KR20130132936A

KR20130132936A - 구강 관리 제품에 사용하기 위한 효소에 의한 과산 생성

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Publication number: KR20130132936A
Application number: KR20137019091A
Authority: KR
Inventors: 리사 에이. 버터릭; 스콧 디. 커닝햄; 로버트 디코시모; 카리 에이. 포써; 타냐 마리아 그루버; 샤론 엘. 하이니; 마크 에스. 패인; 피에르 에. 루비에르; 홍 왕
Original assignee: 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니
Priority date: 2010-12-20
Filing date: 2011-12-19
Publication date: 2013-12-05
Also published as: WO2012087970A2; RU2018123151A3; EP2654695B8; JP6410786B2; CA2822422C; JP6359831B2; CA2822422A1; RU2018123151A; EP2654695A2; BR112013015459B8; JP2017081958A; BR112013015459A2; US8663616B2; US20120328534A1; EP2654695A4; ZA201303372B; RU2660373C2; JP2014506250A; EP2654695B1; CN103269679B

Abstract

과산계 유익제로 구강 표면을 처리하기 위한 조성물 및 방법이 본 명세서에 개시된다. 과산 유익제는 구강 표면 탈색, 미백, 소독, 탈염, 탈취, 생물막의 감소 또는 제거 및 그들의 조합을 위해 사용될 수 있다. 과산은 과산소원의 존재 하에 과가수분해 활성을 갖는 CE-7 탄수화물 에스테라제(과가수분해효소)를 사용하여 카르복실산 에스테르 기질로부터 효소에 의해 생성된다. 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분에 직접적으로 또는 임의의 링커를 통하여 결합된 과가수분해효소를 포함하는 융합 단백질을 사용하여, 과가수분해 활성을 구강 표면에 표적화시킬 수 있다.

Description

구강 관리 제품에 사용하기 위한 효소에 의한 과산 생성{ENZYMATIC PERACID GENERATION FOR USE IN ORAL CARE PRODUCTS}

관련-출원과의 상호 참조

본 출원은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된 미국 가특허 출원 제61/424,903호(출원일: 2010년 12월 20일)에 대한 우선권을 청구한다.

본 발명은 구강 관리 유익제(benefit agent)로서 적어도 하나의 과산을 포함하는 개인 관리 제품의 분야에 관한 것이다. 과산은 적어도 하나의 적절한 카르복실산 에스테르 기질 및 과산소원의 존재 하에 효소에 의해 생성된다. 구체적으로, 과가수분해(perhydrolytic) 활성을 갖는 효소 촉매를 사용하여, 구강 관리 제품에 사용하기 위한 과산 유익제를 생성한다. 과가수분해 효소는 효소에 의해 생성된 과산이 원하는 표면 상에서 또는 그 근처에서 생성되도록 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 적어도 하나의 펩티드 성분을 함유하도록 엔지니어링된 융합 단백질("표적화된 과가수분해효소")의 형태일 수 있다.

퍼옥시카르복실산("과산")은 효과적인 항미생물제이다. 원치 않는 미생물 성장에 대하여 경질 표면, 식품, 살아있는 식물 조직 및 의료 장치를 세정하고/거나 소독하고/거나 살균하는 방법이 기재되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,545,047호; 미국 특허 제6,183,807호; 미국 특허 제6,518,307호; 미국 특허 제5,683,724호; 및 미국 특허 제6,635,286호). 또한, 과산은 세탁용 세제 응용을 위한 표백(bleaching) 조성물을 제조하는데 유용한 것으로 보고되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제3,974,082호; 미국 특허 제5,296,161호; 및 미국 특허 제5,364,554호).

또한, 과산을 포함하는 구강 관리 조성물이 개시되어 있다. 미국 특허 제5,302,375호(비시오, 디.(Viscio, D.))에는 비히클 중에 용해된 과아세트산을 포함하는 치아를 미백시키기 위한 구강 조성물이 개시되며, 여기서, 과아세트산은 물, 아세틸살리실산 및 수용성 알칼리 금속 과탄산염을 배합함으로써 동소에서 비히클 내에서 생성된다. 미국 특허 제5,279,816호(처치(Church) 등)에는 착색되거나 변색된 치아를 미백시키기 위한 과아세트산을 포함하는 조성물의 용도가 개시된다. 미국 특허 제6,221,341호 및 제7,189,385호(몬트고메리, 알.(Montgomery, R.))에는 치아를 미백시키기 위한 방법에서 사용하기에 적절한 퍼옥시산 치아 미백 조성물이 개시되어 있다. 더욱 구체적으로, 과아세트산 조성물은 과산화수소 전구체, 글리세린의 아세트산 에스테르 및 물을 배합하여, 화학적 과가수분해를 통하여, 과아세트산을 생성함에 의해 생성된다. 효소에 의한 과가수분해는 기재되어 있지 않다.

미국 특허 출원 공개 제2009-0311198호(콘카르(Concar) 등)에는 치아를 탈색시키기 위한, 과가수분해 활성을 갖는 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis) 효소를 포함하는 구강 조성물이 개시되어 있다. 과산 유익제를 생성하기 위한 CE-7 과가수분해효소의 이용은 개시되지 않았다. 또한, 콘카르 등은 구강 관리 조성물에서 표적화된 과가수분해 효소의 이용에 대해서는 언급하지 않았다.

바디 케어(body care) 제품에 과가수분해 활성을 갖는 특정 변이체 서브틸리신 칼스베르그(subtilisin Carlsberg) 프로테아제를 포함하는 것이 빌란트(Wieland) 등의 미국 특허 제7,510,859호에 개시되어 있다. 특정 변이체 프로테아제를 뛰어넘는 과가수분해 효소가 기재되어 있지 않거나, 개인 관리 유익제로서 과산의 효소에 의한 생성을 설명하는 어떠한 실험예도 존재하지 않는다.

미국 특허 출원 공개 제2008-0176783 A1호; 제2008-0176299 A1호; 제2009-0005590 A1호; 및 제2010-0041752 A1호(디코시모(DiCosimo) 등)에는 카르복실산 에스테르 기질을 (적절한 과산소원, 예컨대 과산화수소의 존재 하에) 소독제 및/또는 탈색제로 사용하기에 충분한 농도로 퍼옥시카르복실산으로 전환시키기 위한 상당한 과가수분해 활성을 특징으로 하는, 구조적으로 탄수화물 에스테라제의 CE-7 패밀리의 구성원으로 분류된 효소(즉, 세팔로스포린 C 데아세틸라제[CAH] 및 아세틸 자일란 에스테라제[AXE])가 개시되어 있다. 탄수화물 에스테라제의 CE-7 패밀리의 일부 구성원은 일단 반응 성분이 혼합되면, 알코올, 다이올 및 글리세롤의 아세틸 에스테르로부터 1분 내에 4000 내지 5000 ppm, 그리고 5분 내지 30분에 최대 9000 ppm의 과아세트산을 생성하기에 충분한 과가수분해 활성을 갖는 것으로 입증되었다(디코시모 등, 미국 특허 출원 공개 제2009-0005590 A1호). 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529 A1호에는 과가수분해 활성이 향상된 변이체 CE-7 효소가 기재되어 있다. 비록 CE-7 과가수분해효소(perhydrolase)가 특출한 과가수분해 활성을 갖지만, 개인 관리 제품에서의 그들의 이용은 개시된 적이 없다. 이와 같이, 해결해야 할 문제는 과산 유익제의 생성을 위해 적어도 하나의 CE-7 과가수분해효소의 이용을 포함하는 개인 관리 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.

과산은 원하는 혜택에 대하여 표적화되지 않은 물질을 포함하는 다양한 물질에 대하여 반응성일 수 있는 강력한 산화제이다. 이와 같이, 특정 개인 관리 응용은 원하는 표적 체표면 상에 또는 그 근처에 과산 생성을 국소화시킴으로써 과산 유익제를 원하는 체표면에 표적화/집중시키는 능력으로부터 유리할 수 있다. 효소에 의한 과산 생성은 과가수분해효소를 체표면에 표적화시킴으로써 유리할 수 있다. 과가수분해효소를 운반 물질에 표적화시켜, 효소 농도 및 사용자의 노출을 제한함으로써 추가의 이익이 달성될 수 있다.

구강 물질과 결합되는 효소를 사용하는 구강 관리 표면을 처리하는 구강 관리 조성물 및/또는 방법이 보고되어 있다. 미국 특허 제4,138,476호(심슨(Simonson) 등)에는 복합화 시약(complexing reagent)을 통하여 치아의 표면에 대하여 친화성을 갖는 포스페이트 캐리어 기(carrier group)에 공유 결합되는 글루칸-분해 효소의 사용을 포함하는 플라크의 처리 방법이 개시되어 있다. 글루칸 침착물의 효소에 의한 분해는 플라크 물질의 용해 및 분산을 증진시키는 것을 나타낸다.

미국 특허 출원 공개 제2005-0158253호, 미국 특허 제6,830,745호(버드니(Budny) 등)에는 생물막(biofilm) 구조를 효소에 의해 분해하기 위한 고정(anchor) 효소 복합체 및 박테리아 상에서 직접적으로 작용할 수 있는 제2 고정 효소 성분을 포함하는 2-성분 조성물이 개시되어 있다. 생물막 분해 효소는 엑소폴리사카라이드(exopolysaccharide) 백본(backbone) 구조를 직접적으로 분해하는 것이다.

미국 특허 제5,871,714호(버드니, 제이.)에는 고정 분자에 결합된 플라크 매트릭스를 분해하는 효소를 포함하는 박테리아 성장/콜로니화의 조절(예를 들어, 치아 플라크 감소)을 위한 조성물이 개시된다. 표적화된 과가수분해효소의 이용이 기재되어 있지 않다.

미국 특허 제5,490,988호 및 EP 0479,600 B1호(베그스(Beggs) 등)에는 표적 부위에 대한 결합을 위한 수단으로서의 항체 단편의 용도가 개시되며, 여기서, 치료제는 치료제를 표적 부위에 부착시키기 위한 항체 단편에 첨부되는 추가의 펩티드를 통하여 연결된다. 치아 플라크에서 박테리아의 항원 성분에 대하여 친화성을 갖는 변형된 항체 단편을 포함하여 치료제를 전달하는 구강 관리 제품이 개시된다. 치료제는 효소 또는 효소의 조합, 예를 들어, 산화된 할라이드를 형성하기 위하여 과산화효소와 병용한 산화효소에 의해 생성되는 세포독성제일 수 있다. 과산 유익제를 생성하기 위한 표적화된 과가수분해효소의 이용이 기재되어 있지 않다.

EP 0450,800 B1호(베그스 등)에는 함께 작용하여 구강 미생물총에서 발생하는 종을 공격하는 2가지 상이한 효소의 이용이 개시된다. 제1 효소는 제2 효소에 대한 기질로 사용되어 입안의 표적에 대하여 활성인 제제를 생성하는 중간 생성물을 생성한다. 각 효소는 입안의 표적 표면에 대하여 친화성을 갖는 항체 또는 항체 단편에 부착되며, 이에 의해, 사용 중에, 효소는 서로 인접한 표적 부위에 결합된다. 할라이드 또는 티오시아네이트의 존재 하에서 과산화효소에 의해 전환되어, 각각 하이포할라이트 또는 하이포티오시아네이트를 생성할 수 있는 과산화수소를 생성하기 위한 글루코스 산화효소의 조합이 예시된다. 과산 유익제를 생성하기 위한 표적화된 과가수분해효소의 이용은 기재되어 있지 않다.

EP 0451,972 B1호(베그스 등)에는 2가지 효소를 포함하는 제품이 기재되며, 상기 제품은 표적에 대한제를 생성하기 위한 제1 효소 및 제1 효소에 대한 기질인 중간체를 생성하기 위한 제2 효소를 포함하며; 상기 제품은 추가로 둘 모두의 효소에 부착되거나 부착될 수 있어 효소를 함께 결합시키며, 이에 의해 표적 세포에 결합하는 복합체를 형성하는 연결 수단(다시 말하면, 항체 또는 항체 단편)을 포함한다. 하이포할라이트 또는 하이포티오시아네이트 활성제의 형성을 촉매작용시키는 과산화효소에 결합된 산화효소(과산화수소를 생성할 수 있는)가 예시된다.

EP 0453,097 B1호(베그스 등)에는 자가 조립가능하여, 활성제와 표적 부위 간에 가교를 형성할 수 있는 복수의 항체 또는 항체 단편을 사용하는 활성제의 표적 부위로의 전달이 기재된다. 활성제는 글루코스 산화효소 또는 글루코스 산화효소 및 과산화효소의 조합이다. 과산 유익제를 생성하기 위한 표적화된 과가수분해효소의 이용은 기재되어 있지 않다.

펩티드 친화성 물질로서의 항체, 항체 단편(F_ab), 단쇄 융합 가변 영역 항체(scFc), 카멜리대(Camelidae) 항체 및 라지 스캐폴드 디스플레이 단백질(large scaffold display protein)의 이용은 그들의 크기와 비용 때문에 일부 개인 관리 응용에 적절하지 않을 수 있다. 이와 같이, 소정의 저비용 미용 응용에서, 표적화된 유익제의 전달을 위해 더 짧거나 비용이 보다 낮은 펩티드 친화성 물질을 사용하는 것이 필요하다.

미용 유익제를 체표면에 표적화시키기 위한 체표면에 대하여 강력한 친화성을 갖는 더 짧은 바이오패닝된(biopanned) 펩티드의 이용이 기재되어 있다(미국 특허 제7,220,405호; 제7,309,482호; 제7,285,264호 및 제7,807,141호; 미국 특허 출원 공개 제2005-0226839 A1호; 제2007-0196305 A1호; 제2006-0199206 A1호; 제2007-0065387 A1호; 제2008-0107614 A1호; 제2007-0110686 A1호; 제2006-0073111 A1호; 제2010-0158846호; 제2010-0158847호; 및 제2010-0247589호; 및 PCT 출원 공개 WO2008/054746호; WO2004/048399호 및 WO2008/073368호). 미국 특허 제7,807,141호(후앙(Huang) 등)에는 치아 표면에 구강 관리 유익제를 결합시키기에 적절한 펩티드계 구강 관리 표면 시약이 개시된다. 과산 유익제의 생성을 위해 활성 CE-7 과가수분해효소(즉, "표적화된 과가수분해효소")를 결합시키기 위한 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 물질을 이용하는 것이 기재된 적이 없다.

이와 같이, 해결해야 할 추가의 문제는 효소에 의한 과산 생성을 구강 표면에 표적화시키기에 적절한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.

과산계 유익제를 효소에 의해 생성하고, 이를 구강 표면에 전달하기 위한 성분을 포함하는 조성물 및 방법이 제공된다.

일 실시형태에서, 구강 관리 응용, 예를 들어, 구강 표면 탈색, 치아 미백, 소독, 탈염, 탈취, 치아 우식증의 치료, 치아 우식증의 예방, 치아 우식증과 관련된 구강 박테리아의 감소 및 구강 생물막(예를 들어, 치아 플라크)의 치료 또는 제거에서 사용하기 위한 과산 유익제를 효소에 의해 생성하기 위하여, CE-7 과가수분해효소를 사용하는 구강 관리 조성물 및 방법이 제공된다.

일 실시형태에서,

1) a) i) 구조

[X]_mR₅

(여기서, X는 화학식 R₆C(O)O의 에스테르기이며,

R₆은 하이드록실기 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티(moiety)이고, R₆은 C2 내지 C7인 R₆에 대하여, 하나 이상의 에테르 결합을 임의로 포함하고;

R₅는 하이드록실기로 임의로 치환된 C1 내지 C6 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티 또는 5-원 환형 헤테로방향족 모이어티, 또는 6-원 환형 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티이며; R₅에서 각 탄소 원자는 각각 1개 이하의 하이드록실기 또는 1개 이하의 에스테르기 또는 카르복실산기를 포함하고; R₅는 임의로 하나 이상의 에테르 결합을 포함하며;

m은 1 내지 R₅에서의 탄소 원자수 범위의 정수이다)를 갖는 에스테르 - 상기 에스테르는 25℃에서 적어도 5 ppm의 수 용해도를 갖는다 - ;

ii) 구조

(여기서, R₁은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R₃ 및 R₄는 각각 H 또는 R₁C(O)이다)를 갖는 글리세리드;

iii) 화학식

(여기서, R₁은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R₂는 C1 내지 C10 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴, (CH₂CH₂O)_n 또는 (CH₂CH(CH₃)-O)_nH이고, n은 1 내지 10이다)의 하나 이상의 에스테르; 및

iv) 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 및 아세틸화 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 아세틸화 당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기질;

b) 과산소원; 및

c) 과가수분해 활성을 갖는 효소 촉매 - 상기 효소 촉매는 클러스털더블유(CLUSTALW)를 사용하여 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 갖는 효소를 포함하며, 상기 시그니처 모티프는

i) 서열 번호 2의 위치 118 내지 120에 해당하는 위치에서 RGQ 모티프;

ii) 서열 번호 2의 위치 179 내지 183에 해당하는 위치에서 GXSQG 모티프; 및

iii) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함한다 - 를 포함하는 반응 성분의 세트를 제공하는 단계;

2) (1)의 반응 성분을 적절한 반응 조건 하에서 배합하는 단계 - 이에 의해, 적어도 하나의 과산이 효소에 의해 생성된다 - ; 및

3) 구강 표면을 적어도 하나의 과산과 접촉시키는 단계 - 이에 의해, 구강 표면에 탈색, 치아 미백, 소독, 탈염, 탈취, 생물막의 감소 또는 제거 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 과산 기반의 이익이 제공된다 - 를 포함하는 방법이 제공된다.

일 실시형태에서, 구강 표면은 치아 에나멜(enamel), 치아 균막(pellicle), 구강 내의 연조직(예를 들어, 잇몸, 혀) 또는 구강 생물막(예를 들어, 구강 플라크)이다.

다른 실시형태에서, 과가수분해 효소 및 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분을 포함하며, 2가지 성분이 임의로 펩티드 스페이서(spacer)에 의해 분리될 수 있는 융합 단백질(즉, "표적화된 과가수분해효소")의 사용을 포함하는 조성물 및 방법이 제공된다.

일 실시형태에서,

1) a) i) 구조

[X]_mR₅

(여기서, X는 화학식 R₆C(O)O의 에스테르기이며,

R₆은 하이드록실기 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티이고, R₆은 C2 내지 C7인 R₆에 대하여, 하나 이상의 에테르 결합을 임의로 포함하고;

ii) 구조

iii) 화학식

b) 과산소원; 및

c) 과가수분해 활성을 갖는 효소 촉매 - 상기 효소 촉매는 일반 구조

PAH-[L]_y-OCBD

또는

OCBD-[L]_y-PAH

(여기서,

PAH는 과가수분해 활성을 갖는 효소이며;

OCBD는 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이고;

L은 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 임의의 펩티드 링커이며;

y는 0 또는 1이다)을 갖는 융합 단백질을 포함한다 - 를 포함하는 반응 성분의 세트를 제공하는 단계;

융합 단백질은 리파제, 프로테아제, 에스테라제, 아실 트랜스퍼라제, 아릴 에스테라제, 탄수화물 에스테라제 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 과가수분해 효소를 포함할 수 있다.

일 실시형태에서, 융합 단백질은 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 과가수분해 아릴 에스테라제(ArE)를 포함한다. 다른 실시형태에서, 융합 단백질은 서열 번호 460으로 제공된 S54V 마이코박테리움 스메그마티스 아릴 에스테라제와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 과가수분해 효소를 포함한다.

일 실시형태에서, 융합 단백질은 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens)로부터의 과가수분해 에스테라제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 융합 단백질은 서열 번호 477로 제공된 슈도모나스 플루오레슨스 에스테라제와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 과가수분해 효소를 포함한다.

다른 실시형태에서, 융합 단백질은 서열 번호 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 476, 477, 478 및 479로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 과가수분해 효소를 포함한다.

다른 실시형태에서, 융합 단백질은 클러스털더블유를 사용하여 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 갖는 CE-7 과가수분해효소를 포함하며, 상기 시그니처 모티프는

iii) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함한다.

다른 실시형태에서, 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 바람직하게는 적어도 하나의 구강 표면-결합 펩티드를 포함하는 단쇄 펩티드이다. 추가의 실시형태에서, 구강 표면-결합 펩티드는 치아 에나멜, 치아 균막 또는 치아 에나멜 및 치아 균막 둘 모두에 대하여 친화성을 갖는 펩티드이다.

다른 실시형태에서, 하기의 일반 구조를 포함하는 융합 단백질이 제공된다:

PAH-[L]_y-OCBD

또는

OCBD-[L]_y-PAH

상기 식에서,

1) PAH는 과가수분해 활성을 갖는 효소이고;

2) OCBD는 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이며;

3) L은 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 임의의 펩티드 링커이며;

4) y는 0 또는 1이다.

PAH-[L]_y-OCBD

또는

OCBD-[L]_y-PAH

상기 식에서,

a) PAH는 과가수분해 활성을 갖는 CE-7 탄수화물 에스테라제이며, PAH는 클러스털더블유를 사용하여 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 갖고, 상기 시그니처 모티프는

iii) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함하고;

b) OCBD는 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이며;

c) L은 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 임의의 펩티드 링커이고;

d) y는 0 또는 1이다.

다른 실시형태에서,

1) 상기 임의의 과가수분해 융합 단백질을 포함하는 효소 촉매;

2) a) 구조

[X]_mR₅

(여기서, X는 화학식 R₆C(O)O의 에스테르기이며,

b) 구조

c) 화학식

d) 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 및 아세틸화 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 아세틸화 당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기질;

3) 과산소원; 및

4) 구강에 허용가능한 담체 매질을 포함하는 구강 관리 제품이 제공된다.

다른 실시형태에서,

1) 과가수분해 활성을 갖는 효소 촉매 - 상기 효소 촉매는 클러스털더블유를 사용하여 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 갖는 효소를 포함하며, 상기 시그니처 모티프는

a) 서열 번호 2의 위치 118 내지 120에 해당하는 위치에서 RGQ 모티프;

b) 서열 번호 2의 위치 179 내지 183에 해당하는 위치에서 GXSQG 모티프; 및

c) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함한다 - ;

2) a) 구조

[X]_mR₅

(여기서, X는 화학식 R₆C(O)O의 에스테르기이며,

b) 구조

c) 화학식

3) 과산소원; 및

다른 실시형태에서, 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 분리된 폴리펩티드가 제공되며, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421 및 422로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.

다른 실시형태에서, 구강 관리 제품에서 구강 물질/표면의 탈색, 미백, 소독, 탈염, 탈취 또는 생물막의 제거를 위한 유효 농도의 적어도 하나의 과산을 생성하기 위한 과가수분해 활성을 갖는 CE-7 탄수화물 에스테라제의 용도도 또한 제공된다.

다른 실시형태에서,

a) 과가수분해 활성을 갖는 효소 촉매 - 상기 효소 촉매는 클러스털더블유를 사용하여 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 갖는 효소를 포함하며, 상기 시그니처 모티프는

ii) 서열ㅌ번호 2의 위치 179 내지 183에 해당하는 위치에서 GXSQG 모티프; 및

iii) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함한다 - ;

b) 1) 구조

[X]_mR₅

(여기서, X는 화학식 R₆C(O)O의 에스테르기이며,

2) 구조

3) 화학식

d) 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 및 아세틸화 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 아세틸화 당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기질; 및

c) 과산소원을 포함하는 - 이에 의해, (a), (b) 및 (c)의 동시의 또는 단계적 방식(그러나, 특정 순서 없이)의 혼합 시에 과산이 생성된다 - 치아 우식증, 치은염, 구강 칸디다증 또는 치근막염의 치료 또는 예방을 위한 과산 생성 조성물의 용도가 제공된다.

다른 실시형태에서, 구강 제품에서 하기의 일반 구조를 포함하는 융합 단백질의 용도가 제공된다:

PAH-[L]_y-OCBD

또는

OCBD-[L]_y-PAH

상기 식에서,

1) PAH는 서열 번호 460과 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 과가수분해 활성을 갖는 효소이고;

3) L은 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 펩티드 링커이며;

4) y는 0 또는 1이다.

본 명세서에 기재된 일부 에스테르 기질(표 20)은 특히 과산화수소와 반응 시에 화학적으로 과가수분해되어, 과아세트산을 생성하기 쉽다. 다른 실시형태에서, 1,2,3,5-테트라-O-아세틸-리보푸라노스; 1,2,3,4-테트라-O-아세틸-리보피라노스; 2-아세트아미도-2-데옥시-1,3,4,6-테트라아세틸-β-D-글루코피라노스; β-D-글루코피라노스, 1,2,3,4-테트라아세테이트; 2,3,4,6-테트라아세틸-β-D-글루코피라노스; 1,3,4,6-테트라-O-아세틸-만노피라노스; 및 α-D-만노피라노스 펜타아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 과산 전구체를 포함하는 개인 관리 제품이 제공된다. 바람직한 실시형태에서, 개인 관리 제품은 구강 관리 제품이다.

다른 실시형태에서,

a) i) 1,2,3,5-테트라-O-아세틸-리보푸라노스; 1,2,3,4-테트라-O-아세틸-리보피라노스; 2-아세트아미도-2-데옥시-1,3,4,6-테트라아세틸-β-D-글루코피라노스; β-D-글루코피라노스, 1,2,3,4-테트라아세테이트; 2,3,4,6-테트라아세틸-β-D-글루코피라노스; 1,3,4,6-테트라-O-아세틸-만노피라노스; 및 α-D-만노피라노스 펜타아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 과산 전구체; 및

ii) 과산소원을 포함하는 반응 성분의 세트를 제공하는 단계;

b) 체표면을 물의 존재 하에 반응 성분의 세트를 배합하여 생성된 유효량의 과아세트산과 접촉시키는 단계 - 이에 의해, 과아세트산은 체표면에 이익을 제공한다 - 를 포함하는 방법도 또한 제공된다. 바람직한 태양에서, 상기 방법에서 체표면은 구강 조직, 예를 들어, 치아 및/또는 잇몸이다.

생물학적 서열의 간단한 설명

하기의 서열들은 37 C.F.R. §§ 1.821-1.825("뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열 개시를 포함하는 특허출원에 관한 요건 - 서열 규정")를 따르며 세계지적재산권기구(World Intellectual Property Organization, WIPO) 표준 ST.25(2009), 및 유럽 특허 조약(EPC) 및 특허 협력 조약(PCT)의 서열 목록 요건(규정 5.2 및 49.5(a-bis)) 및 시행세칙의 섹션 208 및 부칙 C에 부합한다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 데이터에 사용된 기호 및 체제는 37 C.F.R. §1.822에 제시된 규정을 따른다.

서열 번호 1은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ATCC(등록 상표) 31954(상표명)로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 2는 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 31954(상표명)로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 3은 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 균주 168로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 4는 바실러스 서브틸리스 아종 서브틸리스 균주 168로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 5는 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표)6633(상표명)으로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 6은 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표)6633(상표명)으로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 7은 바실러스 리케니포르미스(B. licheniformis) ATCC(등록 상표) 14580(상표명)으로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 8은 바실러스 리케니포르미스 ATCC(등록 상표) 14580(상표명)으로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 9는 바실러스 푸밀러스(B. pumilus) PS213으로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 10은 바실러스 푸밀러스 PS213으로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 11은 클로스트리듐 써모셀룸(Clostridium thermocellum) ATCC(등록 상표) 27405(상표명)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 12는 클로스트리듐 써모셀룸 ATCC(등록 상표) 27405(상표명)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 13은 써모토가 네아폴리타나(Thermotoga neapolitana)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 14는 써모토가 네아폴리타나로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 15는 써모토가 마리티마(Thermotoga maritima) MSB8로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 16은 써모토가 마리티마 MSB8로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 17은 써모아나에로박테리움(Thermoanaerobacterium) 종 JW/SL YS485로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 18은 써모아나에로박테리움 종 JW/SL YS485로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 19는 바실러스 종 NRRL B-14911로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 핵산 서열이다. 진뱅크(GENBANK)(등록 상표) 수탁 번호 ZP_01168674에 보고된 바와 같이, 바실러스 종 NRRL B-14911로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열이 다른 세팔로스포린 C 데아세틸라제와의 서열 정렬, 및 보고된 길이(340개 아미노산) 대 다른 CAH 효소의 관찰된 길이(전형적으로, 길이가 318 내지 325개 아미노산; 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제US-2010-0087528-A1호 참조)의 비교에 기초하여, 아마도 부정확할 것 같은 15개 아미노산 N-말단 부가물을 암호화하는 것으로 보이는 것에 주의해야 한다. 이와 같이, 본 명세서에 보고된 바와 같은 핵산 서열은 진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 ZP_01168674 하에 보고된 N-말단 15개 아미노산이 없는 바실러스 종 NRRL B-14911로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제 서열을 암호화한다.

서열 번호 20은 서열 번호 19의 핵산 서열에 의해 암호화되는 바실러스 종 NRRL B-14911로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 21은 바실러스 할로두란스(Bacillus halodurans) C-125로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 22는 바실러스 할로두란스 C-125로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 23은 바실러스 클라우시이(Bacillus clausii) KSM-K16으로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 24는 바실러스 클라우시이 KSM-K16으로부터의 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 25는 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 29233(상표명) 세팔로스포린 C 데아세틸라제(CAH)를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 26은 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 29233(상표명) 세팔로스포린 C 데아세틸라제(CAH)의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 27은 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호(본 명세서에 그 전문이 참고로 포함)로부터의 써모토가 네아폴리타나 아세틸 자일란 에스테라제 변이체의 추정된 아미노산 서열(여기서, 위치 277에서의 Xaa 잔기는 Ala, Val, Ser 또는 Thr이다)이다.

서열 번호 28은 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호로부터의 써모토가 마리티마 MSB8 아세틸 자일란 에스테라제 변이체의 추정된 아미노산 서열(여기서, 위치 277에서의 Xaa 잔기는 Ala, Val, Ser 또는 Thr이다)이다.

서열 번호 29는 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호로부터의 써모토가 레틴가에(Thermotoga lettingae) 아세틸 자일란 에스테라제 변이체의 추정된 아미노산 서열(여기서, 위치 277에서의 Xaa 잔기는 Ala, Val, Ser 또는 Thr이다)이다.

서열 번호 30은 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호로부터의 써모토가 페트로필라(Thermotoga petrophila) 아세틸 자일란 에스테라제 변이체의 추정된 아미노산 서열(여기서, 위치 277에서의 Xaa 잔기는 Ala, Val, Ser 또는 Thr이다)이다.

서열 번호 31은 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호로부터의 "RQ2(a)" 유래의 써모토가 종 RQ2 아세틸 자일란 에스테라제 변이체의 추정된 아미노산 서열(여기서, 위치 277에서의 Xaa 잔기는 Ala, Val, Ser 또는 Thr이다)이다.

서열 번호 32는 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호로부터의 "RQ2(b)" 유래의 써모토가 종 RQ2 아세틸 자일란 에스테라제 변이체의 추정된 아미노산 서열(여기서, 위치 278에서의 Xaa 잔기는 Ala, Val, Ser 또는 Thr이다)이다.

서열 번호 33은 써모토가 레틴가에 아세틸 자일란 에스테라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 34는 써모토가 페트로필라 아세틸 자일란 에스테라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 35는 본 명세서에서 "RQ2(a)"로 기재된 써모토가 종 RQ2로부터의 제1 아세틸 자일란 에스테라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 36은 본 명세서에서 "RQ2(b)"로 기재된 써모토가 종 RQ2로부터의 제2 아세틸 자일란 에스테라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 37은 써모아네아로박테리움 사카롤리티쿰(Thermoanearobacterium saccharolyticum) 세팔로스포린 C 데아세틸라제를 암호화하는 코돈 최적화된 핵산 서열이다.

서열 번호 38은 써모아네아로박테리움 사카롤리티쿰 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 추정된 아미노산 서열이다.

서열 번호 39는 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열(진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 EU255910)이다.

서열 번호 40은 락토코커스 락티스로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열(진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 ABX75634.1)이다.

서열 번호 41은 메소리조비움 로티(Mesorhizobium loti)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열(진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 NC_002678.2)이다.

서열 번호 42는 메소리조비움 로티로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열(진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 BAB53179.1)이다.

서열 번호 43은 게오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus)로부터의 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열(진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 AF038547.2)이다.

서열 번호 44는 게오바실러스 스테아로써모필러스로부터의 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열(진뱅크(등록 상표) 수탁 번호 AAF70202.1)이다.

서열 번호 45는 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 대하여 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제(변이체 "A3")를 암호화하는 핵산 서열이다: (F24I/S35T/Q179L/N275D/C277S/S308G/F317S).

서열 번호 46은 "A3" 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 47은 N275D/C277S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 48은 N275D/C277S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 49는 C277S/F317S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 50은 C277S/F317S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 51은 S35T/C277S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 52는 S35T/C277S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 53은 Q179L/C277S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제를 암호화하는 핵산 서열이다.

서열 번호 54는 Q179L/C277S 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 55는 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 대하여 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 843H9를 암호화하는 핵산 서열이다: (L8R/L125Q/Q176L/V183D/F247I/C277S/P292L).

서열 번호 56은 843H9 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 57은 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 대하여 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 843F12를 암호화하는 핵산 서열이다: K77E/A266E/C277S.

서열 번호 58은 843F12 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 59는 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 대하여 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 843C12를 암호화하는 핵산 서열이다: F27Y/I149V/A266V/C277S/I295T/N302S.

서열 번호 60은 843C12 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 61은 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 대하여 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 842H3을 암호화하는 핵산 서열이다: L195Q/C277S.

서열 번호 62는 842H3 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 63은 야생형 써모토가 마리티마 아세틸 자일란 에스테라제 아미노산 서열에 대하여 하기의 치환을 갖는 변이체 아세틸 자일란 에스테라제 841A7을 암호화하는 핵산 서열이다: Y110F/C277S.

서열 번호 64는 841A7 변이체 아세틸 자일란 에스테라제의 아미노산 서열이다.

서열 번호 65 내지 221, 271 및 368은 모발에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 아미노산 서열의 비제한적인 목록이다.

서열 번호 217 내지 269는 피부에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 아미노산 서열이다.

서열 번호 270 및 271은 네일(nail)에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 아미노산 서열이다.

서열 번호 272 내지 382는 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드의 아미노산 서열이다. 서열 번호 272 내지 291 및 312 내지 382는 치아 균막에 대하여 친화성을 갖는다. 서열 번호 292 내지 311은 치아 에나멜에 대하여 친화성을 갖는다.

서열 번호 383 내지 396은 펩티드 링커/스페이서의 아미노산 서열이다.

서열 번호 397은 발현 플라스미드 pLD001의 핵산 서열이다.

서열 번호 398은 시퀀싱(sequencing) 프라이머의 핵산 서열이다.

서열 번호 399 내지 410은 실시예 2로부터의 치아 에나멜-결합 및 치아 균막-결합 펩티드의 아미노산 서열이다.

서열 번호 411은 표 4에 나타낸 바와 같이 C-말단 라이신이 있는 치아-결합 펩티드 DenP03의 아미노산 서열이다.

서열 번호 412 내지 422는 표 4에 나타낸 바와 같이 C-말단 라이신을 갖는 치아 에나멜-결합 펩티드 및 치아 균막-결합 펩티드의 아미노산 서열이다.

서열 번호 423은 펩티드 HC263의 아미노산 서열이다.

서열 번호 424는 본 출원에서 효소 "EZ-1"로도 지칭되는 써모토가 마리티마 변이체 C277S의 아미노산 서열이다.

서열 번호 425 내지 430 및 437 내지 467 및 479는 표 5 및/또는 표 6에 개시된 바와 같은 다양한 과가수분해효소 구축물의 아미노산 서열이다.

서열 번호 431 내지 436 및 468 내지 475는 실시예 4에 개시된 다양한 표적화 서열의 아미노산 서열이다.

서열 번호 476은 하기의 치환을 갖는 써모토가 마리티마 변이체 HTS-007-D5의 아미노산 서열이다: C277T/R296P.

서열 번호 477은 과가수분해 활성을 갖는 슈도모나스 플루오레슨스 에스테라제의 아미노산 서열이다(미국 특허 제7,384,787호; "L29P" 변이체). 치환의 넘버링이 처음의 메티오닌 잔기를 포함하지 않는 개시된 특허로부터 이어짐을 주의한다. 서열 번호 477은 처음의 메티오닌이 본 서열에 포함되기 때문에, 잔기 위치 번호 30에서 L29P 치환을 포함한다).

서열 번호 478은 야생형 마이코박테리움 스메그마티스 아릴 에스테라제의 아미노산 서열이다(미국 특허 제7,754,460호).

본 개시내용에서, 다수의 용어 및 약어가 사용된다. 하기의 정의는 특별히 다르게 언급되지 않는 한 적용된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 요소 또는 성분 앞의 부정 관사("a", "an") 및 정관사("the")는 요소 또는 성분의 경우(즉, 발생)의 수에 관해서는 비제한적인 것으로 의도된다. 따라서, 부정 관사("a", "an") 및 정관사("the")는 하나 또는 적어도 하나를 포함하는 것으로 파악되어야 하며, 요소 또는 성분의 단수형은 그 수가 명백하게 단수임을 의미하는 것이 아니라면 복수형도 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는"은 특허청구범위에서 인용된 바와 같은 언급된 특징, 정수, 단계, 또는 성분의 존재를 의미하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 성분 또는 그의 그룹의 존재 또는 부가를 배제하지 않는다. 용어 "포함하는"은 용어 "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진"에 의해 포함되는 실시형태를 포함하고자 한다. 유사하게, 용어 "본질적으로 이루어진"은 용어 "이루어진"에 의해 포함되는 실시형태를 포함하고자 한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 사용되는 성분 또는 반응물질의 양을 수식하는 용어 "약"은 예를 들어, 현장에서 농축물 또는 사용 용액을 제조하는 데 사용되는 전형적인 측정 및 액체 취급 절차를 통해; 이들 과정에서의 우발적인 오차를 통해; 조성물을 제조하거나 방법을 실행하기 위해 적용된 성분의 제조, 공급원 또는 순도의 차이 등을 통해 발생할 수 있는 수치 분량의 변이를 말한다. 용어 "약"은 또한 특정 초기 혼합물로부터 유발되는 조성물에 대한 상이한 평형 조건으로 인해 달라지는 양을 포함한다. 용어 "약"에 의한 수식 여부를 불문하고, 특허청구범위는 분량의 균등물을 포함한다.

모든 범위는 존재하는 경우 포괄적이며 조합가능하다. 예를 들어, "1 내지 5"의 범위가 기재되는 경우, 기재된 범위는 범위 "1 내지 4", "1 내지 3", "1 내지 2", "1 내지 2 및 4 내지 5", "1 내지 3 및 5" 등을 포함하는 것으로 간주되어야 한다.

본 명세서에서 사용되는 "접촉"은 원하는 결과(표적 표면 결합, 과산 기반의 효과 등)를 달성하는데 충분한 기간 동안 조성물을 표적 체표면과 접촉하게 배치하는 것을 말한다 일 실시형태에서, "접촉"은 원하는 결과를 달성하는데 충분한 기간 동안 유효 농도의 과산을 포함하는(또는 이를 생성할 수 있는) 조성물을 표적 체표면과 접촉하게 배치하는 것을 말할 수 있다. 다른 실시형태에서, "접촉"은 또한 개인 관리 조성물의 적어도 하나의 성분, 예를 들어, 효소에 의한 과가수분해에 사용되는 하나 이상의 반응 성분을 표적 체표면과 접촉하게 배치하는 것을 말할 수 있다. 접촉은 유효 농도의 과산을 포함하는 과산 용액 또는 조성물, 유효 농도의 과산을 형성하는 용액 또는 조성물, 또는 유효 농도의 과산을 형성하는 조성물의 한 성분의 체표면으로의 분무, 처리, 침지, 플러싱(flushing), 그의 위 또는 안으로의 주입, 혼합, 조합, 페인팅, 코팅, 도포, 부착 및 다르게는 전달을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "기질", "적절한 기질" 및 "카르복실산 에스테르 기질"은 상호교환적으로, 구체적으로

(a) 구조

[X]_mR₅

(여기서,

X는 화학식 R₆C(O)O의 에스테르기이며;

R₅는 하이드록실기로 임의로 치환된 C1 내지 C6 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티 또는 5-원 환형 헤테로방향족 모이어티, 또는 6-원 환형 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티이며; R₅에서 각 탄소 원자는 각각 1개 이하의 하이드록실기 또는 1개 이하의 에스테르기 를 포함하고; R₅는 임의로 하나 이상의 에테르 결합을 포함하며;

m은 1 내지 R₅에서의 탄소 원자수 범위의 정수이다)를 갖는 에스테르 - 상기 하나 이상의 에스테르는 25℃에서 적어도 5 ppm의 수 용해도를 갖는다 - ; 또는

(b) 구조

(여기서, R₁은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R₃ 및 R₄는 각각 H 또는 R₁C(O)이다)를 갖는 하나 이상의 글리세리드; 또는

(c) 화학식

(여기서, R₁은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R₂는 C1 내지 C10 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴, (CH₂CH₂O)_n 또는 (CH₂CH(CH₃)-O)_nH이고, n은 1 내지 10이다)의 하나 이상의 에스테르; 또는

(d) 하나 이상의 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 또는 아세틸화 다당류; 또는

(e) (a) 내지 (d)의 임의의 조합을 말한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "과산"은 퍼옥시산, 퍼옥시카르복실산, 퍼옥시산, 퍼카르복실산 및 퍼옥소산과 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "과아세트산"은 "PAA"로 약칭되며, 퍼옥시아세트산, 에탄퍼옥소산 및 CAS 등록 번호 79-21-0의 모든 다른 유의어와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "모노아세틴"은 글리세롤 모노아세테이트, 글리세린 모노아세테이트 및 글리세릴 모노아세테이트와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "다이아세틴"은 글리세롤 다이아세테이트; 글리세린 다이아세테이트, 글리세릴 다이아세테이트 및 CAS 등록 번호 25395-31-7의 모든 다른 유의어와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "트라이아세틴"은 글리세린 트라이아세테이트; 글리세롤 트라이아세테이트; 글리세릴 트라이아세테이트, 1,2,3-트라이아세톡시프로판; 1,2,3-프로판트라이올 트라이아세테이트 및 CAS 등록 번호 102-76-1의 모든 다른 유의어와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "모노부티린"은 글리세롤 모노부티레이트, 글리세린 모노부티레이트 및 글리세릴 모노부티레이트와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "다이부티린"은 글리세롤 다이부티레이트 및 글리세릴 다이부티레이트와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "트라이부티린"은 글리세롤 트라이부티레이트, 1,2,3-트라이부티릴글리세롤 및 CAS 등록 번호 60-01-5의 모든 다른 유의어와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "모노프로피오닌"은 글리세롤 모노프로피오네이트, 글리세린 모노프로피오네이트 및 글리세릴 모노프로피오네이트와 같은 의미이다.

