MX2014011654A - Enzimas utiles para la produccion de peracidos. - Google Patents

Abstract

Se proporciona acetilxilan esterasas y variantes de estas que tienen actividad perhidrolítica para producir ácidos peroxicarboxílicos a partir de ésteres de ácido carboxílico y una fuente de peroxígeno. Se proporciona, además, sistemas para generar perácidos de múltiples componentes que comprenden un catalizador enzimático que tiene actividad perhidrolítica, así como métodos para usar el presente catalizador enzimático para producir ácidos peroxicarboxílicos. El polipéptido que tiene actividad perhidrolítica puede usarse para producir ácidos peroxicarboxílicos adecuados para usar en una gran variedad de aplicaciones, tales como limpieza, desinfección, esterilización, blanqueo, procesamiento de pulpa de madera, procesamiento de pulpa de papel y aplicaciones para el cuidado personal.

Description

ENZIMAS UTILES PARA LA PRODUCCION DE PERACIDOS CAMPO DE LA INVENCION La presente descripción se relaciona con el campo de la biosíntesis de ácidos peroxicarboxílicos y catálisis de enzimas. Más específicamente, se proporcionan sistemas para generar perácidos de múltiples componentes que comprenden un catalizador enzimático que tiene actividad perhidrolítica . Se proporcionan, además, métodos para usar el presente catalizador enzimático para producir ácidos peroxicarboxílicos .

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las composiciones de ácido peroxicarboxílico pueden ser agentes antimicrobianos efectivos. Los métodos para usar ácidos peroxicarboxílicos para limpiar, desinfectar y/o esterilizar superficies duras, textiles, productos de carne, tejidos de plantas vivas y dispositivos médicos contra la flora microbiana indeseable se han descritos (patente de los Estados Unidos núm. 6,545,047; patente de los Estados Unidos núm. 6,183,807; patente de los Estados Unidos núm. 6,518,307; publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2003-0026846; y la patente de los Estados Unidos núm. 5,683,724). Los ácidos peroxicarboxílicos se han usado, además, en diversas aplicaciones de blanqueo que incluyen, pero no se limitan a, aplicaciones de Ref . : 251097 blanqueo/deslignificación de pulpa de madera y para el cuidado de la ropa (patente europea núm. 1040222B1; patente de los Estados Unidos núm. 5,552,018; patente de los Estados Unidos núm. 3,974,082; patente de los Estados Unidos núm. 5,296,161; y patente de los Estados Unidos núm. 5,364,554). La concentración eficaz deseada de ácido peroxicarboxílico puede variar de conformidad con la aplicación del producto (por ejemplo, ca. 500 ppm a 1000 ppm para la desinfección de instrumentos médicos, ca . 30 ppm a 80 ppm para aplicaciones de blanqueo o desinfección de ropa) en un tiempo de reacción de 1 min a 5 min a pH neutro.

Las enzimas clasificadas estructuralmente como miembros de la familia 7 de las carbohidrato esterasas (CE-7) se han usado como perhidrolasas para catalizar la reacción de peróxido de hidrógeno (o, alternativamente, reactivo de peróxido) con ásteres de alquilo de ácidos carboxílicos en agua a un pH en intervalo de básico a acídico (de ca. pH 10 a ca. pH 5) para producir una concentración eficaz de un ácido peroxicarboxílico para tales aplicaciones como la desinfección (tal como de instrumentos médicos, superficies duras, textiles) , blanqueo (tal como el procesamiento/deslignificación de pulpa de madera o pulpa de papel, aplicaciones de blanqueo de tejidos y de cuidado de la ropa) y otras aplicaciones para el cuidado de la ropa, tales como desmanchado, desodorización y desinfección, y aplicaciones para el cuidado personal (patentes de los Estados Unidos núm. 7,964,378; 7,951,566; y 7,723,083; solicitud de patente publicada de los Estados Unidos núm. 2008-0176299 otorgada a DiCosimo et al.; y solicitudes de patentes publicadas de los Estados Unidos núm. 2012-0317733 y 2012-0328534 otorgadas a Chisholm et al.). Se ha descubierto que las enzimas CE- 7 tienen una actividad específica alta para la perhidrólisis de ésteres, particularmente, ésteres de acetilo de alcoholes, dioles y gliceroles. Las variantes de perhidrolasas CE-7 derivadas de diversas especies que tienen rendimiento mejorado han sido reportadas por DiCosimo et al. (patentes de los Estados Unidos núm. 7,927,854; 7,923,233; 7,932,072; 7,910,347; 7,960,528; 8,062,875; 8,206,964; 8,389,254; y 8,389,255; y solicitudes de patentes publicadas de los Estados Unidos núm. 2011-0236336 y 2011-0236338) .

Las carbohidrato esterasas CE-7 reportadas previamente que tienen actividad perhidrolítica (tanto silvestres como variantes de estas) comprendían un motivo "distintivo" estructural conservado como definen Vincent et al. (J. Mol. Biol, 330:593-606 (2003)). Más específicamente, el motivo distintivo CE- 7 usado para identificar y definir estructuralmente los miembros de la familia de carbohidrato esterasas CE-7 comprende tres submotivos conservados: 1) un submotivo "RGQ" de Argll8-Glyll9-Glnl20 , 2) un submotivo "GXSQG" de Glyl86-Xaal87-Serl88-Glnl89-Glyl90, y 3) un submotivo "HE" de His303-Glu304 (la numeración y orientación de los residuos con relación a la secuencia de referencia de Thermotoga marítima proporcionada como sec . con núm. de ident . : 2 ) .

Si bien la gran mayoría de enzimas clasificadas como carbohidrato esterasas CE-7 constan de un motivo distintivo definido por Vincent et al., diversas secuencias de polipéptidos se han agregado a la familia 7 de las carbohidrato esterasas que no contienen el submotivo "HE" (Cantarel et al., "The Carbohydrate-Active EnZymes datábase (CAZy) : an expert resource for Glycogenomics", NAR, 37:D233-D238 (2009) ) . La presencia de actividad perhidrolítica dentro de este subgrupo aún no se ha reportado.

La incorporación de tecnología de enzimas perhidrolíticas en ciertas aplicaciones puede requerir la identificación de nuevas enzimas perhidrolíticas. Por lo tanto, se requiere identificar catalizadores enzimáticos adicionales que comprenden un polipéptido que tiene una actividad perhidrolítica significativa.

SUMARIO DE LA INVENCION Se ha identificado diversas enzimas que tienen una actividad perhidrolítica adecuada para la producción de perácidos a concentraciones eficaces.

En una modalidad, se proporciona un sistema enzimático para producir perácidos; el sistema comprende un grupo de componentes de reacción que comprenden: (1) por lo menos un sustrato seleccionado del grupo que consiste en: (i) uno o más ásteres que tienen la estructura [X] mR5 en donde X = un grupo éster de la fórmula R6-C(0)0; R6 = una porción hidrocarbilo de Cl a C7 lineal, ramificada o cíclica sustituida opcionalmente con grupos hidroxilo o grupos alcoxi de Cl a C4 , en donde R6 comprende, opcionalmente, uno o más enlaces éter para R6 = C2 a C7 ; Rs = una porción hidrocarbilo de Cl a C6 lineal, ramificada o cíclica o porción heteroaromática cíclica de cinco miembros o una porción aromática o heteroaromática cíclica de seis miembros sustituida opcionalmente con grupos hidroxilo; en donde cada átomo de carbono en R5 comprende, individualmente, no más de un grupo hidroxilo o no más de un grupo éster o grupo ácido carboxílico; en donde R5 comprende, opcionalmente, uno o más enlaces éter; m = un entero en el intervalo de 1 al número de átomos de carbono en R5; y en donde los ésteres tienen una solubilidad en agua de por lo menos 5 ppm a 25 °C; (ii) uno o más glicéridos que tienen la estructura en donde Ri = un alquilo de Cl a C21 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi de Cl a C4 y R3 y R4 son, individualmente, H o RiC(O) ; (iii) uno o más ésteres de la fórmula: en donde Ri = un alquilo de Cl a C7 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi de Cl a C4 y R2 = un alquilo de Cl a CIO de cadena lineal o ramificada, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, heteroarilo, (CH2CH20)n, o (CH2CH(CH3) -0)nH y n es de 1 a 10; (iv) uno o más monosacáridos acetilados, disacáridos acetilados o polisacáridos acetilados; y (v) cualquier combinación de (i) a (iv) ; (2) una fuente de peroxígeno; y (3) un catalizador enzimático que comprende un polipéptido que tiene actividad perhidrolítica y una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos que se expone en la sec . con núm. de ident . : 4, siempre que el residuo de aminoácidos unido al lado C-terminal de la histidina catalítica no es ácido glutámico; por medio de lo cual un perácido se produce enzimáticamente con la combinación de los componentes de reacción en condiciones de reacción adecuadas.

En otra modalidad, se proporciona, además, un proceso para producir un ácido peroxicarboxílico el proceso comprende : (a) proporcionar un grupo de componentes de reacción que comprenden: (1) por lo menos un sustrato seleccionado del grupo que consiste en: (i) uno o más ásteres que tienen la estructura [X]mR5 en donde X = un grupo éster de la fórmula R.6-C(0)0; R6 = una porción hidrocarbilo de Cl a C7 lineal, ramificada o cíclica sustituida opcionalmente con grupos hidroxilo o grupos alcoxi de Cl a C , en donde R6 comprende, opcionalmente , uno o más enlaces éter para R6 = C2 a Cl; R5 = una porción hidrocarbilo de Cl a C6 lineal, ramificada o cíclica o porción heteroaromática cíclica de cinco miembros o una porción aromática o heteroaromática cíclica de seis miembros sustituida opcionalmente con grupos hidroxilo; en donde cada átomo de carbono en R5 comprende, individualmente, no más de un grupo hidroxilo o no más de un grupo éster o grupo ácido carboxílico; en donde R5 comprende, opcionalmente, uno o más enlaces éter; m = un entero en el intervalo de 1 al número de átomos de carbono en R5; y en donde los ésteres tienen una solubilidad en agua de por lo menos 5 ppm a 25 °C; (ii) uno o más glicéridos que tienen la estructura en donde Ri = un alquilo de Cl a C21 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi de Cl a C4 y R3 y R son, individualmente, H o RiC(O) ; (iii) uno o más ésteres de la fórmula: en donde Ri = un alquilo de Cl a C7 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi de Cl a C4 y R2 un alquilo de Cl a CIO de cadena lineal o ramificada, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo , heteroarilo, (CH2CH20)n, o (CH2CH (CH3) -0)nH y n es de 1 a 10; (iv) uno o más monosacár idos acilados, disacáridos acilados o polisacáridos acilados; y (v) cualquier combinación de (i) a (iv) ; (2) una fuente de peroxígeno; y (3) un catalizador enzimático que comprende un polipéptido que tiene actividad perhidrolí t ica y una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos que se expone en la sec. con núm . de ident. : 4, siempre que el residuo de aminoácidos unido al lado C-terminal de la histidina catalítica no es ácido glutámico; (b) combinar el grupo de componentes de reacción en condiciones de reacción adecuadas para producir ácido peroxicarboxílico; y (c) opcionalmente, diluir el ácido peroxicarboxílico producido en la etapa (b) .

En otra modalidad, se proporciona un proceso que comprende, además, una etapa (d) , en donde el ácido peroxicarboxilico producido en la etapa (b) o en la etapa (c) se pone en contacto con una superficie dura, la superficie de un cuerpo o por lo menos una prenda de vestir.

El presente proceso produce el ácido peroxicarboxilico deseado al combinar los componentes de reacción. Los componentes de reacción pueden permanecer separados hasta usar.

