JP6410786B2 - 口腔ケア製品において使用するための酵素的な過酸の発生 - Google Patents

口腔ケア製品において使用するための酵素的な過酸の発生 Download PDF

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Description

関連出願への相互参照
本出願は、参照によってその全体が本明細書中に援用される２０１０年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／４２４，９０３号の利益を主張する。
本発明は、口腔ケアの有益剤（ｂｅｎｅｆｉｔ ａｇｅｎｔ）として少なくとも１つの過酸を含むパーソナルケア製品の分野に関する。過酸は、少なくとも１つの適切なカルボン酸エステル基質および過酸素源の存在下で酵素的に生成される。具体的には、口腔ケア製品で使用するための過酸有益剤を生成するために、過加水分解活性を有する酵素触媒が使用される。過加水分解酵素は、酵素的に生成される過酸が所望の表面またはその付近で生成されるように、口腔表面に対する親和性を有する少なくとも１つのペプチド成分を含有するように操作された融合タンパク質（「標的化ペルヒドロラーゼ」）の形態であり得る。
ペルオキシカルボン酸（「過酸」）は有効な抗菌剤である。望ましくない微生物の増殖に対して硬い表面、食品、生きた植物組織、および医療デバイスを清浄化、消毒、および／または衛生化するための方法が記載されている（例えば、特許文献１〜５）。また過酸は、洗濯洗剤用途のための漂白組成物の調製においても有用であることが報告されている（例えば、特許文献６〜８）。
また過酸を含む口腔ケア組成物も開示されている。特許文献９（Ｖｉｓｃｉｏ，Ｄ．）には、媒体中に溶解された過酢酸を含む、歯を白くするための口腔用組成物が開示されており、ここで過酢酸は、水、アセチルサリチル酸、および水溶性のアルカリ金属過炭酸塩を混ぜ合わせることによって、媒体中においてその場で発生される。特許文献１０（Ｃｈｕｒｃｈら）には、染色または変色した歯を白くするための、過酢酸を含む組成物の使用が開示されている。特許文献１１および１２（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｒ．）には、歯を白くするための方法で使用するのに適したペルオキシ酸歯ホワイトニング組成物が開示されている。より具体的には、過酢酸組成物は、過酸化水素前駆体、グリセリンの酢酸エステル、および水を混ぜ合わせて、化学的過加水分解により過酢酸を発生させることによって生成される。酵素的な過加水分解は記載されていない。
特許文献１３（Ｃｏｎｃａｒら）には、歯を漂白するために、過加水分解活性を有するＭ．スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）酵素を含む口腔用組成物が開示されている。過酸有益剤を生成するためのＣＥ−７ペルヒドロラーゼの使用は開示されていない。またＣｏｎｃａｒらは、口腔ケア組成物における標的化過加水分解酵素の使用についても何も記載していない。
過加水分解活性を有する特定の変異体スブチリシンカールスバーグプロテアーゼをボディケア製品に包含させることは、特許文献１４（Ｗｉｅｌａｎｄら）に開示されている。特定の変異体プロテアーゼ以外の過加水分解酵素は記載されておらず、パーソナルケア有益剤としての過酸の酵素的生成を実証する実施例も存在しない。
特許文献１５〜１７および１８（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）には、カルボン酸エステル基質を（過酸化水素などの適切な過酸素源の存在下で）消毒剤および／または漂白剤として使用するのに十分な濃度のペルオキシカルボン酸に転換するために、有意な過加水分解活性を特徴とする炭水化物エステラーゼのＣＥ−７ファミリーのメンバーとして構造的に分類
される酵素（すなわち、セファロスポリンＣデアセチラーゼ［ＣＡＨ］およびアセチルキシランエステラーゼ［ＡＸＥ］）が開示されている。炭水化物エステラーゼのＣＥ−７ファミリーのいくつかのメンバーは、アルコール、ジオール、およびグリセロールのアセチルエステルから、反応成分を混合してから１分以内に４０００〜５０００ｐｐｍ、そして５分〜３０分の間に９０００ｐｐｍまでの過酢酸を生成するのに十分な過加水分解活性を有することが実証されている（ＤｉＣｏｓｉｍｏら、特許文献１９）。特許文献２０には、改善された過加水分解活性を有する変異体ＣＥ−７酵素が記載されている。ＣＥ−７ペルヒドロラーゼは例外的な過加水分解活性を有するが、パーソナルケア製品におけるその使用は開示されていない。従って、解決すべき問題は、過酸有益剤の生成のために少なくとも１つのＣＥ−７ペルヒドロラーゼの使用を含むパーソナルケア組成物および方法を提供することである。
過酸は強酸化剤であり、所望の利益の標的ではない材料を含む様々な材料に対して反応性であり得る。従って、特定のパーソナルケア用途は、過酸の生成を所望の標的体表面またはその付近に局在化させることによって、過酸有益剤を所望の体表面に標的化する／焦点を合わせる能力から利益を得ることができる。酵素的な過酸の生成は、ペルヒドロラーゼを体表面に標的化することによって利益を得ることができる。付加的な利益は、酵素の濃度およびユーザーの暴露を制限するように、ペルヒドロラーゼを送達材料に標的化することによって達成することができる。
口腔材料に結合された酵素で口腔ケア表面を処置する口腔ケア組成物および／または方法が報告されている。特許文献２１（Ｓｉｍｏｎｓｏｎら）には、錯化試薬を介して歯の表面に対する親和性を有するリン酸キャリア基に共有結合されたグルカン分解酵素の使用を含む、プラークを処置するための方法が開示されている。グルカン沈着物の酵素分解は、プラーク材料の溶解および分散を促進すると言われている。
特許文献２２、２３（Ｂｕｄｎｙら）には、バイオフィルム構造体を酵素的に分解するためのアンカー酵素複合体と、細菌に直接作用することができる第２のアンカー酵素成分とを含む２成分組成物が開示されている。バイオフィルム分解酵素は、エキソポリサッカライド骨格構造を直接分解する酵素である。
特許文献２４（Ｂｕｄｎｙ，Ｊ．）には、アンカー分子に結合したプラークマトリックスを分解する酵素を含む、細菌増殖／コロニー形成の制御（例えば、歯垢の低減）のための組成物が開示されている。標的化ペルヒドロラーゼの使用は開示されていない。
特許文献２５および２６（Ｂｅｇｇｓら）には、標的部位に結合するための手段としての抗体断片の使用が開示されており、ここで、治療薬は、治療薬を標的部位に付着させるために抗体断片に付加された付加的なペプチドを介して結合される。治療薬を送達するために歯垢中の細菌の抗原（ａｎｔｉｇｅｎｔｉｃ）成分に対する親和性を有する改変された抗体断片を含む口腔ケア製品が開示されている。治療薬は、酸化ハロゲン化物を形成するために酵素または酵素の組み合わせ（ペルオキシダーゼとオキシダーゼとの組み合わせなど）によって産生される細胞毒性薬であってもよい。過酸有益剤を生成するための標的化ペルヒドロラーゼの使用は記載されていない。
特許文献２７（Ｂｅｇｇｓら）には、口腔細菌叢において発生する種を攻撃するように一緒に作用する２つの異なる酵素の利用が開示されている。第１の酵素は、口の中の標的に対して活性な薬剤を生成するために、第２の酵素のための基質として使用される中間生成物を発生させる。各酵素は、口の中の標的表面に対する親和性を有する抗体または抗体断片に付着され、それにより、使用の際、酵素は互いに近接して標的部位に結合される。例示されているのは、過酸化水素を生成するためのグルコースオキシダーゼの組み合わせ
であり、過酸化水素は次に、ハロゲン化物またはチオシアネートの存在下、ペルオキシダーゼにより転換されて、それぞれハイポハライト（ｈｙｐｏｈａｌｉｔｅ）またはハイポチオシアネート（Ｈｙｐｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）を生成し得る。過酸有益剤を生成するための標的化ペルヒドロラーゼの使用は記載されていない。
特許文献２８（Ｂｅｇｇｓら）には、２つの酵素を含む製品が記載されており、製品は、標的に対して活性剤を発生させるための第１の酵素と、第１の酵素のための基質である中間体を発生させるための第２の酵素とを含み、前記製品はさらに、酵素を互いに結合するために両方の酵素に付着されたまたは付着可能な連結手段（すなわち、抗体または抗体断片）を含み、それにより、標的細胞に結合する複合体が形成される。例示されるのは、ハイポハライトまたはハイポチオシアネート活性剤の形成を触媒するペルオキシダーゼに結合されたオキシダーゼ（過酸化水素を発生させることができる）である。
特許文献２９（Ｂｅｇｇｓら）には、薬剤と標的部位との間を架橋するように自己構築し得る複数の抗体または抗体断片を用いた、活性剤の標的部位への送達が記載されている。活性剤はグルコースオキシダーゼであるか、あるいはグルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼの組み合わせである。過酸有益剤を生成するための標的化ペルヒドロラーゼの使用は記載されていない。
ペプチド親和性材料としての抗体、抗体断片（Ｆａｂ）、単鎖融合可変領域抗体（ｓｃＦｃ）、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）抗体、および大型スキャフォールドディスプレイタンパク質の使用は、そのサイズおよびコストのために、いくつかのパーソナルケア用途に対しては適切でないことがある。従って、特定の低コスト化粧品用途では、有益剤の標的化送達のためにより短くより安価なペプチド親和性材料を使用することの必要性が残されている。
化粧用有益剤を体表面に標的化するために体表面に対する強い親和性を有する、より短いバイオパニングされた（ｂｉｏｐａｎｎｅｄ）ペプチドを使用することが記載されている（特許文献３０〜４３ならびに公開された特許文献４４および４５〜４６）。特許文献４７（Ｈｕａｎｇら）には、口腔ケア有益剤を歯の表面に結合させるために適切なペプチドベースの口腔ケア表面試薬が開示されている。過酸有益剤の生成のための活性ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ（すなわち、「標的化ペルヒドロラーゼ」）を結合させるための、口腔表面に対する親和性を有するペプチド材料の使用は記載されていない。
米国特許第６，５４５，０４７号明細書 米国特許第６，１８３，８０７号明細書 米国特許第６，５１８，３０７号明細書 米国特許第５，６８３，７２４号明細書 米国特許第６，６３５，２８６号明細書 米国特許第３，９７４，０８２号明細書 米国特許第５，２９６，１６１号明細書 米国特許第５，３６４，５５４号明細書 米国特許第５，３０２，３７５号明細書 米国特許第５，２７９，８１６号明細書 米国特許第６，２２１，３４１号明細書 米国特許第７，１８９，３８５号明細書 米国特許出願公開第２００９−０３１１１９８号明細書 米国特許第７，５１０，８５９号明細書 米国特許出願公開第２００８−０１７６７８３Ａ１号明細書 米国特許出願公開第２００８−０１７６２９９Ａ１号明細書 米国特許出願公開第２００９−０００５５９０Ａ１号明細書 米国特許出願公開第２０１０−００４１７５２Ａ１号明細書 米国特許出願公開第２００９−０００５５９０Ａ１号明細書 米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９Ａ１号明細書 米国特許第４，１３８，４７６号明細書 米国特許出願公開第２００５−０１５８２５３号明細書 米国特許第６，８３０，７４５号明細書 米国特許第５，８７１，７１４号明細書 米国特許第５，４９０，９８８号明細書 欧州特許第０４７９，６００Ｂ１号明細書 欧州特許第０４５０，８００Ｂ１号明細書 欧州特許第０４５１，９７２Ｂ１号明細書 欧州特許第０４５３，０９７Ｂ１号明細書 米国特許第７，２２０，４０５号明細書 米国特許第第７，３０９，４８２号明細書、 米国特許第７，２８５，２６４号明細書、 米国特許第７，８０７，１４１号明細書 米国特許出願公開第２００５−０２２６８３９Ａ１号明細書 米国特許出願公開第２００７−０１９６３０５Ａ１号明細書 米国特許出願公開第２００６−０１９９２０６Ａ１号明細書 米国特許出願公開第２００７−００６５３８７Ａ１号明細書 米国特許出願公開第２００８−０１０７６１４Ａ１号明細書 米国特許出願公開第２００７−０１１０６８６Ａ１号明細書 米国特許出願公開第２００６−００７３１１１Ａ１号明細書 米国特許出願公開第２０１０−０１５８８４６号明細書 米国特許出願公開第２０１０−０１５８８４７号明細書 米国特許出願公開第２０１０−０２４７５８９号明細書 国際公開第２００８／０５４７４６号パンフレット 国際公開第２００４／０４８３９９号パンフレット 国際公開第２００８／０７３３６８号パンフレット 米国特許第７，８０７，１４１号明細書
従って、解決すべきさらなる問題は、酵素的な過酸の生成を口腔表面に対して標的化するのに適した組成物および方法を提供することである。
口腔表面に対して過酸ベースの有益剤を酵素的に生成および送達するための成分を含む方法および組成物が提供される。
一実施形態では、口腔表面の漂白、歯のホワイトニング、消毒、脱染、脱臭、う歯の処置、う歯の予防、う歯に関連する口腔細菌の低減、および口腔バイオフィルム（例えば、歯垢）の処置または除去などの口腔ケア用途で使用するための過酸有益剤を酵素的に生成するためにＣＥ−７ペルヒドロラーゼを使用する口腔ケア組成物および方法が提供される。
一実施形態では、
１）ａ）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有するエステル、
ｉｉ）構造
Figure 0006410786
 （式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、
ｉｉｉ）式
Figure 0006410786
 （式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、ならびに
ｉｖ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
ｂ）過酸素源と、
ｃ）過加水分解活性を有する酵素触媒であって、前記酵素触媒が、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、前記シグネチャーモチーフが、
ｉ）配列番号２の位置１１８〜１２０に相当する位置のＲＧＱモチーフと、
ｉｉ）配列番号２の位置１７９〜１８３に相当する位置のＧＸＳＱＧモチーフと、
ｉｉｉ）配列番号２の位置２９８〜２９９に相当する位置のＨＥモチーフと
を含む酵素触媒と
を含む反応成分のセットを提供するステップと、
２）（１）の反応成分を適切な反応条件下で混ぜ合わせ、それにより、少なくとも１つの過酸が酵素的に生成されるステップと、
３）口腔表面を少なくとも１つの過酸と接触させ、それにより、口腔表面が、漂白、歯のホワイトニング、消毒、脱染、脱臭、バイオフィルムの低減または除去、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される過酸ベースの利益を受けるステップと
を含む方法が提供される。
一実施形態では、口腔表面は、歯のエナメル質、歯のペリクル（ｐｅｌｌｉｃｌｅ）、口腔内の軟組織（例えば、歯肉、舌）、または口腔バイオフィルム（例えば、口腔プラーク）である。
別の実施形態では、過加水分解酵素と、口腔表面に対する親和性を有するペプチド成分とを含む融合タンパク質（すなわち、「標的化ペルヒドロラーゼ」）の使用を含む組成物および方法が提供されており、ここで２つの成分は、場合により、ペプチドスペーサーによって分離されていてもよい。
一実施形態では、
１）ａ）ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有するエステル、
ｉｉ）構造
Figure 0006410786
 （式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、
ｉｉｉ）式
Figure 0006410786
 （式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、ならびに
ｉｖ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
ｂ）過酸素源と、
ｃ）過加水分解活性を有する酵素触媒であって、前記酵素触媒が、以下の一般構造：
ＰＡＨ−［Ｌ］ｙ−ＯＣＢＤ
または
ＯＣＢＤ−［Ｌ］ｙ−ＰＡＨ
（式中、ＰＡＨは、過加水分解活性を有する酵素であり、
ＯＣＢＤは、口腔表面に対する親和性を有するペプチド成分であり、
Ｌは、１〜１００の範囲のアミノ酸長さの任意的なペプチドリンカーであり、
ｙは０または１である）
を有する融合タンパク質を含む酵素触媒と
を含む反応成分のセットを提供するステップと、
２）（１）の反応成分を適切な反応条件下で混ぜ合わせ、それにより、少なくとも１つの過酸が酵素的に生成されるステップと、
３）口腔表面を少なくとも１つの過酸と接触させ、それにより、口腔表面が、漂白、歯のホワイトニング、消毒、脱染、脱臭、バイオフィルムの低減または除去、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される過酸ベースの利益を受けるステップと
を含む方法が提供される。
融合タンパク質は、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アリールエステラーゼ、炭水化物エステラーゼ、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される過加水分解酵素を含むことができる。
一実施形態では、融合タンパク質は、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からの過加水分解アリールエステラーゼ（ＡｒＥ）を含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４６０として提供されるＳ５４Ｖマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）アリールエステラーゼに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する過加水分解酵素を含む。
一実施形態では、融合タンパク質は、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からの過加水分解エステラーゼを含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４７７として提供されるシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）エステラーゼに対し
て少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する過加水分解酵素を含む。
別の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４７６、４７７、４７８、および４７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する過加水分解酵素を含む。
別の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有するＣＥ−７ペルヒドロラーゼを含み、前記シグネチャーモチーフは、
ｉ）配列番号２の位置１１８〜１２０に相当する位置のＲＧＱモチーフと、
ｉｉ）配列番号２の位置１７９〜１８３に相当する位置のＧＸＳＱＧモチーフと、
ｉｉｉ）配列番号２の位置２９８〜２９９に相当する位置のＨＥモチーフと
を含む。
別の実施形態では、口腔表面に対する親和性を有するペプチド成分は、好ましくは、少なくとも１つの口腔表面結合ペプチドを含む単鎖ペプチドである。またさらなる実施形態では、口腔表面結合ペプチドは、歯のエナメル質、歯のペリクルまたは歯のエナメル質および歯のペリクルの両方に対する親和性を有するペプチドである。
別の実施形態では、以下の一般構造：
ＰＡＨ−［Ｌ］ｙ−ＯＣＢＤ
または
ＯＣＢＤ−［Ｌ］ｙ−ＰＡＨ
を含む融合タンパク質が提供されており、式中、
１）ＰＡＨは、過加水分解活性を有する酵素であり、
２）ＯＣＢＤは、口腔表面に対する親和性を有するペプチド成分であり、
３）Ｌは、１〜１００の範囲のアミノ酸長さの任意的なペプチドリンカーであり、
４）ｙは０または１である。
別の実施形態では、一般構造：
ＰＡＨ−［Ｌ］ｙ−ＯＣＢＤ
または
ＯＣＢＤ−［Ｌ］ｙ−ＰＡＨ
を含む融合タンパク質が提供されており、式中、
ａ）ＰＡＨは過加水分解活性を有するＣＥ−７炭水化物エステラーゼであり、ＰＡＨは、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有し、前記シグネチャーモチーフは、
ｉ）配列番号２の位置１１８〜１２０に相当する位置のＲＧＱモチーフと、
ｉｉ）配列番号２の位置１７９〜１８３に相当する位置のＧＸＳＱＧモチーフと、
ｉｉｉ）配列番号２の位置２９８〜２９９に相当する位置のＨＥモチーフと
を含み、
ｂ）ＯＣＢＤは、口腔表面に対する親和性を有するペプチド成分であり、
ｃ）Ｌは、１〜１００の範囲のアミノ酸長さの任意的なペプチドリンカーであり、
ｄ）ｙは０または１である。
別の実施形態では、
１）上記の過加水分解融合タンパク質のいずれかを含む酵素触媒と、
２）ａ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有するエステル、
ｂ）構造
Figure 0006410786
 （式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、
ｃ）式
Figure 0006410786
 （式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、ならびに
ｄ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
３）過酸素源と、
４）経口的に許容可能なキャリア媒体と
を含む口腔ケア製品が提供される。
別の実施形態では、
１）過加水分解活性を有する酵素触媒であって、前記酵素触媒が、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、前記シグネチャーモチーフが、
ａ）配列番号２の位置１１８〜１２０に相当する位置のＲＧＱモチーフ、
ｂ）配列番号２の位置１７９〜１８３に相当する位置のＧＸＳＱＧモチーフ、および
ｃ）配列番号２の位置２９８〜２９９に相当する位置のＨＥモチーフ
を含む酵素触媒と、
２）ａ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有するエステル、
ｂ）構造
Figure 0006410786
 （式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、
ｃ）式
Figure 0006410786
 （式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、ならびに
ｄ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
３）過酸素源と、
４）経口的に許容可能なキャリア媒体と
を含む口腔ケア製品が提供される。
別の実施形態では、口腔表面に対する親和性を有する単離ポリペプチドが提供されており、前記ポリペプチドは、配列番号３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、および４２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、口腔ケア製品において、有効濃度の少なくとも１つの過酸を生成して、口腔材料／表面を漂白、ホワイトニング、消毒、脱染、脱臭する、あるいは口腔材料／表面からバイオフィルムを除去するための、過加水分解活性を有するＣＥ−７炭水化物エステラーゼの使用も提供される。
別の実施形態では、
ａ）過加水分解活性を有する酵素触媒であって、前記酵素触媒が、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、前記シグネチャーモチーフが、
ｉ）配列番号２の位置１１８〜１２０に相当する位置のＲＧＱモチーフ、
ｉｉ）配列番号２の位置１７９〜１８３に相当する位置のＧＸＳＱＧモチーフ、および
ｉｉｉ）配列番号２の位置２９８〜２９９に相当する位置のＨＥモチーフ
を含む酵素触媒と、
ｂ）１）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有するエステル、
２）構造
Figure 0006410786
 （式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、
３）式
Figure 0006410786
 （式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、ならびに
ｄ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
ｃ）過酸素源と
を含み、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を同時または段階的（ただし、特定の順番ではない）に混合したときに過酸が形成される過酸発生組成物の、う歯、歯肉炎、口腔カンジダ症、または歯周炎の処置または予防のための使用が提供される。
別の実施形態では、以下の一般構造：
ＰＡＨ−［Ｌ］ｙ−ＯＣＢＤ
または
ＯＣＢＤ−［Ｌ］ｙ−ＰＡＨ
を含む融合タンパク質の口腔製品における使用が提供されており、式中、
１）ＰＡＨは、配列番号４６０に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有する、過加水分解活性を有する酵素であり、
２）ＯＣＢＤは、口腔表面に対する親和性を有するペプチド成分であり、
３）Ｌは、１〜１００の範囲のアミノ酸長さのペプチドリンカーであり、
４）ｙは０または１である。
本明細書（表２０）に記載されるエステル基質のいくつかは、過酢酸を生成するために過酸化水素と反応される際に、化学的な過加水分解の影響を特に受けやすかった。別の実施形態では、１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−リボフラノース、１，２，３，４−テトラ−Ｏ−アセチル−リボピラノース、２−アセトアミド−２−デオキシ−１，３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコピラノース、β−Ｄ−グルコピラノース，１，２，３，４−テトラアセテート、２，３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコピラノース、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−マンノピラノース、およびα−Ｄ−マンノピラノースペンタアセテートからなる群から選択される過酸前駆体を含むパーソナルケア製品が提供される。好ましい実施形態では、パーソナルケア製品は口腔ケア製品である。
別の実施形態では、
ａ）ｉ）１，２，３，５−テトラ−Ｏ−アセチル−リボフラノース、１，２，３，４−テトラ−Ｏ−アセチル−リボピラノース、２−アセトアミド−２−デオキシ−１，３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコピラノース、β−Ｄ−グルコピラノース，１，２，３，４−テトラアセテート、２，３，４，６−テトラアセチル−β−Ｄ−グルコピラノース、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−マンノピラノース、およびα−Ｄ−マン
ノピラノースペンタアセテートからなる群から選択される過酸前駆体と、
ｉｉ）過酸素源と
を含む反応成分のセットを提供するステップと、
ｂ）体表面を、反応成分のセットを水の存在下で混ぜ合わせることによって生成される有効量の過酢酸と接触させ、それにより、過酢酸が体表面に利益を提供するステップと
を含む方法も提供される。好ましい態様では、上記方法における体表面は、歯および／または歯肉などの口腔組織である。
生物学的配列の簡単な説明
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１−１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ）」）に従い、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（２００９年）、ならびに欧州特許条約（ＥＰＣ）および特許協力条約（ＰＣＴ）の規則５．２および４９．５（ａの２）および実施細則の２０８項および付録Ｃの配列表の要件と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載される規則に従う。
配列番号１は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列である。
配列番号２は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）からのセファロスポリンＣデアセチラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号３は、バチルス・スブチリス亜種スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列である。
配列番号４は、バチルス・スブチリス亜種スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株１６８からのセファロスポリンＣデアセチラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号５は、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）６６３３（商標）からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列である。
配列番号６は、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）６６３３（商標）からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの酸配列である。
配列番号７は、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０（商標）からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列である。
配列番号８は、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）１４５８０（商標）からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
配列番号９は、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）ＰＳ２１３からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
配列番号１０は、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）ＰＳ２１３からのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
配列番号１１は、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５（商標）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
配列番号１２は、クロストリジウム・サーモセラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ）ＡＴＣＣ（登録商標）２７４０５（商標）からのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
配列番号１３は、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
配列番号１４は、サーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号１５は、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
配列番号１６は、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号１７は、サーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ＪＷ／ＳＬ ＹＳ４８５からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
配列番号１８は、サーモアナエロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ＪＷ／ＳＬ ＹＳ４８５からのアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
配列番号１９は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＮＲＲＬ Ｂ−１４９１１からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの核酸配列である。ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＺＰ＿０１１６８６７４において報告されるようなバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＮＲＲＬ Ｂ−１４９１１からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列は、他のセファロスポリンＣデアセチラーゼとの配列アライメントと、他のＣＡＨ酵素の観察される長さ（通常は、３１８〜３２５のアミノ酸長さ、参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１０−００８７５２８−Ａ１号明細書を参照）に対する報告される長さ（３４０のアミノ酸）の比較とに基づいて恐らく誤りである、１５アミノ酸Ｎ−末端付加をコードすると思われることに注意すべきである。従って、本明細書で報告される核酸配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＺＰ＿０１１６８６７４で報告されるＮ−末端１５アミノ酸を含まないバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＮＲＲＬ Ｂ−１４９１１からのセファロスポリンＣデアセチラーゼ配列をコードする。
配列番号２０は、配列番号１９の核酸配列によってコードされるバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種ＮＲＲＬ Ｂ−１４９１１からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