본 명세서에 사용되는 용어 "다이프로피오닌"은 글리세롤 다이프로피오네이트 및 글리세릴 다이프로피오네이트와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "트라이프로피오닌"은 글리세릴 트라이프로피오네이트, 글리세롤 트라이프로피오네이트, 1,2,3-트라이프로피오닐글리세롤 및 CAS 등록 번호 139-45-7의 모든 다른 유의어와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "아세틸화 당" 및 "아세틸화 당류"는 적어도 하나의 아세틸기를 포함하는 단당류, 이당류 및 다당류를 말한다. 예에는, 글루코스 펜타아세테이트; 자일로스 테트라아세테이트; 아세틸화 자일란; 아세틸화 자일란 단편; β-D-리보푸라노스-1,2,3,5-테트라아세테이트; 트라이-O-아세틸-D-갈락탈; 및 트라이-O-아세틸-글루칼이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "하이드로카르빌", "하이드로카르빌기" 및 "하이드로카르빌 모이어티"는 단일, 이중 또는 삼중 탄소-탄소 결합 및/또는 에테르 결합으로 연결되고, 이에 따라 수소 원자로 치환된 직쇄, 분지형 또는 환형 배열의 탄소 원자를 의미한다. 이러한 하이드로카르빌기는 지방족 및/또는 방향족일 수 있다. 하이드로카르빌기의 예에는 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, t-부틸, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 펜틸, 사이클로펜틸, 메틸사이클로펜틸, 헥실, 사이클로헥실, 벤질 및 페닐이 포함된다. 바람직한 실시형태에서, 하이드로카르빌 모이어티는 단일 탄소-탄소 결합 및/또는 에테르 결합으로 연결되고 이에 따라 수소 원자로 치환된 직쇄, 분지형 또는 환형 배열의 탄소 원자이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 1,2-에탄다이올; 1,2-프로판다이올; 1,3-프로판다이올; 1,2-부탄다이올; 1,3-부탄다이올; 2,3-부탄다이올; 1,4-부탄다이올; 1,2-펜탄다이올; 2,5-펜탄다이올; 1,5-펜탄다이올; 1,6-펜탄다이올; 1,2-헥산다이올; 2,5-헥산다이올; 1,6-헥산다이올의 "모노에스테르" 및 "다이에스테르" 및 그들의 혼합물은 화학식 RC(O)O(여기서, R은 C1 내지 C7 선형 하이드로카르빌 모이어티이다)의 적어도 하나의 에스테르기를 포함하는 상기 화합물을 말한다. 일 실시형태에서, 카르복실산 에스테르 기질은 프로필렌 글리콜 다이아세테이트(PGDA), 에틸렌 글리콜 다이아세테이트(EDGA) 및 그들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프로필렌 글리콜 다이아세테이트"는 1,2-다이아세톡시프로판, 프로필렌 다이아세테이트, 1,2-프로판다이올 다이아세테이트 및 CAS 등록 번호 623-84-7의 모든 다른 유의어와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "에틸렌 글리콜 다이아세테이트"는 1,2-다이아세톡시에탄, 에틸렌 다이아세테이트, 글리콜 다이아세테이트 및 CAS 등록 번호 111-55-7의 모든 다른 유의어와 같은 의미이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "적절한 효소적 반응 혼합물", "과산의 동소 생성에 적절한 성분", "적절한 반응 성분", "적절한 수성 반응 혼합물", "반응 혼합물" 및 "과산-생성 성분"은 반응물질 및 과가수분해 효소 촉매가 접촉되는 물질 및 물을 말한다. 과산-생성 성분은 적어도 과가수분해 활성을 갖는 효소를 포함하는 것이며, 바람직하게는 과가수분해 효소는 적어도 하나의 CE-7 과가수분해효소(임의로, 체표면에 표적화된 융합 단백질 형태), 적어도 하나의 적절한 카르복실산 에스테르 기질, 과산소원 및 물(과산소원, 예를 들어 과산화수소를 포함하는 수용액)이다. 일 실시형태에서, CE-7 탄수화물 에스테라제의 분류에 속하지 않는 임의의 과가수분해 효소는 조건부로, 표적 표면, 바람직하게는 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 적어도 하나의 펩티드 성분을 갖는 융합 단백질의 형태로 사용될 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "과가수분해"는 과산을 형성하기 위한 선택된 기질과 과산화물의 반응으로 정의된다. 전형적으로, 무기 과산화물은 촉매의 존재 하에 선택된 기질과 반응하여, 퍼옥시카르복실산을 생성한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "화학적 과가수분해"는 기질(퍼옥시카르복실산 전구체)을 과산화수소원과 배합하는 과가수분해 반응을 포함하며, 퍼옥시카르복실산은 효소 촉매의 부재 하에 형성된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "효소에 의한 과가수분해"는 카르복실산 에스테르 기질(과산 전구체)을 과산화수소원 및 물과 배합하여, 효소 촉매가 과산의 형성을 촉매작용시키는 과가수분해 반응을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "과가수분해효소 활성"은 단백질, 건조 세포 중량 또는 고정화된 촉매 중량의 단위 질량(예를 들어, 밀리그램)당 촉매 활성을 말한다.

본 명세서에서 사용되는 "효소 활성 1 유닛" 또는 "활성 1 유닛" 또는 "U"는 특정 온도에서 분당 1 μmol의 퍼옥시카르복실산 생성물의 생성에 필요한 과가수분해효소 활성의 양으로 정의된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "효소 촉매" 및 "과가수분해효소 촉매"는 과가수분해 활성을 갖는 효소를 포함하는 촉매를 말하며, 온전한 미생물 세포, 투과화된(permeabilized) 미생물 세포(들), 미생물 세포 추출물의 하나 이상의 세포 성분, 부분 정제된 효소 또는 정제된 효소의 형태일 수 있다. 또한, 효소 촉매는 화학적으로 변형될 수 있다(예를 들어, 페길화(pegylation)에 의하여 또는 가교 결합 시약과의 반응에 의하여). 또한, 과가수분해효소 촉매는 당업자에게 널리 공지되어 있는 방법을 사용하여 용해성 또는 불용성 지지체 상에 고정화될 수 있으며; 예를 들어, 문헌[Immobilization of Enzymes and Cells; Gordon F. Bickerstaff, Editor; Humana Press, Totowa, NJ, USA; 1997]을 참조한다. 일 실시형태에서, 과가수분해효소 촉매는 구강 관리 스트립(예를 들어, 화이트닝 스트립(whitening strip)) 또는 덴탈 트레이(dental tray) 내에 또는 그 상에 비-공유적으로 또는 공유적으로 고정화될 수 있다. 고정화된 효소는 구강 관리 스트립 또는 덴탈 트레이(예를 들어, 이산화티탄, 수산화인회석, 구강에 허용가능한 접착제, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 등) 내에서 폴리머 지지체 및/또는 성분에 직접 결합될 수 있다. 추가의 실시형태에서, 스트립 또는 덴탈 트레이에 대한 비-공유적 고정화는 스트립 또는 트레이 내의 또는 그 상의 물질에 대하여 강력한 친화성을 갖는 펩티드 결합 도메인(예를 들어, 임의의 펩티드 스페이서를 통해 펩티드 결합 도메인에 결합된 과가수분해 효소를 포함하는 융합 단백질)의 사용을 통해 이루어질 수 있다. 다른 실시형태에서, 덴탈 트레이는 변형가능한 트레이이다. 추가의 실시형태에서, 과가수분해효소 촉매는 치과용 인상(dental impression)의 형성 후에 변형가능한 트레이 내에서 또는 그 상에서 고정화된다.

본 명세서에 사용되는 "아세틸 자일란 에스테라제"는 아세틸화 자일란 및 기타 아세틸화 당류의 탈아세틸화를 촉매작용시키는 효소(E.C. 3.1.1.72; AXE)를 말한다. 본 명세서에 예시된 바와 같이, 유의미한 과가수분해 활성을 갖는 아세틸 자일란 에스테라제로 분류되는 몇몇 효소가 제공된다.

본 명세서에 사용되는 용어 "세팔로스포린 C 데아세틸라제" 및 "세팔로스포린 C 아세틸 가수분해효소"는 세팔로스포린, 예를 들어, 세팔로스포린 C 및 7-아미노세팔로스포란산의 탈아세틸화를 촉매작용시키는 효소(E.C. 3.1.1.41)를 말한다(문헌[Mitsushima et al., (1995) Appl. Env. Microbiol. 61(6):2224-2229]). 유의미한 과가수분해 활성을 갖는 몇몇 세팔로스포린 C 데아세틸라제의 아미노산 서열이 본 명세서에 제공된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 31954(상표명)"는 국제 기탁소 수탁 번호가 ATCC(등록 상표) 31954(상표명)인 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(ATCC)에 기탁된 박테리아 세포를 말한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 31954(상표명)로부터의 유의미한 과가수분해효소 활성을 갖는 효소는 서열 번호 2로 제공된다(미국 특허 출원 공개 제2010-0041752호 참조).

본 명세서에 사용되는 용어 "써모토가 마리티마 MSB8"은 아세틸 자일란 에스테라제 활성을 갖는 것으로 보고된 박테리아 세포이다(진뱅크(등록 상표) NP_227893.1; 미국 특허 출원 공개 제2008-0176299호 참조). 써모토가 마리티마 MSB8로부터의 과가수분해효소 활성을 갖는 효소의 아미노산 서열은 서열 번호 16으로 제공되어 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "분리된 핵산 분자", "분리된 폴리뉴클레오티드" 및 "분리된 핵산 단편"은 상호호환적으로 사용될 것이며, 임의로 합성, 비-천연 또는 변경된 뉴클레오티드 염기를 함유하는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 RNA 또는 DNA의 폴리머를 지칭할 것이다. DNA의 폴리머 형태인 분리된 핵산 분자는 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 하나 이상의 세그먼트로 이루어질 수 있다.

용어 "아미노산"은 단백질 또는 폴리펩티드의 기본 화학 구조 단위를 지칭한다. 하기의 약어는 특정 아미노산을 확인하기 위해 본 명세서에서 사용된다.

예를 들어, 주어진 부위에 화학적으로 균등한 아미노산의 생성을 유발하면서 암호화된 단백질의 기능적 특성에 영향을 미치지 않는 유전자의 변경이 흔하다는 것은 당업계에 주지되어 있다. 본 발명의 목적상, 치환은 하기 5 개 그룹 중 하나의 그룹 내에서의 교환으로 정의된다:

1. 비극성 또는 약간 극성인 작은 지방족 잔기: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);

2. 음으로 하전된 극성 잔기 및 그의 아미드: Asp, Asn, Glu, Gln;

3. 양으로 하전된 극성 잔기: His, Arg, Lys;

4. 비극성인 큰 지방족 잔기: Met, Leu, Ile, Val (Cys); 및

5. 큰 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp.

따라서, 소수성 아미노산인 아미노산 알라닌에 대한 코돈은 소수성이 보다 낮은 다른 잔기(예를 들어, 글리신) 또는 소수성이 보다 높은 잔기(예를 들어, 발린, 류신 또는 아이소류신)를 암호화하는 코돈으로 치환될 수 있다. 마찬가지로, 음으로 하전된 하나의 잔기로 다른 하나를 치환하거나(예를 들어 글루탐산을 아스파르트산으로) 양으로 하전된 하나의 잔기로 다른 하나를 치환하는(예를 들어, 아르기닌을 라이신으로) 변화도 기능적으로 균등한 생성물을 생성시키는 것으로 예상될 수 있다. 많은 경우에, 단백질 분자의 N-말단 및 C-말단 부분의 변경을 유발하는 뉴클레오티드 변화도 단백질의 활성을 변경하지 않을 것으로 예상된다. 각각의 제안된 변형은 당업계의 통상적 기술로 충분히 가능하며, 암호화된 생성물의 생물학적 활성의 보유를 결정하는 것도 그러하다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "시그니처 모티프" 및 "진단 모티프"는 정의된 활성을 갖는 효소의 패밀리 중에 공유되는 보존된 구조를 지칭한다. 시그니처 모티프를 사용하여, 정의된 기질의 패밀리에 대하여 유사한 효소 활성을 갖는 구조적으로 관련된 효소의 패밀리를 정의하고/거나 동정할 수 있다. 시그니처 모티브는 단일의 연속 아미노산 서열 또는 함께 시그니처 모티프를 형성하는 보존된 불연속 모티프의 집합일 수 있다. 전형적으로, 보존된 모티프(들)는 아미노산 서열로 나타낸다. 일 실시형태에서, 과가수분해 효소는 CE-7 탄수화물 에스테라제 시그니처 모티프를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "코돈 최적화된"은 그것이 다양한 숙주의 형질전환을 위한 핵산 분자의 유전자 또는 암호화 영역을 지칭하기 때문에, DNA가 암호화하는 폴리펩티드를 변경시키지 않고, 숙주 유기체의 전형적인 코돈 사용을 반영하기 위한 핵산 분자의 유전자 또는 암호화 영역에서의 코돈의 변경을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 "합성 유전자"는 당업자에게 공지되어 있는 절차를 사용하여 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 빌딩 블록(building block)으로부터 조립될 수 있다. 이들 빌딩 블록을 라이게이션시키고 어닐링시켜, 유전자 세그먼트를 형성하고, 이어서, 이를 효소에 의해 조립하여 전체 유전자를 구축한다. DNA 서열에 관계된 바와 같은 "화학적으로 합성된"은 뉴클레오티드 성분이 시험관 내에서 조립되는 것을 의미한다. DNA의 수동의 화학적 합성은 널리 확립되어 있는 절차를 사용하여 달성될 수 있거나, 자동화된 화학적 합성은 다수의 상업적으로 입수할 수 있는 장치 중 하나를 사용하여 수행할 수 있다. 따라서, 유전자는 숙주 세포의 코돈 편향을 반영하기 위한 뉴클레오티드 서열의 최적화에 기초하여 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다. 당업자는 코돈 사용이 숙주가 선호하는 코돈에 편향된다면, 성공적인 유전자 발현이 가능함을 인식한다. 바람직한 코돈의 결정은 서열 정보를 이용할 수 있는 숙주 세포 유래의 유전자의 조사에 기초할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "유전자"는 암호화 서열에 앞서는 조절 서열(5' 비암호화 서열) 및 암호화 서열에 뒤따르는 조절 서열(3' 비암호화 서열)을 포함하는, 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 말한다. "천연 유전자"는 그 자체의 조절 서열과 함께 자연에서 발견되는 유전자를 지칭한다. "키메라 유전자"는 자연에서 함께 발견되지 않는 조절 및 암호화 서열을 포함하는, 천연 유전자가 아닌 임의의 유전자를 지칭한다. 따라서, 키메라 유전자는 상이한 공급원 유래의 조절 서열과 암호화 서열, 또는 동일한 공급원 유래이지만, 자연에서 발견되는 것과 상이한 방식으로 배열된 조절 서열과 암호화 서열을 포함할 수 있다. "내인성 유전자"는 유기체의 게놈에서 그의 자연적 위치에 있는 천연 유전자를 지칭한다. "외래" 유전자는 숙주 유기체 내에서 정상적으로 발견되는 것이 아니라 유전자 전달에 의해 숙주 유기체 내로 도입된 유전자를 지칭한다. 외래 유전자는 비-천연 유기체 내로 삽입된 천연 유전자, 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다. "트랜스유전자(transgene)"는 형질전환 절차에 의해 게놈 내로 도입된 유전자이다.

본 명세서에 사용되는 "암호화 서열"은 특정 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열을 말한다. "적절한 조절 서열"은 암호화 서열의 상류(5' 비-암호화 서열), 암호화 서열의 내부 또는 암호화 서열의 하류(3' 비-암호화 서열)에 위치하고, 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성 또는 연계된 암호화 서열의 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 서열(translation leader sequence), RNA 프로세싱 부위, 이펙터(effector) 결합 부위 및 스템-루프 구조(stem-loop structure)를 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 용어 "작동가능하게 연결된"은 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받게 하는 단일의 핵산 분자 상의 핵산 서열의 회합을 말한다. 예를 들어, 프로모터는 그것이 암호화 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있는 경우, 다시 말하면, 암호화 서열이 프로모터의 전사적 제어 하에 있는 경우, 그 암호화 서열과 작동가능하게 연결된다. 암호화 서열은 센스 또는 안티센스 배향으로 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 용어 "발현"은 본 발명의 핵산 분자로부터 유래된 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 말한다. 또한, 발현은 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 말할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "형질전환"은 핵산 분자가 숙주 유기체의 게놈으로 전달되어, 유전적으로 안정한 유전성이 야기되는 것을 말한다. 본 발명에서, 숙주 세포의 게놈은 염색체 및 염색체외(예를 들어, 플라스미드) 유전자를 포함한다. 형질전환된 핵산 분자를 포함하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉", "재조합" 또는 "형질전환된" 유기체로 지칭된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "서열 분석 소프트웨어"는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 분석하는데 유용한 임의의 컴퓨터 알고리듬 또는 소프트웨어 프로그램을 지칭한다. "서열 분석 소프트웨어"는 상업적으로 입수할 수 있거나 독립적으로 개발할 수 있다. 통상적인 서열 분석 소프트웨어는 GCG 프로그램 모음(위스콘신 패키지 버전 9.0, 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 악셀리즈 소프트웨어 코포레이션(Accelrys Software Corp.)), BLASTP, BLASTN, BLASTX(문헌[Altschul et al., J. Mol Biol. 215:403-410 (1990)]) 및 DNASTAR(미국 위스콘신주 53715 파크 스트리트 매디슨 1228 S 소재의 디엔에이스타, 인포레이티드(DNASTAR, Inc.)), 클러스털더블유(예를 들어, 버전 1.83; 문헌[Thompson et al ., Nucleic Acids Research, 22(22):4673-4680 (1994)]) 및 스미스 워터만 알고리듬(Smith-Waterman algorithm)이 통합된 FASTA 프로그램(문헌[W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s): Suhai, Sandor. Publisher: Plenum, New York, NY]), 벡터(Vector) NTI (미국 메릴랜드주 베데스다 소재의 인포맥스(Informax)) 및 시퀀처(Sequencher) v. 4.05를 포함할 것이나 이들에 한정되지 않는다. 본 출원과 관련하여, 서열 분석 소프트웨어가 분석을 위해 사용된 경우에는, 그 분석 결과가 달리 명시되지 않는 한, 참조한 프로그램의 "디폴트 값"에 기초할 것임을 이해할 것이다. 본 명세서에서 사용된 "디폴트 값"은 최초 초기화할 때에 소프트웨어에 원래 로딩된 소프트웨어 제조처에 의해 설정된 임의의 수치 또는 파라미터의 세트를 의미할 것이다.

용어 "체표면"은 유익제, 예를 들어 과산 유익제에 대한 표적으로 삼을 수 있는 임의의 인간 체표면을 말한다. 본 발명의 방법 및 조성물은 구강 관리 응용 및 제품에 관한 것이다. 이와 같이, 체표면은 구강 물질/표면을 포함한다. 일 실시형태에서, 구강 물질은 치아 에나멜, 치아 균막, 연조직, 예를 들어, 볼, 혀 및 잇몸 및 구강 생물막(예를 들어, 구강 플라크)을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "생물학적 오염물질"은 미생물, 포자, 바이러스, 프리온(prion) 및 그들의 혼합물을 포함하나 이들에 한정되지 않는 하나 이상의 원치않는 및/또는 병원성 생물학적 엔티티(entity)를 지칭한다. 일 실시형태에서, 생물학적 오염물질을 줄이고/거나 그의 존재를 제거하는데 유용한 유효 농도의 적어도 하나의 과산을 효소에 의해 생성하는 방법이 제공된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "소독한다"는 생물학적 오염물질의 파괴 또는 그의 성장의 방지 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "소독제"는 인간 구강 내의 생물학적 오염 물질, 예를 들어, 치아 우식증, 치은염, 구강 칸디다증 또는 치근막염과 관련된 미생물을 포함할 수 있는 생물학적 오염물질을 파괴하거나, 중화시키거나 그의 성장을 억제함으로써 소독하는 제제를 말한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "소독"은 소독 행위 또는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "보존제"는 질환-운반형(disease-carrying) 미생물의 성장을 억제하는 화학적 제제를 말한다. 일 태양에서, 생물학적 오염물질은 병원성 미생물이다.

본 명세서에 사용되는 용어 "위생적인"은 전형적으로 건강에 해로울 수 있는 제제를 제거하거나, 방지하거나 조절함에 의한, 건강의 회복 또는 유지를 의미하거나 그와 관련이 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "살균하다"는 위생적이게 만드는 것을 의미한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "살균제"는 살균시키는 제제를 말한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "살균"은 살균 행위 또는 과정을 말한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "살생물제"는 미생물을 불활성화시키거나 파괴시키는 전형적으로 광범위의 화학적 제제를 말한다. 미생물을 불활성화시키거나 파괴하는 능력을 나타내는 화학적 제제는 "살생물" 활성을 갖는 것으로 기재된다. 과산은 살생물 활성을 가질 수 있다. 대안의 전형적인 살생물제는 예를 들어, 염소, 이산화염소, 클로로아이소시아누레이트, 차아염소산염, 오존, 아크롤레인, 아민, 염화 페놀 화합물, 구리 염, 유기-황 화합물 및 4차 암모늄 염을 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

본 명세서에 사용되는 어구 "최소 살생물 농도"는 생존가능한 표적화된 미생물의 집단에서 소정의 접촉 시간 동안 원하는 치사의 비가역적인 감소가 생기게 할 살생물제의 최소 농도를 말한다. 유효성은 처리 후에 생존가능한 미생물의 log₁₀ 감소로 측정될 수 있다. 일 태양에서, 처리 후의 생존가능한 미생물의 표적화된 감소는 적어도 3-log₁₀ 감소, 더욱 바람직하게는 적어도 4-log₁₀ 감소, 가장 바람직하게는 적어도 5-log₁₀ 감소이다. 다른 태양에서, 최소의 살생물 농도는 생존가능한 미생물 세포의 적어도 6-log₁₀ 감소이다.

본 명세서에 사용되는 "세정 조성물" 및 "세정 제형"은 치아로부터 원치않는 화합물을 제거하는데 사용되는 조성물(구강 청결제, 치약 등)을 말한다. 상기 용어는 조성물이 과가수분해효소 및 조성물에 사용되는 다른 효소(들)와 상용성인 한, 원하는 특정 유형의 세정 조성물 및 제품의 형태(예를 들어, 액체, 페이스트, 겔, 에멀젼, 과립 또는 분무 조성물)를 위해 선택되는 임의의 물질/화합물을 포함한다.

본 명세서에 사용되는 "구강 세정 조성물"은 치분(dentifrice), 치약, 투스겔(toothgel), 투스파우더(toothpowder), 구강세정제, 구강 스프레이, 구강 젤, 츄잉 검(chewing gum), 로젠지(lozenge), 샤세(sachet), 정제, 바이오겔(biogel), 예방 페이스트(prophylaxis paste), 치아 처리 용액 등을 말한다. 본 발명의 과가수분해효소와 함께 사용되는 구강 관리 조성물은 당업계에 널리 알려져 있다(예를 들어, 모두의 전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,601,750호; 제6,379,653호; 및 제5,989,526호 참조).

본 명세서에서 사용되는 "약제학적으로 허용가능한"은 그 용어가 기재되는 약물, 약제 및/또는 불활성 성분이 합리적인 이익/위험 비와 상응하는 과도한 독성, 배합금기, 불안정성, 자극, 알러지 반응 등 없이 인간 및 다른 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적절한 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 "개인 관리 제품"은 샴푸, 바디 로션, 샤워젤, 국소 모이스처라이저, 치약, 투스겔, 구강청결제, 구강헹굼제(mouthrinse), 플라그 방지 헹굼제(anti-plaque rinse) 및/또는 기타 국소 세정제(cleanser)를 포함하나 이들에 한정되지 않는 모발, 피부, 두피 및 치아의 세정, 탈색 및/또는 소독에 사용되는 제품을 의미한다. 특히 바람직한 일부 실시형태에서, 이들 제품은 인간에서 사용되는 한편, 다른 실시형태에서, 이들 제품은 비-인간 동물(예를 들어, 수의학 응용에서)에서 이용된다.

본 명세서에 사용되는 용어 "치아 미백" 및 "치아 탈색"은 치아(들)의 밝기를 향상시키는(예를 들어, 미백하는) 것을 지칭하는 것으로 상호교환가능하게 사용된다. 상기 용어는 본 발명을 포함하는 치아를 미백시키기에 적절한 임의의 방법뿐 아니라 화학적 처리, 약산 처리, 연마제 치아 미백 및 레이저 치아 미백을 포함하고자 한다. 특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 치아를 미백시키기에 적절한 과가수분해효소 및 과가수분해효소-함유 조성물을 제공한다.

본 명세서에 사용되는 치아의 "고유 착색(stain)"은 에나멜 및 아래의 상아질 내의 색소원(chromogen)으로부터 생성된 색을 말한다. 인간 치아의 고유색은 에나멜의 세선화(thinning) 및 아래의 황색 상아질의 암화(darkening)에 기인하여 노화와 함께 더욱 황색이 되는 경향이 있다. 고유 착색의 제거는 통상 에나멜을 침투하고 내부 색소원을 탈색시키는 과산화물 또는 다른 산화 화학물질의 사용을 필요로 한다.

고유 착색과 대조적으로, "외적 착색"은 통상 천연적으로 치아를 코팅하는 균막 내에서, 외인성 색소원 물질이 에나멜에 결합되는 경우 치아의 표면 상에 형성된다. 대부분의 사람들은 시간이 지남에 따라, 그들의 치아 상에 보기 흉한 어느 정도의 외적 착색을 축적한다. 이러한 착색 과정은 (1) 탄닌-함유 식품 및 음료, 예를 들어, 커피, 차 또는 레드 와인의 섭취; (2) 담배 제품의 사용; 및/또는 (3) 특정 양이온성 물질(예를 들어, 주석, 철 및 클로르헥시딘)에 대한 노출과 같은 인자에 의해 증진된다. 이들 물질은 에나멜의 수산화인회석 구조에 부착되는 경향이 있으며, 이는 치아 변색 및 동시의 치아 백색도의 감소를 야기한다. 수년의 기간에 걸쳐, 외적 착색은 에나멜 층을 침투하고, 고유 착색을 야기할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 용어 "탈취"는 불쾌한 냄새를 제거하거나 예방하는 것을 의미한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "탈염시키다" 또는 "탈염"은 구강 표면으로부터 착색을 제거하는 과정을 말한다. 착색(들)은 고유 착색, 외적 착색 또는 그들의 조합일 수 있다.

본 명세서에 사용되는 과가수분해효소-함유 조성물에서의 "향상된 성능"은 치과 분야에서의 표준 방법을 사용하여 결정시, 다른 조성물에 비하여 탈색-감수성 착색의 세정을 증가시키는 것으로 정의된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 과가수분해효소는 산화 성능의 증가 및 착색의 제거를 제공한다. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 과가수분해효소는 착색의 제거 및/또는 탈색의 성능 증가를 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 "유효량의 과가수분해효소"는 특정 응용에 필요한 효소적 양을 달성하는데 필요한 양의 과가수분해효소를 말한다. 이러한 유효량은 당업자에 의해 용이하게 인식되며, 많은 인자, 예를 들어, 사용되는 특정 효소 변이체, 세정 응용, 세정 조성물의 특정 조성 및 액체 조성물이 필요한지 또는 비-액체(예를 들어, 에멀젼) 조성물이 필요한지의 여부 등에 좌우된다.

본 명세서에 사용되는 용어 "과산소원" 및 "과산소의 공급원"은 과산화수소, 과산화수소 부가물(예를 들어, 우레아-과산화수소 부가물(카르바미드 퍼옥시드)), 과붕산염 및 과탄산염을 포함하나 이들에 한정되지 않는, 수용액에 존재하는 경우 약 1 mM 이상의 농도로 과산화수소를 제공할 수 있는 화합물을 말한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 수성 반응 제형 중의 과산소 화합물에 의해 제공되는 과산화수소의 농도는 반응 성분의 배합시에 초기에는 적어도 0.1 mM 또는 그 이상이다. 일 실시형태에서, 수성 반응 제형 중의 과산화수소 농도는 적어도 0.5 mM이다. 일 실시형태에서, 수성 반응 제형 중의 과산화수소 농도는 적어도 1 mM이다. 다른 실시형태에서, 수성 반응 제형 중의 과산화수소 농도는 적어도 10 mM이다. 다른 실시형태에서, 수성 반응 제형 중의 과산화수소 농도는 적어도 100 mM이다. 다른 실시형태에서, 수성 반응 제형 중의 과산화수소 농도는 적어도 200 mM이다. 다른 실시형태에서, 수성 반응 제형 중의 과산화수소 농도는 500 mM 이상이다. 또 다른 실시형태에서, 수성 반응 제형 중의 과산화수소 농도는 1000 mM 이상이다. 수성 반응 제형 중의 과산화수소 대 효소 기질, 예를 들어, 트라이글리세리드, (H₂O₂:기질)의 몰비는 약 0.002 내지 20, 바람직하게는 약 0.1 내지 10, 가장 바람직하게는 약 0.5 내지 5일 수 있다.

본 명세서에 사용되는 용어 "올리고당"은 글리코시드 결합에 의해 결합되는 2 내지 적어도 24개의 단당류 단위를 함유하는 화합물을 말한다. 용어 "단당류"는 실험식 (CH₂O)_n(여기서, n은 3 이상이고, 탄소 골격은 비분지형이며, 하나의 탄소 원자를 제외한 각 탄소 원자는 하이드록실기를 함유하고, 나머지 탄소 원자는 탄소 원자 1에서 알데히드 또는 케톤이다)의 화합물을 지칭한다. 또한, 용어 "단당류"는 세포내 환형 헤미아세탈 또는 헤미케탈 형태를 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "부형제"는 제형 중의 활성 성분에 대한 담체로 사용되는 불활성 물질을 말한다. 부형제를 사용하여 활성 성분의 저장 안정성과 같이, 제형 중의 활성 성분을 안정화시킬 수 있다. 또한, 부형제는 때때로 활성 성분을 함유하는 제형의 부피를 늘리기 위해 사용된다. 본 명세서에 기재되는 "활성 성분"은 과가수분해 활성을 갖는 효소, 적절한 반응 조건 하에서 과가수분해 효소에 의해 생성되는 과산 또는 그들의 조합일 수 있다.

용어 "실질적으로 물이 없는"은 카르복실산 에스테르에 존재하는 경우 효소 또는 효소 분말의 저장 안정성에 해로운 영향을 주지 않는 제형 중의 물의 농도를 지칭할 것이다. 카르복실산 에스테르는 매우 낮은 농도의 물을 함유할 수 있으며, 예를 들어, 트라이아세틴은 전형적으로 180 ppm 내지 300 ppm의 물을 갖는다. 일 실시형태에서, 과가수분해 효소는 실질적으로 물이 없는 카르복실산 에스테르 기질 중에 저장된다. 추가의 실시형태에서, "실질적으로 물이 없는"은 효소(또는 효소 분말) 및 카르복실산 에스테르를 포함하는 제형 중의 2000 ppm 미만, 바람직하게는 1000 ppm 미만, 더욱 바람직하게는 500 ppm 미만, 더더욱 바람직하게는 250 ppm 미만의 물을 의미할 수 있다. 일 실시형태에서, 과가수분해 효소는 효소가 수용액(예를 들어, 저장 동안 효소에 의해 가수분해될 수 있는 상당한 농도의 카르복실산 에스테르 기질을 함유하지 않는 용액) 중에 안정적이도록 생성 시스템이 고안된다면, 수용액 중에 저장될 수 있다. 일 실시형태에서, 과가수분해 효소는 물 및 하나 이상의 완충제(예를 들어, 바이카르보네이트, 시트레이트, 아세테이트, 포스페이트, 피로포스페이트, 메틸포스포네이트, 석시네이트, 말레이트, 푸마레이트, 타르트레이트 및 말레에이트의 나트륨 및/또는 칼륨 염)가 실질적으로 없는 카르복실산 에스테르 기질을 포함하는 혼합물 중에 저장될 수 있다.

과가수분해 활성을 갖는 효소

과가수분해 활성을 갖는 효소는 효소가 본 발명의 하나 이상의 기질에 대하여 과가수분해 활성을 갖는 한, 리파제, 프로테아제, 에스테라제, 아실 트랜스퍼라제, 아릴 에스테라제, 탄수화물 에스테라제 및 조합으로 분류된 일부 효소를 포함할 수 있다. 예에는 과가수분해 프로테아제(서브틸리신 칼스버그(subtilisin Carlsberg) 변이체; 미국 특허 제7,510,859호), 과가수분해 아릴 에스테라제(슈도모나스 플루오레슨스; 서열 번호 477; 미국 특허 제7,384,787호), 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 과가수분해 아릴 에스테라제/아실 트랜스퍼라제(서열 번호 460 및 478; 미국 특허 제7,754,460호; WO2005/056782호; 및 제EP1689859 B1호) 및 과가수분해효소 탄수화물 에스테라제가 포함될 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 바람직한 태양에서, 과가수분해 탄수화물 에스테라제는 CE-7 탄수화물 에스테라제이다.

일 실시형태에서, 적절한 과가수분해효소는 비-CE-7 과가수분해효소가 표적화된 과가수분해효소 응용에 제한되지 않는다면(다시 말하면, CE-7 탄수화물 에스테라제 패밀리에 속하지 않는 과가수분해 효소는 적어도 하나의 펩티드 표적화 도메인을 포함하는 융합 단백질의 형태로 사용된다), 본 명세서에 보고된 임의의 아미노산 서열에 대하여 적어도 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효소를 포함할 수 있다.

다른 실시형태에서, 적절한 과가수분해효소는 비-CE-7 과가수분해효소가 표적화된 과가수분해효소 응용에 제한되지 않는다면(다시 말하면, CE-7 탄수화물 에스테라제 패밀리에 속하지 않는 과가수분해 효소는 적어도 하나의 펩티드 표적화 도메인을 포함하는 융합 단백질의 형태로 사용된다), 서열 번호 460, 477 및 478에 대하여 적어도 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 효소를 포함할 수 있다. 실질적으로 유사한 과가수분해 효소를 동정하기 위해 사용되는 동일성 백분율 비교 및 서열 정렬이 과가수분해 효소를 포함하는 융합 단백질의 부분(다시 말하면, 표적화 도메인 및 링커는 포함되지 않는다)에 대하여 행해지는 것이 이해된다.

다른 실시형태에서, 융합 단백질은 서열 번호 460으로 제공된 S54V 마이코박테리움 스메그마티스 아릴 에스테라제와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 과가수분해 효소를 포함한다.

일 실시형태에서, 융합 단백질은 슈도모나스 플루오레슨스로부터의 과가수분해 에스테라제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 융합 단백질은 서열 번호 477로 제공된 슈도모나스 플루오레슨스 에스테라제와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 과가수분해 효소를 포함한다.

다른 실시형태에서, 실질적으로 유사한 과가수분해 효소는 비-CE-7 과가수분해효소가 표적화된 과가수분해효소 응용에 제한되지 않는다면(다시 말하면, CE-7 탄수화물 에스테라제 패밀리에 속하지 않는 과가수분해 효소는 적어도 하나의 펩티드 표적화 도메인을 포함하는 융합 단백질의 형태로 사용된다), 매우 엄격한 혼성화 조건(0.1X SSC, 0.1% SDS, 65℃, 및 2X SSC, 0.1% SDS로의 세정에 이은, 0.1X SSC, 0.1% SDS, 65℃의 최종 세정) 하에서 본 발명의 임의의 과가수분해 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것을 포함할 수 있다.

CE-7 과가수분해효소

바람직한 실시형태에서, 구강 관리 조성물 및 방법은 구조적으로 효소의 탄수화물 패밀리 에스테라제 패밀리 7(CE-7 패밀리)의 구성원으로 분류되는 과가수분해 활성을 갖는 효소를 포함한다(문헌[Coutinho, P.M., Henrissat, B. "Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach" in Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering, H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat and B. Svensson eds., (1999) The Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 3-12] 참조). 효소의 CE-7 패밀리는 과산소원과 배합되는 경우 다양한 카르복실산 에스테르 기질로부터 퍼옥시카르복실산을 생성하는데 특히 효과적인 것으로 증명되었다(미국 특허 제7,794,378호; 제7,951,566호; 제7,723,083호; 및 제7,964,378호 및 미국 특허 출원 공개 제2008-0176299호, 제2010-0087529호, 제2011-0081693호 및 제2011-0236335호(DiCosimo et al.); 각각은 본 명세서에 참고로 포함됨)

CE-7 패밀리의 구성원은 세팔로스포린 C 데아세틸라제(CAH; E.C. 3.1.1.41) 및 아세틸 자일란 에스테라제(AXE; E.C. 3.1.1.72)를 포함한다. CE-7 에스테라제 패밀리의 구성원은 보존된 시그니처 모티프를 공유한다(문헌[incent et al., J. Mol. Biol., 330:593-606(2003)]). CE-7 시그니처 모티프("CE-7 과가수분해효소") 및/또는 실질적으로 유사한 구조를 포함하는 과가수분해효소는 본 명세서에 기재된 조성물과 방법에 사용하기에 적절하다. 실질적으로 유사한 생물학적 분자를 동정하는 수단은 당업계에 널리 알려져 있다(예를 들어, 서열 정렬 프로토콜, 핵산 혼성화 및/또는 보존된 시그니처 모티프의 존재). 일 태양에서, 과가수분해효소는 CE-7 시그니처 모티프, 및 본 명세서에 기재된 서열 중 하나에 대하여 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 33%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 42%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 동일성을 포함하는 효소를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 어구 "효소는 구조적으로 CE-7 효소로 분류된다", "CE-7 과가수분해효소" 또는 "구조적으로 탄수화물 에스테라제 패밀리 7 효소로 분류된"은 구조적으로 CE-7 탄수화물 에스테라제로 분류된 과가수분해 활성을 갖는 효소를 지칭하기 위해 사용될 것이다. 이러한 효소의 패밀리는 시그니처 모티프의 존재에 의해 정의될 수 있다(상기 문헌[Vincent et al.]). CE-7 에스테라제에 대한 시그니처 모티프는 3가지 보존된 모티프를 포함한다(서열 번호 2의 참조 서열에 대한 잔기 위치 넘버링; 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 31954(상표명)로부터의 CE-7 과가수분해효소):

a) Arg118-Gly119-Gln120;

b) Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183; 및

c) His298-Glu299.

전형적으로, 아미노산 잔기 위치 180에서의 Xaa는 글리신, 알라닌, 프롤린, 트립토판 또는 트레오닌이다. 촉매 트라이아드에 속하는 3개의 아미노산 잔기 중 2개를 볼드체로 나타내었다. 일 실시형태에서, 아미노산 잔기 위치 180에서의 Xaa는 글리신, 알라닌, 프롤린, 트립토판 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

CE-7 탄수화물 에스테라제 패밀리 내의 보존된 모티프의 추가의 분석에 의해, CE-7 탄수화물 에스테라제 패밀리에 속하는 과가수분해효소를 추가로 정의하기 위해 사용될 수 있는 추가의 보존된 모티프(서열 번호 2의 아미노산 위치 267 내지 269에서의 LXD)의 존재가 나타난다. 추가의 실시형태에서, 상기 정의된 시그니처 모티프는 하기로 정의된 추가의(제4) 보존된 모티프를 포함할 수 있다:

Leu267-Xaa268-Asp269.

아미노산 잔기 위치 268에서의 Xaa는 전형적으로, 아이소류신, 발린 또는 메티오닌이다. 제4 모티프는 촉매 트라이아드(Ser181-Asp269-His298)에 속하는 아스파르트산 잔기(볼드체)를 포함한다.

CE-7 과가수분해효소는 적어도 하나의 체표면에 대하여 친화성을 갖는 적어도 하나의 펩티드 성분을 갖는 융합 단백질의 형태일 수 있다. 일 실시형태에서, 표적화된 과가수분해효소(융합 단백질)가 CE-7 시그니처 모티프를 포함하는지를 결정하기 위해 사용되는 모든 정렬은 체표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이 없는 과가수분해 효소의 아미노산 서열에 기초할 것이다.

많은 널리 공지된 전반적인 정렬 알고리듬(즉, 서열 분석 소프트웨어)을 사용하여 과가수분해효소 활성을 갖는 효소를 대표하는 둘 이상의 아미노산 서열을 정렬하여, 효소가 본 발명의 시그니처 모티프로 이루어지는지 결정할 수 있다. 정렬된 서열(들)을 참조 서열(서열 번호 2)과 비교하여, 시그니처 모티프의 존재를 결정한다. 일 실시형태에서, 참조 아미노산 서열을 사용하는 클러스털(CLUSTAL) 정렬(예를 들어, 클러스털더블유)(본 명세서에 사용되는 바와 같이, 바실러스 서브틸리스 ATCC(등록 상표) 31954(상표명)로부터의 과가수분해효소 서열(서열 번호 2))을 사용하여 CE-7 에스테라제 패밀리에 속하는 과가수분해효소를 동정한다. 보존된 아미노산 잔기의 상대적 넘버링은 참조 아미노산 서열의 잔기 넘버링에 기초하여, 정렬된 서열 내의 작은 삽입 또는 결실(예를 들어, 전형적으로 5개 이하의 아미노산)을 설명한다.

(참조 서열에 비하여) 본 발명의 시그니처 모티프를 포함하는 서열을 동정하기 위해 사용될 수 있는 다른 적절한 알고리듬의 예에는 니들만(Needleman) 및 분쉬(Wunsch)(문헌[J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970)]; 전체 정렬 도구) 및 스미스-워터만(Smith-Waterman)(문헌[J. Mol. Biol. 147:195-197 (1981)]; 국소 정렬 도구)아 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 일 실시형태에서, 스미스-워터만 정렬은 디폴트 파라미터를 사용하여 이행된다. 적절한 디폴트 파라미터의 예에는 블로섬(BLOSUM)62 스코어링 매트릭스(scoring matrix)의 사용이 포함되며, 갭 개방 페널티(GAP open penalty)는 10이고, 갭 연장 페널티(GAP extension penalty)는 0.5이다.

과가수분해효소 중의 전체 동일성 백분율의 비교에 의해, (시그니처 모티프를 보유하면서) 서열 번호 2에 대하여 33%만큼 적은 아미노산 동일성을 갖는 효소가 유의미한 과가수분해효소 활성을 나타내는 것으로 표현되며, 구조적으로 CE-7 탄수화물 에스테라제로 분류된다. 일 실시형태에서, 적절한 과가수분해효소는 CE-7 시그니처 모티프, 및 서열 번호 2에 대하여 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아미노산 동일성을 포함하는 효소를 포함한다.