En un aspecto adicional, se proporciona un sistema de producción y suministro de ácido peroxicarboxilico; el sistema comprende: (a) un primer compartimento que comprende (1) un catalizador enzimático que comprende un polipéptido que tiene actividad perhidrol tica y una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos que se expone en la sec. con núm. de ident . : 4 siempre que el residuo de aminoácidos unido al lado C-terminal de la histidina catalítica no es ácido glutámico; (2) por lo menos un sustrato seleccionado del grupo que consiste en: (i) uno o más ésteres que tienen la estructura [X] mRs en donde X = un grupo éster de la fórmula R.6-C(0)0; R.6 = una porción hidrocarbilo de Cl a C7 lineal, ramificada o cíclica sustituida opcionalmente con grupos hidroxilo o grupos alcoxi de Cl a C4 , en donde R6 comprende, opcionalmente, uno o más enlaces éter para R.6 = C2 a C7 ; R5 = una porción hidrocarbilo de Cl a C6 lineal, ramificada o cíclica o porción heteroaromática cíclica de cinco miembros o una porción aromática o heteroaromática cíclica de seis miembros sustituida opcionalmente con grupos hidroxilo; en donde cada átomo de carbono en R5 comprende, individualmente, no más de un grupo hidroxilo o no más de un grupo éster o grupo ácido carboxílico; en donde R5 comprende, opcionalmente, uno o más enlaces éter; m = un entero en el intervalo de 1 al número de átomos de carbono en R5; y en donde los ésteres tienen una solubilidad en agua de al menos 5 ppm a 25 °C; (ii) uno o más glicéridos que tienen la estructura en donde Ri = un alquilo de Cl a C21 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi de Cl a C4 y R3 y R son, individualmente, H o RiC(O) ; (iii) uno o más esteres de la fórmula: en donde Ri = un alquilo de Cl a C7 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi de Cl a C4 y R2 = un alquilo de Cl a CIO de cadena lineal o ramificada, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, heteroarilo, (CH2CH20)n, o (CH2CH (CH3) -O) nH y n es de 1 a 10; (iv) uno o más monosacáridos acilados, disacáridos acilados o polisacáridos acilados; y (v) cualquier combinación de (i) a (iv) ; y (3) un amortiguador opcional; y (b) un segundo compartimento que comprende: (1) una fuente de peroxígeno; (2) un estabilizante del peróxido; y (3) un amortiguador opcional.

En una modalidad adicional, se proporciona una composición para el cuidado de la ropa; la composición comprende : a) un polipéptido que tiene actividad perhidrolítica y una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos que se expone en la sec . con núm. de ident . : 4, siempre que el residuo de aminoácidos unido al lado C-terminal de la histidina catalítica no es ácido glutámico; b) al menos un sustrato seleccionado del grupo que consiste en: (i) uno o más ésteres que tienen la estructura [X] mRs en donde X = un grupo éster de la fórmula R6-C(0)0; R6 = una porción hidrocarbilo de Cl a C7 lineal, ramificada o cíclica sustituida opcionalmente con grupos hidroxilo o grupos alcoxi de Cl a C4 , en donde R6 comprende, opcionalmente, uno o más enlaces éter para R6 = C2 a C7 ; R5 una porción hidrocarbilo de Cl a C6 lineal, ramificada o cíclica o porción heteroaromática cíclica de cinco miembros o una porción aromática o heteroaromática cíclica de seis miembros sustituida opcionalmente con grupos hidroxilo; en donde cada átomo de carbono en Rs comprende, individualmente, no más de un grupo hidroxilo o no más de un grupo éster o grupo ácido carboxílico; en donde R5 comprende, opcionalmente , uno o más enlaces éter; m = un entero en el intervalo de 1 al número de átomos de carbono en R5; y en donde los ésteres tienen una solubilidad en agua de al menos 5 ppm a 25 °C; (ii) uno o más glicéridos que tienen la estructura en donde Ri = un alquilo de Cl a C21 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi de Cl a C4 y R3 y R4 son, individualmente, H o RiC(O) ; (iii) uno o más ésteres de la fórmula: en donde Ri = un alquilo de Cl a C7 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi de Cl a C4 y R2 = un alquilo de Cl a CIO de cadena lineal o ramificada, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, heteroarilo, (CH2CH20)n, o (CH2CH(CH3) -0)nH y n es de 1 a 10; (iv) uno o más monosacáridos acilados, disacáridos acilados o polisacáridos acilados; y (v) cualquier combinación de (i) a (iv) ; y c) una fuente de peroxígeno; y d) por lo menos un tensioactivo .

En una modalidad adicional, se proporciona un producto para el cuidado personal que comprende un polipéptido que tiene actividad perhidrolítica, el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con el secuencia de aminoácidos que se expone en la sec . con núm. de ident . : 4, siempre que el residuo de aminoácidos unido al lado C-terminal de la histidina catalítica no es ácido glutámico.

En una modalidad adicional, el producto para el cuidado personal es un champú, una crema para el cuerpo, un gel de ducha, un humectante tópico, una crema dental, un gel dental, un enjuague bucal, un lavado bucal, un enjuague antisarro o un producto de limpieza tópico.

En una modalidad adicional, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislado seleccionada del grupo que consiste en : (a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad perhidrolítica ; el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la sec . con núm. de ident . : 14 o sec. con núm. de ident.: 16; (b) un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de la sec. con núm. de ident. : 13 o sec. con núm. de ident. : 15; y (c) un polinucleótido completamente complementario para el polinucleótido de (a) o (b) .

En una modalidad adicional, se proporciona un polipéptido aislado que tiene actividad perhidrolítica que comprende la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 14 o sec. con núm. de ident.: 16.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A y IB son un alineamiento CLUSTAL de las sec. con núms . de ident.: 2, 4, 6, 8, 10, y 12.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS DE NEUCLOTIDOS Y AMINOACIDOS Las siguientes secuencias cumplen con el Título 37 del C.F.R. §§ 1.821-1.825 ("Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - the Sequence Rules") según la norma ST.25 (2009) de la Organización Mundial de Propiedad (WIPO, por sus siglas en inglés) y los requisitos para listados de secuencias del Convenio sobre la Patente Europea (EPC, por sus siglas en inglés) y las reglamentaciones del Tratado de Cooperación en materia de Patentes (PCT, por sus siglas en inglés) 5.2 y 49.5(a-bis) y la sección 208 y el Anexo C de las Instrucciones Administrativas. Los símbolos y el formato que se usan para los datos de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos cumplen con las reglas que se exponen en el Título 37 del C.F.R., §1.822.

La sec . con núm. de ident . : 1 es la secuencia de ácido nucleico de la región codificante optimizada por codones que codifica la acetilxilano esterasa de Thermotoga marítima que tiene actividad perhidrolítica .

La sec. con núm. de ident. : 2 es la secuencia de aminoácidos de la acetilxilano esterasa de Thermotoga marítima que tiene actividad perhidrolítica.

La sec. con núm. de ident. : 3 es la secuencia de ácido nucleico de la región codificante optimizada por codones que codifica una acetilxilano esterasa de Actinosynnema mirum que tiene actividad perhidrolítica.

La sec. con núm. de ident.: 4 es la secuencia de aminoácidos de una acetilxilano esterasa de Actinosynnema mirum que tiene actividad perhidrolítica.

La sec. con núm. de ident. : 5 es la secuencia de ácido nucleico de la región codificante optimizada por codones que codifica una acetilxilano esterasa de Propionibacterium acnés que tiene actividad perhidrolítica.

La sec. con núm. de ident . : 6 es la secuencia de aminoácidos de una acetilxilano esterasa de Propionibacterium acnés que tiene actividad perhidrolítica .

La sec. con núm. de ident.: 7 es la secuencia de ácido nucleico de la región codificante optimizada por codones que codifica una acetilxilano esterasa de Streptococcus equi que tiene actividad perhidrolítica.

La sec. con núm. de ident. : 8 es la secuencia de aminoácidos de una acetilxilano esterasa de Streptococcus egui que tiene actividad perhidrolítica.

La sec. con núm. de ident. : 9 es la secuencia de ácido nucleico de la región codificante optimizada por codones que codifica una acetilxilano esterasa de Stackebrandtia nassauensis que tiene actividad perhidrolítica.

La sec. con núm. de ident. : 10 es la secuencia de aminoácidos de una acetilxilano esterasa de Stackebrandtia nassauensis que tiene actividad perhidrolítica.

La sec. con núm. de ident.: 11 es la secuencia de ácido nucleico de la región codificante optimizada por codones que codifica una acetilxilano esterasa de Streptococcus agalactiae que tiene actividad perhidrolítica.

La sec. con núm. de ident. : 12 es la secuencia de aminoácidos de una acetilxilano esterasa de Streptococcus agalactiae que tiene actividad perhidrolítica.

La sec. con núm. de ident. : 13 es la secuencia de ácido nucleico de la región codificante optimizada por codones que codifica una variante C277S de acetilxilano esterasa de Actinosynnema mirum que tiene actividad perhidrolítica .

La sec. con núm. de ident . : 14 es la secuencia de aminoácidos de una variante C277S de acetilxilano esterasa de Actinosynnema mirum que tiene actividad perhidrolítica.

La sec. con núm. de ident. : 15 es la secuencia de ácido nucleico de la región codificante optimizada por codones que codifica una variante C277T de acetilxilano esterasa de Actinosynnema mirum que tiene actividad perhidrolítica.

La sec. con núm. de ident. : 16 es la secuencia de aminoácidos de una variante C277T de acetilxilano esterasa de Actinosynnema mirum que tiene actividad perhidrolítica.

La sec. con núm. de ident.: 17 es la secuencia de aminoácidos de una variante C277S de Thermotoga marítima (patente de los Estados Unidos núm. 8,062,875).

La sec. con núm. de ident.: 18 es la secuencia de aminoácidos de la variante C277T de Thermotoga marítima (patente de los Estados Unidos núm. 8,062,875).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Se proporcionan composiciones y métodos que comprenden un polipéptido que tiene actividad perhidrolítica, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos que se expone en la sec. con núm. de ident. : 4, siempre que el residuo de aminoácidos unido al lado C-terminal de la histidina catalítica no es ácido glutámico. Las composiciones y métodos son adecuados para producir enzimáticamente por lo menos un perácido adecuado para usar en un producto para el cuidado de la ropa, un producto desinfectante, un producto cosmético o un producto para el cuidado personal.

En esta descripción se usan varios términos y abreviaturas. Se aplican las siguientes definiciones a menos que se mencione específicamente lo contrario.

Como se usa en la presente descripción, los artículos "un (a)", "unos (as)", "el (los)" y "la (las)" que preceden a un elemento o componente de la invención están previstos para ser no restrictivos con respecto a la cantidad de instancias (es decir, ocurrencias) del elemento o componente. Por lo tanto "un", "una" y "el (la)" deben interpretarse para incluir uno o por lo menos uno y la forma singular de la palabra del elemento o componente incluye, además, el plural, a menos que el número obviamente indique que es singular.

El término "que comprende" se refiere a la presencia de las características, enteros, etapas o componentes mencionados tal como se indican en las reivindicaciones, pero no excluye la presencia o adición de una o más características, enteros, etapas, componentes adicionales o grupos de estos. El término "que comprende" está previsto para incluir modalidades abarcadas por los términos "que consiste esencialmente en" y "que consiste en". De manera similar, el término "que consiste esencialmente de" está previsto para incluir modalidades abarcadas por el término "que consiste en".

Como se usa en la presente descripción, el término "aproximadamente" que modifica la cantidad de un ingrediente o reactivo empleado se refiere a la variación que puede producirse en la cantidad numérica, por ejemplo, a través de procedimientos de manejo de líquidos y de mediciones típicos usados para preparar concentrados o soluciones de uso en el mundo real; a través de errores inadvertidos en estos procedimientos; a través de diferencias en la fabricación, procedencia o pureza de los ingredientes empleados para preparar las composiciones o llevar a cabo los métodos; y similares. El término "aproximadamente" también abarca cantidades que difieren debido a condiciones de equilibrio diferentes para una composición que resulta de una mezcla inicial específica. Estén o no modificadas por el término "aproximadamente", las reivindicaciones incluyen equivalentes para las cantidades.

Cuando están presentes, todos los intervalos son inclusivos y combinables. Por ejemplo, cuando se menciona un intervalo de "1 a 5", debe interpretarse que el intervalo mencionado incluye los intervalos "1 a 4", "1 a 3", "1-2", "1-2 & 4-5", "1-3 & 5" y similares.

Como se usa en la presente descripción, el término "sistema de múltiples componentes" se refiere a un sistema para producir enzimáticamente ácido peroxicarboxílico, en donde los componentes permanecen separados hasta usar. Como tal, el sistema de múltiples componentes incluye por lo menos un primer componente que permanece separado de por lo menos un segundo componente. El primer componente y el segundo componente se encuentran separados en compartimentos diferentes hasta usar (es decir, hasta usar el primer compartimento y el segundo compartimento) . El diseño de los sistemas de múltiples componentes dependen, frecuentemente, de la forma física de los componentes a combinar y se describen en mayor detalle a continuación.

Como se usa en la presente descripción, el término "ácido peroxicarboxílico" es sinónimo de perácido, peroxiácido, ácido peroxi, ácido percarboxílico y ácido peroxoico.

Como se usa en la presente descripción, el término "ácido peracético" se abrevia como "PAA" y es sinónimo de ácido peroxiacético, ácido etanoperoxoico y todos los demás sinónimos del número de registro CAS 79-21-0.

Como se usa en la presente descripción, el término "monoacetina" es sinónimo de monoacetato de glicerol, monoacetato de glicerina, y monoacetato de glicerilo.

Como se usa en la presente descripción, el término "diacetina" es sinónimo de diacetato de glicerol; diacetato de glicerina, diacetato de glicerilo y todos los demás sinónimos del número de registro CAS 25395-31-7.

