발, 인간 피부, 인간 네일 또는 인간 구강 표면이 아니며;
L은 임의의 펩티드 링커이고;
y는 0 내지 10의 정수이다.
다른 실시형태에서, CE-7 시그니처 모티프는 서열 번호 2의 아미노산 잔기 267 내지 269와 정렬되는 LXD 모티프를 추가로 포함한다.
CE-7 시그니처 모티프의 존재를 결정하기 위한 정렬이 임의의 링커 또는 TSBD 없이 행해지는 것을 주목해야 한다. 일 실시형태에서, 정렬은 클러스털더블유를 사용하여 행한다.
일 실시형태에서, 표적 물질은 목재, 목재 펄프, 섬유, 실, 천연 섬유로부터 제작된 텍스타일 또는 의복, 반합성 섬유, 합성 섬유 또는 섬유 혼방의 표면이다. 일 실시형태에서, 표적 물질은 셀룰로스 물질, 예를 들어, 셀룰로스, 목재, 목재 펄프, 제지, 제지 펄프, 면, 레이온 및 라이오셀(유기 용매 방사 과정에 의해 수득되는 셀룰로스 섬유)이다. 다른 실시형태에서, 표적 물질은 제지, 섬유, 실, 텍스타일(직물 또는 부직물) 또는 의복에 사용될 수 있는 셀룰로스 물질, 폴리머 또는 코폴리머이다. 이들 물질의 예에는 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리프로필렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리아미드(나일론), 폴리스티렌, 셀룰로스 아세테이트, 면, 폴리에스테르/면 혼방, 목재 퍼프, 제지 및 셀룰로스가 포함될 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
펩티드 성분은 셀룰로스 물질에 대하여 친화성을 가질 수 있다. 이와 같이, 펩티드 성분은 자연 발생 셀룰로스-결합 도메인(상기 문헌[Tomme et al.]), 자연 발생 셀룰로스-결합 도메인으로부터 유래된 표적-결합 도메인 또는 모방체 셀룰로스 결합 도메인(EP1224270B1)일 수 있다. CE-7 과가수분해효소에 결합될 수 있는 셀룰로스-결합 도메인의 예는 클로스트리듐 써모셀룸, 클로스트리듐 셀룰로보란스, 바실러스 종, 써모토가 마리티마 및 칼디셀룰로시룹터 사카로라이티쿠스를 포함하나 이들에 한정되지 않는 미생물로부터 수득될 수 있다. 일 실시형태에서, 셀룰로스-결합 도메인은 클로스트리듐 써모셀룸(예를 들어, "CIP"), 클로스트리듐 셀룰로보란스 CBM17, 바실러스 종 CBM28, 써모토가 마리티마 CBM9-2 또는 칼디셀룰로시룹터 사카로라이티쿠스 CBD1로부터 수득된다. 추가의 실시형태에서, 셀룰로스-결합 도메인은 서열 번호 149, 152, 155, 158 및 161로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함하며; 서열 번호 149, 152, 155, 158 및 161은 임의로, 그들의 C-말단 펩티드 상에 펩티드 링커 및/또는 헥사-his 태그를 포함하지 않을 수 있다.
일 실시형태에서, CE-7 과가수분해효소에 결합된 표적 물질의 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 항체, Fab 항체 단편, 단쇄 가변 단편(scFv) 항체, 카멜리대 항체(문헌[Muyldermans, S., Rev. Mol. Biotechnol. (2001) 74:277-302]), 비-항체 스캐폴드 디스플레이 단백질(다양한 스캐폴드-보조 방법의 검토를 위한 문헌[Hosse et al., Prot. Sci. (2006) 15(1): 14-27] 및 문헌[Binz, H. et al. (2005) Nature Biotechnology 23, 1257-1268]) 또는 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 폴리펩티드일 수 있다. 다른 태양에서, 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 펩티드이다(즉, 표적 표면-결합 펩티드 또는 적어도 하나의 표적 표면-결합 펩티드를 포함하는 표적 표면-결합 도메인). 다른 실시형태에서, 펩티드 성분은 표적 물질의 표면에 대하여 친화성을 갖는 하나 이상의 표적 표면-결합 펩티드를 포함하는 단쇄 펩티드이다.
CE-7 과가수분해효소는 표적 물질에 대하여 친화성을 갖는 하나 이상의 단쇄 펩티드에 결합되어, 표적화된 CE-7 과가수분해효소를 생성할 수 있다. 이러한 단쇄 펩티드의 예는 이전에 기재된 적이 있다. 예를 들어, 서열 번호 65 내지 127은 다양한 폴리머 및 셀룰로스 물질에 대하여 친화성을 갖는 다양한 펩티드의 아미노산 서열이다. 서열 번호 65 내지 79는 폴리메틸 메타크릴레이트에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이고, 서열 번호 80 내지 86은 폴리프로필렌에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이며, 서열 번호 87 내지 95는 폴리테트라플루오로에틸렌에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이고, 서열 번호 96 내지 102는 폴리에틸렌에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이며, 서열 번호 103 내지 108은 폴리아미드(나일론)에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이고, 서열 번호 109 내지 111은 폴리스티렌에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이며, 서열 번호 112 내지 115는 셀룰로스 아세테이트에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이고, 서열 번호 116 및 117은 면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이며, 서열 번호 116 및 118은 폴리에스테르/면 혼방에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이고, 서열 번호 119 내지 121은 제지에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이며, 서열 번호 122 내지 127은 셀룰로스에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 예이다.
표적 물질의 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 임의의 펩티드 링커에 의해 CE-7 과가수분해효소로부터 분리될 수 있다. 소정의 펩티드 링커/스페이서는 길이가 1 내지 100개 또는 1 내지 50개 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 펩티드 스페이서는 길이가 약 1 내지 약 25개, 3 내지 약 40개, 또는 3 내지 약 30개 아미노산이다. 다른 실시형태에서, 스페이서는 길이가 약 5 내지 약 20개 아미노산이다. 다수의 펩티드 링커가 사용될 수 있다. 이와 같이, 표적화된 과가수분해효소의 예에는 표적 물질의 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분에 결합된 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 및 64로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 임의의 CE-7 과가수분해효소가 포함될 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 표적화된 과가수분해효소의 예에는 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 하나 이상의 표적 표면-결합 펩티드에 (임의로 펩티드 스페이서를 통해) 결합된 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 및 64로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 임의의 CE-7 과가수분해효소가 포함될 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
일 실시형태에서, 표적화된 과가수분해효소는 서열 번호 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126 및 127로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표적 표면-결합 펩티드에 결합된 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 및 64로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 CE-7 과가수분해효소를 포함한다.
다른 실시형태에서, 표적화된 과가수분해효소는 하나 이상의 셀룰로스-결합 도메인에 결합된 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 및 64로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 CE-7 과가수분해효소를 포함한다. 다른 태양에서, 표적화된 과가수분해효소는 서열 번호 149, 152, 155, 158 및 161로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 셀룰로스-결합 도메인에 결합된 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 및 64로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 CE-7 과가수분해효소를 포함한다. 또 다른 태양에서, 표적화된 과가수분해효소는 서열 번호 148, 151, 154, 157, 160, 165, 167 및 169로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
결합 친화성
표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 10-5 몰(M) 이하의 표적 표면에 대한 결합 친화성을 포함한다. 특정 실시형태에서 펩티드 성분은 10-5 몰(M)이하의 결합 친화성을 갖는 하나 이상의 표적 표면-결합 펩티드 및/또는 결합 도메인(들)이다. 일부 실시형태에서, 표적 표면-결합 펩티드 또는 도메인은 적어도 약 50 내지 500 mM 염의 존재 하에 10-5 M 이하의 결합 친화성 값을 가질 것이다. 용어 "결합 친화성"은 결합 펩티드와 그의 각각의 기질의 상호작용의 강도를 말한다. 결합 친화성은 결합 펩티드의 해리 상수("KD") 또는 "MB50"에 관하여 정의되거나 측정될 수 있다.
"KD"는 표적 상의 결합 부위가 절반 점유된, 다시 말하면, 펩티드가 결합된 표적(결합 표적 물질)의 농도가 펩티드가 결합되지 않은 표적의 농도와 같은 경우의 펩티드의 농도에 해당한다. 해리 상수가 더 작을수록, 펩티드가 더욱 단단히 결합된다. 예를 들어, 나노몰(nM) 해리 상수를 갖는 펩티드는 마이크로몰(μM) 해리 상수를 갖는 펩티드보다 더욱 단단히 결합한다. 본 발명의 특정 실시형태는 KD 값이 10-5 이하일 것이다.
"MB50"은 ELISA-기반의 결합 검정법에서 수득되는 최대 신호의 50%의 신호를 제공하는 결합 펩티드의 농도를 말한다. 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2005/022683호의 실시예 3을 참고한다. MB50은 복합체의 성분의 결합 상호작용 또는 친화성의 세기의 표시를 제공한다. MB50의 값이 더 낮을수록, 펩티드와 그의 해당하는 기질의 상호작용이 더욱 강력하며, 다시 말하면, 더 낫다. 예를 들어, 나노몰(nM) MB50을 갖는 펩티드는 마이크로몰(μM) MB50을 갖는 펩티드보다 더욱 단단하게 결합한다. 본 발명의 특정 실시형태는 MB50 값이 10-5 M 이하일 것이다.
일부 실시형태에서, 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 KD 또는 MB50 값으로 측정시, 결합 친화성이 약 10-5 M 이하, 약 10-6 M 이하, 약 10-7 M 이하, 약 10-8 M 이하, 약 10-9 M 이하, 또는 약 10-10 M 이하일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "강력한 친화성"은 KD 또는 MB50 값이 약 10-5 M 이하, 바람직하게는 약 10-6 M 이하, 더욱 바람직하게는 약 10-7 M 이하, 더욱 바람직하게는 약 10-8 M 이하, 약 10-9 M 이하, 또는 가장 바람직하게는 약 10-10 M 이하인 결합 친화성을 지칭할 것이다.
다성분 퍼옥시카르복실산 생성 시스템
다수의 활성 성분을 분리하고 배합하는 시스템 및 수단의 고안은 당업계에 알려져 있으며, 일반적으로 개별 반응 성분의 물리적 형태에 좌우될 것이다. 예를 들어, 다수의 활성 유체(액체-액체) 시스템은 전형적으로 멀티-챔버 디스펜서(multi-chamber dispenser) 병 또는 2상 시스템(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2005/0139608호; 미국 특허 제5,398,846호; 미국 특허 제5,624,634호; 미국 특허 제6,391,840호; 유럽 특허 제0807156B1호; 미국 특허 출원 공개 제2005/0008526호; 및 PCT 공개 WO 00/61713호), 예컨대 원하는 탈색제가 반응성 유체의 혼합시에 생성되는 일부 탈색 응용에서 관찰되는 것을 사용한다. 퍼옥시카르복실산을 생성하기 위해 사용되는 다른 형태의 다성분 시스템은 하나 이상의 고체 성분 또는 고체-액체 성분의 조합, 예를 들어, 분말(예를 들어, 미국 특허 제5,116,575호), 다층 정제(예를 들어, 미국 특허 제6,210,639호), 다수의 구획을 갖는 수용해성 패킷(packet)(예를 들어, 미국 특허 제6,995,125호) 및 물의 첨가 시에 반응하는 고체 응집체(예를 들어, 미국 특허 제6,319,888호)를 위해 고안된 것들을 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
다른 실시형태에서, 제1 성분 중의 카르복실산 에스테르는 모노아세틴, 다이아세틴, 트라이아세틴 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 제1 성분 중의 카르복실산 에스테르는 아세틸화 당류이다. 다른 실시형태에서, 제1 성분 중의 효소 촉매는 미립자 고체일 수 있다. 다른 실시형태에서, 제1 반응 성분은 고체 정제 또는 분말일 수 있다.
퍼옥시카르복실산은 매우 반응성이 있으며, 일반적으로 시간이 지남에 따라 농도가 감소된다. 이는 특히 종종 장기간 안정성이 결여된 시판용 사전-형성된 퍼옥시카르복실산 조성물에 대하여 그러하다. 또한, 특히 큰 용기 및/또는 매우 농축된 퍼옥시카르복실산 용액을 더 긴 거리로 운송하는 경우, 사전-형성된 퍼옥시카르복실산 수용액은 취급 및/또는 운송의 어려움을 나타낼 수 있다. 추가로, 사전-형성된 퍼옥시카르복실산 용액은 특정 표적 응용을 위해 원하는 농도의 퍼옥시카르복실산을 제공할 수 없을 수 있다. 이와 같이, 특히 액체 제형을 위해 다양한 반응 성분을 분리되게 유지하는 것이 매우 바람직하다.
원하는 퍼옥시카르복실산을 생성하기 위해 배합되는 둘 이상의 성분을 포함하는 다성분 퍼옥시카르복실산 생성 시스템의 이용이 보고되어 있다. 개별 성분은 연장된 기간 동안 안정적이며, 취급하기에 안전해야 한다(다시 말하면, 혼합 시에 생성되는 퍼옥시카르복실산의 농도로 측정시). 일 실시형태에서, 다성분 효소적 퍼옥시카르복실산 생성 시스템의 저장 안정성은 효소 촉매 안정성에 관하여 측정될 수 있다.
표적화된 효소 촉매를 사용하여, 표적 표면 상에 또는 그 근처에 목적하는 퍼옥시카르복실산 농도를 갖는 과산 수용액을 신속하게 생성하는 다성분 퍼옥시카르복실산 생성 제형을 포함하는 제품(예를 들어, 세탁 관리 제품)이 본 명세서에 제공된다. 혼합은 사용 직전에 및/또는 적용 부위(동소)에서 발생할 수 있다. 일 실시형태에서, 제품 제형은 사용될 때까지 분리되어 유지되는 적어도 2개의 성분으로 이루어질 것이다. 성분의 혼합에 의해, 과산 수용액이 신속하게 형성된다. 생성된 과산 수용액이 의도된 최종 용도에 적절한 유효 농도의 과산을 포함하도록 각 성분이 고안된다. 개별 성분의 조성은 (1) 연장된 저장 안정성을 제공하고/거나 (2) 퍼옥시카르복실산으로 이루어진 적절한 수성 반응 제형의 형성을 증진시키는 능력을 제공하도록 고안되어야 한다.
다성분 제형은 적어도 2개의 실질적으로 액체인 성분으로 이루어질 수 있다. 일 실시형태에서, 다성분 제형은 제1 액체 성분 및 제2 액체 성분을 포함하는 2성분 제형일 수 있다. 용어 "제1" 또는 "제2" 액체 성분의 이용은 상대적이되, 단 특정 성분을 포함하는 2가지 상이한 액체 성분은 사용할 때까지 분리되어 유지된다. 최소한도로, 다성분 퍼옥시카르복실산 제형은 (1) 과가수분해 활성을 갖는 융합 단백질(즉, 표적화된 과가수분해효소)을 갖는 적어도 하나의 효소 촉매, (2) 카르복실산 에스테르 기질, 및 (3) 과산소원 및 물을 포함하며, 여기서, 제형은 성분의 배합시에 목적하는 과산을 효소에 의해 생성한다. 일 실시형태에서, 다성분 퍼옥시카르복실산 제형 중의 과가수분해 활성을 갖는 효소는 표적화된 CE-7 과가수분해효소이다.
2성분 제형에 사용되는 다양한 성분의 유형 및 양은 (1) 각 성분의 저장 안정성, 특히 효소 촉매의 과가수분해 활성 및 (2) 용해성 및/또는 목적하는 퍼옥시카르복실산 수용액을 효율적으로 형성하는 능력을 증진시키는 물리적 특성을 제공하도록 조심히 선택되고, 균형을 이루어야 한다(예를 들어, 수성 반응 혼합물 중의 에스테르 기질의 용해성을 증진시키는 성분 및/또는 적어도 하나의 액체 성분의 점도 및/또는 농도를 변경하는 성분[다시 말하면, 효소에 의한 과가수분해 활성에 대한 상당한 역효과를 갖지 않는 적어도 하나의 공용매]).
효소에 의한 과산 생성 시스템의 성능 및/또는 촉매 안정성을 향상시키는 다양한 방법이 개시된다. 미국 특허 출원 공개 제2010-0048448 A1호에는 용해성 및/또는 특정 에스테르 기질의 혼합 특징을 증진시키는 적어도 하나의 공용매의 이용이 기재된다. 또한, 본 발명의 조성물 및 방법은 공용매를 사용할 수 있다. 일 실시형태에서, 카르복실산 에스테르 기질 및 과가수분해효소 촉매를 포함하는 성분은 Log P 값이 약 2 미만인 유기 용매를 포함하며, Log P는 P = [용질]옥탄올/[용질]물로 표현되는 옥탄올과 물 사이의 기질의 분배 계수의 로그로 정의된다. 효소 활성에 대한 유의미한 역효과를 갖지 않는 log P 값이 2 이하인 몇몇 공용매가 기재된다. 다른 실시형태에서, 공용매는 카르복실산 에스테르 기질 및 효소를 포함하는 반응 성분 내에서 약 20 wt% 내지 약 70 wt%이다. 카르복실산 기질 및 효소를 포함하는 반응 성분은 임의로, 하나 이상의 완충제(예를 들어, 바이카르보네이트, 시트레이트, 아세테이트, 포스페이트, 피로포스페이트, 메틸포스포네이트, 석시네이트, 말레이트, 푸마레이트, 타르트레이트 및 말레에이트의 나트륨 및/또는 칼륨 염)를 포함할 수 있다.
미국 특허 출원 공개 제2010-0086534 A1호에는 2성분 시스템의 용도가 기재되어 있으며, 여기서, 제1 성분은 액체 카르복실산 에스테르와 고체 효소 분말의 제형을 포함하며, 상기 효소 분말은 (a) 과가수분해 활성을 갖는 적어도 하나의 CE-7 에스테라제 및 (b) 적어도 하나의 올리고당 부형제의 제형을 포함하며; 제2 성분은 과산소원 및 과산화수소 안정화제를 갖는 물을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 미국 특허 출원 공개 US 2010-0086534 A1호에 기재된 시스템과 유사한 2성분 제형을 사용할 수 있다. 이와 같이, 올리고당 부형제를 사용하여 효소 활성의 안정화를 도울 수 있다. 일 실시형태에서, 올리고당 부형제는 수평균 분자량이 적어도 약 1250일 수 있고, 중량평균 분자량이 적어도 약 9000일 수 있다. 다른 실시형태에서, 올리고당 부형제는 수평균 분자량이 적어도 약 1700이고, 중량평균 분자량이 적어도 약 15000이다. 다른 실시형태에서, 올리고당은 말토덱스트린이다.
또한, 미국 특허 출원 공개 제2010-0086535-A1호에는 2성분 시스템이 기재되어 있으며, 여기서, 제1 성분은 액체 카르복실산 에스테르와 고체 효소 분말의 제형을 포함하며, 상기 제형은 (a) 과가수분해 활성을 갖는 적어도 하나의 CE-7 에스테라제 및 적어도 하나의 올리고당 부형제 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함하는 효소 분말; 및 (b) 적어도 하나의 완충제를 포함하고, 바람직한 실시형태에서, 완충제는 분리된(다시 말하면, 효소 분말과 분리된) 불용성 성분으로서 카르복실산 에스테르 기질에 첨가되고; 제2 성분은 과산소원 및 과산화수소 안정화제를 갖는 물을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 미국 특허 출원 공개 US 2010-0086535 A1호에 기재된 시스템과 유사한 2성분 제형을 사용할 수 있다. 일 실시형태에서, 부형제는 수평균 분자량이 적어도 약 1250이고, 중량평균 분자량이 적어도 약 9000인 올리고당 부형제일 수 있다. 다른 실시형태에서, 올리고당 부형제는 수평균 분자량이 적어도 약 1700일 수 있고, 중량평균 분자량이 적어도 약 15000일 수 있다. 다른 실시형태에서, 올리고당은 말토덱스트린이다. 추가의 실시형태에서, pH 완충제는 바이카르보네이트 완충제이다. 추가의 실시형태에서, 과산화수소 안정화제는 터피날(TURPINAL)(등록 상표) SL이다.
효소 분말
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 안정화된 효소 분말 형태의 효소 촉매를 사용할 수 있다. 효소 분말을 포함하는 제형을 제조하고 안정화시키는 방법은 미국 특허 출원 공개 제2010-0086534호 및 제2010-0086535호에 기재되어 있다.
일 실시형태에서, 효소는 효소 분말의 건조 중량에 기초하여, 약 5 중량 퍼센트(wt%) 내지 약 75 wt% 범위의 양으로 효소 분말에 존재할 수 있다. 효소 분말/분무-건조된 혼합물 중의 효소의 바람직한 중량% 범위는 약 10 wt% 내지 50 wt%이며, 효소 분말/분무-건조된 혼합물 중의 효소의 더욱 바람직한 중량% 범위는 약 20 wt% 내지 33 wt%이다.
일 실시형태에서, 효소 분말은 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 일 태양에서, 부형제는 효소 분말의 건조 중량에 기초하여 약 95 wt% 내지 약 25 wt%의 범위의 양으로 제공된다. 효소 분말 중의 부형제의 바람직한 wt% 범위는 약 90 wt% 내지 50 wt%이며, 효소 분말 중의 부형제의 더욱 바람직한 wt% 범위는 약 80 wt% 내지 67 wt%이다.
일 실시형태에서, 효소 분말을 제조하기 위해 사용되는 부형제는 올리고당 부형제일 수 있다. 일 실시형태에서, 올리고당 부형제는 수평균 분자량이 적어도 약 1250이고, 중량평균 분자량이 적어도 약 9000이다. 일부 실시형태에서, 올리고당 부형제는 수평균 분자량이 적어도 약 1700이고, 중량평균 분자량이 적어도 약 15000이다. 특정 올리고당은 말토덱스트린, 자일란, 만난, 후코이단, 갈락토만난, 키토산, 라피노스, 스타키오스, 펙틴, 인슐린, 레반, 그라미난, 아밀로펙틴, 수크로스, 락툴로스, 락토스, 말토스, 트레할로스, 셀로비오스, 니제로트라이오스(nigerotriose), 말토트라이오스, 멜레지토스, 말토트라이울로스(maltotriulose), 라피노스, 케스토스(kestose) 및 그들의 혼합물을 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 올리고당 부형제는 말토덱스트린이다. 또한, 올리고당계 부형제는 수용성 비이온성 셀룰로스 에테르, 예를 들어, 하이드록시메틸-셀룰로스 및 하이드록시프로필메틸셀룰로스 및 그들의 혼합물을 포함할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 추가의 실시형태에서, 부형제는 하기의 화합물 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있으나 이들에 한정되지 않는다: 트레할로스, 락토스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 글루코스, 셀로비오스, α-사이클로덱스트린 및 카르복시메틸셀룰로스.
제형은 적어도 하나의 임의의 계면활성제를 포함할 수 있으며, 여기서, 적어도 하나의 계면활성제의 존재가 바람직하다. 계면활성제는 이온성 및 비이온성 계면활성제 또는 습윤제, 예를 들어, 에톡실화 피마자유, 폴리글리콜화 글리세리드, 아세틸화 모노글리세리드, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴록사머, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 유도체, 모노글리세리드 또는 그의 에톡실화 유도체, 다이글리세리드 또는 그의 폴리옥시에틸렌 유도체, 소듐 도쿠세이트, 소듐 라우릴설페이트, 콜린산 또는 그의 유도체, 레시틴, 인지질, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 블록 코폴리머 및 비이온성 유기규소를 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르이며, 폴리소르베이트 80이 더욱 바람직하다.
제형이 효소 분말을 포함하는 경우, 분말을 제조하는데 사용되는 계면활성제는 효소 분말에 존재하는 단백질의 중량에 기초하여, 약 5 wt% 내지 0.1 wt%, 바람직하게는 효소 분말에 존재하는 단백질의 중량에 기초하여, 약 2 wt% 내지 0.5 wt% 범위의 양으로 존재할 수 있다.