配列番号２１は、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）Ｃ−１２５からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列である。
配列番号２２は、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）Ｃ−１２５からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
配列番号２３は、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６からのセファロスポリンＣデアセチラーゼをコードする核酸配列である。
配列番号２４は、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６からのセファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
配列番号２５は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）２９２３３（商標）セファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＣＡＨ）をコードする核酸配列である。
配列番号２６は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）２９２３３（商標）セファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＣＡＨ）の推定アミノ酸配列である。
配列番号２７は、米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書（参照によってその全体が本明細書中に援用される）からのサーモトガ・ネアポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）アセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７のＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
配列番号２８は、米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書からのサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８アセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７のＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
配列番号２９は、米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書からのサーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）アセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７のＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
配列番号３０は、米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書からのサーモトガ・ペトロフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ）アセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７のＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
配列番号３１は、米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書からの「ＲＱ２（ａ）」に由来するサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）種ＲＱ２アセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７７のＸａａ残基は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
配列番号３２は、米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書からの「ＲＱ２（ｂ）」に由来するサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）種ＲＱ２アセチルキシランエステラーゼ変異体の推定アミノ酸配列であり、ここで、位置２７８のＸａａ残基は、Ａｌ
ａ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒである。
配列番号３３は、サーモトガ・レティンガエ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｌｅｔｔｉｎｇａｅ）アセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
配列番号３４は、サーモトガ・ペトロフィラ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｐｅｔｒｏｐｈｉｌａ）アセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
配列番号３５は、本明細書において「ＲＱ２（ａ）」と記載されるサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）種ＲＱ２からの第１のアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
配列番号３６は、本明細書において「ＲＱ２（ｂ）」と記載されるサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）種ＲＱ２からの第２のアセチルキシランエステラーゼの推定アミノ酸配列である。
配列番号３７は、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎｅａｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）セファロスポリンＣデアセチラーゼをコードするコドン最適化核酸配列である。
配列番号３８は、サーモアナエロバクテリウム・サッカロリティカム（Ｔｈｅｒｍｏａｎｅａｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）セファロスポリンＣデアセチラーゼの推定アミノ酸配列である。
配列番号３９は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＥＵ２５５９１０）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
配列番号４０は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＢＸ７５６３４．１）からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号４１は、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＮＣ＿００２６７８．２）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
配列番号４２は、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＢＡＢ５３１７９．１）からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号４３は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＦ０３８５４７．２）からのアセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
配列番号４４は、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受入番号ＡＡＦ７０２０２．１）からのアセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号４５は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ｆ２４Ｉ／
Ｓ３５Ｔ／Ｑ１７９Ｌ／Ｎ２７５Ｄ／Ｃ２７７Ｓ／Ｓ３０８Ｇ／Ｆ３１７Ｓ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ（変異体「Ａ３」）をコードする核酸配列である。
配列番号４６は、「Ａ３」変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号４７は、Ｎ２７５Ｄ／Ｃ２７７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
配列番号４８は、Ｎ２７５Ｄ／Ｃ２７７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号４９は、Ｃ２７７Ｓ／Ｆ３１７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
配列番号５０は、Ｃ２７７Ｓ／Ｆ３１７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号５１は、Ｓ３５Ｔ／Ｃ２７７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
配列番号５２は、Ｓ３５Ｔ／Ｃ２７７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号５３は、Ｑ１７９Ｌ／Ｃ２７７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼをコードする核酸配列である。
配列番号５４は、Ｑ１７９Ｌ／Ｃ２７７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号５５は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：（Ｌ８Ｒ／Ｌ１２５Ｑ／Ｑ１７６Ｌ／Ｖ１８３Ｄ／Ｆ２４７Ｉ／Ｃ２７７Ｓ／Ｐ２９２Ｌ）を有する変異体アセチルキシランエステラーゼ８４３Ｈ９をコードする核酸配列である。
配列番号５６は、８４３Ｈ９変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号５７は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：Ｋ７７Ｅ／Ａ２６６Ｅ／Ｃ２７７Ｓを有する変異体アセチルキシランエステラーゼ８４３Ｆ１２をコードする核酸配列である。
配列番号５８は、８４３Ｆ１２変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号５９は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：Ｆ２７Ｙ／Ｉ１４９Ｖ／Ａ２６６Ｖ／Ｃ２７７Ｓ／Ｉ２９５Ｔ／Ｎ３０２Ｓを有する変異体アセチルキシランエステラーゼ８４３Ｃ１２をコードする核酸配列である。
配列番号６０は、８４３Ｃ１２変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号６１は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：Ｌ１９５Ｑ／Ｃ２７７Ｓを有する変異体アセチルキシランエステラーゼ８４２Ｈ３をコードする核酸配列である。
配列番号６２は、８４２Ｈ３変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号６３は、野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼアミノ酸配列に対する以下の置換：Ｙ１１０Ｆ／Ｃ２７７Ｓを有する変異体アセチルキシランエステラーゼ８４１Ａ７をコードする核酸配列である。
配列番号６４は、８４１Ａ７変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
配列番号６５〜２２１、２７１、および３６８は、毛髪に対する親和性を有するペプチドのアミノ酸配列の非限定的なリストである。
配列番号２１７〜２６９は、皮膚に対する親和性を有するペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号２７０〜２７１は、爪に対する親和性を有するペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号２７２〜３８２は、口腔表面に対する親和性を有するペプチドのアミノ酸配列である。配列番号２７２〜２９１および３１２〜３８２は、歯のペリクルに対する親和性を有する。配列番号２９２〜３１１は、歯のエナメル質に対する親和性を有する。
配列番号３８３〜３９６は、ペプチドリンカー／スペーサーのアミノ酸配列である。
配列番号３９７は、発現プラスミドｐＬＤ００１の核酸配列である。
配列番号３９８は、配列決定プライマーの核酸配列である。
配列番号３９９〜４１０は、実施例２からの歯エナメル質結合ペプチドおよび歯ペリクル結合ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号４１１は、表４に示されるようなＣ−末端リジンを有する歯結合ペプチドＤｅｎＰ０３のアミノ酸配列である。
配列番号４１２〜４２２は、表４に示されるようなＣ−末端リジンを有する歯エナメル質結合ペプチドおよび歯ペリクル結合ペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号４２３は、ペプチドＨＣ２６３のアミノ酸配列である。
配列番号４２４は、本出願では酵素「ＥＺ−１」とも呼ばれるサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）変異体Ｃ２７７Ｓのアミノ酸配列である。
配列番号４２５〜４３０および４３７〜４６７および４７９は、表５および／または表６に開示されるような種々のペルヒドロラーゼ構築物のアミノ酸配列である。
配列番号４３１〜４３６および４６８〜４７５は、実施例４で開示されるような種々の標的配列のアミノ酸配列である。
配列番号４７６は、以下の置換：Ｃ２７７Ｔ／Ｒ２９６Ｐを有するサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）変異体ＨＴＳ−００７−Ｄ５のアミノ酸配列である。
配列番号４７７は、過加水分解活性を有するシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）エステラーゼのアミノ酸配列である（米国特許第７，３８４，７８７号明細書の「Ｌ２９Ｐ」変異体。置換の番号付けは、初期のメチオニン残基を含まない引用特許に従うことに注意すべきである。初期メチオニンが本配列中に含まれるので、配列番号４７７は、残基位置番号３０におけるＬ２９Ｐ置換を含む）。
配列番号４７８は、野生型マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）アリールエステラーゼのアミノ酸配列である（米国特許第７，７５４，４６０号明細書）。
本開示において、いくつかの用語および略語が使用される。他に具体的に記載されない限り、以下の定義が適用される。
本明細書で使用される場合、本発明の要素または成分に先行する冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、要素または成分の事例（すなわち、発生）の数に関して非限定的であることが意図される。従って、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は１つまたは少なくとも１つを含むと解釈されるべきであり、要素または成分の単数の語形は、その数が明らかに単数形であることを意味しない限りは複数形も含む。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、特許請求の範囲において言及される規定の特徴、整数、ステップ、または成分の存在を意味するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、成分またはそれらの群の存在または付加を排除しない。「含む」という用語は、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語によって包含される実施形態を含むことが意図される。同様に、「から本質的になる」という用語は、「からなる」という用語によって包含される実施形態を含むことが意図される。
本明細書で使用される場合、使用される材料または反応物の量を修飾する「約」という用語は、例えば、実際に濃縮物または使用溶液を製造するために使用される典型的な測定および液体処理手順によって、これらの手順における故意でない誤差によって、組成物を製造するためまたは方法を実行するために使用される材料の製造、供給源、または純度の差異によって、および同類のことによって生じ得る数量の変動を指す。また「約」という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物に対する平衡条件が異なるために異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されるかどうかにかかわらず、特許請求の範
囲はその量と同等の量を含む。
存在する場合、全ての範囲は包括的であり、結合可能である。例えば、「１〜５」の範囲が列挙される場合、列挙される範囲は、「１〜４」、「１〜３」、「１〜２」、「１〜２および４〜５」、「１〜３および５」などの範囲を含むと解釈されるべきである。
本明細書で使用される場合、「接触させる」は、所望の結果（標的表面の結合、過酸ベースの効果など）を達成するのに十分な時間、組成物を標的体表面と接触した状態に置くことを指す。一実施形態では、「接触させる」は、所望の結果を達成するのに十分な時間、有効濃度の過酸を含む（または生成することができる）組成物を標的体表面と接触した状態に置くことを指すことができる。別の実施形態では、「接触させる」は、酵素的な過加水分解のために使用される反応成分の１つまたは複数などのパーソナルケア組成物の少なくとも１つの成分を、標的体表面と接触した状態に置くことを指すこともできる。接触には、噴霧、処理、浸漬、フラッシング、注入（上または中に）、混合、混ぜ合わせ、ペインティング、コーティング、適用、付着が含まれ、あるいは、有効濃度の過酸を含む過酸溶液もしくは組成物、有効濃度の過酸を形成する溶液もしくは組成物、または有効濃度の過酸を形成する組成物の成分を体表面と連通させることも含まれる。
本明細書で使用される場合、「基質」、「適切な基質」、および「カルボン酸エステル基質」という用語は、具体的には：
（ａ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘは式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６がＣ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５は、場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または環状５員ヘテロ芳香族もしくは６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有する１つまたは複数のエステル、あるいは
（ｂ）構造
Figure 0006410786
 （式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有する１つまたは複数のグリセリド、あるいは
（ｃ）式
Figure 0006410786
 （式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、あるいは
（ｄ）１つまたは複数のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類、またはアセチル化多糖類、あるいは
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせ
を交換可能に指す。
本明細書で使用される場合、「過酸」という用語は、ペルオキシ酸（ｐｅｒｏｘｙａｃｉｄ）、ペルオキシカルボン酸、ペルオキシ酸（ｐｅｒｏｘｙ ａｃｉｄ）、過カルボン酸およびペルオキソ酸（ｐｅｒｏｘｏｉｃ ａｃｉｄ）と同義である。
本明細書で使用される場合、「過酢酸」という用語は「ＰＡＡ」と略され、ペルオキシ酢酸、エタンペルオキソ酸、およびＣＡＳ登録番号７９−２１−０の全ての他の同義語と同義である。
本明細書で使用される場合、「モノアセチン」という用語は、グリセロールモノアセテート、グリセリンモノアセテート、およびグリセリルモノアセテートと同義である。
本明細書で使用される場合、「ジアセチン」という用語は、グリセロールジアセテート、グリセリンジアセテート、グリセリルジアセテート、およびＣＡＳ登録番号２５３９５−３１−７の全ての他の同義語と同義である。
本明細書で使用される場合、「トリアセチン」という用語は、グリセリントリアセテート、グリセロールトリアセテート、グリセリルトリアセテート、１，２，３−トリアセトキシプロパン、１，２，３−プロパントリオールトリアセテート、およびＣＡＳ登録番号１０２−７６−１の全ての他の同義語と同義である。
本明細書で使用される場合、「モノブチリン」という用語は、グリセロールモノブチレート、グリセリンモノブチレート、およびグリセリルモノブチレートと同義である。
本明細書で使用される場合、「ジブチリン」という用語は、グリセロールジブチレートおよびグリセリルジブチレートと同義である。
本明細書で使用される場合、「トリブチリン」という用語は、グリセロールトリブチレート、１，２，３−トリブチリルグリセロール、およびＣＡＳ登録番号６０−０１−５の全ての他の同義語と同義である。
本明細書で使用される場合、「モノプロピオニン」という用語は、グリセロールモノプロピオネート、グリセリンモノプロピオネート、およびグリセリルモノプロピオネートと同義である。
本明細書で使用される場合、「ジプロピオニン」という用語は、グリセロールジプロピオネートおよびグリセリルジプロピオネートと同義である。
本明細書で使用される場合、「トリプロピオニン」という用語は、グリセリルトリプロピオネート、グリセロールトリプロピオネート、１，２，３−トリプロピオニルグリセロール、およびＣＡＳ登録番号１３９−４５−７の全ての他の同義語と同義である。
本明細書で使用される場合、「アセチル化糖」および「アセチル化糖類」という用語は、少なくとも１つのアセチル基を含む単糖類、二糖類および多糖類を指す。例としては、グルコースペンタアセテート、キシローステトラアセテート、アセチル化キシラン、アセチル化キシラン断片、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、およびトリ−Ｏ−アセチル−グルカールが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「ヒドロカルビル」、「ヒドロカルビル基」、および「ヒドロカルビル部分」という用語は、炭素−炭素の単結合、二重結合、もしくは三重結合および／またはエーテル結合によって結合され、それに応じて水素原子により置換された炭素原子の直鎖、分枝状または環状配置を意味する。このようなヒドロカルビル基は、脂肪族および／または芳香族であり得る。ヒドロカルビル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、ペンチル、シクロペンチル、メチルシクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、ベンジル、およびフェニルが挙げられる。好ましい実施形態では、ヒドロカルビル部分は、炭素−炭素単結合および／またはエーテル結合によって結合され、それに応じて水素原子により置換された炭素原子の直鎖、分枝状または環状配置である。
本明細書で使用される場合、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，５−ペンタンジオール（１，５−ｐｅｎｔａｎｄｉｏｌ）、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールおよびこれらの混合物の「モノエステル」および「ジエステル」という用語は、式ＲＣ（Ｏ）Ｏの少なくとも１つのエステル基を含む前記化合物を指し、式中、ＲはＣ１〜Ｃ７線状ヒドロカルビル部分である。一実施形態では、カルボン酸エステル基質は、プロピレングリコールジアセテート（ＰＧＤＡ）、エチレングリコールジアセテート（ＥＤＧＡ）、およびこれらの混合物からなる群から選択される。
本明細書で使用される場合、「プロピレングリコールジアセテート」という用語は、１，２−ジアセトキシプロパン、プロピレンジアセテート、１，２−プロパンジオールジアセテート、およびＣＡＳ登録番号６２３−８４−７の全ての他の同義語と同義である。
本明細書で使用される場合、「エチレングリコールジアセテート」という用語は、１，２−ジアセトキシエタン、エチレンジアセテート、グリコールジアセテート、およびＣＡＳ登録番号１１１−５５−７の全ての他の同義語と同義である。
本明細書で使用される場合、「適切な酵素反応混合物」、「その場での（ｉｎ ｓｉｔｕ）過酸の発生に適した成分」、「適切な反応成分」、「適切な水性反応混合物」、「反応混合物」、および「過酸発生成分」という用語は、反応物と過加水分解酵素触媒とが接触される材料および水を指す。過酸発生成分は、少なくとも、過加水分解活性を有する酵素（好ましくは、過加水分解酵素は少なくとも１つのＣＥ−７ペルヒドロラーゼ（場合により体表面に標的化された融合タンパク質の形態）である）と、少なくとも１つの適切な
カルボン酸エステル基質と、過酸素源と、水（過酸素源、例えば、過酸化水素を含む水溶液）とを含むであろう。ただし、一実施形態では、炭水化物エステラーゼのＣＥ−７クラスに属さない過加水分解酵素はどれも、標的表面、好ましくは口腔表面に対する親和性を有する少なくとも１つのペプチド成分を有する融合タンパク質の形態で使用されるであろう。
本明細書で使用される場合、「過加水分解」という用語は、過酸を形成するための、選択された基質と過酸化物との反応であると定義される。通常、無機過酸化物が触媒の存在下で選択された基質と反応されて、ペルオキシカルボン酸を生成する。本明細書で使用される場合、「化学的な過加水分解」という用語は、基質（ペルオキシカルボン酸前駆体）が過酸化水素源と混ぜ合わせられる過加水分解反応を含み、この場合、ペルオキシカルボン酸は酵素触媒の非存在下で形成される。本明細書で使用される場合、「酵素的な過加水分解」という用語は、カルボン酸エステル基質（過酸前駆体）が過酸化水素源および水と混ぜ合わせられる過加水分解反応を含み、この場合、酵素触媒が過酸の形成を触媒する。
本明細書で使用される場合、「ペルヒドロラーゼ活性」という用語は、タンパク質の単位質量（例えば、ミリグラム）、乾燥細胞重量、または固定化触媒重量あたりの触媒活性を指す。
本明細書で使用される場合、「酵素活性の１単位」または「活性の１単位」または「Ｕ」は、特定の温度で１分あたり１μｍｏｌのペルオキシカルボン酸生成物を生成するために必要とされるペルヒドロラーゼ活性の量であると定義される。
本明細書で使用される場合、「酵素触媒」および「ペルヒドロラーゼ触媒」という用語は過加水分解活性を有する酵素を含む触媒を指し、全微生物細胞、透過処理された微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つまたは複数の細胞成分、部分精製酵素、または精製酵素の形態であり得る。また酵素触媒は化学修飾されていてもよい（ペグ化、あるいは架橋試薬との反応などによる）。またペルヒドロラーゼ触媒は、当業者によく知られている方法を用いて可溶性または不溶性の担体に固定化されていてもよく、例えば、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ」，Ｇｏｒｄｏｎ Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ，１９９７が参照される。一実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、口腔ケアストリップ（例えば、ホワイトニングストリップ）またはデンタルトレイの中または上に、非共有結合的または共有結合的に固定化され得る。固定化酵素は、高分子担体および／または口腔ケアストリップまたはデンタルトレイ内の成分（例えば、二酸化チタン、ヒドロキシアパタイト、経口的に許容可能な接着剤、ポリエチレン、ポリプロピレンなど）に直接結合されてもよい。さらなる実施形態では、ストリップまたはデンタルトレイへの非共有結合的な固定化は、ストリップまたはトレイの中または上の材料に対して強い親和性を有するペプチド結合ドメインの使用によるものであってもよい（例えば、任意的なペプチドスペーサーを介してペプチド結合ドメインに結合された過加水分解酵素を含む融合タンパク質）。別の実施形態では、デンタルトレイは変形可能なトレイである。またさらなる実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、歯科印象の形成後に変形可能なトレイの中または上に固定化される。
本明細書で使用される場合、「アセチルキシランエステラーゼ」は、アセチル化キシランおよび他のアセチル化糖類の脱アセチル化を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２、ＡＸＥ）を指す。本明細書において説明されるように、有意な過加水分解活性を有するアセチルキシランエステラーゼとして分類されるいくつかの酵素が提供される。
本明細書で使用される場合、「セファロスポリンＣデアセチラーゼ」および「セファロ
スポリンＣアセチルヒドロラーゼ」という用語は、セファロスポリンＣおよび７−アミノセファロスポラン酸などのセファロスポリンの脱アセチル化を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１）を指す（Ｍｉｔｓｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１（６）：２２２４−２２２９）。有意な過加水分解活性を有するいくつかのセファロスポリンＣデアセチラーゼのアミノ酸配列が本明細書において提供される。
本明細書で使用される場合、「バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）」という用語は、国際寄託受入番号ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）を有する、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託された細菌細胞を指す。本明細書に記載されるように、Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）からの有意なペルヒドロラーゼ活性を有する酵素は、配列番号２として提供される（米国特許出願公開第２０１０−００４１７５２号明細書を参照）。
本明細書で使用される場合、「サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８」という用語は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有すると報告された細菌細胞を指す（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＮＰ＿２２７８９３．１、米国特許出願公開第２００８−０１７６２９９号明細書を参照）。サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８からのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号１６として提供される。
本明細書で使用される場合、「単離核酸分子」、「単離ポリヌクレオチド」、および「単離核酸断片」は交換可能に使用され、場合により、合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指すであろう。ＤＮＡのポリマーの形態の単離核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つまたは複数のセグメントから構成され得る。
「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的な化学構造単位を指す。本明細書では、特定のアミノ酸を同定するために以下の略語が使用される。
Figure 0006410786
例えば、所与の部位で化学的に等価なアミノ酸の生成をもたらすが、コードされるタンパク質の機能特性に影響を与えない遺伝子の改変が一般的であることは、当該技術分野においてよく知られている。本発明の目的のために、置換は、以下の５つの群：
１． 小さい脂肪族の非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）、
２． 極性の負帯電残基およびそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、
３． 極性の正帯電残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、
４． 大きい脂肪族の非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ（Ｃｙｓ）、ならびに
５． 大きい芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐ
のうちの１つの中での交換であると定義される。
従って、疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンに対するコドンは、別のあまり疎水性でない残基（グリシン残基）またはより疎水性の残基（バリン、ロイシン、またはイソロイシンなど）をコードするコドンによって置換され得る。同様に、１つの負帯電残基による別の残基（アスパラギン酸によるグルタミン酸など）の置換、あるいは１つの正帯電残基による別の残基（リジンによるアルギニンなど）の置換をもたらす変化も、機能的に等価な産物を生じることが予想され得る。多くの場合、タンパク質分子のＮ−末端およびＣ−末端部分の改変をもたらすヌクレオチドの変化も、タンパク質の活性を変更しないと予想されるであろう。提唱される修飾のそれぞれは、コードされる産物の生物活性の保持の決定と同様に、当該技術分野において十分にルーチン的な技能の範囲内である。