Como se usa en la presente descripción, el término "triacetina" es sinónimo de triacetato de glicerina; triacetato de glicerol; triacetato de glicerilo; 1,2,3-triacetoxipropano; triacetato de 1 , 2 , 3-propanotriol ; y todos los demás sinónimos del núm. de registro CAS 102-76-1.

Como se usa en la presente descripción, el término "monobutirina" es sinónimo de monobutirato de glicerol, monobutirato de glicerina y monobutirato de glicerilo.

Como se usa en la presente descripción, el término "dibutirina" es sinónimo de dibutirato de glicerol y dibutirato de glicerilo.

Como se usa en la presente descripción, el término "tributirina" es sinónimo de tributirato de glicerol; 1,2,3-tributirilglicerol ; y todos los demás sinónimos del núm. de registro CAS 60-01-5.

Como se usa en la presente descripción, el término "monopropionina" es sinónimo de monopropionato de glicerol, monopropionato de glicerina, y monopropionato de glicerilo.

Como se usa en la presente descripción, el término "dipropionina" es sinónimo de dipropionato de glicerol y dipropionato de glicerilo.

Como se usa en la presente descripción, el término "tripropionina" es sinónimo de tripropionato de glicerilo, tripropionato de glicerol, 1 , 2 , 3 -tripropionilglicerol y todos los demás sinónimos del número de registro CAS 139-45-7.

Como se usa en la presente descripción, los términos "azúcar acilada" y "sacárido acilado" se refieren a mono-, di-y polisacáridos que comprenden por lo menos un grupo acilo, en donde el grupo acilo se selecciona del grupo que consiste en carboxilatos alifáticos de cadena lineal que tienen una longitud de la cadena de C2 a C8. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, pentaacetato de glucosa, tetraacetato de xilosa, xilano acetilado, fragmentos de xilano acetilado, ß-D-ribofuranosa-1, 2,3, 5 -tetraacetato, tri -O-acetil-D-galactal y tri-O-acetil-glucal .

Como se usa en la presente descripción, los términos "hidrocarbilo", "grupo hidrocarbilo" y "entidad hidrocarbilo" se refieren a un arreglo de átomos de carbono de cadena lineal, ramificada o cíclica conectados por enlaces carbono-carbono simples, dobles o triples y/o por enlaces éter y sustituidos correspondientemente por átomos de hidrógeno. Los grupos hidrocarbilo pueden ser alifáticos y/o aromáticos. Los ejemplos de grupos hidrocarbilo incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, t-butilo, ciclopropilo, ciclobutilo, pentilo, ciclopentilo, metilciclopentilo, hexilo, ciclohexilo, bencilo, y fenilo. En una modalidad, la porción hidrocarbilo es un arreglo de cadena lineal, ramificada o cíclica de átomos de carbono conectados por enlaces carbono-carbono simples y/o por enlaces éter, y sustituidos correspondientemente con átomos de hidrógeno .

Como se usa en la presente descripción, el término "aromático" se refiere a un compuesto orgánico o porción que se caracteriza por una estabilidad química incrementada resultante de la deslocalización de electrones en un sistema anular que contiene, usualmente, múltiples enlaces dobles conjugados. Los anillos conjugados monocíclicos planos que tienen electrones deslocalizados deben ser aromáticos si tienen electrones n (4n+2) . Los ejemplos de compuestos aromáticos pueden incluir derivados de benceno (tales como ácido 2-, 3- o 4-acetoxibenzoico) . En una modalidad, el sustrato de éster puede ser ácido 4-acetoxibenzoico.

Como se usa en la presente descripción, el término "heterocíclico" se refiere a un compuesto orgánico o porción con una estructura de anillos con uno o más átomos distintos a carbono en por lo menos uno de sus anillos.

Como se usa en la presente descripción, el término "heteroaromático" se refiere a un compuesto orgánico o porción con una estructura anular tanto heterocíclica como aromática, en donde el anillo comprende por lo menos uno de los heteroátomos oxígeno, nitrógeno o azufre. Los ejemplos de porciones heteroaromáticas pueden incluir porciones de piridina, pirrol, furano, y tiofeno.

Como se usa en la presente descripción, los términos "monoésteres" y "diésteres" de 1 , 2 -etanodiol , 1 , 2 -propanodiol , 1, 3-propanodiol, 1 , 2 -butanodiol , 1 , 3 -butanodiol , 2,3-butanodiol, 1 , -butanodiol , 1,2-pentanodiol, 2 , 5 -pentanodiol , 1, 6-pentanodiol, 1 , 2 -hexanodiol , 2 , 5 -hexanodiol , 1,6-hexanodiol se refieren a los compuestos que comprenden por lo menos un grupo éster de la fórmula RC(0)0, en donde R es una porción hidrocarbilo lineal de Cl a C7.

Como se usa en la presente descripción, los términos "formulación de reacción enzimática adecuada", "componentes adecuados para producir un ácido peroxicarboxílico", "componentes de reacción adecuados", "componentes de reacción", "formulación de reacción" y "formulación de reacción acuosa adecuada" se refieren a los materiales y agua, en donde los reactantes y el catalizador enzimático que comprende la variante del polipéptido presente que tiene actividad perhidrolítica entran en contacto para formar el ácido peroxicarboxílico deseado. Los componentes de la formulación de reacción se proporcionan en la presente descripción y aquellos con experiencia en la técnica aprecian el intervalo de variaciones de los componentes adecuados para este proceso. En una modalidad, la formulación de reacción enzimática produce ácido peroxicarboxílico in situ al combinar los componentes de reacción. Como tales, los componentes de reacción pueden proporcionarse como un sistema de múltiples componentes, en donde uno o más de los componentes de reacción permanecen separados hasta el uso. En la técnica se conoce el diseño de los sistemas y medios para separar y combinar múltiples componentes activos y, generalmente, dependerá de la forma física de los componentes individuales de la reacción. Por ejemplo, los sistemas de fluidos (líquido-líquido) activos múltiples usan, típicamente, botellas dispensadoras de múltiples cámaras o sistemas de dos fases (publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2005-0139608; patente de los Estados Unidos núm. 5,398,846; patente de los Estados Unidos núm. 5,624,634; patente de los Estados Unidos núm. 6,391,840; patente E.P. núm. 0807156B1; publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2005-0008526; y publicación del PCT núm. WO 00/61713) tal como se encuentran en algunas aplicaciones decolorantes, en donde el agente decolorante deseado se produce al mezclar los fluidos reactivos . Las formulaciones de múltiples componentes y los sistemas de producción de múltiples componentes para producir enzimáticamente ácidos peroxicarboxílicos a partir de esteres de ácido carboxílico están descritos por DiCosimo et al. en solicitudes de patentes publicadas de los Estados Unidos núm. 2010-0086510 y 2010-0086621, respectivamente. Otras formas de sistemas de múltiples componentes usados para producir ácido peroxicarboxílico pueden incluir, pero no se limitan a, los diseñados para uno o más componentes sólidos o combinaciones de componentes sólidos- líquidos , tales como los polvos usados en muchas composiciones de blanqueo disponibles comercialmente (por ejemplo, patente de los Estados Unidos núm. 5,116,575), tabletas de múltiples capas (por ejemplo, patente de los Estados Unidos núm. 6,210,639), paquetes disolubles en agua que tienen múltiples compartimentos (por ejemplo, patente de los Estados Unidos núm. 6,995,125) y aglomerados sólidos que reaccionan con la adición de agua (por ejemplo, patente de los Estados Unidos núm. 6,319,888) .

Como se usa en la presente descripción, el término "sustrato" o "sustrato de éster de ácido carboxílico" se refieren a los componentes de reacción perhidrolizados enzimáticamente con el uso del presente catalizador enzimático en presencia de una fuente adecuada de peroxígeno, tal como peróxido de hidrógeno. En una modalidad, el sustrato comprende por lo menos un grupo éster con la capacidad de perhidrolizarse enzimáticamente con el uso del catalizador enzimático para producir un ácido peroxicarboxílico.

Como se usa en la presente descripción, el término "perhidrólisis" se define como la reacción de un sustrato seleccionado con una fuente de peróxido de hidrógeno para formar un ácido peroxicarboxílico. Típicamente, el peróxido inorgánico se hace reaccionar con el sustrato seleccionado en presencia de un catalizador para producir el ácido peroxicarboxílico . Como se usa en la presente descripción, el término "perhidrólisis química" incluye reacciones de perhidrólisis en donde un sustrato (tal como un precursor de ácido peroxicarboxílico) se combina con una fuente de peróxido de hidrógeno, en donde el ácido peroxicarboxílico se forma en ausencia de un catalizador enzimático. Como se usa en la presente descripción, el término "perhidrólisis enzimática" se refiere a una reacción de un sustrato seleccionado con una fuente de peróxido de hidrógeno para formar un ácido peroxicarboxílico, en donde la reacción está catalizada por un catalizador enzimático que tiene actividad perhidrolítica .

Como se usa en la presente descripción, el término "actividad de perhidrolasa" se refiere a la actividad del catalizador enzimático por unidad de masa (por ejemplo, miligramo) de proteína, peso seco celular o peso del catalizador inmovilizado.

Como se usa en la presente descripción, "una unidad de actividad enzimática" o "una unidad de actividad" o "U" se define como la cantidad de actividad de perhidrolasa requerida para la producción de 1 µp??? de producto de ácido peroxicarboxílico (tal como ácido peracético) por minuto a una temperatura especificada. "Una unidad de actividad enzimática" puede usarse, además, en la presente descripción para referirse a la cantidad de actividad hidrolítica de ácido peroxicarboxílico que se requiere para la hidrólisis de 1 µ???? de ácido peroxicarboxílico (por ejemplo, ácido peracético) por minuto a una temperatura especificada.

Como se usa en la presente descripción, los términos "catalizador enzimático" y "catalizador de perhidrolasa" se refieren a un catalizador que comprende una enzima (por ejemplo, un polipéptido) que tiene actividad perhidrolítica y puede estar en forma de una célula microbiana completa, célula o células microbianas permeabilizadas, uno o más componentes celulares del extracto de una célula microbiana, enzima parcialmente purificada o enzima purificada. El catalizador enzimático puede modificarse, además, químicamente (por ejemplo, por pegilación o por reacción con reactivos de reticulación) . Además, el catalizador de perhidrolasa se puede inmovilizar en un soporte soluble o insoluble con el uso de métodos muy conocidos para aquellos con experiencia en la técnica; ver, por ejemplo, Immobilization of Enzymes and Cells (2.° edición); José M. Guisan, Editor; Humana Press, Totowa, NJ, Estados Unidos; 2006.

Como se usa en la presente descripción, "clasificada estructuralmente como una enzima CE-7", "clasificada estructuralmente como una enzima de la familia 7 de carbohidrato esterasas", "clasificada estructuralmente como una carbohidrato esterasa CE-7" y "perhidrolasa CE-7" se usan en la presente descripción para referirse a las enzimas que tienen actividad perhidrolítica clasificadas estructuralmente como carbohidrato esterasas CE-7 (ver Cantarel et al., "The Carbohydrate-Active EnZymes datábase (CAZy) : an expert resource for Glycogenomics", NAR, 37:D233-D238 (2009)).

Como se usa en la presente descripción, los términos "cefalosporina C deacetilasa" y "cefalosporina C acetil hidrolasa" se refieren a una enzima (E.C. 3.1.1.41) que cataliza la desacetilación de cefalosporinas, tales como cefalosporina C y ácido 7-aminocefalosporánico (Mitsushima et al., Appl. Environ. Microbiol . , 61(6): 2224-2229 (1995); patente de los Estados Unidos núm. 5,528,152; y la patente de los Estados Unidos núm. 5,338,676) .

Como se usa en la presente descripción, "acetilxilano esterasa" se refiere a una enzima (E.C. 3.1.1.72; AXE) que cataliza la desacetilación de xilanos acetilados y otros sacáridos acetilados.

Como se usa en la presente descripción, el término "Thermotoga marítima" se refiere a una célula bacteriana que se ha reportado que tiene actividad de acetilxilano esterasa (GENBA K® NP_227893.1) . En un aspecto, la cepa de Thermotoga marítima es MSB8 de Thermotoga marítima. La secuencia de aminoácidos de la enzima silvestre que tiene actividad de perhidrolasa a partir de Thermotoga marítima se proporciona como sec. con núm. de ident . : 2.