효소 분말은 추가로 1가지 이상의 완충제(예를 들어, 바이카르보네이트, 시트레이트, 아세테이트, 포스페이트, 피로포스페이트, 메틸포스포네이트, 석시네이트, 말레이트, 푸마레이트, 타르트레이트 및 말레에이트의 나트륨 및/또는 칼륨 염), 및 효소 안정화제(예를 들어, 에틸렌다이아민테트라아세트산, (1-하이드록시에틸리덴)비스포스폰산)를 포함할 수 있다.
효소 분말을 형성하기 위한 제형의 분무 건조는 예를 들어, 문헌[Spray Drying Handbook, 5th ed., K. Masters, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1991)] 및 PCT 특허 출원 공개 WO 97/41833호 및 WO 96/32149호(Platz, R. et al.)에 일반적으로 기재된 바와 같이 수행된다.
일반적으로, 분무 건조는 고도로 이들 분무 건조기 및 특히 분산된 액체와 충분한 양의 고온 공기가 함께 있게 하여 증발을 초래하는 하는 단계 및 액적을 건조시키는 단계로 구성된다. 전형적으로, 공급물은 용매를 증발시키고 건조된 생성물을 수집기로 이동시키는 따뜻한 여과된 공기의 흐름으로 분무된다. 소모된 공기는 이어서 용매와 함께 배기된다. 당업자는 몇몇 상이한 유형의 장치를 사용하여 원하는 제품을 제공할 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 부치 리미티드(Buchi Ltd.)(스위스 포스트파치 소재) 또는 지이에이 니로 코포레이션(GEA Niro Corp.)(덴마크 코펜하겐 소재)에 의해 제조되는 시판용 분무 건조기는 원하는 크기의 입자를 효율적으로 생성할 것이다. 이중 노즐 기술을 사용하는 2가지 용액의 동시의 분무와 같은 특정 응용을 위해 이들 분무 건조기 및 특히 그들의 아토마이저(atomizer)가 변경되거나 맞춤화될 수 있음을 추가로 인식할 것이다. 더욱 구체적으로, 유중수형 에멀젼은 하나의 노즐로부터 무화될 수 있으며, 만니톨과 같은 부착-방지제(anti-adherent)를 함유하는 용액을 제2 노즐로부터 공동-무화할 수 있다. 다른 경우에, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 펌프를 사용하여 맞춤 설계된 노즐을 통해 공급 용액을 밀어내는 것이 바람직할 수 있다. 정확한 형태 및/또는 조성을 포함하는 미세구조체가 생성된다면, 장치의 선택은 중요하지 않으며, 본 명세서의 교시에 비추어 당업자에게 명백할 것이다.
분무된 재료를 건조시키는데 사용되는 기체의 양쪽 입구 및 출구의 온도는 분무된 재료에서 효소의 분해를 야기하지 않는 정도이다. 이러한 온도는 전형적으로 실험에 의해 측정되지만, 일반적으로, 입구 온도는 약 50 ℃ 내지 약 225 ℃ 범위이면서, 출구 온도는 약 30℃ 내지 약 150 ℃ 범위일 것이다. 바람직한 파라미터는 약 0.14 ㎫ 내지 1.03 ㎫(20 내지 150 psi), 바람직하게는 약 0.21-0.28 ㎫ 내지 0.69 ㎫(30-40 내지 100 psi) 범위의 무화 압력을 포함한다. 전형적으로, 사용되는 무화 압력은 다음 중 하나일 것이다(㎫): 0.14, 0.21, 0.28, 0.34, 0.41, 0.48, 0.55, 0.62, 0.69, 0.76, 0.83 또는 그 이상.
효소 분말을 사용하는 경우, 카르복실산 에스테르 중의 효소 분말 또는 효소 분말 제형은 주위 온도에서 저장되는 경우, 연장된 기간 동안 실질적으로 그의 효소적 활성을 유지하는데 필요할 수 있다. 카르복실산 에스테르 중의 효소 분말 또는 효소 분말 제형은 짧은 기간 동안 고온에서 실질적으로 그의 효소적 활성을 유지한다. 일 실시형태에서, "실질적으로 그의 효소적 활성을 유지한다"는 카르복실산 에스테르 중의 효소 분말 또는 효소 분말 제형이 카르복실산 에스테르 및 효소 분말로 이루어진 제형의 제조 전의 효소 분말의 초기 효소 활성에 비하여, 주위 온도에서의 연장된 저장 기간 후에 및/또는 고온(주위 온도 초과)에서의 짧은 저장 기간 후에, 카르복실산 에스테르 및 효소 분말로 이루어진 제형에서의 효소 분말 또는 효소 분말 제형 중의 효소의 효소 활성의 적어도 약 75%를 유지하는 것을 의미한다. 연장된 저장 기간은 주위 온도에서의 약 1년 내지 약 2년의 기간이다. 일 실시형태에서, 고온에서 짧은 저장 기간은 카르복실산 에스테르 및 효소 분말로 이루어진 제형이 40℃에서 생성되는 때로부터 40℃에서 약 8주까지의 기간이다. 다른 실시형태에서, 고온은 약 30℃ 내지 약 52℃의 범위이다. 바람직한 실시형태에서, 고온은 약 30℃ 내지 약 40℃ 범위이다.
일부 실시형태에서, 효소 분말은 40℃에서 카르복실산 에스테르 및 효소 분말로 이루어진 제형의 제조 전의 효소 분말의 초기 효소 활성에 비하여, 40℃에서 8주의 저장 후에 카르복실산 에스테르 및 효소 분말로 이루어진 제형 중에, 효소 활성의 적어도 75%를 유지한다. 다른 실시형태에서, 효소 분말은 40℃에서 카르복실산 에스테르 및 효소 분말로 이루어진 제형의 제조 전의 효소 분말의 초기 효소 활성에 비하여, 40℃에서의 8주의 저장 후에 카르복실산 에스테르 및 효소 분말로 이루어진 제형에서 적어도 하나의 효소의 효소 활성의 적어도 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%를 유지한다. 바람직하게는, 과가수분해 활성은 미국 특허 출원 공개 제2010-0086510호의 실시예 8 내지 13에 기재된 바와 같이 측정되나; 과가수분해 활성의 임의의 측정 방법이 사용될 수 있다.
언급된 기간에 걸친 효소 활성의 추가의 향상은 미국 특허 출원 공개 제2010-0086534호에 기재된 바와 같이, 약 5.5 내지 약 9.5의 pH 범위의 완충 능력을 갖는 완충제를 카르복실산 에스테르 및 분무-건조된 효소 분말로 이루어진 제형에 첨가함으로써 달성될 수 있다. 적절한 완충제는 바이카르보네이트, 피로포스페이트, 포스페이트, 메틸포스포네이트, 시트레이트, 아세테이트, 말레이트, 푸마레이트, 타르트레이트, 말레에이트 또는 석시네이트의 나트륨 염, 칼륨 염 또는 나트륨 또는 칼륨 염의 혼합물을 포함할 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 카르복실산 에스테르 및 분무-건조된 효소 분말로 이루어진 제형에서 사용하기에 바람직한 완충제는 바이카르보네이트, 피로포스페이트, 포스페이트, 메틸포스포네이트, 시트레이트, 아세테이트, 말레이트, 푸마레이트, 타르트레이트, 말레에이트, 또는 석시네이트의 나트륨 염, 칼륨 염, 또는 나트륨 또는 칼륨 염의 혼합물을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 완충제는 바이카르보네이트의 나트륨 및/또는 칼륨 염을 포함한다.
완충제가 카르복실산 에스테르 및 효소 분말 제형에 존재할 수 있는 실시형태에서, 완충제는 카르복실산 에스테르 및 효소 분말로 이루어진 제형 중의 카르복실산 에스테르의 중량에 기초하여, 약 0.01 wt% 내지 약 50 wt% 범위의 양으로 존재할 수 있다. 완충제는 카르복실산 에스테르 및 효소 분말로 이루어진 제형 중의 카르복실산 에스테르의 중량에 기초하여, 약 0.10% 내지 약 10%의 더욱 바람직한 범위로 존재할 수 있다. 추가로, 이들 실시형태에서, 효소의 과가수분해 활성 간의 비교는 카르복실산 에스테르, 약 5.5 내지 약 9.5의 pH 범위에서 완충 능력을 갖는 완충제 및 효소 분말로 이루어진 제형의 제조 전의 효소 분말의 초기 과가수분해 활성에 비한, 40℃에서의 8주의 저장 후에 카르복실산 에스테르, 약 5.5 내지 약 9.5의 pH 범위에서 완충 능력을 갖는 완충제 및 효소 분말로 이루어진 제형에서 적어도 하나의 효소의 과가수분해 활성의 적어도 75%를 유지하는 효소 분말 간의 비교로 결정된다.
건조 효소 분말이 적어도 하나의 효소에 대한 기질인 유기 화합물, 예를 들어, 트라이아세틴 중의 제형으로 저장되는 것으로 의도된다. 첨가되는 과산화수소의 부재 하에, 트라이아세틴은 보통 가수분해 효소(예를 들어, CE-7 탄수화물 에스테라제)에 의해 수용액 중에서 가수분해되어, 다이아세틴 및 아세트산을 생성하며, 아세트산의 생성에 의해, 반응 혼합물의 pH의 감소가 야기된다. 트라이아세틴 중의 효소의 장기간 저장 안정성을 위한 하나의 요건은 트라이아세틴 중에 존재할 수 있는 임의의 물과 트라이아세틴의 유의미한 반응이 존재하지 않는 것이며; 하나의 시판용 트라이아세틴(벨기에 브뤼셀 소재의 테센델로 그룹(Tessenderlo Group)에 의해 공급) 중의 수분 함량에 대한 명시는 0.03 wt%의 물(300 ppm)이다. 트라이아세틴 중의 효소의 저장 동안 발생하는 트라이아세틴의 임의의 가수분해에 의해, 아세트산이 생성될 것이며, 이는 CE-7 과가수분해효소의 활성의 감소 또는 CE-7 과가수분해효소의 불활성화를 야기할 수 있고; 과가수분해효소는 전형적으로 pH 5.0 이하에서 불활성화된다(미국 특허 출원 공개 제2009-0005590호(DiCosimo, R., et al) 참조). 본 출원서에서 사용하기 위해 선택된 부형제는 아세트산이 제형 중의 낮은 농도의 물의 존재에 기인하여 생성될 수 있는 조건 하의 효소를 위하여, 유기 기질 중에서의 효소의 안정성을 제공해야 한다. 건조 효소 분말은 적어도 하나의 효소에 대한 기질인 유기 화합물 중의 제형으로 저장될 수 있으며, 여기서, 제형은 추가로 부형제 및 하나 이상의 완충제(예를 들어, 바이카르보네이트, 시트레이트, 아세테이트, 포스페이트, 피로포스페이트, 메틸포스포네이트, 석시네이트, 말레이트, 푸마레이트, 타르트레이트 및 말레에이트의 나트륨 및/또는 칼륨 염)를 포함한다.
표적화된 효소에 의해 촉매작용되는, 카르복실산 에스테르 및 과산화수소로부터의 과산의 제조에 적절한 반응 조건
과가수분해 활성을 갖는 하나 이상의 표적화된 효소를 사용하여, 본 발명의 조성물 및 방법에서, 유효 농도의 목적하는 과산을 생성할 수 있다. 목적하는 과산은 카르복실산 에스테르를 과가수분해 활성을 갖는 융합 단백질을 포함하는 효소 촉매의 존재 하에, 과산화수소, 과붕산나트륨 또는 과탄산나트륨을 포함하나 이에 한정되지 않는 과산소원과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.
효소 촉매는 과가수분해 활성을 갖는 적어도 하나의 융합 단백질(표적화된 과가수분해효소)을 포함한다. 일 실시형태에서, 표적화된 과가수분해효소 내의 과가수분해 효소는 임의의 과가수분해 효소일 수 있으며, 효소가 본 발명의 하나 이상의 기질에 대하여 과가수분해 활성을 갖는 한, 리파제, 프로테아제, 에스테라제, 아실 트랜스퍼라제, 아릴 에스테라제, 탄수화물 에스테라제 및 조합물을 포함할 수 있다. 예에는 과가수분해 프로테아제(예를 들어, 서브틸리신 변이체; 미국 특허 제7,510,859호), 과가수분해 에스테라제(예를 들어, 슈도모나스 플루오레슨스; 미국 특허 제7,384,787호; 서열 번호 163 및 181) 및 과가수분해 아릴 에스테라제(예를 들어, 마이코박테리움 스메그마티스; 미국 특허 제7,754,460호; WO2005/056782호; 및 EP1689859 B1호; 서열 번호 162[S54V 변이체] 및 180[야생형])가 포함될 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
다른 실시형태에서, 융합 단백질을 제조하기 위해 사용되는 효소는 구조적으로 CE-7 탄수화물 에스테라제 패밀리의 구성원으로 분류된다(CE-7; 상기 문헌[Coutinho, P.M., and Henrissat, B.] 참조). 다른 실시형태에서, 표적화된 과가수분해효소는 구조적으로 세팔로스포린 C 데아세틸라제로 분류된 과가수분해 효소를 포함한다. 다른 실시형태에서, 표적화된 과가수분해효소는 구조적으로 아세틸 자일란 에스테라제로 분류된 과가수분해 효소를 포함한다. CE-7 아세틸 자일란 에스테라제를 셀룰로스 물질에 표적화시키는 경우, CE-7 아세틸 자일란 에스테라제가 천연적으로 셀룰로스-결합 도메인을 함유하지 않는 것이 이해된다. 이와 같이, 셀룰로스 표면에 표적화된 아세틸 자일란 에스테라제는 셀룰로스에 대하여 친화성을 갖는 추가의 펩티드 성분을 갖도록 고안된 키메라 융합 단백질이다.
일 실시형태에서, 과가수분해효소 촉매는 과가수분해 활성, 및
a) 서열 번호 2의 아미노산 잔기 118 내지 120과 정렬되는 RGQ 모티프;
b) 서열 번호 2의 아미노산 잔기 179 내지 183과 정렬되는 GXSQG 모티프; 및
c) 서열 번호 2의 아미노산 잔기 298 및 299와 정렬되는 HE 모티프를 포함하는 CE-7 시그니처 모티프를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 서열 번호 2의 참조 서열에 대한 정렬은 클러스털더블유를 사용하여 수행된다.
추가의 실시형태에서, 추가의 CE-7 시그니처 모티프가 포함될 수 있으며, 추가의(즉, 제4) 모티프는 서열 번호 2의 참조 서열의 아미노산 잔기 267 내지 269와 정렬되는 LXD 모티프로 정의된다.
다른 실시형태에서, 과가수분해효소 촉매는 과가수분해효소 활성을 갖는 효소를 포함하며, 상기 효소는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 및 64로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.
다른 실시형태에서, 과가수분해효소 촉매는 과가수분해효소 활성을 갖는 효소를 포함하며, 상기 효소는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 및 64로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지며, 상기 효소는 시그니처 모티프가 보존되고, 과가수분해효소 활성이 유지되는 한 하나 이상의 부가, 결실 또는 치환을 가질 수 있다.
상술된 바와 같이, CE-7 과가수분해효소는 CE-7 과가수분해효소를 포함하는 제1 부분, 및 과가수분해효소가 표면에 "표적화"되도록 표적 체표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분을 포함하는 제2 부분을 갖는 융합 단백질의 형태로 사용된다. 일 실시형태에서, 임의의 CE-7 과가수분해효소(CE-7 시그니처 모티프의 존재로 정의)는 효소를 표적 표면에 표적화시킬 수 있는 임의의 펩티드 성분/결합 요소에 융합될 수 있다. 일 태양에서, 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 항체, 항체 단편(Fab)뿐 아니라 단쇄 가변 단편(scFv; 면역글로불린의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 영역의 융합), 단일 도메인 카멜리드 항체, 스캐폴드 디스플레이 단백질, 셀룰로스-결합 도메인(셀룰로스 물질을 표적화하는 경우) 및 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 친화성 펩티드를 포함할 수 있다. 항체, 항체 단편 및 다른 면역글로불린-유래의 결합 요소뿐 아니라 라지 스캐폴드 디스플레이 단백질을 포함하는 조성물은 종종 경제적으로 실행가능하지 않다. 이와 같이, 그리고 바람직한 태양에서, 펩티드 성분/결합 요소는 면역글로불린 폴드 및/또는 면역글로불린 도메인이 결여된 단쇄 친화성 펩티드이다.
셀룰로스-결합 도메인은 통상 셀룰로스 분해 효소와 관련이 있다. 12개가 넘는 CBD의 패밀리가 보고되어 있다(상기 문헌[Tomme et al.]). 일 실시형태에서, 셀룰로스-결합 도메인은 CE-7 과가수분해효소를 셀룰로스 물질에 표적화시키기 위한 펩티드 성분으로 사용된다.
짧은 단쇄 체표면-결합 펩티드는 실험에 의해 생성하거나(예를 들어, 음으로 하전된 표면에 표적화된 양으로 하전된 폴리펩티드) 또는 표적 표면에 대한 바이오패닝을 사용하여 생성할 수 있다. 많은 디스플레이 기술(예를 들어, 파지 디스플레이, 효모 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 리보솜 디스플레이 및 mRNA 디스플레이)을 사용하여 친화성 펩티드를 동정/수득하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 개별 표적 표면-결합 펩티드는 임의의 스페이서/링커를 통해 함께 결합되어 더 큰 결합 도메인(본 명세서에서 결합 "손(hand)"으로도 지칭)을 형성하여, 과가수분해 효소의 표적 표면으로의 부착/국소화를 증진시킬 수 있다.
또한, 융합 단백질은 CE-7 과가수분해효소를 표적 표면-결합 도메인으로부터 분리하고/거나 상이한 표적 표면-결합 펩티드(예를 들어, 복수의 표적 표면 결합 펩티드가 함께 결합되어 더 큰 표적 표면-결합 도메인을 형성하는 경우) 사이를 분리하는 하나 이상의 펩티드 링커/스페이서를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 펩티드 스페이서/링커는 최대 10회 반복될 수 있다. 예시적인 펩티드 스페이서의 비제한적인 목록은 서열 번호 128 내지 140 및 143의 아미노산 서열에 의해 제공된다.
적절한 카르복실산 에스테르 기질은 하기의 화학식을 갖는 에스테르를 포함할 수 있다:
(a) 구조
[X]mR5
(여기서,
X는 화학식 R6C(O)O의 에스테르기이며;
R6은 하이드록실기 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티이고, R6은 C2 내지 C7인 R6에 대하여, 하나 이상의 에테르 결합을 임의로 포함하고;
R5는 하이드록실기로 임의로 치환된 C1 내지 C6 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티 또는 5-원 환형 헤테로방향족 모이어티, 또는 6-원 환형 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티이며, R5에서 각 탄소 원자는 각각 1개 이하의 하이드록실기 또는 1개 이하의 에스테르기 또는 카르복실산기를 포함하고, R5는 임의로 하나 이상의 에테르 결합을 포함하며;
m은 1 내지 R5에서의 탄소 원자수 범위의 정수이다)를 갖는 에스테르 - 상기 하나 이상의 에스테르는 25℃에서 적어도 5 ppm의 수 용해도를 갖는다 - ; 또는
(b) 구조
Figure pct00010
(여기서, R1은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R3 및 R4는 각각 H 또는 R1C(O)이다)를 갖는 하나 이상의 글리세리드; 또는
(c) 화학식
Figure pct00011
(여기서, R1은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R2는 C1 내지 C10 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴, (CH2CH2O)n 또는 (CH2CH(CH3)-O)nH이고, n은 1 내지 10이다)의 하나 이상의 에스테르; 또는
(d) 하나 이상의 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 또는 아세틸화 다당류; 또는
(e) (a) 내지 (d)의 임의의 조합.
또한, 적절한 기질은 아실화 단당류, 이당류 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아실화 당류를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 아실화 당류는 아세틸화 자일란; 아세틸화 자일란의 단편; 아세틸화 자일로스(예컨대, 자일로스 테트라아세테이트); 아세틸화 글루코스(예컨대, α-D-글루코스 펜타아세테이트; β-D-글루코스 펜타아세테이트; 1-티오-β-D-글루코스-2,3,4,6-테트라아세테이트); β-D-갈락토스 펜타아세테이트;소르비톨 헥사아세테이트; 수크로스 옥타아세테이트; β-D-리보푸라노스-1,2,3,5-테트라아세테이트; β-D-리보푸라노스-1,2,3,4-테트라아세테이트; 트라이-O-아세틸-D-갈락탈; 트라이-O-아세틸-D-글루칼; β-D-자일로푸라노스 테트라아세테이트, α-D-글루코피라노스 펜타아세테이트; β-D-글루코피라노스-1,2,3,4-테트라아세테이트; β-D-글루코피라노스-2,3,4, 6-테트라아세테이트; 2-아세트아미도-2-데옥시-1,3,4,6-테트라아세틸-β-D-글루코피라노스; 2-아세트아미도-2-데옥시-3,4,6-트라이아세틸-1-클로라이드-α-D-글루코피라노스; α-D-만노피라노스 펜타아세테이트 및 아세틸화 셀룰로스로 이루어진 군으부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 아세틸화 당류는 β-D-리보푸라노스-1,2,3,5-테트라아세테이트; 트라이-O-아세틸-D-갈락탈; 트라이-O-아세틸-D-글루칼; 수크로스 옥타아세테이트; 및 아세틸화 셀룰로스로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시형태에서, 추가의 적절한 기질은 또한 5-아세톡시메틸-2-푸르알데히드; 3,4-다이아세톡시-1-부텐; 4-아세톡시벤조산; 바닐린 아세테이트; 프로필렌 글리콜 메틸 에테르 아세테이트; 메틸 락테이트; 에틸 락테이트; 메틸 글리콜레이트; 에틸 글리콜레이트; 메틸 메톡시아세테이트; 에틸 메톡시아세테이트; 메틸 3-하이드록시부티레이트; 에틸 3-하이드록시부티레이트; 및 트라이에틸 2-아세틸 시트레이트를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 적절한 기질은 모노아세틴; 다이아세틴; 트라이아세틴; 모노프로피오닌; 다이프로피오닌; 트라이프로피오닌; 모노부티린; 다이부티린; 트라이부티린; 글루코스 펜타아세테이트; 자일로스 테트라아세테이트; 아세틸화 자일란; 아세틸화 자일란 단편; β-D-리보푸라노스-1,2,3,5-테트라아세테이트; 트라이-O-아세틸-D-갈락탈; 트라이-O-아세틸-D-글루칼; 1,2-에탄다이올; 1,2-프로판다이올; 1,3-프로판다이올; 1,2-부탄다이올; 1,3-부탄다이올; 2,3-부탄다이올; 1,4-부탄다이올; 1,2-펜탄다이올; 2,5-펜탄다이올; 1,5-펜탄다이올; 1,6-펜탄다이올; 1,2-헥산다이올; 2,5-헥산다이올; 1,6-헥산다이올의 모노에스테르 또는 다이에스테르; 및 그들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 기질은 하나 이상의 에스테르기를 포함하는 C1 내지 C6 폴리올이다. 바람직한 실시형태에서, C1 내지 C6 폴리올 상의 하나 이상의 하이드록실기는 하나 이상의 아세톡시기(예를 들어, 1,3-프로판다이올 다이아세테이트; 1,2-프로판다이올 다이아세테이트; 1,4-부탄다이올 다이아세테이트; 1,5-펜탄다이올 다이아세테이트 등)로 치환된다. 추가의 실시형태에서, 기질은 프로필렌 글리콜 다이아세테이트(PGDA), 에틸렌 글리콜 다이아세테이트(EGDA) 또는 그들의 혼합물이다.
추가의 실시형태에서, 적절한 기질은 모노아세틴, 다이아세틴, 트라이아세틴, 모노프로피오닌, 다이프로피오닌, 트라이프로피오닌, 모노부티린, 다이부티린 및 트라이부티린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 태양에서, 기질은 다이아세틴 및 트라이아세틴으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 실시형태에서, 적절한 기질은 트라이아세틴을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 카르복실산 에스테르는 모노아세틴, 다이아세틴, 트라이아세틴 및 그들의 조합(즉, 혼합물)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 액체 기질이다. 카르복실산 에스테르는 효소-촉매작용되는 과가수분해시에 원하는 농도의 퍼옥시카르복실산을 생성하기에 충분한 농도로 반응 제형에 존재한다. 카르복실산 에스테르는 반응 제형 중에서 완전히 용해성일 필요는 없으나, 과가수분해효소 촉매에 의한 에스테르의 상응하는 퍼옥시카르복실산으로의 전환을 가능하게 하기에 충분한 용해성을 갖는다. 카르복실산 에스테르는 반응 제형의 0.05 wt% 내지 40 wt%의 농도, 바람직하게는 반응 제형의 0.1 wt% 내지 20 wt%의 농도, 더욱 바람직하게는 반응 제형의 0.5 wt% 내지 10 wt%의 농도로 반응 제형 중에 존재한다.