本明細書で使用される場合、「シグネチャーモチーフ」および「診断モチーフ」という用語は、定義される活性を有する酵素のファミリーの間で共有される保存構造を指す。シグネチャーモチーフは、定義される基質ファミリーに対して同様の酵素活性を有する構造的に関連する酵素ファミリーを定義および／または同定するために使用することができる。シグネチャーモチーフは、単一の連続アミノ酸配列であっても、あるいは一緒にシグネチャーモチーフを形成する不連続の保存モチーフの集まりであってもよい。通常、保存モチーフはアミノ酸配列によって表される。一実施形態では、過加水分解酵素はＣＥ−７炭水化物エステラーゼシグネチャーモチーフを含む。
本明細書で使用される場合、種々の宿主の形質転換のための核酸分子の遺伝子またはコード領域に言及する場合の「コドン最適化」という用語は、ＤＮＡがコードするポリペプチドを改変することなく宿主生物の典型的なコドン使用を反映するための、核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンの改変を指す。
本明細書で使用される場合、「合成遺伝子」は、当業者に知られている手順を用いて化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成要素から組み立てることができる。これらの構成要素は連結およびアニールされて遺伝子セグメントを形成し、これは次に酵素的に組み立てられて遺伝子全体を構築する。ＤＮＡ配列に関する場合の「化学的に合成される」は、ヌクレオチド成分がインビトロで組み立てられたことを意味する。十分に確立された手順を用いて手作業によるＤＮＡの化学合成が達成されてもよいし、あるいはいくつかの市販の機械の１つを用いて自動化学合成が実施されてもよい。従って、ヌクレオチド配列の最適化に基づいて最適な遺伝子発現に合わせて遺伝子を作り、宿主細胞のコドンバイアスを反映することができる。当業者は、コドン使用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合に、遺伝子発現が成功する可能性を認識している。好ましいコドンの決定は、配列情報が利用可能な宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づくことができる。
本明細書で使用される場合、「遺伝子」は特定のタンパク質を発現する核酸分子を指し、コード配列の前（５’非コード配列）およびコード配列の後（３’非コード配列）の制御配列が含まれる。「天然遺伝子」は、その独自の制御配列を有して天然に見出される遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然に一緒に見出されない制御およびコード配列を含む、天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる源に由来する制御配列およびコード配列、あるいは同じ源に由来するが天然に見出されるものとは異なった形で配列された制御配列およびコード配列を含むことができる。「内在性遺伝子」は、生物のゲノムにおいてその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子は、通常は宿主生物中に見出されないが遺伝子導入によって宿主生物中に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によってゲノム内に導入された遺伝子である。
本明細書で使用される場合、「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な制御配列」は、コード配列の上流側（５’非コード配列）、内部、または下流側（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を与えるヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方によって影響されるような、単一の核酸分子における核酸配列の関連を指す。例えば、プロモーターはコード配列の発現に影響することができる場合にそのコード配列と作動可
能に連結されており、すなわち、コード配列はプロモーターの転写制御下にある。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動可能に連結され得る。
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、本発明の核酸分子に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。また発現は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すこともできる。
本明細書で使用される場合、「形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝形質をもたらす、宿主生物のゲノムへの核酸分子の転移を指す。本発明において、宿主細胞のゲノムは、染色体および染色体外（例えば、プラスミド）遺伝子を含む。形質転換された核酸分子を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」、「組換え」または「形質転換」生物と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用な任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は市販のものでもよいし、あるいは独立して開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアには、ＧＣＧプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８ Ｓ．Ｐａｒｋ Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１５ ＵＳＡ）、ＣＬＵＳＴＡＬＷ（例えば、バージョン１．８３、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４））、ならびにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４），Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２，１１１−２０．Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）およびＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ｖ．４．０５を組み込んだＦＡＳＴＡプログラムが含まれ得るが、これらに限定されない。本出願との関連において、分析のために配列分析ソフトウェアが使用される場合、他に指定されない限り、分析結果が言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくことは理解されるであろう。本明細書で使用される場合、「デフォルト値」は、最初の初期化の際にソフトウェアと共に最初にロードされた、ソフトウェア製造業者により設定された任意の値またはパラメータのセットを意味するであろう。
「体表面」という用語は、過酸有益剤などの有益剤の標的としての役割を果たすことができる人体の任意の表面を指す。本発明の方法および組成物は、口腔ケア用途および製品に関する。従って、体表面は口腔材料／表面を含む。一実施形態では、口腔材料は、歯のエナメル質、歯のペリクル、頬、舌、および歯肉などの軟組織、ならびに口腔バイオフィルム（例えば、口腔プラーク）を含む。
本明細書で使用される場合、「生物学的汚染物質」という用語は、１つまたは複数の不要なおよび／または病原性の生物学的実体を指し、微生物、胞子、ウィルス、プリオン、およびこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、生物学的汚染物質の存在を低減および／または排除するために有用な有効濃度の少なくとも１つの過酸を酵素的に生成するための方法が提供される。
本明細書で使用される場合、「消毒する」という用語は、生物学的汚染物質を破壊するまたは生物学的汚染物質の増殖を予防するプロセスを指す。本明細書で使用される場合、「消毒剤」という用語は、生物学的汚染物質の破壊、中和または増殖の阻害によって消毒
する薬剤を指し、生物学的汚染物質は、う歯、歯肉炎、口腔カンジダ症、または歯周炎と関連する微生物などのヒト口腔内の生物学的汚染物質を含むことができる。本明細書で使用される場合、「消毒」という用語は、消毒の作用またはプロセスを指す。本明細書で使用される場合、「防腐剤」という用語は、疾患を保有する微生物の増殖を阻害する化学物質を指す。１つの態様では、生物学的汚染物質は病原微生物である。
本明細書で使用される場合、「衛生」という用語は、通常、健康に有害であり得る作用物質を除去、防止または調節することによる、健康の回復または保持を意味する、またはこれらに関する。本明細書で使用される場合、「衛生化する」という用語は、衛生的にすることを意味する。本明細書で使用される場合、「衛生化剤（ｓａｎｉｔｉｚｅｒ）」という用語は、衛生化する薬剤を指す。本明細書で使用される場合、「衛生化」という用語は、衛生化の作用またはプロセスを指す。
本明細書で使用される場合、「殺生物剤（ｂｉｏｃｉｄｅ）」という用語は、微生物を不活性化または破壊する化学物質（通常は広範囲）を指す。微生物を不活性化または破壊する能力を示す化学物質は、「殺生物（ｂｉｏｃｉｄａｌ）」活性を有すると説明される。過酸は、殺生物活性を有することができる。典型的な代替の殺生物剤としては、例えば、塩素、二酸化塩素、クロロイソシアヌレート、次亜塩素酸塩、オゾン、アクロレイン、アミン、塩素化フェノール、銅塩、有機硫黄化合物、および第４級アンモニウム塩を挙げることができる。
本明細書で使用される場合、「最小殺生物濃度」という語句は、特定の接触時間に、標的微生物の生存可能な集団において所望の致死的で不可逆的な低減を生じ得る殺生物剤の最小濃度を指す。有効性は、処理後の生存可能な微生物の減少のｌｏｇ１０によって測定することができる。１つの態様では、標的化される生存可能な微生物の処理後の減少は、少なくとも３−Ｌｏｇ１０の減少、より好ましくは少なくとも４−Ｌｏｇ１０の減少、最も好ましくは少なくとも５−Ｌｏｇ１０の減少である。別の態様では、最小殺生物濃度は、生存可能な微生物細胞の少なくとも６−Ｌｏｇ１０の減少である。
本明細書で使用される場合、「クリーニング組成物」および「クリーニング製剤」は、歯から望ましくない化合物を除去することに用途を見出す組成物（マウスウォッシュ、歯磨きペーストなど）を指す。この用語は、組成物が組成物中で使用されるペルヒドロラーゼおよび他の酵素と適合性である限り、所望されるクリーニング組成物の特定の種類および製品の形態（例えば、液体、ペースト、ジェル、エマルション、顆粒、またはスプレー組成物）のために選択されるあらゆる材料／化合物を包含する。
本明細書で使用される場合、「口腔クリーニング組成物」は、歯磨剤、歯磨きペースト、歯磨きジェル、マウスウォッシュ、マウススプレー、マウスジェル、チューインガム、ロゼンジ、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）、錠剤、バイオジェル、予防ペースト、歯科処置溶液などを指す。本発明のペルヒドロラーゼと共に用途を見出す口腔ケア組成物は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、米国特許第５，６０１，７５０号明細書、同第６，３７９，６５３号明細書、および同第５，９８９，５２６号明細書が参照され、これらは全て参照によってその全体が本明細書中に援用される）。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な」は、この用語が説明する薬物、薬剤および／または不活性成分が、合理的な損益比に見合って過度の毒性、不適合性、不安定性、刺激、アレルギー応答などを伴わずにヒトおよび他の動物の組織と接触して使用するのに適していることを意味する。
本明細書で使用される場合、「パーソナルケア製品」は、毛髪、皮膚、頭皮、および歯
の清浄化、漂白および／または消毒において使用される製品を意味し、シャンプー、ボディローション、シャワージェル、局所保湿剤、歯磨きペースト、歯磨きジェル、マウスウォッシュ、マウスリンス、アンチプラークリンス、および／または他の局所クレンザーが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの特定の好ましい実施形態では、これらの製品はヒトにおいて用いられるが、他の実施形態では、これらの製品は非ヒト動物による用途を見出す（例えば、獣医学用途において）。
本明細書で使用される場合、「歯のホワイトニング」および「歯の漂白」という用語は、歯（単数または複数）の輝度の改善（例えば、ホワイトニング）を指すために交換可能に使用される。この用語は、本発明、ならびに化学処理、弱酸処理、研磨による歯のホワイトニング、およびレーザーによる歯のホワイトニングを含む、歯を白くするのに適したあらゆる方法を包含することが意図される。特に好ましい実施形態では、本発明は、歯を白くするのに適したペルヒドロラーゼおよびペルヒドロラーゼ含有組成物を提供する。
本明細書で使用される場合、歯の「内因性の染み」は、エナメル質および下側の象牙質内の色原体に起因する色を指す。ヒトの歯の内因性の色は、エナメル質の菲薄化および下側の黄色の象牙質の暗色化のために、加齢とともにより黄色くなる傾向がある。内因性の染みの除去は、通常、エナメル質に浸透して内部の色原体を脱色する過酸化物または他の酸化性化学薬品の使用を必要とする。
内因性の染みとは対照的に、「外因性の染み」は、通常は歯を自然にコーティングするペリクル内で外因性の発色材料がエナメル質に結合する際に歯の表面に生じる。ほとんどの人は、時間と共にある程度の見苦しい外因性の染みが歯に蓄積している。この染色プロセスは、（１）コーヒー、お茶、または赤ワインなどのタンニン含有食品および飲料の摂取、（２）タバコ製品の使用、および／または（３）特定のカチオン性物質（例えば、スズ、鉄、およびクロルヘキシジン）への暴露などの因子によって促進される。これらの物質はエナメル質のヒドロキシアパタイト構造に付着しやすく、歯の変色と、それに付随する歯の白色度の低下とをもたらす。何年もの期間にわたって、外因性の染みはエナメル質層に浸透し、内因性の染みを生じる。
本明細書で使用される場合、「脱臭」という用語は、不快な臭気の除去または予防を意味する。
本明細書で使用される場合、「脱染する」または「脱染」という用語は、口腔表面から染みを除去するプロセスを指す。染みは、内因性の染み、外因性の染み、またはこれらの組み合わせであり得る。
本明細書で使用される場合、ペルヒドロラーゼ含有組成物における「増強された性能」は、歯科技術分野において標準的な方法を用いて決定される場合に、他の組成物と比較して漂白剤感受性の染みのクリーニングを向上させることであると定義される。特定の実施形態では、本発明のペルヒドロラーゼは、着色した染みの酸化および除去において増強された性能を提供する。さらなる実施形態では、本発明のペルヒドロラーゼは、染みの除去および／または変色において増強された性能を提供する。
本明細書で使用される場合、「ペルヒドロラーゼ酵素の有効量」は、特定の用途で必要とされる酵素活性を達成するために必要なペルヒドロラーゼ酵素の量を指す。このような有効量は当業者によって容易に確認され、使用される特定の酵素変異体、クリーニング用途、クリーニング組成物の特定の組成、そして液体または非液体（例えば、エマルション）組成物のどちらが必要とされるかなどの多数の因子に基づいている。
本明細書で使用される場合、「過酸素源」および「過酸素の源」という用語は、水溶液中にある場合に約１ｍＭ以上の濃度の過酸化水素を提供することができる化合物を指し、過酸化水素、過酸化水素付加物（例えば、尿素−過酸化水素付加物（過酸化カルバミド））、過ホウ酸塩、および過炭酸塩が含まれるが、これらに限定されない。本明細書において記載されるように、水性反応製剤中の過酸素化合物によって提供される過酸化水素の濃度は、反応成分を混ぜ合わせたときに最初は少なくとも０．１ｍＭ以上である。一実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は、少なくとも０．５ｍＭである。一実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は少なくとも１ｍＭである。別の実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は、少なくとも１０ｍＭである。別の実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は、少なくとも１００ｍＭである。別の実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は、少なくとも２００ｍＭである。別の実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は、５００ｍＭ以上である。さらに別の実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は、１０００ｍＭ以上である。水性反応製剤中の酵素基質、例えばトリグリセリドに対する過酸化水素のモル比（Ｈ２Ｏ２：基質）は約０．００２〜２０でよく、好ましくは約０．１〜１０、最も好ましくは約０．５〜５でよい。
本明細書で使用される場合、「オリゴ糖」という用語は、グリコシド結合によって連結された２個から少なくとも２４個の間の単糖単位を含有する化合物を指す。「単糖」という用語は、実験式（ＣＨ２Ｏ）ｎの化合物を指し、ここで、ｎ≧３であり、炭素骨格は分枝しておらず、各炭素原子は１つを除いてヒドロキシル基を含有し、残りの炭素原子は炭素原子２におけるアルデヒドまたはケトンである。また「単糖」という用語は、細胞内環状ヘミケタール型またはヘミケタール型も指す。
本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、製剤中の活性成分のキャリアとして使用される不活性物質を指す。賦形剤は、活性成分の貯蔵安定性など、製剤中の活性成分を安定化するために使用されてもよい、また賦形剤は、活性成分を含有する製剤を増量するために使用されることもある。本明細書において記載されるように、「活性成分」は、過加水分解活性を有する酵素、適切な反応条件下で過加水分解酵素により生成される過酸、またはこれらの組み合わせであり得る。
「実質的に水を含まない」という用語は、カルボン酸エステル中に存在する場合に酵素または酵素粉末の貯蔵安定性に悪影響を与えない、製剤中の水の濃度を指すであろう。カルボン酸エステルは非常に低濃度の水を含有し得る。例えば、トリアセチンは、通常、１８０ｐｐｍ〜３００ｐｐｍの水を有する。一実施形態では、過加水分解酵素は、実質的に水を含まないカルボン酸エステル基質中で貯蔵される。さらなる実施形態では、「実質的に水を含まない」は、酵素（または酵素粉末）およびカルボン酸エステルを含む製剤中の、２０００ｐｐｍ未満、好ましくは１０００ｐｐｍ未満、より好ましくは５００ｐｐｍ未満、さらにより好ましくは２５０ｐｐｍ未満の水を意味し得る。一実施形態では、過加水分解酵素は、酵素が水溶液中で安定であるように発生系が設計されれば、水溶液中で貯蔵され得る（例えば、貯蔵中に酵素により加水分解されることが可能な有意な濃度のカルボン酸エステル基質を含有しない溶液）。一実施形態では、過加水分解酵素は、実質的に水を含まないカルボン酸エステル基質と、１つまたは複数の緩衝液（例えば、重炭酸、クエン酸、酢酸、リン酸、ピロリン酸、メチルホスホン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、およびマレイン酸のナトリウムおよび／またはカリウム塩）とを含む混合物中で貯蔵され得る。
過加水分解活性を有する酵素
過加水分解活性を有する酵素は、酵素が本発明の基質の１つまたは複数に対する過加水分解活性を有する限り、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アリールエステラーゼ、炭水化物エステラーゼに分類されるいくつかの酵素、およ
び組み合わせを含むことができる。例としては、過加水分解プロテアーゼ（スブチリシンカールスバーグ変異体、米国特許第７，５１０，８５９号明細書）、過加水分解アリールエステラーゼ（シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、配列番号４７７、米国特許第７，３８４，７８７号明細書）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からの過加水分解アリールエステラーゼ／アシルトランスフェラーゼ（配列番号４６０および４７８、米国特許第７，７５４，４６０号明細書、国際公開第２００５／０５６７８２号パンフレット、および欧州特許第１６８９８５９Ｂ１号明細書）、およびペルヒドロラーゼ炭水化物エステラーゼを挙げることができるが、これらに限定されない。好ましい態様では、過加水分解炭水化物エステラーゼはＣＥ−７炭水化物エステラーゼである。
一実施形態では、適切なペルヒドロラーゼは、本明細書において報告されるアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素を含むことができるが、ただし、非ＣＥ−７ペルヒドロラーゼは標的化ペルヒドロラーゼ用途に限定される（すなわち、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属さない過加水分解酵素は、少なくとも１つのペプチド標的ドメインを含む融合タンパク質の形態で使用される）。
別の実施形態では、適切なペルヒドロラーゼは、配列番号４６０、４７７、および４７８に対して少なくとも３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含む酵素を含むことができるが、ただし、非ＣＥ−７ペルヒドロラーゼは標的化ペルヒドロラーゼ用途に限定される（すなわち、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属さない過加水分解酵素は、少なくとも１つのペプチド標的ドメインを含む融合タンパク質の形態で使用される）。実質的に類似の過加水分解酵素を同定するために使用される同一性パーセント比較および配列アライメントは、過加水分解酵素を含む融合タンパク質の一部（すなわち、標的ドメインおよびリンカーは含まれない）に対して実行されることが理解される。
別の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４６０として提供されるＳ５４Ｖマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）アリールエステラーゼに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する過加水分解酵素を含む。
一実施形態では、融合タンパク質は、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からの過加水分解エステラーゼを含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４７７として提供されるシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）エステラーゼに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する過加水分解酵素を含む。
別の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４７６、４７７、４７８、および４７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する過加水分解酵素を含む。
別の実施形態では、実質的に類似の過加水分解酵素は、高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件（０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃、そして２×ＳＳＣ、０
．１％のＳＤＳによる洗浄の後、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃の最終洗浄）下で、本発明の過加水分解酵素のいずれかをコードするポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列によってコードされるものを含むことができるが、ただし、非ＣＥ−７ペルヒドロラーゼは標的化ペルヒドロラーゼ用途に限定される（すなわち、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属さない過加水分解酵素は、少なくとも１つのペプチド標的ドメインを含む融合タンパク質の形態で使用される）。
ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ
好ましい実施形態では、口腔ケア組成物および方法は、構造的に酵素の炭水化物ファミリーエステラーゼファミリー７（ＣＥ−７ファミリー）のメンバーであると分類される過加水分解活性を有する酵素を含む（Ｃｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．，Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ａｃｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ：ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｄａｔａｂａｓｅ ａｐｐｒｏａｃｈ」ｉｎ「Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」，Ｈ．Ｊ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｇ．Ｄａｖｉｅｓ，Ｂ．Ｈｅｎｒｉｓｓａｔ ａｎｄ Ｂ．Ｓｖｅｎｓｓｏｎ ｅｄｓ．，（１９９９）Ｔｈｅ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ｐｐ．３−１２を参照）。酵素のＣＥ−７ファミリーは、過酸素源と混ぜ合わせられたときに様々なカルボン酸エステル基質からペルオキシカルボン酸を生成するために特に有効であることが実証されている（米国特許第７，７９４，３７８号明細書、同第７，９５１，５６６号明細書、同第７，７２３，０８３号明細書、および同第７，９６４，３７８号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００８−０１７６２９９号明細書、同第２０１０−００８７５２９号明細書、同第２０１１−００８１６９３号明細書、および同第２０１１−０２３６３３５号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）、それぞれ参照によって本明細書中に援用される）。
ＣＥ−７ファミリーのメンバーには、セファロスポリンＣデアセチラーゼ（ＣＡＨ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１）およびアセチルキシランエステラーゼ（ＡＸＥ、Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２）が含まれる。ＣＥ−７エステラーゼファミリーのメンバーは、保存されたシグネチャーモチーフを共有する（Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３０：５９３−６０６（２００３））。ＣＥ−７シグネチャーモチーフを含むペルヒドロラーゼ（「ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ」）および／または実質的に類似の構造は、本明細書に記載される組成物および方法において使用するのに適している。実質的に類似の生物分子を同定するための手段は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、配列アライメントプロトコール、核酸ハイブリダイゼーション、および／または保存シグネチャーモチーフの存在）。１つの態様では、ペルヒドロラーゼには、ＣＥ−７シグネチャーモチーフと、本明細書において提供される配列の１つに対する少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３３％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４２％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性とを含む酵素が含まれる。
本明細書で使用される場合、「酵素は構造的にＣＥ−７酵素と分類される」、「ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ」または「構造的に炭水化物エステラーゼファミリー７酵素と分類される」という語句は、構造的にＣＥ−７炭水化物エステラーゼと分類される過加水分解活性を有する酵素を指すために使用されるであろう。この酵素ファミリーは、シグネチャーモチーフの存在によって定義することができる（上記のＶｉｎｃｅｎｔら）。ＣＥ−７エステラーゼのためのシグネチャーモチーフは、３つの保存モチーフ：
ａ）Ａｒｇ１１８−Ｇｌｙ１１９−Ｇｌｎ１２０と、
ｂ）Ｇｌｙ１７９−Ｘａａ１８０−Ｓｅｒ１８１−Ｇｌｎ１８２−Ｇｌｙ１８３と、
ｃ）Ｈｉｓ２９８−Ｇｌｕ２９９と
を含む（残基位置の番号付けは、参照配列の配列番号２（Ｂ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）からのＣＥ−７ペルヒドロラーゼ）に対する）。
通常、アミノ酸残基位置１８０のＸａａは、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファン、またはスレオニンである。触媒トライアドに属する３つのアミノ酸残基のうちの２つは太字である。一実施形態では、アミノ酸残基位置１８０のＸａａは、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファン、およびスレオニンからなる群から選択される。
ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリー内の保存モチーフのさらなる分析は、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーに属するペルヒドロラーゼをさらに定義するために使用され得る付加的な保存モチーフ（配列番号２のアミノ酸位置２６７〜２６９のＬＸＤ）の存在を示す。さらなる実施形態では、上記で定義されたシグネチャーモチーフは、
Ｌｅｕ２６７−Ｘａａ２６８−Ａｓｐ２６９
と定義される付加的な（第４の）保存モチーフを含むことができる。
アミノ酸残基位置２６８のＸａａは、通常、イソロイシン、バリン、またはメチオニンである。第４のモチーフは、触媒トライアド（Ｓｅｒ１８１−Ａｓｐ２６９−Ｈｉｓ２９８）に属するアスパラギン酸残基（太字）を含む。
ＣＥ−７ペルヒドロラーゼは、少なくとも１つの体表面に対する親和性を有する少なくとも１つのペプチド成分を有する融合タンパク質の形態であり得る。一実施形態では、標的化ペルヒドロラーゼ（融合タンパク質）がＣＥ−７シグネチャーモチーフを含むかどうかを決定するために使用される全てのアライメントは、体表面に対する親和性を有するペプチド成分を持たない過加水分解酵素のアミノ酸配列に基づくであろう。
いくつかのよく知られているグローバルアライメントアルゴリズム（すなわち、配列分析ソフトウェア）を用いて、ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を表す２つ以上のアミノ酸配列をアラインさせ、酵素が本発明のシグネチャーモチーフで構成されているかどうかを決定することができる。アラインされた配列は参照配列（配列番号２）と比較され、シグネチャーモチーフの存在が決定される。一実施形態では、参照アミノ酸配列（本明細書で使用される場合、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ（登録商標）３１９５４（商標）からのペルヒドロラーゼ配列（配列番号２））を用いるＣＬＵＳＴＡＬアライメント（ＣＬＵＳＴＡＬＷなど）を使用して、ＣＥ−７エステラーゼファミリーに属するペルヒドロラーゼを同定する。保存アミノ酸残基の相対的な番号付けは、アラインされた配列内の小さい挿入または欠失（例えば、通常は５アミノ酸以下）を考慮に入れるために、参照アミノ酸配列の残基の番号付けに基づく。
本発明のシグネチャーモチーフを含む配列を同定する（参照配列と比較したときに）ために使用され得る他の適切なアルゴリズムの例としては、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３（１９７０）、グローバルアライメントツール）、ならびにＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１）、ローカルアライメントツール）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアライメントは、デフォルトパラメータを用いて実行される。適切なデフォルトパラメータの例としては、ＧＡＰオープンペナルティ＝１０およびＧＡＰ伸長ペナルティー＝０．５と共にＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスの使用が挙げられる。
ペルヒドロラーゼ間での全体的な同一性パーセントの比較により、配列番号２に対してわずか３３％のアミノ酸同一性を有する酵素（シグネチャーモチーフを保持しながら）が有意なペルヒドロラーゼ活性を示し、構造的にＣＥ−７炭水化物エステラーゼと分類されることが示される。一実施形態では、適切なペルヒドロラーゼには、ＣＥ−７シグネチャーモチーフと、配列番号２に対する少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性とを含む酵素が含まれる。
過加水分解活性を有する適切なＣＥ−７炭水化物エステラーゼの例としては、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、４２４、４３７、および４７６などのアミノ酸配列を有する酵素が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、酵素は、１４、１６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、４２４、４３７、および４７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