El término "aminoácido" se refiere a la unidad estructural química básica de una proteína o polipéptido. Las siguientes abreviaturas se usan en la presente descripción Tres letras Una letra Aminoácido Abreviatura Abreviatura Alanina Ala A Arginina Arg R Asparagina Asn N Ácido aspártico Asp D Cisteína Cys C Glutamina Gln Q Ácido glutámico Glu E Glicina Gly G Histidina His H Isoleucina lie I Leucina Leu L Lisina Lis K Metionina Met M Fenilalanina Phe F Prolina Pro P Serina Ser S Treonina Thr T Triptófano Trp W Tirosina Tyr Y Valina Val V Cualquier aminoácido (o Xaa X como se define en la presente descripción) Como se usa en la presente descripción, el término "contaminantes biológicos" se refiere a una o más porciones biológicas no deseadas y/o patógenas que incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, esporas, virus, priones y mezclas de estos. La presente enzima puede usarse para producir una concentración eficaz de por lo menos un ácido peroxicarboxílico útil para reducir y/o eliminar la presencia de los contaminantes biológicos viables. En una modalidad preferida, el contaminante biológico es un microorganismo patogénico viable.

Como se usa en la presente descripción, el término "desinfectar" se refiere al proceso de destrucción o prevención del crecimiento de contaminantes biológicos. Como se usa en la presente descripción, el término "desinfectante" se refiere a un agente que desinfecta mediante la destrucción, neutralización o inhibición del crecimiento de contaminantes biológicos. Típicamente, los desinfectantes se usan para tratar superficies u objetos inanimados. Como se usa en la presente descripción, el término "antiséptico" se refiere a un agente químico que inhibe el crecimiento de los microorganismos que transmiten enfermedades. En un aspecto de la modalidad, los contaminantes biológicos son microorganismos patogénicos.

Como se usa en la presente descripción, el término "sanitario" se refiere a o se relaciona con la restauración o preservación de la salud, típicamente, mediante la eliminación, prevención o control de un agente que puede ser perjudicial para la salud. Como se usa en la presente descripción, el término "desinfectar" significa purificar. Como se usa en la presente descripción, el término "desinfectante" se refiere a un agente de desinfección. Como se usa en la presente descripción, el término "desinfección" se refiere al acto o proceso de desinfectar.

Como se usa en la presente descripción, el término "virucida" se refiere a un agente que inhibe o destruye virus, y es sinónimo de "virucida". Un agente que muestra la capacidad de inhibir o destruir virus se describe como tener actividad "virucida". Los ácidos peroxicarboxílieos pueden tener actividad virucida. Los virucidas alternos típicos conocidos en la técnica que pueden ser adecuados para usar con la presente invención incluyen, por ejemplo, alcoholes, éteres, cloroformo, formaldehído, fenoles, beta propiolactono, yodo, cloro, sales de mercurio, hidroxilamina, óxido de etileno, etilenglicol , compuestos amonio cuaternarios, enzimas, y detergentes.

Como se usa en la presente descripción, el término "biocida" se refiere a un agente químico, típicamente, de amplio espectro, que inactiva o destruye microorganismos. Un agente químico que exhibe la capacidad para inactivar o destruir microorganismos se describe como un agente con actividad "biocida". Los ácidos peroxicarboxílieos pueden tener actividad biocida. Los biocidas alternos típicos conocidos en la técnica que pueden ser adecuados para usar en la presente invención incluyen, por ejemplo, cloro, dióxido de cloro, cloroisocianuratos , hipocloritos , ozono, acroleína, aminas, fenólicos clorados, sales de cobre, compuestos de órgano-azufre, y sales cuaternarias de amonio.

Como se usa en la presente descripción, la frase "concentración biocida mínima" se refiere a la concentración mínima de un agente biocida que, para un tiempo de contacto específico, producirá una reducción deseada letal e irreversible en la población viable de los microorganismos objetivo. La eficacia puede medirse por medio de la reducción logio en los microorganismos viables después del tratamiento. En un aspecto, la reducción objetivo en los microorganismos viables después del tratamiento es una reducción logarítmica de al menos 3 logio, con mayor preferencia, una reducción logarítmica de al menos 4 logio y, con la máxima preferencia, una reducción logarítmica de al menos 5 logio. En otro aspecto, la concentración biocida mínima es una reducción logarítmica de al menos 6 logio en las células microbianas viables.

Como se usa en la presente descripción, el término "fuente de peroxígeno" se refiere a compuestos con la capacidad de proporcionar peróxido de hidrógeno a una concentración de aproximadamente 1 mM o más cuando está en una solución acuosa que incluye, pero no se limita a, peróxido de hidrógeno, aductos de peróxido de hidrógeno [por ejemplo, aducto de urea-peróxido de hidrógeno (peróxido de carbamida) ) , perboratos y percarbonatos, tales como percarbonato sódico. Como se describe en la presente descripción, la concentración de peróxido de hidrógeno proporcionada por el compuesto de peroxígeno en la formulación de la reacción acuosa es, inicialmente , de al menos 1 mM o más cuando se combinan los componentes de la reacción. En una modalidad, la concentración de peróxido de hidrógeno en la formulación de la reacción acuosa es de al menos 0.5 mM. En otra modalidad, la concentración de peróxido de hidrógeno en la formulación de la reacción acuosa es de al menos 10 mM. En otra modalidad, la concentración de peróxido de hidrógeno en la formulación de la reacción acuosa es de al menos 100 mM. En otra modalidad, la concentración de peróxido de hidrógeno en la formulación de la reacción acuosa es de al menos 200 mM. En otra modalidad, la concentración de peróxido de hidrógeno en la formulación de la reacción acuosa es de 500 mM o más. En aun otra modalidad, la concentración de peróxido de hidrógeno en la formulación de la reacción acuosa es de 1000 mM o más. La relación molar del peróxido de hidrógeno y sustrato de enzimas, tales como triglicérido, (H2O2 : sustrato) en la formulación de reacción acuosa puede ser de aproximadamente 0.002 a 20, preferentemente, de aproximadamente 0.1 a 10 y, con la máxima preferencia, de aproximadamente 0.5 a 5.

Como se usa en la presente descripción, el término "agente de beneficio" se refiere a un material que promueve o mejora una ventaja útil, un efecto o beneficio favorable/deseable. En una modalidad, se proporciona un proceso con el cual un agente de beneficio, tal como una composición que comprende un ácido peroxicarboxílico, se aplica a un tejido o prenda de vestir para lograr un beneficio deseado, tal como desinfección, blanqueo, desmanchado, desodorización, y cualquier combinación de estos En otra modalidad, la variante del polipéptido presente que tiene actividad perhidrolítica puede usarse para producir un agente de beneficio a base de perácidos para usar en productos para el cuidado personal (tales como productos para el cuidado del cabello, productos para el cuidado de la piel, productos para el cuidado de las uñas o productos para el cuidado bucal) . En una modalidad, se proporciona un producto para el cuidado personal que comprende un polipéptido que tiene actividad perhidrolítica; el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos que se expone en la sec. con núm. de ident . : 4, 14 o 16, siempre que el residuo de aminoácidos unido al lado C-terminal de la histidina catalítica no es ácido glutámico. Los productos para el cuidado personal están formulados para proporcionar una concentración segura y eficaz del agente de beneficio de perácidos deseado.

Como se usa en la presente descripción, "productos para el cuidado personal" se refiere a productos usados en la limpieza, blanqueo y/o desinfección del cabello, piel, cuero cabelludo y dientes, que incluyen, pero no se limitan a, champús, cremas para el cuerpo, geles de ducha, hidratantes tópicos, crema dental, geles dentales, enjuagues bucales, lavado bucal, enjuagues antisarro y/u otros productos de limpieza tópicos. En algunas modalidades particularmente preferidas, estos productos se usan en seres humanos, mientras que en otras modalidades estos productos son útiles para animales no humanos (por ejemplo, aplicaciones veterinarias) .

Como se usa en la presente descripción, los términos "blanqueo dental" y "decoloración dental" se usan indistintamente y se refieren a mejorar la luminosidad (es decir, blanqueo) de un diente o dientes. Se pretende que el término incluya cualquier método adecuado para blanquear los dientes, que incluyen la presente invención, así como el tratamiento con sustancias químicas, tratamiento con ácido leve, blanqueo dental abrasivo y blanqueo dental por láser. En las modalidades particularmente preferidas, la presente invención proporciona una perhidrolasa y composiciones que contienen perhidrolasa adecuadas para blanquear los dientes.

Polipéptidos que tienen actividad perhidrolítica El "motivo distintivo" para esterasas CE-7 reportado anteriormente con actividad perhidrolítica está comprendido por tres submotivos conservados (la numeración de la posición de los residuos con relación a la secuencia de referencia de la sec. con núm. de ident . : 2; la esterasa de Thermotoga marítima acetilxilano silvestre) : a) Argll8-Glyll9-Glnl20; ("motivo RGQ") ; b) Glyl86-Xaal87-Serl88-Glnl89-Glyl90; y ("motivo GXSQG") ; y c) His303-Glu304. ("motivo HE") .

Típicamente, el Xaa en la posición del residuo del aminoácido 187 es glicina, alanina, prolina, triptófano o treonina. Dos de los tres residuos de aminoácidos que pertenecen a la tríada catalítica están en negritas.

Aunque las enzimas perhidrolíticas presentes contienen el motivo RGQ y el motivo GXSQG, ninguna de las enzimas perhidrolíticas presentes contienen el ácido glutámico dentro del "motivo HE" que previamente se ha reportado como un motivo estructural conservado tal como se muestra en la Tabla A y en las Figura lA.y IB Tabla A. Motivos encontrados dentro de las enzimas presentes que tienen actividad de perhidrolasa . a= secuencia de referencia de Thermotoga marítima . b= previamente reportado como un ácido glutámico conservado, formador de un motivo "HE".

Parece que los presentes polipéptidos que tienen actividad perhidrolítica pueden representar un nuevo subgrupo dentro de la clase genérica más grande de carbohidrato esterasas CE-7 enumeradas como elementos dentro de la base de datos CAZy (Cantarel et al., "The Carbohydrate-Active EnZymes datábase (CAZy) : an expert resource for Glycogenomics", NAR, 37:D233-D238 (2009)). Como tales, los polipéptidos que tienen actividad perhidrolítica usados en la presente solicitud se mencionan en la presente descripción como "carbohidrato esterasas CE-7" o "perhidrolasas CE-7" aunque puedan carecer de una porción del "motivo distintivo" definido previamente.

En otra modalidad, los polipéptidos presentes que tienen actividad perhidrolítica se definen, además, como que tienen la siguiente combinación de motivos cuando se alinean en comparación con la secuencia de referencia de la sec . con núm. de ident . : 2 (numeración de la posición de los residuos con relación a la secuencia de referencia de la sec. con núm. de ident.: 2; la esterasa de Thermotoga marítima acetilxilano silvestre) : a) Argll8-Glyll9-Glnl20; ("motivo RGQ") ; b) Glyl86-Xaal87-Serl88-Glnl89-Glyl90; y ("motivo GXSQG") ; y c) His303-Xaa304. ("motivo HX") ; en donde "Xaa" no es ácido glutámico.

En un aspecto preferido, el residuo de aminoácidos "X" dentro del "motivo HX" es alanina, ácido aspártico o serina .

En otro aspecto, el presente polipéptido que tiene actividad perhidrolítica comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las sec. con núms . de ident.: 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16, siempre que el residuo de aminoácidos unido al lado C-terminal de la histidina catalítica no es ácido glutámico.

En una modalidad, los presentes polipéptidos que tienen actividad perhidrolítica tienen por lo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad de aminoácidos con las secuencias proporcionadas en la presente descripción, siempre que el residuo de aminoácidos unido al lado C-terminal de la histidina catalítica no es ácido glutámico.

En otro aspecto, el presente polipéptido que tiene actividad perhidrolítica comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos que se expone en la sec. con núm. de ident . : 4, siempre que el residuo de aminoácidos unido al lado C-terminal de la histidina catalítica no es ácido glutámico. En otro aspecto, el presente polipéptido que tiene actividad perhidrolítica comprende una secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident . : .

Como se usa en la presente descripción, el término "variante de perhidrolasa" o "variante" se refiere a enzimas perhidrolíticas que tienen una modificación que produce por lo menos una adición, supresión y/o sustitución de aminoácidos en comparación con la enzima correspondiente (típicamente, la enzima silvestre) de la cual se deriva la variante; siempre que se mantengan los motivos requeridos descritos en la presente descripción y la actividad perhidrolítica asociada. Las perhidrolasas variantes de CE-7 se pueden usar, además, en las composiciones y métodos de la presente invención. Los ejemplos de variantes se proporcionan como sec. con núms . de ident . : 14 y 16.

El técnico con experiencia reconoce que las secuencias de perhidrolasa prácticamente similares pueden usarse, además, en las presentes composiciones y métodos. En una modalidad, las secuencias prácticamente similares se definen por su capacidad para hibridizarse en condiciones altamente rigurosas con las moléculas de ácido nucleico asociadas con las secuencias ejemplificadas en la presente descripción. En otra modalidad, los algoritmos de alineamiento de secuencias se pueden usar para definir enzimas prácticamente similares en base al porcentaje de identidad con respecto al ADN o secuencias de aminoácidos proporcionadas en la presente descripción .