과산소원은 과산화수소, 과산화수소 부가물(예를 들어, 우레아-과산화수소 부가물(카르바미드 퍼옥시드)), 과붕산염 및 과탄산염을 포함할 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 반응 제형 중의 과산소 화합물의 농도는 0.0033 wt% 내지 약 50 wt%, 바람직하게는 0.033 wt% 내지 약 40 wt%, 더욱 바람직하게는 0.33 wt% 내지 약 30 wt%의 범위일 수 있다.
많은 과가수분해효소 촉매(전체 세포, 투과화된 전체 세포 및 부분 정제된 전체 세포 추출물)는 카탈라아제 활성(EC 1.11.1.6)을 갖는 것으로 보고되었다. 카탈라아제는 과산화수소의 산소 및 물로의 전환을 촉매작용시킨다. 일 태양에서, 과가수분해 촉매에는 카탈라아제 활성이 결여되어 있다. 다른 태양에서, 카탈라아제 억제제는 반응 제형에 첨가될 수 있다. 카탈라제 억제제의 예에는 나트륨 아지드 및 하이드록실아민 설페이트가 포함되나, 이들에 한정되지 않는다. 당업자는 필요에 따라 카탈라아제 억제제의 농도를 조절할 수 있다. 카탈라제 억제제의 농도는 통상 0.1 mM 내지 약 1 M; 바람직하게는 약 1 mM 내지 약 50 mM; 더욱 바람직하게는 약 1 mM 내지 약 20 mM의 범위이다. 일 태양에서, 나트륨 아지드 농도는 통상 약 20 mM 내지 약 60 mM의 범위인 한편, 하이드록실아민 설페이트 농도는 통상 약 0.5 mM 내지 약 30 mM, 바람직하게는 약 10 mM이다.
다른 실시형태에서, 효소 촉매에는 상당한 카탈라아제 활성이 결여되거나, 카탈라아제 활성을 감소시키거나 제거하도록 엔지니어링될 수 있다. 숙주 세포 내의 카탈라아제 활성은 트랜스포손(transposon) 돌연변이유발, RNA 안티센스 발현, 표적화된 돌연변이유발 및 무작위 돌연변이유발을 포함하나 이에 한정되지 않는 널리 공지되어 있는 기술을 사용하여 카탈라아제 활성을 담당하는 유전자(들)의 발현을 파괴시킴으로써 하향 조절되거나 제거될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 내인성 카탈라아제 활성을 암호화하는 유전자(들)는 하향 조절되거나 파괴된다(즉, 낙-아웃). 본 명세서에 사용되는 "파괴된" 유전자는 변형된 유전자에 의해 암호화된 단백질의 활성 및/또는 기능이 더이상 존재하지 않는 것이다. 유전자를 파괴시키는 수단은 해당 분야에 널리 공지되어 있으며, 해당하는 단백질의 활성 및/또는 기능이 더이상 존재하지 않는 한, 유전자에 대한 삽입, 결실 또는 돌연변이를 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 생성 숙주는 katG 및 katE로 이루어진 군으로부터 선택되는 파괴된 카탈라아제 유전자를 포함하는 이. 콜라이(E. coli) 생성 숙주이다(미국 특허 출원 공개 제2008-0176299호 참조). 다른 실시형태에서, 생성 숙주는 katG 및 katE 카탈라아제 유전자 둘 모두에서의 하향 조절 및/또는 파괴를 포함하는 에스케리키아 콜라이 균주이다.
수성 반응 제형 중의 촉매의 농도는 촉매의 특정 촉매 활성에 좌우되며, 원하는 반응 속도를 수득하도록 선택된다. 과가수분해 반응물 중의 촉매의 중량은 전형적으로 총 반응 부피 ㎖당 0.0001 ㎎ 내지 10 ㎎, 바람직하게는 ㎖당 0.001 ㎎ 내지 2.0 ㎎ 범위이다. 또한, 촉매는 당업자에게 널리 공지되어 있는 방법을 사용하여 용해성 또는 불용성 지지체 상에 고정화될 수 있으며; 예를 들어, 문헌[Immobilization of Enzymes and Cells; Gordon F. Bickerstaff, Editor; Humana Press, Totowa, NJ, USA; 1997]을 참조한다. 고정화된 촉매의 사용에 의해, 이후의 반응에서 촉매의 회수 및 재사용이 가능하게 된다. 효소 촉매는 전체 미생물 세포, 투과화된 미생물 세포, 미생물 세포 추출물, 부분 정제되거나 정제된 효소 및 그들의 혼합물의 형태일 수 있다.
일 태양에서, 카르복실산 에스테르의 화학적 과가수분해 및 효소에 의한 과가수분해의 조합에 의해 생성되는 퍼옥시카르복실산의 농도는 선택된 응용을 위해 유효 농도의 퍼옥시카르복실산을 제공하기에 충분하다. 다른 태양에서, 본 발명은 효소 및 효소 기질의 조합을 제공하여, 원하는 유효 농도의 퍼옥시카르복실산을 생성하며, 여기서, 첨가되는 효소의 부재 하에서, 유의미하게 더 낮은 농도의 퍼옥시카르복실산의 생성이 존재한다. 일부 경우에, 무기 과산화물과 효소 기질의 직접적인 화학적 반응에 의한 효소 기질의 상당한 화학적 과가수분해가 존재할 수 있지만, 원하는 응용에서 유효 농도의 퍼옥시카르복실산을 제공하기 위해 생성되는 충분한 농도의 퍼옥시카르복실산이 존재하지 않을 수 있으며, 총 퍼옥시카르복실산 농도의 유의미한 증가는 적절한 과가수분해효소 촉매를 반응 제형에 첨가함으로써 달성된다.
적어도 하나의 카르복실산 에스테르의 과가수분해에 의해 생성되는 퍼옥시카르복실산(예를 들어, 퍼아세트산)의 농도는 과가수분해 반응의 개시 10분 내, 바람직하게는 5분 내에 적어도 약 0.1 ppm, 바람직하게는 적어도 0.5 ppm, 1 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 300 ppm, 500 ppm, 700 ppm, 1000 ppm, 2000 ppm, 5000 ppm 또는 10,000 ppm의 과산이다. 퍼옥시카르복실산을 포함하는 제품 제형은 임의로, 표적 적용에 대해 원하는 더 낮은 농도의 퍼옥시카르복실산 베이스를 갖는 제형을 생성하도록 물 또는 주로 물로 이루어진 용액으로 희석될 수 있다. 당업자는 반응 성분 및/또는 희석량을 조절하여, 선택된 제품을 위한 목적하는 과산 농도를 달성할 수 있다.
일 태양에서, 원하는 농도의 과산을 생성하는데 필요한 반응 시간은 약 2시간 이하, 바람직하게는 약 30분 이하, 더욱 바람직하게는 약 10분 이하, 가장 바람직하게는 약 5분 이하이다. 다른 태양에서, 표적 표면은 반응 성분의 배합 5분 내에 본 명세서에 기재된 방법에 따라 형성되는 과산과 접촉된다. 일 실시형태에서, 표적 표면은 상기 반응 성분의 배합 약 5분 내지 약 168시간 내에, 또는 상기 반응 성분의 배합 약 5분 내지 약 48시간 내에, 또는 약 5분 내지 2시간 내에, 또는 그 안의 임의의 이러한 시간 간격으로 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생성되는 과산과 접촉된다.
본 명세서에 기재된 방법에 따라 형성된 과산은 제품/응용에서 사용되며, 과산은 표적 표면과 접촉하여, 과산 기반의 이익을 표적 물질에 제공한다. 일 실시형태에서, 표적 표면을 위한 과산의 생성 방법은 동소에서 행해진다.
반응의 온도를 선택하여, 반응 속도와 효소 촉매 활성의 안정성 둘 모두를 조절할 수 있다. 반응 온도는 반응 제형의 동결점 바로 위의 온도(대략 0℃) 내지 약 95℃ 범위일 수 있으며, 바람직한 반응 온도 범위는 5℃ 내지 약 75℃이고, 더욱 바람직한 범위는 약 5℃ 내지 약 55℃이다.
퍼옥시카르복실산을 함유하는 최종 반응 제형의 pH는 약 2 내지 약 9, 바람직하게는 약 3 내지 약 8, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 더더욱 바람직하게는 약 5.5 내지 약 8, 보다 바람직하게는 약 6.0 내지 약 7.5이다. 반응물 및 최종 반응 제형의 pH는 임의로 포스페이트, 피로포스페이트, 바이카르보네이트, 아세테이트 또는 시트레이트를 포함하나 이들에 한정되지 않는 적절한 완충제의 첨가에 의해 조절될 수 있다. 완충제가 사용되는 경우, 완충제의 농도는 전형적으로 0.1 mM 내지 1.0 M, 바람직하게는 1 mM 내지 300 mM, 가장 바람직하게는 10 mM 내지 100 mM이다.
다른 태양에서, 효소에 의한 과가수분해 반응 제형은 분산제로 작용하는 유기 용매를 함유하여, 반응 제형 중의 카르복실산 에스테르의 용해 속도를 증진시킬 수 있다. 이러한 용매는 프로필렌 글리콜 메틸 에테르, 아세톤, 사이클로헥산온, 다이에틸렌 글리콜 부틸 에테르, 트라이프로필렌 글리콜 메틸 에테르, 다이에틸렌 글리콜 메틸 에테르, 프로필렌 글리콜 부틸 에테르, 다이프로필렌 글리콜 메틸 에테르, 사이클로헥산올, 벤질 알코올, 아이소프로판올, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 그들의 혼합물을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.
단일 단계 대 다단계 적용 방법
전형적으로, 과산 유익제를 효소에 의해 생성하기 위한 최소 반응 성분 세트는 (1) 표적화된 융합 단백질의 형태의 적어도 하나의 과가수분해효소, (2) 적어도 하나의 적절한 카르복실산 에스테르 기질 및 (3) 과산소원(및 물)을 포함할 것이다.
본 발명의 조성물의 과산 생성 반응 성분은 사용할 때까지 분리되어 유지될 수 있다. 일 실시형태에서, 과산-생성 성분을 배합한 다음, 표적 표면과 접촉시켜, 이에 의해, 생성되는 과산계 유익제가 표적 표면에 이익을 제공한다. 성분을 배합한 다음 표적 표적 표면과 접촉시키거나, 또는 표적 표면 상에서 배합할 수 있다. 일 실시형태에서, 과산-생성 성분은 과산이 동소에서 생성되도록 배합한다.
또한, 다단계 적용이 사용될 수 있다. 효소에 의한 과산 생성에 필요한 나머지 성분을 적용하기 전에, 과산 생성 시스템(즉, 표적 표면 상에서의, 3가지 기본 반응 성분 중 적어도 하나의 순차적 적용) 조성물의 1가지 또는 2가지의 개별 성분을 표적 표면과 접촉시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 표적화된 과가수분해 효소는 표면을 카르복실산 에스테르 기질 및/또는 과산소원과 접촉시키기 전에 표적 표면과 접촉시킨다(즉, "2-단계 적용"). 표적화된 과가수분해효소는 표적 표면에 대한 융합 단백질의 비공유 결합을 촉진시키는 적절한 조건 하에서 표적 표면과 접촉한다. 나머지 반응 성분을 배합하기 전에, 임의의 헹굼 단계를 사용하여 과잉의 및/또는 미결합 융합 단백질을 제거할 수 있다.
추가의 실시형태에서, 표적화된 과가수분해 효소 및 카르복실산 에스테르를 과산소원의 첨가 전에 표적 표면에 적용한다.
추가의 실시형태에서, 표적화된 과가수분해 효소 및 과산소원(예를 들어, 과산화수소를 포함하는 수용액)을 카르복실산 에스테르 기질의 첨가 전에 표적 표면에 적용한다.
추가의 실시형태에서, 카르복실산 에스테르 기질 및 과산소원(예를 들어, 과산화수소를 포함하는 수용액)을 표적화된 과가수분해 효소의 첨가 전에 표적 표면에 적용한다.
표적화된 과가수분해효소로 제조되는 퍼옥시카르복실산 조성물의 용도
본 발명의 방법에 따라 생성되는 표적화된 효소 촉매로 생성되는 과산은 생물학적 오염물질의 농도의 감소, 예를 들어, 의료 기구(예를 들어, 내시경), 텍스타일(예를 들어, 의복 및 카페트), 식품 조리 표면, 식품 보관 및 식품-포장 장비, 식품의 포장에 사용되는 물질, 닭 부화장 및 생육 시설, 동물 울타리 및 미생물 및/또는 살바이러스 활성을 갖는 폐가공수(spent process water)의 오염 제거를 위해 다양한 경질 표면/무생물 물체 응용에서 사용될 수 있다. 표적화된 효소로 생성되는 퍼옥시카르복실산은 프리온(예를 들어, 특정 프로테아제)을 불활성화시키도록 고안된 제형에서 사용되어, 추가로 살생 활성을 제공할 수 있다(미국 특허 제7,550,420호(DiCosimo et al) 참조).
일 태양에서, 과산 조성물은 오토클레이브 가능하지 않은(non-autoclavable) 의료 기구 및 식품 포장 장비에 대한 소독제로서 유용하다. 과산-함유 제형이 GRAS 또는 식품-등급 성분(표적화된 과가수분해효소, 효소 기질, 과산화수소 및 완충제)을 사용하여 제조될 수 있음에 따라, 표적화된 과가수분해효소-생성된 과산은 또한 동물 고기덩어리, 고기, 과일 및 야채의 오염 제거 또는 제조된 식품의 오염 제거를 위해 사용될 수 있다. 표적화된 과가수분해효소-생성된 과산이 제품에 혼입될 수 있으며, 제품의 최종 형태는 분말, 액체, 겔, 막, 고체 또는 에어로졸이다. 표적화된 과가수분해효소-생성된 과산을 여전히 유효한 오염 제거를 제공하는 농도로 희석할 수 있다.
과가수분해 효소 및 적어도 하나의 펩티드 성분을 포함하는 융합 단백질을 사용하여, 소독되거나 탈색될 표면 상에서 또는 그 근처에서 유효 농도의 과산을 생성한다. 표적 표면은 생물학적 오염물질, 예를 들어, 병원성 미생물 오염물질로 오염된(또는 오염된 것으로 추정되는) 표면 또는 물체일 수 있다. 일 실시형태에서, 과가수분해 효소를 표적화하기 위해 사용되는 펩티드 성분은 오염된 표면, 오염된 것으로 추정된 표면 또는 실제 오염물질(다시 말하면, 펩티드 성분은 실제 생물학적 오염 물질에 대하여 친화성을 갖는다)에 대하여 친화성을 갖는다.
본 명세서에 사용되는 "접촉"은 유효 농도의 과산(표적화된 과가수분해효소에 의해 생성되는)을 포함하는 소독 조성물을 목적하는 효과를 달성하기에 충분한 기간 동안 표적 표면과 접촉하게 배치하는 것을 말한다. 접촉은 유효 농도의 퍼옥시카르복실산을 형성하는 용액 또는 조성물의 표적 표면으로의 분무, 처리, 침지, 플러싱(flushing), 그의 위 또는 안으로의 주입, 혼합, 조합, 페인팅, 코팅, 도포, 부착 및 다르게는 전달을 포함한다. 표적화된 과가수분해효소를 포함하는 소독 조성물을 세정 조성물과 배합하여, 세정 및 소독 둘 모두를 제공할 수 있다. 대안적으로, 세정제(예를 들어, 계면활성제 또는 세제)를 제형에 혼입시켜, 단일 조성물에서 세정 및 소독 둘 모두를 제공할 수 있다.
또한, 조성물은 적어도 하나의 추가의 항미생물제, 프리온-분해 프로테아제, 살바이러스제(virucide), 살포자제(sporicide) 또는 살생제의 조합을 함유할 수 있다. 청구된 방법에 의해 생성되는 과산과 이들 제제의 병용은 생물학적 오염 물질로 오염된(또는 오염된 것으로 의심되는) 표면 및/또는 물체를 세정하고 소독하기 위해 사용되는 경우 증가된 효과 및/또는 상승 효과를 제공할 수 있다. 적절한 항미생물제에는 원하는 정도의 미생물 보호를 제공하기에 충분한 양의 카르복실산 에스테르(예를 들어, p-하이드록시 알킬 벤조에이트 및 알킬 신나메이트), 설폰산(예를 들어, 도데실벤젠 설폰산), 아이오도-화합물 또는 활성 할로겐 화합물(예를 들어, 원소 할로겐, 할로겐 옥시드(예를 들어, NaOCl, HOCl, HOBr, ClO2), 요오드, 인터할라이드(interhalide)(예를 들어, 일염화요오드, 이염화요오드, 삼염화요오드, 사염화요오드, 염화브롬, 일브롬화요오드 또는 이브롬화요오드), 폴리할라이드, 차아염소산염, 차아염소산, 하이포브롬산염, 하이포브롬산, 클로로- 및 브로모-하이단토인, 이산화염소 및 아염소산나트륨), 유기 과산화물, 예를 들어, 벤조일 퍼옥시드, 알킬 벤조일 퍼옥시드, 오존, 일중항 산소 발생자 및 그들의 혼합물, 페놀 유도체(예를 들어, o-페닐 페닐, o-벤질-p-클로로페놀, tert-아밀 페놀 및 C1-C6 알킬 하이드록시 벤조에이트), 4차 암모늄 화합물(예를 들어, 알킬다이메틸벤질 암모늄 클로라이드, 다이알킬다이메틸 암모늄 클로라이드 및 이들의 혼합물) 및 이러한 항미생물제의 혼합물이 포함된다. 유효량의 항미생물제에는 약 0.001 wt% 내지 약 60 wt% 항미생물제, 약 0.01 wt% 내지 약 15 wt% 항미생물제, 또는 약 0.08 wt% 내지 약 2.5 wt%의 항미생물제가 포함된다.
일 태양에서, 상기 방법에 의해 형성되는 과산을 사용하여, 표적 장소 상에(또는 그 근처에) 효소에 의해 생성되는 경우, 생존가능한 생물학적 오염물질(예를 들어, 미생물 집단)의 농도를 감소시킬 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "장소"는 원하는 과산 기반의 이익에 적절한 표적 표면의 일부 또는 모두를 포함한다. 표적 표면은 잠재적으로 생물학적 오염물질로 오염될 수 있는 모든 표면을 포함할 수 있다. 비제한적인 예에는 식품 또는 음료 산업에서 관찰되는 장비 표면(예를 들어, 탱크, 컨베이어, 바닥, 드레인(drain), 냉각기, 냉동고, 장비 표면, 벽, 밸브, 벨트, 파이프, 드레인, 조인트(joint), 크레바스(crevasse), 이들의 조합 등); 건물 표면(예를 들어, 벽, 바닥 및 창); 수처리 시설, 푸울(pool) 및 스파를 비롯한 비-식품-산업 관련 파이프 및 드레인, 및 발효 탱크; 병원 또는 동물병원 표면(예를 들어, 벽, 바닥, 침대, 장비(예를 들어, 내시경), 병원/동물병원 또는 기타 건강관리 환경에서 입는 의복, 예를 들어, 의복, 스크러브(scrub), 신발 및 기타 병원 또는 동물병원 표면); 식당 표면; 욕실 표면; 화장실; 의복 및 신발; 가축, 예를 들어, 가금류, 소, 젖소, 염소, 말 및 돼지를 위한 곳간 또는 축사의 표면; 가금류 또는 새우를 위한 부화장; 및 약제학적 또는 생물 약제학적 표면(예를 들어, 약제학적 또는 생물 약제학적 제조 장비, 약제학적 또는 생물 약제학적 성분, 약제학적 또는 생물 약제학적 부형제)을 포함한다. 추가의 경질 표면에는 식품, 예를 들어, 소고기, 가금류 고기, 돼지고기, 야채, 과일, 해산물, 이들의 조합 등이 포함된다. 또한, 장소는 물 흡수 물질, 예를 들어, 감염된 린넨 또는 기타 텍스타일을 포함할 수 있다. 또한, 장소는 종자, 옥수수, 덩이줄기, 과일 및 야채, 재배 식물 및 특히 작물 재배 식물, 예를 들어, 곡물, 잎 채소 및 샐러드 작물, 뿌리 채소, 콩과 식물, 장과, 감귤류 및 단단한 과일을 포함하는 수확된 식물 또는 식물 생성물을 포함한다.
경질 표면 물질의 비제한적인 예에는 금속(예를 들어, 강, 스테인리스 강, 크롬, 티탄, 철, 구리, 황동, 알루미늄 및 그들의 합금), 광물(예를 들어, 콘크리트), 폴리머 및 플라스틱(예를 들어, 폴리올레핀, 이를 테면, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리(메트)아크릴레이트, 폴리아크릴로니트릴, 폴리부타다이엔, 폴리(아크릴로니트릴, 부타디엔, 스티렌), 폴리(아크릴로니트릴, 부타디엔), 아크릴로니트릴 부타디엔; 폴리에스테르, 예를 들어, 폴리에틸렌 테레프탈레이트; 및 폴리아미드, 예를 들어, 나일론)이 포함될 수 있다. 추가의 표면에는 벽돌, 타일, 세라믹, 자기, 목재, 목재 펄프, 제지, 비닐, 리놀륨 및 카페트가 포함된다.
본 발명의 방법에 의해 형성되는 과산을 사용하여, 섬유, 실, 의류 용품 또는 텍스타일에, 소독, 살균, 탈색, 탈염 및 탈취를 포함하나 이들에 한정되지 않는 이익을 제공할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 형성되는 과산은 몇가지만 말하자면, 텍스타일 사전-세정 처리, 세탁 세제, 세탁 세제 또는 첨가제, 염색 제거제, 탈색 조성물, 탈취 조성물 및 헹굼제를 포함하나 이들에 한정되지 않는 많은 세탁 관리 제품에 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 형성되는 과산은 특히 과아세트산이 사용되는 목재 펄프 또는 제지 펄프 탈색/탈리그닌(delignification) 방법의 하나 이상의 단계에 사용될 수 있다(예를 들어, EP1040222 B1호 및 미국 특허 제5,552,018호(Devenyns, J.) 참조).
세탁 관리 조성물
본 발명의 조성물 및 방법은 표적화된 과산 생성을 위해 세탁 관리 응용에 사용될 수 있다. 표적화된 과가수분해효소는 섬유, 실, 텍스타일(직물 또는 부직물), 또는 의류 물품에 표적화될 수 있다. 과산 생성 시스템에 의해 생성되는 과산에 의해, 소독되거나, 살균되거나, 탈색되거나, 탈염되거나, 탈취되거나 또는 이들의 임의의 조합인 표적화된 표면이 야기된다.
과가수분해 활성을 갖는 융합 단백질은 섬유, 실, 텍스타일(직물 또는 부직물) 또는 의류 용품의 제조에 사용되는 표적 물질에 대하여 친화성을 갖도록 고안된다. 표적 물질은 세탁되는 용품의 제조에 사용되는 천연, 반-합성 및 합성 물질을 포함할 수 있다. 표적 물질은 통상 섬유, 실, 텍스타일 및 의류 용품의 제조에 사용되는 폴리머 및 코폴리머를 포함할 수 있다.
표적 물질은 셀룰로스 물질, 비-셀룰로스 물질(예를 들어, 폴리에스테르, 폴리아크릴계 물질) 및 그들의 배합물을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 표적 표면은 셀룰로스 물질을 포함한다. 이와 같이, 셀룰로스 물질에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분을 사용하여 표적화된 과가수분해효소를 셀룰로스 물질에 결합시킬 수 있다. 나머지 과산-생성 반응 성분은 표적화된 과가수분해효소를 표적 표면에 결합시키기 전에, 이와 함께, 또는 이후에, 첨가될 수 있다.