本明細書で使用される場合、「ＣＥ−７変異体」、「変異体ペルヒドロラーゼ」または「変異体」という用語は、ＣＥ−７シグネチャーモチーフおよび関連の過加水分解活性が保持される限り、変異体が由来する対応する酵素（通常、野生型酵素）と比較したときに少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、および／または置換をもたらす遺伝子改変を有するＣＥ−７ペルヒドロラーゼを指すであろう。ＣＥ−７変異体ペルヒドロラーゼも本発明の組成物および方法において使用することができる。ＣＥ−７変異体の例は、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、４２４、４３７、および４７６として提供される。一実施形態では、変異体は、配列番号２７、２８、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、４２４、４３７、および４７６を含み得る。
当業者は、本発明の組成物および方法において、実質的に類似のＣＥ−７ペルヒドロラーゼ配列（シグネチャーモチーフを保持する）が使用され得ることを認識する。一実施形態では、実質的に類似の配列は、高ストリンジェント条件下で、本明細書において例示される配列に関連する核酸分子とハイブリッド形成するその能力によって定義される。別の実施形態では、配列アライメントアルゴリズムを用い、本明細書において提供されるＤＮＡまたはアミノ酸配列に対する同一性パーセントに基づいて、実質的に類似の酵素を定義することができる。
本明細書で使用される場合、核酸分子は、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で第１の分子の一本鎖が他の分子にアニールすることができる場合に、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸分子と「ハイブリッド形成可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．，Ｔ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（２００１）において例示されている。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件を調整して、中程度に類似した分子（遠縁の生物からの相同配列など）から、高度に類似した分子（近縁の生物から機能酵素を複製する遺伝子など）までをスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、通常、ストリンジェンシー条件を決定する。１つの好ましい条件セットは、６×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより室温で１５分間の洗浄から始ま
り、次に、２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより４５℃で３０分間の洗浄を繰り返し、そして次に、０．２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにより５０℃で３０分間の洗浄を２回繰り返すという一連の洗浄を用いる。より好ましい条件セットはより高温を用い、０．２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳにおける最後の２回の３０分間洗浄の温度を６０℃に上昇させたことを除いて、洗浄は上記のものと同一である。別の好ましい高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件セットは０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃であり、２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳにより洗浄された後、０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、６５℃の最終洗浄が行われる。
ハイブリダイゼーションは２つの核酸が相補的配列を含有することを必要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能である。核酸をハイブリッド形成するために適切なストリンジェンシーは、当該技術分野において周知の変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのためのＴｍの値も大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴｍに相当する）は、以下の順：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡで低下する。長さが１００を超えるヌクレオチドのハイブリッドについては、Ｔｍを計算するための式が誘導されている（上記のＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（上記のＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ）。１つの態様では、ハイブリッド形成可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリッド形成可能な核酸の最小の長さは少なくとも約１５ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドの長さであり、さらにより好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドの長さであり、さらにより好ましくは少なくとも３００ヌクレオチドの長さであり、最も好ましくは少なくとも８００ヌクレオチドの長さである。さらに、当業者は、プローブの長さなどの因子に従って必要であれば、温度および洗浄溶液の塩濃度が調整され得ることを認識するであろう。
本明細書で使用される場合、「同一性パーセント」という用語は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列の間または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該技術分野において、「同一性」は、場合によっては、このような配列のストリング間の一致によって決定されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、「Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８）、「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９３）、「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ」（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９４）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）、ならびに「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ」（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９１）において記載される方法を含むがこれらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて体系化されている。配列アライメントおよび同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ｖ．７
．０のＡｌｉｇｎＸプログラム（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、またはＥＭＢＯＳＳ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ、Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，（６）：２７６−２７７（２０００））を用いて実施され得る。配列の多重アライメントは、アライメントのＣＬＵＳＴＡＬ法（ＣＬＵＳＴＡＬＷ、例えばバージョン１．８３など）（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ、５：１５１−１５３（１９８９）、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０（１９９４）、およびＣｈｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１（１３）：３４９７−５００（２００３））Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅを介してＥｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手可能）を、デフォルトパラメータと共に用いて実施することができる。ＣＬＵＳＴＡＬＷタンパク質アライメントのための適切なパラメータには、ＧＡＰ Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅペナルティー＝１５、ＧＡＰ伸長＝０．２、マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ（例えば、Ｇｏｎｎｅｔ２５０）、タンパク質ＥＮＤＧＡＰ＝−１、タンパク質ＧＡＰＤＩＳＴ＝４、およびＫＴＵＰＬＥ＝１が含まれる。一実施形態では、速いまたは遅いアライメントがデフォルト設定と共に使用されるが、遅いアライメントが好ましい。あるいは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ法（例えば、バージョン１．８３）を用いるパラメータを修正して、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ伸長＝１、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６４）、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＴＯＰ ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５も使用することができる。
１つの態様では、適切な単離核酸分子は、本明細書において報告されるアミノ酸配列と少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。別の態様では、適切な単離核酸分子は、本明細書において報告されるアミノ酸配列と少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも３０％、３３％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするが、ただし、ポリペプチドはＣＥ−７シグネチャーモチーフを保持することを条件とする。適切な核酸分子は上記の相同性を有するだけでなく、通常、約２１０〜３４０のアミノ酸長さ、約３００〜約３４０のアミノ酸長さ、好ましくは約３１０〜約３３０のアミノ酸長さ、最も好ましくは約３１８〜約３２５のアミノ酸長さを有するポリペプチドもコードし、各ポリペプチドは、過加水分解活性を有すると特徴付けられる。
標的化ペルヒドロラーゼ
本明細書で使用される場合、「標的化ペルヒドロラーゼ」および「過加水分解活性を有する標的化酵素」という用語は、標的表面、好ましくは標的化体表面に対する親和性を有する少なくとも１つのペプチド成分に融合／結合された少なくとも１つの過加水分解酵素（野生型またはその変異体）を含む融合タンパク質を指すであろう。標的化ペルヒドロラーゼ内の過加水分解酵素は任意の過加水分解酵素でよく、酵素が本発明の基質の１つまたは複数に対する過加水分解活性を有する限り、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アリールエステラーゼ、炭水化物エステラーゼ、および組み合わせを含むことができる。例としては、過加水分解プロテアーゼ（例えば、サブチリシン変異体、米国特許第７，５１０，８５９号明細書）、過加水分解エステラーゼ（例えば、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、米国特許第７，３８４，７８７号明細書、配列番号４７７）、および過加水分解アリールエステラーゼ（例えば、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、米国特許第７，７５４，４６０号明細書、国際公開第
２００５／０５６７８２号パンフレット、および欧州特許第１６８９８５９Ｂ１号明細書、配列番号４６０［Ｓ５４Ｖ変異体］および４７８［野生型］）を挙げることができるが、これらに限定されない。
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４６０として提供されるＳ５４Ｖマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）アリールエステラーゼに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する過加水分解酵素を含む。
一実施形態では、融合タンパク質は、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からの過加水分解エステラーゼを含む。別の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４７７として提供されるシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）エステラーゼに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有する過加水分解酵素を含む。
別の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４７６、４７７、４７８、および４７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する過加水分解酵素を含む。
本明細書で使用される場合、「ペプチド成分」、「口腔表面に対する親和性を有するペプチド成分」、および「ＯＣＢＤ」という用語は、ペプチド結合によって連結された２つ以上のアミノ酸の少なくとも１つのポリマーを含む、過加水分解酵素の一部ではない融合タンパク質の成分を指し、ここでこの成分は、標的口腔表面に対する親和性を有するであろう。
一実施形態では、体表面に対する親和性を有するペプチド成分は、抗体、Ｆａｂ抗体断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体、ラクダ科抗体（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．，Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２００１）７４：２７７−３０２）、非抗体スキャフォールドディスプレイタンパク質（種々のスキャフォールド補助によるアプローチの概説については、Ｈｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．（２００６）１５（１）：１４−２７およびＢｉｎｚ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３，１２５７−１２６８）、または免疫グロブリンの折り畳みを欠いた単鎖ポリペプチドであり得る。別の態様では、体表面に対する親和性を有するペプチド成分は、免疫グロブリンの折り畳みを欠いた単鎖ペプチド（すなわち、口腔表面に対する親和性を有する体表面結合ペプチドまたは少なくとも１つの体表面結合ペプチドを含む体表面結合ドメイン）である。好ましい実施形態では、ペプチド成分は、口腔表面に対する親和性を有する１つまたは複数の体表面結合ペプチドを含む単鎖ペプチドである。
口腔表面に対する親和性を有するペプチド成分は、任意的なペプチドリンカーによって過加水分解酵素から分離され得る。特定のペプチドリンカー／スペーサーは、１〜１００または１〜５０のアミノ酸長さである。いくつかの実施形態では、ペプチドスペーサーは、約１〜約２５、３〜約４０、または３〜約３０のアミノ酸長さである。他の実施形態では、約５〜約２０のアミノ酸長さのスペーサーである。多数のペプチドリンカーが使用されてもよい。一実施形態では、少なくとも１つのペプチドリンカーが存在し、最大１０回まで繰り返され得る。
１つの体表面に対する親和性を有することが既に確認されたペプチドは、口腔ケア表面
に対しても親和性を有し得る。従って、融合ペプチドは、毛髪（配列番号６５〜２２１、２７１、および３６８）、皮膚（配列番号２１７〜２６９）または爪（配列番号２７０〜２７１）などの別の体表面に対する親和性を有することが既に報告されている少なくとも１つのペプチドを含むことができる。一実施形態では、融合ペプチドは、配列番号２７２〜３８２および３９９〜４２２を含む群からの少なくとも１つの口腔表面結合ペプチドを含む。一実施形態では、融合ペプチドは、配列番号２７２〜３８２、３９９〜４１０、および４１２〜４２２からなる群から選択される少なくとも１つの口腔表面結合ペプチドを含み、ここで、配列番号２７２〜２９１および３１２〜３８２は歯のペリクルに対する親和性を有し、配列番号２９２〜３１１は歯のエナメル質に対する親和性を有し、そして配列番号３９９〜４１０および４１２〜４２２は歯のエナメル質またはペリクルに対する親和性を有する。体表面結合ペプチドのいくつかは２つ以上の体表面に対して強い親和性を有することができ、従って、過加水分解酵素を異なる体表面に標的化するために使用され得る。別の実施形態では、融合ペプチドは、標的体表面に対して静電引力を有するように設計された任意の体表面結合ペプチド（例えば、標的体表面に静電的に結合するように操作された体表面結合ペプチド）を含むことができる。
別の実施形態では、標的表面は、口腔への送達のパッケージングおよび／または方法の一部である材料である。ペプチド成分は、ポリマー、プラスチックおよびフィルムなどの使用中の材料（単数または複数）に対するその親和性について選択される。標的化ペルヒドロラーゼ融合タンパク質の設計は、限定はされないがマウストレイまたはストリップなどの除去可能なデバイス上にそれを保持することによって、ユーザーからの制御されたペルヒドロラーゼの送達および除去を可能にする。
標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ
好ましい実施形態では、「標的化ペルヒドロラーゼ」は、過加水分解活性を有する標的化ＣＥ−７炭水化物エステラーゼである。本明細書で使用される場合、「標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ」および「標的化ＣＥ−７炭水化物エステラーゼ」という用語は、標的化表面、好ましくは標的化体表面に対する親和性を有する少なくとも１つのペプチド成分に融合／結合された少なくとも１つのＣＥ−７ペルヒドロラーゼ（野生型または変異体ペルヒドロラーゼ）を含む融合タンパク質を指すであろう。体表面に対する親和性を有するペプチド成分は、上記で記載されたもののいずれであってもよい。好ましい態様では、標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ中のペプチド成分は、免疫グロブリンの折り畳みを欠いた単鎖ペプチド（すなわち、口腔表面に対する親和性を有する体表面結合ペプチドまたは少なくとも１つの体表面結合ペプチドを含む体表面結合ドメイン）である。好ましい実施形態では、ペプチド成分は、口腔表面に対する親和性を有する１つまたは複数の体表面結合ペプチドを含む単鎖ペプチドである。
口腔表面に対する親和性を有するペプチド成分は、任意的なペプチドリンカーによってＣＥ−７ペルヒドロラーゼから分離され得る。特定のペプチドリンカー／スペーサーは、１〜１００または１〜５０のアミノ酸長さである。いくつかの実施形態では、ペプチドスペーサーは、約１〜約２５、３〜約４０、または３〜約３０のアミノ酸長さである。他の実施形態では、約５〜約２０のアミノ酸長さのスペーサーである。多数のペプチドリンカーが使用されてもよい。
従って、標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼの例としては、口腔表面に対する親和性を有するペプチド成分に結合された配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、４２４、４３７、および４７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＥ−７ペルヒドロラーゼのいずれかを挙げることができるが、これらに限定されない
。好ましい実施形態では、標的化ペルヒドロラーゼの例として、口腔表面に対する親和性を有する１つまたは複数の体表面結合ペプチドに（場合により、ペプチドスペーサーを介して）結合された配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、４２４、４３７、および４７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣＥ−７ペルヒドロラーゼのいずれかを挙げることができるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼは、１つの体表面に対する親和性を有することが既に確認されており、口腔ケア表面に対しても親和性を有し得るペプチドを含むことができる。従って、融合ペプチドは、毛髪（配列番号６５〜２２１、２７１、および３６８）、皮膚（配列番号２１７〜２６９）、または爪（配列番号２７０〜２７１）などの別の体表面に対する親和性を有することが既に報告されている少なくとも１つのペプチドを含むことができる。一実施形態では、融合ペプチドは、配列番号２７２〜３８２および３９９〜４２２を含む群からの少なくとも１つの口腔表面結合ペプチドを含む。一実施形態では、ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ融合ペプチドは、配列番号２７２〜３８２、３９９〜４１０、および４１２〜４２２からなる群から選択される少なくとも１つの口腔表面結合ペプチドを含み、ここで、配列番号２７２〜２９１および３１２〜３８２は歯のペリクルに対する親和性を有し、配列番号２９２〜３１１は歯のエナメル質に対する親和性を有し、そして配列番号３９９〜４１０および４１２〜４２２は歯のエナメル質またはペリクルに対する親和性を有する。体表面結合ペプチドのいくつかは２つ以上の体表面に対して強い親和性を有することができ、従って、過加水分解酵素を異なる体表面に標的化するために使用され得る。別の実施形態では、ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ融合ペプチドは、標的体表面に対して静電引力を有するように設計された任意の体表面結合ペプチド（例えば、標的体表面に静電的に結合するように操作された体表面結合ペプチド）を含むことができる。
別の実施形態では、標的表面は、口腔へのパッケージングおよび／または送達の一部である材料である。ペプチド成分は、ポリマー、プラスチックおよびフィルムなどの使用中の材料（単数または複数）に対するその親和性について選択される。標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ融合タンパク質の設計は、マウストレイまたはストリップなどの除去可能なデバイス上にそれを保持することによってユーザーからの制御されたペルヒドロラーゼの送達および除去を可能にする。
体表面に対する親和性を有するペプチド
口腔表面に結合することができる免疫グロブリンの折り畳みを欠いた単鎖ペプチドは「口腔表面結合ペプチド」（ＯＣＢＰ）とも呼ばれ、例えば、歯の表面に結合するペプチド（歯結合ペプチド）、歯肉などの軟組織に対する親和性を有するペプチド、または口腔中で使用しても安全である経口的に許容可能な材料に対する親和性を有するペプチドを含むことができる。歯結合ペプチドは、歯のエナメル質に対する親和性を有するペプチド（「歯エナメル質結合ペプチド」）、および歯のペリクルに対する親和性を有するペプチド（「歯ペリクル結合ペプチド」）を含むことができる。
少なくとも１つの体表面に対する親和性を有するペプチドの非限定的な例は本明細書において提供されており、毛髪に対する親和性を有するもの（配列番号６５〜２２１、２７１、および３６８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する毛髪結合ペプチド）、皮膚に対する親和性を有するもの（皮膚結合ペプチドは配列番号２１７〜２６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む）、および爪に対する親和性を有するもの（爪結合ペプチドは配列番号２７０〜２７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む）が含まれる。口腔表面に対する親和性を有するペプチド（口腔結合ペプチド）の例は、配列番
号２７２〜３８２および３９９〜４２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。好ましい態様では、口腔表面に対する親和性を有するペプチドは、配列番号２７２〜３８２、３９９〜４１０、および４１２〜４２２からなる群から選択され、ここで、配列番号２７２〜２９１および３１２〜３８２は歯のペリクルに対する親和性を有し、配列番号２９２〜３１１は歯のエナメル質に対する親和性を有し、そして配列番号３９９〜４１０および４１２〜４２２は歯のエナメル質またはペリクルに対する親和性を有する。
一実施形態では、口腔表面に対する親和性も有し得るペプチドは、配列番号６５〜３８２、３９９〜４１０、および４１２〜４２２の１つまたは複数を含むことができる。好ましくは、本発明の組成物および方法において使用されるペプチドは、配列番号２７２〜３８２、３９９〜４１０、および４１２〜４２２からなる群から選択される。別の実施形態では、口腔表面結合ペプチドは、口腔を有するいくつかの表面（例えば、歯肉）に対する皮膚結合ペプチドを含むことができる。別の実施形態では、融合ペプチドは、標的体表面に対して静電引力を有するように設計された任意の体表面結合ペプチド（例えば、標的体表面に静電的に結合するように操作された体表面結合ペプチド）を含むことができる。
別の実施形態では、本発明の組成物および方法は、配列番号３９９〜４１０および４１２〜４２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの口腔表面結合ペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、口腔表面結合ドメインは、約６０までのアミノ酸長さである口腔表面結合ペプチドで構成される。一実施形態では、口腔表面結合ペプチドは、５〜６０のアミノ酸長さである。他の実施形態では、表面結合ペプチドは、７〜５０のアミノ酸長さ、または７〜３０のアミノ酸長さである。さらに他の実施形態では、７〜２７のアミノ酸長さである口腔表面結合ペプチドである。
口腔表面結合ペプチドを含む融合ペプチドは本発明の特定の実施形態であるが、本発明の他の実施形態では複数の口腔表面結合ペプチドを使用することが有利であり得る。複数、すなわち２つ以上の口腔表面結合ペプチドを包含すると、例えば、単一の口腔表面結合ペプチドを含む結合要素よりもさらにより耐久性であるペプチド成分を提供することができる。いくつかの実施形態では、口腔表面結合ドメイン（すなわち、複数、すなわち２つ以上の口腔表面結合ペプチド）は、２〜約５０または２〜約２５の口腔表面結合ペプチドを含む。他の実施形態は、２〜約１０または２〜５の口腔表面結合ペプチドを含む口腔表面結合ドメインを含む。
複数の結合要素（すなわち、口腔表面結合ペプチドまたは口腔表面結合ドメイン）は、直接結合されていてもよいし、あるいはペプチドスペーサーを用いて結合されていてもよい。特定のペプチドスペーサー／リンカーは、１〜１００または１〜５０のアミノ酸長さである。いくつかの実施形態では、ペプチドスペーサーは、約１〜約２５、３〜約４０、または３〜約３０のアミノ酸長さである。他の実施形態では、１〜約２０、または約５〜約２０のアミノ酸長さのスペーサーである。
口腔表面結合ドメイン、およびこれらを構成するより短い口腔表面結合ペプチドは、例えば、ファージディスプレイ、細菌ディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、およびこれらの組み合わせなどの任意の既知のバイオパニング技術を含む、当業者に既知のいくつもの方法を用いて同定することができる。通常、ランダムまたは実質的にランダムな（バイアスが存在する場合）ペプチドライブラリーが標的体表面に対してバイオパニングされ、標的体表面に対する親和性を有するライブラリー内のペプチドが同定される。
ペプチドのランダムライブラリーの生成は周知であり、細菌ディスプレイ（Ｋｅｍｐ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８（７）：４５２０−４５２４（１９８１）、およびＨｅｌｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０（１）：３１−３５，（１９８３））、酵母ディスプレイ（Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８（２１）：９５７８−８２（１９９１））、コンビナトリアル固相ペプチド合成（米国特許第５，４４９，７５４号明細書、米国特許第５，４８０，９７１号明細書、米国特許第５，５８５，２７５号明細書、米国特許第５，６３９，６０３号明細書）、およびファージディスプレイ技術（米国特許第５，２２３，４０９号明細書、米国特許第５，４０３，４８４号明細書、米国特許第５，５７１，６９８号明細書、米国特許第５，８３７，５００号明細書）、リボソームディスプレイ（米国特許第５，６４３，７６８号明細書、米国特許第５，６５８，７５４号明細書、および米国特許第７，０７４，５５７号明細書）、およびｍＲＮＡディスプレイ技術（ＰＲＯＦＵＳＩＯＮ（商標）、米国特許第６，２５８，５５８号明細書、同第６，５１８，０１８号明細書、同第６，２８１，３４４号明細書、同第６，２１４，５５３号明細書、同第６，２６１，８０４号明細書、同第６，２０７，４４６号明細書、同第６，８４６，６５５号明細書、同第６，３１２，９２７号明細書、同第６，６０２，６８５号明細書、同第６，４１６，９５０号明細書、同第６，４２９，３００号明細書、同第７，０７８，１９７号明細書、および同第６，４３６，６６５号明細書を参照）を含む様々な技術によって達成することができる。
結合親和性
口腔表面に対する親和性を有するペプチド成分は、１０−５モル濃度（Ｍ）以下の口腔表面に対する結合親和性を含む。特定の実施形態では、ペプチド成分は、１０−５モル濃度（Ｍ）以下のヒト毛髪、皮膚、爪または口腔に対する結合親和性を有する１つまたは複数の口腔表面結合ペプチドおよび／または結合ドメインである。いくつかの実施形態では、結合ペプチドまたはドメインは、少なくとも約５０〜５００ｍＭの塩の存在下で１０−５Ｍ以下の結合親和性値を有するであろう。「結合親和性」という用語は、結合ペプチドと、そのそれぞれの基質、この場合はヒト口腔表面（歯肉、歯など）との相互作用の強度を指す。結合親和性は、結合ペプチドの解離定数（「ＫＤ」）、または「ＭＢ５０」に関して定義または判断することができる。
「ＫＤ」は、標的上の結合部位の半分が占有される、すなわち、ペプチド結合を有する標的（結合標的材料）の濃度がペプチド結合を有さない標的の濃度と等しい場合のペプチドの濃度に相当する。解離定数が小さいほど、ペプチドはより堅く結合される。例えば、ナノモル濃度（ｎＭ）の解離定数を有するペプチドは、マイクロモル濃度（μＭ）の解離定数を有するペプチドよりも堅く結合する。本発明の特定の実施形態は１０−５以下のＫＤ値を有するであろう。
「ＭＢ５０」は、ＥＬＩＳＡに基づいたアッセイにおいて得られる最大シグナルの５０％であるシグナルを与える結合ペプチドの濃度を指す。例えば、参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２００５／０２２６８３号明細書の実施例３を参照されたい。ＭＢ５０は、複合体の成分の結合相互作用または親和性の強度の表示を提供する。ＭＢ５０の値が低いほど、ペプチドとその対応する基質との相互作用はより強い、すなわち「より良い」。例えば、ナノモル濃度（ｎＭ）のＭＢ５０を有するペプチドは、マイクロモル濃度（μＭ）のＭＢ５０を有するペプチドよりも堅く結合する。本発明の特定の実施形態は、１０−５Ｍ以下のＭＢ５０値を有するであろう。
いくつかの実施形態では、口腔表面に対する親和性を有するペプチド成分は、ＫＤまたはＭＢ５０値により測定される場合に、約１０−５Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、または約１０−９Ｍ以下、または約１０−１０Ｍ以下の結
合親和性を有することができる。
いくつかの実施形態では、口腔表面結合ペプチドおよび／または口腔表面結合ドメインは、ＫＤまたはＭＢ５０値により測定される場合に、約１０−５Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約１０−７Ｍ以下、約１０−８Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、約１０−１０Ｍ以下の結合親和性を有することができる。
本明細書で使用される場合、「強い親和性」という用語は、約１０−５Ｍ以下、好ましくは約１０−６Ｍ以下、より好ましくは約１０−７Ｍ以下、より好ましくは約１０−８Ｍ以下、約１０−９Ｍ以下、または最も好ましくは約１０−１０Ｍ以下のＫＤまたはＭＢ５０値を有する結合親和性を指すであろう。
多成分ペルオキシカルボン酸発生系
複数の活性成分を分離および結合するための系および手段の設計は当該技術分野において知られており、通常、個々の反応成分の物理的な形態に依存し得る。例えば、複数の活性流体（液体−液体）系は、通常、反応性流体を混合したときに所望の漂白剤が生成されるいくつかの漂白用途において見出されるような、マルチチャンバディスペンサーボトルまたは２相系を使用する（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１３９６０８号明細書、米国特許第５，３９８，８４６号明細書、米国特許第５，６２４，６３４号明細書、米国特許第６，３９１，８４０号明細書、欧州特許第０８０７１５６Ｂ１号明細書、米国特許出願公開第２００５／０００８５２６号明細書、およびＰＣＴ公報の国際公開第００／６１７１３号パンフレット）。ペルオキシカルボン酸を発生させるために使用される多成分系の他の形態には、粉末（例えば、米国特許第５，１１６，５７５号明細書）、多層錠剤（例えば、米国特許第６，２１０，６３９号明細書）、多数のコンパートメントを有する水溶性パケット（例えば、米国特許第６，９９５，１２５号明細書）および水が添加されると反応する固体凝集体（例えば、米国特許第６，３１９，８８８号明細書）などの、１つまたは複数の固体成分または固体−液体成分の組み合わせのために設計されたものが含まれ得るが、これらに限定されない。