Como se usa en la presente descripción, una molécula de ácido nucleico es "hibridable" a otra molécula de ácido nucleico, tal como un ADNc, ADN genómico o ARN, cuando una sola cadena de la primera molécula se puede aparear a la otra molécula en las condiciones apropiadas de temperatura y resistencia iónica de la solución. Las condiciones de hibridación y lavado son muy conocidas y se ilustran en Sambrook, J. y Russell, D. , T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001) . Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan la "severidad" de la hibridación. Las condiciones de rigurosidad se pueden ajustar para identificar moléculas moderadamente similares, tales como secuencias homologas de organismos poco relacionados, hasta moléculas muy similares, tales como los genes que duplican enzimas funcionales de organismos estrechamente relacionados. Los lavados posteriores a la hibridación determinan, típicamente, las condiciones de rigurosidad. Un conjunto de condiciones preferidas usa una serie de lavados que comienzan con SSC 6X, SDS al 0.5 % a temperatura ambiente por 15 min, después, se repiten con SSC 2X, SDS al 0.5 % a 45 °C por 30 min y, después, se repiten dos veces más con SSC 0.2X, SDS al 0.5 % a 50 °C por 30 min. Con mayor preferencia, un conjunto de condiciones usa temperaturas más altas en las que los lavados son idénticos a los mencionados anteriormente, excepto que la temperatura de los dos lavados finales de 30 min en SSC 0.2X, SDS al 0.5 % se incrementa a 60 °C. Otro conjunto preferido de condiciones de hibridación altamente rigurosas es SSC 0.1X, SDS al 0.1 %, 65 °C y lavado con SSC 2X, SDS al 0.1 % seguido de un lavado final con SSC 0.1X, SDS al 0.1 %, 65 °C.

La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, son posibles las faltas de coincidencias entre bases. La rigurosidad apropiada para hibridar ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables muy conocidas en la técnica. A mayor grado de similaridad u homología entre las dos secuencias de nucleótidos, mayor será el valor de Tm para los híbridos de ácidos nucleicos que tengan esas secuencias. La estabilidad relativa (que corresponde a un valor más alto de Tm) de hibridaciones de ácidos nucleicos disminuye en el siguiente orden: ARN:AR , ADN :AR , ADN:ADN . Para híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud se han derivado ecuaciones para calcular Tm (Sambrook y Russell, supra) . Para hibridaciones con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos , la posición de las faltas de coincidencias se vuelve más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (Sambrook y Russell, supra) . En un aspecto, la longitud de un ácido nucleico hibridable es de por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos. Preferentemente, una longitud mínima para un ácido nucleico hibridable es de al menos aproximadamente 15 nucleótidos de longitud, con mayor preferencia, al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud, aun con mayor preferencia, al menos 30 nucleótidos de longitud, aun con mayor preferencia, al menos 300 nucleótidos de longitud y, con la máxima preferencia, al menos 800 nucleótidos de longitud. Además, el técnico experimentado reconocerá que la temperatura y la concentración de sal de la solución de lavado podrán regularse según sea necesario de conformidad con factores tales como la longitud de la sonda.

Como se usa en la presente descripción, el término "porcentaje de identidad" es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos , según se determina al comparar las secuencias. En la técnica, "identidad" significa, además, el grado de relación de secuencias entre las secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, según sea el caso, según se determina en función de la coincidencia entre las cadenas de esas secuencias. La "identidad" y la "similitud" pueden calcularse fácilmente mediante métodos conocidos que incluyen, pero no se limita a, aquellos descritos en: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed.) Oxford University Press, NY (1988) ; Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic Press, NY (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I (Griffin, A. M. y Griffin, H. G-, Eds . ) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G. , Ed. ) Academic Press (1987); y Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J, eds.) Stockton Press, NY (1991) . Los métodos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas informáticos públicamente disponibles. Los alineamientos de secuencias y cálculos de porcentaje de identidad se pueden realizar con el programa Megalign del paquete para bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI) , el programa AlignX de Vector NTI v. 7.0 (Informax, Inc, Bethesda, MD) o EMBOSS Open Software Suite (EMBL-EBI; Rice et al, Trends in Genetics 16, (6):276-277 (2000)). El alineamiento múltiple de las secuencias se puede realizar con el uso del método Clustal (tal como CLUSTALW; por ejemplo, versión 1.83) de alineamiento (Higgins y Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1.989); Higgins et al, Nucleic Acids Res. 22:4673-4680 (1994); y Chenna et al, Nucleic Acids Res 31 (13) : 3497-500 (2003)), disponibles de European Molecular Biology Laboratory a través del European Bioinformatics Institute) con los parámetros predeterminados . Los parámetros adecuados para los alineamientos de proteínas CLUSTALW incluyen una penalización por existencia de interrupción=15 , extensión de interrupción =0.2, matriz = Gonnet (por ejemplo, Gonnet250) , proteína ENDGAP = -1, proteína GAPDIST=4 y KTUPLE=1. En una modalidad se usa un alineamiento rápido o lento con las configuraciones predeterminadas, en donde se prefiere un alineamiento lento. Alternativamente, los parámetros que usan el método CLUSTALW (por ejemplo, versión 1.83) pueden modificarse para usar, además, KTUPLE =1, penalización de interrupción=10 , extensión de interrupción =1, matriz = BLOSUM (por ejemplo, BLOSUM64), VENTANA=5 y DIAGONALES SUPERIORES GUARDADAS=5.

"Histidina catalítica" se refiere al residuo de histidina en las perhidrolasas descritas actualmente que forma una triada catalítica con serina y ácido aspártico. Por ejemplo, en la sec . con núm. de ident . : 4, la histidina catalítica es el residuo de aminoácidos núm. 302. Una variante de la sec. con núm. de ident.: 4 que tiene actividad de perhidrolasa tiene su histidina catalítica alineada con la histidina catalítica de la sec. con núm. de ident.: 4 cuando las secuencias se comparan con el uso de CLUSTALW, lo cual significa que la histidina catalítica de la variante puede, pero no debe, estar en la posición de aminoácidos 302 de la variante .

En un aspecto, las moléculas de ácido nucleico aisladas adecuadas codifican un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 84, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntica a las secuencias de aminoácidos reportadas en la presente descripción. Las moléculas de ácido nucleico adecuadas tienen las homologías anteriores pero, además, típicamente, codifican un polipéptido que tiene una longitud de aproximadamente 210 a 340 aminoácidos, de aproximadamente 300 a aproximadamente 340 aminoácidos, preferentemente, de aproximadamente 310 a aproximadamente 330 aminoácidos y, con la máxima preferencia, de aproximadamente 318 a aproximadamente 325 aminoácidos de longitud, en donde cada polipéptido se caracteriza como un polipéptido con actividad perhidrolítica.

Condiciones de reacción adecuadas para la preparación catalizada por enzimas de ácidos peroxicarboxílicos a partir de ásteres de ácido carboxílico y peróxido de hidrógeno Se proporciona un proceso para producir una formulación acuosa que comprende por lo menos un ácido peroxicarboxílico al hacer reaccionar esteres de ácido carboxílico y un peróxido inorgánico (tal como peróxido de hidrógeno, perborato de sodio o percarbonato sódico) en presencia de un catalizador enzimático que tiene actividad perhidrolítica, en donde el catalizador enzimático comprende, en una modalidad, un polipéptido que tiene por lo menos 80 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las sec . con núms . de ident . : 4, 6, 8, 10, 12, 14 y 16, siempre que el residuo de aminoácidos unido al lado C-terminal de la histidina catalítica no es ácido glutámico. En una modalidad adicional, el polipéptido que tiene actividad perhidrolítica comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las sec. con núms. de ident.: 4, 6, 8, 10, 12, 14, y 16. En una modalidad adicional, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4.

En una modalidad, los sustratos adecuados incluyen uno o más esteres proporcionados por la siguiente fórmula: [XlmRs en donde X = un grupo éster de la fórmula R6C(0)0 R6 = una porción hidrocarbilo de Cl a C7 lineal, ramificada o cíclica sustituida opcionalmente con grupos hidroxilo o grupos alcoxi de Cl a C4 , en donde R6 comprende, opcionalmente, uno o más enlaces éter para R6 = C2 a C7; R5 = una porción hidrocarbilo de Cl a C6 lineal, ramificada o cíclica o porción heteroaromática cíclica de cinco miembros o una porción aromática o heteroaromática cíclica de seis miembros sustituida opcionalmente con grupos hidroxilo; en donde cada átomo de carbono en R5 comprende, individualmente, no más de un grupo hidroxilo o no más de un grupo éster o grupo ácido carboxílico; en donde R5 comprende, opcionalmente, uno o más enlaces éter; m = un entero en el intervalo de 1 al número de átomos de carbono en R5; y en donde los ésteres tienen una solubilidad en agua de por lo menos 5 ppm a 25 °C.

En otra modalidad, Re = una porción hidrocarbilo lineal de Cl a C7 , opcionalmente sustituida con grupos hidroxilo o grupos alcoxi de Cl a C4 , que comprende, opcionalmente, uno o más enlaces éter. En otra modalidad adicional preferida, Rs = una porción hidrocarbilo lineal de C2 a C7 , opcionalmente sustituida con grupos hidroxilo y/o que comprende, opcionalmente, uno o más enlaces éter.

En una modalidad, el sustrato adecuado puede incluir ácido 2-acetoxibenzoico, ácido 3 -acetoxibenzoico, ácido 4-acetoxibenzoico o mezclas de estos.

En otra modalidad, los sustratos adecuados incluyen, además, uno o más glicéridos de la fórmula: en donde Ri = un alquilo de Cl a C21 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi de Cl a C4 y R3 y 4 son, individualmente, H o RiC(O) . En una modalidad, el sustrato adecuado es un glicérido de la fórmula descrita anteriormente, en donde Ri = un alquilo de Cl a C7 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi de Cl a C4 y R3 y R son, individualmente, H o RiC(O) ..

En otro aspecto, los sustratos adecuados pueden incluir, además, uno o más ésteres de la fórmula: en donde Ri = un alquilo de Cl a C7 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi de Cl a C4 y R2 = un alquilo de Cl a CIO de cadena lineal o ramificada, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, heteroarilo, (CH2CH20)n o (CH2CH(CH3) -0)nH y n es 1 a 10.

Los sustratos adecuados pueden incluir, además, uno o más sacáridos acilados seleccionados del grupo que consiste en mono, di y polisacáridos acilados. En otra modalidad, los sacáridos acilados se seleccionan del grupo que consiste en xilano acetilado, fragmentos de xilano acetilado, xilosa acetilada (tal como tetraacetato de xilosa) , glucosa acetilada (tal como pentaacetato de a-D-glucosa; pentaacetato de ß-D-glucosa) , pentaacetato de ß-D-galactosa, hexaacetato de sorbitol, octaacetato de sacarosa, ß-D-ribofuranosa-1 , 2 , 3 , 5 -tetraacetato, tri-O-acetil-D-galactal , tri-O-acetil-D-glucal, tetraacetilxilofuranosa, pentaacetato de a-D-glucopiranosa, pentaacetato de -D-manopiranosa y celulosa acetilada. En una modalidad preferida, el sacárido acetilado se selecciona del grupo que consiste en ß-D-ribofuranosa-1 , 2 , 3 , 5-tetraacetato, tri-O-acetil-D-galactal, tri-O-acetil-D-glucal, octaacetato de sacarosa y celulosa acetilada.

En otra modalidad, los sustratos adecuados se seleccionan del grupo que consiste en: monoacetina; diacetina; triacetina; monopropionina; dipropionina; tripropionina; monobuti ina; dibutirina; tributirina; pentaacetato de glucosa; tetraacetato de xilosa; xilano acetilado; fragmentos de xilano acetilado; ß-D-ribofuranosa-1 , 2 , 3 , 5 -tetraacetato; tri-O-acetil-D-galactal ; tri-O-acetil-D-glucal ; monoésteres o diésteres de 1,2-etanodiol, 1, 2-propanodiol, 1, 3-propanodiol, 1, 2-butanodiol, 1, 3 -butanodiol , 2 , 3 -butanodiol , 1,4-butanodiol, 1 , 2-pentanodiol , 2 , 5 -pentanodiol , 1 , 6 -pentanodiol , 1 , 2 -hexanodiol , 2 , 5 -hexanodiol , 1 , 6-hexanodiol ; y mezclas de estos .