과산 유익제의 제2 물질/표면 또는 물체로의 조절된 전달을 위한 제1 물질/표면 또는 물체에 대한 과가수분해효소 표적화
일부 실시형태에서, 과가수분해 효소를 과산계 유익제의 수혜자가 아닌 주요 표적 물질/표면 또는 물체에 표적화시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 과가수분해 효소를 먼저 주요 물질/표면, 예를 들어, 도구, 기구(utensil), 적용기, 패브릭, 붕대, 스폰지, 대걸레, 비-호흡가능한 입자 등에 표적화시키는 것이 바람직할 수 있으며, 이들은 이후에 세정, 탈색, 미백, 소독, 살균, 탈염, 탈취 또는 이들의 임의의 조합을 위해 제2 물질/표면에 과산 기반의 이익의 전달에 사용된다(예를 들어, 대걸레 헤드에 결합된 과가수분해 융합 단백질은 이후에 바닥과 접촉한다). 다른 태양에서, 표적화된 과가수분해 효소는 이후에 활성 융합 단백질을 위한 전달 비히클로 사용되는 입자에 표적화된다(입자에 대하여 친화성을 갖는 결합 도메인을 사용하여). 추가의 태양에서, 융합 단백질을 포함하는 입자는 호흡가능하지 않으며, 독성이 낮다. 다른 실시형태에서, 입자 또는 표면은 셀룰로스에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분을 통하여 과가수분해 융합 단백질에 결합할 수 있는 셀룰로스 물질을 포함한다.
퍼옥시카르복실산 및 과산화수소의 농도를 결정하기 위한 HPLC 검정 방법.
적정, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 기체 크로마토그래피(GC), 질량 분석기(MS), 모세관 전기영동(CE), 문헌[Pinkernell et al., (Anal . Chem ., 69(17):3623-3627 (1997))]에 기재된 분석 절차, 및 본 실시예에 기재된 바와 같은 2,2'-아지노-비스 (3'-에틸벤조타졸린)-6-설포네이트(ABTS) 검정법(문헌[Pinkernell et . al . Analyst, 122: 567-571, (1997)] 및 문헌[Dinu et . al., Adv. Funct . Mater ., 20: 392-398 (2010)])을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 분석 방법을 본 발명의 방법에 사용하여 반응물 및 생성물을 분석할 수 있다.
퍼옥시카르복실산의 최소 살생 농도의 결정
특정 개인 관리 응용, 예를 들어, 몇가지만 말하자면, 체취 및 진균 감염, 및 치아 우식증의 발생과 관련된 것과 같은 원치않는 미생물의 제거와 관련이 있을 수 있다. 이와 같이, 표적 개인 관리 응용을 위한 최소 살생 농도를 측정하고자 할 수 있다. 문헌[J. Gabrielson, et al. (J. Microbiol . Methods 50: 63-73 (2002))]에 기재되어 있는 방법은 퍼옥시카르복실산 또는 과산화수소 및 효소 기질의 최소 살생 농도(MBC)의 결정을 위해 사용할 수 있다. 검정 방법은 XTT 환원 억제를 기반으로 하며, 여기서, XTT((2,3-비스[2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐]-5-[(페닐아미노)카르보닐]-2H-테트라졸륨, 내염, 모노나트륨 염)는 490 ㎚ 또는 450 ㎚에서 측정한 광학 밀도(OD)의 변화에 의해 미생물 호흡 활성을 나타내는 산화환원 염료이다. 그러나, 플레이트 생존 계수, 직접적인 현미경 계수, 건조 중량, 탁도 측정, 흡광도 및 생물발광을 포함하나 이들에 한정되지 않는 소독제 및 보존제의 활성의 시험에 이용할 수 있는 다양한 다른 방법이 존재한다(예를 들어, 문헌[Brock, Semour S., Disinfection, Sterilization, and Preservation, 5th edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA; 2001] 참조).
재조합 미생물 발현
본 발명의 서열의 유전자 및 유전자 산물은 이종 숙주 세포, 특히 미생물 숙주 세포에서 생성될 수 있다. 본 발명의 유전자 및 핵산 분자의 발현에 바람직한 이종 숙주 세포는 진균 또는 박테리아 패밀리에서 관찰될 수 있고, 넓은 범위의 온도, pH 값 및 용매 용인성에 걸쳐 성장하는 미생물 숙주이다. 예를 들어, 박테리아, 효모 및 사상 진균 중 임의의 것이 본 발명의 핵산 분자의 발현에 적절한 숙주일 수 있는 것으로 고려된다. 과가수분해효소는 세포내, 세포외 또는 세포내와 세포외 둘 모두의 조합에서 발현될 수 있으며, 여기서, 세포외 발현은 발효 생성물로부터의 원하는 단백질의 회수를 세포내 발현에 의해 생성되는 단백질의 회수 방법보다 더 용이하게 한다. 전사, 번역 및 단백질 생합성 장치는 세포 바이오매스를 생성하는데 사용되는 세포 공급원료에 비하여 변함 없이 유지되며; 기능적 유전자는 관련 없이 발현될 것이다. 숙주 균주의 예에는 박테리아, 진균 또는 효모 종, 예를 들어, 아스페르길루스(Aspergillus), 트리코더마(Trichoderma), 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia), 파피아(Phaffia), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 야로위아(Yarrowia), 살모넬라(Salmonella), 바실러스(Bacillus), 아키네토박터(Acinetobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 아그로박테리움(Agrobacterium), 에리트로박터(Erythrobacter), 클로로븀(Chlorobium), 크로마튬(Chromatium), 플라보박테리움(Flavobacterium), 사이토파가(Cytophaga), 로도박터(Rhodobacter), 로도코커스(Rhodococcus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 브레비박테리움(Brevibacterium), 코리네박테리아(Corynebacteria), 마이코박테리움(Mycobacterium), 데이노코커스(Deinococcus), 에스케리키아(Escherichia), 에르위니아(Erwinia), 판토에아(Pantoea), 슈도모나스(Pseudomonas), 스핑고모나스(Sphingomonas), 메틸로모나스(Methylomonas), 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로코커스(Methylococcus), 메틸로시너스(Methylosinus), 메틸로마이크로븀(Methylomicrobium), 메틸로시스티스(Methylocystis), 알칼리게네스(Alcaligenes), 시네코시스티스(Synechocystis), 시네코코커스(Synechococcus), 아나바에나(Anabaena), 티오바실러스(Thiobacillus), 메타노박테리움(Methanobacterium), 클레브시엘라(Klebsiella) 및 마익소코커스(Myxococcus)가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 일 실시형태에서, 박테리아 숙주 스트레인은 에스케리키아, 바실러스, 클루이베로마이세스 및 슈도모나스를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 박테리아 숙주 세포는 바실러스 서브틸리스 또는 에스케리키아 콜라이이다.
대규모 미생물 성장 및 기능적 유전자 발현은 매우 다양한 단순 또는 복합 탄수화물, 유기산 및 알코올 또는 포화 탄화수소, 예를 들어, 메탄 또는 광합성 숙주 또는 화학자가영양(chemoautotrophic) 숙주의 경우에 이산화탄소, 소정의 형태 및 양의 질소, 인, 황, 산소, 탄소, 또는 작은 무기 이온을 포함하는 임의의 미량의 미량영양소를 사용할 수 있다. 성장 속도의 조절은 특정 조절 분자의 배양물로의 첨가 또는 무첨가에 의해 영향을 받을 수 있으며, 통상 영양분 또는 에너지원을 고려하지 않는다.
적절한 숙주 세포의 형질전환에 유용한 벡터 또는 카세트가 당업계에 널리 알려져 있다. 전형적으로, 벡터 또는 카세트는 관련 유전자의 전사 및 번역을 유도하는 서열, 선별가능한 마커, 및 자가 복제 또는 염색체 통합을 허용하는 서열을 포함한다. 적절한 벡터는 전사 개시 제어부를 품고 있는 유전자의 5'의 영역 및 전사 종결을 제어하는 DNA 단편의 3'의 영역을 포함한다. 둘 모두의 제어 영역이 형질전환된 숙주 세포에 대하여 동종의 및/또는 생성 숙주에 대해 천연의 유전자로부터 유래되는 경우가 가장 바람직하지만, 그러한 제어 영역이 그렇게 유래될 필요는 없다.
바람직한 숙주 세포에서 본 발명의 세팔로스포린 C 데아세틸라제 암호화 영역의 발현을 작동시키기에 유용한 개시 제어 영역 또는 프로모터는 많으며, 당업자에게 잘 알려져 있다. 사실상, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (사카로마이세스에서의 발현에 유용함); AOX1 (피키아에서의 발현에 유용함); 및 lac, araB, tet, trp, lPL, lPR, T7, tac 및 trc(에스케리키아 콜라이에서의 발현에 유용함)뿐 아니라 amy, apr, npr 프로모터 및 바실러스에서의 발현에 유용한 다양한 파지 프로모터를 포함하나 이들에 한정되지 않는 이들 유전자를 작동시킬 수 있는 임의의 프로모터가 본 발명에 적절하다.
종결 제어 영역은 또한 바람직한 숙주 세포의 다양한 천연의 유전자로부터 유래될 수 있다. 일 실시형태에서, 종결 제어 영역의 포함은 선택적이다. 다른 실시형태에서, 키메라 유전자는 바람직한 숙주 세포 유래의 종결 제어 영역을 포함한다.
산업적 생성
다양한 배양 방법을 적용하여, 과가수분해효소 촉매를 생성할 수 있다. 예를 들어, 재조합 미생물 숙주로부터 과발현되는 특정 유전자 산물의 대규모 생성은 배치식(batch), 유가식(fed-batch) 및 연속식(continuous) 배양 방법에 의해 생성될 수 있다. 배치식 및 유가식 배양 방법은 통상적이며, 해당 분야에 널리 알려져 있으며, 예는 문헌[Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989)] 및 문헌[Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36:227-234 (1992)]에서 찾을 수 있다.
또한, 목적 과가수분해효소 촉매의 상업적 생성은 연속식 배양으로 달성될 수 있다. 연속식 배양은 정의된 배양 배지를 생물반응기에 연속 첨가함과 동시에, 동량의 조절된 배지를 처리를 위해 제거하는 개방형 시스템이다. 연속식 배양은 일반적으로 세포를 고정된 높은 액상 밀도로 유지시키며, 여기서, 세포는 주로 대수기 성장으로 존재한다. 대안적으로, 연속식 배양은 고정화된 세포로 실시될 수 있고, 여기서, 탄소 및 영양분을 지속적으로 공급하고, 가치있는 생성물, 부산물 또는 폐기물을 세포 매스로부터 지속적으로 제거한다. 세포 고정화는 천연 및/또는 합성 재료로 이루어진 매우 다양한 고체 지지체를 사용하여 수행할 수 있다.
배치식 발효, 유가식 발효 또는 연속식 배양으로부터의 목적 과가수분해효소 촉매의 회수는 당업계에 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 효소 촉매가 세포 내에서 생성되는 경우, 세포 페이스트(paste)를 원심분리 또는 막 여과에 의해 배양 배지로부터 분리하고, 임의로, 물 또는 원하는 pH의 수성 완충제로 세정한 다음, 원하는 pH에서의 수성 완충제 중의 세포 페이스트의 현탁액을 균질화시켜, 원하는 효소 촉매를 함유하는 세포 추출물을 생성한다. 효소 촉매 용액으로부터 원치않는 단백질을 침전시키기 위한 열-처리 단계 전에, 세포 추출물을 임의로, 적절한 여과 조제, 예를 들어 셀라이트 또는 실리카를 통해 여과하여, 세포 데브리스를 제거할 수 있다. 이어서, 원하는 효소 촉매를 함유하는 용액을 막 여과 또는 원심분리에 의하여 침전된 세포 데브리스 및 단백질로부터 분리할 수 있으며, 얻은 부분-정제된 효소 촉매 용액을 추가의 막 여과에 의해 농축시킨 다음, 임의로 적절한 담체(예를 들어, 말토덱스트린, 포스페이트 완충제, 시트레이트 완충제 또는 그들의 혼합물)와 혼합하고, 분무 건조시켜, 원하는 효소 촉매를 함유하는 고체 분말을 생성할 수 있다.
양, 농도, 또는 다른 값 또는 파라미터가 범위, 바람직한 범위 또는 바람직한 상한값 및 바람직한 하한값의 목록으로서 주어지는 경우, 범위가 별도로 개시되는 지에 상관없이 임의의 상한 범위 또는 바람직한 값 및 임의의 하한 범위 또는 바람직한 값의 임의의 쌍으로부터 형성된 모든 범위를 구체적으로 개시하는 것으로 이해되어야 한다. 수치 값의 범위가 본 명세서에서 언급될 경우, 달리 기술되지 않는다면, 그 범위는 그 종점 및 그 범위 내의 모든 정수와 분수를 포함하고자 하는 것이다. 범위를 정의할 때 열거된 특정 값으로 본 발명의 범주를 한정하고자 하는 것은 아니다.
일반 방법
본 발명의 바람직한 태양을 보여주기 위해 하기 실시예가 제공된다. 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능하는 기술을 따르며, 이에 따라, 그의 바람직한 실시 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음이 당업자에 의해 인식되어야 한다. 그러나, 본 개시내용의 견지에서, 당업자는 개시된 특정 실시형태에서 많은 변경이 이루어질 수 있으며, 여전히 본 명세서에 개시된 방법 및 실시예의 목적 및 범주로부터 벗어남 없이, 비슷하거나 유사한 결과가 수득되는 것을 인식해야 한다.
모든 시약 및 재료는 달리 특정하지 않는 한, 디프코 래보러터리즈(DIFCO Laboratories)(미국 미시간주 디트로이트 소재), GIBCO/BRL(미국 메릴랜드주 개더스버그 소재), 티씨아이 아메리카(TCI America)(미국 오리건주 포틀랜드 소재), 로슈 디아그노스틱스 코포레이션(Roche; Diagnostics Corporation)(미국 인디애나주 인디애나폴리스), 써모 사이언티픽(미국 일리노이주 록포드 소재의 피어스 프로틴 리서츠 프로덕츠(Pierce Protein Research Products)) 또는 시그마-알드리치 케미컬 컴퍼니(Sigma-Aldrich Chemical Company)(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 수득하였다.
설명에서 하기의 약어는 후술되는 바와 같은 측정 유닛, 기술, 특성 또는 화합물에 해당한다: "sec" 또는 "s"는 초를 의미하고, "min"은 분을 의미하며, "h" 또는 "hr"은 시간을 의미하고, "㎕"은 마이크로리터를 의미하며, "㎖"은 밀리리터를 의미하고, "ℓ"은 리터를 의미하며, "mM"은 밀리몰을 의미하고, "M"은 몰을 의미하며, "mmol"은 밀리몰을 의미하고, "ppm"은 백만분율을 의미하며, "wt"는 중량을 의미하고, "wt%"는 중량 백분율을 의미하며, "g"는 그램을 의미하고, "㎎"는 밀리그램을 의미하며, "㎍"는 마이크로그램을 의미하고, "ng"는 나노그램을 의미하며, "g"는 중력을 의미하고, "HPLC"는 고성능 액체 크로마토그래피를 의미하며, "dd H2O"는 증류수 및 탈이온수를 의미하고, "dcw"는 건조 세포 중량을 의미하며, "ATCC" 또는 "ATCC(등록 상표)"는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(미국 버지니아주 머내서스 소재)을 의미하고, "U"는 과가수분해효소 활성의 단위를 의미하며, "rpm"은 분당 회전수 의미하고, "PAH"는 과가수분해효소를 의미하고, "EDTA"는 에틸렌다이아민테트라아세트산을 의미한다.
HPLC 과가수분해효소 검정법
반응 혼합물 중의 과아세트산(PAA) 농도의 결정을 문헌[Pinkernell et al.]에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 반응 혼합물의 분취액(0.040 ㎖)을 사전결정된 시간에 제거하고, 수 중의 5 mM 인산 0.960 ㎖과 혼합하고; 희석된 시료의 pH의 pH 4 미만으로의 조정에 의해, 반응을 즉시 종결시켰다. 생성된 용액을 12,000 rpm에서 2분 동안의 원심분리에 의하여, 울트라프리(ULTRAFREE)(등록 상표) MC-필터 유닛(30,000 보통 분자량 한계(NMWL), 밀리포어(Millipore) 카탈로그 번호 UFC3LKT 00)을 사용하여 여과하였다. 생성된 여액의 분취액(0.100 ㎖)을 0.300 ㎖의 탈이온수를 함유하는 1.5-㎖ 스크류 캡(screw cap) HPLC 바이얼(vial)(미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 아질런트 테크놀로지즈(Agilent Technologies); #5182-0715)로 옮긴 다음, 아세토니트릴 중의 20 mM MTS (메틸-p-톨릴-설피드) 0.100 ㎖을 첨가하고, 바이얼을 캡핑하고, 내용물을 광의 부재 하에 약 25℃에서 10분의 인큐베이션 전에 간단히 혼합하였다. 이어서, 각 바이얼에, 0.400 ㎖의 아세토니트릴 및 아세토니트릴 중의 트라이페닐포스핀(TPP, 40 mM) 용액 0.100 ㎖을 첨가하고, 바이얼을 다시 캡핑하고, 생성된 용액을 혼합하고, 광의 부재 하에 약 25℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 각 바이얼에 0.100 ㎖의 10 mM N,N-다이에틸-m-톨루아미드(DEET; HPLC 외부 표준물질)를 첨가하고, 생성된 용액을 HPLC(워터스 얼라이언스(Waters Alliance) e2695, 미국 매사추세츠주 소재의 워터스 코포레이션(Waters Corporation)으로 분석하였다.
HPLC 방법:
프레컬럼 수펠코 수펠가드 디스커버리(precolumn Supelco Supelguard Discovery) C8(시그마-알드리치; 카탈로그 번호 59590-U)이 있는 수펠코 디스커버리(Supelco Discovery) C8 컬럼(10 ㎝ × 4.0-㎜, 5 ㎛)(카탈로그 번호 569422-U); 10 마이크로리터 주입 부피; 1.0 ㎖/분 및 주위 온도에서 CH3CN(시그마-알드리치; #270717) 및 탈이온수를 사용한 구배 방법:
Figure pct00012
발현 벡터 pLD001
플라스미드 pLD001(서열 번호 141)은 이전에 에스케리키아 콜라이에 적절한 발현 벡터로 보고되었다(본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2010-0158823 A1호(Wang et al.) 참고).
벡터 pLD001은 상업적으로 입수할 수 있는 벡터 pDEST17(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐(Invitrogen)) 유래의 것이었다. 이는 상업적으로 입수할 수 있는 벡터 pDEST17(미국 캘리포니아주 캘스배드 소재의 인비트로겐)로부터 유래되며, 효소 케토스테로이드 아이소머라제(KSI)의 단편을 암호화하는 서열을 포함한다.
표준 재조합 DNA 방법을 사용하여, NdeI 및 BamHI 부위에 의해 결합되는 다양한 가수분해효소/과가수분해효소에 대한 암호화 서열을 KSI 단편을 대체하여, pLD001의 NdeI 및 BamHI 부위 사이에 라이게이션시킬 수 있다. 유사하게, BamHI 및 AscI 부위에 의해 결합되는 결합 도메인의 암호화 서열을 pLD001의 BamHI 및 AscI 부위 사이에 라이게이션시킬 수 있다.
실시예 1
면-표적화된 과가수분해효소 융합의 구축
이러한 실시예에는 셀룰로스-결합 서열을 통하여 셀룰로스에 표적화된, 구체적으로 면에 표적화된 과가수분해효소의 생성을 위한 발현 시스템의 고안이 기재되어 있다.
셀룰로스-결합 도메인(각각 서열 번호 148, 151 및 154)으로의 과가수분해효소의 융합을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 147, 150 및 153)가 18개 아미노산 가요성 링커(서열 번호 143)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(그 자체는 N-말단에 Met가 있고, C-말단에 His6이 있는 클로스트리듐 써모셀룸(서열 번호 149), 클로스트리듐 셀룰로보란스(서열 번호 152) 및 바실러스 종(서열 번호 155)으로부터의 셀룰라제의 셀룰로스-결합 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 융합된다)에 3'-말단에서 융합되는 써모토가 마리티마 과가수분해효소의 C277S 변이체(서열 번호 142)의 뉴클레오티드 서열을 갖도록 고안하였다. 유전자를 에스케리키아 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화시키고, DNA2.0(미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재)에 의해 합성하였다. 암호화 서열을 발현 벡터 pLD001(서열 번호 141) 내에 T7 프로모터 뒤에, NdeI과 AscI 제한 부위 사이에 클로닝하여, 각각 플라스미드 pLR988, pLR1049 및 pLR1050을 제공하였다. 융합 단백질을 발현하기 위하여, 플라스미드는 에스케리키아 콜라이 균주 BL21AI(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐)으로 옮겨, 각각 균주 LR3310, LR3504 및 LR3505를 생성하였다.
써모토가 마리티카 과가수분해효소(서열 번호 142)의 비-표적화 C277S 변이체를 유사하게 클로닝하였다. 비표적화된 과가수분해효소의 생성은 이전에 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호(DiCosimo et al.)에서 기재되었다.
초기에 모발에 대한 결합을 위해 고안된 다른 과가수분해효소 융합("PAH-HC263"; 서열 번호 145)에 대한 암호화 유전자(서열 번호 144)를 하기의 실험에서 음성 대조군으로 사용하였다(공동-출원되고, 공동-계류 중인 미국 가특허 출원(명칭: "ENZYMATIC PERACID GENERATION FOR USE IN HAIR CARE PRODUCTS"), 대리인 문서 번호 CL5175 US PROV 참조)).
실시예 2
호열성 셀룰로스-결합 도메인에 융합된 과가수분해효소를 포함하는 융합 단백질의 생성
이러한 실시예에는 내열성 셀룰로스-결합 도메인을 통하여 셀룰로스에 표적화된 과가수분해효소의 발현 및 정제가 기재되어 있다.
균주 LR3310을 50 ㎎/ℓ의 스펙티노마이신을 함유하는 1 리터의 자가유도(autoinduction) 배지(10 g/ℓ 트립톤, 5 g/ℓ 효모 추출물, 5 g/ℓ NaCl, 50 mM Na2HPO4, 50 mM KH2PO4, 25 mM (NH4)2SO4, 3 mM MgSO4, 0.75% 글리세롤, 0.075% 글루코스 및 0.05% 아라비노스)에서, 200 rpm 진탕 하에 37℃에서 20시간 동안 성장시켰다. 비-표적화된 써모토가 마리티마 C277S 변이체의 제조 및 재조합 발현이 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호(DiCosimo et al)에서 이전에 보고된 적이 있다.