別の実施形態では、第１の成分中のカルボン酸エステルは、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。別の実施形態では、第１の成分中のカルボン酸エステルは、アセチル化糖類である。別の実施形態では、第１の成分中の酵素触媒は、微粒子固体、液体またはジェルであり得る。別の実施形態では、第１の反応成分は、固体錠剤または粉末であり得る。
ペルオキシカルボン酸は非常に反応性であり、通常、時間が経つと濃度が低下する。これは特に、長期安定性を欠いていることが多い市販の予備成形されたペルオキシカルボン酸組成物に当てはまる。予備成形されたペルオキシカルボン酸の水溶液は、特に、大型容器および／または高度に濃縮されたペルオキシカルボン酸溶液をより長距離にわたって輸送する場合に、取扱いおよび／または輸送の難点も示し得る。さらに、予備成形されたペルオキシカルボン酸溶液は、特定の標的用途に対して所望の濃度のペルオキシカルボン酸を提供することができないことがある。従って、特に液体製剤の場合に、種々の反応成分を分離して保持することが非常に望ましい。
所望のペルオキシカルボン酸を生成するために混ぜ合わせられる２つ以上の成分を含む多成分ペルオキシカルボン酸発生系の使用は報告されている。個々の成分は取扱いが安全で、長期間安定（すなわち、混合したときに生成されるペルオキシカルボン酸の濃度により測定される場合に）でなければならない。一実施形態では、多成分酵素ペルオキシカルボン酸発生系の貯蔵安定性は、酵素触媒の安定性に関して評価することができる。
所望のペルオキシカルボン酸濃度を有する水性過酸溶液を急速に生成するために酵素触媒を使用する多成分ペルオキシカルボン酸発生製剤を含むパーソナルケア製品が本明細書において提供される。混合は使用の直前に、そして／あるいは適用部位において（その場で）起こり得る。一実施形態では、パーソナルケア製品製剤は、使用されるまで分離して保持される少なくとも２つの成分で構成され得る。成分の混合は、水性過酸溶液を急速に形成する。各成分は、得られる水性過酸溶液が、意図される最終用途に適した効果的な過酸濃度を含むように設計される。個々の成分の組成は、（１）長期の貯蔵安定性を提供するように、そして／あるいは（２）ペルオキシカルボン酸で構成される適切な水性反応製剤の形成を高める能力を提供するように設計されなければならない。
多成分製剤は、少なくとも２つの実質的に液体の成分で構成され得る。一実施形態では、多成分製剤は、第１の液体成分および第２の液体成分を含む２成分製剤であり得る。「第１」または「第２」の液体成分という用語の使用は相対的であるが、ただし、特定の材料を含む２つの異なる液体成分は使用されるまで分離して保持されるものとする。最低でも、多成分ペルオキシカルボン酸製剤は、（１）過加水分解活性を有する少なくとも１つの酵素触媒（前記少なくとも１つの酵素は、好ましくは、ＣＥ−７エステラーゼに分類される）と、（２）カルボン酸エステル基質と、（３）過酸素源および水とを含み、成分が混ぜ合わせられると製剤は所望の過酸を酵素的に生成する。
２成分製剤において使用される種々の原料のタイプおよび量は、（１）各成分、特に酵素触媒の過加水分解活性の貯蔵安定性と、（２）溶解度および／または所望の水性ペルオキシカルボン酸溶液を効果的に形成する能力を増強する物理特性とを提供するように慎重に選択され、バランスがとられるべきである（例えば、水性反応混合物中のエステル基質の溶解度を増強する原料、および／または液体成分［すなわち、酵素的な過加水分解活性に著しい悪影響を与えない少なくとも１つの共溶媒］の少なくとも１つの粘度および／濃度を変更する原料）。
酵素的な過酸発生系の性能および／または触媒安定性を改善するために種々の方法が開示されている。米国特許出願公開第２０１０−００４８４４８Ａ１号明細書には、特定のエステル基質の溶解度および／または混合特性を増強するために少なくとも１つの共溶媒の使用が記載されている。本発明のパーソナルケア組成物および方法も、共溶媒を使用することができる。一実施形態では、カルボン酸エステル基質およびペルヒドロラーゼ触媒を含む成分は、約２未満のＬｏｇ Ｐ値を有する有機溶媒を含む。ここで、Ｌｏｇ Ｐは、Ｐ＝［溶質］オクタノール／［溶質］水で表される、オクタノールと水の間の物質の分配係数の対数であると定義される。酵素活性に著しい悪影響を与えない、２以下のＬｏｇ
Ｐ値を有するいくつかの共溶媒が記載されている。別の実施形態では、共溶媒は、カルボン酸エステル基質および酵素を含む反応成分内の約２０重量％〜約７０重量％である。カルボン酸エステル基質および酵素を含む反応成分は、場合により、１つまたは複数の緩衝液（例えば、重炭酸、クエン酸、酢酸、リン酸、ピロリン酸、メチルホスホン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、およびマレイン酸のナトリウムおよび／またはカリウム塩）を含んでいてもよい。
米国特許出願公開第２０１０−００８６５３４Ａ１号明細書には２成分系の使用が記載されており、第１の成分は、液体カルボン酸エステルおよび固体酵素粉末の製剤を含み、前記酵素粉末は、（ａ）過加水分解活性を有する少なくとも１つのＣＥ−７エステラーゼ、および（ｂ）少なくとも１つのオリゴ糖賦形剤の製剤を含み、第２の成分は、過酸素源および過酸化水素安定剤を有する水を含む。本発明のパーソナルケア組成物および方法は、米国特許出願公開第２０１０−００８６５３４Ａ１号明細書に記載される系と同様の２成分製剤を使用することができる。従って、オリゴ糖賦形剤は、酵素活性の安定化を促進するために使用され得る。一実施形態では、オリゴ糖賦形剤は、少なくとも約１２５０の
数平均分子量および少なくとも約９０００の重量平均分子量を有し得る。別の実施形態では、オリゴ糖賦形剤は、少なくとも約１７００の数分子量および少なくとも約１５０００の重量平均分子量を有し得る。別の実施形態では、オリゴ糖はマルトデキストリンである。
米国特許出願公開第２０１０−００８６５３５−Ａ１号明細書にも２成分系が記載されており、第１の成分は、液体カルボン酸エステルおよび固体酵素粉末の製剤を含み、前記製剤は、（ａ）過加水分解活性を有する少なくとも１つのＣＥ−７エステラーゼおよび少なくとも１つのオリゴ糖賦形剤および少なくとも１つの界面活性剤を含む酵素粉末と、（ｂ）少なくとも１つの緩衝液（好ましい実施形態では、緩衝液は別箇の（すなわち、酵素粉末から分離されている）不溶性成分としてカルボン酸エステル基質に添加される）とを含み、第２の成分は、過酸素源および過酸化水素安定剤を有する水を含む。本発明のパーソナルケア組成物および方法は、米国特許出願公開第２０１０−００８６５３５Ａ１号明細書に記載される系と同様の２成分製剤を使用することができる。一実施形態では、賦形剤は、少なくとも約１２５０の数平均分子量および少なくとも約９０００の重量平均分子量を有するオリゴ糖賦形剤であり得る。別の実施形態では、オリゴ糖賦形剤は、少なくとも約１７００の数平均分子量および少なくとも約１５０００の重量平均分子量を有し得る。別の実施形態では、オリゴ糖はマルトデキストリンである。さらなる実施形態では、任意的なｐＨ緩衝液は重炭酸緩衝液である。またさらなる実施形態では、過酸化水素安定剤はＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬである。
酵素粉末
いくつかの実施形態では、パーソナルケア組成物は、安定化酵素粉末の形態の酵素触媒を使用し得る。酵素粉末を含む製剤を製造および安定化するための方法は、米国特許出願公開第２０１０−００８６５３４号明細書および同第２０１０−００８６５３５号明細書に記載されている。
一実施形態では、酵素は、酵素粉末の乾燥重量を基準として約５重量パーセント（重量％）〜約７５重量％の範囲の量で酵素粉末中に存在し得る。酵素粉末／噴霧乾燥混合物中の酵素の好ましい重量パーセント範囲は約１０重量％〜５０重量％であり、酵素粉末／噴霧乾燥混合物中の酵素のより好ましい重量パーセント範囲は、約２０重量％〜３３重量％である。
一実施形態では、酵素粉末は、さらに、賦形剤を含むことができる。１つの態様では、賦形剤は、酵素粉末の乾燥重量を基準として、約９５重量％〜約２５重量％の範囲の量で提供される。酵素粉末中の賦形剤の好ましい重量％範囲は約９０重量％〜５０重量％であり、酵素粉末中の賦形剤のより好ましい重量％範囲は、約８０重量％〜６７重量％である。
一実施形態では、酵素粉末を調製するために使用される賦形剤は、オリゴ糖賦形剤であり得る。一実施形態では、オリゴ糖賦形剤は、少なくとも約１２５０の数平均分子量および少なくとも約９０００の重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、オリゴ糖賦形剤は、少なくとも約１７００の数平均分子量および少なくとも約１５０００の重量平均分子量を有する。特定のオリゴ糖としては、マルトデキストリン、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナン、キトサン、ラフィノース、スタキオース、ペクチン、インスリン、レバン、グラミナン、アミロペクチン、スクロース、ラクツロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、ニゲロトリオース、マルトトリオース、メレジトース、マルトトリウロース、ラフィノース、ケストース、およびこれらの混合物を挙げることができるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、オリゴ糖賦形剤はマルトデキストリンである。またオリゴ糖ベースの賦形剤としては、ヒドロキシメ
チル−セルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース、ならびにこれらの混合物などの水溶性の非イオン性セルロースエーテルも挙げることができるが、これらに限定されない。またさらなる実施形態では、賦形剤は、以下の化合物：トレハロース、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、グルコース、セロビオース、α−シクロデキストリン、およびカルボキシメチルセルロースのうちの１つまたは複数から選択することができるが、これらに限定されない。
製剤は少なくとも１つの任意選択的な界面活性剤を含んでいてもよく、少なくとも１つの界面活性剤の存在が好ましい。界面活性剤には、エトキシ化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポロキサマー、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン誘導体、モノグリセリドまたはそのエトキシ化誘導体、ジグリセリドまたはそのポリオキシエチレン誘導体、ナトリウムドクサート、ラウリル硫酸ナトリウム、コール酸またはその誘導体、レシチン、リン脂質、エチレングリコールおよびプロピレングリコールのブロックコポリマー、ならびに非イオン性有機ケイ素（ｏｒｇａｎｏｓｉｌｉｃｏｎｅｓ）などのイオン性および非イオン性の界面活性剤または湿潤剤が含まれ得るが、これらに限定されない。好ましくは、界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリソルベート８０がより好ましい。
製剤が酵素粉末を含む場合、粉末を調製するために使用される界面活性剤は、酵素粉末中に存在するタンパク質の重量を基準として約５重量％〜０．１重量％の範囲、好ましくは、酵素粉末中に存在するタンパク質の重量を基準として約２重量％〜０．５重量％の範囲の量で存在し得る。
酵素粉末はさらに、１つまたは複数の緩衝液（例えば、重炭酸、クエン酸、酢酸、リン酸、ピロリン酸、メチルホスホン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、およびマレイン酸のナトリウムおよび／またはカリウム塩）と、酵素安定剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸、（１−ヒドロキシエチリデン）ビスホスホン酸））とを含んでいてもよい。
酵素粉末を形成するための製剤の噴霧乾燥は、例えば、「Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｉｎｇ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」，５ｔｈ ｅｄ．，Ｋ．Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）、およびＰＣＴ特許公報の国際公開第９７／４１８３３号パンフレットおよび国際公開第９６／３２１４９号パンフレット（Ｐｌａｔｚ，Ｒ．ら）において概略的に記載されるように行われる。
一般に、噴霧乾燥は、高度に分散された液体と、十分な体積の温風とを結びつけて、液滴の蒸発および乾燥を生じることからなる。通常、原料は暖かいろ過空気の流れの中に噴霧され、溶媒が蒸発されて、乾燥された生成物がコレクターに搬送される。次に、使用済みの空気は溶媒と共に排出される。当業者は、所望の生成物を提供するためにいくつかの異なるタイプの装置が使用され得ることを認識するであろう。例えば、Ｂｕｃｈｉ Ｌｔｄ．（Ｐｏｓｔｆａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）またはＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｃｏｒｐ．（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）によって製造される市販の噴霧乾燥器は、所望のサイズの粒子を効果的に生成するであろう。さらに、これらの噴霧乾燥器、特にそのアトマイザーは、ダブルノズル技術を用いて、２つの溶液の同時噴霧などの特殊な用途のために変更またはカスタマイズされ得ることが認識されるであろう。より具体的には、油中水エマルションを１つのノズルから微粒化し、マンニトールなどの抗接着剤を含有する溶液を第２のノズルから同時に微粒化することができる。他の場合には、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）ポンプを用いて特注設計のノズルから原料溶液を押出すのが望ましいこともある。正しいモルホロジーおよび／または組成を含む微細構造が生成される
とすれば、装置の選択は重要ではなく、本明細書における教示を考慮すれば当業者には明らかであろう。
噴霧される材料を乾燥するために使用されるガスの入口および出口の温度はいずれも、噴霧される材料中の酵素の分解を引き起こさないような温度である。このような温度は通常実験的に決定されるが、一般に、入口温度は約５０℃〜約２２５℃の範囲であり、出口温度は約３０℃〜約１５０℃の範囲であろう。好ましいパラメータには、約２０〜１５０ｐｓｉ（０．１４ＭＰａ〜１．０３ＭＰａ）の範囲、好ましくは約３０〜４０から１００ｐｓｉ（０．２１〜０．２８ＭＰａから０．６９ＭＰａ）の範囲の微粒化圧力が含まれる。通常、使用される微粒化圧力は、以下の（ＭＰａ）０．１４、０．２１、０．２８、０．３４、０．４１、０．４８、０．５５、０．６２、０．６９、０．７６、０．８３またはそれ以上のうちの１つであろう。
一実施形態では、「実質的にその酵素活性を保持する」は、カルボン酸エステルおよび酵素粉末で構成される製剤において、周囲温度で長い貯蔵期間の後、および／または高温（周囲温度よりも高い）で短い貯蔵期間の後、酵素粉末またはカルボン酸エステル中の酵素粉末の製剤が、カルボン酸エステルおよび酵素粉末で構成される製剤を調製する前の酵素粉末の初期酵素活性と比較して、酵素粉末または酵素粉末の製剤中の酵素の酵素活性の少なくとも約７５パーセントを保持することを意味する。長い貯蔵期間は、周囲温度で約１年〜約２年の期間である。一実施形態では、高温における短い貯蔵期間は、カルボン酸エステルおよび酵素粉末で構成される製剤が４０℃で生成されたときから４０℃で約８週間までの期間である。別の実施形態では、高温は、約３０℃〜約５２℃の範囲である。好ましい実施形態では、高温は、約３０℃〜約４０℃の範囲である。
いくつかの実施形態では、カルボン酸エステルおよび酵素粉末で構成される製剤において４０℃で８週間の貯蔵の後、酵素粉末は、４０℃でカルボン酸エステルおよび酵素粉末で構成される製剤を調製する前の酵素粉末の初期酵素活性と比較して、酵素活性の少なくとも７５パーセントを保持する。他の実施形態では、カルボン酸エステルおよび酵素粉末で構成される製剤において４０℃で８週間の貯蔵の後、酵素粉末は、４０℃でカルボン酸エステルおよび酵素粉末で構成される製剤を調製する前の酵素粉末の初期酵素活性と比較して、少なくとも１つの酵素の酵素活性の少なくとも７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセントを保持する。好ましくは、過加水分解活性は、米国特許出願公開第２０１０−００８６５１０号明細書の実施例８〜１３に記載されるように測定されるが、過加水分解活性の任意の測定方法が使用され得る。
規定される期間にわたる酵素活性のさらなる改善は、米国特許出願公開第２０１０−００８６５３４号明細書に記載されるように、カルボン酸エステルおよび噴霧乾燥された酵素粉末で構成される製剤に、約５．５〜約９．５のｐＨ範囲において緩衝能力を有する緩衝液を添加することによって達成することができる。適切な緩衝液としては、重炭酸、ピロリン酸、リン酸、メチルホスホン酸、クエン酸、酢酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、マレイン酸またはコハク酸のナトリウム塩、カリウム塩、またはナトリウムもしくはカリウム塩の混合物を挙げることができるが、これらに限定されない。カルボン酸エステルおよび噴霧乾燥酵素粉末で構成される製剤において使用するために好ましい緩衝液には、重炭酸、ピロリン酸、リン酸、メチルホスホン酸、クエン酸、酢酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸塩、マレイン酸またはコハク酸のナトリウム塩、カリウム塩、またはナトリウムもしくカリウム塩の混合物が含まれる。
カルボン酸エステルおよび酵素粉末製剤中に緩衝液が存在し得る実施形態では、緩衝液は、カルボン酸エステルおよび酵素粉末で構成される製剤中のカルボン酸エステルの重量
を基準として、約０．０１重量％〜約５０重量％の範囲の量で存在することができる。緩衝液は、カルボン酸エステルおよび酵素粉末で構成される製剤中のカルボン酸エステルの重量を基準として、約０．１０％〜約１０％のより好ましい範囲で存在し得る。さらに、これらの実施形態では、酵素の過加水分解活性間の比較は、カルボン酸エステル、約５．５〜約９．５のｐＨ範囲で緩衝能力を有する緩衝液、および酵素粉末で構成される製剤において４０℃で８週間の貯蔵の後、カルボン酸エステル、約５．５〜約９．５のｐＨ範囲で緩衝能力を有する緩衝液、および酵素粉末で構成される製剤を調製する前の酵素粉末の初期過加水分解活性と比較して、少なくとも１つの酵素の過加水分解活性の少なくとも７５パーセントを保持する酵素粉末の間で決定される。
乾燥酵素粉末は、トリアセチンなどの少なくとも１つの酵素のための基質である有機化合物中の製剤として貯蔵されることが意図される。添加される過酸化水素の非存在下で、トリアセチンは、通常、水溶液中でＣＥ−７炭水化物エステラーゼにより加水分解されて、ジアセチンおよび酢酸を生成し、酢酸の生成は、反応混合物のｐＨの低下を引き起こす。トリアセチン中の酵素の長期間の貯蔵安定性の１つの要件は、トリアセチンと、トリアセチン中に存在し得る任意の水との有意の反応が存在しないことであり、１つの市販のトリアセチン（Ｔｅｓｓｅｎｄｅｒｌｏ Ｇｒｏｕｐ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍにより供給される）中の含水量についての仕様は、０．０３重量％の水（３００ｐｐｍ）である。トリアセチン中での酵素の貯蔵中に生じるトリアセチンの任意の加水分解は、ＣＥ−７ペルヒドロラーゼの活性の低下または不活性化を引き起こし得る酢酸を生成し得る。ペルヒドロラーゼは、通常、５．０以下のｐＨで不活性化される（米国特許出願公開第２００９−０００５５９０号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏ，Ｒ．らを参照）。本出願において使用するために選択される賦形剤は、製剤中の低濃度の水のために酢酸が発生され得る条件下で、酵素のための有機基質中における酵素の安定性を提供しなければならない。製剤が賦形剤および１つまたは複数の緩衝液（例えば、重炭酸、クエン酸、酢酸、リン酸、ピロリン酸、メチルホスホン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、およびマレイン酸のナトリウムおよび／またはカリウム塩）をさらに含む場合、乾燥酵素粉末は、少なくとも１つの酵素のための基質である有機化合物中の製剤として貯蔵することができる。
カルボン酸エステルおよび過酸化水素から酵素触媒により過酸を調製するための適切な反応条件
過加水分解活性を有する１つまたは複数の酵素を使用して、本発明のパーソナルケア組成物および方法において、有効濃度の所望の過酸を発生させることができる。所望のペルオキシカルボン酸は、過加水分解活性を有する酵素触媒の存在下で、カルボン酸エステルと、過酸素源（過酸化水素、過酸化亜鉛、過酸化ナトリウム、過酸化尿素、過酸化カルシウム、過ホウ酸ナトリウム、過炭酸ナトリウムまたは過酸化水素の錯体を含むがこれらに限定されない）とを反応させることによって調製され得る。
標的化ペルヒドロラーゼ内の過加水分解酵素は任意の過加水分解酵素でよく、酵素が本発明の基質の１つまたは複数に対する過加水分解活性を有する限り、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アリールエステラーゼ、炭水化物エステラーゼ、および組み合わせを含むことができる。例としては、過加水分解プロテアーゼ（サブチリシン変異体、米国特許第７，５１０，８５９号明細書）、過加水分解エステラーゼ（シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、米国特許第７，３８４，７８７号明細書、「Ｌ２９Ｐ」変異体配列番号４７７）、および過加水分解アリールエステラーゼ（マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、米国特許第７，７５４，４６０号明細書、国際公開第２００５／０５６７８２号パンフレット、および欧州特許第１６８９８５９Ｂ１号明細書、配列番号４６０［Ｓ５４Ｖ変異体］および４７８［野生型］）を挙げることができるが、これらに限定されない。
一実施形態では、酵素触媒はペルヒドロラーゼ活性を有する少なくとも１つの酵素を含み、前記酵素は、構造的にいくつかのＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリー（ＣＥ−７、上記のＣｏｕｔｉｎｈｏ，Ｐ．Ｍ．およびＨｅｎｒｉｓｓａｔ，Ｂ．を参照）に分類される。別の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、構造的にセファロスポリンＣデアセチラーゼに分類される。別の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、構造的にアセチルキシランエステラーゼに分類される。
一実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、過加水分解活性と、
ａ）配列番号２のアミノ酸残基１１８〜１２０とアラインするＲＧＱモチーフ、
ｂ）配列番号２のアミノ酸残基１７９〜１８３とアラインするＧＸＳＱＧモチーフ、および
ｃ）配列番号２のアミノ酸残基２９８〜２９９とアラインするＨＥモチーフ
を含むシグネチャーモチーフとを有する酵素を含む。
好ましい実施形態では、参照配列番号２に対するアライメントはＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて実施される。
さらなる実施形態では、ＣＥ−７シグネチャーモチーフはさらに、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて参照配列の配列番号２にアラインされたときに、アミノ酸残基２６７〜２６９においてＬＸＤモチーフと定義される付加的な（すなわち、第４の）モチーフを含むことができる。
別の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒はペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を含み、前記酵素は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、４２４、４３７、および４７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒はペルヒドロラーゼ活性を有する酵素を含み、前記酵素は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、４２４、４３７、および４７６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ここで、シグネチャーモチーフが保存され、ペルヒドロラーゼ活性が保持される限り、前記酵素は１つまたは複数の付加、欠失、または置換を有していてもよい。
上記のように、ＣＥ−７ペルヒドロラーゼは、ペルヒドロラーゼが所望の体表面に「標的化される」ように、ＣＥ−７ペルヒドロラーゼを含む第１の部分と、標的体表面に対する親和性を有するペプチド成分を含む第２の部分とを有する融合タンパク質であり得る。一実施形態では、任意のＣＥ−７ペルヒドロラーゼ（ＣＥ−７シグネチャーモチーフの存在によって定義される）は、酵素を体表面に標的化することができる任意のペプチド成分／結合要素に融合され得る。１つの態様では、口腔表面に対する親和性を有するペプチド成分は、抗体、抗体断片（Ｆａｂ）、ならびに単鎖可変断片（ｓｃＦｖ、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合物）、単一ドメインラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）抗体、スキャフォールドディスプレイタンパク質、および免疫グロブリンの折り畳みを欠いた単鎖親和性ペプチドを含むことができる。抗体、抗体断片および他の免疫グロブリン由来の結合要素、ならびに大型スキャフォールドディスプレイタンパク質を含む組成物は、多くの場合、経済的に実行可能ではない。従って、好ましい態様では、ペプチド成分／結合要素は、免疫グロブリンの折り畳みおよび／または免疫グロブリンドメ
インを欠いた単鎖親和性ペプチドである。短い単鎖体表面結合ペプチドは実験的に生成されてもよいし（例えば、負帯電表面に標的化された正帯電ポリペプチド）、あるいは標的体表面に対するバイオパニングを用いて生成されてもよい。いくつものディスプレイ技術（例えば、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイ、リボソームディスプレイ、およびｍＲＮＡディスプレイ）を用いて親和性ペプチドを同定する／得るための方法は、当該技術分野においてよく知られている。個々の口腔表面結合ペプチドは、より大きい結合「ドメイン」（本明細書では、結合「ハンド」とも呼ばれる）を形成して過加水分解酵素の標的口腔表面への付着／局在化を高めるために、任意的なスペーサー／リンカーを介して結合されてもよい。
融合タンパク質は、ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ酵素と口腔表面結合ドメインとを分離し、そして／あるいは異なる口腔表面結合ペプチド間を分離する（例えば、より大きい標的口腔表面結合ドメインを形成するために複数の口腔表面結合ペプチドが結合されている場合）、１つまたは複数のペプチドリンカー／スペーサーを含むこともできる。多数のペプチドリンカー／スペーサーが存在してもよく、リンカーの数は最大１０回まで繰り返され得る。例示的なペプチドスペーサーの非限定的なリストは、配列番号３８３〜３９６のアミノ酸配列および表５に示される配列によって提供される。
口腔表面に対する親和性を有する適切なペプチドは、本明細書において上記で記載されている。上記の「ディスプレイ」技術のいずれかを用いて追加の口腔表面結合ペプチドを同定するための方法はよく知られており、追加の口腔表面結合ペプチドを同定するために使用することができる。
適切なカルボン酸エステル基質は、以下の式を有するエステルを含むことができる：
（ａ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、
Ｘは、式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６は、場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６がＣ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５は、場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有する１つまたは複数のエステル、あるいは
（ｂ）構造
Figure 0006410786
 （式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有する１つまたは複数のグリセリド、あるいは
（ｃ）式
Figure 0006410786
 （式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、あるいは
（ｄ）１つまたは複数のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類、またはアセチル化多糖類、あるいは
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせ。
適切な基質は、アシル化単糖類、二糖類、および多糖類からなる群から選択される１つまたは複数のアシル化糖類を含むこともできる。別の実施形態では、アシル化糖類は、アセチル化キシラン、アセチル化キシランの断片、アセチル化キシロース（キシローステトラアセテートなど）、アセチル化グルコース（α−Ｄ−グルコースペンタアセテート、β−Ｄ−グルコースペンタアセテート、１−チオ−β−Ｄ−グルコース−２，３，４，６−テトラアセテートなど）、β−Ｄ−ガラクトースペンタアセテート、ソルビトールヘキサアセテート、スクロースオクタアセテート、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，４−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカール、β−Ｄ−キシロフラノーステトラアセテート、α−Ｄ−グルコピラノースペンタアセテート、β−Ｄ−グルコピラノース−１，２，３，４−テトラアセテート、β−Ｄ−グルコピラノース−２，３，４、６−テトラアセテート、２−アセトアミド−２−デオキシ−１，３，４，６−テトルアセチル−β−Ｄ−グルコピラノース、２−アセトアミド−２−デオキシ−３，４，６−トリアセチル−１−クロリド−α−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−マンノピラノースペンタアセテート、およびアセチル化セルロースからなる群から選択される。好ましい実施形態では、アセチル化糖類は、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカール、スクロースオクタアセテート、およびアセチル化セルロースからなる群から選択される。
別の実施形態では、付加的な適切な基質は、５−アセトキシメチル−２−フルアルデヒド、３，４−ジアセトキシ−１−ブテン、４−アセトキシ安息香酸（ａｃｅｔｏｘｙｂｅｎｅｚｏｉｃ ａｃｉｄ）、酢酸バニリン、プロピレングリコールメチルエーテルアセテート、乳酸メチル、乳酸エチル、グリコール酸メチル、グリコール酸エチル、メトキシ酢酸メチル、メトキシ酢酸エチル、３−ヒドロキシ酪酸メチル、３−ヒドロキシ酪酸エチル、および２−アセチルクエン酸トリエチルも含むことができる。
別の実施形態では、適切な基質は、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプ
ロピオニン、ジプロピオニン、トリプロピオニン、モノブチリン、ジブチリン、トリブチリン、グルコースペンタアセテート、キシローステトラアセテート、アセチル化キシラン、アセチル化キシラン断片、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカールと、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールのモノエステルまたはジエステルと、これらの混合物からなる群から選択される。別の実施形態では、基質は、１つまたは複数のエステル基を含むＣ１〜Ｃ６ポリオールである。好ましい実施形態では、Ｃ１〜Ｃ６ポリオールのヒドロキシル基の１つまたは複数は、１つまたは複数のアセトキシ基によって置換されている（１，３−プロパンジオールジアセテート、１，２−プロパンジオールジアセテート、１，４−ブタンジオールジアセテート、１，５−ペンタンジオールジアセテートなど）。さらなる実施形態では、基質は、プロピレングリコールジアセテート（ＰＧＤＡ）、エチレングリコールジアセテート（ＥＧＤＡ）、またはこれらの混合物である。
さらなる実施形態では、適切な基質は、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン、トリプロピオニン、モノブチリン、ジブチリン、およびトリブチリンからなる群から選択される。さらに別の態様では、基質は、ジアセチンおよびトリアセチンからなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、適切な基質はトリアセチンを含む。
好ましい実施形態では、カルボン酸エステルは、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、およびこれらの組み合わせ（すなわち、混合物）からなる群から選択される液体基質である。カルボン酸エステルは、酵素に触媒される過加水分解の際に所望の濃度のペルオキシカルボン酸を生成するのに十分な濃度で、反応製剤中に存在する。カルボン酸エステルは反応製剤中に完全に溶解性である必要はないが、ペルヒドロラーゼ触媒によってエステルが対応するペルオキシカルボン酸に転換できるようにするために十分な溶解度を有する。カルボン酸エステルは、反応製剤の０．０５重量％〜４０重量％の濃度、好ましくは反応製剤の０．１重量％〜２０重量％の濃度、より好ましくは反応製剤の０．５重量％〜１０重量％の濃度で反応製剤中に存在する。
過酸素源としては、過酸化水素、過酸化水素付加物（例えば、尿素−過酸化水素付加物（過酸化カルバミド））過ホウ酸塩、過炭酸塩および過酸化塩を挙げることができるが、これらに限定されない。反応製剤中の過酸素化合物の濃度は、０．００３３重量％〜約５０重量％の範囲、好ましくは０．０３３重量％〜約４０重量％の範囲、より好ましくは０．１重量％〜約３０重量％の範囲であり得る。