En otra modalidad, el éster de ácido carboxílico se selecciona del grupo que consiste en monoacetina, diacetina, triacetina, y combinaciones de estas. En otra modalidad, el sustrato es un poliol de Cl a C6 que comprende uno o más grupos éster. En una modalidad preferida, uno o más de los grupos hidroxilo en el poliol de Cl a C6 se sustituyen con uno o más grupos acetoxi (tales como diacetato de 1,3-propanodiol, diacetato de 1, 4 -butanodiol, etc.). En otra modalidad, el sustrato es diacetato de propilenglicol (PGDA) , diacetato de etilenglicol (EGDA) , o una mezcla de estos.

En otra modalidad, los sustratos adecuados se seleccionan del grupo que consiste en acetato de etilo; lactato de metilo; lactato de etilo; glicolato de metilo; glicolato de etilo; metoxiacetato de metilo; metoxiacetato de etilo; 3-hidroxibutirato de metilo; 3-hidroxibutirato de etilo; 2-acetilcitrato de trietilo; pentaacetato de glucosa; gluconolactona; glicéridos (mono-, di- y triglicéridos) , tales como monoacetina, diacetina, triacetina, monopropionina, dipropionina (dipropionato de glicerilo) , tripropionina (1 , 2 , 3-tripropionilglicerol) , monobutirina, dibutirina (dibutirato de glicerilo), tributirina (1,2,3-tributirilglicerol); sacáridos acetilados; y mezclas de estos.

En una modalidad adicional, los sustratos adecuados se seleccionan del grupo que consiste en monoacetina, diacetina, triacetina, monopropionina, dipropionina, tripropionina, monobutirina, dibutirina, tributirina, acetato de etilo, y lactato de etilo. En otro aspecto adicional, el sustrato se selecciona del grupo que consiste en diacetina, triacetina, acetato de etilo y lactato de etilo. En una modalidad especialmente preferida, el sustrato adecuado comprende triacetina .

El éster de ácido carboxílico está presente en la formulación de reacción acuosa a una concentración suficiente para producir la concentración deseada de ácido peroxicarboxílico con perhidrólisis catalizada por enzimas. No es necesario que el éster de ácido carboxílico sea completamente soluble en la formulación de reacción acuosa, pero debe tener la solubilidad suficiente para permitir que el catalizador de perhidrolasa convierta el éster al ácido peroxicarboxílico correspondiente. El éster de ácido carboxílico está presente en la formulación de reacción acuosa a una concentración de 0.0005 % en peso a 40 % en peso de la formulación de reacción acuosa, preferentemente, a una concentración de 0.01 % en peso a 20 % en peso de la formulación de reacción acuosa y, con mayor preferencia, a una concentración de 0.05 % en peso a 10 % en peso de la formulación de reacción acuosa. El % en peso de áster de ácido carboxílico puede ser, opcionalmente , mayor que el límite de solubilidad del éster de ácido carboxílico, de manera que la concentración del éster de ácido carboxílico es por lo menos 0.0005 % en peso en la formulación de reacción acuosa compuesta de agua, catalizador enzimático y una fuente de peróxido, en donde el remanente del éster de ácido carboxílico permanece como una segunda fase separada de una formulación de reacción acuosa/orgánica de dos fases. No todo el éster de ácido carboxílico agregado debe disolverse inmediatamente en la formulación de reacción acuosa y después de un mezclado inicial de todos los componentes de reacción, el mezclado continuo o discontinuo es opcional.

Los ácidos peroxicarboxílicos producidos por los componentes de reacción presentes pueden variar en función de los sustratos seleccionados, siempre que se usa el catalizador enzimático presente. En una modalidad, el ácido peroxicarboxílico producido es ácido peracético, ácido perpropiónico, ácido perbutírico, ácido peroctanoico, ácido perláctico, ácido perglicólico, ácido permetoxiacético, ácido per- ß-hidroxibutírico, o mezclas de estos.

La fuente de peroxígeno puede incluir, pero no se limita a, peróxido de hidrógeno, aductos de peróxido de hidrógeno (por ejemplo, aducto de urea-peróxido de hidrógeno (peróxido de carbamida) ) , sales de perborato y sales de percarbonato. Alternativamente, el peróxido de hidrógeno puede producirse in situ por medio de la reacción de un sustrato y oxígeno catalizado por una enzima que tiene actividad de oxidasa (que incluye, pero no se limita a, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, sorbitol oxidasa, hexosa oxidasa, alcohol oxidasa, glicerol oxidasa, monoamina oxidasa, glicolato oxidasa, lactato oxidasa, piruvato oxidasa, oxalato oxidasa, colina oxidasa, colesterol oxidasa, piranosa oxidasa, carboxialcohol oxidasa, L-aminoácido oxidasa, glicina oxidasa, glutamato oxidasa, lisina oxidasa, y uricasa) . La concentración del compuesto de peroxígeno en la formulación de reacción acuosa puede estar en el intervalo de 0.0033 % en peso a aproximadamente 50 % en peso, preferentemente, de 0.033 % en peso a aproximadamente 40 % en peso, con mayor preferencia, de 0.33 % en peso a aproximadamente 30 % en peso.

Se ha reportado que muchos catalizadores de perhidrolasa (tales como células completas, células completas permeabilizadas y extractos de células completas parcialmente purificados) tienen actividad de catalasas (EC 1.11.1.6). Las catalasas catalizan la conversión del peróxido de hidrógeno en oxígeno y agua. En un aspecto, el catalizador enzimático que tiene actividad de perhidrolasa carece de actividad de catalasas . En otro aspecto, el catalizador enzimático que tiene actividad de perhidrolasa tiene una actividad de catalasas suficientemente baja que la presencia de la actividad de catalasas no interfiere significativamente con la producción de ácido peroxicarboxílico catalizada por perhidrolasas . En otro aspecto, se agrega un inhibidor de catalasas en la formulación de reacción acuosa. Los ejemplos de inhibidores de catalasas incluyen, pero no se limitan a, azida sódica y sulfato de hidroxilamina . Una persona con experiencia en la técnica puede ajustar la concentración del inhibidor de catalasas según sea necesario. La concentración del inhibidor de catalasas varía, típicamente, de 0.1 mM a aproximadamente 1 M; preferentemente, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM; con mayor preferencia, de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 20 mM. En un aspecto, la concentración de azida sódica se encuentra, típicamente, en el intervalo de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 60 mM, mientras que la concentración de sulfato de hidroxilamina es, típicamente, de aproximadamente 0.5 mM a aproximadamente 30 mM, preferentemente, aproximadamente 10 mM La actividad de la catalasa en una célula hospedera puede regularse a la baja o eliminarse por medio de la alteración de la expresión del o los genes responsables de la actividad de la catalasa por medio de técnicas muy conocidas que incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis de transposones, expresión de ARN complementario, mutagénesis dirigida, y mutagénesis aleatoria. En una modalidad preferida, el gen o genes que codifican la actividad de catalasas endógenas se regulan a la baja o se interrumpen (es decir, "se bloquean") . Como se usa en la presente descripción, un gen "interrumpido" es un gen en el cual la actividad y/o función de la proteína codificada por el gen modificado ya no está presente. En la técnica se conocen medios para alterar un gen y estos pueden incluir, pero no se limitan a, inserciones, supresiones o mutaciones del gen siempre que la actividad y/o función de la proteína correspondiente ya no esté presente. En otra modalidad adicional preferida, el hospedero de producción es un hospedero de producción de E. coli que comprende un gen catalasa interrumpido seleccionado del grupo que consiste en JatG y katE (ver la patente de los Estados Unidos núm. 7,951,566 otorgada a DiCosimo et al.). En otra modalidad, el hospedero de producción es una cepa de E. coli que comprende una regulación a la baja y/o una interrupción en ambos genes catalasa katG y katE. Se ha preparado una cepa de E. coli que comprende un bloqueo doble de katG y katE y se describe como cepa KLP18 de E. coli (patente de los Estados Unidos núm. 7,951,566 otorgada a DiCosimo et al.).

La concentración del catalizador en la formulación de la reacción acuosa depende de la actividad catalítica específica del catalizador y se elige de manera que se obtenga la velocidad de reacción deseada. El peso del catalizador en las reacciones de perhidrólisis se encuentra, típicamente, en el intervalo de 0.0001 mg a 50 mg por mi del volumen total de la reacción, preferentemente, de 0.0005 mg a 10 mg por mi, con mayor preferencia, de 0.0010 mg a 2.0 mg por mi. Además, el catalizador se puede inmovilizar en un soporte soluble o insoluble con el uso de métodos muy conocidos para aquellos con experiencia en la técnica; ver, por ejemplo, Immobilization of Enzymes and Cells 2nd(2.° edición); José M. Guisan, Editor; Humana Press, Totowa, NJ, Estados Unidos; 2006. El uso de catalizadores inmovilizados permite recuperar y reusar el catalizador en reacciones posteriores. El catalizador enzimático puede estar en la forma de células microbianas enteras, células microbianas permeabilizadas , extractos de células microbianas, enzimas purificadas o parcialmente purificadas, y mezclas de estas.

En un aspecto, la concentración de ácido peroxicarboxílico producido por la combinación de perhidrólisis química y perhidrólisis enzimática del éster de ácido carboxílico es suficiente para producir una concentración efectiva de ácido peroxicarboxílico para desinfección, blanqueo, desinfección, desodorización o desmanchado a un pH deseado. En otro aspecto, el ácido peroxicarboxílico se produce a una concentración segura y eficaz adecuada para usar en un producto para el cuidado personal para aplicar en el cabello, la piel, las uñas o en tejidos de la cavidad oral, tal como el esmalte de los dientes, película dental o encías. En otro aspecto, los métodos presentes proporcionan combinaciones de enzimas y sustratos de enzimas para producir la concentración de ácido peroxicarboxílico eficaz deseada, en donde, si no se añaden enzimas, la concentración del ácido peroxicarboxílico producido es significativamente menor. Si bien puede haber cierta perhidrólisis química del sustrato de enzimas por reacción química directa de peróxido inorgánico con el sustrato de enzimas, es posible que no haya una concentración suficiente de ácido peroxicarboxílico producido para proporcionar una concentración efectiva de ácido peroxicarboxílico en las aplicaciones deseadas y un incremento significativo en la concentración total de ácido peroxicarboxílico se logra al agregar un catalizador de perhidrolasa adecuado en la formulación de reacción acuosa.

En un aspecto de la presente invención, la concentración de ácido peroxicarboxílico producido (por ejemplo, ácido peracético) por perhidrólisis enzimática es por lo menos aproximadamente 2 ppm, preferentemente, por lo menos 20 ppm, preferentemente, por lo menos 100 ppm, con mayor preferencia, por lo menos aproximadamente 200 ppm de ácido peroxicarboxílico, con mayor preferencia, por lo menos 300 ppm, con mayor preferencia, por lo menos 500 ppm, con mayor preferencia, por lo menos 700 ppm, con mayor preferencia, por lo menos aproximadamente 1000 ppm de ácido peroxicarboxílico, con mayor preferencia, por lo menos aproximadamente 2000 ppm de ácido peroxicarboxílico, con la máxima preferencia, por lo menos 10,000 ppm de ácido peroxicarboxílico en el transcurso de 5 minutos, con mayor preferencia, en el transcurso de 1 minuto de iniciar la reacción de perhidrólisis enzimática. En un segundo aspecto de la presente invención, la concentración de ácido peroxicarboxílico producido (por ejemplo, ácido peracético) por la perhidrólisis enzimática es por lo menos aproximadamente 2 ppm, preferentemente, por lo menos 20 ppm, preferentemente, por lo menos 30 ppm, con mayor preferencia, por lo menos aproximadamente 40 ppm de ácido peroxicarboxílico, con mayor preferencia, por lo menos 50 ppm, con mayor preferencia, por lo menos 60 ppm, con mayor preferencia, por lo menos 70 ppm, con mayor preferencia, por lo menos aproximadamente 80 ppm de ácido peroxicarboxílico, con la máxima preferencia, por lo menos 100 ppm de ácido peroxicarboxílico en el transcurso de 5 minutos, con mayor preferencia, en el transcurso de 1 minuto de iniciar la reacción de perhidrólisis enzimática (es decir, el tiempo determinado desde que se combina los componentes de reacción para formar la formulación) .

La formulación acuosa que comprende el ácido peroxicarboxílico puede diluirse, opcionalmente , con diluyente que comprende agua, o una solución mayormente compuesta de agua, para producir una formulación con la concentración objetivo inferior deseada de ácido peroxicarboxílico . En un aspecto, el tiempo de reacción requerido para producir la concentración (o el intervalo de concentración) que se desea de ácido peroxicarboxílico es de aproximadamente 20 minutos o menos, preferentemente, aproximadamente 5 minutos o menos, con la máxima preferencia, aproximadamente 1 minuto o menos .