과가수분해 활성을 갖는 적절한 CE-7 탄수화물 에스테라제의 예에는 아미노산 서열, 예를 들어, 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 424, 437 및 476을 갖는 효소가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 일 실시형태에서, 효소는 14, 16, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 424, 437 및 476으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "CE-7 변이체", "변이체 과가수분해효소" 또는 "변이체"는 CE-7 시그니처 모티프 및 관련 과가수분해 활성이 유지되는 한, 변이체가 유래되는 해당하는 효소(전형적으로 야생형 효소)에 비하여, 적어도 하나의 아미노산 부가, 결실 및/또는 치환을 야기하는 유전자 변형을 갖는 CE-7 과가수분해효소를 지칭할 것이다. 또한, CE-7 변이체 과가수분해효소는 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다. CE-7 변이체의 예는 서열 번호 27, 28, 29, 30, 31, 32, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 424, 437 및 476으로 제공된다. 일 실시형태에서, 변이체는 서열 번호 27, 28, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 424, 437 및 476을 포함할 수 있다.

당업자는 실질적으로 유사한 CE-7 과가수분해효소 서열(시그니처 모티프 보유)이 또한 본 발명의 조성물 및 방법에 사용될 수 있음을 인식한다. 일 실시형태에서, 실질적으로 유사한 서열은 매우 엄격한 조건 하에서 본 명세서에 예시된 서열과 관련된 핵산 분자와 혼성화하는 그들의 능력에 의해 정의된다. 다른 실시형태에서, 서열 정렬 알고리듬을 사용하여, 본 명세서에 제공되는 DNA 또는 아미노산 서열에 대한 동일성 백분율에 기초하여 실질적으로 유사한 효소를 정의할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 핵산 분자는 제1 분자의 단일의 가닥이 적절한 온도 및 용액 이온 세기의 조건 하에서 다른 분자에 어닐링될 수 있는 경우, 다른 핵산 분자, 예를 들어, cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA에 "혼성화가능하다". 혼성화 및 세정 조건은 널리 공지되어 있으며, 문헌[Sambrook, J. and Russell, D., T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001)]에 예시되어 있다. 온도 및 이온 세기 조건은 혼성화의 "엄격성(stringency)"을 결정한다. 엄격성 조건을 조정하여, 관계가 먼 유기체로부터의 상동 서열과 같은 중등으로 유사한 분자 내지 밀접하게 관련된 유기체로부터의 기능성 효소를 중복시키는 유전자와 같은 고도로 유사한 분자를 스크리닝할 수 있다. 혼성화 후 세정이 전형적으로 엄격성 조건을 결정한다. 한 세트의 바람직한 조건은 실온에서 15분 동안 6X SSC, 0.5% SDS로 시작한 다음, 45℃에서 30분 동안 2X SSC, 0.5% SDS로 반복한 다음, 50℃에서 30분 동안 0.2X SSC, 0.5% SDS로 2회 반복한 일련의 세정을 사용한다. 더욱 바람직한 세트의 조건은 더 높은 온도를 사용하며, 여기서, 세정은 0.2X SSC, 0.5% SDS에서의 최종 2회의 30분 세정의 온도가 60℃로 증가된 것을 제외하고 상기와 동일하다. 다른 바람직한 세트의 고도로 엄격한 혼성화 조건은 0.1X SSC, 0.1% SDS, 65℃이며, 2X SSC, 0.1% SDS로 세정하고, 0.1X SSC, 0.1% SDS, 65℃의 최종 세정으로 이어진다.

혼성화의 엄격성에 따라 염기 간의 미스매치가 가능하지만, 혼성화를 위해서는 2개의 핵산이 상보적 서열을 함유하는 것이 요구된다. 혼성화되는 핵산에 대해 적절한 엄격성은, 당업계에 주지된 변수인 핵산의 길이 및 상보성의 정도에 의존한다. 2개 뉴클레오티드 서열 사이의 유사성 또는 상동성의 정도가 클수록, 이들 서열을 가진 핵산의 하이브리드에 대한 Tm의 값이 커진다. 핵산 혼성화의 상대적 안정성(높은 Tm에 상응함)은 하기의 순서로 감소한다: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 100개 뉴클레오티드 길이를 초과하는 하이브리드에 대하여, Tm을 계산하는 수학식이 유도되었다(상기 문헌[Sambrook and Russell]). 더 짧은 핵산, 즉, 올리고뉴클레오티드의 혼성화에 있어서는 미스매치의 위치가 더욱 중요해지며 올리고뉴클레오티드의 길이가 그의 특이성을 결정한다(상기 문헌[Sambrook and Russell]). 일 태양에서, 혼성화가능한 핵산의 길이는 적어도 약 10개 뉴클레오티드이다. 바람직하게는, 혼성화가능한 핵산의 최소의 길이는 적어도 약 15개 뉴클레오티드 길이, 더욱 바람직하게는 적어도 약 20개 뉴클레오티드 길이, 더더욱 바람직하게는 적어도 30개 뉴클레오티드 길이, 더더욱 바람직하게는 적어도 300개 뉴클레오티드 길이, 가장 바람직하게는 적어도 800개 뉴클레오티드 길이이다. 또한, 프로브의 길이와 같은 인자에 따라 필요한 경우에 온도 및 세정 용액 염 농도를 조정할 수 있음을 당업자는 인식할 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "동일성 백분율"은 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계로서, 서열을 비교함으로써 결정된다. 당업계에서, "동일성"은 또한 경우에 따라서, 서열의 스트링(string) 간의 매치에 의해 결정되는, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 간의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성" 및 "유사성"은 문헌[Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988)]; 문헌[Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993)]; 문헌[Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994)]; 문헌[Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987)]; 및 문헌[Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991)]에 기재된 것을 포함하나 이들에 한정되지 않는 공지되어 있는 방법에 의해 용이하게 계산할 수 있다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공중에게 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 명시되어 있다. 레이저진(LASERGENE) 바이오인포매틱스 컴퓨팅 스위트(bioinformatics computing suite)(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 디엔에이스타 인코포레이티드)의 멕얼라인(Megalign) 프로그램, 벡터 NTI v. 7.0(미국 메릴랜드주 베데스다 소재의 인포맥스, 인코포레이티드)의 얼라인엑스(AlignX) 프로그램, 또는 엠보스 오픈 소프트웨어 스위트(EMBOSS Open Software Suite)(EMBL-EBI; 문헌[Rice et al., Trends in Genetics 16, (6):276-277 (2000)])를 사용하여 서열 정렬 및 동일성 백분율 계산을 수행할 수 있다. 서열의 다중의 정렬은 디폴트 파라미터와 함께 클러스털 정렬 방법(예를 들어, 클러스털더블유; 예를 들어, 버전 1.83)(문헌[Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989)]; 문헌[Higgins et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-4680 (1994)]; 및 문헌[Chenna et al., Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500 (2003)], 유럽 바이오인포매틱스 연구소(European Bioinformatics Institute)를 통하여 유럽 분자 생물학 실험실로부터 입수가능함)을 사용하여 수행할 수 있다. 클러스털더블유 단백질 정렬에 적절한 파라미터는 갭 존재 페널티(GAP Existence penalty)=15, 갭 연장=0.2, 매트릭스=고넷(Gonnet)(예를 들어, 고넷250), 단백질 엔드갭(ENDGAP)=-1, 단백질 갭디스트(GAPDIST)=4, 및 KTUPLE=1을 포함한다. 일 실시형태에서, 고속 또는 저속 정렬은 디폴트 설정으로 사용되며, 저속 정렬이 바람직하다. 대안적으로, 클러스털더블유 방법(예를 들어, 버전 1.83)을 사용하는 파라미터는 또한 KTUPLE=1, 갭 페널티=10, 갭 연장=1, 매트릭스=블로섬(예를 들어, 블로섬64), 윈도우(WINDOW)=5 및 탑 디아고날 세이브드(TOP DIAGONALS SAVED)=5를 사용하여 변경될 수 있다.

일 태양에서, 적절한 분리된 핵산 분자는 본 명세서에 기재된 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화한다. 다른 태양에서, 적절한 분리된 핵산 분자는 본 명세서에 기재된 아미노산 서열에 대하여 적어도 약 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 33%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하되; 단, 폴리펩티드는 CE-7 시그니처 모티프를 보유한다. 적절한 핵산 분자는 상기 상동성을 가질 뿐 아니라, 또한 전형적으로 약 210 내지 340개 아미노산 길이, 약 300 내지 약 340개 아미노산, 바람직하게는 약 310 내지 약 330개 아미노산, 가장 바람직하게는 약 318 내지 약 325개 아미노산 길이를 갖는 폴리펩티드를 암호화하며, 각 폴리펩티드는 과가수분해 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.

표적화된 과가수분해효소

본 명세서에 사용되는 용어 "표적화된 과가수분해효소" 및 "과가수분해 활성을 갖는 표적화된 효소"는 표적 표면, 바람직하게는 표적화된 체표면에 대하여 친화성을 갖는 적어도 하나의 펩티드 성분에 융합/결합된 적어도 하나의 과가수분해 효소(야생형 또는 그의 변이체)를 포함하는 융합 단백질을 지칭할 것이다. 표적화된 과가수분해효소 내의 과가수분해 효소는 임의의 과가수분해 효소일 수 있으며, 효소가 본 발명의 하나 이상의 기질에 대하여 과가수분해 활성을 갖는 한, 리파제, 프로테아제, 에스테라제, 아실 트랜스퍼라제, 아릴 에스테라제, 탄수화물 에스테라제 및 조합물을 포함할 수 있다. 예에는 과가수분해 프로테아제(예를 들어, 서브틸리신 변이체; 미국 특허 제7,510,859호), 과가수분해 에스테라제(예를 들어, 슈도모나스 플루오레슨스; 미국 특허 제7,384,787호; 서열 번호 477) 및 과가수분해 아릴 에스테라제(예를 들어, 마이코박테리움 스메그마티스; 미국 특허 제7,754,460호; WO2005/056782호; 및 제EP1689859 B1호; 서열 번호 460[S54V 변이체] 및 478[야생형])가 포함될 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

일 실시형태에서, 융합 단백질은 서열 번호 460으로 제공된 S54V 마이코박테리움 스메그마티스 아릴 에스테라제와 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 과가수분해 효소를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "펩티드 성분", "구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분" 및 "OCBD"는 펩티드 결합에 의해 결합된 둘 이상의 아미노산의 적어도 하나의 폴리머를 포함하는 과가수분해 효소의 부분이 아닌 융합 단백질의 성분을 지칭할 것이며; 성분은 표적 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는다.

일 실시형태에서, 체표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 항체, Fab 항체 단편, 단쇄 가변 단편(scFv) 항체, 카멜리대 항체(문헌[Muyldermans, S., Rev. Mol. Biotechnol. (2001) 74:277-302]), 비-항체 스캐폴드 디스플레이 단백질(다양한 스캐폴드-보조 방법의 검토를 위한 문헌[Hosse et al., Prot. Sci. (2006) 15(1): 14-27] 및 문헌[Binz, H. et al . (2005) Nature Biotechnology 23, 1257-1268]) 또는 면역글로불린 폴드(immunoglobulin fold)가 결여된 단쇄 폴리펩티드일 수 있다. 다른 태양에서, 체표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 펩티드이다(즉, 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 체표면-결합 펩티드 또는 적어도 하나의 체표면-결합 펩티드를 포함하는 체표면-결합 도메인). 바람직한 실시형태에서, 펩티드 성분은 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 하나 이상의 체표면-결합 펩티드를 포함하는 단쇄 펩티드이다.

구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 임의의 펩티드 링커에 의해 과가수분해효소로부터 분리될 수 있다. 소정의 펩티드 링커/스페이서는 길이가 1 내지 100개 또는 1 내지 50개 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 펩티드 스페이서는 길이가 약 1 내지 약 25개, 3 내지 약 40개, 또는 3 내지 약 30개 아미노산이다. 다른 실시형태에서, 스페이서는 길이가 약 5 내지 약 20개 아미노산이다. 다수의 펩티드 링커가 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 적어도 하나의 펩티드 링커가 존재하며, 최대 10번 반복될 수 있다.

이전에 하나의 체표면에 대하여 친화성을 갖는 것으로 동정된 펩티드는 구강 표면에 대한 친화성도 또한 가질 수 있다. 이와 같이, 융합 펩티드는 다른 체표면, 예를 들어, 모발(서열 번호 65 내지 221, 271 및 368); 피부(서열 번호 217 내지 269); 또는 네일(서열 번호 270 및 271)에 대하여 친화성을 갖는 것으로 이전에 보고된 적어도 하나의 것을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 융합 펩티드는 서열 번호 272 내지 382 및 399 내지 422를 포함하는 군으로부터의 적어도 하나의 구강 표면-결합 펩티드를 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 펩티드는 서열 번호 272 내지 382, 399 내지 410 및 412 내지 422로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 구강 표면-결합 펩티드를 포함하며; 서열 번호 272 내지 291 및 312 내지 382는 치아 균막에 대하여 친화성을 가지며; 서열 번호 292 내지 311은 치아 에나멜에 대하여 친화성을 갖고; 서열 번호 399 내지 410 및 412 내지 422는 치아 에나멜 또는 균막에 대하여 친화성을 갖는다. 일부 체표면-결합 펩티드는 1개 초과의 체표면에 대하여 강력한 친화성을 가질 수 있으며, 이와 같이 상이한 체표면에 대하여 과가수분해 효소를 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 융합 펩티드는 표적 체표면에 정전기 인력을 갖도록 고안된 임의의 체표면-결합 펩티드(예를 들어, 표적 체표면에 정전기적으로 결합되도록 엔지니어링된 체표면-결합 펩티드)를 포함할 수 있다.

다른 실시형태에서, 표적 표면은 패키징 및/또는 구강으로의 전달 방법의 일부의 물질이다. 펩티드 성분은 폴리머, 플라스틱 및 막과 같은 이용에서 물질 또는 물질들에 대한 친화성에 대해 선택된다. 표적화된 과가수분해효소 융합 단백질 고안은 비제한적으로 마우쓰(mouth) 트레이 또는 스트립과 같은 제거가능한 장치에서 이를 유지함으로써 사용자로부터의 과가수분해효소의 전달의 조절 및 제거를 가능하게 한다.

표적화된 CE-7 과가수분해효소

바람직한 실시형태에서, "표적화된 과가수분해효소"는 과가수분해 활성을 갖는 표적화된 CE-7 탄수화물 에스테라제이다. 본 명세서에 사용되는 용어 "표적화된 CE-7 과가수분해효소" 및 "표적화된 CE-7 탄수화물 에스테라제"는 표적화된 표면, 바람직하게는 표적화된 체표면에 대하여 친화성을 갖는 적어도 하나의 펩티드 성분에 융합/결합된 적어도 하나의 CE-7 과가수분해효소(야생형 또는 변이체 과가수분해효소)를 포함하는 융합 단백질을 지칭할 것이다. 체표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 상기 기재된 임의의 것일 수 있다. 바람직한 태양에서, 표적화된 CE-7 과가수분해효소의 펩티드 성분은 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 펩티드이다(즉, 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 체표면-결합 펩티드 또는 적어도 하나의 체표면-결합 펩티드를 포함하는 체표면-결합 도메인). 바람직한 실시형태에서, 펩티드 성분은 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 하나 이상의 체표면-결합 펩티드를 포함하는 단쇄 펩티드이다.

구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 임의의 펩티드 링커에 의해 CE-7 과가수분해효소로부터 분리될 수 있다. 소정의 펩티드 링커/스페이서는 길이가 1 내지 100개 또는 1 내지 50개 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 펩티드 스페이서는 길이가 약 1 내지 약 25개, 3 내지 약 40개, 또는 3 내지 약 30개 아미노산이다. 다른 실시형태에서, 스페이서는 길이가 약 5 내지 약 20개 아미노산이다. 다수의 펩티드 링커가 사용될 수 있다.

이와 같이, 표적화된 CE-7 과가수분해효소의 예에는 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분에 결합된 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 424, 437 및 476으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 임의의 CE-7 과가수분해효소가 포함될 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 표적화된 과가수분해효소의 예에는 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 하나 이상의 체표면-결합 펩티드에 (임의로 펩티드 스페이서를 통해) 결합된 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 424, 437 및 476으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 임의의 CE-7 과가수분해효소가 포함될 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

다른 실시형태에서, 표적화된 CE-7 과가수분해효소는 또한 구강 관리 표면에 대하여 친화성을 가질 수 있는, 하나의 체표면에 대하여 친화성을 갖는 것으로 이전에 동정된 펩티드를 포함할 수 있다. 이와 같이, 융합 펩티드는 다른 체표면, 예를 들어, 모발(서열 번호 65 내지 221, 271 및 368); 피부(서열 번호 217 내지 269); 또는 네일(서열 번호 270 및 271)에 대하여 친화성을 갖는 것으로 이전에 보고된 적어도 하나의 것을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 융합 펩티드는 서열 번호 272 내지 382 및 399 내지 422를 포함하는 군으로부터의 적어도 하나의 구강 표면-결합 펩티드를 포함한다. 일 실시형태에서, CE-7 과가수분해효소 융합 펩티드는 서열 번호 272 내지 382, 399 내지 410 및 412 내지 422로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 구강 표면-결합 펩티드를 포함하며; 서열 번호 272 내지 291 및 312 내지 382는 치아 균막에 대하여 친화성을 가지며; 서열 번호 292 내지 311은 치아 에나멜에 대하여 친화성을 갖고; 서열 번호 399 내지 410 및 412 내지 422는 치아 에나멜 또는 균막에 대하여 친화성을 갖는다. 일부 체표면-결합 펩티드는 1개 초과의 체표면에 대하여 강력한 친화성을 가질 수 있으며, 이와 같이 상이한 체표면에 대하여 과가수분해 효소를 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, CE-7 과가수분해효소 융합 펩티드는 표적 체표면에 정전기 인력을 갖도록 고안된 임의의 체표면-결합 펩티드(예를 들어, 표적 체표면에 정전기적으로 결합되도록 엔지니어링된 체표면-결합 펩티드)를 포함할 수 있다.

다른 실시형태에서, 표적 표면은 패키징 및/또는 구강으로의 전달 방법의 일부인 물질이다. 펩티드 성분은 폴리머, 플라스틱 및 막과 같은 이용에서 물질 또는 물질들에 대한 친화성에 대해 선택된다. 표적화된 CE-7 과가수분해효소 융합 단백질 고안은 마우쓰 트레이 또는 스트립과 같은 제거가능한 장치에서 이를 유지함으로써 사용자로부터의 과가수분해효소의 전달의 조절 및 제거를 가능하게 한다.

체표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드

구강 표면에 결합할 수 있는 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 펩티드는 "구강 표면-결합 펩티드"(OCBP)로 지칭되며, 예를 들어, 치아 표면에 결합하는 펩티드(치아-결합 펩티드), 연조직, 예를 들어, 잇몸에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 또는 구강에서 사용하기에 안전한 구강에 허용가능한 물질에 대하여 친화성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 치아-결합 펩티드는 치아 에나멜에 대하여 친화성을 갖는 펩티드("치아 에나멜-결합 펩티드") 및 치아 균막에 대하여 친화성을 갖는 펩티드("치아 균막-결합 펩티드")를 포함할 수 있다.

모발(서열 번호 65 내지 221, 271 및 368로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 모발-결합 펩티드), 피부(피부-결합 펩티드는 서열 번호 217 내지 269로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다) 및 네일(네일-결합 펩티드는 서열 번호 270 및 271로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다)에 대하여 친화성을 갖는 것을 포함하는 적어도 하나의 체표면에 대하여 친화성을 갖는 비제한적인 펩티드의 목록이 본 명세서에 제공된다. 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드(구강-결합 펩티드)의 예에는 서열 번호 272 내지 382 및 399 내지 422로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열이 포함된다. 바람직한 태양에서, 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드는 서열 번호 272 내지 382, 399 내지 410 및 412 내지 422로 이루어진 군으로부터 선택되며; 서열 번호 272 내지 291 및 312 내지 382는 치아 균막에 대하여 친화성을 갖고; 서열 번호 292 내지 311은 치아 에나멜에 대하여 친화성을 가지며; 서열 번호 399 내지 410 및 412 내지 422는 치아 에나멜 또는 균막에 대하여 친화성을 갖는다.

일 실시형태에서, 구강 표면에 대하여 친화성을 가질 수 있는 펩티드는 또한 서열 번호 65 내지 382, 399 내지 410 및 412 내지 422 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 조성물 및 방법에 사용되는 펩티드는 서열 번호 272 내지 382, 399 내지 410 및 412 내지 422로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 구강 표면-결합 펩티드는 일부 구강 표면(예를 들어, 잇몸)에 대한 피부-결합 펩티드를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 융합 펩티드는 표적 체표면에 정전기 인력을 갖도록 고안된 임의의 체표면-결합 펩티드(예를 들어, 표적 체표면에 정전기적으로 결합되도록 엔지니어링된 체표면-결합 펩티드)를 포함할 수 있다.

다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 서열 번호 399 내지 410 및 412 내지 422로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 구강 표면-결합 펩티드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 구강 표면-결합 도메인은 길이가 최대 약 60개 아미노산인 구강 표면-결합 펩티드로 이루어진다. 일 실시형태에서 구강 표면-결합 펩티드는 길이가 5 내지 60개 아미노산이다. 다른 실시형태에서, 표면-결합 펩티드는 길이가 7 내지 50개 아미노산이거나, 길이가 7 내지 30개 아미노산이다. 또 다른 실시형태는 길이가 7 내지 27개 아미노산인 구강 표면-결합 펩티드이다.

구강 표면-결합 펩티드를 포함하는 융합 펩티드가 본 발명의 특정 실시형태이지만, 본 발명의 다른 실시형태에서 다수의 구강 표면결합 펩티드를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 다수, 즉, 둘 이상의 구강 표면-결합 펩티드의 포함은 예를 들어, 심지어 단일 구강 표면-결합 펩티드를 포함하는 결합 요소보다 더 내구성 있는 펩티드 성분을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 구강 표면-결합 도메인(다시 말하면, 다수, 즉, 2개 이상의 구강 표면-결합 펩티드)은 2 내지 약 50개 또는 2 내지 약 25개 구강 표면-결합 펩티드를 포함한다. 다른 실시형태는 2 내지 약 10개 또는 2 내지 5개 구강 표면-결합 펩티드를 포함하는 구강 표면-결합 도메인을 포함한다.

다수의 결합 요소(즉, 구강 표면-결합 펩티드 또는 구강 표면-결합 도메인)는 서로 직접 결합될 수 있거나, 이들은 펩티드 스페이서를 사용하여 함께 결합될 수 있다. 소정의 펩티드 스페이서/링커는 길이가 1 내지 100개 또는 1 내지 50개 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 펩티드 스페이서는 길이가 약 1 내지 약 25개, 3 내지 약 40개, 또는 3 내지 약 30개 아미노산이다. 다른 실시형태에서, 스페이서는 길이가 약 1 내지 약 20개 또는 약 5 내지 약 20개 아미노산이다.

구강 표면-결합 도메인 및 그들을 구성하는 더 짧은 구강 표면-결합 펩티드는 예를 들어, 임의의 공지되어 있는 바이오패닝 기술, 예를 들어, 파지 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 효모 디스플레이, 리보솜 디스플레이, mRNA 디스플레이 및 그들의 조합을 비롯한 당업계에 공지되어 있는 많은 방법을 사용하여 동정할 수 있다. 전형적으로, 펩티드의 무작위 또는 실질적인 무작위(사건에서 편향이 존재) 라이브러리를 표적 체표면에 대하여 바이오패닝하여, 표적 체표면에 대하여 친화성을 갖는 라이브러리 내의 펩티드를 동정한다.

펩티드의 무작위 라이브러리의 생성은 널리 공지되어 있으며, 박테리아 디스플레이(문헌[Kemp, D.J.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78(7):4520-4524 (1981)] 및 문헌[Helfman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80(1):31-35, (1983)]), 효모 디스플레이(문헌[Chien et al., Proc Natl Acad Sci USA 88(21):9578-82 (1991)]), 조합 고체상 펩티드 합성(미국 특허 제5,449,754호, 미국 특허 제5,480,971호, 미국 특허 제5,585,275호, 미국 특허 제5,639,603호) 및 파지 디스플레이 기술(미국 특허 제5,223,409호, 미국 특허 제5,403,484호, 미국 특허 제5,571,698호, 미국 특허 제5,837,500호); 리보솜 디스플레이(미국 특허 제5,643,768호; 미국 특허 제5,658,754호; 및 미국 특허 제7,074,557호),및 mRNA 디스플레이 기술(프로퓨젼(상표명); 미국 특허 제6,258,558호; 제6,518,018호; 제6,281,344호; 제6,214,553호; 제6,261,804호; 제6,207,446호; 제6,846,655호; 제6,312,927호; 제6,602,685호; 제6,416,950호; 제6,429,300호; 제7,078,197호; 및 제6,436,665호 참조)을 포함하는 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다.

결합 친화성

구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 10^-5 몰(M) 이하의 구강 표면에 대한 결합 친화성을 포함한다. 특정 실시형태에서, 펩티드 성분은 10^-5 몰(M) 이하의 인간 모발, 피부, 네일 또는 구강에 대한 결합 친화성을 갖는 하나 이상의 구강 표면-결합 펩티드 및/또는 결합 도메인(들)이다. 일부 실시형태에서, 결합 펩티드 또는 도메인은 적어도 약 50 내지 500 mM 염의 존재 하에 10^-5 M 이하의 결합 친화성 값을 가질 것이다. 용어 "결합 친화성"은 결합 펩티드와 그의 각 기질, 이 경우에는 인간 구강 표면(잇몸, 치아 등)의 상호작용의 세기를 말한다. 결합 친화성은 결합 펩티드의 해리 상수("K_D") 또는 "MB₅₀"에 관하여 정의되거나 측정될 수 있다.

"K_D"는 표적 상의 결합 부위가 절반 점유된, 다시 말하면, 펩티드가 결합된 표적(결합 표적 물질)의 농도가 펩티드가 결합되지 않은 표적의 농도와 같은 경우의 펩티드의 농도에 해당한다. 해리 상수가 더 작을수록, 펩티드가 더욱 단단히 결합된다. 예를 들어, 나노몰(nM) 해리 상수를 갖는 펩티드는 마이크로몰(μM) 해리 상수를 갖는 펩티드보다 더욱 단단히 결합한다. 본 발명의 특정 실시형태는 K_D 값이 10^-5 이하일 것이다.

"MB₅₀"은 ELISA-기반의 결합 검정법에서 수득되는 최대 신호의 50%의 신호를 제공하는 결합 펩티드의 농도를 말한다. 예를 들어, 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2005/022683호의 실시예 3을 참고한다. MB₅₀은 복합체의 성분의 결합 상호작용 또는 친화성의 세기의 표시를 제공한다. MB₅₀의 값이 더 낮을수록, 펩티드와 그의 해당하는 기질의 상호작용이 더욱 강력하며, 다시 말하면, 더 낫다. 예를 들어, 나노몰(nM) MB₅₀을 갖는 펩티드는 마이크로몰(μM) MB₅₀을 갖는 펩티드보다 더욱 단단하게 결합한다. 본 발명의 특정 실시형태는 MB₅₀ 값이 10^-5 M 이하일 것이다.

일부 실시형태에서, 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 K_D 또는 MB₅₀ 값으로 측정시, 결합 친화성이 약 10^-5 M 이하, 약 10^-6 M 이하, 약 10^-7 M 이하, 약 10^-8 M 이하, 약 10^-9 M 이하, 또는 약 10^-10 M 이하일 수 있다.

일부 실시형태에서, 구강 표면-결합 펩티드 및/또는 구강 표면-결합 도메인은 K_D 또는 MB₅₀ 값으로 측정시, 결합 친화성이 약 10^-5 M 이하, 약 10^-6 M 이하, 약 10^-7 M 이하, 약 10^-8 M 이하, 약 10^-9 M 이하, 또는 약 10^-10 M 이하일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "강력한 친화성"은 K_D 또는 MB₅₀ 값이 약 10^-5 M 이하, 바람직하게는 약 10^-6 M 이하, 더욱 바람직하게는 약 10^-7 M 이하, 더욱 바람직하게는 약 10^-8 M 이하, 약 10^-9 M 이하, 또는 가장 바람직하게는 약 10^-10 M 이하인 결합 친화성을 지칭할 것이다.

다성분 퍼옥시카르복실산 생성 시스템

다수의 활성 성분을 분리하고 배합하는 시스템 및 수단의 고안은 당업계에 알려져 있으며, 일반적으로 개별 반응 성분의 물리적 형태에 좌우될 것이다. 예를 들어, 다수의 활성 유체(액체-액체) 시스템은 전형적으로 멀티-챔버 디스펜서(multi-chamber dispenser) 병 또는 2상 시스템(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2005/0139608호; 미국 특허 제5,398,846호; 미국 특허 제5,624,634호; 미국 특허 제6,391,840호; 유럽 특허 제0807156B1호; 미국 특허 출원 공개 제2005/0008526호; 및 PCT 공개 WO 00/61713호), 예컨대 원하는 탈색제가 반응성 유체의 혼합시에 생성되는 일부 탈색 응용에서 관찰되는 것을 사용한다. 퍼옥시카르복실산을 생성하기 위해 사용되는 다른 형태의 다성분 시스템은 하나 이상의 고체 성분 또는 고체-액체 성분의 조합, 예를 들어, 분말(예를 들어, 미국 특허 제5,116,575호), 다층 정제(예를 들어, 미국 특허 제6,210,639호), 다수의 구획을 갖는 수용해성 패킷(packet)(예를 들어, 미국 특허 제6,995,125호) 및 물의 첨가 시에 반응하는 고체 응집체(예를 들어, 미국 특허 제6,319,888호)를 위해 고안된 것들을 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

다른 실시형태에서, 제1 성분 중의 카르복실산 에스테르는 모노아세틴, 다이아세틴, 트라이아세틴 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 제1 성분 중의 카르복실산 에스테르는 아세틸화 당류이다. 다른 실시형태에서, 제1 성분 중의 효소 촉매는 미립자 고체, 액체 또는 겔일 수 있다. 다른 실시형태에서, 제1 반응 성분은 고체 정제 또는 분말일 수 있다.

퍼옥시카르복실산은 매우 반응성이 있으며, 일반적으로 시간이 지남에 따라 농도가 감소된다. 이는 특히 종종 장기간 안정성이 결여된 시판용 사전-형성된 퍼옥시카르복실산 조성물에 대하여 그러하다. 또한, 특히 큰 용기 및/또는 매우 농축된 퍼옥시카르복실산 용액을 더 긴 거리로 운송하는 경우, 사전-형성된 퍼옥시카르복실산 수용액은 취급 및/또는 운송의 어려움을 나타낼 수 있다. 추가로, 사전-형성된 퍼옥시카르복실산 용액은 특정 표적 응용을 위해 원하는 농도의 퍼옥시카르복실산을 제공할 수 없을 수 있다. 이와 같이, 특히 액체 제형을 위해 다양한 반응 성분을 분리되게 유지하는 것이 매우 바람직하다.

원하는 퍼옥시카르복실산을 생성하기 위해 배합되는 둘 이상의 성분을 포함하는 다성분 퍼옥시카르복실산 생성 시스템의 이용이 보고되어 있다. 개별 성분은 연장된 기간 동안 안정적이며, 취급하기에 안전해야 한다(다시 말하면, 혼합 시에 생성되는 퍼옥시카르복실산의 농도로 측정시). 일 실시형태에서, 다성분 효소적 퍼옥시카르복실산 생성 시스템의 저장 안정성은 효소 촉매 안정성에 관하여 측정될 수 있다.

원하는 퍼옥시카르복실산 농도를 갖는 과산 수용액을 빠르게 생성하기 위해 효소 촉매를 사용하는, 다성분 퍼옥시카르복실산 생성 제형을 포함하는 개인 관리 제품이 본 명세서에 제공된다. 혼합은 사용 직전에 및/또는 적용 부위(동소)에서 발생할 수 있다. 일 실시형태에서, 개인 관리 제품 제형은 사용될 때까지 분리되어 유지되는 적어도 2개의 성분으로 이루어질 것이다. 성분의 혼합에 의해, 과산 수용액이 신속하게 형성된다. 생성된 과산 수용액이 의도된 최종 용도에 적절한 유효 농도의 과산을 포함하도록 각 성분이 고안된다. 개별 성분의 조성은 (1) 연장된 저장 안정성을 제공하고/거나 (2) 퍼옥시카르복실산으로 이루어진 적절한 수성 반응 제형의 형성을 증진시키는 능력을 제공하도록 고안되어야 한다.

다성분 제형은 적어도 2개의 실질적으로 액체인 성분으로 이루어질 수 있다. 일 실시형태에서, 다성분 제형은 제1 액체 성분 및 제2 액체 성분을 포함하는 2성분 제형일 수 있다. 용어 "제1" 또는 "제2" 액체 성분의 이용은 상대적이되, 단 특정 성분을 포함하는 2가지 상이한 액체 성분은 사용할 때까지 분리되어 유지된다. 최소한도로, 다성분 퍼옥시카르복실산 제형은 (1) 과가수분해 활성을 가지며, 바람직하게는 CE-7 에스테라제로 분류된 적어도 하나의 효소 촉매, (2) 카르복실산 에스테르 기질 및 (3) 과산소원 및 물을 포함하며, 제형은 성분의 혼합시에 원하는 과산을 효소에 의해 생성한다.

2성분 제형에 사용되는 다양한 성분의 유형 및 양은 (1) 각 성분의 저장 안정성, 특히 효소 촉매의 과가수분해 활성 및 (2) 용해성 및/또는 원하는 퍼옥시카르복실산 수용액을 효율적으로 형성하는 능력을 증진시키는 물리적 특성을 제공하도록 조심히 선택되고, 균형을 이루어야 한다(예를 들어, 수성 반응 혼합물 중의 에스테르 기질의 용해성을 증진시키는 성분 및/또는 적어도 하나의 액체 성분의 점도 및/또는 농도를 변경하는 성분[다시 말하면, 효소에 의한 과가수분해 활성에 대한 상당한 역효과를 갖지 않는 적어도 하나의 공용매]).

효소에 의한 과산 생성 시스템의 성능 및/또는 촉매 안정성을 향상시키는 다양한 방법이 개시된다. 미국 특허 출원 공개 제2010-0048448 A1호에는 용해성 및/또는 특정 에스테르 기질의 혼합 특징을 증진시키는 적어도 하나의 공용매의 이용이 기재된다. 또한, 본 발명의 개인 관리 조성물 및 방법은 공용매를 사용할 수 있다. 일 실시형태에서, 카르복실산 에스테르 기질 및 과가수분해효소 촉매를 포함하는 성분은 Log P 값이 약 2 미만인 유기 용매를 포함하며, Log P는 P = [용질]_옥탄올/[용질]_물로 표현되는 옥탄올과 물 사이의 기질의 분배 계수의 로그로 정의된다. 효소 활성에 대한 유의미한 역효과를 갖지 않는 log P 값이 2 이하인 몇몇 공용매가 기재된다. 다른 실시형태에서, 공용매는 카르복실산 에스테르 기질 및 효소를 포함하는 반응 성분 내에서 약 20 wt% 내지 약 70 wt%이다. 카르복실산 기질 및 효소를 포함하는 반응 성분은 임의로, 하나 이상의 완충제(예를 들어, 바이카르보네이트, 시트레이트, 아세테이트, 포스페이트, 피로포스페이트, 메틸포스포네이트, 석시네이트, 말레이트, 푸마레이트, 타르트레이트 및 말레에이트의 나트륨 및/또는 칼륨 염)를 포함할 수 있다.

미국 특허 출원 공개 제2010-0086534 A1호에는 2성분 시스템의 용도가 기재되어 있으며, 여기서, 제1 성분은 액체 카르복실산 에스테르와 고체 효소 분말의 제형을 포함하며, 상기 효소 분말은 (a) 과가수분해 활성을 갖는 적어도 하나의 CE-7 에스테라제 및 (b) 적어도 하나의 올리고당 부형제의 제형을 포함하며; 제2 성분은 과산소원 및 과산화수소 안정화제를 갖는 물을 포함한다. 본 발명의 개인 관리 조성물 및 방법은 미국 특허 출원 공개 US 2010-0086534 A1호에 기재된 시스템과 유사한 2성분 제형을 사용할 수 있다. 이와 같이, 올리고당 부형제를 사용하여 효소 활성의 안정화를 도울 수 있다. 일 실시형태에서, 올리고당 부형제는 수평균 분자량이 적어도 약 1250일 수 있고, 중량평균 분자량이 적어도 약 9000일 수 있다. 다른 실시형태에서, 올리고당 부형제는 수평균 분자량이 적어도 약 1700이고, 중량평균 분자량이 적어도 약 15000이다. 다른 실시형태에서, 올리고당은 말토덱스트린이다.

또한, 미국 특허 출원 공개 제2010-0086535-A1호에는 2성분 시스템이 기재되어 있으며, 여기서, 제1 성분은 액체 카르복실산 에스테르와 고체 효소 분말의 제형을 포함하며, 상기 제형은 (a) 과가수분해 활성을 갖는 적어도 하나의 CE-7 에스테라제 및 적어도 하나의 올리고당 부형제 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함하는 효소 분말; 및 (b) 적어도 하나의 완충제를 포함하고, 바람직한 실시형태에서, 완충제는 분리된(다시 말하면, 효소 분말과 분리된) 불용성 성분으로서 카르복실산 에스테르 기질에 첨가되고; 제2 성분은 과산소원 및 과산화수소 안정화제를 갖는 물을 포함한다. 본 발명의 개인 관리 조성물 및 방법은 미국 특허 출원 공개 제2010-0086535 A1호에 기재된 시스템과 유사한 2성분 제형을 사용할 수 있다. 일 실시형태에서, 부형제는 수평균 분자량이 적어도 약 1250이고, 중량평균 분자량이 적어도 약 9000인 올리고당 부형제일 수 있다. 다른 실시형태에서, 올리고당 부형제는 수평균 분자량이 적어도 약 1700일 수 있고, 중량평균 분자량이 적어도 약 15000일 수 있다. 다른 실시형태에서, 올리고당은 말토덱스트린이다. 추가의 실시형태에서, 임의의 pH 완충제는 바이카르보네이트 완충제이다. 추가의 실시형태에서, 과산화수소 안정화제는 터피날(TURPINAL)(등록 상표) SL이다.

효소 분말

일부 실시형태에서, 개인 관리 조성물은 안정화된 효소 분말 형태의 효소 촉매를 사용할 수 있다. 효소 분말을 포함하는 제형을 제조하고 안정화시키는 방법은 미국 특허 출원 공개 제2010-0086534호 및 제2010-0086535호에 기재되어 있다.

일 실시형태에서, 효소는 효소 분말의 건조 중량에 기초하여, 약 5 중량 퍼센트(wt%) 내지 약 75 wt% 범위의 양으로 효소 분말에 존재할 수 있다. 효소 분말/분무-건조된 혼합물 중의 효소의 바람직한 중량% 범위는 약 10 wt% 내지 50 wt%이며, 효소 분말/분무-건조된 혼합물 중의 효소의 더욱 바람직한 중량% 범위는 약 20 wt% 내지 33 wt%이다.

일 실시형태에서, 효소 분말은 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 일 태양에서, 부형제는 효소 분말의 건조 중량에 기초하여 약 95 wt% 내지 약 25 wt%의 범위의 양으로 제공된다. 효소 분말 중의 부형제의 바람직한 wt% 범위는 약 90 wt% 내지 50 wt%이며, 효소 분말 중의 부형제의 더욱 바람직한 wt% 범위는 약 80 wt% 내지 67 wt%이다.

일 실시형태에서, 효소 분말을 제조하기 위해 사용되는 부형제는 올리고당 부형제일 수 있다. 일 실시형태에서, 올리고당 부형제는 수평균 분자량이 적어도 약 1250이고, 중량평균 분자량이 적어도 약 9000이다. 일부 실시형태에서, 올리고당 부형제는 수평균 분자량이 적어도 약 1700이고, 중량평균 분자량이 적어도 약 15000이다. 특정 올리고당은 말토덱스트린, 자일란, 만난, 후코이단, 갈락토만난, 키토산, 라피노스, 스타키오스, 펙틴, 인슐린, 레반, 그라미난, 아밀로펙틴, 수크로스, 락툴로스, 락토스, 말토스, 트레할로스, 셀로비오스, 니제로트라이오스(nigerotriose), 말토트라이오스, 멜레지토스, 말토트라이울로스(maltotriulose), 라피노스, 케스토스(kestose) 및 그들의 혼합물을 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 올리고당 부형제는 말토덱스트린이다. 또한, 올리고당계 부형제는 수용성 비이온성 셀룰로스 에테르, 예를 들어, 하이드록시메틸-셀룰로스 및 하이드록시프로필메틸셀룰로스 및 그들의 혼합물을 포함할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 추가의 실시형태에서, 부형제는 하기의 화합물 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있으나 이들에 한정되지 않는다: 트레할로스, 락토스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 글루코스, 셀로비오스, α-사이클로덱스트린 및 카르복시메틸셀룰로스.

제형은 적어도 하나의 임의의 계면활성제를 포함할 수 있으며, 여기서, 적어도 하나의 계면활성제의 존재가 바람직하다. 계면활성제는 이온성 및 비이온성 계면활성제 또는 습윤제, 예를 들어, 에톡실화 피마자유, 폴리글리콜화 글리세리드, 아세틸화 모노글리세리드, 소르비탄 지방산 에스테르, 폴록사머, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 유도체, 모노글리세리드 또는 그의 에톡실화 유도체, 다이글리세리드 또는 그의 폴리옥시에틸렌 유도체, 소듐 도쿠세이트, 소듐 라우릴설페이트, 콜린산 또는 그의 유도체, 레시틴, 인지질, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜의 블록 코폴리머 및 비이온성 유기규소를 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르이며, 폴리소르베이트 80이 더욱 바람직하다.

제형이 효소 분말을 포함하는 경우, 분말을 제조하는데 사용되는 계면활성제는 효소 분말에 존재하는 단백질의 중량에 기초하여, 약 5 wt% 내지 0.1 wt%, 바람직하게는 효소 분말에 존재하는 단백질의 중량에 기초하여, 약 2 wt% 내지 0.5 wt% 범위의 양으로 존재할 수 있다.

효소 분말은 추가로 하나 이상의 완충제(예를 들어, 바이카르보네이트, 시트레이트, 아세테이트, 포스페이트, 피로포스페이트, 메틸포스포네이트, 석시네이트, 말레이트, 푸마레이트, 타르트레이트 및 말레에이트의 나트륨 및/또는 칼륨 염), 및 효소 안정화제(예를 들어, 에틸렌다이아민테트라아세트산, (1-하이드록시에틸리덴)비스포스폰산)를 포함할 수 있다.