過酸素源（すなわち、過酸化水素）は、有効量の過酸化水素を生成することができる酵素を用いて、酵素的に発生されてもよい。例えば、グルコースオキシダーゼ、ラクトースオキシダーゼ、炭水化物オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、エチレングリコールオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、およびアミノ酸オキシダーゼを含むがこれらに限定されない種々のオキシダーゼを本発明の組成物および方法において使用して、有効量の過酸化水素を生成することができる。
多くのペルヒドロラーゼ触媒（全細胞、透過処理された全細胞、および部分精製全細胞抽出物）は、カタラーゼ活性を有することが報告されている（ＥＣ １．１１．１．６）。カタラーゼは、過酸化水素から酸素および水への転換を触媒する。１つの態様では、過加水分解触媒にはカタラーゼ活性がない。別の態様では、カタラーゼ阻害剤が反応製剤に
添加され得る。当業者は、必要に応じてカタラーゼ阻害剤の濃度を調整することができる。カタラーゼ阻害剤の濃度は、通常、０．１ｍＭ〜約１Ｍの範囲であり、好ましくは約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、より好ましくは約１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲である。
別の実施形態では、酵素触媒は有意なカタラーゼ活性を持たないか、あるいはカタラーゼ活性を低減または除去するように操作され得る。宿主細胞におけるカタラーゼ活性は、トランスポゾン変異誘発、ＲＮＡアンチセンス発現、標的化変異誘発、およびランダム変異誘発を含むがこれらに限定されないよく知られた技術を用いて、カタラーゼ活性の原因である遺伝子の発現を破壊することによって下方制御または除去することができる。好ましい実施形態では、内在性カタラーゼ活性をコードする遺伝子は、下方制御または破壊（すなわち、ノックアウト）される。本明細書で使用される場合、「破壊された」遺伝子は、修飾された遺伝子によってコードされるタンパク質の活性および／または機能がもう存在しないものである。遺伝子を破壊するための手段は当該技術分野においてよく知られており、対応するタンパク質の活性および／または機能が存在しなくなる限り、遺伝子への挿入、欠失、または突然変異を含むことができるが、これらに限定されない。さらに好ましい実施形態では、産生宿主は、ｋａｔＧおよびｋａｔＥからなる群から選択される破壊されたカタラーゼ遺伝子を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生宿主である（米国特許出願公開第２００８−０１７６２９９号明細書を参照）。別の実施形態では、産生宿主は、ｋａｔＧおよびｋａｔＥカタラーゼ遺伝子の両方における下方制御および／または破壊を含むＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。
水性反応製剤中の触媒の濃度は触媒の特定の触媒活性に依存し、所望の反応速度を得るように選択される。過加水分解反応における触媒の重量は、通常、全反応体積の０．０００１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．００１ｍｇ〜２．０ｍｇ／ｍＬの範囲である。また触媒は、当業者によく知られた方法を用いて可溶性または不溶性担体に固定化されていてもよく、例えば、「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ」，Ｇｏｒｄｏｎ Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ，１９９７が参照される。固定化触媒の使用により、その後の反応における触媒の回収および再利用が可能になる。酵素触媒は、全微生物細胞、透過処理された微生物細胞、微生物細胞抽出物、部分精製または精製酵素、およびこれらの混合物の形態であり得る。
１つの態様では、カルボン酸エステルの化学的な過加水分解および酵素的な過加水分解の組み合わせによって発生されるペルオキシカルボン酸の濃度は、選択されるパーソナルケア用途のために有効な濃度のペルオキシカルボン酸を提供するのに十分である。別の態様では、本発明の方法は、所望の有効濃度のペルオキシカルボン酸を生成するための酵素および酵素基質の組み合わせを提供しており、添加される酵素が存在しないと、著しくより低い濃度のペルオキシカルボン酸が生成される。場合によっては、無機過酸化物と酵素基質との直接的な化学反応によって酵素基質の実質的に化学的な過加水分解が起こり得るが、所望の用途において有効な濃度のペルオキシカルボン酸を提供するために十分な濃度のペルオキシカルボン酸は発生されないことがあり、全ペルオキシカルボン酸濃度の著しい増大は、適切なペルヒドロラーゼ触媒の反応製剤への添加によって達成される。
少なくとも１つのカルボン酸エステルの過加水分解によって発生されるペルオキシカルボン酸（例えば、過酢酸）の濃度は、過加水分解反応の開始から１０分以内、好ましくは５分以内に、少なくとも約０．１ｐｐｍであり、好ましくは少なくとも０．５ｐｐｍ、１ｐｐｍ、５ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、２０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、２００ｐｐｍ、３００ｐｐｍ、５００ｐｐｍ、７００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍ、２０００ｐｐｍ、５０００ｐｐｍまたは１０，０００ｐｐｍの過酸である。ペルオキシカルボン酸を含む製品製剤は、場合により、標的用途に基づいて所望されるより低い濃度のペルオキシカルボン酸を含む製剤を
生成するために、水、または主に水で構成される溶液で希釈されてもよい。明らかに、当業者は、選択されるパーソナルケア製品に対する所望の過酸濃度を達成するために反応成分および／または希釈量を調整することができる。
１つの態様では、所望の濃度の過酸を生成するために必用とされる反応時間は、約２時間以内、好ましくは約３０分以内、より好ましくは約１０分以内、最も好ましくは約５分以内である。他の態様では、口腔表面は、反応成分を混ぜ合わせてから５分以内の間、本明細書に記載される方法に従って形成されるペルオキシカルボン酸と接触される。一実施形態では、標的口腔表面は、前記反応成分を混ぜ合わせてから約５分間〜約１６８時間以内の間、または前記反応成分を混ぜ合わせてから約５分間〜約４８時間以内、または約５分間〜２時間以内の間、またはその中の任意の時間間隔で、本明細書に記載される方法で生成されるペルオキシカルボン酸と接触される。
本明細書に記載される方法に従って形成される過酸はパーソナルケア製品／用途において使用され、過酸は標的口腔表面と接触されて、過酸ベースの利益を口腔に提供する。一実施形態では、標的体表面に対して過酸を生成するための方法はその場で実行される。
反応の温度は、反応速度および酵素触媒活性の安定性の両方を調節するように選択され得る。特定のパーソナルケア用途では明らかに、標的体表面の温度（例えば、口腔内で３７度）が反応の温度であり得る。反応の温度は、反応製剤の氷点（約０℃）のすぐ上の温度から約９５℃までの範囲であり得るが、好ましい範囲は５℃〜約７５℃であり、さらに好ましい反応温度範囲は、約５℃〜約５５℃である。
ペルオキシカルボン酸を含有する最終反応製剤のｐＨは約２〜約９であり、好ましくは約３〜約８、より好ましくは約５〜約８、さらにより好ましくは約５．５〜約８であり、またさらにより好ましくは約６．０〜約７．５である。反応、そして最終反応製剤のｐＨは、場合により、リン酸、ピロリン酸、重炭酸、酢酸、またはクエン酸を含むがこれらに限定されない適切な緩衝液の添加により調節され得る。緩衝液の濃度は、使用される場合には、通常０．１ｍＭ〜１．０Ｍであり、好ましくは１ｍＭ〜３００ｍＭであり、最も好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭである。
別の態様では、酵素的な過加水分解反応製剤は、反応製剤中のカルボン酸エステルの溶解速度を高めるために、分散剤としての役割を果たす有機溶媒を含有していてもよい。このような溶媒としては、プロピレングリコールメチルエーテル、アセトン、シクロヘキサノン、ジエチレングリコールブチルエーテル、トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールブチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、シクロヘキサノール、ベンジルアルコール、イソプロパノール、エタノール、プロピレングリコール、およびこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
単一段階適用方法と多段階適用方法との対比
通常、過酸有益剤を酵素的に生成するための最低限の反応成分のセットは、（１）ＣＥ−７ペルヒドロラーゼなどの、本明細書に記載されるような過加水分解活性を有する少なくとも１つの酵素（場合により、標的化された融合タンパク質の形態である）と、（２）少なくとも１つの適切なカルボン酸エステル基質と、（３）過酸素源とを含むであろう。
パーソナルケア組成物の過酸発生反応成分は、使用されるまで分離して保持され得る。一実施形態では、過酸発生成分は混ぜ合わせられてから標的体表面と接触され、それにより、得られる過酸ベースの有益剤は、体表面に利益を提供する。成分は混ぜ合わせられてから標的体表面と接触されてもよいし、あるいは標的化体表面上で混ぜ合わせられてもよ
い。一実施形態では、過酸発生成分は、過酸がその場で生成されるように混ぜ合わせられる。
多段階の適用が用いられてもよい。過酸発生系（すなわち、３つの基本的な反応成分の少なくとも１つを体表面に順次適用する）組成物の個々の成分のうちの１つまたは２つは、酵素的な過酸の生成に必要とされる残りの成分を適用する前に口腔表面と接触され得る。一実施形態では、過加水分解酵素は、口腔表面をカルボン酸エステル基質および／または過酸素源と接触させる前に口腔表面と接触される（すなわち、「２段階適用」）。一実施形態では、過加水分解活性を有する酵素は、酵素的な過酸の生成に必要な残り成分を混ぜ合わせる前に口腔表面に適用される標的化ペルヒドロラーゼである。
好ましい実施形態では、過加水分解活性を有する酵素は、酵素的な過酸の生成に必要な残りの成分を混ぜ合わせる前に口腔表面に適用される「標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ」（すなわち、ＣＥ−７融合タンパク質）である（すなわち、２段階適用方法）。標的化ペルヒドロラーゼは、融合タンパク質の口腔表面への非共有結合を促進するのに適切な条件下で口腔表面と接触される。任意的なすすぎステップを使用して、残りの反応成分を混ぜ合わせる前に、過剰および／または非結合の融合タンパク質を除去することができる。
さらなる実施形態では、過加水分解酵素（場合により、口腔表面に標的化された融合タンパク質の形態である）およびカルボン酸エステルは、過酸素源の添加よりも前に標的口腔表面に適用される。
さらなる実施形態では、過加水分解酵素（場合により、口腔表面に標的化された融合タンパク質の形態である）および過酸素源（例えば、過酸化水素を含む水溶液）は、カルボン酸エステル基質の添加よりも前に口腔表面に適用される．
さらなる実施形態では、カルボン酸エステル基質および過酸素源（例えば、過酸化水素を含む水溶液）は、過加水分解酵素（場合により、口腔表面に標的化された融合タンパク質の形態である）の添加よりも前に口腔表面に適用される。
さらに別の実施形態では、本明細書に記載される組成物または方法のいずれかを、本発明を実行するためのキットに組み込むことができる。キットは、過酸の酵素的な生成を促進するための材料および試薬を含むことができる。例示的なキットは、基質、過酸素源、および過加水分解活性を有する酵素触媒を含み、ここで、酵素触媒は場合により口腔表面に標的化され得る。その他のキット成分は、以下の：サンプルチューブ、固体担体、教材（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍａｔｅｒｉａｌ）、および過酸を酵素的に生成する際に有用な許容可能な成分またはキャリアなどの他の溶液または他の化学試薬のうちの１つまたは複数を含むことができるがこれらに限定されない。
口腔ケア組成物
経口的に許容可能な成分／キャリア
本発明の組成物および方法は、経口的に許容可能なキャリアおよび付加的な（すなわち、過酸ベースの有益剤に加えて）口腔ケア有益剤を含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、「口腔ケア有益剤」という用語は、所望の／有益な効果または属性を口腔表面に提供する化合物または物質に適用される一般用語である。一実施形態では、口腔表面のための有益剤は、（過酸ベースの有益剤に加えて）二酸化チタンなどの白色顔料、およびヒドロキシアパタイトまたはジルコンなどの白色鉱物を含むがこれらに限定されない着色剤を含むことができる。別の実施形態では、口腔ケア有益剤は、増白剤、ならびに例えば、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、グリコシダーゼ、エステラーゼ、および多糖類ヒドロラーゼなどの付加的な酵素を含むこともできる。別の態様で
は、有益剤は、抗プラーク剤、抗染み剤、および抗菌剤を含むことができる。抗菌剤は、抗菌ペプチド、マガイニン、セクロピン、殺微生物剤（ｍｉｃｒｏｂｉｏｃｉｄｅ）、トリクロサン、クロルヘキシジン、塩化セチルピリジニウム、第４級アンモニウム化合物、クロロキシレノール、クロロキシエタノール、フタル酸およびその塩、チモール、ならびにこれらの組み合わせを含むことができるが、これらに限定されない。口腔ケア有益剤は、フッ化ナトリウムまたはモノフルオロリン酸ナトリウムなどの抗う蝕剤、ならびにウィンターグリーン油、ペパーミント油、もしくはスペアミント油、またはサリチル酸メチル、ユーカリプトール、もしくはバニリンなどの風味剤を含むこともできる。口腔ケア有益剤は、いくつか例を挙げると、コハク酸塩ベースの冷却化合物などの冷却剤、および唾液分泌剤（ｓａｌｉｖａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を含むこともできる。本明細書で使用される場合、「唾液分泌剤」という用語は、口腔ケア組成物中に存在する場合にユーザーのより多い唾液分泌を促進する材料を指す。一実施形態では、有益剤は口腔ケア製品中での使用が認可された経口的に許容可能な材料である。別の実施形態では、経口的に許容可能な有益剤は、歯の表面的な外観を改善するために使用される。
経口的に許容可能なキャリア媒体中で使用されることが多い成分の非限定的なリストは、Ｗｈｉｔｅらにより米国特許第６，７４０，３１１号明細書において、Ｌａｗｌｅｒらにより米国特許第６，７０６，２５６号明細書において、Ｆｕｇｌｓａｎｇらにより米国特許第６，２６４，９２５号明細書において、そしてＩｂｒａｈｉｍらにより米国特許出願公開第２００５−００６９５０１号明細書において記載されている（これらはそれぞれ、参照によってその全体が本明細書中に援用される）。例えば、口腔ケア組成物は、以下の：研磨剤、界面活性剤、酸化防止剤、キレート剤、フッ化物源、増粘剤、緩衝剤、溶媒、湿潤剤、キャリア、増量剤、抗プラーク剤、抗染色剤、抗菌剤、抗う蝕剤、抗炎症剤、脱感作剤、甘味剤、風味剤、口臭清涼剤、冷却剤、栄養分、および唾液分泌剤のうちの１つまたは複数を含むことができる。
口腔ケア組成物が所望の過酸有益剤を酵素的に生成する能力を保持するように混合物中の成分が選択されることは認識されるであろう。本明細書に開示される口腔ケアシステムの適切な混合物は、日常的な実験を用いて当業者によって決定され得る。口腔ケア製剤を有する口腔ケア有益剤の全濃度は、口腔ケア組成物の全重量に対して約０．００１重量％〜約９０重量％であり得る。
口腔ケア組成物は、歯磨きペースト、練歯磨、歯磨きジェルまたは歯磨き粉、マウスウォッシュ、口臭清涼剤、およびデンタルフロスを含むことができるが、これらに限定されない。付加的な実施形態には、マウストレイを介して口腔環境に適用されるペーストまたはジェル中における反応成分の適用が含まれる。反応成分の１つまたは複数を送達して過酸有益剤を発生させるために、反応成分の１つまたは複数はまず、エナメル質に接着されるプラスチックストリップ上に付着させることもできる。ペルヒドロラーゼ融合物をストリップなどの送達デバイス上に付着させる場合、ペルヒドロラーゼ融合物は、デバイスの使用中、および使用後のデバイスの除去中に、ペルヒドロラーゼのストリップへの付着および保持を助けるために、ストリップの材料に対する親和性を有する結合要素を含むように設計され得る。
口腔の疾患に関連する微生物の低減または不要なバイオフィルムの除去のための過酸ベースの口腔ケア製品
過酸ベースの口腔ケア製品は、う歯（例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）など）、歯肉炎、口腔カンジダ症、または歯周炎に関連する口腔細菌を低減するために使用され得る。過酸ベースの口腔ケア製品は、口腔バイオフィルムを低減または除去するために使用され得る。
一実施形態では、口腔ケア製品において有効濃度の少なくとも１つの過酸を生成するための過加水分解活性を有する酵素の使用は、口腔表面の漂白、ホワイトニング、消毒、脱染、脱臭または口腔表面からのバイオフィルムの除去のために提供される。
一実施形態では、過加水分解活性を有する酵素は標的化ペルヒドロラーゼであり、酵素が本発明の基質の１つまたは複数に対する過加水分解活性を有する限り、リパーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、アリールエステラーゼ、炭水化物エステラーゼ、および組み合わせを含むことができる。例としては、過加水分解プロテアーゼ（例えば、サブチリシン変異体、米国特許第７，５１０，８５９号明細書）、過加水分解エステラーゼ（例えば、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、米国特許第７，３８４，７８７号明細書、配列番号４７７）、および過加水分解アリールエステラーゼ（例えば、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、米国特許第７，７５４，４６０号明細書、国際公開第２００５／０５６７８２号パンフレット、および欧州特許第１６８９８５９Ｂ１号明細書、配列番号４６０［Ｓ５４Ｖ変異体］および４７８［野生型］）を挙げることができるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、口腔ケア製品において有効濃度の少なくとも１つの過酸を生成するための過加水分解活性を有するＣＥ−７炭水化物エステラーゼの使用は、口腔表面の漂白、ホワイトニング、消毒、脱染、脱臭または口腔表面からのバイオフィルムの除去のために提供される。
別の実施形態では、以下の過酸発生組成物の使用も提供されており、本組成物は、
ａ）過加水分解活性を有する酵素触媒であって、前記酵素触媒が、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、前記シグネチャーモチーフが、
ｉ）配列番号２の位置１１８〜１２０に相当する位置のＲＧＱモチーフと、
ｉｉ）配列番号２の位置１７９〜１８３に相当する位置のＧＸＳＱＧモチーフと、
ｉｉｉ）配列番号２の位置２９８〜２９９に相当する位置のＨＥモチーフと
を含む酵素触媒と、
ｂ）１）構造
［Ｘ］ｍＲ５
（式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたは複数のエーテル結合を含んでいてもよく、
Ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中の溶解度を有するエステル、
２）構造
Figure 0006410786
 （式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
を有するグリセリド、
３）式
Figure 0006410786
 （式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
の１つまたは複数のエステル、ならびに
４）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
ｃ）過酸素源と、
を含み、（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）を混ぜ合わせると過酸が形成される。ここで、過酸発生製剤は、う歯、歯肉炎、口腔カンジダ症、または歯周炎の処置または予防のために使用される。
ペルオキシカルボン酸および過酸化水素の濃度を決定するためのＨＰＬＣ検定方法
反応物および生成物を分析するために、滴定、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）、質量分析（ＭＳ）、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）、Ｕ．Ｐｉｎｋｅｒｎｅｌｌら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９（１７）：３６２３−３６２７（１９９７））によって記載される分析手順、ならびに本発明の実施例において記載されるような２，２’−アジノ−ビス−（３−エチルベンゾタゾリン）−６−スルホネート（ＡＢＴＳ）検定（Ｕ．Ｐｉｎｋｅｒｎｅｌｌ ｅｔ．ａｌ．Ａｎａｌｙｓｔ，１２２：５６７−５７１（１９９７）およびＤｉｎｕ ｅｔ．ａｌ．Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．，２０：３９２−３９８（２０１０））を含むがこれらに限定されない様々な分析方法を、本発明の方法において使用することができる。
ペルオキシカルボン酸の最小殺生物濃度の決定
特定のパーソナルケア用途は、いくつか例を挙げると体臭、真菌感染、およびう歯の発生に関連するものなど、不要な微生物の除去と関連し得る。従って、標的パーソナルケア用途のための最小殺生物濃度を測定することが望まれるかもしれない。Ｊ．Ｇａｂｒｉｅｌｓｏｎら（Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５０：６３−７３（２００２）
）によって記載される方法は、ペルオキシカルボン酸、または過酸化水素および酵素基質の最小殺生物濃度（ＭＢＣ）を決定するために使用することができる。検定法は、ＸＴＴの還元阻害に基づいており、ここで、ＸＴＴ（（２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩、モノナトリウム塩）は、４９０ｎｍまたは４５０ｎｍで測定される光学濃度（ＯＤ）の変化による微生物の呼吸活性を示す酸化還元色素である。しかしながら、消毒剤および防腐剤の活性を試験するために利用可能な様々なその他の方法が存在し、生存可能なプレートのカウント、直接的な顕微鏡のカウント、乾燥重量、濁度測定、吸光度、およびバイオルミネセンスなどが含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｂｒｏｃｋ，Ｓｅｍｏｕｒ Ｓ．，「Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ」，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ、ＵＳＡ；２００１を参照）。
組換え微生物の発現
本発明の配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種宿主細胞において、特に微生物宿主の細胞において産生され得る。本発明の遺伝子および核酸分子の発現のための好ましい異種宿主細胞は、真菌または細菌ファミリーにおいて見出すことができ、広範な温度、ｐＨ値、および溶媒耐性にわたって増殖する微生物宿主である。例えば、細菌、酵母、および糸状菌はどれも適切に本発明の核酸分子の発現の宿主となり得ると考えられる。ペルヒドロラーゼは、細胞内、細胞外、または細胞内および細胞外の両方の組み合わせにおいて発現され得るが、ここで、細胞外発現によって、発酵産物からの所望のタンパク質の回収は、細胞内発現により産生されるタンパク質の回収方法よりも容易になる。転写、翻訳およびタンパク質生合成装置は、細胞バイオマスを発生させるために使用される細胞原料に対して不変なままであり、それにもかかわらず機能遺伝子は発現されるであろう。宿主株の例としては、アスペルギルス属、トリコデルマ属、サッカロミセス属、ピキア属、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、クルイベロミセス属、カンジダ属、ハンゼヌラ属、ヤロウィア属、サルモネラ属、バチルス属、アシネトバクター属、ザイモモナス属、アグロバクテリウム属、エリスロバクター属（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム属、クロマチウム属、フラボバクテリウム属、サイトファーガ属、ロドバクター属、ロドコッカス属、ストレプトミセス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリア属、マイコバクテリウム属、ディノコッカス属、エシェリキア属、エルウィニア属、パンテア属、シュードモナス属、スフィンゴモナス属、メチロモナス属、メチロバクター属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス属、メチロサイナス属、メチロミクロビウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス属、シネコシスティス属、シネココッカス属、アナベナ属、チオバチルス属、メタノバクテリウム属、クレブシエラ属、およびミキソコッカス属などの細菌、真菌または酵母種が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、細菌宿主株には、エシェリキア属、バチルス属、クルイベロミセス属、およびシュードモナス属が含まれる。好ましい実施形態では、細菌宿主細胞は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である。
大規模の微生物の増殖および機能遺伝子の発現は、様々な単純または複合糖質、有機酸、およびアルコール、またはメタンなどの飽和炭化水素、または二酸化炭素（光合成または化学独立栄養宿主の場合）、窒素、リン、硫黄、酸素、炭素または任意の微量栄養素（小さい無機イオンを含む）の形態および量を使用し得る。増殖速度の制御は、特定の制御分子を培養に添加するか否かによって影響され得るが、これらは通常、栄養分またはエネルギー源とは考えられない。
適切な宿主細胞の形質転換のために有用なベクターまたはカセットは当該技術分野でよく知られている。通常、ベクターまたはカセットは、関連の遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、および自己複製または染色体の組込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始の調節を包含する遺伝子の５’領域と、転写の終結を調節するＤＮＡ断片の３’領域とを含む。両方の調節領域が形質転換宿主細胞に相同および／または産生宿主に天然の遺伝子に由来する場合が最も好ましいが、このような調節領域はそのような由来でなくてもよい。
所望の宿主細胞における本発明のセファロスポリンＣデアセチラーゼのコード領域の発現を駆動するために有用な開始調節領域またはプロモーターは多数あり、当業者によく知られている。事実上、これらの遺伝子を駆動することができるあらゆるプロモーターが本発明に適しており、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス属における発現に有用）、ＡＯＸ１（ピキア属における発現に有用）、ならびにｌａｃ、ａｒａＢ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における発現に有用）、そしてバチルス属における発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよび種々のファージプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
終結調節領域も、好ましい宿主細胞に天然の種々の遺伝子に由来し得る。一実施形態では、終結調節領域の包含は任意的である。別の実施形態では、キメラ遺伝子は、好ましい宿主細胞に由来する終結調節領域を含む。
工業的な産生
ペルヒドロラーゼ触媒を産生するために様々な培養方法を適用することができる。例えば、組換え微生物宿主から過剰発現される特定の遺伝子産物の大規模産生は、バッチ培養、流加培養、および連続培養法によって行うことができる。バッチおよび流加培養法は一般的であり、当該技術分野においてよく知られており、その例は、Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ ｉｎ 「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）およびＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７−２３４（１９９２）において見出すことができる。
所望のペルヒドロラーゼ触媒の商業的な産生は、連続培養を用いて達成することもできる。連続培養は開放系であり、定義される培地がバイオリアクターに連続的に添加され、同時に、等量の条件培地が処理のために除去される。一般に、連続培養は、細胞が主に対数増殖期にあるときに、細胞を一定の高い液相密度に維持する。あるいは、連続培養は固定化細胞を用いて実施することもでき、ここで、炭素および栄養分は連続的に添加され、価値のある産物、副産物または老廃物は細胞塊から連続的に除去される。細胞の固定化は、天然および／または合成材料で構成される様々な固体担体を用いて実施することができる。
バッチ発酵、流加発酵、または連続培養からの所望のペルヒドロラーゼ触媒の回収は、当業者に知られている方法のいずれかによって達成され得る。例えば、酵素触媒が細胞内で産生される場合、細胞ペーストは遠心分離または膜ろ過によって培地から分離され、場合により水または所望のｐＨの水性緩衝液で洗浄され、次に、所望のｐＨの水性緩衝液中の細胞ペーストの懸濁液は均質化されて、所望の酵素触媒を含有する細胞抽出物を生じる。細胞抽出物は、場合により、セライトまたはシリカなどの適切なろ過助剤を通してろ過され、酵素触媒溶液から不要なタンパク質を沈殿させるための加熱処理ステップの前に細
胞片が除去されてもよい。次に、所望の酵素触媒を含有する溶液は、膜ろ過または遠心分離によって、沈殿した細胞片およびタンパク質から分離されてもよく、得られた部分精製酵素触媒溶液は、付加的な膜ろ過によって濃縮され、次に場合により、適切なキャリア（例えば、マルトデキストリン、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはこれらの混合物）と混合され、噴霧乾燥されて所望の酵素触媒を含む固体粉末を生じ得る。
量、濃度、またはその他の値またはパラメータが、範囲、好ましい範囲、または好ましい上限値および好ましい下限値の一覧のいずれかで与えられる場合、これは、範囲が別々に開示されているかどうかにかかわらず、任意の範囲の上限または好ましい値と、任意の範囲の下限または好ましい値との任意の対から形成される全ての範囲を具体的に開示すると理解されるべきである。本明細書において数値の範囲が列挙される場合、他に記載されない限り、その範囲は、その両端点ならびに範囲内の全ての整数および分数を含むことが意図される。範囲を定義する場合、本発明の範囲は、列挙される特定の値に限定されることは意図されない。
一般的な方法
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために提供される。実施例において開示される技術が、本発明の実施において十分に機能するための技術に従い、従って、その実施のために好ましいモードを構成すると考えられることは、当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本発明の開示を考慮して、開示される特定の実施形態において多くの変化が成され、そしてそれでもなお本発明で開示される方法および実施例の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができると認識すべきである。
全ての試薬および材料は、他に指定されない限り、ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ｉｎ）、Ｔｈｅｒｍｏ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）またはＳｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。
本明細書における以下の略語は、以下のように、測定、技術、特性、または化合物の単位に相当する：「ｓｅｃ」または「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」または「ｈｒ」は時間を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「ｐｐｍ」は１００万分の１を意味し、「ｗｔ」は重量を意味し、「ｗｔ％」は重量パーセントを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｇ」は重力を意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィを意味し、「ｄｄＨ２Ｏ」は蒸留および脱イオン水を意味し、「ｄｃｗ」は乾燥細胞重量を意味し、「ＡＴＣＣ」または「ＡＴＣＣ（登録商標）」はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を意味し、「Ｕ」はペルヒドロラーゼ活性の単位を意味し、「ｒｐｍ」は１分間の回転数を意味し、「Ｔｇ」はガラス転移温度を意味し、そして「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を意味する。
発現ベクターｐＬＤ００１
プラスミドｐＬＤ００１（配列番号２９２）はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のための適切な発現ベクターであることが既に報告されている（参照によって本明細書中に援用される
米国特許出願公開第２０１０−０１５８８２３Ａ１号明細書（Ｗａｎｇら）を参照）。