세포를 8000 rpm 및 4℃에서의 원심분리에 의해 수집하고, 조직 호모지나이저(브린크만 호모지나이저 모델 PCU11)를 사용하여 3500 rpm에서 세포 펠렛을 얼음으로 냉각된 용해 완충제(50 mM Tris pH 7.5, 5 mM EDTA, 100 mM NaCl) 300 ㎖에 재현탁화시킨 다음 원심분리(8000 rpm, 4℃)에 의해 세정하였다. 이어서, 세포를 조직 호모지나이저를 사용하여 75 ㎎의 달걀 흰자 라이소자임(시그마)을 함유하는 냉각된 용해 완충제에서의 재현탁화에 의해 용해시켰다. 세포 현탁액을 조직 호모지나이저를 사용한 주기적인 균질화와 함께, 얼음 위에 3시간 동안 정치되게 하여, 라이소자임에 의한 세포벽의 분해를 가능하게 하였다. 이 단계에서, 추출물의 어떠한 거품 형성도 피하도록 주의하였다. 추출물을 나누고(500-㎖ 병당 150 ㎖), -20℃에서 동결시켰다. 동결된 세포 추출물을 실온(약 22℃)에서 해동시키고, 조직 호모지나이저를 사용하여 균질화시키고, 20% 최대 출력, 1분 동안 2 펄스/초, 1회 반복에서, 5 ㎜ 프로브가 장착된 초음파분해기(브란슨 울트라소닉스 코포레이션(Branson Ultrasonics Corporation); 소니파이어(Sonifier) 모델 450)를 사용하는 초음파분해에 의해 파괴하였다. 용해된 세포 추출물을 4 × 50-㎖ 코니컬(conical) 폴리프로필렌 원심분리용 튜브로 옮긴 다음, 10,000 rpm에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 세포 데브리스(debris)뿐 아니라 파괴되지 않은 세포를 포함하는 펠렛을 동결시켰다. 용해물의 분취액을 15-㎖ 코니컬 폴리프로필렌 튜브(12 × 5-㎖)로 옮기고 15분 동안 60℃로 가열하고, 얼음 위에서 냉각시키고, 4 × 50-㎖ 코니컬 폴리프로필렌 원심분리용 튜브로 모았다. 내열성 효소를 함유하는 가용성 분획 및 침전된 에스케리키아 콜라이 단백질을 10,000 rpm에서 10분 동안 4℃에서의 원심분리에 의해 분리하였다. 세포 파괴가 초음파분해 단계 후에 불완전하였다면, 동결된 펠렛을 다시 해동시키고, 2차의 초음파분해, 원심분리 및 열 처리를 가하였다. 이러한 정제 프로토콜의 산출량은 통상 ㎖당 2 내지 4 ㎎의 단백질을 제공하며, 융합 과가수분해효소의 순도는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 분석에 의해 추정시 90% 내지 75%의 단백질이었다. 표준물질(시그마-알드리치)로서 소 혈청 알부민의 용액을 사용하여 총 단백질을 BCA 검정법(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치)에 의해 정량화하였다.
실시예 3
셀룰로스-결합 도메인에 융합된 과가수분해효소를 포함하는 다른 융합 단백질의 생성
이러한 실시예에는 열안정하지 않은 셀룰로스-결합 도메인을 통하여 셀룰로스에 표적화된 과가수분해효소의 발현 및 정제가 기재되어 있다.
균주 LR3504 및 LR3505를 균주 LR3310을 위해 실시예 2에 기재된 바와 같이 1 ℓ의 자가유도 배지에서 성장시켰다. 세포를 수집하고, 전체 세포 추출물을 균주 LR3310의 세포에 대해 기재된 바와 같이 라이소자임/동결-해동 사이클에 의해 제조하였다.
과가수분해효소 융합을 함유하는 용해성 세포 추출물을 금속 킬레이트화 친화성 크로마토그래피로 처리하였다. 5 ㎖의 용해물을 20 ㎖의 평형화/세정 완충제(10 mM Tris HCl pH 7.5, 10% 글리세롤, 150 mM NaCl, 1mM 이미다졸)로 평형화시킨 5-㎖ Co-NTA 크로마토그래피 컬럼(Co-NTA 카탈로그 번호 89965, 미국 일리노이스주 록포드 소재의 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)) 상에 로딩하였다. 이어서, 컬럼을 15 ㎖의 평형화/세정 완충제로 세정하고, 결합 융합 단백질을 15 ㎖의 용리 완충제(10 mM Tris HCl pH 7.5, 10% 글리세롤, 150 mM NaCl, 150mM 이미다졸)로 용리시켰다. 과가수분해효소 융합을 추가의 정제 없이 시험하였다.
실시예 4
효소 가수분해효소 활성의 정량화
이러한 실시예에는 비특이적 에스테라제 기질을 사용하는 과가수분해효소의 가수분해효소 활성을 통한 과가수분해효소의 검출 및 정량화 방법이 기재되어 있다.
과가수분해효소 융합의 가수분해효소 활성을 pNPA(p-니트로페닐 아세틸 에스테르)로 결정하였다. 전형적으로, 효소를 가수분해효소 검정 완충제(50 mM KH2PO4, pH 7.2) 중에 1 내지 0.01 ㎍/㎖의 농도로 희석하였다. 25℃ 또는 30℃에서 3 mM(아세토니트릴 중에 용해된 100 mM pNPA 30 ㎕/㎖)의 최종 농도로의 pNPA의 첨가에 의해 반응을 개시하였다. 시간에 따른 400 ㎚에서의 흡광도의 변화를 기록하였다. pNPA의 비-효소적 가수분해의 백그라운드 수준 때문에, 비-효소 대조군을 분석에 포함시켰다. 활성을 Δ400/분(시료) - Δ400/분(비-효소 대조군)으로 측정하고, 가수분해되는 pNPA(μmol)/단백질(㎎) × 분(pNPA 몰 흡수: 10909 M-1)로 전환시켰다. 융합 단백질의 비활성은 통상 10 내지 30 μmol/㎎ × 분이었다.
실시예 5
셀룰로스-표적화 과가수분해효소 융합의 면 패브릭으로의 결합
이러한 실시예에는 셀룰로스-결합 서열의 과가수분해효소로의 융합에 의존적인 방식의, 과가수분해효소의 셀룰로스로의 결합이 기재되어 있다.
면 결합 실험을 위하여, 블루베리 쥬스로 염색된 면 패브을 받은 대로 사용하였다(미국 펜실베이니아주 웨스트 피트슨 소재의 테스트 패브릭스 인코포레이티드(Test Fabrics Inc., West Pittson, PA)). 견본(1 ㎠, 약 27 ㎎)을 1.8-㎖ 원심분리용 튜브에 첨가하였다. 가수분해 검정 완충제(1 ㎖)를 견본에 첨가한 다음, 과가수분해효소를 이 용액에 첨가하였다. 효소를 아담스 뉴테이터(Adams Nutator)(모델 1105, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 벡턴 디킨슨(Becton Dickinson))에서 온건하게 진탕시키면서(24 rpm); 30분 동안 면 견본에 결합되게 하였다. 견본과 함께 또는 모발 없이, 효소 부재 대조군을 pNPA 가수분해효소 시약의 비-효소적 가수분해를 설명하기 위하여 결합 실험에 포함시켰다. 결합 단계 후에, 결합 완충제 0.8 ㎖ 분취액을 9.2 ㎖ 완충제를 포함하는 새로운 튜브로 옮겨, 미결합 효소의 양을 정량화하였다. 추가의 결합 완충제를 제거하고, 견본을 가수분해효소 완충제 중의 1% 트윈(등록 상표)-20, 1 ㎖로 4회 세정하고, 각각 가수분해효소 완충제 중에서의 1 ㎖의 2회의 세정으로 이어졌다. 이어서 견본을 10 ㎖의 가수분해효소 검정법에서 재현탁화시키고, 견본에 계속 결합되는 가수분해효소 활성을 측정하였다. 써모토가 마리티마 과가수분해효소의 C277S 변이체(본 명세서에서 "PAH"로도 지칭; 서열 번호 142)를 대조군(비-표적화 과가수분해효소)으로 사용하였다. 결과는 표 1에 제공되어 있다.
Figure pct00013
이러한 실험에 의해, CIP 셀룰로스-결합 도메인에 의해 셀룰로스에 표적화된 과가수분해효소 융합이 1% 트윈(등록 상표)-20에서의 광범위한 세정 후에 면 패브릭 상에 유지되는 한편, 비표적화 과가수분해효소 또는 다른 표면에 표적화된 과가수분해효소를 포함하는 융합 단백질은 그렇지 않았음이 입증되었다.
실시예 6
셀룰로스-표적화된 과가수분해 융합의 셀룰로스 물질로의 결합
이러한 실시예에는 셀룰로스-표적화 과가수분해효소 융합의 몇몇 면 혼방 패브릭으로의 결합이 기재된다.
표적화된 과가수분해효소 융합 단백질 C277S-CIP(서열 번호 148), C277S-CBM17(서열 번호 151) 및 C277S-CBM28(서열 번호 154)의 결합을 표 2에 나타낸 면 혼방 패브릭 상에서 시험하였다. 견본(1 ㎠)을 상술된 바와 같은 융합 단백질 용액 1㎖에 노출시켰다. 견본을 상술된 바와 같이 세정하고, 효소를 pNPA 검정법을 사용하여 그의 가수분해효소 활성에 의해 검출하였다.
Figure pct00014
이러한 실시예에 의해, 셀룰로스계 또는 셀룰로스 함유 패브릭으로의 과가수분해효소의 표적화의 적용가능성 및 유용성이 입증된다.
실시예 7
염색된 면 패브릭 상의 C277S-CIP 셀룰로스-표적화 과가수분해효소의 탈색 활성
이러한 실시예에는 효소가 패브릭으로부터 세정되는 응용에서 염색된 면 패브릭의 탈색에서, 과가수분해효소에 융합된 셀룰로스 표적화 도메인의 이익이 기재되어 있다.
블루베리-염색된 견본(1 ㎠)을 3 ㎖의 PAH 완충제를 함유하는 50-㎖ 폴리프로필렌 튜브(튜브당 3개의 견본)에 배치하였다. 3개의 튜브에는 각각 14 ㎕의 C277S-CIP(4.7 ㎍/㎖), 27 ㎕의 비표적화("비태그화") 써모토가 마리티마 C277S(9 ㎍/㎖)를 제공하고, 효소를 제공하지 않았다.
효소가 온건한 진탕 하에서 30분 동안 결합되게 하였다. 이어서, 견본을 1% 트윈(등록 상표)-20을 함유하는 5 ㎖의 C277S 완충제로 4회 세정하고, C277S 완충제로 2회 이상 세정하였다. 견본을 실온(약 22℃)에서 30분 동안 건조시키고, 그들의 색상을 색도계(SP64 포터블 스피어 스펙트로포토미터(Portable Sphere Spectrophotometer), 모델 SP64, 미국 미시건주 그랜드빌 소재의 엑스-라이트 인코포레이티드(X-Rite Inc.))로 측정하였다(설정: 파장 범위 400 ㎚ 내지 700 ㎚, 매 10 ㎚, 구경 8 ㎜). 2가지 색상 측정은 각 견본의 전방 및 후방 상에서 이루어졌으며, 4개의 값을 평균화하였다.
이어서, 각 견본을 11 mM 과산화수소 + 100 mM 트라이아세틴을 함유하는 1 ㎖의 50 mM Tris pH 7.5 완충제가 있는 1.8-㎖ 원심분리용 튜브에 배치하고, 온건하게 스월링(swirling)시키면서 실온에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 용액을 제거하고, 견본을 50 mM Tris pH 7.5로 세정하고, 대기 건조시키고, 그들의 색상을 색도계를 사용하여 측정하였다.
Figure pct00015
이러한 실시예는 검정법의 조건 하에서, 표적화된 효소의 존재가 과산화수소 및 트라이아세틴 용액에 의해 제공되는 것보다 탈색을 유의미하게 증진시키는 것을 보여준다. 탈색의 증진은 비표적화된 과가수분해효소에 의해 생성되지 않았으며, 이는 과가수분해효소가 세정 단계 후에 면 패브릭에 결합되지 않음을 나타내며, 이에 따라 과가수분해효소의 표적화의 이점이 면 패브릭 상에 보유되는 것이 입증된다.
Figure pct00016
이러한 실시예는 과가수분해효소의 셀룰로스로의 표적화 때문에, 다른 셀룰로스-결합 도메인이 과가수분해효소에 융합되는 경우 향상된 탈색이 이행될 수 있음을 보여준다.
실시예 8
과가수분해효소 표적화에 의한 탈색 향상
이러한 실시예에는 효소가 패브릭으로부터 세정되지 않는 응용에서 염색된 면 패브릭의 탈색에서, 과가수분해효소에 융합된 셀룰로스 표적화 도메인의 이익이 기재되어 있다.
이러한 실험에서, 면 패브릭에 결합된 표적화된 과가수분해효소에 의한 과아세트산의 생성에 기인한 탈색을 동일한 총량의 효소의 첨가에서, 비결합 비표적화된 과가수분해효소에 기인한 탈색과 비교하였다. 첨가되는 효소의 총량을 효소의 가수분해효소 활성을 측정함으로써 평가하였다.
블루베리-염색된 면의 견본(1 ㎠)을 1 ㎖의 PAH 완충제를 함유하는 2-㎖ 원심분리용 튜브에 배치하였다. 일련의 튜브에 증가하는 양의 CIP 표적화된 과가수분해효소(C277S-CIP)를 제공하였다: 0, 20, 40 및 80 ㎕의 효소(추정된 90% 순도에서 4 ㎍/㎕의 1:20 희석). 이후에 비표적화된 효소를 제공할 일련의 튜브는 PAH 완충제만을 제공하는 것을 제외하고 동일한 방식으로 제조하였다. 2벌의 튜브를 표적화된 효소 및 이후에 첨가될 비표적화된 효소 둘 모두에 대하여, 하나는 견본 상에 유지되는 효소의 양을 측정하기 위해, 그리고 하나는 탈색을 측정하기 위해, 시험할 각 효소 농도에 대하여 설정하였다. 모든 튜브를 실온(약 22℃)에서 30분 동안 온건하게 진탕시켰다.
모든 C277S-CIP 함유 튜브에 대하여, 0.8 ㎖의 효소 용액을 9.2 ㎖의 PAH-완충제를 함유하는 15-㎖ 폴리프로필렌 튜브로 옮겨, 미결합 효소 분획을 나타내는 가수분해효소 활성을 측정하였다. 견본을 수동으로 진탕시키면서 PAH-완충제 중의 1 ㎖의 1% 트윈(등록 상표)으로 3회 세정하고, 이어서, 1 ㎖의 완충제 PAH-완충제로 2회 세정하였다. 각 C277S-CIP 농도에 대한 하나의 견본을 10 ㎖의 PAH 완충제를 함유하는 15-㎖ 폴리프로필렌 튜브로 옮겨, 결합 가수분해효소 활성을 측정하였다. 각 C277S-CIP(서열 번호 148) 농도에 대한 제2 견본 및 이후에 비표적화 써모토가 마리티마 C277S 효소(서열 번호 142)를 제공하는 모든 다른 견본을 새로운 2-㎖ 원심분리용 튜브로 옮겼다.
C277S-CIP 효소를 제공하지 않은 견본의 절반을 10 ㎖의 PAH-완충제 및 증가하는 양의 비표적화된 효소(추정된 25% 순도에서 0, 10, 20, 30, 40, 50 및 60 ㎕의 13.6 ㎍/㎖ 효소 용액)를 함유하는 15-㎖ 폴리프로필렌 튜브로 옮겨, 결합된 가수분해효소 활성을 측정하였다.
결합된 C277S-CIP 및 미결합 비표적화된 C277S를 갖는 견본의 가수분해효소 활성을 아세토니트릴 중의 100 mM pNPA 300 ㎕를 첨가하고, 시간에 따른 400 ㎚에서의 흡광도의 변화를 모니터링함으로써 측정하였다.
C277S-CIP를 제공하지 않은 제2 세트의 견본에, 증가하는 양의 비표적화된 과가수분해효소를 첨가하였다(추정된 25% 순도에서 0, 10, 20, 30, 40, 50 및 60 ㎕의 13.6 ㎍/㎖ 효소 용액). 이들 견본 및 이전에 표적화된 C277S-CIP에 의해 접촉된 적이 있는 견본에 50 mM Tris pH 7.5 중의 1 ㎖의 11 mM 과산화수소 + 100 mM 트라이아세틴을 제공하여, 과아세트산 생성에 의한 탈색을 평가하였다. 초기의 혼합 후에, 튜브를 실온에 10분 동안 놔두었다. 탈색 반응을 용액의 제거 및 2 × 1-㎖의 50 mM Tris pH 7.5로의 헹굼에 의해 10분 후에 중단시켰다. 견본을 대기 건조시키고, 그들의 색상을 색도계로 측정하였다. 이 실험을 반복하였다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 첨가되는 동량의 효소 활성에 대하여, 그리고 동일한 반응 기간에 대하여, 셀룰로스 표적화된 과가수분해효소는 비표적화된 과가수분해효소에 비해 염색된 견본을 탈색시키는데 있어서 더욱 효율적이었다.
이러한 실시예에서는 효소의 효능의 증가를 위한 셀룰로스 기질로의 과가수분해효소의 표적화의 유용성이 입증되었다.
Figure pct00017
실시예 9
추가의 호열성 셀룰로스 결합 도메인으로의 과가수분해효소 융합의 구축
이러한 실시예에는 셀룰로스-결합 서열을 통하여 셀룰로스에 표적화된, 그리고 구체적으로 면에 표적화된 추가의 과가수분해효소의 생성을 위한 발현 시스템의 고안이 기재되어 있으며, 여기서, 셀룰로스 결합 도메인은 호열성이다.
셀룰로스-결합 도메인(각각 서열 번호 157 및 160)으로의 과가수분해효소의 융합을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열 번호 156 및 159)가 18개 아미노산 가요성 링커(서열 번호 143)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(그 자체는 N-말단에 Met가 있는 써모토가 마리티마로부터의 엔도-1,4-베타-자일라나제 A의 셀룰로스-결합 도메인 CBM9-2(서열 번호 159) 및 칼디셀룰로시룹터 사카로라이티쿠스로부터의 셀룰라제 A의 CBD1(서열 번호 161)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 융합된다)에 3'-말단에서 융합되는 써모토가 마리티마 과가수분해효소의 C277S 변이체(서열 번호 142)의 뉴클레오티드 서열을 갖도록 고안하였다. 유전자를 에스케리키아 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화시키고, DNA2.0(미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재)에 의해 합성하였다. 암호화 서열을 발현 벡터 내에 NdeI 및 AscI 제한 부위를 사용하여 pBAD 프로모터 뒤에 클로닝하여, 각각 플라스미드 pLR1069 및 pLR1071을 제공하였다. 융합 단백질을 발현하기 위하여, 플라스미드를 에스케리키아 콜라이 균주 LR3728(MG1655 araBAD- ackA- pta- msbB- katE- katG-)로 옮겼다.
실시예 10
과가수분해효소 및 호열성 셀룰로스-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질의 생성
이러한 실시예에는 내열성 셀룰로스-결합 도메인을 통하여 셀룰로스에 표적화된 과가수분해효소의 발현 및 정제가 기재되어 있다.
써모토가 마리티마 과가수분해효소의 써모토가 마리티마로부터의 엔도-1,4-베타-자일라나제 A의 셀룰로스-결합 도메인 CBM9-2(서열 번호 159) 및 칼디셀룰로시룹터 사카로라이티쿠스로부터의 셀룰라제 A의 CBD1(서열 번호 161)으로의 융합을 암호화하는 유전자를 발현하는 균주를 실시예 2에 기재된 바와 같은 자가유도 배지에서 성장시켰다. 세포를 8000 rpm 및 4℃에서의 원심분리에 의해 수집하고, 세포 펠렛을 10,000 유닛의 벤조나제(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치)를 함유하는 300 ㎖의 얼음-냉각된 50 mM KH2PO4, pH 7.2 완충제에서 재현탁화시킴으로써 세정하였다.
세포를 프렌치 압력 셀(French pressure cell)을 통한 2회 통과에 의해 파괴하였다. 용해된 세포 추출물을 4 × 50-㎖ 코니컬 폴리프로필렌 원심분리용 튜브로 옮기고, 10,000 rpm에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 5 ㎖의 용해성 분획을 15-㎖ 코니컬 폴리프로필렌 튜브로 옮기고 15분 동안 80℃로 가열하고, 얼음 위에서 냉각시키고, 4 × 50-㎖ 코니컬 폴리프로필렌 원심분리용 튜브로 모았다. 내열성 효소를 함유하는 가용성 분획 및 침전된 에스케리키아 콜라이 단백질을 10,000 rpm에서 10분 동안 4℃에서의 원심분리에 의해 분리하였다. 이러한 정제 프로토콜의 산출량은 통상 ㎖당 2 내지 4 ㎎의 단백질을 제공하며, 융합 과가수분해효소의 순도는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 분석에 의해 추정시 90% 내지 75%의 단백질이었다. 표준물질(시그마-알드리치)로서 소 혈청 알부민의 용액을 사용하여 총 단백질을 BCA 검정법(미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치)에 의해 정량화하였다. 과가수분해효소 활성을 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린)-6-설포네이트)를 사용하여 측정하였다. 융합 과가수분해효소의 비활성은 각각 482 μmol PAA/분/㎎ 및 629 μmol PAA/분/㎎이었다.
호열성 셀룰로스 결합 도메인 둘 모두로의 써모토가 마리티마 과가수분해효소의 융합은 용해성으로 남아있으며, 이는 그들이 비-표적화된 과가수분해효소와 동일한 과정에 의해 생성될 수 있는 것을 나타낸다.
실시예 11
호열성 셀룰로스-결합 도메인에 융합된 과가수분해효소의 작용성의 입증
이러한 실시예에서는 내열성 셀룰로스-결합 도메인을 통하여 셀룰로스에 표적화된 과가수분해효소의 활성뿐 아니라 셀룰로스로의 그들의 결합이 입증된다.
호열성 결합 도메인을 함유하도록 엔지니어링된 과가수분해효소 융합을 셀룰로스 슬러리(아비셀(Avicel)(등록 상표) 미정질 셀룰로스, (미국 펜실베이니아주 필라델피아 소재의 에프엠씨 코포레이션(FMC Corp.)), 1 ㎖의 50 mM 인산칼륨 완충제 pH 7.2 중의 20 ㎎)(2.5 ㎎의 효소/g(셀룰로스))와 접촉시켰다. 30분의 온건한 진탕 후에, 셀룰로스를 원심분리에 의해 펠렛화시켰다. 상층액(미결합 분획)을 새로운 튜브로 옮기고, 셀룰로스는 1 ㎖의 인산염 완충제로 5회 세정하였다. 과가수분해효소 활성을 미결합 분획뿐 아니라 결합 분획(5번째 완충제 세정 후의 셀룰로스 슬러리)에서 측정하였다. 써모토가 CBM9-2 셀룰로스-결합 도메인에 융합된 과가수분해효소의 활성의 96% 및 칼디셀룰로시룹터 CBD-1 셀룰로스-결합 도메인에 융합된 과가수분해효소의 활성의 98%가 셀룰로스 상에 유지되었다. 결합 및 미결합 분획에 존재하는 단백질의 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해, 세정된 아비셀(등록 상표) 슬러리에서 융합 과가수분해효소에 해당하는 단백질 밴드가 나타났으며, 비결합 분획에서는 그렇지 않았고, 이에 의해, 과가수분해효소에 융합되는 경우, 셀룰로스에 대한 그들의 결합 및 이에 따른 셀룰로스 결합 도메인의 작용성을 확인하였다.
이러한 실시예에서는 다른 셀룰로스 결합 도메인이 과가수분해효소 결합 도메인에서 엔지니어링될 수 있으며, 과가수분해효소가 그의 활성을 보유하고 셀룰로스에 결합되게 하는 것이 입증된다.
실시예 12
셀룰로스 결합 도메인에 대한 과가수분해효소에 대한 추가의 융합의 구축
이러한 실시예에 의해, 셀룰로스에 표적화된 추가의 과가수분해효소의 생성을 위한 발현 시스템의 고안이 입증된다.
Figure pct00018
폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 164, 166 및 168)을 바실러스 푸밀러스, 락토코커스 락티스 및 메소리조비움 로티로부터의 자일란 에스테라제(서열 번호 10, 40 및 42)의 18개 아미노산 가요성 링커(서열 번호 143)(그 자체는 CIP 셀룰로스 결합 도메인 클로스트리듐 써모셀룸(서열 번호 149)에 융합된다)로의 융합을 암호화하도록 고안하였다. 이들 효소는 써모토가 마리티마 과가수분해효소가 그러한 것처럼, 가수분해효소의 CE-7 패밀리에 속한다.
폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 170, 172 및 174)을 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 아릴 에스테라제의 S54V 변이체(서열 번호 162)의 18개 아미노산 가요성 링커(서열 번호 143)(그 자체는 클로스트리듐 써모셀룸으로부터의 셀룰로스 결합 도메인 CIP(서열 번호 149), 칼디셀룰로시룹터 사카로라이티쿠스로부터의 CBD1(서열 번호 161) 및 써모토가 마리티마로부터의 CBM9-2(서열 번호 158)에 융합된다)로의 융합을 암호화하도록 고안하였다. 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 아릴 에스테라제는 써모토가 마리티마 과가수분해효소의 분류와는 상이한 분류의 가수분해 효소에 속한다.