효소 분말을 형성하기 위한 제형의 분무 건조는 예를 들어, 문헌[Spray Drying Handbook, 5^th ed., K. Masters, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1991)] 및 PCT 특허 출원 공개 WO 97/41833호 및 WO 96/32149호(Platz, R. et al.)에 일반적으로 기재된 바와 같이 수행된다.

일반적으로, 분무 건조는 고도로 분산된 액체와 충분한 양의 고온 공기가 함께 있게 하여 증발을 초래하는 하는 단계 및 액적을 건조시키는 단계로 구성된다. 전형적으로, 공급물은 용매를 증발시키고 건조된 생성물을 수집기로 이동시키는 따뜻한 여과된 공기의 흐름으로 분무된다. 소모된 공기는 이어서 용매와 함께 배기된다. 당업자는 몇몇 상이한 유형의 장치를 사용하여 원하는 제품을 제공할 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 부치 리미티드(Buchi Ltd.)(스위스 포스트파치 소재) 또는 지이에이 니로 코포레이션(GEA Niro Corp.)(덴마크 코펜하겐 소재)에 의해 제조되는 시판용 분무 건조기는 원하는 크기의 입자를 효율적으로 생성할 것이다. 특히 이중 노즐 기술을 사용하는 2가지 용액의 동시의 분무와 같은 특정 응용을 위해 이들 분무 건조기 및 그들의 아토마이저(atomizer)가 변경되거나 맞춤화될 수 있음을 추가로 인식할 것이다. 더욱 구체적으로, 유중수형 에멀젼은 하나의 노즐로부터 무화될 수 있으며, 만니톨과 같은 부착-방지제(anti-adherent)를 함유하는 용액을 제2 노즐로부터 공동-무화할 수 있다. 다른 경우에, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 펌프를 사용하여 맞춤 설계된 노즐을 통해 공급 용액을 밀어내는 것이 바람직할 수 있다. 정확한 형태 및/또는 조성을 포함하는 미세구조체가 생성된다면, 장치의 선택은 중요하지 않으며, 본 명세서의 교시에 비추어 당업자에게 명백할 것이다.

분무된 재료를 건조시키는데 사용되는 기체의 양쪽 입구 및 출구의 온도는 분무된 재료에서 효소의 분해를 야기하지 않는 정도이다. 이러한 온도는 전형적으로 실험에 의해 측정되지만, 일반적으로, 입구 온도는 약 50℃ 내지 약 225℃ 범위이면서 출구 온도는 약 30℃ 내지 약 150℃ 범위일 것이다. 바람직한 파라미터는 약 0.14 ㎫ 내지 1.03 ㎫(20 내지 150 psi), 바람직하게는 약 0.21-0.28 ㎫ 내지 0.69 ㎫(30-40 내지 100 psi) 범위의 무화 압력을 포함한다. 전형적으로, 사용되는 무화 압력은 다음 중 하나일 것이다(㎫): 0.14, 0.21, 0.28, 0.34, 0.41, 0.48, 0.55, 0.62, 0.69, 0.76, 0.83 또는 그 이상.

일 실시형태에서, "실질적으로 그의 효소적 활성을 유지한다"는 카르복실산 에스테르 중의 효소 분말 또는 효소 분말 제형이 카르복실산 에스테르 및 효소 분말로 이루어진 제형의 제조 전의 효소 분말의 초기 효소 활성에 비하여, 주위 온도에서의 연장된 저장 기간 후에 및/또는 고온(주위 온도 초과)에서의 짧은 저장 기간 후에, 카르복실산 에스테르 및 효소 분말로 이루어진 제형에서의 효소 분말 또는 효소 분말 제형 중의 효소의 효소 활성의 적어도 약 75%를 유지하는 것을 의미한다. 연장된 저장 기간은 주위 온도에서의 약 1년 내지 약 2년의 기간이다. 일 실시형태에서, 고온에서 짧은 저장 기간은 카르복실산 에스테르 및 효소 분말로 이루어진 제형이 40℃에서 생성되는 때로부터 40℃에서 약 8주까지의 기간이다. 다른 실시형태에서, 고온은 약 30℃ 내지 약 52℃의 범위이다. 바람직한 실시형태에서, 고온은 약 30℃ 내지 약 40℃ 범위이다.

일부 실시형태에서, 효소 분말은 40℃에서 카르복실산 에스테르 및 효소 분말로 이루어진 제형의 제조 전의 효소 분말의 초기 효소 활성에 비하여, 40℃에서 8주의 저장 후에 카르복실산 에스테르 및 효소 분말로 이루어진 제형 중에, 효소 활성의 적어도 75%를 유지한다. 다른 실시형태에서, 효소 분말은 40℃에서 카르복실산 에스테르 및 효소 분말로 이루어진 제형의 제조 전의 효소 분말의 초기 효소 활성에 비하여, 40℃에서의 8주의 저장 후에 카르복실산 에스테르 및 효소 분말로 이루어진 제형에서 적어도 하나의 효소의 효소 활성의 적어도 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%를 유지한다. 바람직하게는, 과가수분해 활성은 미국 특허 출원 공개 제2010-0086510호의 실시예 8 내지 13에 기재된 바와 같이 측정되나; 과가수분해 활성의 임의의 측정 방법이 사용될 수 있다.

언급된 기간에 걸친 효소 활성의 추가의 향상은 미국 특허 출원 공개 제2010-0086534호에 기재된 바와 같이, 약 5.5 내지 약 9.5의 pH 범위의 완충 능력을 갖는 완충제를 카르복실산 에스테르 및 분무-건조된 효소 분말로 이루어진 제형에 첨가함으로써 달성될 수 있다. 적절한 완충제는 바이카르보네이트, 피로포스페이트, 포스페이트, 메틸포스포네이트, 시트레이트, 아세테이트, 말레이트, 푸마레이트, 타르트레이트, 말레에이트 또는 석시네이트의 나트륨 염, 칼륨 염 또는 나트륨 또는 칼륨 염의 혼합물을 포함할 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 카르복실산 에스테르 및 분무-건조된 효소 분말로 이루어진 제형에서 사용하기에 바람직한 완충제는 바이카르보네이트, 피로포스페이트, 포스페이트, 메틸포스포네이트, 시트레이트, 아세테이트, 말레이트, 푸마레이트, 타르트레이트, 말레에이트, 또는 석시네이트의 나트륨 염, 칼륨 염, 또는 나트륨 또는 칼륨 염의 혼합물을 포함한다.

완충제가 카르복실산 에스테르 및 효소 분말 제형에 존재할 수 있는 실시형태에서, 완충제는 카르복실산 에스테르 및 효소 분말로 이루어진 제형 중의 카르복실산 에스테르의 중량에 기초하여, 약 0.01 wt% 내지 약 50 wt% 범위의 양으로 존재할 수 있다. 완충제는 카르복실산 에스테르 및 효소 분말로 이루어진 제형 중의 카르복실산 에스테르의 중량에 기초하여, 약 0.10% 내지 약 10%의 더욱 바람직한 범위로 존재할 수 있다. 추가로, 이들 실시형태에서, 효소의 과가수분해 활성 간의 비교는 카르복실산 에스테르, 약 5.5 내지 약 9.5의 pH 범위에서 완충 능력을 갖는 완충제 및 효소 분말로 이루어진 제형의 제조 전의 효소 분말의 초기 과가수분해 활성에 비한, 40℃에서의 8주의 저장 후에 카르복실산 에스테르, 약 5.5 내지 약 9.5의 pH 범위에서 완충 능력을 갖는 완충제 및 효소 분말로 이루어진 제형에서 적어도 하나의 효소의 과가수분해 활성의 적어도 75%를 유지하는 효소 분말 간의 비교로 결정된다.

건조 효소 분말이 적어도 하나의 효소에 대한 기질인 유기 화합물, 예를 들어, 트라이아세틴 중의 제형으로 저장되는 것으로 의도된다. 첨가되는 과산화수소의 부재 하에, 트라이아세틴은 보통 CE-7 탄수화물 에스테라제에 의해 수용액 중에서 가수분해되어, 다이아세틴 및 아세트산을 생성하며, 아세트산의 생성에 의해, 반응 혼합물의 pH의 감소가 야기된다. 트라이아세틴 중의 효소의 장기간 저장 안정성을 위한 하나의 요건은 트라이아세틴 중에 존재할 수 있는 임의의 물과 트라이아세틴의 유의미한 반응이 존재하지 않는 것이며; 하나의 시판용 트라이아세틴(벨기에 브뤼셀 소재의 테센델로 그룹(Tessenderlo Group)에 의해 공급) 중의 수분 함량에 대한 명시는 0.03 wt%의 물(300 ppm)이다. 트라이아세틴 중의 효소의 저장 동안 발생하는 트라이아세틴의 임의의 가수분해에 의해, 아세트산이 생성될 것이며, 이는 CE-7 과가수분해효소의 활성의 감소 또는 CE-7 과가수분해효소의 불활성화를 야기할 수 있고; 과가수분해효소는 전형적으로 pH 5.0 이하에서 불활성화된다(미국 특허 출원 공개 제2009-0005590호(DiCosimo, R., et al) 참조). 본 출원서에서 사용하기 위해 선택된 부형제는 아세트산이 제형 중의 낮은 농도의 물의 존재에 기인하여 생성될 수 있는 조건 하의 효소를 위하여, 유기 기질 중에서의 효소의 안정성을 제공해야 한다. 건조 효소 분말은 적어도 하나의 효소에 대한 기질인 유기 화합물 중의 제형으로 저장될 수 있으며, 여기서, 제형은 추가로 부형제 및 하나 이상의 완충제(예를 들어, 바이카르보네이트, 시트레이트, 아세테이트, 포스페이트, 피로포스페이트, 메틸포스포네이트, 석시네이트, 말레이트, 푸마레이트, 타르트레이트 및 말레에이트의 나트륨 및/또는 칼륨 염)를 포함한다.

효소에 의해 촉매작용되는, 카르복실산 에스테르 및 과산화수소로부터의 과산의 제조에 적절한 반응 조건

본 발명의 개인 관리 조성물 및 방법에서, 과가수분해 활성을 갖는 하나 이상의 효소를 사용하여 유효 농도의 원하는 과산(들)을 생성할 수 있다. 원하는 퍼옥시카르복실산은 카르복실산 에스테르를 과가수분해 활성을 갖는 효소 촉매의 존재 하에 과산화수소, 과산화아연, 과산화나트륨, 우레아 퍼옥시드, 과산화칼슘, 과붕산나트륨, 과탄산나트륨, 또는 과산화수소의 복합체를 포함하나 이들에 한정되지 않는 과산소원과 반응시킴으로써 제조될 수 있다.

표적화된 과가수분해효소 내의 과가수분해 효소는 임의의 과가수분해 효소일 수 있으며, 효소가 본 발명의 하나 이상의 기질에 대하여 과가수분해 활성을 갖는 한, 리파제, 프로테아제, 에스테라제, 아실 트랜스퍼라제, 아릴 에스테라제, 탄수화물 에스테라제 및 조합물을 포함할 수 있다. 예에는 과가수분해 프로테아제(서브틸리신 변이체; 미국 특허 제7,510,859호), 과가수분해 에스테라제(슈도모나스 플루오레슨스; 미국 특허 제7,384,787호; "L29P" 변이체 서열 번호 477) 및 과가수분해 아릴 에스테라제(마이코박테리움 스메그마티스; 미국 특허 제7,754,460호; WO2005/056782호; 및 EP1689859 B1호; 서열 번호 460[S54V 변이체] 및 478[야생형])가 포함될 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.

일 실시형태에서, 효소 촉매는 과가수분해효소 활성을 갖는 적어도 하나의 효소를 포함하며, 상기 효소는 구조적으로, CE-7 탄수화물 에스테라제 패밀리(CE-7; 상기 문헌[Coutinho, P.M., and Henrissat, B.] 참조)의 구성원으로 분류된다. 다른 실시형태에서, 과가수분해효소 촉매는 구조적으로, 세팔로스포린 C 데아세틸라제로 분류된다. 다른 실시형태에서, 과가수분해효소 촉매는 구조적으로, 아세틸 자일란 에스테라제로 분류된다.

일 실시형태에서, 과가수분해효소 촉매는 과가수분해 활성, 및

a) 서열 번호 2의 아미노산 잔기 118 내지 120과 정렬되는 RGQ 모티프;

b) 서열 번호 2의 아미노산 잔기 179 내지 183과 정렬되는 GXSQG 모티프; 및

c) 서열 번호 2의 아미노산 잔기 298 및 299와 정렬되는 HE 모티프를 포함하는 시그니처 모티프를 갖는 효소를 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 서열 번호 2의 참조 서열에 대한 정렬은 클러스털더블유를 사용하여 수행된다.

추가의 실시형태에서, 추가의 CE-7 시그니처 모티프가 포함될 수 있으며, 추가의(즉, 제4) 모티프는 클러스털더블유를 사용하여 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬하는 경우 아미노산 잔기 267 내지 269에서의 LXD 모티프로 정의된다.

다른 실시형태에서, 과가수분해효소 촉매는 과가수분해효소 활성을 갖는 효소를 포함하며, 상기 효소는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 424, 437 및 476으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다.

다른 실시형태에서, 과가수분해효소 촉매는 과가수분해효소 활성을 갖는 효소를 포함하며, 상기 효소는 서열 번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 424, 437 및 476으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 가지며, 상기 효소는 시그니처 모티프가 보존되고, 과가수분해효소 활성이 유지되는 한 하나 이상의 부가, 결실 또는 치환을 가질 수 있다.

상술된 바와 같이, CE-7 과가수분해효소는 CE-7 과가수분해효소를 포함하는 제1 부분, 및 과가수분해효소가 원하는 체표면에 "표적화"되도록 표적 체표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분을 포함하는 제2 부분을 갖는 융합 단백질일 수 있다. 일 실시형태에서, 임의의 CE-7 과가수분해효소(CE-7 시그니처 모티프의 존재로 정의)는 효소를 체표면에 표적화시킬 수 있는 임의의 펩티드 성분/결합 요소에 융합될 수 있다. 일 태양에서, 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분은 항체, 항체 단편(F_ab)뿐 아니라 단쇄 가변 단편(scFv; 면역글로불린의 중쇄(V_H) 및 경쇄(V_L)의 가변 영역의 융합), 단일 도메인 카멜리드 항체, 스캐폴드 디스플레이 단백질 및 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 친화성 펩티드를 포함할 수 있다. 항체, 항체 단편 및 다른 면역글로불린-유래의 결합 요소뿐 아니라 라지 스캐폴드 디스플레이 단백질을 포함하는 조성물은 종종 경제적으로 실행가능하지 않다. 이와 같이, 그리고 바람직한 태양에서, 펩티드 성분/결합 요소는 면역글로불린 폴드 및/또는 면역글로불린 도메인이 결여된 단쇄 친화성 펩티드이다. 짧은 단쇄 체표면-결합 펩티드는 실험에 의해 생성하거나(예를 들어, 음으로 하전된 표면에 표적화된 양으로 하전된 폴리펩티드) 또는 표적 체표면에 대한 바이오패닝을 사용하여 생성할 수 있다. 많은 디스플레이 기술(예를 들어, 파지 디스플레이, 효모 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 리보솜 디스플레이 및 mRNA 디스플레이)을 사용하여 친화성 펩티드를 확인/수득하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 개별 구강 표면-결합 펩티드는 임의의 스페이서/링커를 통해 함께 결합되어 더 큰 결합 "도메인"(본 명세서에서 결합 "손(hand)"으로도 지칭)을 형성하여, 과가수분해 효소의 표적 구강 표면으로의 부착/국소화를 증진시킬 수 있다.

또한, 융합 단백질은 CE-7 과가수분해효소 및 구강 표면-결합 도메인 및/또는 상이한 구강 표면-결합 펩티드(예를 들어, 복수의 구강 표면 결합 펩티드가 함께 결합되어 더 큰 표적 구강 표면 결합 도메인을 형성하는 경우) 사이를 분리하는 하나 이상의 펩티드 링커/스페이서를 포함할 수 있다. 다수의 펩티드 링커/스페이서가 존재할 수 있으며, 링커의 수는 최대 10회 반복될 수 있다. 예시적인 펩티드 스페이서의 비제한적인 목록은 서열 번호 383 내지 396의 아미노산 서열 및 표 5에 예시된 것으로 제공된다.

구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 적절한 펩티드는 본 명세서에서 상기에 기재되어 있다. 상기 "디스플레이" 기술 중 임의의 것을 사용하는 추가의 구강 표면-결합 펩티드의 확인 방법은 당업계에 널리 알려져 있으며, 이를 사용하여 추가의 구강 표면-결합 펩티드를 확인할 수 있다.

적절한 카르복실산 에스테르 기질은 하기의 화학식을 갖는 에스테르를 포함할 수 있다:

(a) 구조

[X]_mR₅

(여기서,

X는 화학식 R₆C(O)O의 에스테르기이며;

(b) 구조

(c) 화학식

(e) (a) 내지 (d)의 임의의 조합.

또한, 적절한 기질은 아실화 단당류, 이당류 및 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아실화 당류를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 아실화 당류는 아세틸화 자일란; 아세틸화 자일란의 단편; 아세틸화 자일로스(예컨대, 자일로스 테트라아세테이트); 아세틸화 글루코스(예컨대, α-D-글루코스 펜타아세테이트; β-D-글루코스 펜타아세테이트; 1-티오-β-D-글루코스-2,3,4,6-테트라아세테이트); β-D-갈락토스 펜타아세테이트;소르비톨 헥사아세테이트; 수크로스 옥타아세테이트; β-D-리보푸라노스-1,2,3,5-테트라아세테이트; β-D-리보푸라노스-1,2,3,4-테트라아세테이트; 트라이-O-아세틸-D-갈락탈; 트라이-O-아세틸-D-글루칼; β-D-자일로푸라노스 테트라아세테이트, α-D-글루코피라노스 펜타아세테이트; β-D-글루코피라노스-1,2,3,4-테트라아세테이트; β-D-글루코피라노스-2,3,4, 6-테트라아세테이트; 2-아세트아미도-2-데옥시-1,3,4,6-테트라아세틸-β-D-글루코피라노스; 2-아세트아미도-2-데옥시-3,4,6-트라이아세틸-1-클로라이드-α-D-글루코피라노스; α-D-만노피라노스 펜타아세테이트 및 아세틸화 셀룰로스로 이루어진 군으부터 선택된다. 바람직한 실시형태에서, 아세틸화 당류는 β-D-리보푸라노스-1,2,3,5-테트라아세테이트; 트라이-O-아세틸-D-갈락탈; 트라이-O-아세틸-D-글루칼; 수크로스 옥타아세테이트; 및 아세틸화 셀룰로스로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 실시형태에서, 추가의 적절한 기질은 또한 5-아세톡시메틸-2-푸르알데히드; 3,4-다이아세톡시-1-부텐; 4-아세톡시벤조산; 바닐린 아세테이트; 프로필렌 글리콜 메틸 에테르 아세테이트; 메틸 락테이트; 에틸 락테이트; 메틸 글리콜레이트; 에틸 글리콜레이트; 메틸 메톡시아세테이트; 에틸 메톡시아세테이트; 메틸 3-하이드록시부티레이트; 에틸 3-하이드록시부티레이트; 및 트라이에틸 2-아세틸 시트레이트를 포함할 수 있다.

다른 실시형태에서, 적절한 기질은 모노아세틴; 다이아세틴; 트라이아세틴; 모노프로피오닌; 다이프로피오닌; 트라이프로피오닌; 모노부티린; 다이부티린; 트라이부티린; 글루코스 펜타아세테이트; 자일로스 테트라아세테이트; 아세틸화 자일란; 아세틸화 자일란 단편; β-D-리보푸라노스-1,2,3,5-테트라아세테이트; 트라이-O-아세틸-D-갈락탈; 트라이-O-아세틸-D-글루칼; 1,2-에탄다이올; 1,2-프로판다이올; 1,3-프로판다이올; 1,2-부탄다이올; 1,3-부탄다이올; 2,3-부탄다이올; 1,4-부탄다이올; 1,2-펜탄다이올; 2,5-펜탄다이올; 1,5-펜탄다이올; 1,6-펜탄다이올; 1,2-헥산다이올; 2,5-헥산다이올; 1,6-헥산다이올의 모노에스테르 또는 다이에스테르; 및 그들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 기질은 하나 이상의 에스테르기를 포함하는 C1 내지 C6 폴리올이다. 바람직한 실시형태에서, C1 내지 C6 폴리올 상의 하나 이상의 하이드록실기는 하나 이상의 아세톡시기(예를 들어, 1,3-프로판다이올 다이아세테이트; 1,2-프로판다이올 다이아세테이트; 1,4-부탄다이올 다이아세테이트; 1,5-펜탄다이올 다이아세테이트 등)로 치환된다. 추가의 실시형태에서, 기질은 프로필렌 글리콜 다이아세테이트(PGDA), 에틸렌 글리콜 다이아세테이트(EGDA) 또는 그들의 혼합물이다.

추가의 실시형태에서, 적절한 기질은 모노아세틴, 다이아세틴, 트라이아세틴, 모노프로피오닌, 다이프로피오닌, 트라이프로피오닌, 모노부티린, 다이부티린 및 트라이부티린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 태양에서, 기질은 다이아세틴 및 트라이아세틴으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 실시형태에서, 적절한 기질은 트라이아세틴을 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 카르복실산 에스테르는 모노아세틴, 다이아세틴, 트라이아세틴 및 그들의 조합(즉, 혼합물)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 액체 기질이다. 카르복실산 에스테르는 효소-촉매작용되는 과가수분해시에 원하는 농도의 퍼옥시카르복실산을 생성하기에 충분한 농도로 반응 제형에 존재한다. 카르복실산 에스테르는 반응 제형 중에서 완전히 용해성일 필요는 없으나, 과가수분해효소 촉매에 의한 에스테르의 상응하는 퍼옥시카르복실산으로의 전환을 가능하게 하기에 충분한 용해성을 갖는다. 카르복실산 에스테르는 반응 제형의 0.05 wt% 내지 40 wt%의 농도, 바람직하게는 반응 제형의 0.1 wt% 내지 20 wt%의 농도, 더욱 바람직하게는 반응 제형의 0.5 wt% 내지 10 wt%의 농도로 반응 제형 중에 존재한다.

과산소원은 과산화수소, 과산화수소 부가물(예를 들어, 우레아-과산화수소 부가물(카르바미드 퍼옥시드)), 과붕산염, 과탄산염 및 과산화염을 포함할 수 있으나 이들에 한정되지 않는다. 반응 제형 중의 과산소 화합물의 농도는 0.0033 wt% 내지 약 50 wt%, 바람직하게는 0.033 wt% 내지 약 40 wt%, 더욱 바람직하게는 0.1 wt% 내지 약 30 wt%의 범위일 수 있다.

또한, 과산소원(즉, 과산화수소)은 유효량의 과산화수소를 생성할 수 있는 효소를 사용하여 효소에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 글루코스 산화효소, 락토스 산화효소, 탄수화물 산화효소, 알코올 산화효소, 에틸렌 글리콜 산화효소, 글리세롤 산화효소 및 아미노산 산화효소를 포함하나 이들에 한정되지 않는 다양한 산화효소가 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용되어, 유효량의 과산화수소를 생성할 수 있다.

많은 과가수분해효소 촉매(전체 세포, 투과화된 전체 세포 및 부분 정제된 전체 세포 추출물)는 카탈라아제 활성(EC 1.11.1.6)을 갖는 것으로 보고되었다. 카탈라아제는 과산화수소의 산소 및 물로의 전환을 촉매작용시킨다. 일 태양에서, 과가수분해 촉매에는 카탈라아제 활성이 결여되어 있다. 다른 태양에서, 카탈라아제 억제제는 반응 제형에 첨가될 수 있다. 당업자는 필요에 따라 카탈라아제 억제제의 농도를 조절할 수 있다. 카탈라제 억제제의 농도는 통상 0.1 mM 내지 약 1 M; 바람직하게는 약 1 mM 내지 약 50 mM; 더욱 바람직하게는 약 1 mM 내지 약 20 mM의 범위이다.

다른 실시형태에서, 효소 촉매에는 상당한 카탈라아제 활성이 결여되거나, 카탈라아제 활성을 감소시키거나 제거하도록 엔지니어링될 수 있다. 숙주 세포 내의 카탈라아제 활성은 트랜스포손(transposon) 돌연변이유발, RNA 안티센스 발현, 표적화된 돌연변이유발 및 무작위 돌연변이유발을 포함하나 이에 한정되지 않는 널리 공지되어 있는 기술을 사용하여 카탈라아제 활성을 담당하는 유전자(들)의 발현을 파괴시킴으로써 하향 조절되거나 제거될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 내인성 카탈라아제 활성을 암호화하는 유전자(들)는 하향 조절되거나 파괴된다(즉, 낙-아웃). 본 명세서에 사용되는 "파괴된" 유전자는 변형된 유전자에 의해 암호화된 단백질의 활성 및/또는 기능이 더이상 존재하지 않는 것이다. 유전자를 파괴시키는 수단은 해당 분야에 널리 공지되어 있으며, 해당하는 단백질의 활성 및/또는 기능이 더이상 존재하지 않는 한, 유전자에 대한 삽입, 결실 또는 돌연변이를 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 추가의 바람직한 실시형태에서, 생성 숙주는 katG 및 katE로 이루어진 군으로부터 선택되는 파괴된 카탈라아제 유전자를 포함하는 에스케리키아 콜라이(E. coli) 생성 숙주이다(미국 특허 출원 공개 제2008-0176299호 참조). 다른 실시형태에서, 생성 숙주는 katG 및 katE 카탈라아제 유전자 둘 모두에서의 하향 조절 및/또는 파괴를 포함하는 에스케리키아 콜라이 균주이다.

수성 반응 제형 중의 촉매의 농도는 촉매의 특정 촉매 활성에 좌우되며, 원하는 반응 속도를 수득하도록 선택된다. 과가수분해 반응물 중의 촉매의 중량은 전형적으로 총 반응 부피 ㎖당 0.0001 ㎎ 내지 10 ㎎, 바람직하게는 ㎖당 0.001 ㎎ 내지 2.0 ㎎ 범위이다. 또한, 촉매는 당업자에게 널리 공지되어 있는 방법을 사용하여 용해성 또는 불용성 지지체 상에 고정화될 수 있으며; 예를 들어, 문헌[Immobilization of Enzymes and Cells; Gordon F. Bickerstaff, Editor; Humana Press, Totowa, NJ, USA; 1997]을 참조한다. 고정화된 촉매의 사용에 의해, 이후의 반응에서 촉매의 회수 및 재사용이 가능하게 된다. 효소 촉매는 전체 미생물 세포, 투과화된 미생물 세포, 미생물 세포 추출물, 부분 정제되거나 정제된 효소 및 그들의 혼합물의 형태일 수 있다.

일 태양에서, 카르복실산 에스테르의 화학적 과가수분해 및 효소에 의한 과가수분해의 조합에 의해 생성되는 퍼옥시카르복실산의 농도는 선택된 개인 관리 응용을 위해 유효 농도의 퍼옥시카르복실산을 제공하기에 충분하다. 다른 태양에서, 본 발명은 효소 및 효소 기질의 조합을 제공하여, 원하는 유효 농도의 퍼옥시카르복실산을 생성하며, 여기서, 첨가되는 효소의 부재 하에서, 유의미하게 더 낮은 농도의 퍼옥시카르복실산의 생성이 존재한다. 일부 경우에, 무기 과산화물과 효소 기질의 직접적인 화학적 반응에 의한 효소 기질의 상당한 화학적 과가수분해가 존재할 수 있지만, 원하는 응용에서 유효 농도의 퍼옥시카르복실산을 제공하기 위해 생성되는 충분한 농도의 퍼옥시카르복실산이 존재하지 않을 수 있으며, 총 퍼옥시카르복실산 농도의 유의미한 증가는 적절한 과가수분해효소 촉매를 반응 제형에 첨가함으로써 달성된다.

적어도 하나의 카르복실산 에스테르의 과가수분해에 의해 생성되는 퍼옥시카르복실산(예를 들어, 과아세트산)의 농도는 과가수분해 반응의 개시 10분 내, 바람직하게는 5분 내에 적어도 약 0.1 ppm, 바람직하게는 적어도 0.5 ppm, 1 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm, 100 ppm, 200 ppm, 300 ppm, 500 ppm, 700 ppm, 1000 ppm, 2000 ppm, 5000 ppm 또는 10,000 ppm의 과산이다. 퍼옥시카르복실산을 포함하는 제품 제형은 임의로, 표적 적용에 대해 원하는 더 낮은 농도의 퍼옥시카르복실산 베이스를 갖는 제형을 생성하도록 물 또는 주로 물로 이루어진 용액으로 희석될 수 있다. 당업자가 반응 성분 및/또는 희석량을 조절하여, 선택된 개인 관리 제품을 위한 원하는 과산 농도를 달성할 수 있는 것이 명백하다.

일 태양에서, 원하는 농도의 과산을 생성하는데 필요한 반응 시간은 약 2시간 이하, 바람직하게는 약 30분 이하, 더욱 바람직하게는 약 10분 이하, 가장 바람직하게는 약 5분 이하이다. 다른 태양에서, 구강 표면은 반응 성분의 배합 5분 내에 본 명세서에 기재된 방법에 따라 형성되는 퍼옥시카르복실산과 접촉된다. 일 실시형태에서, 표적 구강 표면은 상기 반응 성분의 배합 약 5분 내지 약 168시간 내에, 또는 상기 반응 성분의 배합 약 5분 내지 약 48시간 내에, 또는 약 5분 내지 2시간 내에, 또는 그 안의 임의의 이러한 시간 간격으로 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생성되는 퍼옥시카르복실산과 접촉된다.

본 명세서에 기재된 방법에 따라 형성된 과산은 개인 관리 제품/응용에서 사용되며, 과산은 표적 구강 표면과 접촉하여, 과산 기반의 이익을 구강에 제공한다. 일 실시형태에서, 표적 체표면을 위한 과산의 생성 방법은 동소에서 행해진다.

반응의 온도를 선택하여, 반응 속도와 효소 촉매 활성의 안정성 둘 모두를 조절할 수 있다. 명백하게, 특정 개인 관리 응용을 위하여, 표적 체표면의 온도(예를 들어, 구강 내의 37℃)는 반응 온도일 수 있다. 반응 온도는 반응 제형의 동결점 바로 위의 온도(대략 0℃) 내지 약 95℃ 범위일 수 있으며, 바람직한 범위는 5℃ 내지 약 75℃이고, 더욱 바람직한 반응 온도 범위는 약 5℃ 내지 약 55℃이다.

퍼옥시카르복실산을 함유하는 최종 반응 제형의 pH는 약 2 내지 약 9, 바람직하게는 약 3 내지 약 8, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 더더욱 바람직하게는 약 5.5 내지 약 8, 보다 바람직하게는 약 6.0 내지 약 7.5이다. 반응물 및 최종 반응 제형의 pH는 임의로 포스페이트, 피로포스페이트, 바이카르보네이트, 아세테이트 또는 시트레이트를 포함하나 이들에 한정되지 않는 적절한 완충제의 첨가에 의해 조절될 수 있다. 완충제가 사용되는 경우, 완충제의 농도는 전형적으로 0.1 mM 내지 1.0 M, 바람직하게는 1 mM 내지 300 mM, 가장 바람직하게는 10 mM 내지 100 mM이다.

다른 태양에서, 효소에 의한 과가수분해 반응 제형은 분산제로 작용하는 유기 용매를 함유하여, 반응 제형 중의 카르복실산 에스테르의 용해 속도를 증진시킬 수 있다. 이러한 용매는 프로필렌 글리콜 메틸 에테르, 아세톤, 사이클로헥산온, 다이에틸렌 글리콜 부틸 에테르, 트라이프로필렌 글리콜 메틸 에테르, 다이에틸렌 글리콜 메틸 에테르, 프로필렌 글리콜 부틸 에테르, 다이프로필렌 글리콜 메틸 에테르, 사이클로헥산올, 벤질 알코올, 아이소프로판올, 에탄올, 프로필렌 글리콜 및 그들의 혼합물을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.

단일 단계 대 다단계 적용 방법

전형적으로, 과산 유익제를 효소에 의해 생성하기 위한 최소 반응 성분 세트는 (1) 본 명세서에 기재된 과가수분해 활성을 갖는 적어도 하나의 효소, 예를 들어, CE-7 과가수분해효소(임의로, 표적화된 융합 단백질 형태), (2) 적어도 하나의 적절한 카르복실산 에스테르 기질 및 (3) 과산소원을 포함할 것이다.

개인 관리 조성물의 과산 생성 반응 성분은 사용할 때까지 분리되어 유지될 수 있다. 일 실시형태에서, 과산-생성 성분을 배합한 다음, 표적 체표면과 접촉시켜, 이에 의해, 생성되는 과산계 유익제가 체표면에 이익을 제공한다. 성분을 배합한 다음 표적 체표면과 접촉시키거나, 또는 표적 체표면 상에서 배합할 수 있다. 일 실시형태에서, 과산-생성 성분은 과산이 동소에서 생성되도록 배합한다.

또한, 다단계 적용이 사용될 수 있다. 효소에 의한 과산 생성에 필요한 나머지 성분을 적용하기 전에, 과산 생성 시스템(즉, 체표면 상에서의, 3가지 기본 반응 성분 중 적어도 하나의 순차적 적용) 조성물의 1가지 또는 2가지의 개별 성분을 구강 표면과 접촉시킬 수 있다. 일 실시형태에서, 과가수분해 효소는 구강 표면을 카르복실산 에스테르 기질 및/또는 과산소원과 접촉시키기 전에 구강 표면과 접촉시킨다(즉, "2-단계 적용"). 일 실시형태에서, 과가수분해 활성을 갖는 효소는 효소에 의한 과산 생성에 필요한 나머지 성분을 배합하기 전에 구강 표면에 적용되는 표적화된 과가수분해효소이다.

바람직한 실시형태에서, 과가수분해 활성을 갖는 효소는 효소에 의한 과산 생성에 필요한 나머지 성분을 배합하기 전에 구강 표면에 적용되는(즉, 2-단계 적용 방법) "표적화된 CE-7 과가수분해효소"(즉, CE-7 융합 단백질)이다. 표적화된 과가수분해효소는 구강 표면에 대한 융합 단백질의 비공유 결합을 촉진시키는 적절한 조건 하에서 구강 표면과 접촉한다. 나머지 반응 성분을 배합하기 전에, 임의의 헹굼 단계를 사용하여 과잉의 및/또는 미결합 융합 단백질을 제거할 수 있다.

추가의 실시형태에서, 과가수분해 효소(임의로, 구강 표면에 표적화된 융합 단백질 형태) 및 카르복실산 에스테르를 과산소원의 첨가 전에 표적 구강 표면에 적용한다.

추가의 실시형태에서, 과가수분해 효소(임의로 구강 표면에 표적화된 융합 단백질 형태) 및 과산소원(예를 들어, 과산화수소를 포함하는 수용액)을 카르복실산 에스테르 기질의 첨가 전에 구강 표면에 적용한다.

추가의 실시형태에서, 카르복실산 에스테르 기질 및 과산소원(예를 들어, 과산화수소를 포함하는 수용액)을 과가수분해 효소(임의로 구강 표면에 표적화된 융합 단백질 형태)의 첨가 전에 구강 표면에 적용한다.

또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 방법 중 임의의 것이 본 발명을 실시하기 위한 키트에 통합될 수 있다. 키트는 효소에 의한 과산의 생성을 용이하게 하는 재료 및 시약을 포함할 수 있다. 예시적인 키트에는 기질, 과산소원 및 과가수분해 활성을 갖는 효소 촉매가 포함되며, 여기서, 효소 촉매는 임의로 구강 표면에 표적화될 수 있다. 기타 키트 성분은 제한 없이, 다음의 것 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 시료 튜브, 고체 지지체, 지시 자료 및 과산을 효소에 의해 생성하는데 유용한 기타 용액 또는 기타 화학 시약, 예를 들어, 허용가능한 성분 또는 담체.

구강 관리 조성물

구강에 허용가능한 성분/담체/매질

또한, 본 발명의 조성물 및 방법은 구강에 허용가능한 담체뿐 아니라 추가의(즉, 과산계 유익제에 더하여) 구강 관리 유익제를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "구강 관리 유익제"는 원하는/유익한 효과를 제공하거나 구강 표면에 기여하는 화합물 또는 물질에 적용되는 일반 용어이다. 일 실시형태에서, 구강 표면에 대한 유익제는 백색 안료, 예를 들어, 이산화티탄 및 백색 미네랄(white mineral), 예를 들어, 수산화인회석 또는 지르콘을 포함하나 이들에 한정되지 않는 착색제를 (과산계 유익제에 더하여) 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 구강 관리 유익제는 또한 미백제 및 추가의 효소, 예를 들어, 옥시다제, 퍼옥시다제, 프로테아제, 리파제, 글리코시다제, 에스테라제 및 다당류 가수분해효소를 포함할 수 있다. 다른 태양에서, 유익제는 항-플라크제, 항-착색제 및 항미생물제를 포함할 수 있다. 항미생물제에는 항미생물 펩티드, 마가이닌(magainin), 세크로핀(cecropin), 살미생물제, 트리클로산(triclosan), 클로르헥시딘, 세틸피리디늄 클로라이드, 4차 암모늄 화합물, 클로록실레놀, 클로록시에탄올, 프탈산 및 그의 염, 티몰 및 그들의 조합이 포함될 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 구강 관리 유익제는 항충치제, 예를 들어, 플루오르화나트륨 또는 나트륨 모노플루오로포스페이트 및 향미제, 예를 들어, 동록유(wintergreen), 페퍼민트 오일, 스피어민트 오일, 또는 메틸 살리실레이트, 유칼립톨 또는 바닐린을 포함할 수 있다. 또한, 구강 관리 유익제는 몇가지만 말하자면, 청량제(coolant), 예를 들어, 석시네이트계 청량제 화합물 및 타액분비제(salivating agent)를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "타액분비제"는 구강 관리 조성물에 존재하는 경우, 사용자의 타액분비를 더 크게 증진시키는 물질을 말한다. 일 실시형태에서, 유익제는 구강 관리 제품에 사용하는 것으로 승인된 구강에 허용가능한 물질이다. 다른 실시형태에서, 구강에 허용가능한 유익제를 사용하여, 치아의 미용적 외관을 개선시킨다.

구강에 허용가능한 담체 매질에 종종 사용되는 성분의 비-제한적인 목록은 본 명세서에 그들의 전문이 각각 참고로 포함되는 미국 특허 제6,740,311호(White et al.); 미국 특허 제6,706,256호(Lawler et al.); 미국 특허 제6,264,925호(Fuglsang et al.); 및 미국 특허 출원 공개 제2005-0069501호(Ibrahim et al.)에 기재되어 있다. 예를 들어, 구강 관리 조성물은 연마제, 계면활성제, 산화방지제, 킬레이트제, 플루오르화물 공급원, 증점제, 완충제, 용매, 보습제, 담체, 증량제(bulking agent), 항-플라크제, 항-착색제, 항미생물제, 항충치제, 항-염증제, 탈감작화제(desensitizing agent), 감미제, 착향제, 호흡-청량(breath-freshening)제, 청량제, 영양제 및 타액분비제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.

혼합물 중의 성분은 구강 관리 조성물이 원하는 과산 유익제를 효소에 의해 생성하는 능력을 유지하도록 선택되는 것이 인식될 것이다. 본 명세서에 개시된 구강 관리 시스템의 적절한 혼합물은 통상의 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다. 구강 관리 제형이 있는 구강 관리 유익제의 총 농도는 구강 관리 조성물의 총 중량에 비하여 약 0.001 중량% 내지 약 90 중량%일 수 있다.

구강 관리 조성물은 치약, 덴탈 크림(dental cream), 투스젤, 또는 투스 파우더, 구강 세정제, 호흡 청량제 및 치실(dental floss)을 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 추가의 실시형태는 마우스 트레이를 통하여 구강 환경에 적용되는 페이스트 또는 겔의 반응 성분의 적용을 포함한다. 또한, 하나 이상의 반응 성분은 먼저, 에나멜에 부착되는 플라스틱 스트립 상에 침착되어, 하나 이상의 반응 성분을 전달하여, 과산 유익제를 생성할 수 있다. 전달 장치, 예를 들어, 스트립 상의 과가수분해효소 융합의 침착의 경우에, 과가수분해효소 융합은 스트립의 물질에 대하여 친화성을 갖는 결합 요소를 포함하여, 사용과 사용 후의 장치의 제거 동안 과가수분해효소의 스트립으로의 침착 및 보유를 지원하도록 고안될 수 있다.

구강 질환과 관련된 미생물을 감소시키거나 원치않는 생물막을 제거하기 위한 과산계 구강 관리 제품

과산계 구강 관리 제품을 사용하여 치아 우식증(예를 들어, 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)), 치은염, 구강 칸디다증 또는 치근막염과 관련된 구강 박테리아를 줄일 수 있다. 과산계 구강 관리 제품을 사용하여, 구강 생물막(들)을 감소시키거나 제거할 수 있다.

일 실시형태에서, 유효 농도의 적어도 하나의 과산을 생성하기 위한 구강 관리 제품에서, 구강 표면을 탈색시키거나, 미백하거나, 소독하거나, 탈염시키거나, 탈취시키거나 또는 그로부터 생물막을 제거하기 위한 과가수분해 활성을 갖는 효소의 용도가 제공된다.

일 실시형태에서, 과가수분해 활성을 갖는 효소는 표적화된 과가수분해효소이며, 효소가 본 발명의 하나 이상의 기질에 대하여 과가수분해 활성을 갖는 한, 리파제, 프로테아제, 에스테라제, 아실 트랜스퍼라제, 아릴 에스테라제, 탄수화물 에스테라제 및 조합을 포함할 수 있다. 예에는 과가수분해 프로테아제(예를 들어, 서브틸리신 변이체; 미국 특허 제7,510,859호), 과가수분해 에스테라제(예를 들어, 슈도모나스 플루오레슨스; 미국 특허 제7,384,787호; 서열 번호 477) 및 과가수분해 아릴 에스테라제(예를 들어, 마이코박테리움 스메그마티스; 미국 특허 제7,754,460호; WO2005/056782호; 및 제EP1689859 B1호; 서열 번호 460[S54V 변이체] 및 478[야생형])가 포함될 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

다른 실시형태에서, 구강 관리 제품에서 구강 표면의 탈색, 미백, 소독, 탈염, 탈취 또는 생물막의 제거를 위한 유효 농도의 적어도 하나의 과산을 생성하기 위한 과가수분해 활성을 갖는 CE-7 탄수화물 에스테라제의 용도가 제공된다.