ベクターｐＬＤ００１は、市販のベクターｐＤＥＳＴ１７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に由来した。これは、酵素ケトステロイドイソメラーゼ（ＫＳＩ）の断片をコードする、市販のベクターｐＥＴ３１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に由来する配列を含む。ＫＳＩ断片は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において不溶性封入体へのペプチドの分割を促進するための融合パートナーとして含有された。ｐＥＴ３１ｂからのＫＳＩコード化配列は、標準的な変異誘発手順（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、野生型ＫＳＩ配列において見出される１つのＣｙｓコドンに加えて、３つの追加のＣｙｓコドンを含むように改変した。さらに、コード配列内の全てのＡｓｐコドンは、Ｇｌｕコドンによって置換した。プラスミドｐＬＤ００１（配列番号３９７で与えられる）は、当業者によく知られている標準組換えＤＮＡ法を用いて構築した。
実施例１
歯の漂白剤としての過酢酸の有効性
この実施例では、モデル染色エナメル質表面における漂白効果を達成するための過酢酸の使用が説明される。ウシエナメル質切歯は、ＳＥ Ｄｅｎｔａｌ（Ｂａｔｏｎ Ｒｏｕｇｅ，ＬＡ）から入手した。ダイヤモンド刃を有するＤＲＥＭＥＬ（登録商標）回転鋸（Ｒｏｂｅｒｔ Ｂｏｓｃｈ Ｐｏｗｅｒ Ｔｏｏｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を用いて、歯を両側で約７ｍｍのエナメル質スラブに分割および切断した。エナメル質スラブを清浄化し、軽く研磨して表面屑を除去した。ヒトの染色歯と同様の色に染色するために、エナメル質をコーヒーおよびお茶の混合物により１〜５日間前処理した。
各エナメル質ブロックを使用の前に水中で少なくとも１時間水和させた。試験溶液への暴露の前に基質の色測定を得た。５００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中３２％のストックから過酢酸の溶液を調製した。同じ緩衝液中で２．５％のＨ２Ｏ２の溶液も調製した。複数のエナメル質ブロックを各溶液に１分間暴露した後、さらに５分間、１０分間、１５分間および３０分間暴露した。各処理に対してストック溶液から過酢酸および過酸化水素の新しい溶液を調製した。各処理の後、エナメル質ブロックを水ですすぎ、Ｋｏｎｉｃａ−Ｍｉｎｏｌｔａ ２６００ｄ分光光度計により測定した。各サンプルの白色度は、表１および２に記載されるように決定された。
白色度（ＷＩ）は国際照明委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）（ＣＩＥ）によって定義され、ＡＳＴＭ法Ｅ３１３−０５に記載されており、Ｄ６５／１０入射光に対して：
ＷＩ＝Ｙ＋８００＊（０．３１３８−ｘ）＋１７００＊（０．３３１０−ｙ）
として計算され、式中、Ｙ、ｘ、およびｙはそれぞれ、エナメル基質の輝度率および色度座標である。
Figure 0006410786
Figure 0006410786
より正の値への白色度の変化はホワイトニング効果を示した。サンプルの目視検査も、緩衝液および過酸化水素対照と比較して過酢酸で処理したサンプルに対して認知できるホワイトニング効果を示した。このデータは、過酢酸が有効な漂白剤であり、過酸化水素よりも低濃度で優れた性能を提供することを実証する。
実施例２
標準的なバイオパニングを用いる歯エナメル質およびペリクル結合ペプチドの選択
この実施例の目的は、標準的なファージディスプレイバイオパニングを用いて、歯のエナメル質およびペリクルに結合するファージペプチドを同定することであった。
ウシエナメル質切歯は、ＳＥ Ｄｅｎｔａｌ（Ｂａｔｏｎ Ｒｏｕｇｅ，ＬＡ）から入手した。歯を約５平方ｍｍに切断し、研磨して表面屑を除去した。エナメル質ブロックは使用する前に滅菌した。ウェル内にエナメル質表面のみを露出させるように、成形材料を含有するウェルプレート内にエナメル質ブロックを埋め込んだ。口の中で３０分間インキュベーションしてペリクル被覆表面を形成するために、ワックス台にブロックを取り付けることによって、追加のエナメル質ブロック上にペリクルを形成した。ペリクル被覆エナメル基質を、ＣＯＬＧＡＴＥ（登録商標）ＭＡＸＦＲＥＳＨ（登録商標）歯磨きペースト（Ｃｏｌｇａｔｅ−Ｐａｌｍｏｌｉｖｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）の１：２スラリーでブラシで磨き、さらに３０分間再インキュベートした。ブロックの一部をワックスから取り出してウェルプレートに埋め込み、その他は、再度ブラシで磨いてからウェルプレートに埋め込んだ。埋め込みプロセスは、溶液がエナメル質およびペリクル被覆エナメル質表面だけと接触することを可能にした。
次に、基質をブロッキング緩衝液中、室温で１時間インキュベート（約２２℃、０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を有するリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＵＰＨ（商標）＃２８３７２）中１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＰＢＳＴ））した後、ＰＢＳＴで２回洗浄した。１５〜２０のアミノ酸長さのランダムペプチドインサート（１０１１ｐｆｕ）を含有するファージのライブラリーを各ウェルに添加した。最終結合溶液は、１０１１ｐｆｕのファージ、１０％のＵＶ処理した全唾液、および０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０（ＰＢＳＴ）中１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有した。５０ｒｐｍで振とうさせながら３７℃で３０分間インキュベーションした後、各ウェルから液体を吸引することにより非結合ファージを除去してから、１．０ｍＬのＰＢＳＴで６回洗浄した。
次に、エナメル質ブロックを清浄なチューブに移し、０．２Ｍのグリシン−ＨＣｌ中１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡからなる１ｍＬの溶出緩衝液（ｐＨ２．２）を各ウェルに添加し、１０分間インキュベートして、結合ファージを溶出させた。次に、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌからなる１６７μＬの中和緩衝液（ｐＨ９．１）を各ウェルに添加した。溶出緩衝液中およびエナメル質ブロック上にあるファージ粒子は、ＬＢ培地中に１：１００で希釈した一晩培養物から２０ｍＬの希釈Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８細胞と共に３７℃で４．５時間インキュベートすることにより増幅した。その後、細胞培養物を２分間遠心分離し、上澄みの上部１５ｍＬを新しいチューブに移し、２．５ｍＬのＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ポリエチレングリコール−８００、２．５Ｍの塩化ナトリウム）を添加し、ファージを４℃で一晩沈殿させた。４℃で１０，０００×ｇにおける遠心分離により沈殿物を捕集し、得られたペレットを１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させた。これは１回目の増幅ストックであった。次に、１回目の増幅されたファージストックを標準プロトコルに従って滴定した。次の回のバイオパニングのために、前の回からの２×１０１１ｐｆｕを超えるファージストックを使用した。１回目の後の追加の回のそれぞれには、ヒト全唾液（室温で２時間ＵＶ処理した）による付加的な洗浄、炭酸緩衝液（ｐＨ９．４）（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＵＰＨ（商標）炭酸−重炭酸緩衝液＃２８３８２）による２回の洗浄、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ２．５）による２回の洗浄、そしてその後の通常のＰＢＳＴによる２回の洗浄も含まれた。
３回目およびその後の各回のバイオパニングの後に、９５のランダムな単一ファージプラークを単離し、Ｉｌｌｕｓｔｒａ Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉ ５００ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて一本鎖ファージゲノムＤＮＡを調製し、−９６ｇＩＩＩ配列決定プライマー（５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’、配列番号３９８）を用いて、ＤｕＰｏｎｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて配列決定した。提示されたペプチドは、遺伝子ＩＩＩのシグナルペプチドのすぐ後に位置する。ペプチド配列に基づいて、表３に示されるように、さらなる結合分析のために１２のファージ候補を同定した。
Figure 0006410786
実施例３
エナメル質における歯結合候補の特徴付け
この実施例の目的は、合成的に産生されたペプチドを用いて、エナメル質表面におけるペプチド組成物の結合を確認することである。
表３から得られる配列を用いて合計１１の合成ペプチドを製造した。Ｃ−末端にビオチン標識リジンを有するペプチドは、ＳｙｎＢｉｏＳｃｉ Ｃｏｒｐ．（Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ，ＣＡ）から入手した。
エナメル基質を実施例２に記載されるように調製した。ＰＢＳＴ（０．１％のＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を有するＰｉｅｒｃｅ ＢＵｐＨ（商標）＃２８３７２）中１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡからなる１ｍＬのブロッキング緩衝液と共に各基質を室温（約２２℃）で１時間インキュベートした。各ウェルから液体を吸引することによりブロッキング緩衝液を除去した。ＰＢＳＴからなる洗浄緩衝液でチューブを２回すすいだ。ブロッキング緩衝液中に希釈することによって調製した５００μＬの２０μＭペプチド溶液をウェルに満たした。サンプルを３７℃でゆっくり振とうさせながら３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで６回洗浄することによって非結合ペプチドを除去した。次に、ＰＢＳＴ中に１：１０００で希釈した５００μＬのホースラディッシュペルオキシダーゼ／ストレプトアビジン結合体（Ｐｉｅｒｃｅ＃２２１２７）を添加し、室温（約２２℃）で１時間インキュベートした。結合体溶液を除去し、エナメル質ブロックをＰＢＳＴで４回洗浄した。
各エナメル基質をウェルから取り出し、１５ｍＬの試験管中で１０ｍＬのＰＢＳＴにより再度洗浄した。次に、各エナメル基質を清浄なウェルプレート内に取り付け、エナメル質表面のみを露出させた。２００μＬのＱＵＡＮＴＡＢＬＵ（商標）基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ、＃１８５６１８７）を各エナメル質ブロックに直接添加した。溶液を室温で２０分間インキュベートした。２００μＬのＱＵＡＮＴＡＢＬＵ（商標）停止溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を添加した。混合した後、２００μＬの溶液を清浄な９６ウェルブラック微量遠心プレートに移した。マイクロプレ
ート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、３２５ｎｍ励起および４２０ｎｍ発光（カットオフ波長なし）によりプレートの蛍光を測定した。得られた蛍光値は表４で与えられる。１１のペリクル／エナメル質結合候補の分析を既知の結合ペプチド、ＤｅｎＰ０３と比較した。３回再現したエナメル基質を用いて各配列を試験した。
Figure 0006410786
実施例４
ペルヒドロラーゼおよびペルヒドロラーゼ融合物の構築
この実施例では、エナメル質結合配列を介してエナメル質に標的化されたペルヒドロラーゼの産生のための発現系の設計が説明される。
エナメル質結合ドメインに対する過加水分解活性を有する酵素（「ペルヒドロラーゼ」）の融合物をコードする遺伝子は、種々のアミノ酸可動性リンカー（各リンカーはさらに、表６に記載されるようにエナメル質結合ドメインまたは非結合配列対照に融合される）をコードするヌクレオチド配列に対して３’端部で融合した表５に記載される種々の酵素のポリヌクレオチド配列を有するように設計した。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために遺伝子をコドン最適化し、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により合成した。プラスミドを生じるＮｄｅＩおよびＡｓｃＩ制限部位の間のＴ７プロモーター（発現ベクターｐＬＤ００１（配列番号３９７））またはｐＢＡＤプロモーターの後ろでコード配列をプラスミドにおいてクローン化した。融合タンパク質を発現させるために、Ｔ７プロモーター下での構築のために適切な発現宿主：Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１ＡＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に、あるいはｐＢＡＤプロモーター下での構築のためにＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５のＡｒａＢＡＤ誘導体に、プラスミドを移した。
表５に記載される非標的化ペルヒドロラーゼ変異体を同様にクローン化した。サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）変異体の調製および組換え
発現は、参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書においてＤｉＣｏｓｉｍｏらにより既に報告されている。
ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（アセチルキシランエステラーゼ、配列番号４０）、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）（アセチルキシランエステラーゼ、配列番号４２）、およびバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）（アセチルキシランエステラーゼ、配列番号１０）からの付加的なＣＥ−７ペルヒドロラーゼを同様にしてクローン化した。ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）、およびバチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）からのＣＥ−７ペルヒドロラーゼのクローン化および発現は、米国特許出願公開第２０１１−００８１６９３号明細書および米国特許第７，９５１，５６６号明細書（それぞれ、参照によって本明細書に援用される）においてＤｉＣｏｓｉｍｏらにより既に報告されている。
ペルヒドロラーゼのＣＥ−７ファミリーに属さない過加水分解酵素も同様にしてクローン化した。過加水分解活性を有するマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）アリールエステラーゼ（「ＡｒＥ」、野生型配列は配列番号４７８であり、Ｓ５４Ｖ変異体は配列番号４６０として提供される）は、米国特許第７，７５４，４６０号明細書に記載されている。過加水分解活性を有するシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）エステラーゼ変異体Ｌ２９Ｐ（「Ｐｆｌ」、配列番号４７７）は、米国特許第７，３８４，７８７号明細書に記載されている。
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実施例５
融合タンパク質の産生
この実施例には、口腔表面に結合するための標的配列を有するまたは有さないペルヒドロラーゼの発現および精製が記載される。
５０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含有する１Ｌの自己誘導培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、３ｍＭのＭｇＳＯ４、０．７５％のグリセロール、０．０７５％のグルコースおよび０．０５％アラビノース）において、２００ｒｐｍの攪拌下、株を３７℃で２０時間増殖させた。非標的化ペルヒドロラーゼの産生は、米国特許出願公開第２０１０−００８７５２９号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）において既に記載されている。標的化ペルヒドロラーゼの産生は、同様のプロトコルに従った。細胞を８０００ｒｐｍの遠心分離により収集し、１ｍＭのＤＴＴを含有する２０ｍＬの５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．１）中に細胞ペレットを再懸濁させることにより洗浄した。溶液を８０００ｒｐｍで再度遠心分離し、上澄みを除去し、ＤＴＴを含有するリン酸緩衝液中にペレットを再分散させた。次に、溶液を３０秒間均質化して、ペレットを分散させた（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ＨｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒモデルＰＣＵ１１）。次に、１３，０００ｐｓｉ（約８９．６ＭＰａ）のＦｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ（ＳＬＭ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により溶液を処理することによって、細胞を溶解させた。完全な溶解を達成するために、溶液をプレスによりさらに２回処理した。次に、細胞溶液を円錐チューブに移し、８５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）構築物については、上澄みを除去し、８０℃で３０分間加熱した。溶液を再度遠心分離して、上澄みを清浄なバイアルに移した。
非好熱性酵素については、汚染細胞成分から酵素を精製するために熱処理は使用しなかった。代わりに、Ｃｏ−ＮＴＡアガロース（ＨｉｓＰｕｒ Ｃｏｂａｌｔ Ｒｅｓｉｎ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品番号：８９９６５）を用いる金属キレート化クロマトグラフィによって、酵素のＣ−末端に融合されたＨｉｓ６タグを用いてサンプルを精製した。通常、４体積の平衡緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％のグリセロール、１ｍＭのイミダゾールおよび１５０ｍＭのＮａＣｌ）で平衡化されたＣｏ−ＮＴＡアガロースの５〜１０ｍＬのカラムに細胞抽出物を負荷した。カラムに負荷される各抽出物の量は、Ｃｏ−ＮＴＡアガロースビーズ１ｍＬ当たり５〜１０ｍｇのペルヒドロラーゼ融合物を含有するように調整した。樹脂を２ベッド体積の平衡緩衝液で洗浄し、２体積の溶出緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０％のグリセロール、１５０ｍＭのイミダゾール、５００ｍＭのＮａＣｌ）で溶出させた。画分を収集し、全長の精製タンパク質の存在をＰＡＧＥにより確認した。
構築物ＥＺ−１９〜ＥＺ−２６を製造するために、細胞産生の後、８０００ｒｐｍの遠心分離により細胞を捕集し、２０ｍＬの５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中に細胞ペレットを再懸濁させることによって洗浄した。溶液を８０００ｒｐｍで再度遠心分離した。上澄みを除去し、ペレットをリン酸緩衝液中に再分散させた。次に、溶液を３０秒間均質化して、ペレットを分散させた（Ｂｒｉｎｋｍａｎ ＨｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒモデルＰＣＵ１１）。次に、１３，０００ｐｓｉ（約８９．６ＭＰａ）のＦｒｅｎｃｈ
Ｐｒｅｓｓ（ＳＬＭ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により溶液を処理することによって、細胞を溶解させた。完全な溶解を達成するために、溶液をプレスによりさらに２回処理した。次に、細胞溶液を円錐チューブに移し、８５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞ライセートペレット５０ｍＬ当たり３ｍＬの緩衝液で、不溶性ライセートペレットをサルコシル緩衝液（５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、２％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）−Ｘ１００および１．５％のサルコシル）中に溶解させた。溶液を遠心分離し、上澄みを新しいチューブに移した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）からのＨｉｓＰｕｒ（商標）Ｃｏｂａｌｔ Ｒｅｓｉｎキットを用いることにより、融合タンパク質を精製した。
これらの製造および精製プロトコルのアウトプットは、通常、１ｍＬ当たり２〜１０ｍｇのタンパク質を生じ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）分析で推定される
場合に、融合ペルヒドロラーゼ純度はタンパク質の９０％〜７５％である。ウシ血清アルブミン溶液を標準として用いるビシンコニン酸（ＢＣＡ）検定（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって全タンパク質を定量した。
実施例６
エナメル質標的化ペルヒドロラーゼ融合物のヒドロキシアパタイトへの結合
この実施例には、ペルヒドロラーゼのヒドロキシアパタイト粒子への結合が記載される。ヒドロキシアパタイトは、エナメル質の有効な模倣物である。
ヒドロキシアパタイトへの結合について、表６に記載されるペルヒドロラーゼ酵素を査定した。ヒドロキシアパタイトナノ粒子（Ａｌｄｒｉｃｈ６７７４１８）の分散体は、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中０．５％の固形分で作った。ヒドロキシアパタイト分散体に酵素ストック溶液を１０μＭの最終濃度になるまで添加し、微量遠心管中で穏やかに攪拌しながら３０分間インキュベートした。各サンプルを１００００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上澄みを除去し、付加的な緩衝液を添加した。粒子を再懸濁させ、新しいチューブに移した。プロセスをさらに２回繰り返した。６０μＬのサンプル、２０μＬのＬＤＳ緩衝液および８μＬの還元剤（Ｎｕ−ＰＡＧＥ）を混ぜ合わせることによって、酵素の初期インプット、各洗浄ステップで粒子から除去された上澄み、および最終粒子のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために調製した。サンプルを８５℃で１０分間加熱した。２５μＬの各サンプルを４−１２％ＢｉｓＴｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に負荷し、１１５ボルトで１．５時間実行した。ゲルを除去し、Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の１：１希釈物により一晩染色し、脱イオン水中で４時間脱染した。ゲルを分析し、バンドの存在に基づいて各画分中の酵素の検出を推定した。分析の結果は表７に提供されており、ゲルにおける各バンドの相対強度の表示は、ヒドロキシアパタイト表面と各酵素との間の結合の強度を決定するために酵素インプットと比較される（インプット＝１）。
Figure 0006410786
表７のデータは、ペルヒドロラーゼの標的配列との融合物が洗浄後にヒドロキシアパタイト上に保持されていたが、非標的化ペルヒドロラーゼは保持されなかったことを実証する。
実施例７
溶液中のそしてヒドロキシアパタイトに結合した酵素ペルヒドロラーゼ活性の定量
この実施例には、過酢酸を発生させるためにトリアセチンおよび過酸化水素を用いて、ペルヒドロラーゼをそのペルヒドロラーゼ活性により検出および定量するための方法が記
載される。
過酢酸の検出は、過酢酸による２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホネート（ＡＢＴＳ）酸化の比色分析検出を用いるＰｉｎｋｅｒｎｅｌｌら（Ａｎａｌｙｓｔ，１９９７，１２２，５６７）に記載される方法に従った。トリアセチンおよび過酸化水素の添加により過酢酸を形成した後、９０μＬの溶液を、ウェルプレート中の１０μＬの０．１ＭのＨ３ＰＯ４に添加した。５０μＬの１Ｍの酢酸、５０μＬの０．５ｇ／ＬのＡＢＴＳおよび５０μＬの０．００２ｇ／ＬのＫＩを添加した。溶液を５分間発展させた。マイクロプレートリーダーを用いて溶液の吸光度を４０５ｎｍで測定した。過酢酸濃度は、過酢酸試薬溶液を用いて同時に発展させた標準曲線に基づいて計算した。
溶液中の酵素活性は、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中０．６２５μｇ／ｍＬの各酵素の溶液を作ることによって測定した。１０μＬの酵素溶液を、９０μＬの緩衝液、３０μＬの３％トリアセチン水、３０μＬの３０ｍＭのＨ２Ｏ２と混合した。溶液を５分間インキュベートした。上記のようにＡＢＴＳ酸化による検出のために９０μＬアリコートを取り出した。結果は表８に記載される。
Figure 0006410786
ＨＡＰディスク表面に一旦結合した融合物のペルヒドロラーゼ活性を、同じＡＢＴＳ法で検出した。ヒドロキシアパタイトディスク（ＨｉＭｅｄ Ｉｎｃ，Ｏｌｄ Ｂｅｔｈｐａｇｅ，ＮＹ、５ｍｍ直径×１．８ｍｍ厚）を２０μＭの酵素溶液（５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７．２）中で６０分間インキュベートした後、６回洗浄した（５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．２）。酵素が吸着したディスクを新しいウェルに移し、２００μＬのリン酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．２）、３０μＬの３％トリアセチン（最終濃度０．３４６％）および３０μＬの３０ｍＭのＨ２Ｏ２（最終濃度３．４６ｍＭ）を添加した。溶液を室温で５分間インキュベートさせた。９０μＬの溶液を１０μＬの１００ｍＭのＨ３ＰＯ４を含有する新しいウェルにピペットで取った。５０μＬの酢酸、５０μＬのＫＩ、５０μＬのＡＢＴＳを上記のように添加した。溶液を室温で５分間発展させ、Ａ４０５ｎｍで読み取った。結果は表９に記載される。
Figure 0006410786
この実験は、ＥＺ−５およびＥＺ−７がヒドロキシアパタイトに結合した場合に活性な酵素であり、トリアセチンおよび過酸化水素の添加により過酢酸を生成することを実証する。ＥＺ−１で検出された過酢酸の値が低いことは、ＥＺ−１がヒドロキシアパタイトに結合せず（実施例６）、過酢酸を発生させるために表面に存在しないという他の観察と一致していた。
実施例８
付加的なＣＥ−７ペルヒドロラーゼ構築物に関して、溶液中のそしてヒドロキシアパタイトに結合した酵素ペルヒドロラーゼ活性の定量
この実施例には、過酢酸を発生させるためにトリアセチンおよび過酸化水素を用いて、溶液中およびヒドロキシアパタイトに結合したときの、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）（Ｂｐｕ）、メソリゾビウム・ロティ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｌｏｔｉ）（Ｍｌｏ）およびラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（Ｌｌａ）からのＣＥ−７ペルヒドロラーゼおよびそれぞれの融合タンパク質の過加水分解活性が記載される。
表６に記載されるペルヒドロラーゼ酵素を溶液活性について査定した。１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１００ｍＭのトリアセチン、１００ｍＭのＨ２Ｏ２中０．５μＭの酵素を含有する５００μＬの溶液を作ることによる、溶液活性においてペルヒドロラーゼを測定するための方法は、実施例７に記載した。溶液を混合し、３７℃で１０分間インキュベートした。１０μＬアリコートを取り出し、実施例７に記載されるように検出のために希釈した。過酢酸濃度は、過酢酸のストック溶液（Ａｌｄｒｉｃｈ）で作成した標準曲線を用いて決定した。また、対照として酵素を存在させずに実験を実施した。
Figure 0006410786
これらの構築物のヒドロキシアパタイトへの結合を査定するために、３３ｍｇのヒドロキシアパタイト粒子（Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ＴＹＰＥ Ｉ、８０μｍサイズのＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で洗浄した。上澄みを除去した後、ヒドロキシアパタイト分散体に酵素ストック溶液を１０μＭの最終濃度になるまで添加し、微量遠心管中で穏やかに攪拌しながら３０分間インキュベートした。各サンプルを１００００ｒｐｍで１分間遠心分離した。上澄みを除去し、付加的な緩衝液を添加した。粒子を再懸濁させ、新しいチューブに移した。プロセスをさらに２回繰り返した。１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中１００ｍＭのトリアセチン、１００ｍＭのＨ２Ｏ２を含有する５００μｌの溶液を添加することによって、ヒドロキシアパタイトに結合した酵素活性を測定した。溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。アリコートを取り出し、実施例７に記載されるようにＡＢＴＳ酸化による検出のために適切に希釈したＨ３ＰＯ４と混合した。各実験に対して対照として酵素を含まない実験を別の日に実施した。結果は表１１に記載される。
Figure 0006410786
実験は、Ｂｐｕ、ＭｌｏおよびＬｌｏ酵素からの全てのＣＥ−７ペルヒドロラーゼ融合物が、酵素なしの対照と比較して、溶液中でもヒドロキシアパタイト表面に結合した後でも、有意なペルヒドロラーゼ活性を示したことを実証する。Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）からの３つのＣＥ−７ペルヒドロラーゼ融合物は全て、Ｍ．ロティ（Ｍ．ｌｏｔｉ）またはＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）からの融合酵素と比較して、より高い酵素活性を有する。Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）からの標的化ＥＺ−２９は、非標的化ＥＺ−２７と比較して、より高い結合活性を示した。
実施例９
標的化Ｃ２７７ＳペルヒドロラーゼのＣＸＨペプチドとの融合物に関して、溶液中のそしてヒドロキシアパタイトに結合した酵素活性の定量
この実施例には、溶液中でそしてヒドロキシアパタイトに結合したときに過酢酸を発生させるためにトリアセチンおよび過酸化水素を用いて、ＣＥ−７ Ｃ２７７ＳおよびＣＸＨペプチドとの融合物およびそのペルヒドロラーゼ活性が記載される。ヒドロキシアパタイトはエナメル質の有効な模倣物である。
表６に記載されるペルヒドロラーゼ酵素ＥＺ−１９〜ＥＺ−２６を溶液中の酵素活性について査定した。ペルヒドロラーゼを溶液活性において測定するための方法は実施例７で記載した。溶液中の酵素活性は、１００ｍＭのトリアセチン、１００ｍＭのＨ２Ｏ２および１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中０．５μＭの各酵素の５００μｌのサルコシル緩衝液溶液を作ることによって測定した。溶液を３７℃で１０分間インキュベートした。Ｈ３ＰＯ４との混合により反応を停止させた後、適切な希釈のために１０μＬアリコートを取り出し、次に実施例７に記載されるようにＡＢＴＳ酸化により検出した。結果は表１２に記載される。
同じペルヒドロラーゼ融合酵素を、ヒドロキシアパタイトへの結合についても査定した
。水和ヒドロキシアパタイトディスク（５ｍｍ直径×１．８ｍｍ厚、ＨｉＭｅｄ Ｉｎｃから）を使用した。ディスクを１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中で１０分間平衡化した。２００μＬの酵素溶液を１０ｍＭのリン酸緩衝液中１０μＭの最終濃度になるまでヒドロキシアパタイトディスクに添加し、微量遠心管中で穏やかに攪拌しながら３０分間インキュベートした。上澄みを取り出し、非結合酵素活性検定のために使用した。ディスクを新しいチューブに移し、リン酸緩衝液ですすいだ。プロセスをさらに２回繰り返した。酵素が結合したヒドロキシアパタイトディスクの酵素活性は、１００ｍＭのトリアセチン、１００ｍＭのＨ２Ｏ２および１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を含有する５００μｌの溶液をディスクに添加し、３７℃で３０分間インキュベートすることによって測定した。Ｈ３ＰＯ４との混合により反応を停止させた後、適切な希釈のために１０μＬアリコートを取り出し、次に実施例７に記載されるようにＡＢＴＳ酸化により検出した。実験は数日にわたって実施し、酵素を含まない溶液を毎日対照として使用した。酵素なし対照を差し引いた後の結果は表１２に記載される。
Figure 0006410786
実験は、ＣＸＨ標的配列を有するＣ２７７Ｓ変異体がすべて活性であり、溶液中でそしてヒドロキシアパタイトに結合したときに十分な量の過酢酸を発生させることを実証した。
実施例１０
非ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ構築物に関して、溶液中のそしてヒドロキシアパタイトに結合した酵素ペルヒドロラーゼ活性の定量
この実施例の目的は、溶液中でそしてヒドロキシアパタイトに結合したときに過酢酸を発生させるための、表６に記載されるＭ．スメグマチス（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からの標的化または非標的化アリールエステラーゼ酵素変異体およびＰ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）からのペルヒドロラーゼ変異体の使用を実証することである。
アリールエステラーゼ構築物に関して、溶液中の酵素活性は、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、１００ｍＭのトリアセチン、および１００ｍＭのＨ２Ｏ２中０．５μＭの各酵素の１ｍＬの溶液を作ることによって測定した。溶液を混合し、３７℃で３０分
間インキュベートした。実施例７に記載されるように、一部をＨ３ＰＯ４に取り出すことによって反応を停止させ、１０μＬアリコートを取り出して、ＡＢＴＳ酸化による検出のために希釈した。