폴리뉴클레오티드 서열(서열 번호 176 및 178)을 슈도모나스 플루오레슨스로부터의 가수분해효소의 L29P 변이체(서열 번호 163)의 18개 아미노산 가요성 링커(서열 번호 143)(그 자체는 클로스트리듐 써모셀룸으로부터의 셀룰로스 결합 도메인 CIP(서열 번호 149) 및 써모토가 마리티마로부터의 CBM9-2(서열 번호 158)에 융합된다)로의 융합을 암호화하도록 고안하였다. 슈도모나스 플루오레슨스로부터의 가수분해효소/에스테라제는 써모토가 마리티마 과가수분해효소의 분류 또는 마이코박테리움 스메그마티스의 분류와는 상이한 분류의 가수분해 효소에 속한다.
유전자를 에스케리키아 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화시키고, DNA2.0(미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재)에 의해 합성하였다. 암호화 서열을 플라스미드에서, 실시예 1 및 9에 기재된 것과 유사한 방식으로, T7 프로모터 또는 pBAD 프로모터 뒤에 클로닝하였다. 플라스미드를 적절한 발현 숙주에 전달하였다: T7 프로모터 하의 구축물을 위한 에스케리키아 콜라이 균주 BL21AI(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐) 또는 pBAD 프로모터 하의 구축물을 위한 에스케리키아 콜라이 MG1655의 araBAD 유도균주.
실시예 13
대안적인 에스테라제/과가수분해효소 및 셀룰로스-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질의 생성
이러한 실시예에는 셀룰로스에 표적화된 다양한 대안적인 에스테라제/과가수분해효소의 발현 및 정제가 기재되어 있다.
실시예 12의 표 6에서 가수분해효소/과가수분해효소에 대한 융합을 암호화하는 유전자를 발현하는 균주를 200 rpm 진탕 하에서 37℃에서 20시간 동안 50 ㎎/ℓ의 스펙티노마이신을 함유하는 1 ℓ의 자가유도 배지(10 g/ℓ 트립톤, 5 g/ℓ 효모 추출물, 5 g/ℓ NaCl, 50 mM Na2HPO4, 50 mM KH2PO4, 25 mM (NH4)2SO4, 3 mM MgSO4, 0.75% 글리세롤, 0.075% 글루코스 및 0.05% 아라비노스)에서 성장시켰다. 모든 단백질 융합은 에스케리키아 콜라이에서 잘 발현되었다. 세포를 8000 rpm 및 4℃에서의 원심분리에 의해 수집하고, 조직 호모지나이저(브린크만 호모지나이저 모델 PCU11)를 사용하여 3500 rpm에서 세포 펠렛을 얼음으로 냉각된 용해 완충제(50 mM Tris pH 7.5 100 mM NaCl) 300 ㎖에 재현탁화시킨 다음 원심분리(8000 rpm, 4℃)에 의해 세정하였다. 세포를 약 110.32 ㎫(16,000 psi)에서 프렌치 압력 셀을 통한 2회 통과에 의해 파괴하였다. 용해된 세포 추출물을 4 × 50- ㎖ 코니컬 폴리프로필렌 원심분리용 튜브로 옮기고, 10,000 rpm에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 효소를 함유하는 상층액을 새로운 튜브로 옮겼다. 각 추출물 중의 적절한 양의 융합 단백질을 쿠마시(Coomassie) 염색된 PAGE 겔 상의 소 혈청 알부민 표준물질의 밴드와의 비교에 의해 추정하였다.
이러한 실시예에서는 다양한 셀룰로스 결합 도메인에 대한 가수분해효소/과가수분해효소의 다양한 조합의 생성이 입증된다.
실시예 14
셀룰로스-결합 도메인에 융합된 대안적인 과가수분해효소의 과가수분해효소 활성
이러한 실시예에는 셀룰로스에 표적화된 대안적인 에스테라제/과가수분해효소의 활성이 기재되어 있다.
실시예 13에 기재된 바와 같이 생성되는 다양한 표적화 도메인을 갖는 셀룰로스에 표적화된 효소의 과가수분해효소 활성을 ABTS 검정법으로 측정하였다. 결과는 표 7에 보고되어 있으며, 표적화된 CE-7뿐 아니라 비-CE7 가수분해효소가 과가수분해 활성을 갖는 것을 보여준다.
Figure pct00019
이러한 실시예에서는 CE-7 패밀리로부터의 또는 다른 패밀리로부터의 다른 셀룰로스-표적화된 가수분해효소의 융합이 생성될 수 있으며, 과가수분해 활성을 가지며, 셀룰로스 물질을 수반하는 응용에서 직접적으로 또는 효소 발생 후에 사용될 수 있음이 입증된다.
실시예 15
셀룰로스 결합 도메인에 융합된 대안적인 과가수분해효소의 결합
이러한 실시예에는 셀룰로스에 표적화된 대안적인 에스테라제/과가수분해효소의 활성이 기재되어 있다.
다양한 셀룰로스 결합 도메인에 융합된 가수분해효소/과가수분해효소의 다양한 조합을 발현하는 에스케리키아 콜라이의 미정제 추출물을 셀룰로스 슬러리와 접촉시켰다. 추출물을 과잉으로 로딩하여, 셀룰로스를 포화시켰다(아비셀(등록 상표), 1 ㎖의 50 mM 인산칼륨 완충제 pH7.2 중의 20 ㎎; 과가수분해효소 융합 대략 300 ㎍의 효소/20 ㎎의 셀룰로스). 30분의 온건한 진탕 후에, 셀룰로스를 원심분리에 의해 펠렛화시켰다. 상층액(미결합 분획)을 제거하고, 셀룰로스 펠렛을 1 ㎖의 인산염 완충제로 3회 세정하였다. 제3 세정 후에, 셀룰로스를 1 ㎖의 인산염 완충제 중에 재현탁화시켰다. 20 ㎕의 재현탁화된 슬러리를 20 ㎕의 변성 SDS PAGE 시료 완충제와 혼합하고, 5분 동안 끓였다. 셀룰로스-표적화된 과가수분해효소의 결합을 결합 분획에 존재하는 단백질의 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 평가하였다(레인당 20 ㎕ 샘플 로딩). 모든 융합은 세정된 아비셀(등록 상표) 슬러리에서 융합 과가수분해효소 결합에 해당하는 적절한 크기를 갖는 단백질 밴드를 보였다. 모든 밴드는 모두 유사한 강도를 가졌으며, 이에 따라, 과가수분해효소에 융합되는 경우, 셀룰로스 결합 도메인의 작용성이 입증된다.
이러한 실시예에서는 상이한 가수분해효소 패밀리로부터의 상이한 과가수분해효소가 상이한 셀룰로스 결합 도메인을 통하여 셀룰로스에 표적화될 수 있으며, 셀룰로스 결합 도메인이 써모토가 과가수분해효소 이외의 과가수분해효소로의 융합의 맥락에서 작용성인 것이 입증된다.
SEQUENCE LISTING <110> E.I. du Pont de Nemours and Company, Inc. Rouviere, Pierre Solomon, Linda Fahnestock, Stephen Gruber, Tanja Cunningham, Scott Payne, Mark Wang, Hong DiCosimo, Robert <120> Targeted Perhydrolases <130> CL5048 PCT <150> US 61/424,916 <151> 2010-12-20 <160> 181 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 960 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(960) <400> 1 atg caa cta ttc gat ctg ccg ctc gac caa ttg caa aca tat aag cct 48 Met Gln Leu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Gln Leu Gln Thr Tyr Lys Pro 1 5 10 15 gaa aaa aca gca ccg aaa gat ttt tct gag ttt tgg aaa ttg tct ttg 96 Glu Lys Thr Ala Pro Lys Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Leu Ser Leu 20 25 30 gag gaa ctt gca aaa gtc caa gca gaa cct gat tta cag ccg gtt gac 144 Glu Glu Leu Ala Lys Val Gln Ala Glu Pro Asp Leu Gln Pro Val Asp 35 40 45 tat cct gct gac gga gta aaa gtg tac cgt ctc aca tat aaa agc ttc 192 Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Lys Ser Phe 50 55 60 gga aac gcc cgc att acc gga tgg tac gcg gtg cct gac aag caa ggc 240 Gly Asn Ala Arg Ile Thr Gly Trp 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Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala Ala Ala 180 185 190 ctg tca gac att cca aaa gcc gcg gtt gcc gat tat cct tat tta agc 624 Leu Ser Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser 195 200 205 aac ttc gaa cgg gcc att gat gtg gcg ctt gaa cag ccg tac ctt gaa 672 Asn Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu 210 215 220 atc aat tcc ttc ttc aga aga aat ggc agc ccg gaa aca gaa gtg cag 720 Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Gly Ser Pro Glu Thr Glu Val Gln 225 230 235 240 gcg atg aag aca ctt tca tat ttc gat att atg aat ctc gct gac cga 768 Ala Met Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala Asp Arg 245 250 255 gtg aag gtg cct gtc ctg atg tca atc ggc ctg att gac aag gtc acg 816 Val Lys Val Pro Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Ile Asp Lys Val Thr 260 265 270 ccg ccg tcc acc gtg ttt gcc gcc tac aat cat ttg gaa aca gag aaa 864 Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Glu Lys 275 280 285 gag ctg aag gtg tac cgc tac ttc gga cat gag tat atc cct gct ttt 912 Glu Leu Lys 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20 25 30 Lys Glu Ser Glu Gly Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Lys Val Asp 35 40 45 Phe His Leu Lys Thr Val Glu Thr Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Ala Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Met Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Gly Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Gly Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Val Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ile Ser Phe Pro Arg 165 170 175 Val Asp Ser Arg Lys Val Val Val Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Asn Arg Val Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Val Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp 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cttactacta cagacgagtc 480 ttcacggacg ctgtcagagc cgttgaagct gctgcttctt ttcctcaggt agatcaagaa 540 agaatcgtga tagctggagg cagtcagggt ggcggaatag cccttgcggt gagcgctctc 600 tcaaagaaag caaaggctct tctgtgcgat gtgccgtttc tgtgtcactt cagaagagca 660 gtacagcttg tggatacgca tccatacgcg gagatcacga actttctaaa gacccacaga 720 gacaaggaag aaatcgtgtt caggactctt tcctatttcg atggagtgaa cttcgcagcc 780 agagcgaaga tccctgcgct gttttctgtg ggtctcatgg acaacatttg tcctccttca 840 acggttttcg ctgcctacaa ttactacgct ggaccgaagg aaatcagaat ctatccgtac 900 aacaaccacg agggaggagg ctctttccaa gcggttgaac aggtgaaatt cttgaaaaaa 960 ctatttgaga aaggctaa 978 <210> 16 <211> 325 <212> PRT <213> Thermotoga maritima <400> 16 Met Ala Phe Phe Asp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Glu Glu Thr Leu 20 25 30 Ala Glu Ser Glu Lys Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Arg Met Glu 35 40 45 Ser His Leu Lys Thr Val Glu Ala Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Leu Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Gly Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Gln 165 170 175 Val Asp Gln Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asn Ile Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Tyr 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Val Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Lys 305 310 315 320 Leu Phe Glu Lys Gly 325 <210> 17 <211> 963 <212> DNA <213> Thermoanaerobacterium sp. <400> 17 atgggacttt tcgacatgcc attacaaaaa cttagagaat acactggtac aaatccatgc 60 cctgaagatt tcgatgagta ttggaatagg gctttagatg agatgaggtc agttgatcct 120 aaaattgaat tgaaagaaag tagctttcaa gtatcctttg cagaatgcta tgacttgtac 180 tttacaggtg ttcgtggtgc cagaattcat gcaaagtata taaaacctaa gacagaaggg 240 aaacatccag cgttgataag atttcatgga tattcgtcaa attcaggcga ctggaacgac 300 aaattaaatt acgtggcggc aggcttcacc gttgtggcta tggatgtaag aggtcaagga 360 gggcagtctc aagatgttgg cggtgtaact gggaatactt taaatgggca tattataaga 420 gggctagacg atgatgctga taatatgctt ttcaggcata ttttcttaga cactgcccaa 480 ttggctggaa tagttatgaa catgccagaa gttgatgaag atagagtggg agtcatggga 540 ccttctcaag gcggagggct gtcgttggcg tgtgctgcat tggagccaag ggtacgcaaa 600 gtagtatctg aatatccttt tttatctgac tacaagagag tttgggactt agaccttgca 660 aaaaacgcct atcaagagat tacggactat ttcaggcttt ttgacccaag gcatgaaagg 720 gagaatgagg tatttacaaa gcttggatat atagacgtta aaaaccttgc gaaaaggata 780 aaaggcgatg tcttaatgtg cgttgggctt atggaccaag tatgtccgcc atcaactgtt 840 tttgcagcct acaacaacat acagtcaaaa aaagatataa aagtgtatcc tgattatgga 900 catgaaccta tgagaggatt tggagattta gcgatgcagt ttatgttgga actatattca 960 taa 963 <210> 18 <211> 320 <212> PRT <213> Thermoanaerobacterium sp. <400> 18 Met Gly Leu Phe Asp Met Pro Leu Gln Lys Leu Arg Glu Tyr Thr Gly 1 5 10 15 Thr Asn Pro Cys Pro Glu Asp Phe Asp Glu Tyr Trp Asn Arg Ala Leu 20 25 30 Asp Glu Met Arg Ser Val Asp Pro Lys Ile Glu Leu Lys Glu Ser Ser 35 40 45 Phe Gln Val Ser Phe Ala Glu Cys Tyr Asp Leu Tyr Phe Thr Gly Val 50 55 60 Arg Gly Ala Arg Ile His Ala Lys Tyr Ile Lys Pro Lys Thr Glu Gly 65 70 75 80 Lys His Pro Ala Leu Ile Arg Phe His Gly Tyr Ser Ser Asn Ser Gly 85 90 95 Asp Trp Asn Asp Lys Leu Asn Tyr Val Ala Ala Gly Phe Thr Val Val 100 105 110 Ala Met Asp Val Arg Gly Gln Gly Gly Gln Ser Gln Asp Val Gly Gly 115 120 125 Val Thr Gly Asn Thr Leu Asn Gly His Ile Ile Arg Gly Leu Asp Asp 130 135 140 Asp Ala Asp Asn Met Leu Phe Arg His Ile Phe Leu Asp Thr Ala Gln 145 150 155 160 Leu Ala Gly Ile Val Met Asn Met Pro Glu Val Asp Glu Asp Arg Val 165 170 175 Gly Val Met Gly Pro Ser Gln Gly Gly Gly Leu Ser Leu Ala Cys Ala 180 185 190 Ala Leu Glu Pro Arg Val Arg Lys Val Val Ser Glu Tyr Pro Phe Leu 195 200 205 Ser Asp Tyr Lys Arg Val Trp Asp Leu Asp Leu Ala Lys Asn Ala Tyr 210 215 220 Gln Glu Ile Thr Asp Tyr Phe Arg Leu Phe Asp Pro Arg His Glu Arg 225 230 235 240 Glu Asn Glu Val Phe Thr Lys Leu Gly Tyr Ile Asp Val Lys Asn Leu 245 250 255 Ala Lys Arg Ile Lys Gly Asp Val Leu Met Cys Val Gly Leu Met Asp 260 265 270 Gln Val Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Asn Ile Gln 275 280 285 Ser Lys Lys Asp Ile Lys Val Tyr Pro Asp Tyr Gly His Glu Pro Met 290 295 300 Arg Gly Phe Gly Asp Leu Ala Met Gln Phe Met Leu Glu Leu Tyr Ser 305 310 315 320 <210> 19 <211> 978 <212> DNA <213> Bacillus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(978) <400> 19 atg aac ctt ttt gat atg ccc ctt gag gag ctg cag cat tac aag cct 48 Met Asn Leu Phe Asp Met Pro Leu Glu Glu Leu Gln His Tyr Lys Pro 1 5 10 15 gcc cag acc agg cag gat gat ttt gag tca ttc tgg aaa aag cgg att 96 Ala Gln Thr Arg Gln Asp Asp Phe Glu Ser Phe Trp Lys Lys Arg Ile 20 25 30 gag gag aac agt caa tat ccg ctg aat ata gaa gta atg gag cgg gtt 144 Glu Glu Asn Ser Gln Tyr Pro Leu Asn Ile Glu Val Met Glu Arg Val 35 40 45 tat ccg gtt ccg gga gtg aga gta tat gat att tat ttt gac ggg ttc 192 Tyr Pro Val Pro Gly Val Arg Val Tyr Asp Ile Tyr Phe Asp Gly Phe 50 55 60 cgg aat tcc cgc atc cat ggg gtg tat gtt act cca gaa act ccg gga 240 Arg Asn Ser Arg Ile His Gly Val Tyr Val Thr Pro Glu Thr Pro Gly 65 70 75 80 gcg gac act cct gcg gca gtg att ttt cac ggc tat aac tgg aac acg 288 Ala Asp Thr Pro Ala Ala Val Ile Phe His Gly Tyr Asn Trp Asn Thr 85 90 95 ctg cag ccg cat tac agc ttc aag cac gtg att cag ggg att cct gta 336 Leu Gln Pro His Tyr Ser Phe Lys His Val Ile Gln Gly Ile Pro Val 100 105 110 ctg atg gtg gag gtg cgg gga caa aat ctc ttg tct cca gat aga aat 384 Leu Met Val Glu Val Arg Gly Gln Asn Leu Leu Ser Pro Asp Arg Asn 115 120 125 cat tat ggg aat gga ggt ccg gga ggc tgg atg aca ctc ggc gtg atg 432 His Tyr Gly Asn Gly Gly Pro Gly Gly Trp Met Thr Leu Gly Val Met 130 135 140 gat ccc gat caa tat tat tac agc ctg gta tat atg gac tgc ttc cgc 480 Asp Pro Asp Gln Tyr Tyr Tyr Ser Leu Val Tyr Met Asp Cys Phe Arg 145 150 155 160 agc att gat gct gtc agg gaa ctg tcg agg aag aga agt gtg ttt gtg 528 Ser Ile Asp Ala Val Arg Glu Leu Ser Arg Lys Arg Ser Val Phe Val 165 170 175 gaa ggc gga agc cag gga ggt gca ctg gcg att gcc gca gcc gcc ctg 576 Glu Gly Gly Ser Gln Gly Gly Ala Leu Ala Ile Ala Ala Ala Ala Leu 180 185 190 cag gat gac atc ctg ctt gca ctc gcc gac atc cct ttt ctc acc cat 624 Gln Asp Asp Ile Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ile Pro Phe Leu Thr His 195 200 205 ttc aag cgt tcc gtg gag ctt tcc tcg gat gga ccg tat cag gag att 672 Phe Lys Arg Ser Val Glu Leu Ser Ser Asp Gly Pro Tyr Gln Glu Ile 210 215 220 tcc cac tac ttc aaa gtt cat gat cct ctt cat caa acg gaa gag cag 720 Ser His Tyr Phe Lys Val His Asp Pro Leu His Gln Thr Glu Glu Gln 225 230 235 240 gta tat cag acg ctc agc tat gtg gac tgc atg aac atg gcc agc atg 768 Val Tyr Gln Thr Leu Ser Tyr Val Asp Cys Met Asn Met Ala Ser Met 245 250 255 gtt gaa tgt cca gtc ctt ctt tca gcc ggt ctg gaa gac atc gtt tgt 816 Val Glu Cys Pro Val Leu Leu Ser Ala Gly Leu Glu Asp Ile Val Cys 260 265 270 ccc ccg tcc agt gca ttt gca ctg ttc aac cat ctc ggc ggg cca aaa 864 Pro Pro Ser Ser Ala Phe Ala Leu Phe Asn His Leu Gly Gly Pro Lys 275 280 285 gaa ata cgg gcc tat ccg gaa tac gcc cat gaa gta ccg gct gtc cat 912 Glu Ile Arg Ala Tyr Pro Glu Tyr Ala His Glu Val Pro Ala Val His 290 295 300 gaa gag gaa aag ctg aag ttt ata tct tca agg cta aaa aat aga gaa 960 Glu Glu Glu Lys Leu Lys Phe Ile Ser Ser Arg Leu Lys Asn Arg Glu 305 310 315 320 aag agg tgc cgg cca tga 978 Lys Arg Cys Arg Pro 325 <210> 20 <211> 325 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 20 Met Asn Leu Phe Asp Met Pro Leu Glu Glu Leu Gln His Tyr Lys Pro 1 5 10 15 Ala Gln Thr Arg Gln Asp Asp Phe Glu Ser Phe Trp Lys Lys Arg Ile 20 25 30 Glu Glu Asn Ser Gln Tyr Pro Leu Asn Ile Glu Val Met Glu Arg Val 35 40 45 Tyr Pro Val Pro Gly Val Arg Val Tyr Asp Ile Tyr Phe Asp Gly Phe 50 55 60 Arg Asn Ser Arg Ile His Gly Val Tyr Val Thr Pro Glu Thr Pro Gly 65 70 75 80 Ala Asp Thr Pro Ala Ala Val Ile Phe His Gly Tyr Asn Trp Asn Thr 85 90 95 Leu Gln Pro His Tyr Ser Phe Lys His Val Ile Gln Gly Ile Pro Val 100 105 110 Leu Met Val Glu Val Arg Gly Gln Asn Leu Leu Ser Pro Asp Arg Asn 115 120 125 His Tyr Gly Asn Gly Gly Pro Gly Gly Trp Met Thr Leu Gly Val Met 130 135 140 Asp Pro Asp Gln Tyr Tyr Tyr Ser Leu Val Tyr Met Asp Cys Phe Arg 145 150 155 160 Ser Ile Asp Ala Val Arg Glu Leu Ser Arg Lys Arg Ser Val Phe Val 165 170 175 Glu Gly Gly Ser Gln Gly Gly Ala Leu Ala Ile Ala Ala Ala Ala Leu 180 185 190 Gln Asp Asp Ile Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ile Pro Phe Leu Thr His 195 200 205 Phe Lys Arg Ser Val Glu Leu Ser Ser Asp Gly Pro Tyr Gln Glu Ile 210 215 220 Ser His Tyr Phe Lys Val His Asp Pro Leu His Gln Thr Glu Glu Gln 225 230 235 240 Val Tyr Gln Thr Leu Ser Tyr Val Asp Cys Met Asn Met Ala Ser Met 245 250 255 Val Glu Cys Pro Val Leu Leu Ser Ala Gly Leu Glu Asp Ile Val Cys 260 265 270 Pro Pro Ser Ser Ala Phe Ala Leu Phe Asn His Leu Gly Gly Pro Lys 275 280 285 Glu Ile Arg Ala Tyr Pro Glu Tyr Ala His Glu Val Pro Ala Val His 290 295 300 Glu Glu Glu Lys Leu Lys Phe Ile Ser Ser Arg Leu Lys Asn Arg Glu 305 310 315 320 Lys Arg Cys Arg Pro 325 <210> 21 <211> 960 <212> DNA <213> Bacillus halodurans <400> 21 ttagagatca gataaaaatt gaaaaatccg atcacgatgg cctggcaaat cttcgtgagc 60 aaagtctgga tataactcga tactttttgt cgtcgtgagt ttgttataca tggcaaattg 120 tgtagacggc gggcaaaccg tatccattaa cccaacagca agtaagactt ctccctttac 180 gagtggagca agatgctgaa tatcaatata gcctagcttc gtaaagattt cagcctcacg 240 tcggtgctgt ggatcaaagc gacgaaaata cgtttgcaat tcgtcataag ctttctcggc 300 taaatccatc tcccatacgc gttggtaatc gctaaggaaa ggataaacag gagctacctt 360 tttaattttc ggttccaaag ccgcacaagc aatcgctaag gcccctcctt gtgaccaacc 420 tgtcactgcc acgcgctctt catcgacttc aggaaggttc atcacaatgt tggcaagctg 480 agccgtatca agaaacacat gacggaacaa taattgatca gcattatcat cgagtccgcg 540 tattatatga ccggaatgag tattcccctt cacgcctcct gtgtcttcag acaagcctcc 600 ttgcccgcga acgtccattg caagaacaga atatccgagg gctgcgtaat gaagtaaacc 660 cgtccattcc cccgcattca tcgtatatcc gtgaaaatga ataaccgccg ggtgtgtccc 720 gctcgtgtgt cttgggcgca cgtattttgc gtgaattcta gcacccctaa cccctgtaaa 780 atataggtgg aagcattctg catacgtggt ttgaaaatca ctcggtatga gctctacgtt 840 tggatttacc tttctcatct cttgtaaagc acgatcccaa tactcagtaa agtcatctgg 900 ctttggatta cgtcccatgt actcttttaa ttcggttaac ggcatgtcta ttagtggcat 960 <210> 22 <211> 319 <212> PRT <213> Bacillus halodurans <400> 22 Met Pro Leu Ile Asp Met Pro Leu Thr Glu Leu Lys Glu Tyr Met Gly 1 5 10 15 Arg Asn Pro Lys Pro Asp Asp Phe Thr Glu Tyr Trp Asp Arg Ala Leu 20 25 30 Gln Glu Met Arg Lys Val Asn Pro Asn Val Glu Leu Ile Pro Ser Asp 35 40 45 Phe Gln Thr Thr Tyr Ala Glu Cys Phe His Leu Tyr Phe Thr Gly Val 50 55 60 Arg Gly Ala Arg Ile His Ala Lys Tyr Val Arg Pro Arg His Thr Ser 65 70 75 80 Gly Thr His Pro Ala Val Ile His Phe His Gly Tyr Thr Met Asn Ala 85 90 95 Gly Glu Trp Thr Gly Leu Leu His Tyr Ala Ala Leu Gly Tyr Ser Val 100 105 110 Leu Ala Met Asp Val Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ser Glu Asp Thr Gly 115 120 125 Gly Val Lys Gly Asn Thr His Ser Gly His Ile Ile Arg Gly Leu Asp 130 135 140 Asp Asn Ala Asp Gln Leu Leu Phe Arg His Val Phe Leu Asp Thr Ala 145 150 155 160 Gln Leu Ala Asn Ile Val Met Asn Leu Pro Glu Val Asp Glu Glu Arg 165 170 175 Val Ala Val Thr Gly Trp Ser Gln Gly Gly Ala Leu Ala Ile Ala Cys 180 185 190 Ala Ala Leu Glu Pro Lys Ile Lys Lys Val Ala Pro Val Tyr Pro Phe 195 200 205 Leu Ser Asp Tyr Gln Arg Val Trp Glu Met Asp Leu Ala Glu Lys Ala 210 215 220 Tyr Asp Glu Leu Gln Thr Tyr Phe Arg Arg Phe Asp Pro Gln His Arg 225 230 235 240 Arg Glu Ala Glu Ile Phe Thr Lys Leu Gly Tyr Ile Asp Ile Gln His 245 250 255 Leu Ala Pro Leu Val Lys Gly Glu Val Leu Leu Ala Val Gly Leu Met 260 265 270 Asp Thr Val Cys Pro Pro Ser Thr Gln Phe Ala Met Tyr Asn Lys Leu 275 280 285 Thr Thr Thr Lys Ser Ile Glu Leu Tyr Pro Asp Phe Ala His Glu Asp 290 295 300 Leu Pro Gly His Arg Asp Arg Ile Phe Gln Phe Leu Ser Asp Leu 305 310 315 <210> 23 <211> 954 <212> DNA <213> Bacillus clausii <400> 23 atgccattag tcgatatgcc gttgcgcgag ttgttagctt atgaaggaat aaaccctaaa 