다른 실시형태에서,

b) 1) 구조

[X]_mR₅

(여기서, X는 화학식 R₆C(O)O의 에스테르기이며,

2) 구조

3) 화학식

4) 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 및 아세틸화 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 아세틸화 당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기질; 및

c) 과산소원을 포함하는 - 이에 의해, (a), (b) 및 (c)의 혼합시에 과산이 형성되며, 과산 생성 제형은 치아 우식증, 치은염, 구강 칸디다증 또는 치근막염의 치료 또는 예방을 위해 사용된다 - 과산 생성 조성물의 용도도 또한 제공된다.

퍼옥시카르복실산 및 과산화수소의 농도를 결정하기 위한 HPLC 검정 방법.

적정, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 기체 크로마토그래피(GC), 질량 분석기(MS), 모세관 전기영동(CE), 문헌[U. Pinkernell et al., (Anal . Chem ., 69(17):3623-3627 (1997))]에 기재된 분석 절차, 및 본 실시예에 기재된 바와 같은 2,2'-아지노-비스 (3-에틸벤조타졸린)-6-설포네이트(ABTS) 검정법(문헌[U. Pinkernell et. al. Analyst, 122: 567-571 (1997)] 및 문헌[Dinu et. al. Adv. Funct. Mater ., 20: 392-398 (2010)])을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 분석 방법을 본 발명의 방법에 사용하여 반응물 및 생성물을 분석할 수 있다.

퍼옥시카르복실산의 최소 살생 농도의 결정

특정 개인 관리 응용, 예를 들어, 몇가지만 말하자면, 체취 및 진균 감염, 및 치아 우식증의 발생과 관련된 것과 같은 원치않는 미생물의 제거와 관련이 있을 수 있다. 이와 같이, 표적 개인 관리 응용을 위한 최소 살생 농도를 측정하고자 할 수 있다. 문헌[J. Gabrielson, et al. (J. Microbiol . Methods 50: 63-73 (2002))]에 기재되어 있는 방법은 퍼옥시카르복실산 또는 과산화수소 및 효소 기질의 최소 살생 농도(MBC)의 결정을 위해 사용할 수 있다. 검정 방법은 XTT 환원 억제를 기반으로 하며, 여기서, XTT((2,3-비스[2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐]-5-[(페닐아미노)카르보닐]-2H-테트라졸륨, 내염, 모노나트륨 염)는 490 ㎚ 또는 450 ㎚에서 측정한 광학 밀도(OD)의 변화에 의해 미생물 호흡 활성을 나타내는 산화환원 염료이다. 그러나, 플레이트 생존 계수, 직접적인 현미경 계수, 건조 중량, 탁도 측정, 흡광도 및 생물발광을 포함하나 이들에 한정되지 않는 소독제 및 보존제의 활성의 시험에 이용할 수 있는 다양한 다른 방법이 존재한다(예를 들어, 문헌[Brock, Semour S., Disinfection, Sterilization, and Preservation, 5^th edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA; 2001] 참조).

재배합 미생물 발현

본 발명의 서열의 유전자 및 유전자 산물은 이종 숙주 세포, 특히 미생물 숙주 세포에서 생성될 수 있다. 본 발명의 유전자 및 핵산 분자의 발현에 바람직한 이종 숙주 세포는 진균 또는 박테리아 패밀리에서 관찰될 수 있고, 넓은 범위의 온도, pH 값 및 용매 용인성에 걸쳐 성장하는 미생물 숙주이다. 예를 들어, 박테리아, 효모 및 사상 진균 중 임의의 것이 본 발명의 핵산 분자의 발현에 적절한 숙주일 수 있는 것으로 고려된다. 과가수분해효소는 세포내, 세포외 또는 세포내와 세포외 둘 모두의 조합에서 발현될 수 있으며, 여기서, 세포외 발현은 발효 생성물로부터의 원하는 단백질의 회수를 세포내 발현에 의해 생성되는 단백질의 회수 방법보다 더 용이하게 한다. 전사, 번역 및 단백질 생합성 장치는 세포 바이오매스를 생성하는데 사용되는 세포 공급원료에 비하여 변함 없이 유지되며; 기능적 유전자는 관련 없이 발현될 것이다. 숙주 균주의 예에는 박테리아, 진균 또는 효모 종, 예를 들어, 아스페르길루스(Aspergillus), 트리코더마(Trichoderma), 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia), 파피아(Phaffia), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula), 야로위아(Yarrowia), 살모넬라(Salmonella), 바실러스(Bacillus), 아키네토박터(Acinetobacter), 자이모모나스(Zymomonas), 아그로박테리움(Agrobacterium), 에리트로박터(Erythrobacter), 클로로븀(Chlorobium), 크로마튬(Chromatium), 플라보박테리움(Flavobacterium), 사이토파가(Cytophaga), 로도박터(Rhodobacter), 로도코커스(Rhodococcus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 브레비박테리움(Brevibacterium), 코리네박테리아(Corynebacteria), 마이코박테리움(Mycobacterium), 데이노코커스(Deinococcus), 에스케리키아(Escherichia), 에르위니아(Erwinia), 판토에아(Pantoea), 슈도모나스(Pseudomonas), 스핑고모나스(Sphingomonas), 메틸로모나스(Methylomonas), 메틸로박터(Methylobacter), 메틸로코커스(Methylococcus), 메틸로시너스(Methylosinus), 메틸로마이크로븀(Methylomicrobium), 메틸로시스티스(Methylocystis), 알칼리게네스(Alcaligenes), 시네코시스티스(Synechocystis), 시네코코커스(Synechococcus), 아나바에나(Anabaena), 티오바실러스(Thiobacillus), 메타노박테리움(Methanobacterium), 클레브시엘라(Klebsiella) 및 마익소코커스(Myxococcus)가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 일 실시형태에서, 박테리아 숙주 균주에는 에스케리키아, 바실러스, 클루이베로마이세스 및 슈도모나스가 포함된다. 바람직한 실시형태에서, 박테리아 숙주 세포는 바실러스 서브틸리스 또는 에스케리키아 콜라이이다.

대규모 미생물 성장 및 기능적 유전자 발현은 매우 다양한 단순 또는 복합 탄수화물, 유기산 및 알코올 또는 포화 탄화수소, 예를 들어, 메탄 또는 광합성 숙주 또는 화학자가영양(chemoautotrophic) 숙주의 경우에 이산화탄소, 소정의 형태 및 양의 질소, 인, 황, 산소, 탄소, 또는 작은 무기 이온을 포함하는 임의의 미량의 미량영양소를 사용할 수 있다. 성장 속도의 조절은 특정 조절 분자의 배양물로의 첨가 또는 무첨가에 의해 영향을 받을 수 있으며, 통상 영양분 또는 에너지원을 고려하지 않는다.

적절한 숙주 세포의 형질전환에 유용한 벡터 또는 카세트가 당업계에 널리 알려져 있다. 전형적으로, 벡터 또는 카세트는 관련 유전자의 전사 및 번역을 유도하는 서열, 선별가능한 마커, 및 자가 복제 또는 염색체 통합을 허용하는 서열을 포함한다. 적절한 벡터는 전사 개시 제어부를 품고 있는 유전자의 5'의 영역 및 전사 종결을 제어하는 DNA 단편의 3'의 영역을 포함한다. 둘 모두의 제어 영역이 형질전환된 숙주 세포에 대하여 동종의 및/또는 생성 숙주에 대해 천연의 유전자로부터 유래되는 경우가 가장 바람직하지만, 그러한 제어 영역이 그렇게 유래될 필요는 없다.

바람직한 숙주 세포에서 본 발명의 세팔로스포린 C 데아세틸라제 암호화 영역의 발현을 작동시키기에 유용한 개시 제어 영역 또는 프로모터는 많으며, 당업자에게 잘 알려져 있다. 사실상, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (사카로마이세스에서의 발현에 유용함); AOX1 (피키아에서의 발현에 유용함); 및 lac, araB, tet, trp, lPL, lPR, T7, tac 및 trc (에스케리키아 콜라이에서의 발현에 유용함)뿐 아니라 amy, apr, npr 프로모터 및 바실러스에서의 발현에 유용한 다양한 파지 프로모터를 포함하나 이들에 한정되지 않는 이들 유전자를 작동시킬 수 있는 임의의 프로모터가 본 발명에 적절하다.

종결 제어 영역은 또한 바람직한 숙주 세포의 다양한 천연의 유전자로부터 유래될 수 있다. 일 실시형태에서, 종결 제어 영역의 포함은 선택적이다. 다른 실시형태에서, 키메라 유전자는 바람직한 숙주 세포 유래의 종결 제어 영역을 포함한다.

산업적 생성

다양한 배양 방법을 적용하여, 과가수분해효소 촉매를 생성할 수 있다. 예를 들어, 재조합 미생물 숙주로부터 과발현되는 특정 유전자 산물의 대규모 생성은 배치식(batch), 유가식(fed-batch) 및 연속식(continuous) 배양 방법에 의해 생성될 수 있다. 배치식 및 유가식 배양 방법은 통상적이며, 해당 분야에 널리 알려져 있으며, 예는 문헌[Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989)] 및 문헌[Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36:227-234 (1992)]에서 찾을 수 있다.

또한, 목적 과가수분해효소 촉매의 상업적 생성은 연속식 배양으로 달성될 수 있다. 연속식 배양은 정의된 배양 배지를 생물반응기에 연속 첨가함과 동시에, 동량의 조절된 배지를 처리를 위해 제거하는 개방형 시스템이다. 연속식 배양은 일반적으로 세포를 고정된 높은 액상 밀도로 유지시키며, 여기서, 세포는 주로 대수기 성장으로 존재한다. 대안적으로, 연속식 배양은 고정화된 세포로 실시될 수 있고, 여기서, 탄소 및 영양분을 지속적으로 공급하고, 가치있는 생성물, 부산물 또는 폐기물을 세포 매스로부터 지속적으로 제거한다. 세포 고정화는 천연 및/또는 합성 재료로 이루어진 매우 다양한 고체 지지체를 사용하여 수행할 수 있다.

배치식 발효, 유가식 발효 또는 연속식 배양으로부터의 목적 과가수분해효소 촉매의 회수는 당업계에 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 효소 촉매가 세포 내에서 생성되는 경우, 세포 페이스트(paste)를 원심분리 또는 막 여과에 의해 배양 배지로부터 분리하고, 임의로, 물 또는 원하는 pH의 수성 완충제로 세정한 다음, 원하는 pH에서의 수성 완충제 중의 세포 페이스트의 현탁액을 균질화시켜, 원하는 효소 촉매를 함유하는 세포 추출물을 생성한다. 효소 촉매 용액으로부터 원치않는 단백질을 침전시키기 위한 열-처리 단계 전에, 세포 추출물을 임의로, 적절한 여과 조제, 예를 들어 셀라이트 또는 실리카를 통해 여과하여, 세포 데브리스를 제거할 수 있다. 이어서, 원하는 효소 촉매를 함유하는 용액을 막 여과 또는 원심분리에 의하여 침전된 세포 데브리스 및 단백질로부터 분리할 수 있으며, 얻은 부분-정제된 효소 촉매 용액을 추가의 막 여과에 의해 농축시킨 다음, 임의로 적절한 담체(예를 들어, 말토덱스트린, 포스페이트 완충제, 시트레이트 완충제 또는 그들의 혼합물)와 혼합하고, 분무 건조시켜, 원하는 효소 촉매를 함유하는 고체 분말을 생성할 수 있다.

양, 농도, 또는 다른 값 또는 파라미터가 범위, 바람직한 범위 또는 바람직한 상한값 및 바람직한 하한값의 목록으로서 주어지는 경우, 범위가 별도로 개시되는 지에 상관없이 임의의 상한 범위 또는 바람직한 값 및 임의의 하한 범위 또는 바람직한 값의 임의의 쌍으로부터 형성된 모든 범위를 구체적으로 개시하는 것으로 이해되어야 한다. 수치 값의 범위가 본 명세서에서 언급될 경우, 달리 기술되지 않는다면, 그 범위는 그 종점 및 그 범위 내의 모든 정수와 분수를 포함하고자 하는 것이다. 범위를 정의할 때 열거된 특정 값으로 본 발명의 범주를 한정하고자 하는 것은 아니다.

일반 방법

본 발명의 바람직한 태양을 보여주기 위해 하기 실시예가 제공된다. 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능하는 기술을 따르며, 이에 따라, 그의 바람직한 실시 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음이 당업자에 의해 인식되어야 한다. 그러나, 본 개시내용의 견지에서, 당업자는 개시된 특정 실시형태에서 많은 변경이 이루어질 수 있으며, 여전히 본 명세서에 개시된 방법 및 실시예의 목적 및 범주로부터 벗어남 없이, 비슷하거나 유사한 결과가 수득되는 것을 인식해야 한다.

모든 시약 및 재료는 달리 특정하지 않는 한, 디프코 래보러터리즈(DIFCO Laboratories)(미국 미시간주 디트로이트 소재), GIBCO/BRL(미국 메릴랜드주 개더스버그 소재), 티씨아이 아메리카(TCI America)(미국 오리건주 포틀랜드 소재), 로슈 디아그노스틱스 코포레이션(Roche Diagnostics Corporation)(미국 인디애나주 인디애나폴리스), 써모 사이언티픽(미국 일리노이주 록포드 소재의 피어스 프로틴 리서츠 프로덕츠(Pierce Protein Research Products)) 또는 시그마/알드리치 케미컬 컴퍼니(Sigma/Aldrich Chemical Company)(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 수득하였다.

설명에서 하기의 약어는 후술되는 바와 같은 측정 유닛, 기술, 특성 또는 화합물에 해당한다: "sec" 또는 "s"는 초를 의미하고, "min"은 분을 의미하며, "h" 또는 "hr"은 시간을 의미하고, "㎕"은 마이크로리터를 의미하며, "㎖"은 밀리리터를 의미하고, "L"은 리터를 의미하며, "mM"은 밀리몰을 의미하고, "M"은 몰을 의미하며, "mmol"은 밀리몰을 의미하고, "ppm"은 백만분율을 의미하며, "wt"는 중량을 의미하고, "wt%"는 중량 백분율을 의미하며, "g"는 그램을 의미하고, "㎎"는 밀리그램을 의미하며, "㎍"는 마이크로그램을 의미하고, "ng"는 나노그램을 의미하며, "g"는 중력을 의미하고, "HPLC"는 고성능 액체 크로마토그래피를 의미하며, "dd H₂O"는 증류수 및 탈이온수를 의미하고, "dcw"는 건조 세포 중량을 의미하며, "ATCC" 또는 "ATCC(등록 상표)"는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(미국 버지니아주 머내서스 소재)을 의미하고, "U"는 과가수분해효소 활성의 단위를 의미하며, "rpm"은 분당 회전수를 의미하고, "Tg"는 유리 전이 온도를 의미하며, "EDTA"는 에틸렌다이아민테트라아세트산을 의미한다.

발현 벡터 pLD001

플라스미드 pLD001(서열 번호 397)은 이전에 에스케리키아 콜라이에 대한 적절한 발현 벡터로 보고된 적이 있다(본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2010-0158823 A1호(Wang et al.) 참조).

벡터 pLD001은 상업적으로 입수할 수 있는 벡터 pDEST17(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐(Invitrogen)) 유래의 것이었다. 이는 상업적으로 입수할 수 있는 벡터 pET31b(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 노바겐(Novagen)) 유래의 서열을 포함하며, 효소 케토스테로이드 아이소머라제(KSI)의 단편을 암호화한다. KSI 단편은 에스케리키아 콜라이에서 펩티드의 불용성 봉입체로의 분할을 증진시키기 위한 융합 파트너로 포함시켰다. pET31b로부터의 KSI-암호화 서열을 표준 돌연변이유발 절차(퀵체인지(QuickChange) II, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재의 스트라타진(Stratagene))를 사용하여 야생형 KSI 서열에서 관찰되는 하나의 Cys 코돈에 더하여 3개의 추가의 Cys 코돈을 포함하도록 변형시켰다. 또한, 암호화 서열 내의 모든 Asp 코돈을 Glu 코돈으로 대체하였다. 서열 번호 397로 제공되는 플라스미드 pLD001을 당업자에게 널리 공지되어 있는 표준 재조합 DNA 방법을 사용하여 구축하였다.

실시예 1

치아 미백제로서의 과아세트산의 유효성

본 실시예에는 에나멜 표면이 착색된 모델에서의 탈색 효과를 달성하기 위한 과아세트산의 이용이 기재되어 있다. 소 에나멜 절치(incisor)를 SE 덴탈(Dental)(미국 루이지애나주 배턴 루지 소재)로부터 수득하였다. 치아를 섹션화하고(sectioned), 다이아몬드 칼날과 함께 드레멜(Dremel)(등록 상표) 회전톱(미국 일리노이주 시카고 소재의 로버트 보슈 파워 툴 코포레이션(Robert Bosch Power Tool Corporation))을 사용하여 각 측 상에 대략 7 ㎜의 에나멜 슬라브(slab)로 절단하였다. 에나멜 슬라브를 세정하고, 부드럽게 닦아 표면 데브리스를 제거하였다. 에나멜을 1 내지 5일 동안 커피 및 차의 혼합물로 사전처리하여, 인간 착색된 치아와 유사한 색상으로 착색시켰다.

각 에나멜 블록(block)을 사용 전에 적어도 1시간 동안 수 중에서 수화시켰다. 기질에 대한 색상 측정을 시험 용액에 대한 노출 전에 수득하였다. 과아세트산의 용액을 500 mM 인산나트륨 완충제, pH 7.2 중에 32% 스톡(stock)으로부터 제조하였다. 또한, 2.5% H₂O₂의 용액을 동일한 완충제에서 제조하였다. 다수의 에나멜 블록을 각 용액에 1분 동안 노출시키고, 5분, 10분, 15분 및 30분의 추가의 노출로 이어졌다. 각 처리를 위하여, 새로운 과아세트산 및 과산화수소 용액을 스톡 용액으로부터 제조하였다. 각 처리 후에, 에나멜 블록을 물로 헹구고, 코니카-미놀타(Konica-Minolta) 2600d 분광광도계를 사용하여 측정하였다. 백색도를 표 1 및 2에 열거된 각 시료에 대하여 결정하였다.

백색도(WI)는 국제 조명 위원회(International Commission on Illumination)(CIE)에 의해 정의되고, ASTM 방법 E313-05에 기재되어 있으며, 하기와 같이 D65/10 입사광에 대하여 계산하였다:

WI = Y + 800*(0.3138-x) + 1700*(0.3310-y)

상기 식에서, Y, x 및 y는 각 에나멜 기질의 휘도율 및 색도 좌표이다.

보다 양의 값으로의 백색도의 변화는 미백 효과를 나타낸다. 또한, 시료의 육안의 검사에 의해, 완충제 및 과산화수소 대조군에 비하여 과아세트산 처리된 시료에 대한 감지할 수 있는 미백 효과가 나타났다. 이러한 데이터에 의해, 과아세트산이 효과적인 탈색제이며, 보다 낮은 농도에서 과산화수소에 대하여 뛰어난 성능을 제공하는 것이 입증된다.

실시예 2

표준 바이오패닝을 사용한 치아 에나멜 및 균막 결합 펩티드의 선택

본 실시예의 목적은 표준 파지 디스플레이 바이오패닝을 사용하여 치아 에나멜 및 균막에 결합하는 파지 펩티드를 동정하려는 것이다.

소 에나멜 절치를 SE 덴탈(미국 루이지애나주 배턴 루지 소재)로부터 수득하였다. 치아를 대략 5 ㎣로 절단하고, 닦아서 표면 데브리스를 제거하였다. 에나멜 블록을 사용 전에 살균시켰다. 에나멜 블록을 몰딩 재료를 함유하는 웰 플레이트에 포매시켜, 웰 내의 에나멜 표면 만을 노출시켰다. 30분 동안 입 안에서의 인큐베이션을 위하여 고정되는 왁스 상에 블록을 고정시켜, 균막 코팅된 표면을 형성함으로써, 균막을 추가의 에나멜 블록 상에 형성하였다. 균막 코팅된 에나멜 기질에 콜게이트(Colgate)(등록 상표) 맥스프레시(MaxFresh)(등록 상표) 치약(미국 뉴욕주 뉴욕 소재의 콜게이트-팔몰리브(Colgate-Palmolive))의 1:2 슬러리로 솔질하고, 추가 30분 동안 다시 인큐베이션시켰다. 블록의 일부를 왁스로부터 제거하고, 웰 플레이트 내에 포매하는 한편, 다른 것들은 웰 플레이트 내의 포매 전에 다시 솔질하였다. 포매 과정은 오직 에나멜 및 균막-코팅된 에나멜 표면과의 용액 접촉을 가능하게 하였다.

이어서, 기질을 실온(약 22℃)에서, 0.1% 트윈(등록 상표)20이 있는 블로킹 완충제(포스페이트 완충된 염수 pH 7.2 중의 1 ㎎/㎖ 소 혈청 알부민(피어스(Pierce) BupH(상표명) #28372))(PBST)에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, PBST를 사용한 2회의 세정으로 이어졌다. 길이가 15 내지 20개 아미노산인 무작위 펩티드 삽입물을 함유하는 파지의 라이브러리(10¹¹pfu)를 각 웰에 첨가하였다. 최종 결합 용액에는 10¹¹pfu 파지, 10% UV 처리된 전 타액(whole saliva) 및 0.1% 트윈(등록 상표)20 (PBST) 중의 1 ㎎/㎖ BSA가 함유되어 있다. 50 rpm에서의 쉐이킹과 함께 37℃에서 30분의 인큐베이션 후에, 각 웰 밖으로 액체를 흡입시킴으로써 미결합 파지를 제거하고, 1.0 ㎖ PBST로의 6회의 세정으로 이어졌다.

이어서, 에나멜 블록을 깨끗한 튜브로 옮기고, 0.2 M 글리신-HCl, pH 2.2 중의 1 ㎎/㎖ BSA로 이루어진 용리 완충제 1 ㎖을 각 웰에 첨가하고, 10분 동안 인큐베이션시켜 결합 파지를 용리시켰다. 이어서, 1 M Tris-HCl, pH 9.1로 이루어진 중화 완충제 167 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 용리 완충제 중에 있는 파지 입자뿐 아니라 에나멜 블록 상에 있는 파지 입자는 37℃에서 4.5시간 동안 LB 배지에서 1:100 희석한 밤샘 배양물로부터의 20 ㎖의 희석된 에스케리키아 콜라이 ER2738 세포와 함께 인큐베이션시킴으로써 증식시켰다. 이후에, 세포 배양물을 2분 동안 원심분리시키고, 상측의 15 ㎖의 상층액을 새로운 튜브로 옮기고, 2.5 ㎖의 PEG/NaCl(20% 폴리에틸렌 글리콜-800, 2.5 M 염화나트륨)을 첨가하고, 파지가 4℃에서 하룻밤 침전되게 하였다. 침전물을 4℃에서 10,000 x g에서의 원심분리에 의해 수집하고, 생성된 펠렛을 1 ㎖의 PBS 중에 재현탁화시켰다. 이는 1차 증폭된 스톡이었다. 이어서, 증식된 1차 파지 스톡을 표준 프로토콜에 따라 적정하였다. 이후의 회차의 바이오패닝을 위하여, 이전의 회차로부터의 2 x 10¹¹ 초과의 pfu의 파지 스톡을 사용하였다. 1차 후의 각 추가의 회차는 또한 인간 전체 타액(실온에서 2시간 동안 UV 처리)으로의 추가의 세정, 탄산염 완충제 pH 9.4(피어스 BupH(상표명) 탄산염-중탄산염 완충제 #28382)로의 2회의 세정, 50 mM 포스페이트 완충제, pH 2.5로의 2회의 세정에 이은 보통의 PBST로의 2회의 세정을 포함하였다.

3차의 바이오패닝 및 이후의 각 회차 후에, 95개의 무작위 단일 파지 플라크를 분리하고, 단일 가닥의 파지 게놈 DNA를 일러스타 템플리피(Illustra Templiphi) 500 증폭 키트(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 지이 헬쓰케어(GE Healthcare))를 사용하여 제조하고, -96 gIII 시퀀싱 프라이머(5'-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3'; 서열 번호 398)를 사용하여 듀폰 시퀀싱 시설(DuPont Sequencing Facility)에서 시퀀싱하였다. 디스플레이된 펩티드는 유전자 III의 신호 펩티드 직후에 위치한다. 펩티드 서열에 기초하여, 12개의 파지 후보물질을 표 3에 나타낸 바와 같이 추가의 결합 분석을 위해 동정하였다.

실시예 3

에나멜 상의 치아-결합 후보물질의 특성화

본 실시예의 목적은 합성에 의해 생성된 펩티드를 사용하여 에나멜 표면 상의 펩티드 조성물의 결합을 확인하려는 것이다.

총 11개의 합성 펩티드를 표 3으로부터 수득된 서열을 사용하여 제작하였다. 펩티드를 C-말단에서 비오틴 표지된 라이신을 사용하여 신바이오사이 코포레이션(SynBioSci Corp.)(미국 캘리포니아주 리버모어 소재)로부터 수득하였다.

에나멜 기질을 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조하였다. 각 기질을 PBST(0.1% 트윈(등록 상표) 20이 있는 피어스 BupH(상표명) #28372) 중의 1 ㎎/㎖ BSA로 이루어진 블로킹 완충제 1 ㎖과 함께 실온(약 22℃)에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 블로킹 완충제를 각 웰 밖으로 액체를 흡입시킴으로써 제거하였다. 튜브를 PBST로 이루어진 세정 완충제로 2회 헹구었다. 웰을 블로킹 완충제 중에 희석시킴으로써 제조된 20 μM 펩티드 용액 500 ㎕로 채웠다. 시료를 37℃에서 저속으로 쉐이킹시키면서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 비-결합 펩티드를 PBST로의 6회의 세정에 의해 제거하였다. 이어서, PBST 중에 1:1000 희석된 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)/스트렙트아비딘 컨쥬게이트(피어스 #22127) 500 ㎕를 첨가하고, 실온(약 22℃)에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 컨쥬게이트 용액을 제거하고, 에나멜 블록을 PBST로 4회 세정하였다.

각 에나멜 기질을 웰로부터 제거하고, 10 ㎖의 PBST가 있는 15-㎖ 시험 튜브에서 다시 세정하였다. 이어서, 각 에나멜 기질을 에나멜 표면만이 노출되게 깨끗한 웰 플레이트에 고정시켰다. 200 ㎕의 쿠안타블루(QuantaBlu)(상표명) 기질 용액(미국 일리노이주 록포드 소재의 써모-피셔(Thermo-Fisher); #1856187)을 각 에나멜 블록에 직접 첨가하였다. 용액을 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 200 ㎕의 쿠안타블루(상표명) 스탑(Stop) 용액(써모 피셔)을 첨가하였다. 혼합 후에, 200 ㎕의 용액을 깨끗한 96-웰 블랙(black) 원심분리용 플레이트로 옮겼다. 플레이트의 형광을 마이크로플레이트 분광광도계(미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 몰레큘라 디바이스즈(Molecular Devices))를 사용하여 컷 오프 파장 없이 325 ㎚ 여기 및 420 ㎚ 방출을 사용하여 측정하였다. 생성된 형광 값은 표 4에 제공되어 있다. 11개의 균막/에나멜 결합 후보물질의 분석을 공지되어 있는 결합 펩티드, DenP03과 비교하였다. 각 서열을 3개의 반복검증 에나멜 기질을 사용하여 시험하였다.

실시예 4

과가수분해효소 및 과가수분해효소 융합의 구축

이러한 실시예에는 에나멜-결합 서열을 통하여 에나멜에 표적화된 과가수분해효소의 생성을 위한 발현 시스템의 고안이 기재되어 있다.

에나멜-결합 도메인에 대한 과가수분해 활성을 갖는 효소("과가수분해효소")의 융합을 암호화하는 유전자는 3'-말단에서 다양한 아미노산 가요성 링커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 융합된 표 5에 열거된 다양한 효소의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖도록 고안하였으며; 각 링커는 표 6에 기재된 바와 같은 에나멜-결합 도메인 또는 비-결합 서열 대조군에 추가로 융합된다. 유전자를 에스케리키아 콜라이에서의 발현을 위해 코돈 최적화시키고, DNA2.0(미국 캘리포니아주 멘로 파크 소재)에 의해 합성하였다. 암호화 서열을 플라스미드 내에서, T7 프로모터(발현 벡터 pLD001(서열 번호 397)) 또는 pBAD 프로모터 뒤에, NdeI과 AscI 제한 부위 사이에 클로닝하여, 플라스미드를 생성하였다. 융합 단백질을 발현시키기 위하여, 플라스미드를 적절한 발현 숙주에 전달하였다: T7 프로모터 하의 구축물을 위한 에스케리키아 콜라이 균주 BL21AI(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐) 또는 pBAD 프로모터 하의 구축물을 위한 에스케리키아 콜라이 MG1655의 AraBAD 유도균주.

표 5에 열거된 비-표적화된 과가수분해효소 변이체를 유사하게 클로닝하였다. 써모토가 마리티마 변이체의 제조 및 재조합 발현은 이전에 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호(DiCosimo et al.)에서 기재되었다.

락토코커스 락티스(아세틸 자일란 에스테라제; 서열 번호 40), 메소리조비움 로티(아세틸 자일란 에스테라제; 서열 번호 42) 및 바실러스 푸밀러스(아세틸 자일란 에스테라제; 서열 번호 10)로부터의 추가의 CE-7 과가수분해효소를 유사한 방식으로 클로닝하였다. 락토코커스 락티스, 메소리조비움 로티 및 바실러스 푸밀러스로부터의 CE-7 과가수분해효소의 클로닝 및 발현은 이전에, 각각이 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제2011-0081693호 및 미국 특허 제7,951,566호(DiCosimo et al.)에 기재되었다.

과가수분해효소의 CE-7 패밀리에 속하지 않는 과가수분해 효소도 또한 유사한 방식으로 클로닝하였다. 과가수분해 활성을 갖는 마이코박테리움 스메그마티스 아릴 에스테라제("ArE"; 야생형 서열은 서열 번호 478이며; S54V 변이체는 서열 번호 460으로 제공된다)는 미국 특허 제7,754,460호에 기재되어 있다. 과가수분해 활성을 갖는 슈도모나스 플루오레슨스 에스테라제 변이체 L29P("Pfl"; 서열 번호 477)는 미국 특허 제7,384,787호에 기재되어 있다.

실시예 5

융합 단백질의 생성

이러한 실시예에는 구강 표면에 대한 결합을 위한 표적화 서열이 있거나 없는 과가수분해효소의 발현 및 정제가 기재되어 있다.

균주를 50 ㎎/L의 스펙티노마이신을 함유하는 1 리터의 자가유도(autoinduction) 배지(10 g/L의 트립톤, 5 g/L의 효모 추출물, 5 g/L의 NaCl, 50 mM Na₂HPO₄, 50 mM KH₂PO₄, 25 mM (NH₄)₂SO₄, 3 mM MgSO₄, 0.75% 글리세롤, 0.075% 글루코스 및 0.05% 아라비노스)에서 200 rpm 진탕 하에 37℃에서 20시간 동안 성장시켰다. 비표적화된 과가수분해효소의 생성은 이전에 미국 특허 출원 공개 제2010-0087529호(DiCosimo et al.)에서 기재되었다. 표적화된 과가수분해효소의 생성은 유사한 프로토콜을 따랐다. 세포를 8000 rpm에서의 원심분리에 의해 수집하고, 세포 펠렛을 1 mM DTT를 함유하는 20 ㎖의 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 7.1에 재현탁화시킴으로써 세정하였다. 용액을 8000 rpm에서 다시 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 펠렛을 DTT를 함유하는 포스페이트 완충제에 다시 재분산시켰다. 이어서, 용액을 30초 동안 균질화시켜, 펠렛을 분산시켰다(브린크만 호모지나이저 모델(Brinkman Homogenizer model) PCU11). 이어서, 용액을 89.6 ㎫(약 13,000 psi)에서 프렌치 프레스(French Press)(SLM 인스트루먼츠(Instruments))를 통과하게 처리함으로써 세포를 용해시켰다. 용액을 추가 2회 프레스를 통과하게 처리하여, 완전한 용해를 달성하였다. 이어서, 세포 용액을 코니컬 튜브(conical tube)로 옮기고, 8500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 써모토가 마리티마 구축물을 위하여, 상층액을 제거하고, 80℃에서 30분 동안 가열하였다. 용액을 다시 원심분리하고, 상층액을 깨끗한 바이얼로 옮겼다.

비-호열성 효소에 대하여, 오염시키는 세포 성분으로부터 효소를 정제하기 위하여 열 처리를 사용하지 않았다. 대신에, 시료를 Co-NTA 아가로스(히스푸르 코발트 레진(HisPur Cobalt Resin), 써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 제품 번호: 89965)를 사용하는 금속 킬레이트화 크로마토그래피에 의해 효소의 C-종말단에 융합된 His6 태그를 사용하여 정제하였다. 전형적으로, 세포 추출물을 4 부피의 평형화 완충제(10 mM Tris HCl pH 7.5, 10% 글리세롤, 1 mM 이미다졸 및 150 mM NaCl)로 평형화된 Co-NTA 아가로스의 5 내지 10 ㎖ 컬럼에 로딩하였다. 컬럼 상에 로딩된 각 추출물의 양을 Co-NTA 아가로스 비드 ㎖당 5 내지 10 ㎎의 과가수분해효소 융합을 함유하도록 조정하였다. 레진을 2 충진 부피의 평형화 완충제로 세정하고, 2 부피의 용리 완충제(10 mM Tris HCl pH 7.5, 10% 글리세롤, 150 mM 이미다졸, 500 mM NaCl)로 용리시켰다. 분획을 수집하고, 전장의 정제된 단백질의 존재를 PAGE에 의해 확인하였다.

세포 생성 후에 구축물 EZ-19- 내지 EZ-26의 생성을 위하여, 세포를 8000 rpm에서의 원심분리에 의해 수집하고, 세포 펠렛을 20 ㎖의 50 mM 인산칼륨 완충제, pH 7.2에 재현탁화시킴으로써 세정하였다. 용액을 8000 rpm에서 다시 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 펠렛을 포스페이트 완충제에 다시 재분산시켰다. 이어서, 용액을 30초 동안 균질화시켜, 펠렛을 분산시켰다(브린크만 호모지나이저 모델 PCU11). 이어서, 용액을 89.6 ㎫(약 13,000 psi)에서 프렌치 프레스(SLM 인스트루먼츠)를 통과하게 처리함으로써 세포를 용해시켰다. 용액을 추가 2회 프레스를 통과하게 처리하여, 완전한 용해를 달성하였다. 이어서, 세포 용액을 코니컬 튜브로 옮기고, 8500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 불용성 용해물 펠렛을 50 ㎖의 세포 용해물 펠렛당 3 ㎖의 완충제로, 사르코실(sarkosyl) 완충제(50 mM 포스페이트 완충제 pH 7.2, 2% 트리톤(등록 상표)-X100 및 1.5% 사르코실) 중에 용해시켰다. 용액을 원심분리하고, 상층액을 새로운 튜브로 옮겼다. 융합 단백질을 써모 사이언티픽(미국 일리노이주 록포드 소재)으로부터의 히스푸르(상표명) 코발트 레진 키트를 사용함으로써 정제하였다.

이러한 생성 및 정제 프로토콜의 산출량은 통상 ㎖당 2 내지 10 ㎎의 단백질을 제공하며, 융합 과가수분해효소의 순도는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE) 분석에 의해 추정시 90% 내지 75%의 단백질이었다. 표준물질로서 소 혈청 알부민의 용액을 사용하여 총 단백질을 BCA(비신코닌산(bicinchoninic acid)) 검정법(써모 사이언티픽)에 의해 정량화하였다.

실시예 6

에나멜-표적화된 과가수분해효소 융합의 수산화인회석으로의 결합

이러한 실시예에는 과가수분해효소의 수산화인회석 입자로의 결합이 기재된다. 수산화인회석은 에나멜에 대한 효과적인 모방체(mimic)이다.

표 6에 열거된 과가수분해효소는 수산화인회석으로의 결합에 대해 평가하였다. 수산화인회석 나노입자(알드리치 677418)의 분산액을 10 mM 포스페이트 완충제 pH 7.2에 0.5% 고형물로 제조하였다. 효소 스톡 용액을 수산화인회석 분산액에 10 μM의 최종 농도로 첨가하고, 온건하게 진탕시키면서 원심분리용 튜브에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 각 시료를 10000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 추가의 완충제를 첨가하였다. 입자를 재현탁화시키고, 새로운 튜브에 옮겼다. 상기 과정을 추가 2회 반복하였다. 원래 효소 투입 시료, 각 세정 단계를 사용하여 입자로부터 제거된 상층액 및 최종 입자를 SDS-PAGE 분석을 위해 60 ㎕의 시료, 20 ㎕의 LDS 완충제 및 8 ㎕의 환원제(Nu-PAGE)를 배합함으로써 제조하였다. 시료를 85℃에서 10분 동안 가열하였다. 25 ㎕의 각 시료를 4-12% 비스트리스(BisTris) 겔(인비트로겐(Invitrogen)) 상에 로딩하고, 1.5시간 동안 115 볼트에서 전개시켰다. 겔을 제거하고, 심플리 블루 스테인(Simply Blue stain)(인비트로겐)의 1:1 희석액으로 하룻밤 염색하고, 탈이온수 중에서 4시간 동안 탈염시켰다. 겔을 분석하고, 각 분획 중의 효소의 검출을 밴드의 존재에 기초하여 추정하였다. 분석의 결과는 수산화인회석 표면과 각 효소 간의 결합의 세기를 결정하기 위하여, 효소 투입(투입 = 1)에 비한 겔에서의 각 밴드의 상대 세기의 표시와 함께 표 7에 제공되어 있다.

표 7의 데이터에 의해, 표적화 서열과의 과가수분해효소 융합이 세정 후에 수산화인회석에 남아 있는 한편, 비표적화 과가수분해효소는 그렇지 않았다.

실시예 7

수산화인회석에 대한 결합 및 용액 중의 과가수분해효소 활성의 정량화

이러한 실시예에는 과아세트산을 생성하기 위해 트라이아세틴 및 과산화수소를 사용하는 과가수분해효소의 과가수분해효소 활성을 통한 과가수분해효소의 검출 및 정량화 방법이 기재되어 있다.

과아세트산의 검출은 과아세트산에 의한 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린)-6-설포네이트(ABTS) 산화의 비색 검출을 사용하여 문헌[Pinkernell et. al. (Analyst, 1997, 122, 567)]에 기재된 방법을 따랐다. 트라이아세틴 및 과산화수소를 첨가하여 과아세트산을 형성한 후에, 90 ㎕의 용액을 웰 플레이트 내의 10 ㎕의 0.1 M H₃PO₄에 첨가하였다. 50 ㎕의 1 M 아세트산, 50 ㎕의 0.5 g/L ABTS 및 50 ㎕의 0.002 g/L KI를 첨가하였다. 용액을 5분 동안 발색(develop)되게 하였다. 용액의 흡광도를 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 405 ㎚에서 측정하였다. 과아세트산 농도를 동시에 과아세트산 시약 용액을 사용하여 만든 표준 곡선에 기초하여 계산하였다.

용액 중의 효소 활성을 50 mM 포스페이트 완충제, pH 7.2 중의 0.625 ㎍/㎖의 각 효소의 용액을 제조함으로써 측정하였다. 10 ㎕의 효소 용액을 90 ㎕의 완충제, 30 ㎕의 수 중의 3% 트라이아세틴, 30 ㎕의 30 mM H₂O₂와 혼합하였다. 용액을 5분 동안 인큐베이션시켰다. 90 ㎕의 분취액을 상기 기재된 바와 같이 ABTS 산화를 통한 검출을 위해 제거하였다. 결과는 표 8에 열거되어 있다.

HAP 디스크(disc) 표면에 1회 결합된 융합의 과가수분해효소 활성을 동일한 ABTS 방법을 사용하여 결정하였다. 수산화인회석 디스크(미국 뉴욕주 올드 베쓰페이지 소재의 하이메드 인코포레이티드(HiMed Inc); 5 ㎜ 직경 X 1.8㎜ 두께)를 20 μM 효소 용액(50 mM 인산칼륨 완충제 pH 7.2) 중에 60분 동안 인큐베이션시키고, 6회의 세정(50 mM 인산칼륨 완충제 pH 7.2)으로 이어졌다. 효소가 흡수된 디스크를 새로운 웰로 옮기고, 200 ㎕의 포스페이트 완충제(10 mM pH 7.2), 30 ㎕의 3% 트라이아세틴(0.346%의 최종 농도) 및 30 ㎕의 30 mM H₂O₂(3.46 mM의 최종 농도)를 첨가하였다. 용액을 실온에서 5분 동안 인큐베이션되게 하였다. 90 ㎕의 용액을 10 ㎕의 100 mM H₃PO₄를 함유하는 새로운 웰로 피펫팅하였다. 50 ㎕의 아세트산, 50 ㎕의 KI, 50 ㎕의 ABTS를 상기 기재된 바와 같이 첨가하였다. 용액을 실온에서 5분 동안 발색시키고, A405㎚에서 판독하였다. 결과는 표 9에 열거되어 있다.

이러한 실험에는 EZ-5 및 EZ-7이 수산화인회석에 결합되는 경우 활성 효소이며, 트라이아세틴 및 과산화수소의 첨가와 함께 과아세트산이 생성되는 것이 입증된다. EZ-1과 함께 검출된 낮은 과아세트산의 값은 EZ-1이 수산화인회석(실시예 6)에 결합되지 않으며, 과아세트산을 생성하기 위하여 표면 상에 존재하지 않는다는 다른 관찰과 일치하는 것이다.

실시예 8

추가의 CE -7 과가수분해효소 구축물을 위한 용액 중의 과가수분해효소 및 결합된 과가수분해효소 활성의 정량화

이러한 실시예에는 써모토가 마리티마, 바실러스 푸밀러스(Bpu), 메소리조비움 로티(Mlo) 및 락토바실러스 락티스(Lla)로부터의 수산화인회석에 결합하는 경우, 그리고 용액 중의 CE-7 과가수분해효소 및 각 융합 단백질의 트라이아세틴 및 과산화수소를 사용하여 과아세트산을 생성하는 과가수분해 활성이 기재되어 있다.