En otros aspectos, la superficie o el objeto inanimado contaminado con una concentración de uno o más contaminantes biológicos se pone en contacto con el ácido peroxicarboxílico formado de conformidad con los procesos descritos en la presente descripción en el transcurso de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 168 horas de la combinación de los componentes de reacción o en el transcurso de aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 48 horas, o en el transcurso de aproximadamente 1 minuto a 2 horas de la combinación de los componentes de reacción, o cualquier intervalo de tiempo en estos .

En otro aspecto, el ácido peroxicarboxílico formado de conformidad con los procesos descritos en la presente descripción se usa en una aplicación para el cuidado de la ropa, en donde el ácido peroxicarboxílico se pone en contacto con la ropa o un tejido para proporcionar un beneficio, tal como desinfección, blanqueo, desmanchado, desodorización y/o una combinación de estos. El ácido peroxicarboxílico puede usarse en una gran variedad de productos para el cuidado de la ropa que incluyen, pero no se limitan a, tratamientos previos al lavado de ropa o tejidos, detergentes o aditivos para ropa, removedores de manchas, composiciones de blanqueo, composiciones de desodorización y agentes de enjuague. En una modalidad, el presente proceso para producir un ácido peroxicarboxílico para una superficie objetivo se lleva a cabo in situ.

En el contexto de aplicaciones para el cuidado de la ropa, el término "poner una prenda de vestir o tejido en contacto con" se refiere a que la prenda de vestir o tejido se expone a una formulación descrita en la presente descripción. Con este propósito, existe muchos formatos para usar la formulación para tratar artículos de ropa o textiles que incluyen, pero no se limitan a, líquidos, sólidos, geles, pastas, barras, tabletas, aerosoles, espumas, polvos o gránulos y pueden suministrarse por dosificación manual, dosificación unitaria, dosificación desde un sustrato, rociado y dosificación automática desde una máquina para lavar o secar ropa. Las composiciones granulares pueden estar, además, en forma compacta; las composiciones líquidas pueden estar, además, en forma concentrada.

Cuando las formulaciones descritas en la presente descripción se usan en una lavadora automática de ropa, la formulación puede contener, además, componentes típicos para detergentes para ropa. Por ejemplo, los componentes típicos incluyen, pero no se limitan a, tensioactivos , agentes de blanqueo, activadores de blanqueo, enzimas adicionales, supresores de espuma, dispersantes, dispersantes de jabones de cal, agentes de remoción de suciedad y antirredepósito, agentes suavizantes, inhibidores de la corrosión, inhibidores del deslustre, germicidas, agentes ajustadores de pH, fuentes de alcalinidad no aditivas, agentes quelantes, rellenadores orgánicos y/o inorgánicos, solventes, hidrótropos, abrillantadores ópticos, tintes, y perfumes. Las formulaciones descritas en la presente descripción pueden usarse, además, como productos aditivos detergentes en forma sólida o líquida. Tales productos aditivos están previstos para complementar o aumentar el rendimiento de composiciones detergentes convencionales y pueden agregarse en cualquier etapa del proceso de limpieza.

En relación con los presentes sistemas y métodos para el cuidado de la ropa en donde el perácido se produce para uno o más de blanqueo, eliminación de manchas y reducción de olores, la concentración de perácido producido {por ejemplo, ácido peracético) least por la perhidrólisis de por lo menos un éster de ácido carboxílico puede ser por lo menos aproximadamente 2 ppm, preferentemente, por lo menos 20 ppm, preferentemente, por lo menos 100 ppm y con mayor preferencia, por lo menos aproximadamente 200 ppm de perácido. En relación con los presentes sistemas y métodos para el cuidado de la ropa en donde el perácido se produce para desinfección o sanitización, la concentración de perácido producido (por ejemplo, ácido peracético) por la perhidrólisis de por lo menos un éster de ácido carboxílico puede ser por lo menos aproximadamente 2 ppm, con mayor preferencia, por lo menos 20 ppm, con mayor preferencia, por lo menos 200 ppm, con mayor preferencia, por lo menos 500 ppm, con mayor preferencia, por lo menos 700 ppm, con mayor preferencia, por lo menos aproximadamente 1000 ppm de perácido, con la máxima preferencia, por lo menos 2000 ppm de perácido en el transcurso de 10 minutos, preferentemente, en el transcurso de 5 minutos y, con la máxima preferencia, en el transcurso de 1 minuto de iniciar la reacción de perhidrólisis. La formulación del producto que comprende el perácido puede diluirse, opcionalmente , con agua, o una solución mayormente comprendida de agua, para producir una formulación con la concentración inferior de perácido deseada. En un aspecto de los presentes métodos y sistemas, el tiempo de reacción requerido para producir la concentración deseada de perácido no es mayor que aproximadamente dos horas, preferentemente, no mayor que aproximadamente 30 minutos, con mayor preferencia, no mayor que aproximadamente 10 minutos, incluso con mayor preferencia, no mayor que aproximadamente 5 minutos y, con la máxima preferencia, en aproximadamente 1 minuto o menos .

La temperatura de la reacción se selecciona para controlar la velocidad de reacción y la estabilidad de la actividad del catalizador enzimático. La temperatura de la reacción puede estar en el intervalo desde justo por encima del punto de congelación de la formulación de reacción acuosa (aproximadamente 0 °C) hasta aproximadamente 85 °C, con un intervalo preferido de la temperatura de la reacción de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 75 °C.

El pH de la formulación de reacción acuosa si bien produce enzimáticamente ácido peroxicarboxílico se mantiene a un pH en el intervalo de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 10.0, preferentemente, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 8.5 y, aún con mayor preferencia, de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5. En una modalidad, el pH de la formulación de reacción acuosa se encuentra en el intervalo de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 8.5 durante por lo menos 30 minutos después de combinar los componentes de reacción. El pH de la formulación de reacción acuosa puede ajustarse o controlarse por la adición o incorporación de un amortiguador adecuado, que incluye, pero no se limita a, fosfato, pirofosfato, bicarbonato, acetato o citrato. En una modalidad, el amortiguador se selecciona de un amortiguador fosfato, un amortiguador bicarbonato o un amortiguador formado por la combinación de agua dura (agua del grifo para simular aplicaciones para el cuidado de la ropa) y percarbonato (a partir de percarbonato sódico usado para producir peróxido de hidrógeno) . Cuando se usa un amortiguador, la concentración de este es, típicamente, de 0.1 mM a 1.0 M, preferentemente, de 1 mM a 300 mM y, con la máxima preferencia, de 10 mM a 100 mM. En otro aspecto de la presente invención, no se agrega ningún amortiguador en la mezcla de reacción, mientras se produce enzimáticamente ácido peroxicarboxílico .

En otro aspecto adicional, formulación de reacción acuosa de perhidrólisis enzimática puede contener un solvente orgánico que actúa como un dispersante para mejorar la velocidad de disolución del éster de ácido carboxílico en la formulación de reacción acuosa. Los solventes incluyen, pero no se limitan a, éter metílico de propilenglicol , acetona, ciclohexanona, éter butílico de dietilenglicol , éter metílico de tripropilenglicol , éter metílico de dietilenglicol, éter butílico de propilenglicol, éter metílico de dipropilenglicol , ciclohexanol , alcohol bencílico, isopropanol, etanol, propilenglicol, y mezclas de estos.

En otro aspecto, el producto de perhidrólisis enzimática puede contener componentes adicionales que proporcionan la funcionalidad deseada. Estos componentes adicionales incluyen, pero no se limitan a, amortiguadores, mej oradores detergentes, agentes de espesamiento, emulsionantes, tensioactivos , agentes humectantes, inhibidores de la corrosión (por ejemplo, benzotriazol) , estabilizadores enzimáticos y estabilizadores de peróxido {por ejemplo, agentes quelantes de iones metálicos) . Muchos de los componentes adicionales son muy conocidos en la industria de los detergentes (ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos núm. 5,932,532; que se incorpora en la presente descripción como referencia) . Los ejemplos de emulsionantes incluyen, pero no se limitan a, alcohol polivinílico o polivinilpirrolidona . Los ejemplos de agentes de espesamiento incluyen, pero no se limitan a, RD (silicato estratificado sintético) LAPONITE®, almidón de maíz, PVP, Carbowax® (polietilenglicol y/o metoxipolietilenglicol ) , Carbopol® (polímero reticulado de acrilatos) , Cabosil® (dióxido de silicio de humo amorfo sintético), polisorbato 20, PVA, y lecitina. Los ejemplos de sistemas amortiguadores incluyen, pero no se limitan a, fosfato monobásico sódico/fosfato dibásico sódico; ácido sulfámico/trietanolamina; ácido cítrico/trietanolamina ; ácido tartárico/trietanolamina; ácido succínico/trietanolamina ; y ácido acético/trietanolamina . Los ejemplos de tensioactivos incluyen, pero no se limitan a, a) tensioactivos no iónicos, tales como copolímeros en bloque de óxido de etileno u óxido de propileno, alcoholes primarios y secundarios, lineales o ramificados, etoxilados o propoxilados y óxidos de fosfina alifáticos; b) tensioactivos catiónicos, tales como compuestos amonio cuaternarios, particularmente, compuestos amonio cuaternarios que tienen un grupo alquilo de C8-C20 unido a un átomo de nitrógeno unido, además, a tres grupos alquilo de C1-C2; c) tensioactivos aniónicos, tales como ácidos carboxílicos de alcano (por ejemplo, ácidos grasos de C8-C20) , alquilfosfonatos , alcanosulfonatos (por ejemplo, dodecilsulfato de sodio "SDS") o sulfonatos de alquilbenceno lineales o ramificados, sulfonatos de alqueno; y d) tensioactivos anfotéricos y zwitteriónicos, tales como ácidos aminocarboxílieos , ácidos aminodicarboxílieos, alquilbetaínas , y mezclas de estos. Los componentes adicionales pueden incluir fragancias, tintes, estabilizadores de peróxido de hidrógeno (por ejemplo, quelantes de metal, tales como ácido 1-hidroxietiliden-l, 1-difosfónico (DEQUEST® 2010, Solutia Inc., St . Louis, MO) y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) ) , SL (ácido etidrónico) TURPINAL®, 0520 (fosfonato) DEQUEST® , 0531 (fosfonato) DEQUEST®, estabilizadores de actividad enzimática (por ejemplo, polietilenglicol (PEG) ) y mej oradores detergentes.

En otro aspecto, el producto de perhidrólisis enzimática puede mezclarse previamente para producir la concentración deseada de ácido peroxicarboxílico antes de poner en contacto la superficie u objeto inanimado a desinfectar.

En otro aspecto, el producto de perhidrólisis enzimática no se mezcla previamente para producir la concentración deseada de ácido peroxicarboxílico antes de poner en contacto la superficie u objeto inanimado a desinfectar, en lugar de eso, los componentes de la formulación de reacción acuosa que producen la concentración deseada de ácido peroxicarboxílico se ponen en contacto con la superficie u objeto inanimado a desinfectar y/o a blanquear o desmanchar, lo que produce la concentración deseada de ácido peroxicarboxílico. En algunas modalidades, los componentes de la formulación de reacción acuosa se combinan o se mezclan en el locus. En algunas modalidades, los componentes de reacción se suministran o se aplican en el locus y, posteriormente, se mezclan o se combinan para producir la concentración deseada de ácido peroxicarboxílico .

Producción de ácidos peroxicarboxílicos con el uso de un catalizador de perhidrolasa Los ácidos peroxicarboxílicos, una vez producidos, son bastante reactivos y pueden disminuir en concentración durante períodos prolongados de tiempo, según las variables que incluyen, pero no se limitan a, temperatura y pH. Como tal, se puede preferir mantener los diversos componentes de reacción separados, especialmente, para formulaciones líquidas. En un aspecto, la fuente de peróxido de hidrógeno se separa ya sea del sustrato o del catalizador de perhidrolasa, preferentemente, de ambos. Esto puede lograrse con el uso de una gran variedad de técnicas que incluyen, pero no se limitan a, el uso de dispensadores con cámaras de múltiples compartimentos (patente de los Estados Unidos núm. 4,585,150) y al momento de usar al combinar físicamente el catalizador de perhidrolasa con una fuente de peroxígeno (tal como peróxido de hidrógeno) y los presentes sustratos para iniciar la reacción de perhidrólisis enzimática acuosa. El catalizador de perhidrolasa puede, opcionalmente, inmovilizarse dentro del cuerpo de la cámara de reacción o separarse (por ejemplo, filtrarse, etc.) del producto de reacción que comprende el ácido peroxicarboxílico antes de poner en contacto la superficie y/u objeto previsto para tratamiento. El catalizador de perhidrolasa puede estar en una matriz líquida o en una forma sólida (por ejemplo, polvo o tableta) o puede estar incorporado dentro de una matriz sólida que, posteriormente, se mezcla con los sustratos para iniciar la reacción de perhidrólisis enzimática. En un aspecto adicional, el catalizador de perhidrolasa puede estar contenido dentro de una bolsa disoluble o porosa que se puede agregar a la matriz de sustratos acuosos para iniciar la perhidrólisis enzimática. En otro aspecto adicional, el catalizador de perhidrolasa puede comprender el contenido dentro de un compartimento separado de una bolsa disoluble o porosa que tiene por lo menos un compartimento adicional para el contenido de contención que comprende el sustrato de éster y/o la fuente de peróxido. En otro aspecto adicional, un polvo que comprende el catalizador enzimático se suspende en el sustrato (por ejemplo, triacetina) y al momento de usar se mezcla con una fuente de peroxígeno en agua.