60 ccagcagatt ttgaccaata ctggaaccgg gccaaaacgg aaattgaagc gattgatccc 120 gaagtcactc tagtcgaatc ttctttccag tgttcgtttg caaactgtta ccatttctat 180 tatcgaagcg ctggaaatgc aaaaatccat gcgaaatacg tacagccaaa agcaggggag 240 aagacgccag cagtttttat gttccatggg tatggggggc gttcagccga atggagcagc 300 ttgttaaatt atgtagcggc gggtttttct gttttctata tggacgtgcg tggacaaggt 360 ggaacttcag aggatcctgg gggcgtaagg gggaatacat ataggggcca cattattcgc 420 ggcctcgatg ccgggccaga cgcacttttt taccgcagcg ttttcttgga caccgtccaa 480 ttggttcgtg ctgctaaaac attgcctcac atcgataaaa cacggcttat ggccacaggg 540 tggtcgcaag ggggcgcctt aacgcttgcc tgtgctgccc ttgttcctga aatcaagcgt 600 cttgctccag tatacccgtt tttaagcgat tacaagcgag tgtggcaaat ggatttagcg 660 gttcgttcgt ataaagaatt ggctgattat ttccgttcat acgatccgca acataaacgc 720 catggcgaaa tttttgaacg ccttggctac atcgatgtcc agcatcttgc tgaccggatt 780 caaggagatg tcctaatggg agttggttta atggatacag aatgcccgcc gtctacccaa 840 tttgctgctt ataataaaat aaaggctaaa aaatcgtatg agctctatcc tgattttggc 900 catgagcacc ttccaggaat gaacgatcat atttttcgct ttttcactag ttga 954 <210> 24 <211> 317 <212> PRT <213> Bacillus clausii <400> 24 Met Pro Leu Val Asp Met Pro Leu Arg Glu Leu Leu Ala Tyr Glu Gly 1 5 10 15 Ile Asn Pro Lys Pro Ala Asp Phe Asp Gln Tyr Trp Asn Arg Ala Lys 20 25 30 Thr Glu Ile Glu Ala Ile Asp Pro Glu Val Thr Leu Val Glu Ser Ser 35 40 45 Phe Gln Cys Ser Phe Ala Asn Cys Tyr His Phe Tyr Tyr Arg Ser Ala 50 55 60 Gly Asn Ala Lys Ile His Ala Lys Tyr Val Gln Pro Lys Ala Gly Glu 65 70 75 80 Lys Thr Pro Ala 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Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp 85 90 95 ggt gag att cat gaa atg gta aac tgg gca ctc cat ggc tac gcc gca 336 Gly Glu Ile His Glu Met Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Ala 100 105 110 ttc ggc atg ctt gtc cgc ggc cag cag agc agc gag gat acg agt att 384 Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Ser Ser Glu Asp Thr Ser Ile 115 120 125 tca ccg cac ggt cac gct ttg ggc tgg atg acg aaa gga att ctt gat 432 Ser Pro His Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Asp 130 135 140 aaa gat aca tac tat tac cgc ggt gtt tat ttg gac gcc gtc cgc gcg 480 Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala 145 150 155 160 ctt gag gtc atc agc agc ttc gac gag gtt gac gaa aca agg atc ggt 528 Leu Glu Val Ile Ser Ser Phe Asp Glu Val Asp Glu Thr Arg Ile Gly 165 170 175 gtg aca gga gga agc caa ggc gga ggt tta acc att gcc gca gca gcg 576 Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala Ala Ala 180 185 190 ctg tca gac att cca aaa gcc gcg gtt gcc gat tat cct tat tta agc 624 Leu Ser Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser 195 200 205 aac ttc gaa cgg gcc att gat gtg gcg ctt gaa cag ccg tac ctt gaa 672 Asn Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu 210 215 220 atc aat tcc ttc ttc aga aga aat ggc agc ccg gaa aca gaa gtg cag 720 Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Gly Ser Pro Glu Thr Glu Val Gln 225 230 235 240 gcg atg aag aca ctt tca tat ttc gat att atg aat ctc gct gac cga 768 Ala Met Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala Asp Arg 245 250 255 gtg aag gtg cct gtc ctg atg tca atc ggc ctg att gac aag gtc acg 816 Val Lys Val Pro Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Ile Asp Lys Val Thr 260 265 270 ccg cca tcc acc gtg ttt gcc gcc tac aat cat ttg gaa aca gag aaa 864 Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Glu Lys 275 280 285 gag ctg aag gtg tac cgc tac ttc gga cat gag tat atc cct gct ttt 912 Glu Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Tyr Ile Pro Ala Phe 290 295 300 caa acg gaa aaa ctt gct ttc ttt aag cag cat ctt aaa ggc tga taa 960 Gln Thr Glu Lys Leu Ala Phe Phe Lys Gln His Leu Lys Gly 305 310 315 <210> 26 <211> 318 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 26 Met Gln Leu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Gln Leu Gln Thr Tyr Lys Pro 1 5 10 15 Glu Lys Thr Ala Pro Lys Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Leu Ser Leu 20 25 30 Glu Glu Leu Ala Lys Val Gln Ala Glu Pro Asp Leu Gln Pro Val Asp 35 40 45 Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Lys Ser Phe 50 55 60 Gly Asn Ala Arg Ile Thr Gly Trp Tyr Ala Val Pro Asp Lys Gln Gly 65 70 75 80 Pro His Pro Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp 85 90 95 Gly Glu Ile His Glu Met Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Ala 100 105 110 Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Ser Ser Glu Asp Thr Ser Ile 115 120 125 Ser Pro His Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Asp 130 135 140 Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala 145 150 155 160 Leu Glu Val Ile Ser Ser Phe Asp Glu Val Asp Glu Thr Arg Ile Gly 165 170 175 Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala Ala Ala 180 185 190 Leu Ser Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser 195 200 205 Asn Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu 210 215 220 Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Gly Ser Pro Glu Thr Glu Val Gln 225 230 235 240 Ala Met Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala Asp Arg 245 250 255 Val Lys Val Pro Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Ile Asp Lys Val Thr 260 265 270 Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Glu Lys 275 280 285 Glu Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Tyr Ile Pro Ala Phe 290 295 300 Gln Thr Glu Lys Leu Ala Phe Phe Lys Gln His Leu Lys Gly 305 310 315 <210> 27 <211> 325 <212> PRT <213> Thermotoga neapolitana <220> <221> MISC_FEATURE <222> (277)..(277) <223> Xaa is Ala, Val, Ser, or Thr. <400> 27 Met Ala Phe Phe Asp Met Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Arg Glu Thr Leu 20 25 30 Lys Glu Ser Glu Gly Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Lys Val Asp 35 40 45 Phe His Leu Lys Thr Val Glu Thr Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Ala Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Met Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Gly Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Gly Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Val Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ile Ser Phe Pro Arg 165 170 175 Val Asp Ser Arg Lys Val Val Val Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Asn Arg Val Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Val Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Val Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Thr Ile Xaa Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Ile Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Arg 305 310 315 320 Leu Phe Glu Glu Gly 325 <210> 28 <211> 325 <212> PRT <213> Thermotoga maritima <220> <221> MISC_FEATURE <222> (277)..(277) <223> Xaa is Ala, Val, Ser, or Thr. <400> 28 Met Ala Phe Phe Asp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Glu Glu Thr Leu 20 25 30 Ala Glu Ser Glu Lys Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Arg Met Glu 35 40 45 Ser His Leu Lys Thr Val Glu Ala Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Leu Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Gly Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Gln 165 170 175 Val Asp Gln Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asn Ile Xaa Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Tyr 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Val Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Lys 305 310 315 320 Leu Phe Glu Lys Gly 325 <210> 29 <211> 326 <212> PRT <213> Thermotoga lettingae <220> <221> MISC_FEATURE <222> (277)..(277) <223> Xaa is Ala, Val, Ser, or Thr. <400> 29 Met Val Tyr Phe Asp Met Pro Leu Glu Asp Leu Arg Lys Tyr Leu Pro 1 5 10 15 Gln Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Asp Phe Trp Lys Gln Thr Ile 20 25 30 His Glu Thr Arg Gly Tyr Phe Gln Glu Pro Ile Leu Lys Lys Val Asp 35 40 45 Phe Tyr Leu Gln Asn Val Glu Thr Phe Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Lys Ile Lys Gly Trp Leu Ile Leu Pro Lys Phe Arg Asn 65 70 75 80 Gly Lys Leu Pro Cys Val Val Glu Phe Val Gly Tyr Gly Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro Tyr Asp Trp Leu Leu Trp Ser Ala Ala Gly Tyr Ala His 100 105 110 Phe Ile Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Asn Trp Met Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Glu Asp Asn Pro Ser Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Leu Thr Lys Gly Val Leu Asn Pro Glu Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Met Asp Ala Phe Met Ala Val Glu Thr Ile Ser Gln Leu Glu Gln 165 170 175 Ile Asp Ser Gln Thr Ile Ile Leu Ser Gly Ala Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Ser Lys Val Met Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Tyr Lys Arg Ala Val Gln Ile Thr 210 215 220 Asp Ser Met Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Arg Tyr Cys Lys Thr His Ile 225 230 235 240 Asp Lys Ile Gln Thr Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Cys Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asp Ile Xaa Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Tyr 275 280 285 Tyr Ala Gly Glu Lys Asp Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe His Thr Leu Glu Lys Leu Lys Phe Val Lys Lys 305 310 315 320 Thr Ile Ser Met Arg Glu 325 <210> 30 <211> 325 <212> PRT <213> Thermotoga petrophilia <220> <221> MISC_FEATURE <222> (277)..(277) <223> Xaa is Ala, Val, Ser, or Thr. <400> 30 Met Ala Phe Phe Asp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Glu Gly Thr Leu 20 25 30 Ala Glu Asn Glu Lys Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Arg Met Glu 35 40 45 Ser His Leu Lys Thr Val Glu Ala Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Met Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Met Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Asp Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Arg 165 170 175 Val Asp His Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Val Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asn Ile Xaa Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Ile Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Arg 305 310 315 320 Leu Phe Glu Lys Gly 325 <210> 31 <211> 325 <212> PRT <213> Thermotoga sp. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (277)..(277) <223> Xaa is Ala, Val, Ser, or Thr. <400> 31 Met Ala Phe Phe Asp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Lys Glu Thr Leu 20 25 30 Ala Glu Ser Glu Lys Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Arg Met Glu 35 40 45 Ser His Leu Lys Thr Val Glu Val Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Leu Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Asp Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Arg 165 170 175 Val Asp His Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Val Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asn Ile Xaa Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Ile Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Arg 305 310 315 320 Leu Phe Glu Lys Gly 325 <210> 32 <211> 329 <212> PRT <213> Thermotoga sp. <220> <221> MISC_FEATURE <222> (278)..(278) <223> Xaa is Ala, Val, Ser, or Thr. <400> 32 Met Ala Leu Phe Asp Met Pro Leu Glu Lys Leu Arg Ser Tyr Leu Pro 1 5 10 15 Asp Arg Tyr Glu Glu Glu Asp Phe Asp Leu Phe Trp Lys Glu Thr Leu 20 25 30 Glu Glu Ser Arg Lys Phe Pro Leu Asp Pro Ile Phe Glu Arg Val Asp 35 40 45 Tyr Leu Leu Glu Asn Val Glu Val Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Ala Trp Leu Ile Leu Pro Val Val Lys Lys 65 70 75 80 Glu Glu Arg Leu Pro Cys Ile Val Glu Phe Ile Gly Tyr Arg Gly Gly 85 90 95 Arg Gly Phe Pro Phe Asp Trp Leu Phe Trp Ser Ser Ala Gly Tyr Ala 100 105 110 His Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Thr Ser Arg Val Lys Gly 115 120 125 Asp Thr Pro Asp Tyr Cys Asp Glu Pro Ile Asn Pro Gln Phe Pro Gly 130 135 140 Phe Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg 145 150 155 160 Val Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Thr Ala Ser Ser Phe Pro 165 170 175 Gly Ile Asp Pro Glu Arg Ile Ala Val Val Gly Thr Ser Gln Gly Gly 180 185 190 Gly Ile Ala Leu Ala Val Ala Ala Leu Ser Glu Ile Pro Lys Ala Leu 195 200 205 Val Ser Asn Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Ile 210 215 220 Thr Asp Asn Ala Pro Tyr Ser Glu Ile Val Asn Tyr Leu Lys Val His 225 230 235 240 Arg Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly 245 250 255 Val Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Ala 260 265 270 Leu Met Asp Lys Thr Xaa Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn 275 280 285 His Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Lys Val Tyr Pro Phe Asn Glu His 290 295 300 Glu Gly Gly Glu Ser Phe Gln Arg Met Glu Glu Leu Arg Phe Met Lys 305 310 315 320 Arg Ile Leu Lys Gly Glu Phe Lys Ala 325 <210> 33 <211> 326 <212> PRT <213> Thermotoga lettingae <400> 33 Met Val Tyr Phe Asp Met Pro Leu Glu Asp Leu Arg Lys Tyr Leu Pro 1 5 10 15 Gln Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Asp Phe Trp Lys Gln Thr Ile 20 25 30 His Glu 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Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Cys Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asp Ile Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Tyr 275 280 285 Tyr Ala Gly Glu Lys Asp Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe His Thr Leu Glu Lys Leu Lys Phe Val Lys Lys 305 310 315 320 Thr Ile Ser Met Arg Glu 325 <210> 34 <211> 325 <212> PRT <213> Thermotoga petrophilia <400> 34 Met Ala Phe Phe Asp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Glu Gly Thr Leu 20 25 30 Ala Glu Asn Glu Lys Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Arg Met Glu 35 40 45 Ser His Leu Lys Thr Val Glu Ala Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Met Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Met Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Asp Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Arg 165 170 175 Val Asp His Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Val Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asn Ile Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Ile Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Arg 305 310 315 320 Leu Phe Glu Lys Gly 325 <210> 35 <211> 325 <212> PRT <213> Thermotoga sp. <400> 35 Met Ala Phe Phe Asp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Lys Glu Thr Leu 20 25 30 Ala Glu Ser Glu Lys Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Arg Met Glu 35 40 45 Ser His Leu Lys Thr Val Glu Val Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Leu Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Asp Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Arg 165 170 175 Val Asp His Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys 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gtcatttgga tcctaggcgg caaagatact gttgttcctc cgattacgca aatggcggct 840 tacaataaaa tacaaagtaa aaaatctctc tatgtcttac ctgaatacgg ccatgaatat 900 cttcctaaaa ttagcgactg gttaagagag aatcaataa 939 <210> 40 <211> 312 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 40 Met Thr Lys Ile Asn Asn Trp Gln Asp Tyr Gln Gly Ser Ser Leu Lys 1 5 10 15 Pro Glu Asp Phe Asp Lys Phe Trp Asp Glu Lys Ile Asn Leu Val Ser 20 25 30 Asn His Gln Phe Glu Phe Glu Leu Ile Glu Lys Asn Leu Ser Ser Lys 35 40 45 Val Val Asn Phe Tyr His Leu Trp Phe Thr Ala Ile Asp Gly Ala Lys 50 55 60 Ile His Ala Gln Leu Ile Val Pro Lys Asn Leu Lys Glu Lys Tyr Pro 65 70 75 80 Ala Ile Leu Gln Phe His Gly Tyr His Cys Asp Ser Gly Asp Trp Val 85 90 95 Asp Lys Ile Gly Ile Val Ala Glu Gly Asn Val Val Leu Ala Leu Asp 100 105 110 Cys Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ser Gln Asp Asn Ile Gln Thr Met Gly 115 120 125 Met Thr Met Lys Gly Leu Ile Val Arg Gly Ile Asp Glu Gly Tyr Glu 130 135 140 Asn Leu Tyr Tyr Val Arg Gln Phe Met Asp Leu Ile Thr Ala Thr Lys 145 150 155 160 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aaagtggttg attcgaggct gctaacaaag 900 cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca ataactagca taaccccttg 960 gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccggatatc 1020 cacaggacgg gtgtggtcgc catgatcgcg tagtcgatag tggctccaag tagcgaagcg 1080 agcaggactg ggcggcggcc aaagcggtcg gacagtgctc cgagaacggg tgcgcataga 1140 aattgcatca acgcatatag cgctagcagc acgccatagt gactggcgat gctgtcggaa 1200 tggacgatat cccgcaagag gcccggcagt accggcataa ccaagcctat gcctacagca 1260 tccagggtga cggtgccgag gatgacgatg agcgcattgt tagatttcat acacggtgcc 1320 tgactgcgtt agcaatttaa ctgtgataaa ctaccgcatt aaagcttgca gtggcggttt 1380 tcatggcttg ttatgactgt ttttttgggg tacagtctat gcctcgggca tccaagcagc 1440 aagcgcgtta cgccgtgggt cgatgtttga tgttatggag cagcaacgat gttacgcagc 1500 agggcagtcg ccctaaaaca aagttaaaca tcatgaggga agcggtgatc gccgaagtat 1560 cgactcaact atcagaggta gttggcgtca tcgagcgcca tctcgaaccg acgttgctgg 1620 ccgtacattt gtacggctcc gcagtggatg gcggcctgaa gccacacagt gatattgatt 1680 tgctggttac ggtgaccgta aggcttgatg aaacaacgcg gcgagctttg atcaacgacc 1740 ttttggaaac ttcggcttcc cctggagaga gcgagattct ccgcgctgta gaagtcacca 1800 ttgttgtgca cgacgacatc attccgtggc gttatccagc taagcgcgaa ctgcaatttg 1860 gagaatggca gcgcaatgac attcttgcag gtatcttcga gccagccacg atcgacattg 1920 atctggctat cttgctgaca aaagcaagag aacatagcgt tgccttggta ggtccagcgg 1980 cggaggaact ctttgatccg gttcctgaac aggatctatt tgaggcgcta aatgaaacct 2040 taacgctatg gaactcgccg cccgactggg ctggcgatga gcgaaatgta gtgcttacgt 2100 tgtcccgcat ttggtacagc gcagtaaccg gcaaaatcgc gccgaaggat gtcgctgccg 2160 actgggcaat ggagcgcctg ccggcccagt atcagcccgt catacttgaa gctagacagg 2220 cttatcttgg acaagaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg 2280 tccactacgt gaaaggcgag atcaccaagg tagtcggcaa ataatgtcta acaattcgtt 2340 caagcttatc gatgataagc tgtcaaacat gagaattctt gaagacgaaa gggcctcgtg 2400 atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc 2460 acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat 2520 atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 