표 6에 열거된 과가수분해효소를 용액 활성에 대하여 평가하였다. 100 mM 포스페이트 완충제, pH 7.2 중의 0.5 μM의 효소, 100 mM의 트라이아세틴, 100 mM의 H₂O₂를 함유하는 500 ㎕ 용액을 제조함에 의한 용액 중의 과가수분해효소 활성의 측정 방법은 실시예 7에 기재되어 있다. 용액을 혼합하고, 37℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 10 ㎕의 분취액을 제거하고, 실시예 7에 기재된 바와 같이 검출을 위해 희석하였다. 과아세트산 농도는 과아세트산의 스톡 용액(알드리치)을 사용하여 생성된 표준 곡선을 사용하여 결정하였다. 효소 부재를 대조군으로 제시하는 실험도 또한 수행하였다.

이들 구축물의 수산화인회석으로의 결합을 평가하기 위하여, 33 ㎎의 수산화인회석 입자(마크로-프렙 세라믹 하이드로아파타이트 타입(Macro-prep Ceramic Hydroxyapatite TYPE) I, 80 ㎛ 사이즈, 미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재의 바이오래드(BioRad))를 10 mM 포스페이트 완충제 pH 7.2로 세정하였다. 상층액을 제거한 후에, 효소 스톡 용액을 수산화인회석 분산액에 10 μM의 최종 농도로 첨가하고, 온건하게 진탕시키면서 원심분리용 튜브에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 각 시료를 10000 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고, 추가의 완충제를 첨가하였다. 입자를 재현탁화시키고, 새로운 튜브에 옮겼다. 상기 과정을 추가 2회 반복하였다. 수산화인회석 결합된 효소 활성을 100 mM 포스페이트 완충제, pH 7.2 중의 100 mM 트라이아세틴, 100 mM H₂O₂를 함유하는 500 ㎕ 용액을 첨가함으로써 측정하였다. 용액을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 분취액을 제거하고, H₃PO₄와 혼합하고, 실시예 7에 기재된 바와 같은 ABTS 산화를 통한 검출을 위해 적절하게 희석하였다. 실험을 상이한 날에 수행하였으며, 각 실험에 대하여 효소 부재를 대조군으로서 사용하였다. 결과는 표 11에 열거되어 있다.

이러한 실험에서는 Bpu, Mlo 및 Llo 효소로부터의 모든 CE-7 과가수분해효소 융합이 효소 부재 대조군에 비하여, 용액 중에서 뿐만 아니라 수산화인회석 표면에 대한 결합 후에 유의미한 과가수분해효소 활성이 나타난 것이 입증된다. 바실러스 푸밀러스로부터의 모든 3가지 CE-7 과가수분해효소 융합은 마이코박테리움 로티 또는 락토코커스 락티스로부터의 융합 효소에 비하여 효소 활성이 더 높았다. 바실러스 푸밀러스로부터의 표적화된 EZ-29는 비표적화된 EZ-27에 비하여 더 높은 결합 활성을 나타냈다.

실시예 9

CXH 펩티드가 있는 표적화된 C277S 과가수분해효소 융합에 대한 용액 중의, 그리고 수산화인회석에 결합된 효소 활성의 정량화

이러한 실시예에는 CE-7 C277S 및 CXH 펩티드와의 융합, 및 용액 중에서, 그리고 수산화인회석에 결합되는 경우에, 트라이아세틴 및 과산화수소를 사용하여 과아세트산을 생성하는 그들의 과가수분해효소 활성이 기재되어 있다. 수산화인회석은 에나멜에 대한 효과적인 모방체이다.

표 6에 열거된 과가수분해효소 EZ-19 내지 EZ-26을 용액 중의 효소 활성에 대하여 평가하였다. 용액 중의 과가수분해효소 활성을 측정하는 방법은 실시예 7에 기재되어 있다. 용액 중의 효소 활성을 100 mM 트라이아세틴, 100 mM H₂O₂ 및 10 mM 포스페이트 완충제, pH 7.2 중의 0.5 μM의 각 효소의 500 ㎕ 사르코실 완충제 용액을 제조함으로써 측정하였다. 용액을 37℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 반응을 H₃PO₄와 혼합함으로써 중단시킨 후에, 10 ㎕ 분취액을 적절한 희석을 위해 제거한 다음, 실시예 7에 기재된 바와 같이 ABTS 산화를 통해 검출하였다. 결과는 표 12에 열거되어 있다.

또한, 동일한 과가수분해효소 융합 효소를 수산화인회석에 대한 결합에 대해 평가하였다. 수화된 수산화인회석 디스크(5 ㎜ 직경 × 1.8 ㎜ 두께, 하이메드 인코포레이티드로부터의)를 사용하였다. 디스크를 10 mM 포스페이트 완충제 pH 7.2에서 10분 동안 평형화시켰다. 200㎕의 효소 용액을 10 mM 포스페이트 완충제 중의 10 μM의 최종 농도로 수산화인회석 디스크에 첨가하고, 온건하게 진탕시키면서 원심분리용 튜브에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 상층액을 제거하고, 미결합 효소 활성 검정법을 위해 사용하였다. 디스크를 새로운 튜브에 옮기고, 포스페이트 완충제로 헹구었다. 상기 과정을 추가 2회 반복하였다. 결합된 효소가 있는 수산화인회석 디스크의 효소 활성을 100 mM 트라이아세틴, 100 mM H₂O₂ 및 100 mM 포스페이트 완충제, pH 7.2를 함유하는 500 ㎕ 용액을 디스크에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시킴으로써 측정하였다. 반응을 H₃PO₄와 혼합함으로써 중단시킨 후에, 10 ㎕ 분취액을 적절한 희석을 위해 제거한 다음, 실시예 7에 기재된 바와 같이 ABTS 산화를 통해 검출하였다. 실험을 몇일에 걸쳐 수행하고, 효소 부재 용액을 각 날에 대조군으로 사용하였다. 효소 부재 대조군을 제한 후의 결과는 표 12에 열거되어 있다.

실험에 의해, CXH 표적화 서열이 있는 모든 C277S 변이체가 용액 중에서, 그리고 수산화인회석에 결합되는 경우에, 활성이 있으며 충분한 양의 과아세트산을 생성하는 것이 입증되었다.

실시예 10

비 CE-7 과가수분해효소 구축물에 대한, 용액 중의, 그리고 수산화인회석에 결합되는 과가수분해효소 활성의 정량화

본 실시예의 목적은 용액 중에서, 그리고 수산화인회석에 결합되는 경우에 과아세트산을 생성하기 위한, 마이코박테리움 스메그마티스로부터의 표적화 또는 비표적화 아릴 에스테라제 효소 변이체 및 표 6에 열거된 슈도모나스 플루오레슨스로부터의 과가수분해효소 변이체의 용도를 증명하려는 것이다.

아릴 에스테라제 구축물을 위하여, 용액 중의 효소 활성은 100 mM 포스페이트 완충제, pH 7.2 중의 0.5 μM의 각 효소, 100 mM 트라이아세틴 및 100 mM H₂O₂의 1 ㎖ 용액을 제조함으로써 측정하였다. 용액을 혼합하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 실시예 7에 기재된 바와 같이, 반응은 일부를 H₃PO₄로 옮김으로써 중단시키고, 10 ㎕ 분취액을 제거하고, ABTS 산화를 통한 검출을 위해 희석하였다.

수산화인회석 상의 결합 및 활성의 평가를 위하여, 아릴 에스테라제 효소를 10mM 포스페이트 완충제 중의 10 μM 용액을 사용하여, 완충제 세정된 HAP 입자(마크로-프렙 세라믹 하이드로아파타이트(Macro-prep Ceramic Hydroxyapatite) 타입 I, 80 ㎛ 사이즈, 미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재의 바이오래드) 33 ㎎을 사용하여 실시예 8에 기재된 바와 같이 수산화인회석 입자에 노출시켰다. 원심분리 및 효소 용액의 제거 후에, 원심분리 및 상층액의 제거에 의하여 입자를 포스페이트 완충제로 헹구었다. 100 mM 트라이아세틴, 100 mM H₂O₂ 및 100 mM 포스페이트 완충제, pH 7.2를 함유하는 200 ㎕ 용액을 입자에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 실시예 7에 기재된 바와 같이, 반응은 일부를 H₃PO₄로 옮김으로써 중단시키고, 10 ㎕ 분취액을 제거하고, ABTS 산화를 통한 검출을 위해 희석하였다. 용액 및 표면 결합 검정법 둘 모두에 대한 결과는 표 13에 열거되어 있다.

슈도모나스 플루오레슨스 구축물을 위하여, 용액 활성을 1 M 아세트산나트륨 완충제, pH 5.5 중의 2 μM 효소, 100 mM H₂O₂를 함유하는 1 ㎖ 용액을 혼합함으로써 측정하였다. 용액을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 실시예 7에 기재된 바와 같이, 반응은 일부를 H₃PO₄로 옮김으로써 중단시키고, 10 ㎕ 분취액을 제거하고, ABTS 산화를 통한 검출을 위해 희석하였다. 수산화인회석 상의 결합 및 활성의 평가를 위하여, 슈도모나스 플루오레슨스 효소를 완충제 세정된 HAP 입자(마크로-프렙 세라믹 하이드로아파타이트 타입 I, 80 ㎛ 사이즈, 미국 캘리포니아주 헤르큘레스 소재의 바이오래드) 100 ㎎을 사용하여 실시예 8에 기재된 바와 같이 10 mM 포스페이트 완충제 중에 20 μM로 수산화인회석 입자에 노출시켰다. 원심분리 및 효소 용액의 제거 후에, 원심분리 및 상층액의 제거에 의하여 입자를 포스페이트 완충제로 헹구었다. 1 M 아세트산나트륨 완충제, pH 5.5 중의 300 mM H₂O₂를 함유하는 200 ㎕ 용액을 입자에 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 실시예 7에 기재된 바와 같이, 반응은 일부를 H₃PO₄로 옮김으로써 중단시키고, 10 ㎕ 분취액을 제거하고, ABTS 산화를 통한 검출을 위해 희석하였다. 용액 및 표면 결합 검정법 둘 모두에 대한 결과는 표 14에 열거되어 있다.

이들 실험에 의해, CE-7 패밀리를 벗어난 패밀리로부터의 과가수분해효소가 표적화 서열을 포함하는 구축물에 대하여 용액 중에서, 그리고 수산화인회석에 결합되는 경우에 활성이 있음이 입증된다.

실시예 11

용액 중의 및 소 에나멜에 결합된 에나멜-표적화 C277S 및 C277T 변이체 과가수분해효소 융합의 과가수분해 활성의 정량화

이러한 실시예에는 과가수분해효소 융합 단백질의 소 에나멜으로의 결합, 및 용액 중의 그리고 소 에나멜에 결합되는 경우의 효소 활성의 측정이 기재된다.

표 5에 열거된 과가수분해효소를 실시예 7에 기재된 바와 같이 용액 중의 효소 활성에 대하여 평가하였다. 용액 중의 효소 활성을 100 mM 트라이아세틴, 100 mM H₂O₂ 및 10 mM 포스페이트 완충제, pH 7.2 중의 0.5 μM의 각 효소의 500 ㎕ 용액을 제조함으로써 측정하였다. 용액을 37℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 반응을 분취액을 H₃PO₄와 혼합함으로써 중단시킨 후에, 10 ㎕ 분취액을 적절한 희석을 위해 제거한 다음, 실시예 7에 기재된 바와 같이 ABTS 산화를 통해 검출하였다. 결과는 표 15에 열거되어 있다.

또한, 과가수분해효소를 소 에나멜 기질로의 결합에 대해 평가하였다. 에나멜 기질을 실시예 2 및 3에 기재된 바와 같이 제조하였다. 각 에나멜 블록을 실온(약 22℃)에서 하룻밤 동안 수 중에 수화시켰다. 이어서, 에나멜 블록을 10분 동안 10 mM 인산칼륨 완충제, pH7.2로 평형화시켰다. 에나멜 기질을 완충제로 3회 헹구었다. 에나멜 웰을 10 mM 포스페이트 완충제 중에서 희석시킴으로써 제조된 10 μM 효소 용액 500 ㎕로 채웠다. 시료를 37℃에서 저속으로 쉐이킹시키면서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 비-결합 효소를 포스페이트 완충제로의 4회의 세정에 의해 제거하였다. 이어서, 각 에나멜 블록을 퍼티(putty)가 채워진 24-웰 플레이트 내측에 포매시키고, 오직 에나멜 상측 표면 만을 노출시켰다. 에나멜 결합 효소로부터의 과가수분해효소 활성을 실시예 8에 기재된 바와 같이 측정하였다. 100 ㎕의 반응 혼합물(100 mM 포스페이트 완충제, pH7.2 및 100 mM H₂O₂ 및 100 mM 트라이아세틴)을 에나멜의 상측에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 90 ㎕의 분취액을 실시예 8에 기재된 바와 같이 ABTS 산화를 통한 검출을 위해 제거하였다. 결과는 표 15에 열거되어 있다. 각 시료 데이터점은 3가지 독립적인 에나멜 블록의 평균을 나타낸다.

이러한 실험에 의해, 써모토가 마리티마 서열 변이체로부터의 C227S 및 C277T를 사용하는 융합이 표적 서열을 포함하는 구축물에 대하여, 용액 중에서, 그리고 소 에나멜에 결합되는 경우에 활성이 있으며, 치아를 미백시키기에 충분한 수준의 과아세트산을 생성함이 입증된다.

실시예 12

1-단계 적용에서 과가수분해효소를 사용한 치아 탈색 효능

이러한 실시예의 목적은 1-단계 적용에서 효소에 의해 생성된 과아세트산의 치아 탈색 효과를 보여주고 화학적으로 유도된 과아세트산으로 달성되는 효능과 비교하려는 것이다. 표적 치아 탈색 수준을 달성하기 위하여 과가수분해 효소(CE-7 과가수분해효소) 시스템을 사용하는 2가지 방법을 개발하였다. 제1 방법(본 명세서에서 "1-단계 방법"으로 지칭)은 에나멜 착색 모델을 사용하여 상이한 양의 적어도 하나의 CE-7 과가수분해효소를 트라이아세틴(일 예의 적절한 에스테르 기질) 및 과산화수소와 배합하여, 과아세트산을 생성하는 것을 포함한다. 소 에나멜 절치를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 착색된 소 에나멜 블록을 기질의 색상을 안정화시키기 위하여 사용하기 적어도 1시간 전에 수 중에 수화시켰다. 각 에나멜 블록에 대한 색상을 수화 후에, 실험의 시작 전에 측정하였다. 3가지 에나멜 시료를 각 용액 유형에 대하여 처리하였다. 사용된 용액은 완충제만의 대조군, 2.5% H₂O₂, 1% 과아세트산, 10 μM EZ-1(C277S; 서열 번호 424), 100 mM 트라이아세틴 및 250 mM H₂O₂를 함유하는 과가수분해효소 조성물 및 100 mM 트라이아세틴 및 250 mM H₂O₂의 효소 부재 대조군이었다. 모든 용액을 500 mM 인산나트륨 완충제, pH 7.2 중에서 제조하였다. 중성의 pH에서 1% 과아세트산 용액을 유지하는데 높은 완충제 세기가 필요하였다. 모든 용액을 각 처리점을 위해 새로이 제조하였다. 효소-트라이아세틴-H₂O₂ 조합물 및 트라이아세틴- H₂O₂ 조합물을 에나멜 노출 직전에 혼합하였다. 각 처리 단계 후에, 각 에나멜 블록을 물로 헹구고, 색상 측정치를 수득하였다. 총 61분의 처리 시간을 1분, 5분, 10분, 15분 및 30분의 노출 기간과 함께 사용하였다. 1분, 10분 및 30분 처리 후의 용액 중의 과아세트산의 농도를 ABTS 산화의 비색 검출에 의해 평가하였다. 결과는 표 16 및 17에 제공되어 있다.

비색 방법에 의한 반응 혼합물 중의 과아세트산(PAA) 농도의 결정을 상기 문헌[Dinu et. al.]에 기재된 방법에 따라 수행하였다. 125 mM 시트르산칼륨 완충제, pH 5.0 중의 1 mM 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린)-6-설포네이트(ABTS), 50 μM 요오드화칼륨의 시약 용액을 제조하였다. 25 ㎕의 시료를 975 ㎕의 이러한 검출 시약과 혼합하고, 5분 동안 인큐베이션되게 하였다. 용액을 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 405 ㎚에서 흡광도에 대하여 분석하였다. 용액 중의 과아세트산의 상대량의 비교를 흡광도 값을 직접 비교함으로써 결정하였다.

표 16의 데이터에 의해, 효소-에스테르-과산화물 조성물이 치아의 미백에 효과적인 것이 확인된다. 표 17의 데이터에 의해, 과아세트산이 EZ-1(C277S; 서열 번호 424) 효소, 트라이아세틴 및 H₂O₂의 조합으로부터 생성되는 것이 입증된다. 또한, 화학적 과아세트산에 대한 흡광도 데이터의 비교에 의해, 효소적 탈색 시스템이 놀랍게도 더 나은 미백 성능과 함께 더 낮은 검출가능한 과아세트산을 보이는 것으로 나타났다. 또한, 트라이아세틴 및 H₂O₂를 함유하는 효소-부재에 대하여 낮은 수준의 과아세트산이 시간이 지남에 따라 생성되며, 이는 ABTS 시약으로의 1:10 희석으로 검출되었다(표에는 포함되지 않음). 이는 효소 촉매작용된 과아세트산의 높은 수준의 생성에 비하여 훨씬 더 느린 속도로 검출가능한 탈색 성능으로 이어졌다.

실시예 13

1-단계 적용에서 에나멜 표적화된 과가수분해 효소를 사용한 치아 탈색 효능

이러한 실시예의 목적은 표적화된 CE-7 과가수분해효소를 사용하는 1-단계 적용에서 효소에 의해 생성된 과아세트산의 치아 탈색 효과를 보여주고 화학적으로 유도된 과아세트산으로 달성되는 효능과 비교하려는 것이다.

소 에나멜 절치를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 착색된 소 에나멜 블록을 기질의 색상을 안정화시키기 위하여 사용하기 적어도 1시간 전에 수 중에 수화시켰다. 각 에나멜 블록에 대한 색상을 수화 후에, 실험의 시작 전에 측정하였다. 2가지 에나멜 시료를 각 용액 유형에 대하여 처리하였다. 사용된 용액은 완충제만의 대조군, 0.1% 과아세트산, 0.52 μM EZ-7(에나멜 결합 도메인이 있는 C277S; 서열 번호 429), 100 mM 트라이아세틴 및 32.6 mM H₂O₂를 포함하는 과가수분해효소 조성물이었다. 모든 용액을 100 mM 인산나트륨 완충제, pH 7.2 중에서 제조하였다. 모든 용액을 각 처리점을 위해 새로이 제조하였다. 효소-트라이아세틴-H₂O₂ 조합물을 에나멜 노출 직전에 혼합하였다. 각 처리 단계 후에, 각 에나멜 블록을 물로 헹구고, 색상 측정치를 수득하였다. 30분의 처리 시간을 각 에나멜 기질의 세트에 대하여 4회 반복하였다. 30분 처리 후의 용액 중의 과아세트산의 농도를 ABTS 산화의 비색 검출에 의해 평가하였다. 결과는 표 18 및 19에 제공되어 있다.

표 18의 데이터에 의해, 표적화된 효소-에스테르-과산화물 조성물이 1-단계 과정에서 치아를 미백시키는데 효과적인 것이 확인된다. 표 19의 데이터에 의해, 과아세트산이 EZ-7 효소, 트라이아세틴 및 H₂O₂의 조합으로부터 생성되는 것이 입증된다.

실시예 14

다양한 에스테르 기질에 대한 CE-7 과가수분해효소를 사용하는 과아세트산 생성

이러한 실시예의 목적은 에나멜 표적화 과가수분해효소를 포함하는 매우 다양한 CE-7 과가수분해효소가 구강 관리 특이적 조건 하에서 매우 다양한 에스테르로부터의 과아세트산의 형성을 촉매작용시키는 것을 입증하려는 것이었다.

써모토가 마리티마 과가수분해효소의 변이체를 클로닝하고, 재조합으로 발현하고, 실시예 4에 기재된 것과 유사한 방식으로 정제하였다. 이들 과가수분해효소 변이체의 서열 변화가 표 5에 열거되어 있다.

다양한 에스테르 기질을 표 5에 열거된 적어도 2개 이상의 과가수분해효소 변이체에 대하여 시험하였다. 맞춤 합성한 3가지 에스테르를 제외하고, 모든 다른 에스테르를 시그마 알드리치(미국 미주리주 세인트 루이스 소재), 티씨아이 아메리카(미국 오리건주 포틀랜드 소재), 알파 아에사르(Alpha Aesar)(미국 매사추세츠주 워드 힐 소재) 또는 테센들로 컴퍼니(Tessendlo Company)(미국 애리조나주 포에닉스 소재)로부터 구하였다.

에스테르 기질에 대한 다양한 효소를 시험하기 위하여, 각 개별 반응의 시작을 0.5 내지 1분의 시차를 둠으로써 최대 4개의 반응을 동시에 수행하는 것이 편리하였다. 각 개별 반응을 자성 교반 막대가 구비된 유리관(높이: 76 ㎜; 외경: 33 ㎜; 내경: 24 ㎜)에서 수행하였다. 4개의 반응관을 함께 묶고, 재킷형(jacketed) 1 리터, 스테인리스 강, 템퍼링 비커(tempering beaker)(케이지더블유 아이소썸(KGW IsoTherm), # TSS-G 1000W)에서 불변의 온도로 유지하고, 순환수를 써모 네스랩(Thermo NesLab) 재순환 배쓰(모델 # RTE-7 디지털 원(Digital One))에 의해 조절하였다. 완충제(6 ㎖, 100 mM 인산나트륨 완충제, pH 7.2)를 각 반응관에 첨가하고, 37℃에서 평형화되게 하였다. 대상 에스테르 기질을 첨가하여 100 mM 농도를 달성하였다. 반응을 40 ppm 효소 및 60 mM H₂O₂ (37 ㎕, 30% 과산화수소 용액)의 동시의 첨가에 의해 개시하였다. 과아세트산의 생성을 추적하기 위하여, 각 반응으로부터의 80 ㎕ 시료를 1 내지 15분의 특정 간격으로 제거하였다. 시료를 즉시, 효소적 반응을 중단시키고(pH를 2 내지 3으로 낮춤으로써) 편리한 HPLC 분석을 위해 시료를 희석하기에 충분한 소정의 부피 및 농도의 인산 용액을 함유하는 원심분리기 필터 튜브(나노세프(NanoSep) 30K VWR 카탈로그 번호 82031-354)에서 켄칭하였다. 산-켄칭된 시료를 5분 동안 원심분리하여, 임의의 미립자를 제거하였다. 일단 여과되면, 과아세트산에 대한 카르스트(Karst) 반응 및 HPLC 분석을 즉시 미국 특허 제7,829,315호(DiCosimo et al.)에 이전에 기재된 방법을 사용하여 각 시료 세트 상에서 수행하였다. 각 에스테르 기질에 의해 생성되는 최대의 과아세트산이 표 20에 열거되어 있다.

이들 에스테르 기질을 표 20에 대한 데이터를 생성하기 위하여 사용된 동일한 반응 조건 하에서, 표적화된 C277S 과가수분해효소 변이체, EZ-7을 사용하여 과아세트산 생성에 대하여 시험하였다. EZ-7 과가수분해효소 시스템을 사용한 프로필렌 글리콜 다이아세테이트 또는 수크로스 옥타아세테이트를 사용한 과아세트산 생성이 표 21에 나타나 있다. 나타낸 데이터에 의해, 대안적인 에스테르가 실시예 5에 기재된 바와 같은 표적화된 과가수분해효소의 변이체에 대한 효율적인 기질임이 입증된다.

실시예 15

다양한 에스테르 기질에 대한 CE-7 과가수분해효소를 사용하는 치아 탈색

이러한 실시예의 목적은 구강 관리 관련 조건 하에서 4가지 에스테르로부터의 과아세트산의 형성을 촉매작용시키는 CE-7 과가수분해효소를 사용하는 치아 탈색 효능을 입증하려는 것이었다.

이러한 실시예를 위하여, 써모토가 마리티마 과가수분해효소의 C277S(EZ-1) 변이체를 실시예 4에서와 같이 클로닝하고, 재조합에 의해 발현하고, 정제하였다. 트라이아세틴(테센들로 컴퍼니(미국 애리조나주 포에닉스 소재))을 제외하고, 모든 기질을 시그마-알드리치(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 구매하였다.

기질 트라이아세틴(TA), α-D-글루코스 펜타아세테이트(GPA), 수크로스 옥타아세테이트(SOC) 및 프로필렌 글리콜 다이아세테이트(PGDA)를 사용하여 EZ-1(C277S; 서열 번호 424)의 효소 매개의 치아 미백을 입증하였다. 각 기질과 함께 과아세트산의 생성에 사용되는 최적의 조건은 실시예 14에서의 연구로부터 유래된 것이며, 다음과 같이 아래에 기재되어 있다:

40 ppm EZ-1, 100 mM 기질, X mM H₂O₂, 95 mM 포스페이트, pH 7.2(여기서, X는 기질의 아이덴티티에 따라 달라진다); 100 mM H₂O₂ (TA), 360 mM H₂O₂ (PGDA 및 SOC), 60 mM H₂O₂ (GPA).

소 에나멜 절치를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 착색된 에나멜 블록을 상아질 측을 아래로 향하게 하여, 24웰 플레이트에 배치하고, 포스페이트 완충제, pH 7.2에서 하룻밤 수화시켰다. 처리 전에, 각 치아의 색상 측정을 코니카-미놀타(Konica-Minolta) 2600d 분광광도계를 사용하여 수행하고, 백색도를 실시예 1에 상세화된 바와 같이 계산하였다.

각 효소 용액을 1.5-㎖ 원심분리기용 튜브(에펜도르프(Eppendorf), #2243102-1)에서 제조하고, 1 ㎖의 용액을 즉시, 사전-수화된 치아를 함유하는 24 웰 플레이트로 옮겼다. 대조군 시료는 100 mM 포스페이트 완충제, pH 7.2 및 100 mM 시트레이트/포스페이트 완충제, pH 5.3 중의 9% H₂O₂로 이루어진다. 치아를 실온에서 30분 동안 인큐베이션시키고, 제거하고, 100 mM 포스페이트, pH 7.2로 헹구고, 색상 측정을 취하였다. 치아를 다시 24 웰 플레이트에 배치하고, 이 때 새로운 효소 용액을 제조하고, 각 웰에 첨가하였다. 이러한 과정을 총 3번의 미백 처리(처리당 30분)에 대하여 반복하였다(표 22).

표 22에서 관찰된 바와 같이, TA, PGDA, SOC 및 GPA를 사용하여, 효소에 의해 생성된 모든 과아세트산 시료는 각 연속적인 처리와 함께, 보다 양의 값으로의 이동에 의해 나타나는 바와 같은 백색도의 유의미한 변화를 나타내었다. 완충제 대조군에 대한 백색도의 변화는 미미하며, ΔWI는 11.4이다. 또한, 이들 측정은 각 30분 처리 후에 치아의 육안의 검사와 일치한다. 이러한 데이터에 의해, EZ-1과 함께 다양한 상이한 기질을 사용하여, 효소에 의해 생성된 과아세트산이 커피-차로 착색된 소 치아의 미백에 효과적임이 입증되었다.

실시예 16

2-단계 적용에서 과가수분해효소를 사용한 치아 탈색 효능

본 실시예의 목적은 2-단계 적용에서의 과가수분해효소 시스템의 치아 탈색 효능을 증명하려는 것이다.

소 에나멜 절치를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 착색된 에나멜 블록을 48 웰 플레이트 내에 포매시켜, 상아질 후면을 용액 노출로부터 보호하였다. 10 mM 포스페이트 완충제, pH 7.2 중의 10 μM의 각 효소의 용액을 제조하고, 500 ㎕의 용액을 각 에나멜 기질과 함께 60분 동안 인큐베이션시켰다. 효소 용액을 제거하고, 각 웰을 추가 500 ㎕의 완충제로 3회 헹구었다. 에나멜 블록을 미백 과정을 위해 새로운 웰에 배치하였다. 50 mM 포스페이트 pH 7.2 완충제 중의 40 mM 트라이아세틴, 100 mM H₂O₂의 최종 농도가 있는 용액을 새로이 제조하고, 500 ㎕의 용액을 각 에나멜 블록에 첨가하였다. 1시간 경과에 걸쳐, 에나멜 블록을 제거하고, 색상 측정을 수득한 다음, 각각을 웰 플레이트 내의 용액으로 복귀시켰다. 각 시료에 대한 백색도를 모니터링하였다. 결과는 표 23에 열거되어 있다.

이러한 실시예에는 표면 결합 과가수분해효소가 에나멜의 표면에서 과아세트산의 형성을 촉매작용시킴으로써 치아를 미백시키는데 사용될 수 있음이 입증된다. 이러한 실시예에서 탈색 성능은 수산화인회석 상에서의 각 효소의 유지의 관찰과 관련이 있다. 비표적화 EZ-1(C277S; 서열 번호 424)은 수산화인회석 및 에나멜 상에서 불량한 유지를 보였으며, 이에 따라 2-단계 과정에서 적절한 미백을 달성하는 능력이 낮았다. 에나멜 상에서 효소를 유지하기 위한 효과적인 표적화 서열의 첨가에 의해, 2-단계 적용 과정에서 과아세트산의 생성이 가능하게 된다.

실시예 17

2-단계 적용에서 과가수분해효소를 사용한 치아 탈색 효능

본 실시예의 목적은 2-단계 적용에서의 표적화 및 비표적화 과가수분해효소 시스템의 치아 탈색 효능을 증명하려는 것이다.

소 에나멜 절치를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 착색된 에나멜 블록을 실리 퍼티(silly putty)(등록 상표)(미국 펜실베이니아주 이스턴 소재의 크래욜라 엘엘씨(Crayola LLC))가 채워진 웰, 24-웰 플레이트에 포매시켜, 상아질 후면을 용액 노출로부터 보호하였다. 10 mM 포스페이트 완충제, pH 7.2 중의 20 μM의 각 효소의 용액을 제조하고, 500 ㎕의 효소 용액을 각 에나멜 블록에 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 이어서, 에나멜 블록을 매번 추가 500 ㎕의 완충제로 3회 헹구었다. 미백 과정을 위하여, 에나멜 블록을 옮기고, 새로운 퍼티 웰에 포매시켰다. 100 mM 포스페이트 완충제, 100 mM 트라이아세틴, 100 mM H₂O₂, pH 7.2를 함유하는 용액(200 ㎕)을 에나멜에 첨가하고, 37℃에서 10분 동안 인큐베이션시켰다. 에나멜 블록을 겸자(forcep)를 사용하여 웰로부터 제거한 다음, 헹구고, 색상 측정을 위하여 1.5 ㎖의 물로 채운 웰에 저장하였다. 2-단계 과정을 5회 반복하였다(총 50분). 2-단계 과정 후의 커피-차로 착색된 소 에나멜의 색상 측정의 결과는 표 24에 나타나 있다. 각 시료 데이터점은 독립적인 에나멜 블록의 2번의 반복을 나타낸다.

시스템에서 생성된 과아세트산의 수준을 측정하기 위하여, ABTS 방법을 사용하고, 90 ㎕의 반응 혼합물을 10 ㎕의 정지 완충제(1.33 M H₃PO₄)를 함유하는 새로운 웰로 옮겼다. 시료를 100 mM 포스페이트 완충제를 사용하여 1:100으로 희석하고, 실시예 8에 나타낸 바와 같이 ABTS 검출 시약에 첨가하였다. 결과는 표 25에 열거되어 있다. 각 시료 데이터점은 독립적인 에나멜 블록의 2번의 반복을 나타낸다.

이러한 실시예에는 표면 결합 과가수분해효소가 에나멜의 표면에서 과아세트산의 형성을 촉매작용시킴으로써 치아를 미백시키는데 사용될 수 있음이 입증된다. 소 에나멜을 사용하는 이러한 실시예에서 탈색 성능은 수산화인회석 상에서의 각 효소의 유지의 관찰과 관련이 있다. 비표적화 EZ-1(C277S)은 수산화인회석 및 에나멜 상에서 불량한 유지를 보였으며, 이에 따라 2-단계 과정에서 적절한 미백을 달성하는 능력이 낮았다. 에나멜 상에서 효소를 유지하기 위한 효과적인 표적화 서열의 첨가에 의해, 2-단계 적용 과정에서 과아세트산의 생성이 가능하게 된다.