ヒドロキシアパタイトにおける結合および活性を査定するために、１０ｍＭのリン酸緩衝液中１０μＭの溶液を用いて、３３ｍｇの緩衝液洗浄したＨＡＰ粒子（Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ＴＹＰＥ Ｉ、８０μｍサイズのＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、実施例８に記載されるように、アリールエステラーゼ酵素をヒドロキシアパタイト粒子に暴露した。遠心分離および酵素溶液の除去の後、遠心分離および上澄の除去により粒子をリン酸緩衝液ですすいだ。１００ｍＭのトリアセチン、１００ｍＭのＨ２Ｏ２および１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を含有する２００μＬの溶液を粒子に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。実施例７に記載されるように、一部をＨ３ＰＯ４に取り出すことによって反応を停止させ、１０μＬアリコートを取り出して、ＡＢＴＳ酸化による検出のために希釈した。溶液および表面結合検定の両方の結果は表１３に記載される。
Figure 0006410786
Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）構築物に関して、１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中２μＭの酵素、１００ｍＭのＨ２Ｏ２を含有する１ｍＬの溶液を混合することによって溶液活性を測定した。溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。実施例７に記載されるように、一部をＨ３ＰＯ４に取り出すことによって反応を停止させ、１０μＬアリコートを取り出して、ＡＢＴＳ酸化による検出のために希釈した。ヒドロキシアパタイトにおける結合および活性を査定するために、１００ｍｇの緩衝液洗浄したＨＡＰ粒子（Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ Ｃｅｒａｍｉｃ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ ＴＹＰＥ Ｉ、８０μｍサイズのＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、実施例８に記載されるように、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）酵素を１０ｍＭのリン酸緩衝液中２０μＭでヒドロキシアパタイト粒子に暴露した。遠心分離および酵素溶液の除去の後、遠心分離および上澄の除去により粒子をリン酸緩衝液ですすいだ。１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）中３００ｍＭのＨ２Ｏ２を含有する２００μＬの溶液を粒子に添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。実施例７に記載されるように、一部をＨ３ＰＯ４に取り出すことによって反応を停止させ、１０μＬアリコートを取り出して、ＡＢＴＳ酸化による検出のために希釈した。溶液および表面結合検定の両方の結果は表１４に記載される。
Figure 0006410786
これらの実験は、ＣＥ−７ファミリー以外のファミリーからのペルヒドロラーゼが、標的配列を含む構築物に関して溶液中でそしてヒドロキシアパタイトに結合したときに活性であることを実証する。
実施例１１
溶液中のそしてウシエナメル質に結合した、エナメル質標的化Ｃ２７７ＳおよびＣ２７７Ｔ変異体ペルヒドロラーゼ融合物の過加水分解活性の定量
この実施例には、ペルヒドロラーゼ融合タンパク質のウシエナメル質への結合、ならびに溶液中およびウシエナメル質に結合したときの酵素活性の測定が記載される。
表５に記載されるペルヒドロラーゼ酵素を、実施例７に記載されるように溶液中の酵素活性について査定した。溶液中の酵素活性は、１００ｍＭトリアセチン、１００ｍＭのＨ２Ｏ２および１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中０．５μＭの各酵素の５００μｌの溶液を作ることによって測定した。溶液を３７℃で１０分間インキュベートした。アリコートをＨ３ＰＯ４と混合することによって反応を停止させた後、適切な希釈のために１０μＬアリコートを取り出し、次に実施例７に記載されるようにＡＢＴＳ酸化により検出した。結果は表１５に記載される。
ペルヒドロラーゼ酵素は、ウシエナメル基質への結合についても査定した。エナメル基質は、実施例２および３に記載されるように調製した。各エナメル質ブロックを室温（約２２℃）において水中で一晩水和させた。次に、エナメル質ブロックを１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）により１０分間平衡化した。エナメル基質を緩衝液で３回すすいだ。１０ｍＭのリン酸緩衝液中に希釈することにより調製した５００μＬの１０μＭの酵素溶液をエナメル質ウェルに満たした。サンプルを３７℃でゆっくり振とうさせながら３０分間インキュベートした。リン酸緩衝液で４回洗浄することによって非結合酵素を除去した。次に、パテを充填した２４ウェルプレートの内部に各エナメル質ブロックを埋め込み、エナメル質の上部表面のみを露出させた。エナメル質結合酵素からのペルヒドロラーゼ活性を実施例８に記載されるように測定した。１００μＬの反応混合物（１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）および１００ｍＭのＨ２Ｏ２および１００ｍＭのトリアセチン）をエナメル質の上部に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。実施例
８に記載されるようにＡＢＴＳ酸化による検出のために９０μＬのアリコートを取り出した。結果は表１５に記載される。各サンプルデータ点は、３個の独立したエナメル質ブロックの平均を表す。
Figure 0006410786
この実験は、標的配列を含む構築物について、Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）配列変異体からのＣ２２７ＳおよびＣ２７７Ｔを用いる融合物が、溶液中でそしてウシエナメル質に結合したときに活性であり、歯を白くするために十分なレベルの過酢酸を発生させることを実証する。
実施例１２
１段階適用において過加水分解酵素を用いる歯の漂白の効力
この実施例の目的は、１段階適用において酵素的に発生される過酢酸の歯の漂白効果を示し、化学的に誘導される過酢酸で達成される性能と比較することである。過加水分解酵素（ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ）系を使用して歯の漂白の目標レベルを達成するために２つの方法を開発した。第１の方法（本明細書では、「１段階アプローチ」と呼ばれる）は
、モデル染色エナメル基質を用いて、異なる量の少なくとも１つのＣＥ−７ペルヒドロラーゼを、トリアセチン（適切なエステル基質の例）および過酸化水素と混ぜ合わせて、過酢酸を発生させることを含む。実施例１に示されるようにウシエナメル質切歯を調製した。使用前に、染色ウシエナメル質ブロックを水中で少なくとも１時間水和させて、基質の色を安定化させた。水和の後、実験を開始する前に、各エナメル質ブロックの色を測定した。各溶液タイプに対して３つのエナメル質サンプルを処理した。使用した溶液は、緩衝液のみの対照と、２．５％のＨ２Ｏ２と、１％の過酢酸と、１０μＭのＥＺ−１（Ｃ２７７Ｓ、配列番号４２４）、１００ｍＭのトリアセチンおよび２５０ｍＭのＨ２Ｏ２を含むペルヒドロラーゼ組成物と、１００ｍＭのトリアセチンおよび２５０ｍＭのＨ２Ｏ２の酵素なしの対照とであった。全ての溶液は、５００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中で調製した。１％の過酢酸溶液を中性ｐＨに保持するために、高い緩衝液強度が必要であった。各処理点に対して、全ての溶液を新しく調製した。酵素−トリアセチン−Ｈ２Ｏ２の組み合わせおよびトリアセチン−Ｈ２Ｏ２の組み合わせは、エナメル質の暴露の直前に混合した。各処理ステップの後、各エナメル質ブロックを水ですすぎ、色測定を得た。全処理時間６１分を使用し、暴露時間は１分、５分、１０分、１５分および３０分であった。１分、１０分および３０分の処理の後の溶液中の過酢酸の濃度を、ＡＢＴＳ酸化の比色分析検出によって評価した。結果は表１６および１７で提供される。
Figure 0006410786
比色分析法による反応混合物中の過酢酸（ＰＡＡ）濃度の決定は、Ｄｉｎｕら（上記）によって記載される方法に従って実施した。１２５ｍＭのクエン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０）中、１ｍＭの２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン）−６−スルホネート（ＡＢＴＳ）、５０μＭのヨウ化カリウムの試薬溶液を調製した。２５μＬのサンプルを、９７５μＬのこの検出試薬と混合し、５分間インキュベートさせた。マイクロプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍにおける吸光度について溶液を分析した。吸光度値を直接比較することにより、溶液中の過酢酸の相対量の比較を決定した。
Figure 0006410786
表１６のデータは、酵素−エステル−過酸化物組成物が歯を白くするのに有効であることを確認する。表１７のデータは、ＥＺ−１（Ｃ２７７Ｓ、配列番号４２４）酵素、トリアセチンおよびＨ２Ｏ２の組み合わせから過酢酸が生成されることことを実証する。化学的な過酢酸の吸光度データの比較も、意外にも酵素的な漂白系がより優れたホワイトニング性能を示し、検出可能な過酢酸がより低いことを示す。ＡＢＴＳ試薬への１：１０希釈物で検出した非酵素含有トリアセチンおよびＨ２Ｏ２についても時間と共に低レベルの過酢酸が生成される（表には含まれない）。この結果、検出可能な漂白性能がもたらされるが、酵素触媒による高レベルの過酢酸生成と比較するとはるかにゆっくりとした速度である。
実施例１３
１段階適用においてエナメル質標的化過加水分解酵素を用いる歯の漂白効力
この実施例の目的は、標的化ＣＥ−７ペルヒドロラーゼを用いて１段階適用において酵素的に発生される過酢酸の歯の漂白効果を示し、化学的に誘導される過酢酸で達成される性能と比較することである。
実施例１に示されるようにウシエナメル質切歯を調製した。使用前に、染色ウシエナメル質ブロックを水中で少なくとも１時間水和させて、基質の色を安定化させた。水和の後、実験を開始する前に、各エナメル質ブロックの色を測定した。各溶液タイプに対して２つのエナメル質サンプルを処理した。使用した溶液は、緩衝液のみの対照と、０．１％の過酢酸と、０．５２μＭのＥＺ−７（エナメル質結合ドメインを有するＣ２７７Ｓ、配列番号４２９）、１００ｍＭのトリアセチンおよび３２．６ｍＭのＨ２Ｏ２を含むペルヒドロラーゼ組成物とであった。全ての溶液は、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中で調製した。各処理点に対して、全ての溶液を新しく調製した。酵素−トリアセチン−Ｈ２Ｏ２の組み合わせは、エナメル質の暴露の直前に混合した。各処理ステップの後に、各エナメル質ブロックを水ですすぎ、色測定を得た。エナメル基質の各セットに対して、３０分の処理時間を４回繰り返した。３０分の処理後の溶液中の過酢酸の濃度を、ＡＢＴＳ酸化の比色分析検出によって評価した。結果は、表１８および１９で提供される。
Figure 0006410786
Figure 0006410786
表１８のデータは、標的化酵素−エステル−過酸化物組成物が、１段階プロセスで歯を白くするのに有効であることを確認する。表１９のデータは、ＥＺ−７酵素、トリアセチンおよびＨ２Ｏ２の組み合わせから過酢酸が生成されることを実証する。
実施例１４
様々なエステル基質に対してＣＥ−７ペルヒドロラーゼを使用した過酢酸の生成
この実施例の目的は、口腔ケアの特定の条件下で幅広いＣＥ−７ペルヒドロラーゼ（エナメル質を標的とするペルヒドロラーゼを含む）が幅広いエステルからの過酢酸の形成を触媒することを実証することであった。
サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼの変異体をクローン化し、組換えで発現し、実施例４に記載される方法と同様に精製した。これらのペルヒドロラーゼ変異体の配列変化は表５に記載される。
表５に記載されるペルヒドロラーゼ変異体のうちの少なくとも２つまたはそれ以上に対して、種々のエステル基質を試験した。カスタム合成した３つのエステルを除いて、他のエステルは全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）、Ａｌｐｈａ Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ，ＭＡ）またはＴｅｓｓｅｎｄｌｏ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺ）から入手した。
種々の酵素をエステル基質に対して試験するために、個々の反応の開始を０．５〜１分ずらすことにより４つの反応を同時に実行するのが便利であった。個々の反応は、磁気攪拌子を備えたガラス容器（高さ：７６ｍｍ、外径：３３ｍｍ、内径：２４ｍｍ）において実施した。４つの反応容器をまとめて、Ｔｈｅｒｍｏ ＮｅｓＬａｂ再循環浴（Ｍｏｄｅｌ＃ＲＴＥ−７ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｏｎｅ）によって制御された循環水を有する被覆され
た１リットルのステンレス鋼製焼き戻しビーカー（ＫＧＷ ＩｓｏＴｈｅｒｍ、＃ＴＳＳ−Ｇ１０００ｗ）において一定の温度に保持した。緩衝液（６ｍＬ、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２）を各反応容器に添加し、３７℃まで平衡化させた。１００ｍＭの濃度を達成するように対象のエステル基質を添加した。４０ｐｐｍの酵素および６０ｍＭのＨ２Ｏ２（３７μＬ、３０％の過酸化水素溶液）を同時に添加することによって反応を開始させた。過酢酸の生成を追跡するために、１〜１５分の特定の間隔で各反応からの８０μＬのサンプルを取り出した。酵素反応を停止させ（ｐＨを２〜３に低下させることにより、便利なＨＰＬＣ分析のためにサンプルを希釈するのに十分な体積および濃度のリン酸溶液を含有する微量遠心フィルタチューブ（ＮａｎｏＳｅｐ ３０Ｋ ＶＷＲ
ｃａｔ ＃８２０３１−３５４）中で、サンプルを直ちに反応停止させた。酸で反応停止させたサンプルを５分間遠心分離し、あらゆる粒子を除去した。ろ過したらすぐに、米国特許第７，８２９，３１５号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏら）に既に記載されている方法を用いて、各サンプルセットにおいて過酢酸のＫａｒｓｔ反応およびＨＰＬＣ分析をすぐに実施した。各エステル基質により精製される最大過酢酸は表２０に記載される。
Figure 0006410786
Figure 0006410786
Figure 0006410786
Figure 0006410786
表２０のデータを得るために使用したものと同じ反応条件下で、標的化Ｃ２７７Ｓペル
ヒドロラーゼ変異体、ＥＺ−７を用いて、これらのエステル基質を過酢酸の生成について試験した。ＥＺ−７ペルヒドロラーゼ系と共にプロピレングリコールジアセテートまたはスクロースオクタアセテートを用いる過酢酸の生成は表２１に示される。表示されるデータは、代替のエステルが、実施例５に記載されるようなペルヒドロラーゼの標的化変異体のために有効な基質であることを実証する。
Figure 0006410786
実施例１５
様々なエステル基質に対してＣＥ−７ペルヒドロラーゼを用いる歯の漂白
この実施例の目的は、口腔ケア関連条件下で４つのエステルからの過酢酸の形成を触媒するＣＥ−７ペルヒドロラーゼを用いて歯の漂白効力を実証することであった。
この実施例のために、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）ペルヒドロラーゼのＣ２７７Ｓ（ＥＺ−１）変異体をクローン化し、組換えで発現し、実施例４に記載されるように精製した。トリアセチン（Ｔｅｓｓｅｎｄｌｏ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺ））を除いて、基質は全てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
基質のトリアセチン（ＴＡ）、α−Ｄ−グルコースペンタアセテート（ＧＰＡ）、スクロースオクタアセテート（ＳＯＣ）およびプロピレングリコールジアセテート（ＰＧＤＡ）を用いて、ＥＺ−１（Ｃ２７７Ｓ、配列番号４２４）による酵素仲介の歯のホワイトニングを実証した。各基質による過酢酸の発生のために使用される最適な条件は実施例１４における研究から誘導され、以下に記載される：４０ｐｐｍのＥＺ−１、１００ｍＭの基質、ＸｍＭのＨ２Ｏ２、９５ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．２）。ここで、Ｘは基質の同一性に応じて変わり、１００ｍＭのＨ２Ｏ２（ＴＡ）、３６０ｍＭのＨ２Ｏ２（ＰＧＤＡおよびＳＯＣ）、６０ｍＭのＨ２Ｏ２（ＧＰＡ）である。
実施例１に示されるようにウシエナメル質切歯を調製した。染色エナメル質ブロックを、象牙質側を下に向けて２４ウェルプレート内に入れ、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中で一晩水和させた。処理の前に、Ｋｏｎｉｃａ−Ｍｉｎｏｌｔａ ２６００ｄ分光光度計を用いて各歯の色測定を実施し、実施例１で規定されるように白色度を計算した。
各酵素溶液を１．５ｍＬの微量遠心管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，＃２２４３１０２−１）中で調製し、すぐに、予め水和させた歯を含有する２４ウェルプレートに１ｍＬの溶液を移した。対照サンプルは、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、および１００ｍＭのクエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ５．３）中９％のＨ２Ｏ２で構成した。歯を室温で３０分間インキュベートし、１００ｍＭのリン酸塩（ｐＨ７．２）ですすぎ、色測定を行った。歯を２４ウェルプレート内に戻し、その時点で、新しい酵素溶液を調製し、各ウェルに添加した。このプロセスを、１回の処理あたり３０分、全部で３回のホワイトニング処理のために繰り返した（表２２）。
Figure 0006410786
表２２において観察されるように、ＴＡ、ＰＧＤＡ、ＳＯＣおよびＧＰＡを用いて酵素的に発生された過酢酸サンプルは全て、それぞれの連続処理に関してより正の値へのシフトによって示されるように、白色度の有意な変化を示す。緩衝液対照の白色度の変化はわずかであり、ΔＷＩは１１．４である。これらの測定は、各３０分処理の後の歯の目視検査とも一致する。このデータは、ＥＺ−１と共に様々な異なる基質を用いて酵素的に発生された過酢酸が、コーヒー−お茶で染色したウシの歯のホワイトニングにおいて有効であることを実証する。
実施例１６
２段階適用において過加水分解酵素を用いる歯の漂白効力
この実施例の目的は、２段階適用においてペルヒドロラーゼ系の歯の漂白効力を実証することであった。
実施例１に示されるようにウシエナメル質切歯を調製した。染色エナメル質ブロックを象牙質の背面を溶液の暴露から保護するように４８ウェルプレート中に埋め込んだ。１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中１０μＭの各酵素の溶液を調製し、５００μＬの溶液を各エナメル基質と共に６０分間インキュベートした。酵素溶液を除去し、各ウェルを付加的な５００μＬの緩衝液で３回すすいだ。エナメル質ブロックをホワイトニングプロセスのために新しいウェルに入れた。５０ｍＭのリン酸（ｐＨ７．２）緩衝液中４０ｍＭのトリアセチン、１００ｍＭのＨ２Ｏ２の最終濃度の溶液を新しく調製し、５００μＬの溶液を各エナメル質ブロックに添加した。１時間にわたって、エナメル質ブロックを取り出して色測定を得てから、それぞれをウェルプレート内の溶液に戻した。各サンプルの白色度をモニターした。結果は表２３に記載される。
Figure 0006410786
この実施例は、エナメル質の表面で過酢酸の形成を触媒することによって歯を白くするために表面結合ペルヒドロラーゼが使用され得ることを実証する。この実施例における漂白性能は、ヒドロキシアパタイト上で観察される各酵素の保持と相関する。非標的化ＥＺ−１（Ｃ２７７Ｓ、配列番号４２４）はヒドロキシアパタイトおよびエナメル質における弱い保持を示し、従って、２段階プロセスで適切なホワイトニングを達成する可能性は低い。酵素をエナメル質上に保持するために有効な標的配列を付加すると、２段階適用プロセスにおける過酢酸の生成が可能になる。
実施例１７
２段階適用において過加水分解酵素を用いる歯の漂白効力
この実施例の目的は、２段階適用における標的化および非標的化ペルヒドロラーゼ系の歯の漂白効力を実証することであった。
実施例１に示されるようにウシエナメル質切歯を調製した。ＳＩＬＬＹ ＰＵＴＴＹ（登録商標）（Ｃｒａｙｏｌａ ＬＬＣ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）をウェルに充填した２４−ウェルプレートに象牙質の背面を溶液暴露から保護するように染色エナメル質ブロックを埋め込んだ。１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中２０μＭの各酵素の溶液を調製し、５００μＬの酵素溶液を各エナメル質ブロックに添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。次に、毎回付加的な５００μＬの緩衝液によりエナメル質ブロックを３回すすいだ。エナメル質ブロックを、ホワイトニングプロセスのために新しいパテウェルに移して埋め込んだ。１００ｍＭのリン酸緩衝液、１００ｍＭのトリアセチン、１００ｍＭのＨ２Ｏ２（ｐＨ７．２）を含有する溶液（２００μＬ）をエナメル質に添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。鉗子を用いてエナメル質ブロックをウェルから取り出し、次にすすぎ、色測定のために１．５ｍＬの水を満たしたウェル内に貯蔵した。２段階プロセスを５回（全部で５０分間）繰り返した。２段階プロセス後のコーヒー−お茶で染色したウシエナメル質の色測定の結果は、表２４に示した。各サンプルデータ点は、独立したエナメル質ブロックの２回の繰り返しを表す。
系内で発生された過酢酸のレベルを測定するために、ＡＢＴＳ法を使用し、９０μＬの反応混合物を、１０μＬの停止緩衝液（１．３３ＭのＨ３ＰＯ４）を含有する新しいウェルに取り出した。サンプルを１００ｍＭのリン酸緩衝液により１：１００で希釈し、実施例８に記載されるようにＡＢＴＳ検出試薬に添加した。結果は表２５に記載される。各サンプルデータ点は独立したエナメル質ブロックの２回の繰り返しを表す。
Figure 0006410786
Figure 0006410786
この実施例は、エナメル質の表面で過酢酸の形成を触媒することによって歯を白くするために表面結合ペルヒドロラーゼが使用され得ることを実証する。ウシエナメル質を用いるこの実施例における漂白性能は、ヒドロキシアパタイト上で観察される各酵素の保持と相関する。非標的化ＥＺ−１（Ｃ２７７Ｓ）は、ヒドロキシアパタイトおよびエナメル質における弱い保持を示し、従って、２段階プロセスで適切なホワイトニングを達成する可能性は低い。酵素をエナメル質上に保持するために有効な標的配列を付加すると、２段階適用プロセスにおける過酢酸の生成が可能になる。

Claims (10)

  1. ａ）ｉ）構造
    ［Ｘ］ｍＲ５
    （式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
    Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含んでいてもよく、
    Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含んでいてもよく、
    ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
    を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中溶解度を有するエステル、
    ｉｉ）構造
    Figure 0006410786
     （式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
    を有するグリセリド、
    ｉｉｉ）式
    Figure 0006410786
     （式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
    の１つまたはそれより多いエステル、および
    ｉｖ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
    からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
    ｂ）過酸素源と、
    ｃ）ペルヒドロリシス活性を有する酵素触媒であって、該酵素触媒が、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、該シグネチャーモチーフが、
    ｉ）配列番号２の位置１１８〜１２０に対応する位置のＲＧＱモチーフと、
    ｉｉ）配列番号２の位置１７９〜１８３に対応する位置のＧＸＳＱＧモチーフと、
    ｉｉｉ）配列番号２の位置２９８〜２９９に対応する位置のＨＥモチーフと
    を含む酵素触媒であって、
    配列番号２８と少なくとも９０％の配列同等性を有し、配列番号２８の２７７に相当する一のアミノ酸が、アラニン、バリン、セリン又はトレオニンである酵素触媒
    を含む反応成分のセットを備え、
    上記の反応成分を適切な反応条件下で組み合わせ、それにより、少なくとも１つの過酸が酵素的に生成され、口腔表面を少なくとも１つの過酸と接触させ、それにより、口腔表面が、漂白、歯のホワイトニング、消毒、脱染、脱臭、バイオフィルムの低減または除去、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される過酸ベースの利益を受ける口腔ケア製品。
  2. ペルヒドロリシス活性を有する酵素が過酸有益剤の生成よりも前に口腔内に存在する、請求項１に記載の口腔ケア製品。
  3. ａ）ｉ）構造
    ［Ｘ］ｍＲ５
    （式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
    Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含んでいてもよく、
    Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含んでいてもよく、
    ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
    を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中溶解度を有するエステル、
    ｉｉ）構造
    Figure 0006410786
     （式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
    を有するグリセリド、
    ｉｉｉ）式
    Figure 0006410786
     （式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）、
    の１つまたはそれより多いエステル、および
    ｉｖ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
    からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
    ｂ）過酸素源と、
    ｃ）ペルヒドロリシス活性を有する酵素触媒であって、以下の一般構造：
    ＰＡＨ−［Ｌ］ｙ−ＯＣＢＤ
    または
    ＯＣＢＤ−［Ｌ］ｙ−ＰＡＨ
    （式中、ＰＡＨは、ペルヒドロリシス活性を有する酵素であり、
    該酵素が、ペルヒドロリシス活性を有するＣＥ−７炭水化物エステラーゼであり、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有し、該シグネチャーモチーフが、
    １）配列番号２の位置１１８〜１２０に対応する位置のＲＧＱモチーフと、
    ２）配列番号２の位置１７９〜１８３に対応する位置のＧＸＳＱＧモチーフと、
    ３）配列番号２の位置２９８〜２９９に対応する位置のＨＥモチーフと
    を含み、
    該酵素は、配列番号２８と少なくとも９０％の配列同等性を有し、配列番号２８の位置２７７に相当するアミノ酸が、アラニン、バリン、セリン又はトレオニンであり、
    ＯＣＢＤは、口腔表面に対する親和性を有するペプチド成分であり、
    Ｌは、１〜１００の範囲のアミノ酸長さの任意選択的なペプチドリンカーであり、
    ｙは０または１である）
    を有する融合タンパク質を含む酵素触媒と
    を含む反応成分のセットを備え、
    上記の反応成分を適切な反応条件下で組み合わせ、それにより、少なくとも１つの過酸が酵素的に生成され、口腔表面を少なくとも１つの過酸と接触させ、それにより、口腔表面が、漂白、歯のホワイトニング、消毒、脱染、脱臭、バイオフィルムの低減または除去、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される過酸ベースの利益を受ける口腔ケ
    ア製品。
  4. 口腔表面に対する親和性を有するペプチド成分が、抗体、Ｆａｂ抗体断片、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）抗体、ラクダ科抗体、スカフォールドディスプレイタンパク質または免疫グロブリンの折り畳みを欠いた単鎖ポリペプチドである、請求項３に記載の口腔ケア製品。
  5. 単鎖ポリペプチドが、５〜６０の範囲のアミノ酸長さであり、口腔表面に対して１０−５Ｍ以下のＫＤ値またはＭＢ５０値を有する少なくとも１つの口腔表面結合ペプチドを含む、請求項４に記載の口腔ケア製品。
  6. 単鎖ポリペプチドが２〜５０の口腔表面結合ペプチドを含み、口腔表面結合ペプチドが、独立してそして場合により、１〜１００の範囲のアミノ酸長さのポリペプチドスペーサーによって分離されていてもよい、請求項５に記載の口腔ケア製品。
  7. 口腔表面が、歯のエナメル質、歯のペリクルまたはこれらの組み合わせを含む歯の表面である、請求項１または３に記載の口腔ケア製品。
  8. 反応成分のセットを組み合わせてから５分以内に、過酸が５００ｐｐｂ〜１０，０００ｐｐｍの濃度で生成される、請求項１または３に記載の口腔ケア製品。
  9. 基質がトリアセチンを含む、請求項１または３に記載の口腔ケア製品。
  10. １）ペルヒドロリシス活性を有する酵素触媒であって、該酵素触媒が、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたときに参照配列の配列番号２とアラインするＣＥ−７シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、該シグネチャーモチーフが、
    ａ）配列番号２の位置１１８〜１２０に対応する位置のＲＧＱモチーフと、
    ｂ）配列番号２の位置１７９〜１８３に対応する位置のＧＸＳＱＧモチーフと、
    ｃ）配列番号２の位置２９８〜２９９に対応する位置のＨＥモチーフと
    を含む酵素触媒であって、
    配列番号２８と少なくとも９０％の配列同等性を有し、配列番号２８の位置２７７に相当するアミノ酸が、アラニン、バリン、セリン又はトレオニンである酵素触媒、
    ２）ａ）構造
    ［Ｘ］ｍＲ５
    （式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり、
    Ｒ６＝場合によりヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７線状、分枝状または環状ヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含んでいてもよく、
    Ｒ５＝場合によりヒドロキシル基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６線状、分枝状、もしくは環状ヒドロカルビル部分または５員環状ヘテロ芳香族部分または６員環状芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり、ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み、Ｒ５は場合により１つまたはそれより多いエーテル結合を含んでいてもよく、
    ｍは、１からＲ５中の炭素原子の数までの範囲の整数である）
    を有し、２５℃において少なくとも５ｐｐｍの水中溶解度を有するエステル、
    ｂ）構造
    Figure 0006410786
     （式中、Ｒ１＝場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である）
    を有するグリセリド、
    ｃ）式
    Figure 0006410786

    （式中、Ｒ１は、場合によりヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基によって置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７直鎖または分枝鎖アルキルであり、Ｒ２は、Ｃ１〜Ｃ１０直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である）
    の１つまたはそれより多いエステル、および
    ｄ）アセチル化単糖類、アセチル化二糖類、およびアセチル化多糖類からなる群から選択されるアセチル化糖類
    からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
    ３）過酸素源と
    を含み、１）、２）、および３）を混合したときに過酸が形成される過酸発生組成物の、う歯、歯肉炎、口腔カンジダ症、または歯周炎の処置または予防のための口腔ケア製品の製造のための使用。
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