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gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt 3420 gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt 3480 gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 3540 atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 3600 atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 3660 aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 3720 aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 3780 ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 3840 ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 3900 tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 3960 ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 4020 acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 4080 gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 4140 cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 4200 aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 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ccggaacata atggtgcagg gcgctgactt 5100 ccgcgtttcc agactttacg aaacacggaa accgaagacc attcatgttg ttgctcaggt 5160 cgcagacgtt ttgcagcagc agtcgcttca cgttcgctcg cgtatcggtg attcattctg 5220 ctaaccagta aggcaacccc gccagcctag ccgggtcctc aacgacagga gcacgatcat 5280 gcgcacccgt ggccaggacc caacgctgcc cgagatgcgc cgcgtgcggc tgctggagat 5340 ggcggacgcg atggatatgt tctgccaagg gttggtttgc gcattcacag ttctccgcaa 5400 gaattgattg gctccaattc ttggagtggt gaatccgtta gcgaggtgcc gccggcttcc 5460 attcaggtcg aggtggcccg gctccatgca ccgcgacgca acgcggggag gcagacaagg 5520 tatagggcgg cgcctacaat ccatgccaac ccgttccatg tgctcgccga ggcggcataa 5580 atcgccgtga cgatcagcgg tccagtgatc gaagttaggc tggtaagagc cgcgagcgat 5640 ccttgaagct gtccctgatg gtcgtcatct acctgcctgg acagcatggc ctgcaacgcg 5700 ggcatcccga tgccgccgga agcgagaaga atcataatgg ggaaggccat ccagcctcgc 5760 gtcgcgaacg ccagcaagac gtagcccagc gcgtcggccg ccatgccggc gataatggcc 5820 tgcttctcgc cgaaacgttt ggtggcggga ccagtgacga aggcttgagc gagggcgtgc 5880 aagattccga ataccgcaag cgacaggccg 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sequence <220> <223> synthetic construct <400> 179 Met Ser Thr Phe Val Ala Lys Asp Gly Thr Gln Ile Tyr Phe Lys Asp 1 5 10 15 Trp Gly Ser Gly Lys Pro Val Leu Phe Ser His Gly Trp Pro Leu Asp 20 25 30 Ala Asp Met Trp Glu Tyr Gln Met Glu Tyr Leu Ser Ser Arg Gly Tyr 35 40 45 Arg Thr Ile Ala Phe Asp Arg Arg Gly Phe Gly Arg Ser Asp Gln Pro 50 55 60 Trp Thr Gly Asn Asp Tyr Asp Thr Phe Ala Asp Asp Ile Ala Gln Leu 65 70 75 80 Ile Glu His Leu Asp Leu Lys Glu Val Thr Leu Val Gly Phe Ser Met 85 90 95 Gly Gly Gly Asp Val Ala Arg Tyr Ile Ala Arg His Gly Ser Ala Arg 100 105 110 Val Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ala Val Thr Pro Leu Phe Gly Gln 115 120 125 Lys Pro Asp Tyr Pro Gln Gly Val Pro Leu Asp Val Phe Ala Arg Phe 130 135 140 Lys Thr Glu Leu Leu Lys Asp Arg Ala Gln Phe Ile Ser Asp Phe Asn 145 150 155 160 Ala Pro Phe Tyr Gly Ile Asn Lys Gly Gln Val Val Ser Gln Gly Val 165 170 175 Gln Thr Gln Thr Leu Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Thr 180 185 190 Val Asp Cys Val Thr Ala Phe Ala Glu Thr Asp Phe Arg Pro Asp Met 195 200 205 Ala Lys Ile Asp Val Pro Thr Leu Val Ile His Gly Asp Gly Asp Gln 210 215 220 Ile Val Pro Phe Glu Thr Thr Gly Lys Val Ala Ala Glu Leu Ile Lys 225 230 235 240 Gly Ala Glu Leu Lys Val Tyr Lys Asp Ala Pro His Gly Phe Ala Val 245 250 255 Thr His Ala Gln Gln Leu Asn Glu Asp Leu Leu Ala Phe Leu Lys Arg 260 265 270 Gly Pro Gly Ser Gly Gly Ala Gly Ser Pro Gly Ser Ala Gly Gly Pro 275 280 285 Gly Ser Val Ala Thr Ala Lys Tyr Gly Thr Pro Val Ile Asp Gly Glu 290 295 300 Ile Asp Glu Ile Trp Asn Thr Thr Glu Glu Ile Glu Thr Lys Ala Val 305 310 315 320 Ala Met Gly Ser Leu Asp Lys Asn Ala Thr Ala Lys Val Arg Val Leu 325 330 335 Trp Asp Glu Asn Tyr Leu Tyr Val Leu Ala Ile Val Lys Asp Pro Val 340 345 350 Leu Asn Lys Asp Asn Ser Asn Pro Trp Glu Gln Asp Ser Val Glu Ile 355 360 365 Phe Ile Asp Glu Asn Asn His Lys Thr Gly Tyr Tyr Glu Asp Asp Asp 370 375 380 Ala Gln Phe Arg Val Asn Tyr Met Asn Glu Gln Thr Phe Gly Thr Gly 385 390 395 400 Gly Ser Pro Ala Arg Phe Lys Thr Ala Val Lys Leu Ile Glu Gly Gly 405 410 415 Tyr Ile Val Glu Ala Ala Ile Lys Trp Lys Thr Ile Lys Pro Thr Pro 420 425 430 Asn Thr Val Ile Gly Phe Asn Ile Gln Val Asn Asp Ala Asn Glu Lys 435 440 445 Gly Gln Arg Val Gly Ile Ile Ser Trp Ser Asp Pro Thr Asn Asn Ser 450 455 460 Trp Arg Asp Pro Ser Lys Phe Gly Asn Leu Arg Leu Ile Lys 465 470 475 <210> 180 <211> 216 <212> PRT <213> Mycobacterium smegmatis <400> 180 Met Ala Lys Arg Ile Leu Cys Phe Gly Asp Ser Leu Thr Trp Gly Trp 1 5 10 15 Val Pro Val Glu Asp Gly Ala Pro Thr Glu Arg Phe Ala Pro Asp Val 20 25 30 Arg Trp Thr Gly Val Leu Ala Gln Gln Leu Gly Ala Asp Phe Glu Val 35 40 45 Ile Glu Glu Gly Leu Ser Ala Arg Thr Thr Asn Ile Asp Asp Pro Thr 50 55 60 Asp Pro Arg Leu Asn Gly Ala Ser Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Ala Thr 65 70 75 80 His Leu Pro Leu Asp Leu Val Ile Ile Met Leu Gly Thr Asn Asp Thr 85 90 95 Lys Ala Tyr Phe Arg Arg Thr Pro Leu Asp Ile Ala Leu Gly Met Ser 100 105 110 Val Leu Val Thr Gln Val Leu Thr Ser Ala Gly Gly Val Gly Thr Thr 115 120 125 Tyr Pro Ala Pro Lys Val Leu Val Val Ser Pro Pro Pro Leu Ala Pro 130 135 140 Met Pro His Pro Trp Phe Gln Leu Ile Phe Glu Gly Gly Glu Gln Lys 145 150 155 160 Thr Thr Glu Leu Ala Arg Val Tyr Ser Ala Leu Ala Ser Phe Met Lys 165 170 175 Val Pro Phe Phe Asp Ala Gly Ser Val Ile Ser Thr Asp Gly Val Asp 180 185 190 Gly Ile His Phe Thr Glu Ala Asn Asn Arg Asp Leu Gly Val Ala Leu 195 200 205 Ala Glu Gln Val Arg Ser Leu Leu 210 215 <210> 181 <211> 272 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens <400> 181 Met Ser Thr Phe Val Ala Lys Asp Gly Thr Gln Ile Tyr Phe Lys Asp 1 5 10 15 Trp Gly Ser Gly Lys Pro Val Leu Phe Ser His Gly Trp Leu Leu Asp 20 25 30 Ala Asp Met Trp Glu Tyr Gln Met Glu Tyr Leu Ser Ser Arg Gly Tyr 35 40 45 Arg Thr Ile Ala Phe Asp Arg Arg Gly Phe Gly Arg Ser Asp Gln Pro 50 55 60 Trp Thr Gly Asn Asp Tyr Asp Thr Phe Ala Asp Asp Ile Ala Gln Leu 65 70 75 80 Ile Glu His Leu Asp Leu Lys Glu Val Thr Leu Val Gly Phe Ser Met 85 90 95 Gly Gly Gly Asp Val Ala Arg Tyr Ile Ala Arg His Gly Ser Ala Arg 100 105 110 Val Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ala Val Thr Pro Leu Phe Gly Gln 115 120 125 Lys Pro Asp Tyr Pro Gln Gly Val Pro Leu Asp Val Phe Ala Arg Phe 130 135 140 Lys Thr Glu Leu Leu Lys Asp Arg Ala Gln Phe Ile Ser Asp Phe Asn 145 150 155 160 Ala Pro Phe Tyr Gly Ile Asn Lys Gly Gln Val Val Ser Gln Gly Val 165 170 175 Gln Thr Gln Thr Leu Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Thr 180 185 190 Val Asp Cys Val Thr Ala Phe Ala Glu Thr Asp Phe Arg Pro Asp Met 195 200 205 Ala Lys Ile Asp Val Pro Thr Leu Val Ile His Gly Asp Gly Asp Gln 210 215 220 Ile Val Pro Phe Glu Thr Thr Gly Lys Val Ala Ala Glu Leu Ile Lys 225 230 235 240 Gly Ala Glu Leu Lys Val Tyr Lys Asp Ala Pro His Gly Phe Ala Val 245 250 255 Thr His Ala Gln Gln Leu Asn Glu Asp Leu Leu Ala Phe Leu Lys Arg 260 265 270

Claims (48)

1) a) i) 구조
[X]mR5
(여기서, X는 화학식 R6C(O)O의 에스테르기이며,
R6은 하이드록실기 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티(moiety)이고, R6은 C2 내지 C7인 R6에 대하여, 하나 이상의 에테르 결합을 임의로 포함하고;
R5는 하이드록실기로 임의로 치환된 C1 내지 C6 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티 또는 5-원 환형 헤테로방향족 모이어티, 또는 6-원 환형 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티이며; R5에서 각 탄소 원자는 각각 1개 이하의 하이드록실기 또는 1개 이하의 에스테르기 또는 카르복실산기를 포함하고; R5는 임의로 하나 이상의 에테르 결합을 포함하며;
m은 1 내지 R5에서의 탄소 원자수 범위의 정수이다)를 갖는 에스테르 - 상기 에스테르는 25℃에서 적어도 5 ppm의 수 용해도를 갖는다 - ;
ii) 구조
Figure pct00020

(여기서, R1은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R3 및 R4는 각각 H 또는 R1C(O)이다)를 갖는 글리세리드;
iii) 화학식
Figure pct00021

(여기서, R1은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R2는 C1 내지 C10 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴, (CH2CH2O)n 또는 (CH2CH(CH3)-O)nH이고, n은 1 내지 10이다)의 하나 이상의 에스테르; 및
iv) 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 및 아세틸화 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 아세틸화 당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기질;
b) 과산소원; 및
c) 일반 구조
PAH-[L]y-TSBD
또는
TSBD-[L]y-PAH
(여기서,
PAH는 과가수분해(perhydrolytic) 활성을 갖는 효소이며;
TSBD는 표적 물질의 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이고; 표면은 체표면 또는 구강 표면이 아니며;
L은 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 임의의 펩티드 링커이고;
y는 0 또는 1이다)를 포함하는 과가수분해 활성을 갖는 융합 단백질을 포함하는 반응 성분의 세트를 제공하는 단계; 및
2) (1)의 반응 성분을 적절한 반응 조건 하에서 배합하는 단계 - 이에 의해,
a) 융합 단백질이 표적 표면에 결합하고;
b) 적어도 하나의 과산이 효소에 의해 생성되고, 표적 표면과 접촉하며; 이에 의해, 표적 표면에 표백(bleaching), 미백, 소독, 살균(sanitizing), 탈염(destaining), 탈취 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 과산 기반의 이익이 제공된다 - 를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 반응 성분이 표적 표면 상에서 배합되는 방법.
제1항에 있어서, 반응 성분이 표적 표면과의 접촉 전에 배합되는 방법.
제1항에 있어서, 과가수분해 활성을 갖는 융합 단백질이 효소에 의한 과산의 생성 전에 표적 표면 상에 존재하는 방법.
제1항에 있어서, 과가수분해 활성을 갖는 상기 효소가 프로테아제, 리파제, 에스테라제, 아실 트랜스퍼라제, 아릴 에스테라제, 탄수화물 에스테라제, 세팔로스포린 아세틸 가수분해효소, 아세틸 자일란 에스테라제 또는 그들의 임의의 조합인 방법.
제5항에 있어서, 아릴 에스테라제가 서열 번호 162에 대하여 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제5항에 있어서, 과가수분해 활성을 갖는 효소가 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처(signature) 모티프를 포함하는 탄수화물 에스테라제이며, 상기 시그니처 모티프가
1) 서열 번호 2의 위치 118 내지 120에 해당하는 위치에서 RGQ 모티프;
2) 서열 번호 2의 위치 179 내지 183에 해당하는 위치에서 GXSQG 모티프; 및
3) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함하는 방법.
제1항, 제6항 또는 제7항에 있어서, 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이 항체, Fab 항체 단편, 단쇄 가변 단편(scFv) 항체, 카멜리대(Camelidae) 항체, 스캐폴드(scaffold) 디스플레이 단백질 또는 면역글로불린 폴드(fold)가 결여된 단쇄 폴리펩티드인 방법.
제1항, 제6항 또는 제7항에 있어서, 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이 셀룰로스-결합 도메인인 방법.
제9항에 있어서, 셀룰로스-결합 도메인이 클로스트리듐 써모셀룸(Clostridium thermocellum), 클로스트리듐 셀룰로보란스(Clostridium cellulovorans), 바실러스(Bacillus) 종, 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) 또는 칼디셀룰로시룹터 사카로라이티쿠스(Caldicellulosiruptor saccharolyticus)로부터의 셀룰로스-결합 효소로부터 수득되는 방법.
제9항에 있어서, 셀룰로스-결합 도메인이 셀룰로스-결합 도메인 패밀리 CBM9, CBM17, CBM28 또는 CBD3의 구성원인 방법.
제8항에 있어서, 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 폴리펩티드인 방법.
제12항에 있어서, 단쇄 폴리펩티드는 길이가 5 내지 60개 아미노산 범위인, 표적 표면에 대한 KD 값 또는 MB50 값이 10-5 M 이하인 적어도 하나의 표적 표면-결합 펩티드를 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 단쇄 폴리펩티드가 2 내지 50개 표적 표면-결합 펩티드를 포함하며, 표적 표면-결합 펩티드는 독립적으로 그리고 임의로, 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 펩티드 스페이서(spacer)에 의해 분리되는 방법.
제1항에 있어서, 표적 물질이 셀룰로스 물질을 포함하는 방법.
제15항에 있어서, 셀룰로스 물질이 셀룰로스, 목재, 목재 펄프, 제지, 면(cotton), 레이온, 라이오셀(lyocell) 또는 그들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
제1항 또는 제16항에 있어서, 표적 물질이 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리프로필렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리스티렌, 셀룰로스 아세테이트 또는 그들의 임의의 조합을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 과산이 반응 성분의 세트의 배합 5분 내에 500 ppb 내지 10,000 ppm의 농도로 생성되는 방법.
제18항에 있어서, 과산이 1시간 미만 동안 표적 표면과 접촉되는 방법.
제1항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 과산이 과아세트산인 방법.
제1항에 있어서, 기질이 트라이아세틴을 포함하는 방법.
하기의 일반 구조를 포함하는 융합 단백질:
PAH-[L]y-TSBD
또는
TSBD-[L]y-PAH
상기 식에서,
PAH는 과가수분해 활성을 갖는 효소이며;
TSBD는 표적 물질의 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이고; 표면은 체표면 또는 구강 표면이 아니며;
L은 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 임의의 펩티드 링커이고;
y는 0 또는 1이다.
제22항에 있어서, 과가수분해 활성을 갖는 상기 효소가 프로테아제, 리파제, 에스테라제, 아실 트랜스퍼라제, 아릴 에스테라제, 탄수화물 에스테라제, 세팔로스포린 아세틸 가수분해효소, 아세틸 자일란 에스테라제 또는 그들의 임의의 조합인 융합 단백질.
제23항에 있어서, 아릴 에스테라제가 서열 번호 162에 대하여 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
제23항에 있어서, 과가수분해 활성을 갖는 효소가 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 갖는 탄수화물 에스테라제이며, 상기 시그니처 모티프가
1) 서열 번호 2의 위치 118 내지 120에 해당하는 위치에서 RGQ 모티프;
2) 서열 번호 2의 위치 179 내지 183에 해당하는 위치에서 GXSQG 모티프; 및
3) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함하는 융합 단백질.
제23항, 제24항 또는 제25항에 있어서, 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이 항체, Fab 항체 단편, 단쇄 가변 단편(scFv) 항체, 카멜리대 항체, 스캐폴드 디스플레이 단백질 또는 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 폴리펩티드인 융합 단백질.
제23항, 제24항 또는 제25항에 있어서, 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이 셀룰로스-결합 도메인인 융합 단백질.
제26항에 있어서, 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 폴리펩티드인 융합 단백질.
제28항에 있어서, 상기 적어도 하나의 표적 표면-결합 펩티드는 상기 표적 표면에 대한 KD 값 또는 MB50 값이 10-5 M 이하인 융합 단백질.
제28항에 있어서, 단쇄 폴리펩티드는 길이가 5 내지 60개 아미노산 범위인 적어도 하나의 표적 표면-결합 펩티드를 포함하는 융합 단백질.
제30항에 있어서, 단쇄 폴리펩티드가 2 내지 50개 표적 표면-결합 펩티드를 포함하며, 표적 표면-결합 펩티드는 독립적으로 그리고 임의로, 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 폴리펩티드 스페이서에 의해 분리되는 융합 단백질.
제22항에 있어서, 펩티드 성분이 200개 이하의 길이의 아미노산을 포함하는 융합 단백질.
1) i) 구조
[X]mR5
(여기서, X는 화학식 R6C(O)O의 에스테르기이며,
R6은 하이드록실기 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티이고, R6은 C2 내지 C7인 R6에 대하여, 하나 이상의 에테르 결합을 임의로 포함하고;
R5는 하이드록실기로 임의로 치환된 C1 내지 C6 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티 또는 5-원 환형 헤테로방향족 모이어티, 또는 6-원 환형 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티이며; R5에서 각 탄소 원자는 각각 1개 이하의 하이드록실기 또는 1개 이하의 에스테르기 또는 카르복실산기를 포함하고; R5는 임의로 하나 이상의 에테르 결합을 포함하며;
m은 1 내지 R5에서의 탄소 원자수 범위의 정수이다)를 갖는 에스테르 - 상기 에스테르는 25℃에서 적어도 5 ppm의 수 용해도를 갖는다 - ;
ii) 구조
Figure pct00022

(여기서, R1은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R3 및 R4는 각각 H 또는 R1C(O)이다)를 갖는 글리세리드;
iii) 화학식
Figure pct00023

(여기서, R1은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R2는 C1 내지 C10 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴, (CH2CH2O)n 또는 (CH2CH(CH3)-O)nH이고, n은 1 내지 10이다)의 하나 이상의 에스테르; 및
iv) 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 및 아세틸화 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 아세틸화 당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기질;
2) 과산소원; 및
3) 일반 구조
PAH-[L]y-TSBD
또는
TSBD-[L]y-PAH
(여기서,
PAH는 과가수분해 활성을 갖는 효소이며; 과가수분해 활성을 갖는 상기 효소가 리파제, 프로테아제, 에스테라제, 아실 트랜스퍼라제, 아릴 에스테라제, 탄수화물 에스테라제, 세팔로스포린 아세틸 가수분해효소, 아세틸 자일란 에스테라제 또는 그들의 임의의 조합이고;
TSBD는 표적 물질의 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이며; 표면은 체표면 또는 구강 표면이 아니고;
L은 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 임의의 펩티드 링커이며;
y는 0 또는 1이다)를 포함하는 과가수분해 활성을 갖는 융합 단백질을 포함하는 반응 성분의 세트를 포함하는 과산 생성 시스템.
제33항에 있어서, 아릴 에스테라제가 서열 번호 162에 대하여 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 과산 생성 시스템.
제33항에 있어서, 과가수분해 활성을 갖는 탄수화물 에스테라제가 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 갖는 CE-7 탄수화물 에스테라제이고, 상기 시그니처 모티프는
i) 서열 번호 2의 위치 118 내지 120에 해당하는 위치에서 RGQ 모티프;
ii) 서열 번호 2의 위치 179 내지 183에 해당하는 위치에서 GXSQG 모티프; 및
iii) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함하는 과산 생성 시스템.
제22항 또는 제23항의 융합 단백질을 포함하는 세탁 관리 제품.
제36항에 있어서, 세탁 관리 제품이 분말, 과립, 페이스트, 겔, 액체, 정제, 헹굼제(rinse) 또는 그들의 임의의 조합의 형태인 세탁 관리 제품.
1) a) i) 구조
[X]mR5
(여기서, X는 화학식 R6C(O)O의 에스테르기이며,
R6은 하이드록실기 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티이고, R6은 C2 내지 C7인 R6에 대하여, 하나 이상의 에테르 결합을 임의로 포함하고;
R5는 하이드록실기로 임의로 치환된 C1 내지 C6 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티 또는 5-원 환형 헤테로방향족 모이어티, 또는 6-원 환형 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티이며; R5에서 각 탄소 원자는 각각 1개 이하의 하이드록실기 또는 1개 이하의 에스테르기 또는 카르복실산기를 포함하고; R5는 임의로 하나 이상의 에테르 결합을 포함하며;
m은 1 내지 R5에서의 탄소 원자수 범위의 정수이다)를 갖는 에스테르 - 상기 에스테르는 25℃에서 적어도 5 ppm의 수 용해도를 갖는다 - ;
ii) 구조
Figure pct00024

(여기서, R1은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R3 및 R4는 각각 H 또는 R1C(O)이다)를 갖는 글리세리드;
iii) 화학식
Figure pct00025

(여기서, R1은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R2는 C1 내지 C10 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴, (CH2CH2O)n 또는 (CH2CH(CH3)-O)nH이고, n은 1 내지 10이다)의 하나 이상의 에스테르; 및
iv) 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 및 아세틸화 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 아세틸화 당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기질;
b) 과산소원; 및
c) 일반 구조
PAH-[L]y-TSBD
또는
TSBD-[L]y-PAH
(여기서,
PAH는 과가수분해 활성을 갖는 효소이며;
TSBD는 표적 물질의 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이고; 표면은 체표면 또는 구강 표면이 아니며;
L은 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 임의의 펩티드 링커이고;
y는 0 또는 1이며;
과가수분해 활성을 갖는 효소는 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 포함하며, 상기 시그니처 모티프는
i) 서열 번호 2의 위치 118 내지 120에 해당하는 위치에서 RGQ 모티프;
ii) 서열 번호 2의 위치 179 내지 183에 해당하는 위치에서 GXSQG 모티프; 및
iii) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함한다)를 포함하는 과가수분해 활성을 갖는 융합 단백질을 포함하는 반응 성분의 세트를 제공하는 단계;
2) 표적 표면과 과가수분해 활성을 갖는 융합 단백질을 접촉시키는 단계 - 이에 의해, 융합 단백질이 표적 표면에 결합한다 - ;
3) 임의로, 표적 표면을 헹구는 단계; 및
4) 결합된 융합 단백질을 갖는 표적 표면을 상기 적어도 하나의 기질 및 과산소원과 접촉시키는 단계 - 이에 의해, 적어도 하나의 과산이 융합 단백질에 의해, 효소에 의해 생성되고, 이에 의해, 표적 표면에 표백, 미백, 소독, 탈염(destaining), 탈취, 생물막(biofilm)의 감소 또는 제거 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 과산 기반의 이익이 제공된다 - 를 포함하는 방법.
a) 융합 단백질을 암호화하는 발현가능한 유전자 구축물(genetic construct)을 포함하는 재조합 미생물 숙주 세포를 제공하는 단계 - 상기 융합 단백질은 셀룰로스 물질에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분에 결합된 과가수분해 활성을 갖는 효소를 포함한다 - ;
b) 재조합 미생물 숙주 세포를 적절한 조건 하에서 성장시키는 단계 - 이에 의해, 융합 단백질이 생성된다 - ; 및
c) 임의로, 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 셀룰로스 물질에 대하여 친화성을 갖는 적어도 하나의 펩티드 성분에 결합된 과가수분해 효소를 포함하는 융합 단백질의 생성 방법.
제39항에 있어서, 재조합 미생물 숙주 세포가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)인 방법.
제39항에 있어서, 과가수분해 활성을 갖는 상기 효소가 프로테아제, 리파제, 에스테라제, 아실 트랜스퍼라제, 아릴 에스테라제, 탄수화물 에스테라제, 세팔로스포린 아세틸 가수분해효소, 아세틸 자일란 에스테라제 또는 그들의 임의의 조합인 방법.
제41항에 있어서, 아릴 에스테라제가 서열 번호 162에 대하여 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 방법.
제41항에 있어서, 과가수분해 활성을 갖는 효소가 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 포함하는 탄수화물 에스테라제이며, 상기 시그니처 모티프가
1) 서열 번호 2의 위치 118 내지 120에 해당하는 위치에서 RGQ 모티프;
2) 서열 번호 2의 위치 179 내지 183에 해당하는 위치에서 GXSQG 모티프; 및
3) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함하는 방법.
제39항에 있어서, 셀룰로스 물질에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이 셀룰로스-결합 도메인인 방법.
제44항에 있어서, 셀룰로스-결합 도메인이 클로스트리듐 써모셀룸, 클로스트리듐 셀룰로보란스, 바실러스 종, 써모토가 마리티마 또는 칼디셀룰로시룹터 사카로라이티쿠스로부터의 셀룰로스-결합 효소로부터 수득되는 방법.
제44항에 있어서, 셀룰로스-결합 도메인이 셀룰로스-결합 도메인 패밀리 CBM9, CBM17, CBM28 또는 CBD3의 구성원인 방법.
제39항에 있어서, 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 폴리펩티드인 방법.
표적 표면의 표백, 미백, 소독, 살균, 탈염 또는 탈취를 위해 유효 농도의 적어도 하나의 과산을 효소에 의해 생성하기 위한, 세탁 제품에서의 제22항, 제23항, 제24항 또는 제25항의 융합 단백질의 용도.
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