SEQUENCE LISTING <110> E.I. duPont de Nemours and Company Inc. Di Cosimo, Robert Cunningham, Scott Butterick, Lisa Fosser, Kari Gruber, Tanja Wang, Hong Rouviere, Pierre Payne, Mark <120> ENZYMATICA PERACID GNERATION FOR USE IN ORAL CARE PRODUCTS <130> CL5256 PCT <150> US 61/424,903 <151> 2010-12-20 <160> 479 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 960 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(960) <400> 1 atg caa cta ttc gat ctg ccg ctc gac caa ttg caa aca tat aag cct 48 Met Gln Leu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Gln Leu Gln Thr Tyr Lys Pro 1 5 10 15 gaa aaa aca gca ccg aaa gat ttt tct gag ttt tgg aaa ttg tct ttg 96 Glu Lys Thr Ala Pro Lys Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Leu Ser Leu 20 25 30 gag gaa ctt gca aaa gtc caa gca gaa cct gat tta cag ccg gtt gac 144 Glu Glu Leu Ala Lys Val Gln Ala Glu Pro Asp Leu Gln Pro Val Asp 35 40 45 tat cct gct gac gga gta aaa gtg tac cgt ctc aca tat aaa agc ttc 192 Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Lys Ser Phe 50 55 60 gga aac gcc cgc att acc gga tgg tac gcg gtg cct gac aag caa ggc 240 Gly Asn Ala Arg Ile Thr Gly Trp Tyr Ala Val Pro Asp Lys Gln Gly 65 70 75 80 ccg cat ccg gcg atc gtg aaa tat cat ggc tac aat gca agc tat gat 288 Pro His Pro Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp 85 90 95 ggt gag att cat gaa atg gta aac tgg gca ctc cat ggc tac gcc gca 336 Gly Glu Ile His Glu Met Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Ala 100 105 110 ttc ggc atg ctt gtc cgc ggc cag cag agc agc gag gat acg agt att 384 Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Ser Ser Glu Asp Thr Ser Ile 115 120 125 tca ctg cac ggt cac gct ttg ggc tgg atg acg aaa gga att ctt gat 432 Ser Leu His Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Asp 130 135 140 aaa gat aca tac tat tac cgc ggt gtt tat ttg gac gcc gtc cgc gcg 480 Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala 145 150 155 160 ctt gag gtc atc agc agc ttc gac gag gtt gac gaa aca agg atc ggt 528 Leu Glu Val Ile Ser Ser Phe Asp Glu Val Asp Glu Thr Arg Ile Gly 165 170 175 gtg aca gga gga agc caa ggc gga ggt tta acc att gcc gca gca gcg 576 Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala Ala Ala 180 185 190 ctg tca gac att cca aaa gcc gcg gtt gcc gat tat cct tat tta agc 624 Leu Ser Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser 195 200 205 aac ttc gaa cgg gcc att gat gtg gcg ctt gaa cag ccg tac ctt gaa 672 Asn Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu 210 215 220 atc aat tcc ttc ttc aga aga aat ggc agc ccg gaa aca gaa gtg cag 720 Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Gly Ser Pro Glu Thr Glu Val Gln 225 230 235 240 gcg atg aag aca ctt tca tat ttc gat att atg aat ctc gct gac cga 768 Ala Met Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala Asp Arg 245 250 255 gtg aag gtg cct gtc ctg atg tca atc ggc ctg att gac aag gtc acg 816 Val Lys Val Pro Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Ile Asp Lys Val Thr 260 265 270 ccg ccg tcc acc gtg ttt gcc gcc tac aat cat ttg gaa aca gag aaa 864 Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Glu Lys 275 280 285 gag ctg aag gtg tac cgc tac ttc gga cat gag tat atc cct gct ttt 912 Glu Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Tyr Ile Pro Ala Phe 290 295 300 caa acg gaa aaa ctt gct ttc ttt aag cag cat ctt aaa ggc tga taa 960 Gln Thr Glu Lys Leu Ala Phe Phe Lys Gln His Leu Lys Gly 305 310 315 <210> 2 <211> 318 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 2 Met Gln Leu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Gln Leu Gln Thr Tyr Lys Pro 1 5 10 15 Glu Lys Thr Ala Pro Lys Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Leu Ser Leu 20 25 30 Glu Glu Leu Ala Lys Val Gln Ala Glu Pro Asp Leu Gln Pro Val Asp 35 40 45 Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Lys Ser Phe 50 55 60 Gly Asn Ala Arg Ile Thr Gly Trp Tyr Ala Val Pro Asp Lys Gln Gly 65 70 75 80 Pro His Pro Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp 85 90 95 Gly Glu Ile His Glu Met Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Ala 100 105 110 Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Ser Ser Glu Asp Thr Ser Ile 115 120 125 Ser Leu His Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Asp 130 135 140 Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val 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gaacctgatt tacagccggt tgactatcct gctgacggag taaaagtgta ccgtctcaca 180 tataaaagct tcggaaacgc ccgcattacc ggatggtacg cggtgcctga caaggaaggc 240 ccgcatccgg cgatcgtgaa atatcatggc tacaatgcaa gctatgatgg tgagattcat 300 gaaatggtaa actgggcact ccatggctac gccacattcg gcatgcttgt ccgcggccag 360 cagagcagcg aggatacgag tatttcaccg cacggtcacg ctttgggctg gatgacgaaa 420 ggaattcttg ataaagatac atactattac cgcggtgttt atttggacgc cgtccgcgcg 480 cttgaggtca tcagcagctt cgacgaggtt gacgaaacaa ggatcggtgt gacaggagga 540 agccaaggcg gaggtttaac cattgccgca gcagcgctgt cagacattcc aaaagccgcg 600 gttgccgatt atccttattt aagcaacttc gaacgggcca ttgatgtggc gcttgaacag 660 ccgtaccttg aaatcaattc cttcttcaga agaaatggca gcccggaaac agaagtgcag 720 gcgatgaaga cactttcata tttcgatatt atgaatctcg ctgaccgagt gaaggtgcct 780 gtcctgatgt caatcggcct gattgacaag gtcacgccgc cgtccaccgt gtttgccgcc 840 tacaatcatt tggaaacaaa gaaagagctg aaggtgtacc gctacttcgg acatgagtat 900 atccctgctt ttcaaactga aaaacttgct ttctttaagc agcatcttaa aggctga 957 <210> 4 <211> 318 <212> 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gcatgctagt ccgcggccag 360 cagagcagcg aggatacgag tatttctcca catggccatg ctttgggctg gatgacgaaa 420 ggaatccttg ataaagatac atactattac cggggcgttt atttggacgc tgtccgcgcg 480 cttgaggtca tcagcagctt tgacgaagtt gacgaaacaa gaatcggtgt gacaggcgga 540 agccaaggag gcggcttaac cattgccgca gccgctctgt cagacattcc aaaagccgcg 600 gttgccgatt atccttattt aagcaacttt gaacgggcca ttgatgtggc gcttgaacag 660 ccgtaccttg aaatcaattc cttctttaga agaaatggaa gcccggaaac ggaagagaag 720 gcgatgaaga cactttcata tttcgatatt atgaatctcg ctgaccgagt gaaggtccct 780 gtcctgatgt cgatcggtct gattgacaag gtcacgccgc cgtccaccgt gtttgccgca 840 tacaaccact tggagacaga gaaagagctc aaagtgtacc gctacttcgg gcatgagtat 900 atccctgcct ttcaaacaga aaaacttgct ttctttaagc agcatcttaa aggctga 957 <210> 6 <211> 318 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 6 Met Gln Leu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Gln Leu Gln Thr Tyr Lys Pro 1 5 10 15 Glu Lys Thr Thr Pro Asn Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Ser Ser Leu 20 25 30 Asp Glu Leu Ala Lys Val Lys Ala Ala Pro Asp Leu Gln Leu Val Asp 35 40 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gctgaatccg 960 taa 963 <210> 12 <211> 320 <212> PRT <213> Clostridium thermocellum <400> 12 Met Ala Gln Leu Tyr Asp Met Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Lys 1 5 10 15 Pro Ala Leu Thr Lys Gln Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Glu Lys Ser 20 25 30 Leu Lys Glu Leu Ala Glu Ile Pro Leu Lys Tyr Gln Leu Ile Pro Tyr 35 40 45 Asp Phe Pro Ala Arg Arg Val Lys Val Phe Arg Val Glu Tyr Leu Gly 50 55 60 Phe Lys Gly Ala Asn Ile Glu Gly Trp Leu Ala Val Pro Glu Gly Glu 65 70 75 80 Gly Leu Tyr Pro Gly Leu Val Gln Phe His Gly Tyr Asn Trp Ala Met 85 90 95 Asp Gly Cys Val Pro Asp Val Val Asn Trp Ala Leu Asn Gly Tyr Ala 100 105 110 Ala Phe Leu Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Gly Arg Ser Val Asp Asn 115 120 125 Ile Val Pro Gly Ser Gly His Ala Leu Gly Trp Met Ser Lys Gly Ile 130 135 140 Leu Ser Pro Glu Glu Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Met Asp Ala Val 145 150 155 160 Arg Ala Val Glu Ile Leu Ala Ser Leu Pro Cys Val Asp Glu Ser Arg 165 170 175 Ile Gly Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Ala Leu Ala Val 180 185 190 Ala Ala Leu Ser Gly Ile Pro Lys Val Ala Ala Val His Tyr Pro Phe 195 200 205 Leu Ala His Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Pro Asp Gly Pro Tyr 210 215 220 Leu Glu Ile Asn Glu Tyr Leu Arg Arg Asn Ser Gly Glu Glu Ile Glu 225 230 235 240 Arg Gln Val Lys Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala 245 250 255 Pro Arg Ile Lys Cys Arg Thr Trp Ile Cys Thr Gly Leu Val Asp Glu 260 265 270 Ile Thr Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Val Tyr Asn His Leu Lys Cys 275 280 285 Pro Lys Glu Ile Ser Val Phe Arg Tyr Phe Gly His Glu His Met Pro 290 295 300 Gly Ser Val Glu Ile Lys Leu Arg Ile Leu Met Asp Glu Leu Asn Pro 305 310 315 320 <210> 13 <211> 978 <212> DNA <213> Thermotoga neapolitana <400> 13 atggccttct tcgatatgcc ccttgaggaa ctgaaaaagt accggcctga aaggtacgag 60 gagaaagatt tcgatgagtt ctggagggaa acacttaaag aaagcgaagg attccctctg 120 gatcccgtct ttgaaaaggt ggactttcat ctcaaaacgg ttgaaacgta cgatgttact 180 ttctctggat acagggggca gagaataaag ggctggcttc ttgttccgaa gttggcggaa 240 gaaaagcttc catgcgtcgt gcagtacata ggttacaatg gtggaagggg ttttccacac 300 gactggctgt tctggccgtc aatgggttac atctgttttg tcatggacac cagggggcag 360 ggaagcggct ggatgaaggg agacacaccg gattaccctg agggtccagt cgatccacag 420 taccccggat tcatgacgag gggcattctg gatccgggaa cctattacta caggcgagtc 480 ttcgtggatg cggtcagggc ggtggaagca gccatttcct tcccgagagt ggattccagg 540 aaggtggtgg tggccggagg cagtcagggt gggggaatcg cccttgcggt gagtgccctg 600 tcgaacaggg tgaaggctct gctctgcgat gtgccgtttc tgtgccactt cagaagggcc 660 gtgcaacttg tcgacacaca cccatacgtg gagatcacca acttcctcaa aacccacagg 720 gacaaagagg agattgtttt cagaacactt tcctacttcg atggtgtgaa ctttgcagca 780 agggcaaagg tgcccgccct gttttccgtt gggctcatgg acaccatctg tcctccctcg 840 acggtcttcg ccgcttacaa ccactacgcc ggtccaaagg agatcagaat ctatccgtac 900 aacaaccacg aaggtggagg ttctttccag gcaattgagc aggtgaaatt cttgaagaga 960 ctatttgagg aaggctag 978 <210> 14 <211> 325 <212> PRT <213> Thermotoga neapolitana <400> 14 Met Ala Phe Phe Asp Met Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Arg Glu Thr Leu 20 25 30 Lys Glu Ser Glu Gly Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Lys Val Asp 35 40 45 Phe His Leu Lys Thr Val Glu Thr Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Ala Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Met Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Gly Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Gly Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Val Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ile Ser Phe Pro Arg 165 170 175 Val Asp Ser Arg Lys Val Val Val Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Asn Arg Val Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Val Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Val Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Thr Ile Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Ile Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Arg 305 310 315 320 Leu Phe Glu Glu Gly 325 <210> 15 <211> 978 <212> DNA <213> Thermotoga maritima <400> 15 atggccttct tcgatttacc actcgaagaa ctgaagaaat atcgtccaga gcggtacgaa 60 gagaaagact tcgatgagtt ctgggaagag acactcgcag agagcgaaaa gttcccctta 120 gaccccgtct tcgagaggat ggagtctcac ctcaaaacag tcgaagcgta cgatgtcacc 180 ttctccggat acaggggaca gaggatcaaa gggtggctcc ttgttccaaa actggaagaa 240 gaaaaacttc cctgcgttgt gcagtacata ggatacaacg gtggaagagg attccctcac 300 gactggctgt tctggccttc tatgggttac atatgtttcg tcatggatac tcgaggtcag 360 ggaagcggct ggctgaaagg agacacaccg gattaccctg agggtcccgt tgaccctcag 420 tatccaggat tcatgacaag aggaatactg gatcccagaa cttactacta cagacgagtc 480 ttcacggacg ctgtcagagc cgttgaagct gctgcttctt ttcctcaggt agatcaagaa 540 agaatcgtga tagctggagg cagtcagggt ggcggaatag cccttgcggt gagcgctctc 600 tcaaagaaag caaaggctct tctgtgcgat gtgccgtttc tgtgtcactt cagaagagca 660 gtacagcttg tggatacgca tccatacgcg gagatcacga actttctaaa gacccacaga 720 gacaaggaag aaatcgtgtt caggactctt tcctatttcg atggagtgaa cttcgcagcc 780 agagcgaaga tccctgcgct gttttctgtg ggtctcatgg acaacatttg tcctccttca 840 acggttttcg ctgcctacaa ttactacgct ggaccgaagg aaatcagaat ctatccgtac 900 aacaaccacg agggaggagg ctctttccaa gcggttgaac aggtgaaatt cttgaaaaaa 960 ctatttgaga aaggctaa 978 <210> 16 <211> 325 <212> PRT <213> Thermotoga maritima <400> 16 Met Ala Phe Phe Asp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Glu Glu Thr Leu 20 25 30 Ala Glu Ser Glu Lys Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Arg Met Glu 35 40 45 Ser His Leu Lys Thr Val Glu Ala Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Leu Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Gly Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Gln 165 170 175 Val Asp Gln Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asn Ile Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Tyr 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Val Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Lys 305 310 315 320 Leu Phe Glu Lys Gly 325 <210> 17 <211> 963 <212> DNA <213> Thermoanaerobacterium sp. <400> 17 atgggacttt tcgacatgcc attacaaaaa cttagagaat acactggtac aaatccatgc 60 cctgaagatt tcgatgagta ttggaatagg gctttagatg agatgaggtc agttgatcct 120 aaaattgaat tgaaagaaag tagctttcaa gtatcctttg cagaatgcta tgacttgtac 180 tttacaggtg ttcgtggtgc cagaattcat gcaaagtata taaaacctaa gacagaaggg 240 aaacatccag cgttgataag atttcatgga tattcgtcaa attcaggcga ctggaacgac 300 aaattaaatt acgtggcggc aggcttcacc gttgtggcta tggatgtaag aggtcaagga 360 gggcagtctc aagatgttgg cggtgtaact gggaatactt taaatgggca tattataaga 420 gggctagacg atgatgctga taatatgctt ttcaggcata ttttcttaga cactgcccaa 480 ttggctggaa tagttatgaa catgccagaa gttgatgaag atagagtggg agtcatggga 540 ccttctcaag gcggagggct gtcgttggcg tgtgctgcat tggagccaag ggtacgcaaa 600 gtagtatctg aatatccttt tttatctgac tacaagagag tttgggactt agaccttgca 660 aaaaacgcct atcaagagat tacggactat ttcaggcttt ttgacccaag gcatgaaagg 720 gagaatgagg tatttacaaa gcttggatat atagacgtta aaaaccttgc gaaaaggata 780 aaaggcgatg tcttaatgtg cgttgggctt atggaccaag tatgtccgcc atcaactgtt 840 tttgcagcct acaacaacat acagtcaaaa aaagatataa aagtgtatcc tgattatgga 900 catgaaccta tgagaggatt tggagattta gcgatgcagt ttatgttgga actatattca 960 taa 963 <210> 18 <211> 320 <212> PRT <213> Thermoanaerobacterium sp. <400> 18 Met Gly Leu Phe Asp Met Pro Leu Gln Lys Leu Arg Glu Tyr Thr Gly 1 5 10 15 Thr Asn Pro Cys Pro Glu Asp Phe Asp Glu Tyr Trp Asn Arg Ala Leu 20 25 30 Asp Glu Met Arg Ser Val Asp Pro Lys Ile Glu Leu Lys Glu Ser Ser 35 40 45 Phe Gln Val Ser Phe Ala Glu Cys Tyr Asp Leu Tyr Phe Thr Gly Val 50 55 60 Arg Gly Ala Arg Ile His Ala Lys Tyr Ile Lys Pro Lys Thr Glu Gly 65 70 75 80 Lys His Pro Ala Leu Ile Arg Phe His Gly Tyr Ser Ser Asn Ser Gly 85 90 95 Asp Trp Asn Asp Lys Leu Asn Tyr Val Ala Ala Gly Phe Thr Val Val 100 105 110 Ala Met Asp Val Arg Gly Gln Gly Gly Gln Ser Gln Asp Val Gly Gly 115 120 125 Val Thr Gly Asn Thr Leu Asn Gly His Ile Ile Arg Gly Leu Asp Asp 130 135 140 Asp Ala Asp Asn Met Leu Phe Arg His Ile Phe Leu Asp Thr Ala Gln 145 150 155 160 Leu Ala Gly Ile Val Met Asn Met Pro Glu Val Asp Glu Asp Arg Val 165 170 175 Gly Val Met Gly Pro Ser Gln Gly Gly Gly Leu Ser Leu Ala Cys Ala 180 185 190 Ala Leu Glu Pro Arg Val Arg Lys Val Val Ser Glu Tyr Pro Phe Leu 195 200 205 Ser Asp Tyr Lys Arg Val Trp Asp Leu Asp Leu Ala Lys Asn Ala Tyr 210 215 220 Gln Glu Ile Thr Asp Tyr Phe Arg Leu Phe Asp Pro Arg His Glu Arg 225 230 235 240 Glu Asn Glu Val Phe Thr Lys Leu Gly Tyr Ile Asp Val Lys Asn Leu 245 250 255 Ala Lys Arg Ile Lys Gly Asp Val Leu Met Cys Val Gly Leu Met Asp 260 265 270 Gln Val Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Asn Ile Gln 275 280 285 Ser Lys Lys Asp Ile Lys Val Tyr Pro Asp Tyr Gly His Glu Pro Met 290 295 300 Arg Gly Phe Gly Asp Leu Ala Met Gln Phe Met Leu Glu Leu Tyr Ser 305 310 315 320 <210> 19 <211> 978 <212> DNA <213> Bacillus sp. <220> <221> CDS <222> (1)..(978) <400> 19 atg aac ctt ttt gat atg ccc ctt gag gag ctg cag cat tac aag cct 48 Met Asn Leu Phe Asp Met Pro Leu Glu Glu Leu Gln His Tyr Lys Pro 1 5 10 15 gcc cag acc agg cag gat gat ttt gag tca ttc tgg aaa aag cgg att 96 Ala Gln Thr Arg Gln Asp Asp Phe Glu Ser Phe Trp Lys Lys Arg Ile 20 25 30 gag gag aac agt caa tat ccg ctg aat ata gaa gta atg gag cgg gtt 144 Glu Glu Asn Ser Gln Tyr Pro Leu Asn Ile Glu Val Met Glu Arg Val 35 40 45 tat ccg gtt ccg gga gtg aga gta tat gat att tat ttt gac ggg ttc 192 Tyr Pro Val Pro Gly Val Arg Val Tyr Asp Ile Tyr Phe Asp Gly Phe 50 55 60 cgg aat tcc cgc atc cat ggg gtg tat gtt act cca gaa act ccg gga 240 Arg Asn Ser Arg Ile His Gly Val Tyr Val Thr Pro Glu Thr Pro Gly 65 70 75 80 gcg gac act cct gcg gca gtg att ttt cac ggc tat aac tgg aac acg 288 Ala Asp Thr Pro Ala Ala Val Ile Phe His Gly Tyr Asn Trp Asn Thr 85 90 95 ctg cag ccg cat tac agc ttc aag cac gtg att cag ggg att cct gta 336 Leu Gln Pro His Tyr Ser Phe Lys His Val Ile Gln Gly Ile Pro Val 100 105 110 ctg atg gtg gag gtg cgg gga caa aat ctc ttg tct cca gat aga aat 384 Leu Met Val Glu Val Arg Gly Gln Asn Leu Leu Ser Pro Asp Arg Asn 115 120 125 cat tat ggg aat gga ggt ccg gga ggc tgg atg aca ctc ggc gtg atg 432 His Tyr Gly Asn Gly Gly Pro Gly Gly Trp Met Thr Leu Gly Val Met 130 135 140 gat ccc gat caa tat tat tac agc ctg gta tat atg gac tgc ttc cgc 480 Asp Pro Asp Gln Tyr Tyr Tyr Ser Leu Val Tyr Met Asp Cys Phe Arg 145 150 155 160 agc att gat gct gtc agg gaa ctg tcg agg aag aga agt gtg ttt gtg 528 Ser Ile Asp Ala Val Arg Glu Leu Ser Arg Lys Arg Ser Val Phe Val 165 170 175 gaa ggc gga agc cag gga ggt gca ctg gcg att gcc gca gcc gcc ctg 576 Glu Gly Gly Ser Gln Gly Gly Ala Leu Ala Ile Ala Ala Ala Ala Leu 180 185 190 cag gat gac atc ctg ctt gca ctc gcc gac atc cct ttt ctc acc cat 624 Gln Asp Asp Ile Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ile Pro Phe Leu Thr His 195 200 205 ttc aag cgt tcc gtg gag ctt tcc tcg gat gga ccg tat cag gag att 672 Phe Lys Arg Ser Val Glu Leu Ser Ser Asp Gly Pro Tyr Gln Glu Ile 210 215 220 tcc cac tac ttc aaa gtt cat gat cct ctt cat caa acg gaa gag cag 720 Ser His Tyr Phe Lys Val His Asp Pro Leu His Gln Thr Glu Glu Gln 225 230 235 240 gta tat cag acg ctc agc tat gtg gac tgc atg aac atg gcc agc atg 768 Val Tyr Gln Thr Leu Ser Tyr Val Asp Cys Met Asn Met Ala Ser Met 245 250 255 gtt gaa tgt cca gtc ctt ctt tca gcc ggt ctg gaa gac atc gtt tgt 816 Val Glu Cys Pro Val Leu Leu Ser Ala Gly Leu Glu Asp Ile Val Cys 260 265 270 ccc ccg tcc agt gca ttt gca ctg ttc aac cat ctc ggc ggg cca aaa 864 Pro Pro Ser Ser Ala Phe Ala Leu Phe Asn His Leu Gly Gly Pro Lys 275 280 285 gaa ata cgg gcc tat ccg gaa tac gcc cat gaa gta ccg gct gtc cat 912 Glu Ile Arg Ala Tyr Pro Glu Tyr Ala His Glu Val Pro Ala Val His 290 295 300 gaa gag gaa aag ctg aag ttt ata tct tca agg cta aaa aat aga gaa 960 Glu Glu Glu Lys Leu Lys Phe Ile Ser Ser Arg Leu Lys Asn Arg Glu 305 310 315 320 aag agg tgc cgg cca tga 978 Lys Arg Cys Arg Pro 325 <210> 20 <211> 325 <212> PRT <213> Bacillus sp. <400> 20 Met Asn Leu Phe Asp Met Pro Leu Glu Glu Leu Gln His Tyr Lys Pro 1 5 10 15 Ala Gln Thr Arg Gln Asp Asp Phe Glu Ser Phe Trp Lys Lys Arg Ile 20 25 30 Glu Glu Asn Ser Gln Tyr Pro Leu Asn Ile Glu Val Met Glu Arg Val 35 40 45 Tyr Pro Val Pro Gly Val Arg Val Tyr Asp Ile Tyr Phe Asp Gly Phe 50 55 60 Arg Asn Ser Arg Ile His Gly Val Tyr Val Thr Pro Glu Thr Pro Gly 65 70 75 80 Ala Asp Thr Pro Ala Ala Val Ile Phe His Gly Tyr Asn Trp Asn Thr 85 90 95 Leu Gln Pro His Tyr Ser Phe Lys His Val Ile Gln Gly Ile Pro Val 100 105 110 Leu Met Val Glu Val Arg Gly Gln Asn Leu Leu Ser Pro Asp Arg Asn 115 120 125 His Tyr Gly Asn Gly Gly Pro Gly Gly Trp Met Thr Leu Gly Val Met 130 135 140 Asp Pro Asp Gln Tyr Tyr Tyr Ser Leu Val Tyr Met Asp Cys Phe Arg 145 150 155 160 Ser Ile Asp Ala Val Arg Glu Leu Ser Arg Lys Arg Ser Val Phe Val 165 170 175 Glu Gly Gly Ser Gln Gly Gly Ala Leu Ala Ile Ala Ala Ala Ala Leu 180 185 190 Gln Asp Asp Ile Leu Leu Ala Leu Ala Asp Ile Pro Phe Leu Thr His 195 200 205 Phe Lys Arg Ser Val Glu Leu Ser Ser Asp Gly Pro Tyr Gln Glu Ile 210 215 220 Ser His Tyr Phe Lys Val His Asp Pro Leu His Gln Thr Glu Glu Gln 225 230 235 240 Val Tyr Gln Thr Leu Ser Tyr Val Asp Cys Met Asn Met Ala Ser Met 245 250 255 Val Glu Cys Pro Val Leu Leu Ser Ala Gly Leu Glu Asp Ile Val Cys 260 265 270 Pro Pro Ser Ser Ala Phe Ala Leu Phe Asn His Leu Gly Gly Pro Lys 275 280 285 Glu Ile Arg Ala Tyr Pro Glu Tyr Ala His Glu Val Pro Ala Val His 290 295 300 Glu Glu Glu Lys Leu Lys Phe Ile Ser Ser Arg Leu Lys Asn Arg Glu 305 310 315 320 Lys Arg Cys Arg Pro 325 <210> 21 <211> 960 <212> DNA <213> Bacillus halodurans <400> 21 ttagagatca gataaaaatt gaaaaatccg atcacgatgg cctggcaaat cttcgtgagc 60 aaagtctgga tataactcga tactttttgt cgtcgtgagt ttgttataca tggcaaattg 120 tgtagacggc gggcaaaccg tatccattaa cccaacagca agtaagactt ctccctttac 180 gagtggagca agatgctgaa tatcaatata gcctagcttc gtaaagattt cagcctcacg 240 tcggtgctgt ggatcaaagc gacgaaaata cgtttgcaat tcgtcataag ctttctcggc 300 taaatccatc tcccatacgc gttggtaatc gctaaggaaa ggataaacag gagctacctt 360 tttaattttc ggttccaaag ccgcacaagc aatcgctaag gcccctcctt gtgaccaacc 420 tgtcactgcc acgcgctctt catcgacttc aggaaggttc atcacaatgt tggcaagctg 480 agccgtatca agaaacacat gacggaacaa taattgatca gcattatcat cgagtccgcg 540 tattatatga ccggaatgag tattcccctt cacgcctcct gtgtcttcag acaagcctcc 600 ttgcccgcga acgtccattg caagaacaga atatccgagg gctgcgtaat gaagtaaacc 660 cgtccattcc cccgcattca tcgtatatcc gtgaaaatga ataaccgccg ggtgtgtccc 720 gctcgtgtgt cttgggcgca cgtattttgc gtgaattcta gcacccctaa cccctgtaaa 780 atataggtgg aagcattctg catacgtggt ttgaaaatca ctcggtatga gctctacgtt 840 tggatttacc tttctcatct cttgtaaagc acgatcccaa tactcagtaa agtcatctgg 900 ctttggatta cgtcccatgt actcttttaa ttcggttaac ggcatgtcta ttagtggcat 960 <210> 22 <211> 319 <212> PRT <213> Bacillus halodurans <400> 22 Met Pro Leu Ile Asp Met Pro Leu Thr Glu Leu Lys Glu Tyr Met Gly 1 5 10 15 Arg Asn Pro Lys Pro Asp Asp Phe Thr Glu Tyr Trp Asp Arg Ala Leu 20 25 30 Gln Glu Met Arg Lys Val Asn Pro Asn Val Glu Leu Ile Pro Ser Asp 35 40 45 Phe Gln Thr Thr Tyr Ala Glu Cys Phe His Leu Tyr Phe Thr Gly Val 50 55 60 Arg Gly Ala Arg Ile His Ala Lys Tyr Val Arg Pro Arg His Thr Ser 65 70 75 80 Gly Thr His Pro Ala Val Ile His Phe His Gly Tyr Thr Met Asn Ala 85 90 95 Gly Glu Trp Thr Gly Leu Leu His Tyr Ala Ala Leu Gly Tyr Ser Val 100 105 110 Leu Ala Met Asp Val Arg Gly Gln Gly Gly Leu Ser Glu Asp Thr Gly 115 120 125 Gly Val Lys Gly Asn Thr His Ser Gly His Ile Ile Arg Gly Leu Asp 130 135 140 Asp Asn Ala Asp Gln Leu Leu Phe Arg His Val Phe Leu Asp Thr Ala 145 150 155 160 Gln Leu Ala Asn Ile Val Met Asn Leu Pro Glu Val Asp Glu Glu Arg 165 170 175 Val Ala Val Thr Gly Trp Ser Gln Gly Gly Ala Leu Ala Ile Ala Cys 180 185 190 Ala Ala Leu Glu Pro Lys Ile Lys Lys Val Ala Pro Val Tyr Pro Phe 195 200 205 Leu Ser Asp Tyr Gln Arg Val Trp Glu Met Asp Leu Ala Glu Lys Ala 210 215 220 Tyr Asp Glu Leu Gln Thr Tyr Phe Arg Arg Phe Asp Pro Gln His Arg 225 230 235 240 Arg Glu Ala Glu Ile Phe Thr Lys Leu Gly Tyr Ile Asp Ile Gln His 245 250 255 Leu Ala Pro Leu Val Lys Gly Glu Val Leu Leu Ala Val Gly Leu Met 260 265 270 Asp Thr Val Cys Pro Pro Ser Thr Gln Phe Ala Met Tyr Asn Lys Leu 275 280 285 Thr Thr Thr Lys Ser Ile Glu Leu Tyr Pro Asp Phe Ala His Glu Asp 290 295 300 Leu Pro Gly His Arg Asp Arg Ile Phe Gln Phe Leu Ser Asp Leu 305 310 315 <210> 23 <211> 954 <212> DNA <213> Bacillus clausii <400> 23 atgccattag tcgatatgcc gttgcgcgag ttgttagctt atgaaggaat aaaccctaaa 60 ccagcagatt ttgaccaata ctggaaccgg gccaaaacgg aaattgaagc gattgatccc 120 gaagtcactc tagtcgaatc ttctttccag tgttcgtttg caaactgtta ccatttctat 180 tatcgaagcg ctggaaatgc aaaaatccat gcgaaatacg tacagccaaa agcaggggag 240 aagacgccag cagtttttat gttccatggg tatggggggc gttcagccga atggagcagc 300 ttgttaaatt atgtagcggc gggtttttct gttttctata tggacgtgcg tggacaaggt 360 ggaacttcag aggatcctgg gggcgtaagg gggaatacat ataggggcca cattattcgc 420 ggcctcgatg ccgggccaga cgcacttttt taccgcagcg ttttcttgga caccgtccaa 480 ttggttcgtg ctgctaaaac attgcctcac atcgataaaa cacggcttat ggccacaggg 540 tggtcgcaag ggggcgcctt aacgcttgcc tgtgctgccc ttgttcctga aatcaagcgt 600 cttgctccag tatacccgtt tttaagcgat tacaagcgag tgtggcaaat ggatttagcg 660 gttcgttcgt ataaagaatt ggctgattat ttccgttcat acgatccgca acataaacgc 720 catggcgaaa tttttgaacg ccttggctac atcgatgtcc agcatcttgc tgaccggatt 780 caaggagatg tcctaatggg agttggttta atggatacag aatgcccgcc gtctacccaa 840 tttgctgctt ataataaaat aaaggctaaa aaatcgtatg agctctatcc tgattttggc 900 catgagcacc ttccaggaat gaacgatcat atttttcgct ttttcactag ttga 954 <210> 24 <211> 317 <212> PRT <213> Bacillus clausii <400> 24 Met Pro Leu Val Asp Met Pro Leu Arg Glu Leu Leu Ala Tyr Glu Gly 1 5 10 15 Ile Asn Pro Lys Pro Ala Asp Phe Asp Gln Tyr Trp Asn Arg Ala Lys 20 25 30 Thr Glu Ile Glu Ala Ile Asp Pro Glu Val Thr Leu Val Glu Ser Ser 35 40 45 Phe Gln Cys Ser Phe Ala Asn Cys Tyr His Phe Tyr Tyr Arg Ser Ala 50 55 60 Gly Asn Ala Lys Ile His Ala Lys Tyr Val Gln Pro Lys Ala Gly Glu 65 70 75 80 Lys Thr Pro Ala Val Phe Met Phe His Gly Tyr Gly Gly Arg Ser Ala 85 90 95 Glu Trp Ser Ser Leu Leu Asn Tyr Val Ala Ala Gly Phe Ser Val Phe 100 105 110 Tyr Met Asp Val Arg Gly Gln Gly Gly Thr Ser Glu Asp Pro Gly Gly 115 120 125 Val Arg Gly Asn Thr Tyr Arg Gly His Ile Ile Arg Gly Leu Asp Ala 130 135 140 Gly Pro Asp Ala Leu Phe Tyr Arg Ser Val Phe Leu Asp Thr Val Gln 145 150 155 160 Leu Val Arg Ala Ala Lys Thr Leu Pro His Ile Asp Lys Thr Arg Leu 165 170 175 Met Ala Thr Gly Trp Ser Gln Gly Gly Ala Leu Thr Leu Ala Cys Ala 180 185 190 Ala Leu Val Pro Glu Ile Lys Arg Leu Ala Pro Val Tyr Pro Phe Leu 195 200 205 Ser Asp Tyr Lys Arg Val Trp Gln Met Asp Leu Ala Val Arg Ser Tyr 210 215 220 Lys Glu Leu Ala Asp Tyr Phe Arg Ser Tyr Asp Pro Gln His Lys Arg 225 230 235 240 His Gly Glu Ile Phe Glu Arg Leu Gly Tyr Ile Asp Val Gln His Leu 245 250 255 Ala Asp Arg Ile Gln Gly Asp Val Leu Met Gly Val Gly Leu Met Asp 260 265 270 Thr Glu Cys Pro Pro Ser Thr Gln Phe Ala Ala Tyr Asn Lys Ile Lys 275 280 285 Ala Lys Lys Ser Tyr Glu Leu Tyr Pro Asp Phe Gly His Glu His Leu 290 295 300 Pro Gly Met Asn Asp His Ile Phe Arg Phe Phe Thr Ser 305 310 315 <210> 25 <211> 960 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(960) <400> 25 atg caa cta ttc gat ctg ccg ctc gac caa ttg caa aca tat aag cct 48 Met Gln Leu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Gln Leu Gln Thr Tyr Lys Pro 1 5 10 15 gaa aaa aca gca ccg aaa gat ttt tct gag ttt tgg aaa ttg tct ttg 96 Glu Lys Thr Ala Pro Lys Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Leu Ser Leu 20 25 30 gag gaa ctt gca aaa gtc caa gca gaa cct gat cta cag ccg gtt gac 144 Glu Glu Leu Ala Lys Val Gln Ala Glu Pro Asp Leu Gln Pro Val Asp 35 40 45 tat cct gct gac gga gta aaa gtg tac cgt ctc aca tat aaa agc ttc 192 Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Lys Ser Phe 50 55 60 gga aac gcc cgc att acc gga tgg tac gcg gtg cct gac aag caa ggc 240 Gly Asn Ala Arg Ile Thr Gly Trp Tyr Ala Val Pro Asp Lys Gln Gly 65 70 75 80 ccg cat ccg gcg atc gtg aaa tat cat ggc tac aat gca agc tat gat 288 Pro His Pro Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp 85 90 95 ggt gag att cat gaa atg gta aac tgg gca ctc cat ggc tac gcc gca 336 Gly Glu Ile His Glu Met Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Ala 100 105 110 ttc ggc atg ctt gtc cgc ggc cag cag agc agc gag gat acg agt att 384 Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Ser Ser Glu Asp Thr Ser Ile 115 120 125 tca ccg cac ggt cac gct ttg ggc tgg atg acg aaa gga att ctt gat 432 Ser Pro His Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Asp 130 135 140 aaa gat aca tac tat tac cgc ggt gtt tat ttg gac gcc gtc cgc gcg 480 Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala 145 150 155 160 ctt gag gtc atc agc agc ttc gac gag gtt gac gaa aca agg atc ggt 528 Leu Glu Val Ile Ser Ser Phe Asp Glu Val Asp Glu Thr Arg Ile Gly 165 170 175 gtg aca gga gga agc caa ggc gga ggt tta acc att gcc gca gca gcg 576 Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala Ala Ala 180 185 190 ctg tca gac att cca aaa gcc gcg gtt gcc gat tat cct tat tta agc 624 Leu Ser Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser 195 200 205 aac ttc gaa cgg gcc att gat gtg gcg ctt gaa cag ccg tac ctt gaa 672 Asn Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu 210 215 220 atc aat tcc ttc ttc aga aga aat ggc agc ccg gaa aca gaa gtg cag 720 Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Gly Ser Pro Glu Thr Glu Val Gln 225 230 235 240 gcg atg aag aca ctt tca tat ttc gat att atg aat ctc gct gac cga 768 Ala Met Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala Asp Arg 245 250 255 gtg aag gtg cct gtc ctg atg tca atc ggc ctg att gac aag gtc acg 816 Val Lys Val Pro Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Ile Asp Lys Val Thr 260 265 270 ccg cca tcc acc gtg ttt gcc gcc tac aat cat ttg gaa aca gag aaa 864 Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Glu Lys 275 280 285 gag ctg aag gtg tac cgc tac ttc gga cat gag tat atc cct gct ttt 912 Glu Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Tyr Ile Pro Ala Phe 290 295 300 caa acg gaa aaa ctt gct ttc ttt aag cag cat ctt aaa ggc tga taa 960 Gln Thr Glu Lys Leu Ala Phe Phe Lys Gln His Leu Lys Gly 305 310 315 <210> 26 <211> 318 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 26 Met Gln Leu Phe Asp Leu Pro Leu Asp Gln Leu Gln Thr Tyr Lys Pro 1 5 10 15 Glu Lys Thr Ala Pro Lys Asp Phe Ser Glu Phe Trp Lys Leu Ser Leu 20 25 30 Glu Glu Leu Ala Lys Val Gln Ala Glu Pro Asp Leu Gln Pro Val Asp 35 40 45 Tyr Pro Ala Asp Gly Val Lys Val Tyr Arg Leu Thr Tyr Lys Ser Phe 50 55 60 Gly Asn Ala Arg Ile Thr Gly Trp Tyr Ala Val Pro Asp Lys Gln Gly 65 70 75 80 Pro His Pro Ala Ile Val Lys Tyr His Gly Tyr Asn Ala Ser Tyr Asp 85 90 95 Gly Glu Ile His Glu Met Val Asn Trp Ala Leu His Gly Tyr Ala Ala 100 105 110 Phe Gly Met Leu Val Arg Gly Gln Gln Ser Ser Glu Asp Thr Ser Ile 115 120 125 Ser Pro His Gly His Ala Leu Gly Trp Met Thr Lys Gly Ile Leu Asp 130 135 140 Lys Asp Thr Tyr Tyr Tyr Arg Gly Val Tyr Leu Asp Ala Val Arg Ala 145 150 155 160 Leu Glu Val Ile Ser Ser Phe Asp Glu Val Asp Glu Thr Arg Ile Gly 165 170 175 Val Thr Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly Leu Thr Ile Ala Ala Ala Ala 180 185 190 Leu Ser Asp Ile Pro Lys Ala Ala Val Ala Asp Tyr Pro Tyr Leu Ser 195 200 205 Asn Phe Glu Arg Ala Ile Asp Val Ala Leu Glu Gln Pro Tyr Leu Glu 210 215 220 Ile Asn Ser Phe Phe Arg Arg Asn Gly Ser Pro Glu Thr Glu Val Gln 225 230 235 240 Ala Met Lys Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Ile Met Asn Leu Ala Asp Arg 245 250 255 Val Lys Val Pro Val Leu Met Ser Ile Gly Leu Ile Asp Lys Val Thr 260 265 270 Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His Leu Glu Thr Glu Lys 275 280 285 Glu Leu Lys Val Tyr Arg Tyr Phe Gly His Glu Tyr Ile Pro Ala Phe 290 295 300 Gln Thr Glu Lys Leu Ala Phe Phe Lys Gln His Leu Lys Gly 305 310 315 <210> 27 <211> 325 <212> PRT <213> Thermotoga neapolitana <220> <221> MISC_FEATURE <222> (277)..(277) <223> Xaa is Ala, Val, Ser, or Thr. <400> 27 Met Ala Phe Phe Asp Met Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Arg Glu Thr Leu 20 25 30 Lys Glu Ser Glu Gly Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Lys Val Asp 35 40 45 Phe His Leu Lys Thr Val Glu Thr Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Ala Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Met Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Gly Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Gly Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Val Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ile Ser Phe Pro Arg 165 170 175 Val Asp Ser Arg Lys Val Val Val Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Asn Arg Val Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Val Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Val Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Thr Ile Xaa Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Ile Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Arg 305 310 315 320 Leu Phe Glu Glu Gly 325 <210> 28 <211> 325 <212> PRT <213> Thermotoga maritima <220> <221> MISC_FEATURE <222> (277)..(277) <223> Xaa is Ala, Val, Ser, or Thr. <400> 28 Met Ala Phe Phe Asp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Glu Glu Thr Leu 20 25 30 Ala Glu Ser Glu Lys Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Arg Met Glu 35 40 45 Ser His Leu Lys Thr Val Glu Ala Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Leu Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Gly Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Gln 165 170 175 Val Asp Gln Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asn Ile Xaa Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Tyr 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Val Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Lys 305 310 315 320 Leu Phe Glu Lys Gly 325 <210> 29 <211> 326 <212> PRT <213> Thermotoga lettingae <220> <221> MISC_FEATURE <222> (277)..(277) <223> Xaa is Ala, Val, Ser, or Thr. <400> 29 Met Val Tyr Phe Asp Met Pro Leu Glu Asp Leu Arg Lys Tyr Leu Pro 1 5 10 15 Gln Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Asp Phe Trp Lys Gln Thr Ile 20 25 30 His Glu Thr Arg Gly Tyr Phe Gln Glu Pro Ile Leu Lys Lys Val Asp 35 40 45 Phe Tyr Leu Gln Asn Val Glu Thr Phe Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Lys Ile Lys Gly Trp Leu Ile Leu Pro Lys Phe Arg Asn 65 70 75 80 Gly Lys Leu Pro Cys Val Val Glu Phe Val Gly Tyr Gly Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro Tyr Asp Trp Leu Leu Trp Ser Ala Ala Gly Tyr Ala His 100 105 110 Phe Ile Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Asn Trp Met Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Glu Asp Asn Pro Ser Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Leu Thr Lys Gly Val Leu Asn Pro Glu Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Met Asp Ala Phe Met Ala Val Glu Thr Ile Ser Gln Leu Glu Gln 165 170 175 Ile Asp Ser Gln Thr Ile Ile Leu Ser Gly Ala Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Ser Lys Val Met Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Tyr Lys Arg Ala Val Gln Ile Thr 210 215 220 Asp Ser Met Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Arg Tyr Cys Lys Thr His Ile 225 230 235 240 Asp Lys Ile Gln Thr Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Cys Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asp Ile Xaa Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Tyr 275 280 285 Tyr Ala Gly Glu Lys Asp Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe His Thr Leu Glu Lys Leu Lys Phe Val Lys Lys 305 310 315 320 Thr Ile Ser Met Arg Glu 325 <210> 30 <211> 325 <212> PRT <213> Thermotoga petrophilia <220> <221> MISC_FEATURE <222> (277)..(277) <223> Xaa is Ala, Val, Ser, or Thr. <400> 30 Met Ala Phe Phe Asp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Glu Gly Thr Leu 20 25 30 Ala Glu Asn Glu Lys Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Arg Met Glu 35 40 45 Ser His Leu Lys Thr Val Glu Ala Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Met Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Met Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Asp Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Arg 165 170 175 Val Asp His Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr 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RQ2a <220> <221> MISC_FEATURE <222> (277)..(277) <223> Xaa is Ala, Val, Ser, or Thr. <400> 31 Met Ala Phe Phe Asp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Lys Glu Thr Leu 20 25 30 Ala Glu Ser Glu Lys Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Arg Met Glu 35 40 45 Ser His Leu Lys Thr Val Glu Val Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Leu Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Asp Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Arg 165 170 175 Val Asp His Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Val Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asn Ile Xaa Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Ile Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Arg 305 310 315 320 Leu Phe Glu Lys Gly 325 <210> 32 <211> 329 <212> PRT <213> Thermotoga sp. RQ2b <220> <221> MISC_FEATURE <222> (278)..(278) <223> Xaa is Ala, Val, Ser, or Thr. <400> 32 Met Ala Leu Phe Asp Met Pro Leu Glu Lys Leu Arg Ser Tyr Leu Pro 1 5 10 15 Asp Arg Tyr Glu Glu Glu Asp Phe Asp Leu Phe Trp Lys Glu Thr Leu 20 25 30 Glu Glu Ser Arg Lys Phe Pro Leu Asp Pro Ile Phe Glu Arg Val Asp 35 40 45 Tyr Leu Leu Glu Asn Val Glu Val Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Ala Trp Leu Ile Leu Pro Val Val Lys Lys 65 70 75 80 Glu Glu Arg Leu Pro Cys Ile Val Glu Phe Ile Gly Tyr Arg Gly Gly 85 90 95 Arg Gly Phe Pro Phe Asp Trp Leu Phe Trp Ser Ser Ala Gly Tyr Ala 100 105 110 His Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Thr Ser Arg Val Lys Gly 115 120 125 Asp Thr Pro Asp Tyr Cys Asp Glu Pro Ile Asn Pro Gln Phe Pro Gly 130 135 140 Phe Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg 145 150 155 160 Val Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Thr Ala Ser Ser Phe Pro 165 170 175 Gly Ile Asp Pro Glu Arg Ile Ala Val Val Gly Thr Ser Gln Gly Gly 180 185 190 Gly Ile Ala Leu Ala Val Ala Ala Leu Ser Glu Ile Pro Lys Ala Leu 195 200 205 Val Ser Asn Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Ile 210 215 220 Thr Asp Asn Ala Pro Tyr Ser Glu Ile Val Asn Tyr Leu Lys Val His 225 230 235 240 Arg Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly 245 250 255 Val Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Ala 260 265 270 Leu Met Asp Lys Thr Xaa Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn 275 280 285 His Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Lys Val Tyr Pro Phe Asn Glu His 290 295 300 Glu Gly Gly Glu Ser Phe Gln Arg Met Glu Glu Leu Arg Phe Met Lys 305 310 315 320 Arg Ile Leu Lys Gly Glu Phe Lys Ala 325 <210> 33 <211> 326 <212> PRT <213> Thermotoga lettingae <400> 33 Met Val Tyr Phe Asp Met Pro Leu Glu Asp Leu Arg Lys Tyr Leu Pro 1 5 10 15 Gln Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Asp Phe Trp Lys Gln Thr Ile 20 25 30 His Glu Thr Arg Gly Tyr Phe Gln Glu Pro Ile Leu Lys Lys Val Asp 35 40 45 Phe Tyr Leu Gln Asn Val Glu Thr Phe Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Lys Ile Lys Gly Trp Leu Ile Leu Pro Lys Phe Arg Asn 65 70 75 80 Gly Lys Leu Pro Cys Val Val Glu Phe Val Gly Tyr Gly Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro Tyr Asp Trp Leu Leu Trp Ser Ala Ala Gly Tyr Ala His 100 105 110 Phe Ile Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Asn Trp Met Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Glu Asp Asn Pro Ser Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Leu Thr Lys Gly Val Leu Asn Pro Glu Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Met Asp Ala Phe Met Ala Val Glu Thr Ile Ser Gln Leu Glu Gln 165 170 175 Ile Asp Ser Gln Thr Ile Ile Leu Ser Gly Ala Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Ser Lys Val Met Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Tyr Lys Arg Ala Val Gln Ile Thr 210 215 220 Asp Ser Met Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Arg Tyr Cys Lys Thr His Ile 225 230 235 240 Asp Lys Ile Gln Thr Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Cys Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asp Ile Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Tyr 275 280 285 Tyr Ala Gly Glu Lys Asp Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe His Thr Leu Glu Lys Leu Lys Phe Val Lys Lys 305 310 315 320 Thr Ile Ser Met Arg Glu 325 <210> 34 <211> 325 <212> PRT <213> Thermotoga petrophilia <400> 34 Met Ala Phe Phe Asp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Glu Gly Thr Leu 20 25 30 Ala Glu Asn Glu Lys Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Arg Met Glu 35 40 45 Ser His Leu Lys Thr Val Glu Ala Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Met Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Met Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Asp Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Arg 165 170 175 Val Asp His Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Val Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asn Ile Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Ile Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Arg 305 310 315 320 Leu Phe Glu Lys Gly 325 <210> 35 <211> 325 <212> PRT <213> Thermotoga sp. RQ2 <400> 35 Met Ala Phe Phe Asp Leu Pro Leu Glu Glu Leu Lys Lys Tyr Arg Pro 1 5 10 15 Glu Arg Tyr Glu Glu Lys Asp Phe Asp Glu Phe Trp Lys Glu Thr Leu 20 25 30 Ala Glu Ser Glu Lys Phe Pro Leu Asp Pro Val Phe Glu Arg Met Glu 35 40 45 Ser His Leu Lys Thr Val Glu Val Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Gly Trp Leu Leu Val Pro Lys Leu Glu Glu 65 70 75 80 Glu Lys Leu Pro Cys Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Asn Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Tyr Ile Cys 100 105 110 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Leu Lys Gly Asp 115 120 125 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Asp Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Arg 165 170 175 Val Asp His Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Val Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asn Ile Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn His 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Ile Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Arg 305 310 315 320 Leu Phe Glu Lys Gly 325 <210> 36 <211> 329 <212> PRT <213> Thermotoga sp. RQ2 <400> 36 Met Ala Leu Phe Asp Met Pro Leu Glu Lys Leu Arg Ser Tyr Leu Pro 1 5 10 15 Asp Arg Tyr Glu Glu Glu Asp Phe Asp Leu Phe Trp Lys Glu Thr Leu 20 25 30 Glu Glu Ser Arg Lys Phe Pro Leu Asp Pro Ile Phe Glu Arg Val Asp 35 40 45 Tyr Leu Leu Glu Asn Val Glu Val Tyr Asp Val Thr Phe Ser Gly Tyr 50 55 60 Arg Gly Gln Arg Ile Lys Ala Trp Leu Ile Leu Pro Val Val Lys Lys 65 70 75 80 Glu Glu Arg Leu Pro Cys Ile Val Glu Phe Ile Gly Tyr Arg Gly Gly 85 90 95 Arg Gly Phe Pro Phe Asp Trp Leu Phe Trp Ser Ser Ala Gly Tyr Ala 100 105 110 His Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Thr Ser Arg Val Lys Gly 115 120 125 Asp Thr Pro Asp Tyr Cys Asp Glu Pro Ile Asn Pro Gln Phe Pro Gly 130 135 140 Phe Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg 145 150 155 160 Val Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Thr Ala Ser Ser Phe Pro 165 170 175 Gly Ile Asp Pro Glu Arg Ile Ala Val Val Gly Thr Ser Gln Gly Gly 180 185 190 Gly Ile Ala Leu Ala Val Ala Ala Leu Ser Glu Ile Pro Lys Ala Leu 195 200 205 Val Ser Asn Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Ile 210 215 220 Thr Asp Asn Ala Pro Tyr Ser Glu Ile Val Asn Tyr Leu Lys Val His 225 230 235 240 Arg Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly 245 250 255 Val Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Ala 260 265 270 Leu Met Asp Lys Thr Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn 275 280 285 His Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Lys Val Tyr Pro Phe Asn Glu His 290 295 300 Glu Gly Gly Glu Ser Phe Gln Arg Met Glu Glu Leu Arg Phe Met Lys 305 310 315 320 Arg Ile Leu Lys Gly Glu Phe Lys Ala 325 <210> 37 <211> 960 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic gene - codon optimized <400> 37 atgggtctgt tcgatatgcc actgcaaaaa ctgcgtgaat ataccggtac caacccatgt 60 cctgaggatt tcgatgaata ctgggatcgc gcactggacg aaatgcgtag cgttgatcct 120 aaaatcaaga tgaagaagag ctcctttcaa gttccgttcg cggaatgtta cgatctgtat 180 tttaccggcg ttcgtggtgc ccgcattcac gcgaaataca ttcgtccgaa aaccgaaggc 240 aaacacccgg cgctgattcg cttccatggt tactccagca actctggtga ttggaacgac 300 aagctgaact acgttgcggc tggttttacc gtagtagcga tggacgctcg tggccagggt 360 ggccaatctc aggacgtcgg cggtgttaat ggcaacaccc tgaacggtca catcatccgt 420 ggcctggacg atgatgcaga taacatgctg ttccgtcata ttttcctgga caccgcgcag 480 ctggctggta tcgttatgaa catgccggaa atcgatgagg accgcgtagc tgttatgggt 540 ccgtcccagg gcggcggtct gtccctggcg tgtgcggctc tggaacctaa aatccgtaaa 600 gtagtgtccg aatatccgtt cctgagcgac tacaagcgtg tgtgggatct ggatctggcc 660 aaaaatgcgt accaagaaat cactgactat ttccgtctgt tcgacccacg ccacgaacgt 720 gagaacgagg tttttactaa actgggttac attgacgtaa agaacctggc gaaacgtatc 780 aaaggtgatg ttctgatgtg cgtgggcctg atggatcagg tctgcccgcc gagcaccgta 840 tttgcagcat acaacaacat ccagtccaag aaggacatca aagtctaccc ggactatggt 900 cacgaaccga tgcgtggctt cggtgacctg gctatgcagt tcatgctgga actgtattct 960 <210> 38 <211> 320 <212> PRT <213> Thermoanaerobacterium saccharolyticum <400> 38 Met Gly Leu Phe Asp Met Pro Leu Gln Lys Leu Arg Glu Tyr Thr Gly 1 5 10 15 Thr Asn Pro Cys Pro Glu Asp Phe Asp Glu Tyr Trp Asp Arg Ala Leu 20 25 30 Asp Glu Met Arg Ser Val Asp Pro Lys Ile Lys Met Lys Lys Ser Ser 35 40 45 Phe Gln Val Pro Phe Ala Glu Cys Tyr Asp Leu Tyr Phe Thr Gly Val 50 55 60 Arg Gly Ala Arg Ile His Ala Lys Tyr Ile Arg Pro Lys Thr Glu Gly 65 70 75 80 Lys His Pro Ala Leu Ile Arg Phe His Gly Tyr Ser Ser Asn Ser Gly 85 90 95 Asp Trp Asn Asp Lys Leu Asn Tyr Val Ala Ala Gly Phe Thr Val Val 100 105 110 Ala Met Asp Ala Arg Gly Gln Gly Gly Gln Ser Gln Asp Val Gly Gly 115 120 125 Val Asn Gly Asn Thr Leu Asn Gly His Ile Ile Arg Gly Leu Asp Asp 130 135 140 Asp Ala Asp Asn Met Leu Phe Arg His Ile Phe Leu Asp Thr Ala Gln 145 150 155 160 Leu Ala Gly Ile Val Met Asn Met Pro Glu Ile Asp Glu Asp Arg Val 165 170 175 Ala Val Met Gly Pro Ser Gln Gly Gly Gly Leu Ser Leu Ala Cys Ala 180 185 190 Ala Leu Glu Pro Lys Ile Arg Lys Val Val Ser Glu Tyr Pro Phe Leu 195 200 205 Ser Asp Tyr Lys Arg Val Trp Asp Leu Asp Leu Ala Lys Asn Ala Tyr 210 215 220 Gln Glu Ile Thr Asp Tyr Phe Arg Leu Phe Asp Pro Arg His Glu Arg 225 230 235 240 Glu Asn Glu Val Phe Thr Lys Leu Gly Tyr Ile Asp Val Lys Asn Leu 245 250 255 Ala Lys Arg Ile Lys Gly Asp Val Leu Met Cys Val Gly Leu Met Asp 260 265 270 Gln Val Cys Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Asn Ile Gln 275 280 285 Ser Lys Lys Asp Ile Lys Val Tyr Pro Asp Tyr Gly His Glu Pro Met 290 295 300 Arg Gly Phe Gly Asp Leu Ala Met Gln Phe Met Leu Glu Leu Tyr Ser 305 310 315 320 <210> 39 <211> 939 <212> DNA <213> Lactococcus lactis <400> 39 atgacaaaaa taaacaattg gcaagattat caaggaagtt cacttaaacc agaggatttt 60 gataaatttt gggatgaaaa aattaatttg gtttcaaatc atcaatttga atttgaatta 120 atagaaaaaa atctttcctc taaggtagtt aacttttatc atttgtggtt tacagctatt 180 gatggagcta aaattcatgc tcagttaatt gttcccaaga atttgaaaga gaaataccca 240 gccatcttac aatttcatgg ttatcattgc gatagtgggg attgggtcga taaaataggg 300 atagttgccg aagggaatgt agttcttgcg cttgattgtc gaggacaagg tggtttaagt 360 caagataata ttcaaactat ggggatgaca atgaagggac tcattgttcg aggaattgat 420 gaagggtatg aaaatctcta ttacgttcgc caatttatgg acttaataac tgcaaccaaa 480 attttatccg agtttgattt tgttgatgaa acaaatataa gtgcacaagg tgcttctcaa 540 ggtggagcgc ttgccgttgc ttgcgccgca ctttctcctc ttataaaaaa ggtgactgcc 600 acttacccct ttctttcaga ttatcgcaaa gcttatgagc ttggtgccga ggaatctgct 660 ttcgaagaac ttccatattg gtttcagttt aaagatccac ttcatctaag agaagactgg 720 ttttttaatc agttggaata cattgatatt caaaatttag caccaagaat taaggctgag 780 gtcatttgga tcctaggcgg caaagatact gttgttcctc cgattacgca aatggcggct 840 tacaataaaa tacaaagtaa aaaatctctc tatgtcttac ctgaatacgg ccatgaatat 900 cttcctaaaa ttagcgactg gttaagagag aatcaataa 939 <210> 40 <211> 312 <212> PRT <213> Lactococcus lactis <400> 40 Met Thr Lys Ile Asn Asn Trp Gln Asp Tyr Gln Gly Ser Ser Leu Lys 1 5 10 15 Pro Glu Asp Phe Asp Lys Phe Trp Asp Glu Lys Ile Asn Leu Val Ser 20 25 30 Asn His Gln Phe Glu Phe Glu Leu Ile Glu Lys Asn Leu Ser Ser Lys 35 40 45 Val Val Asn Phe Tyr His Leu Trp Phe Thr Ala Ile Asp Gly Ala Lys 50 55 60 Ile His Ala Gln Leu Ile Val Pro Lys Asn Leu Lys Glu Lys Tyr Pro 65 70 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Ser Leu Tyr Val Leu Pro Glu Tyr Gly His Glu Tyr Leu Pro Lys Ile 290 295 300 Ser Asp Trp Leu Arg Glu Asn Gln 305 310 <210> 41 <211> 972 <212> DNA <213> Mesorhizobium loti <400> 41 atgccgttcc cggatctgat ccagcccgaa ctgggcgctt atgtcagcag tgtcggcatg 60 ccggacgact ttgcccaatt ctggacgtcg accatcgccg aggctcgcca ggccggcggt 120 gaggtcagta tcgtgcaggc gcagacgaca ctgaaggcgg tccagtcctt cgatgtcacg 180 tttccaggat acggcggtca tccaatcaaa ggatggctga tcttgccgac gcaccacaag 240 gggcggcttc ccctcgtcgt gcagtatatc ggctatggcg gcggccgcgg cttggcgcat 300 gagcaactgc attgggcggc gtcaggcttt gcctatttcc gaatggatac acgcgggcag 360 ggaagcgact ggagcgtcgg tgagaccgcc gatcccgtcg gctcgacctc gtccattccc 420 ggctttatga cgcgtggcgt gctggacaag aatgactact attaccggcg cctgttcacc 480 gatgccgtga gggcgataga tgctctgctc ggactggact tcgtcgatcc cgaacgcatc 540 gcggtttgcg gtgacagtca gggaggcggt atttcgctcg ccgttggcgg catcgacccg 600 cgcgtcaagg ccgtaatgcc cgacgttcca tttctgtgcg actttccgcg cgctgtgcag 660 actgccgtgc gcgatcccta tttggaaatc gttcgctttc tggcccagca tcgcgaaaag 720 aaggcggcag tctttgaaac gctcaactat ttcgactgcg tcaacttcgc ccggcggtcc 780 aaggcgccgg cgctgttttc ggtggccctg atggacgaag tctgcccgcc ctctaccgtg 840 tatggcgcat tcaatgccta tgcaggcgaa aagaccatca cagagtacga attcaacaat 900 catgaaggcg ggcaaggcta tcaagagcgc caacagatga cgtggctcag caggctgttc 960 ggtgtcggct ga 972 <210> 42 <211> 323 <212> PRT <213> Mesorhizobium loit <400> 42 Met Pro Phe Pro Asp Leu Ile Gln Pro Glu Leu Gly Ala Tyr Val Ser 1 5 10 15 Ser Val Gly Met Pro Asp Asp Phe Ala Gln Phe Trp Thr Ser Thr Ile 20 25 30 Ala Glu Ala Arg Gln Ala Gly Gly Glu Val Ser Ile Val Gln Ala Gln 35 40 45 Thr Thr Leu Lys Ala Val Gln Ser Phe Asp Val Thr Phe Pro Gly Tyr 50 55 60 Gly Gly His Pro Ile Lys Gly Trp Leu Ile Leu Pro Thr His His Lys 65 70 75 80 Gly Arg Leu Pro Leu Val Val Gln Tyr Ile Gly Tyr Gly Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Leu Ala His Glu Gln Leu His Trp Ala Ala Ser Gly Phe Ala Tyr 100 105 110 Phe Arg Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Asp Trp Ser Val Gly Glu 115 120 125 Thr Ala Asp Pro Val Gly Ser Thr Ser Ser Ile Pro Gly Phe Met Thr 130 135 140 Arg Gly Val Leu Asp Lys Asn Asp Tyr Tyr Tyr Arg Arg Leu Phe Thr 145 150 155 160 Asp Ala Val Arg Ala Ile Asp Ala Leu Leu Gly Leu Asp Phe Val Asp 165 170 175 Pro Glu Arg Ile Ala Val Cys Gly Asp Ser Gln Gly Gly Gly Ile Ser 180 185 190 Leu Ala Val Gly Gly Ile Asp Pro Arg Val Lys Ala Val Met Pro Asp 195 200 205 Val Pro Phe Leu Cys Asp Phe Pro Arg Ala Val Gln Thr Ala Val Arg 210 215 220 Asp Pro Tyr Leu Glu Ile Val Arg Phe Leu Ala Gln His Arg Glu Lys 225 230 235 240 Lys Ala Ala Val Phe Glu Thr Leu Asn Tyr Phe Asp Cys Val Asn Phe 245 250 255 Ala Arg Arg Ser Lys Ala Pro Ala Leu Phe Ser Val Ala Leu Met Asp 260 265 270 Glu Val Cys Pro Pro Ser Thr Val Tyr Gly Ala Phe Asn Ala Tyr Ala 275 280 285 Gly Glu Lys Thr Ile Thr Glu Tyr Glu Phe Asn Asn His Glu Gly Gly 290 295 300 Gln Gly Tyr Gln Glu Arg Gln Gln Met Thr Trp Leu Ser Arg Leu Phe 305 310 315 320 Gly Val Gly <210> 43 <211> 990 <212> DNA <213> Geobacillus stearothermophilus <400> 43 atgttcgata tgccgttagc acaattacag aaatacatgg ggacaaatcc gaagccggct 60 gattttgctg acttttggag tcgagcgttg gaggaattat ctgcccaatc gttgcattat 120 gagctgattc cggcaacatt tcaaacgaca gtggcgagtt gctaccattt gtatttcacg 180 ggagtcggcg gggctagagt ccattgtcag ttagtaaaac cgagagagca gaagcagaaa 240 ggcccggggt tggtatggtt tcatggctac catacgaata gcggcgattg ggtcgataaa 300 ctggcatatg ctgcggcagg ttttactgta ttggcgatgg attgccgcgg ccaaggagga 360 aaatcagagg ataatttgca agtgaaaggc ccaacattga agggccatat tattcgcgga 420 attgaggatc caaatcctca tcatctttat tatcgaaatg tttttttaga tacagttcag 480 gcggtaagaa ttttatgctc tatggatcat attgatcgtg aacgaattgg tgtatatggc 540 gcttcccaag gaggagcgtt ggcattagcg tgtgctgctc tggaaccatc ggtggtgaaa 600 aaagcggttg tgctctatcc atttttatcg gattataagc gggcgcaaga gttggatatg 660 aaaaataccg cgtatgagga aattcattat tattttcgat ttttagatcc cacacatgag 720 cgggaagaag aagtatttta caaactaggc tatattgata ttcaactctt agccgatcgg 780 atttgtgccg atgttttatg ggctgttgcg ctagaagacc atatttgtcc cccgtccaca 840 caatttgctg tttataataa aattaagtca aaaaaagaca tggttttgtt ttacgagtat 900 ggtcatgagt atttaccgac tatgggagac cgtgcttatc tgtttttttg cccgatcttc 960 tttccaatcc aaaagagaaa cgttaagtaa 990 <210> 44 <211> 329 <212> PRT <213> Geobacillus stearothermophilus <400> 44 Met Phe Asp Met Pro Leu Ala Gln Leu Gln Lys Tyr Met Gly Thr Asn 1 5 10 15 Pro Lys Pro Ala Asp Phe Ala Asp Phe Trp Ser Arg Ala Leu Glu Glu 20 25 30 Leu Ser Ala Gln Ser Leu His Tyr Glu Leu Ile Pro Ala Thr Phe Gln 35 40 45 Thr Thr Val Ala Ser Cys Tyr His Leu Tyr Phe Thr Gly Val Gly Gly 50 55 60 Ala Arg Val His Cys Gln Leu Val Lys Pro Arg Glu Gln Lys Gln Lys 65 70 75 80 Gly Pro Gly Leu Val Trp Phe His Gly Tyr His Thr Asn Ser Gly Asp 85 90 95 Trp Val Asp Lys Leu Ala Tyr Ala Ala Ala Gly Phe Thr Val Leu Ala 100 105 110 Met Asp Cys Arg Gly Gln Gly Gly Lys Ser Glu Asp Asn Leu Gln Val 115 120 125 Lys Gly Pro Thr Leu Lys Gly His Ile Ile Arg Gly Ile Glu Asp Pro 130 135 140 Asn Pro His His Leu Tyr Tyr Arg Asn Val Phe Leu Asp Thr Val Gln 145 150 155 160 Ala Val Arg Ile Leu 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ctg ttc tgg ccg tct atg ggc ttc att tgc 336 Gly Phe Pro His Asp Trp Leu Phe Trp Pro Ser Met Gly Phe Ile Cys 100 105 110 ttc gtc atg gat act cgt ggt cag ggt tcc ggc tgg ctg aaa ggc gat 384 Phe Val Met Asp Thr Arg Gly Gln Gly Ser Gly Trp Leu Lys Gly Asp 115 120 125 act ccg gat tat ccg gag ggc ccg gta gac ccg cag tac cct ggc ttc 432 Thr Pro Asp Tyr Pro Glu Gly Pro Val Asp Pro Gln Tyr Pro Gly Phe 130 135 140 atg acg cgt ggt att ctg gat ccg cgt acc tat tac tat cgc cgc gtt 480 Met Thr Arg Gly Ile Leu Asp Pro Arg Thr Tyr Tyr Tyr Arg Arg Val 145 150 155 160 ttt acc gat gca gtt cgt gcc gta gag gcc gcg gct tct ttc cct cag 528 Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Gln 165 170 175 gtt gac cag gag cgt att gtt atc gct ggt ggc tcc cag ggt ggc ggc 576 Val Asp Gln Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 atc gcc ctg gcg gta tct gcg ctg agc aag aaa gct aag gca ctg ctg 624 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu 195 200 205 tgt gac gtc ccg ttc ctg tgt cac ttc cgt cgc gct gtt cag ctg gta 672 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 gat acc cat ccg tac gcg gag att act aac ttc ctg aaa act cac cgc 720 Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 gac aaa gaa gaa atc gtt ttc cgc acc ctg tcc tat ttc gac ggc gtt 768 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 aac ttc gcg gct cgt gca aaa att ccg gca ctg ttc tct gtt ggt ctg 816 Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 atg gac aac atc agc cct cct tct acc gtt ttc gcg gca tat aac tat 864 Met Asp Asn Ile Ser Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Tyr 275 280 285 tat gcg ggt ccg aaa gaa atc cgt atc tat ccg tac aac aac cac gaa 912 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 ggc ggt ggt agc ttt cag gct gtt gaa caa gtg aaa ttc ctg aag aaa 960 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Val Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Lys 305 310 315 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Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asn Ile Ser Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Tyr 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Arg Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Val Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Lys 305 310 315 320 Leu Phe Glu Lys Gly 325 <210> 65 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 65 Arg Val Pro Asn Lys Thr Val Thr Val Asp Gly Ala 1 5 10 <210> 66 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 66 Asp Arg His Lys Ser Lys Tyr Ser Ser Thr Lys Ser 1 5 10 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Val Ala Arg Tyr Ile Ala Arg His Gly Ser Ala Arg 100 105 110 Val Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ala Val Thr Pro Leu Phe Gly Gln 115 120 125 Lys Pro Asp Tyr Pro Gln Gly Val Pro Leu Asp Val Phe Ala Arg Phe 130 135 140 Lys Thr Glu Leu Leu Lys Asp Arg Ala Gln Phe Ile Ser Asp Phe Asn 145 150 155 160 Ala Pro Phe Tyr Gly Ile Asn Lys Gly Gln Val Val Ser Gln Gly Val 165 170 175 Gln Thr Gln Thr Leu Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Thr 180 185 190 Val Asp Cys Val Thr Ala Phe Ala Glu Thr Asp Phe Arg Pro Asp Met 195 200 205 Ala Lys Ile Asp Val Pro Thr Leu Val Ile His Gly Asp Gly Asp Gln 210 215 220 Ile Val Pro Phe Glu Thr Thr Gly Lys Val Ala Ala Glu Leu Ile Lys 225 230 235 240 Gly Ala Glu Leu Lys Val Tyr Lys Asp Ala Pro His Gly Phe Ala Val 245 250 255 Thr His Ala Gln Gln Leu Asn Glu Asp Leu Leu Ala Phe Leu Lys Arg 260 265 270 Gly Pro Gly Ser Gly Gly Ala Gly Ser Pro Gly Ser Ala Gly Gly Pro 275 280 285 Gly Ser His His His His His His 290 295 <210> 466 <211> 306 <212> PRT <213> artificial sequence 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Leu Val Gly Phe Ser Met 85 90 95 Gly Gly Gly Asp Val Ala Arg Tyr Ile Ala Arg His Gly Ser Ala Arg 100 105 110 Val Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ala Val Thr Pro Leu Phe Gly Gln 115 120 125 Lys Pro Asp Tyr Pro Gln Gly Val Pro Leu Asp Val Phe Ala Arg Phe 130 135 140 Lys Thr Glu Leu Leu Lys Asp Arg Ala Gln Phe Ile Ser Asp Phe Asn 145 150 155 160 Ala Pro Phe Tyr Gly Ile Asn Lys Gly Gln Val Val Ser Gln Gly Val 165 170 175 Gln Thr Gln Thr Leu Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Thr 180 185 190 Val Asp Cys Val Thr Ala Phe Ala Glu Thr Asp Phe Arg Pro Asp Met 195 200 205 Ala Lys Ile Asp Val Pro Thr Leu Val Ile His Gly Asp Gly Asp Gln 210 215 220 Ile Val Pro Phe Glu Thr Thr Gly Lys Val Ala Ala Glu Leu Ile Lys 225 230 235 240 Gly Ala Glu Leu Lys Val Tyr Lys Asp Ala Pro His Gly Phe Ala Val 245 250 255 Thr His Ala Gln Gln Leu Asn Glu Asp Leu Leu Ala Phe Leu Lys Arg 260 265 270 Gly Pro Gly Ser Gly Gly Ala Gly Ser Pro Gly Ser Ala Gly Gly Pro 275 280 285 Gly Ser Asp Pro Thr Lys Pro Pro Arg Thr Pro Thr Ala Asn Thr Ser 290 295 300 Arg Pro His His Asn Phe Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro His His 305 310 315 320 His His His His <210> 468 <211> 61 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 468 Glu Pro Glu Pro Glu Gly Pro Gly Ser Gly Gly Ala Gly Ser Pro Gly 1 5 10 15 Ser Ala Gly Gly Pro Gly Ser Glu Pro Glu Pro Glu Trp Lys Thr Lys 20 25 30 Lys Ile Leu Leu Ser Arg Thr Arg Arg Ile Met Arg Gln Val Val Arg 35 40 45 Ser Val Met His Lys Ile Trp His His His His His His 50 55 60 <210> 469 <211> 62 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 469 Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gly Pro Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Ser Pro Gly Ser Ala Gly Gly Pro Gly Ser Trp Lys Thr 20 25 30 Lys Lys Ile Leu Leu Ser Arg Thr Arg Arg Ile Met Arg Gln Val Val 35 40 45 Arg Ser Val Met His Lys Ile Trp His His His His His His 50 55 60 <210> 470 <211> 61 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 470 Glu Pro Glu Pro Glu Gly Pro Gly Ser Gly Gly Ala Gly Ser Pro Gly 1 5 10 15 Ser Ala Gly Gly Pro Gly Ser Glu Pro Glu Pro Glu Pro Leu Trp Arg 20 25 30 Arg Ile Thr Lys Arg Lys Leu Val Arg Pro Val Ala Thr Leu Met Trp 35 40 45 Tyr Trp Phe Thr Ser Lys Arg His His His His His His 50 55 60 <210> 471 <211> 62 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 471 Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gly Pro Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ala Gly Ser Pro Gly Ser Ala Gly Gly Pro Gly Ser Pro Leu Trp 20 25 30 Arg Arg Ile Thr Lys Arg Lys Leu Val Arg Pro Val Ala Thr Leu Met 35 40 45 Trp Tyr Trp Phe Thr Ser Lys Arg His His His His His His 50 55 60 <210> 472 <211> 57 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> synthetic construct <400> 472 Glu Pro Glu Gly Pro Gly Ser Gly Gly Ala Gly Ser Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Gly Gly Pro Gly Ser Glu Pro Glu Arg Met Leu Ser Arg Ile Leu Arg 20 25 30 Met Phe Val Arg Ile Leu Lys Arg Glu Arg Leu Ser Gln Val Arg Gly 35 40 45 Leu Phe Val His His His His His His 50 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150 155 160 Phe Thr Asp Ala Val Arg Ala Val Glu Ala Ala Ala Ser Phe Pro Gln 165 170 175 Val Asp Gln Glu Arg Ile Val Ile Ala Gly Gly Ser Gln Gly Gly Gly 180 185 190 Ile Ala Leu Ala Val Ser Ala Leu Ser Lys Lys Ala Lys Ala Leu Leu 195 200 205 Cys Asp Val Pro Phe Leu Cys His Phe Arg Arg Ala Val Gln Leu Val 210 215 220 Asp Thr His Pro Tyr Ala Glu Ile Thr Asn Phe Leu Lys Thr His Arg 225 230 235 240 Asp Lys Glu Glu Ile Val Phe Arg Thr Leu Ser Tyr Phe Asp Gly Val 245 250 255 Asn Phe Ala Ala Arg Ala Lys Ile Pro Ala Leu Phe Ser Val Gly Leu 260 265 270 Met Asp Asn Ile Thr Pro Pro Ser Thr Val Phe Ala Ala Tyr Asn Tyr 275 280 285 Tyr Ala Gly Pro Lys Glu Ile Pro Ile Tyr Pro Tyr Asn Asn His Glu 290 295 300 Gly Gly Gly Ser Phe Gln Ala Val Glu Gln Val Lys Phe Leu Lys Lys 305 310 315 320 Leu Phe Glu Lys Gly 325 <210> 477 <211> 272 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens <400> 477 Met Ser Thr Phe Val Ala Lys Asp Gly Thr Gln Ile Tyr Phe Lys Asp 1 5 10 15 Trp Gly Ser Gly Lys Pro Val Leu Phe Ser His Gly Trp 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Phe 130 135 140 Lys Thr Glu Leu Leu Lys Asp Arg Ala Gln Phe Ile Ser Asp Phe Asn 145 150 155 160 Ala Pro Phe Tyr Gly Ile Asn Lys Gly Gln Val Val Ser Gln Gly Val 165 170 175 Gln Thr Gln Thr Leu Gln Ile Ala Leu Leu Ala Ser Leu Lys Ala Thr 180 185 190 Val Asp Cys Val Thr Ala Phe Ala Glu Thr Asp Phe Arg Pro Asp Met 195 200 205 Ala Lys Ile Asp Val Pro Thr Leu Val Ile His Gly Asp Gly Asp Gln 210 215 220 Ile Val Pro Phe Glu Thr Thr Gly Lys Val Ala Ala Glu Leu Ile Lys 225 230 235 240 Gly Ala Glu Leu Lys Val Tyr Lys Asp Ala Pro His Gly Phe Ala Val 245 250 255 Thr His Ala Gln Gln Leu Asn Glu Asp Leu Leu Ala Phe Leu Lys Arg 260 265 270 Gly Pro Gly Ser Gly Gly Ala Gly Ser Pro Gly Ser Ala Gly Gly Pro 275 280 285 Gly Ser Pro Ser Ala Gln Ser Gln Leu Pro Asp Lys His Ser Gly Leu 290 295 300 His Glu Arg Ala Pro Gln Arg Tyr Gly Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro 305 310 315 320 Glu Pro Ile Pro Glu Pro Pro Lys Glu Ala Pro Val Val Ile Glu Lys 325 330 335 Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Pro Ala His Asp His 340 345 350 Lys Asn Gln Lys Glu Thr His Gln Arg His Ala Ala Gly Ser Gly Gly 355 360 365 Gly Gly Ser Pro His His His His 370 375

Claims

1) a) i) 구조
[X]_mR₅
(여기서, X는 화학식 R₆C(O)O의 에스테르기이며,
R₆은 하이드록실기 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티(moiety)이고, R₆은 C2 내지 C7인 R₆에 대하여, 하나 이상의 에테르 결합을 임의로 포함하고;
R₅는 하이드록실기로 임의로 치환된 C1 내지 C6 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티 또는 5-원 환형 헤테로방향족 모이어티 또는 6-원 환형 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티이며; R₅에서 각 탄소 원자는 각각 1개 이하의 하이드록실기 또는 1개 이하의 에스테르기 또는 카르복실산기를 포함하고; R₅는 임의로 하나 이상의 에테르 결합을 포함하며;
m은 1 내지 R₅에서의 탄소 원자수 범위의 정수이다)를 갖는 에스테르 - 상기 에스테르는 25℃에서 적어도 5 ppm의 수 용해도를 갖는다 - ;
ii) 구조

(여기서, R₁은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R₃ 및 R₄는 각각 H 또는 R₁C(O)이다)를 갖는 글리세리드;
iii) 화학식

(여기서, R₁은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R₂는 C1 내지 C10 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴, (CH₂CH₂O)_n 또는 (CH₂CH(CH₃)-O)_nH이고, n은 1 내지 10이다)의 하나 이상의 에스테르; 및
iv) 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 및 아세틸화 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 아세틸화 당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기질;
b) 과산소원; 및
c) 과가수분해(perhydrolytic) 활성을 갖는 효소 촉매 - 상기 효소 촉매는 클러스털더블유(CLUSTALW)를 사용하여 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처(signature) 모티프를 갖는 효소를 포함하며, 상기 시그니처 모티프는
i) 서열 번호 2의 위치 118 내지 120에 해당하는 위치에서 RGQ 모티프;
ii) 서열 번호 2의 위치 179 내지 183에 해당하는 위치에서 GXSQG 모티프; 및
iii) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함한다 - 를 포함하는 반응 성분의 세트를 제공하는 단계;
2) (1)의 반응 성분을 적절한 반응 조건 하에서 배합하는 단계 - 이에 의해, 적어도 하나의 과산이 효소에 의해 생성된다 - ; 및
3) 구강 표면을 적어도 하나의 과산과 접촉시키는 단계 - 이에 의해, 구강 표면에 탈색(bleaching), 치아 미백, 소독, 탈염(destaining), 탈취, 생물막(biofilm)의 감소 또는 제거 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 과산 기반의 이익이 제공된다 - 를 포함하는 방법.

제1항에 있어서, 반응 성분이 구강 내에서 배합되는 방법.

제1항에 있어서, 반응 성분이 구강 표면과의 접촉 전에 구강의 외측에서 배합되는 방법.

제1항에 있어서, 과가수분해 활성을 갖는 효소가 과산 유익제(benefit agent)의 생성 전에 구강 내에 존재하는 방법.

1) a) i) 구조
[X]_mR₅
(여기서, X는 화학식 R₆C(O)O의 에스테르기이며,
R₆은 하이드록실기 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티이고, R₆은 C2 내지 C7인 R₆에 대하여, 하나 이상의 에테르 결합을 임의로 포함하고;
R₅는 하이드록실기로 임의로 치환된 C1 내지 C6 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티 또는 5-원 환형 헤테로방향족 모이어티 또는 6-원 환형 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티이며; R₅에서 각 탄소 원자는 각각 1개 이하의 하이드록실기 또는 1개 이하의 에스테르기 또는 카르복실산기를 포함하고; R₅는 임의로 하나 이상의 에테르 결합을 포함하며;
m은 1 내지 R₅에서의 탄소 원자수 범위의 정수이다)를 갖는 에스테르 - 상기 에스테르는 25℃에서 적어도 5 ppm의 수 용해도를 갖는다 - ;
ii) 구조

(여기서, R₁은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R₂는 C1 내지 C10 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴, (CH₂CH₂O)_n 또는 (CH₂CH(CH₃)-O)_nH이고, n은 1 내지 10이다)의 하나 이상의 에스테르; 및
iv) 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 및 아세틸화 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 아세틸화 당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기질;
b) 과산소원; 및
c) 과가수분해 활성을 갖는 효소 촉매 - 상기 효소 촉매는 일반 구조
PAH-[L]_y-OCBD
또는
OCBD-[L]_y-PAH
(여기서,
PAH는 과가수분해 활성을 갖는 효소이며;
OCBD는 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이고;
L은 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 임의의 펩티드 링커이며;
y는 0 또는 1이다)를 갖는 융합 단백질을 포함한다 - 를 포함하는 반응 성분의 세트를 제공하는 단계;
2) (1)의 반응 성분을 적절한 반응 조건 하에서 배합하는 단계 - 이에 의해, 적어도 하나의 과산이 효소에 의해 생성된다 - ; 및
3) 구강 표면을 적어도 하나의 과산과 접촉시키는 단계 - 이에 의해, 구강 표면에 탈색, 치아 미백, 소독, 탈염, 탈취, 생물막의 감소 또는 제거 및 그들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 과산 기반의 이익이 제공된다 - 를 포함하는 방법.

제5항에 있어서, 과가수분해 활성을 갖는 효소가 리파제, 프로테아제, 에스테라제, 아실 트랜스퍼라제, 아릴 에스테라제, 탄수화물 에스테라제 및 그들의 조합의 군으로부터 선택되는 방법.

제6항에 있어서, 탄수화물 에스테라제가 클러스털더블유를 사용하여 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 갖는 CE-7 탄수화물 에스테라제이며, 상기 시그니처 모티프가
1) 서열 번호 2의 위치 118 내지 120에 해당하는 위치에서 RGQ 모티프;
2) 서열 번호 2의 위치 179 내지 183에 해당하는 위치에서 GXSQG 모티프; 및
3) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함하는 방법.

제5항, 제6항 또는 제7항에 있어서, 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이 항체, F_ab 항체 단편, 단쇄 가변 단편(scFv) 항체, 카멜리대(Camelidae) 항체, 스캐폴드(scaffold) 디스플레이 단백질 또는 면역글로불린 폴드(fold)가 결여된 단쇄 폴리펩티드인 방법.

제6항에 있어서, 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 폴리펩티드인 방법.

제9항에 있어서, 단쇄 폴리펩티드가 구강 표면에 대한 K_D 값 또는 MB₅₀ 값이 10^-5 M 이하인, 길이가 5 내지 60개 아미노산 범위인 적어도 하나의 구강 표면-결합 펩티드를 포함하는 방법.

제10항에 있어서, 단쇄 폴리펩티드가 2 내지 50개 구강 표면-결합 펩티드를 포함하며, 구강 표면-결합 펩티드는 독립적으로 그리고 임의로, 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 폴리펩티드 스페이서에 의해 분리되는 방법.

제1항 또는 제5항에 있어서, 구강 표면이 치아 표면인 방법.

제12항에 있어서, 치아 표면이 치아 에나멜(enamel), 치아 균막(pellicle) 또는 그들의 조합을 포함하는 방법.

제10항에 있어서, 구강 표면-결합 펩티드가 치아 에나멜-결합 펩티드인 방법.

제10항에 있어서, 구강 표면-결합 펩티드가 치아 균막-결합 펩티드인 방법.

제10항에 있어서, 구강 표면-결합 펩티드가 피부-결합 펩티드인 방법.

제1항 또는 제5항에 있어서, 과산이 반응 성분의 세트의 배합 5분 내에 500 ppb 내지 10,000 ppm의 농도로 생성되는 방법.

제17항에 있어서, 과산이 1시간 미만 동안 구강 관리 표면과 접촉되는 방법.

제1항 또는 제5항에 있어서, 과산이 과아세트산인 방법.

제19항에 있어서, 반응 성분의 배합 5분 내에, 유효 농도의 과아세트산이 효소에 의해 생성되고, 구강 표면과 접촉되는 방법.

제1항 또는 제5항에 있어서, 기질이 트라이아세틴을 포함하는 방법.

하기의 일반 구조를 포함하는 융합 단백질:
PAH-[L]_y-OCBD
또는
OCBD-[L]_y-PAH
상기 식에서,
1) PAH는 과가수분해 활성을 갖는 효소이고;
2) OCBD는 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이며;
3) L은 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 펩티드 링커이고;
4) y는 0 또는 1이다.

제22항에 있어서, 과가수분해 활성을 갖는 효소가 리파제, 프로테아제, 에스테라제, 아실 트랜스퍼라제, 아릴 에스테라제, 탄수화물 에스테라제 및 그들의 조합의 군으로부터 선택되는 융합 단백질.

제23항에 있어서, 효소가 과가수분해 활성을 갖는 CE-7 탄수화물 에스테라제이며; PAH는 클러스털더블유를 사용하여 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 갖고, 상기 시그니처 모티프는
1) 서열 번호 2의 위치 118 내지 120에 해당하는 위치에서 RGQ 모티프;
2) 서열 번호 2의 위치 179 내지 183에 해당하는 위치에서 GXSQG 모티프; 및
3) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함하는 융합 단백질.

제23항에 있어서, 과가수분해 활성을 갖는 효소가 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis)로부터의 아릴 에스테라제인 융합 단백질.

제23항, 제24항 또는 제25항에 있어서, 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이 면역글로불린 폴드가 결여된 단쇄 폴리펩티드인 융합 단백질.

제26항에 있어서, 단쇄 폴리펩티드는 길이가 5 내지 60개 아미노산 범위인 적어도 하나의 구강 표면-결합 펩티드를 포함하는 융합 단백질.

제27항에 있어서, 상기 적어도 하나의 구강 표면-결합 펩티드는 K_D 값 또는 MB₅₀ 값이 10^-5 M 이하인 융합 단백질.

제26항에 있어서, 단쇄 폴리펩티드가 2 내지 50개 구강 표면-결합 펩티드를 포함하며, 구강 표면-결합 펩티드는 독립적으로 그리고 임의로, 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 폴리펩티드 스페이서에 의해 분리되는 융합 단백질.

제22항, 제23항, 제24항 및 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이 200개 이하의 길이의 아미노산을 포함하는 융합 단백질.

1) 제23항의 융합 단백질을 포함하는 효소 촉매;
2) a) 구조
[X]_mR₅
(여기서, X는 화학식 R₆C(O)O의 에스테르기이며,
R₆은 하이드록실기 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티이고, R₆은 C2 내지 C7인 R₆에 대하여, 하나 이상의 에테르 결합을 임의로 포함하고;
R₅는 하이드록실기로 임의로 치환된 C1 내지 C6 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티 또는 5-원 환형 헤테로방향족 모이어티 또는 6-원 환형 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티이며; R₅에서 각 탄소 원자는 각각 1개 이하의 하이드록실기 또는 1개 이하의 에스테르기 또는 카르복실산기를 포함하고; R₅는 임의로 하나 이상의 에테르 결합을 포함하며;
M은 1 내지 R₅에서의 탄소 원자수 범위의 정수이다)를 갖는 에스테르 - 상기 에스테르는 25℃에서 적어도 5 ppm의 수 용해도를 갖는다 - ;
b) 구조

(여기서, R₁은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R₃ 및 R₄는 각각 H 또는 R₁C(O)이다)를 갖는 글리세리드;
c) 화학식

(여기서, R₁은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R₂는 C1 내지 C10 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴, (CH₂CH₂O)_n 또는 (CH₂CH(CH₃)-O)_nH이고, n은 1 내지 10이다)의 하나 이상의 에스테르; 및
c) 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 및 아세틸화 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 아세틸화 당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기질;
3) 과산소원; 및
4) 구강에 허용가능한 담체 매질을 포함하는 구강 관리 제품.

1) 과가수분해 활성을 갖는 효소 촉매 - 상기 효소 촉매는 클러스털더블유를 사용하여 서열 번호 2의 참조 서열과 정렬되는 CE-7 시그니처 모티프를 갖는 효소를 포함하며, 상기 시그니처 모티프는
a) 서열 번호 2의 위치 118 내지 120에 해당하는 위치에서 RGQ 모티프;
b) 서열 번호 2의 위치 179 내지 183에 해당하는 위치에서 GXSQG 모티프; 및
c) 서열 번호 2의 위치 298 및 299에 해당하는 위치에서 HE 모티프를 포함한다 - ;
2) a) 구조
[X]_mR₅
(여기서, X는 화학식 R₆C(O)O의 에스테르기이며,
R₆은 하이드록실기 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티이고, R₆은 C2 내지 C7인 R₆에 대하여, 하나 이상의 에테르 결합을 임의로 포함하고;
R₅는 하이드록실기로 임의로 치환된 C1 내지 C6 선형, 분지형 또는 환형 하이드로카르빌 모이어티 또는 5-원 환형 헤테로방향족 모이어티 또는 6-원 환형 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티이며; R₅에서 각 탄소 원자는 각각 1개 이하의 하이드록실기 또는 1개 이하의 에스테르기 또는 카르복실산기를 포함하고; R₅는 임의로 하나 이상의 에테르 결합을 포함하며;
M은 1 내지 R₅에서의 탄소 원자수 범위의 정수이다)를 갖는 에스테르 - 상기 에스테르는 25℃에서 적어도 5 ppm의 수 용해도를 갖는다 - ;
b) 구조

(여기서, R₁은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R₂는 C1 내지 C10 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴, (CH₂CH₂O)_n 또는 (CH₂CH(CH₃)-O)_nH이고, n은 1 내지 10이다)의 하나 이상의 에스테르; 및
d) 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 및 아세틸화 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 아세틸화 당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기질;
3) 과산소원; 및
4) 구강에 허용가능한 담체 매질을 포함하는 구강 관리 제품.

제32항에 있어서, 과가수분해 활성을 갖는 효소가 제22항의 융합 단백질인 구강 관리 제품.

제33항에 있어서, 제2 부분이 적어도 하나의 치아 에나멜-결합 또는 치아 균막-결합 펩티드를 포함하는 단쇄 펩티드인 구강 관리 제품.

제34항에 있어서, 적어도 하나의 치아 에나멜-결합 또는 치아 균막-결합 펩티드는 길이가 5 내지 60개 아미노산 범위인 구강 관리 제품.

제31항, 제32항, 제33항, 제34항 또는 제35항에 있어서, 구강 관리 제품이 분말, 페이스트, 겔, 액체, 연고, 정제, 헹굼제(rinse) 또는 그들의 임의의 조합의 형태인 구강 관리 제품.

제36항에 있어서, 구강 관리 제품이 치약, 치과용 크림(dental cream), 투스 겔(tooth gel), 투스 파우더(tooth powder), 구강 세정제(mouth wash), 호흡 청량제(breath freshener), 스트립(strip) 또는 치실(dental floss)인 구강 관리 제품.

제36항에 있어서, 구강 관리 제품이 미백 스트립(whitening strip) 또는 치과용 트레이(dental tray)의 형태인 구강 관리 제품.

제31항 또는 제32항에 있어서, 효소 촉매가 구강 관리 제품의 사용 전에, 기질, 과산소원, 또는 기질 및 과산소원 둘 모두로부터 분리되어 유지되는 구강 관리 제품.

서열 번호 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421 및 422로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 분리된 폴리펩티드.

구강 관리 제품에서 구강 표면의 탈색, 미백, 소독, 탈염, 탈취 또는 생물막의 제거를 위한 유효 농도의 적어도 하나의 과산을 생성하기 위한 과가수분해 활성을 갖는 CE-7 탄수화물 에스테라제의 용도.

(여기서, R₁은 하이드록실 또는 C1 내지 C4 알콕시기로 임의로 치환된 C1 내지 C7 직쇄 또는 분지쇄 알킬이며, R₂는 C1 내지 C10 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 알킬아릴, 알킬헤테로아릴, 헤테로아릴, (CH₂CH₂O)_n 또는 (CH₂CH(CH₃)-O)_nH이고, n은 1 내지 10이다)의 하나 이상의 에스테르; 및
d) 아세틸화 단당류, 아세틸화 이당류 및 아세틸화 다당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 아세틸화 당류로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 기질; 및
3) 과산소원을 포함하는 - 이에 의해, (1), (2) 및 (3)의 혼합 시에 과산이 생성된다 - 치아 우식증, 치은염, 구강 칸디다증 또는 치근막염의 치료 또는 예방을 위한 과산 생성 조성물의 용도.

제41항에 있어서, 과가수분해 활성을 갖는 효소가 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 적어도 하나의 부분을 포함하는 융합 단백질의 형태인 용도.

구강 제품에서의 하기의 일반 구조를 포함하는 융합 단백질의 용도:
PAH-[L]_y-OCBD
또는
OCBD-[L]_y-PAH
상기 식에서,
1) PAH는 서열 번호 460과 적어도 95% 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 과가수분해 활성을 갖는 효소이고;
2) OCBD는 구강 표면에 대하여 친화성을 갖는 펩티드 성분이며;
3) L은 길이가 1 내지 100개 아미노산 범위인 펩티드 링커이고;
4) y는 0 또는 1이다.