Método para determinar la concentración de ácido peroxicarboxílico y peróxido de hidrógeno.

Una gran variedad de métodos analíticos pueden usarse en el presente método para analizar los reactantes y productos que incluyen, pero no se limitan a, valoración, cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) , cromatografía de gases (GC) , espectroscopia de masas (MS) , electroforesis capilar (CE) , el procedimiento analítico de HPLC descrito por U. Karst et al. [Anal. Chem. , 69 (17) : 3623-3627 (1997)) y el ensayo de 2 , 2 ' -azino-bis (3-etilbenzotazolina) -6-sulfonato (ABTS) (ver U. Pinkernell et al., The Analyst 122:567-571 (1997); S. Minning, et al., Analytica Chimica Acta 378:293-298 (1999) y la patente núm. WO 2004/058961 Al) como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 7,951,566.

Determinación de la concentración biocida mínima de ácidos peroxicarboxílicos El método descrito por J. Gabrielson et al. (J. Microbiol . Methods 50: 63-73 (2002)) puede usarse para determinar la concentración biocida mínima (MBC, por sus siglas en inglés) de ácidos peroxicarboxílieos o de sustratos de enzimas y peróxido de hidrógeno. El método de ensayo se basa en la inhibición de la reducción de XTT, en donde XTT (2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil] -5- [ (fenilamino) carbonil] -2H-tetrazolio, sal interna, sal de monosodio) es un tinte redox que indica la actividad respiratoria microbiana por un cambio en la densidad óptica (OD) determinada a 490 nm o 450 nm. Sin embargo, existen otros métodos disponibles para probar la actividad de los desinfectantes y antisépticos que incluyen, pero no se limitan a, recuentos de placas viables, recuentos microscópicos directos, peso seco, mediciones de turbidez, absorbancia y bioluminiscencia (ver, por ejemplo, Brock, Semour S., Disinfection, Sterilization y Preservation, 5.° edición, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, Estados Unidos; 2001) .

Usos de composiciones de ácido peroxicarboxílico preparadas enzimáticamente El ácido peroxicarboxílico producido por catalizadores enzimáticos producido de conformidad con el presente método puede usarse en una gran variedad de aplicaciones para superficies duras/objetos inanimados para la reducción de concentraciones de contaminantes biológicos, como la descontaminación de instrumentos médicos (por ejemplo, endoscopios) , textiles (tales como prendas de vestir y alfombras), superficies para preparar alimentos, equipo para almacenar y envasar alimentos, materiales usados para envasar productos alimenticios, instalaciones de criaderos de pollos y establos para ganado, recintos de animales y agua industrial consumida que tiene actividad microbiana y/o virucida. Los ácidos peroxicarboxílieos producidos por enzimas pueden usarse en formulaciones diseñadas para inactivar priones (por ejemplo, ciertas proteasas) para proporcionar adicionalmente actividad biocida (ver la patente de los Estados Unidos núm. 7,550,420 otorgada a DiCosimo et al.) .

En un aspecto, la composición de ácido peroxicarboxílico es útil como un agente desinfectante para instrumentos médicos que no pueden colocarse en autoclave y equipo para envasar alimentos. Dado que la formulación que contiene ácido peroxicarboxílico se puede preparar con el uso de componentes GRAS (generalmente reconocidos como seguros) o de grado alimenticio (enzima, sustrato de enzimas, peróxido de hidrógeno y amortiguador) , el ácido peroxicarboxílico producido por enzimas puede usarse, además, para descontaminar cuerpos de animales muertos, carne, frutas y vegetales, o para descontaminar alimentos preparados. El ácido peroxicarboxílico producido por enzimas puede incorporarse en un producto cuya forma final es un polvo, líquido, gel, película, sólido o aerosol. El ácido peroxicarboxílico producido por enzimas puede diluirse hasta una concentración que aún proporciona una descontaminación eficaz .

Las composiciones que comprenden una concentración eficaz de ácido peroxicarboxílico pueden usarse para desinfectar superficies y/u objetos contaminados (o que se sospecha que están contaminados) con contaminantes biológicos, tales como contaminantes microbianos patogénicos, al poner la superficie u objeto en contacto con los productos producidos mediante los presentes procesos. Como se usa en la presente descripción, "poner en contacto" se refiere a colocar una composición desinfectante que comprende una concentración efectiva de ácido peroxicarboxílico en contacto con la superficie u objeto inanimado que se sospecha que está contaminado con un contaminante biológico durante un período de tiempo suficiente para limpiar y desinfectar. Poner en contacto incluye atomizar, tratar, sumergir, drenar, verter sobre o en, mezclar, combinar, pintar, revestir, aplicar, fijar a y comunicar de cualquier otra manera una solución o composición de ácido peroxicarboxílico que comprende una concentración eficaz de ácido peroxicarboxílico, o una solución o composición que forma una concentración eficaz de ácido peroxicarboxílico, con la superficie u objeto inanimado que se sospecha que está contaminado con una concentración de un contaminante biológico. Las composiciones desinfectantes pueden combinarse con una composición de limpieza para proporcionar tanto limpieza como desinfección.

Alternativamente, un agente de limpieza (por ejemplo, un tensioactivo o detergente) puede incorporarse en la formulación para proporcionar tanto limpieza como desinfección en una sola composición.

Las composiciones que comprenden una concentración eficaz de ácido peroxicarboxílico pueden contener, además, por lo menos un agente antimicrobiano adicional, combinaciones de proteasas degradadoras de priones, un virucida, un esporicida o un biocida. Las combinaciones de estos agentes con el ácido peroxicarboxílico producido mediante los procesos reivindicados pueden facilitar efectos incrementados y/o sinérgicos cuando se usan para limpiar y desinfectar superficies y/u objetos contaminados (o que se sospecha que están contaminados) con contaminantes biológicos. Los agentes antimicrobianos adecuados incluyen ésteres carboxílicos (por ejemplo, benzoatos de p-hidroxialquilo y cinamatos de alquilo) ; ácidos sulfónicos (por ejemplo, ácido sulfónico de dodecilbenceno) ; compuestos de yodo o compuestos de halógenos activos (por ejemplo, halógenos elementales, óxidos de halógeno (por ejemplo, NaOCl , H0C1 , HOBr, C102) , yodo, interhaluros (por ejemplo, monocloruro de yodo, dicloruro de yodo, tricloruro de yodo, tetracloruro de yodo, cloruro de bromo, monobromuro de yodo o dibromuro de yodo), polihaluros, sales de hipoclorito, ácido hipocloroso, sales de hipobromito, ácido hipobromoso, cloro- y bromo-hidantoínas , dióxido de cloro y clorito sódico) ; peróxidos orgánicos que incluyen peróxido de benzoílo, peróxidos de alquilbenzoílo, ozono, generadores de oxígeno singulete, y mezclas de estos; derivados fenólicos (por ejemplo, fenol de o-fenilo, o-bencil-p-clorofenol , fenol de tert-amilo y hidroxibenzoatos de alquilo de C1-C6) ; compuestos amonio cuaternarios (por ejemplo, cloruro amónico de alquildimetilbencilo, cloruro amónico de dialquildimetilo y mezclas de estos) ; y mezclas de tales agentes antimicrobianos, en una cantidad suficiente para producir el grado deseado de protección microbiana. Las cantidades efectivas de agentes antimicrobianos incluyen de aproximadamente 0.001 % en peso a aproximadamente 60 % en peso de agente antimicrobiano, de aproximadamente 0.01 % en peso a aproximadamente 15 % en peso de agente antimicrobiano o de aproximadamente 0.08 % en peso a aproximadamente 2.5 % en peso de agente antimicrobiano.

En un aspecto, los ácidos peroxicarboxílicos formados por el proceso pueden usarse para reducir la concentración de contaminantes biológicos viables (tales como una población microbiana) cuando se aplican sobre y/o en un locus . Como se usa en la presente descripción, un "locus" comprende parte de o toda la superficie objetivo adecuada para desinfectar o blanquear. Las superficies objetivo incluyen todas las superficies que pueden contaminarse potencialmente con contaminantes biológicos. Los ejemplos no limitantes incluyen superficies de equipo de la industria de alimentos o bebidas (tales como tanques, cintas transportadoras, pisos, drenajes, enfriadores, congeladores, superficies, paredes, válvulas, cintas, tuberías, drenajes, uniones, grietas del equipo, combinaciones de estos, y similares); superficies de edificios (tales como paredes, pisos y ventanas) ; tubería y drenajes no relacionados con la industria alimenticia, que incluyen instalaciones para el tratamiento del agua, piscinas y balnearios y tanques de fermentación; superficies de hospitales o clínicas veterinarias (tales como paredes, pisos, camas, equipo (tal como endoscopios), vestimenta que se usa en hospitales/clínicas veterinarias u otros centros para el cuidado de la salud que incluyen prendas de vestir, vestimenta de quirófano, zapatos y otras superficies de hospitales o clínicas veterinarias) ; superficies de restaurantes; superficies de baños; excusados; prendas de vestir y zapatos; superficies de graneros o establos de ganadería, tales como aves de corral, ganado, vacas lecheras, cabras, caballos y cerdos; criaderos para aves de corral o para camarón; y superficies farmacéuticas o biofarmacéuticas (por ejemplo, equipo para fabricar productos farmacéuticos o biofarmacéuticos , ingredientes farmacéuticos o biofarmacéuticos , ingredientes farmacéuticos o biofarmacéuticos) . Otras superficies duras adicionales incluyen productos alimenticios, tales como carne de res, aves, cerdo, vegetales, frutas, mariscos, combinaciones de estos, y similares. El locus puede incluir, además, materiales absorbentes de agua, tales como ropa blanca u otros textiles infectados. El locus incluye, además, plantas cosechadas o productos de plantas que incluyen semillas, cormos, tubérculos, frutas y vegetales, plantas agrícolas y, especialmente, plantas de cultivo que incluyen cereales, hierbas y vegetales, vegetales con raíz, legumbres, frutas de bayas, frutas cítricas y frutas duras.

Los ejemplos no limitantes de materiales de superficies duras son metales, (por ejemplo, acero, acero inoxidable, cromo, titanio, hierro, cobre, latón, aluminio y aleaciones de estos) , minerales (por ejemplo, hormigón) , polímeros y plásticos (por ejemplo, poliolefinas , tales como polietileno, polipropileno, poliestireno, poli (met ) acrilato, poliacrilonitrilo, polibutadieno, poli (propenonitrilo, butadieno, estireno) , poli (propenonitrilo, butadieno), butadieno de propenonitrilo; poliésteres, tales como tereftalato de polietileno; y poliamidas, tales como nailon) . Las superficies adicionales incluyen ladrillo, baldosa, cerámica, porcelana, madera, pulpa de madera, papel, vinilo, linóleo, y alfombra.

Los ácidos peroxicarboxílieos formados por el presente proceso pueden usarse para proporcionar un beneficio para una prenda de vestir o un tejido que incluye, pero no se limita a, la desinfección, esterilización, blanqueo, desmanchado, y desodorización . Los ácidos peroxicarboxílicos formados por el presente proceso pueden usarse en un número variado de productos para el cuidado de la ropa que incluyen, pero no se limitan a, tratamientos antes del lavado de tejidos, detergentes para ropa, detergentes o aditivos para ropa, removedores de manchas, composiciones de blanqueo, composiciones de desodorización y agentes de enjuague, por nombrar algunos .

Los ácidos peroxicarboxílicos formados por el presente proceso pueden usarse en una o más etapas del proceso de blanqueo/deslignificación de pulpa de madera o pulpa de papel, particularmente, en donde se usa ácido peracético (por ejemplo, ver la patente europea núm. 1040222 Bl y la patente de los Estados Unidos núm. 5,552,018 otorgada a Devenyns, J.) .

Aplicaciones para el cuidado personal Las enzimas perhidrolíticas descritas en la presente descripción pueden usarse para producir un agente de beneficio de perácidos para aplicaciones personales, tales como cuidado del cabello (blanqueo, depilatorio) , cuidado de la piel (aclaramiento de la piel, antimicrobiano) y aplicaciones para el cuidado oral (blanqueamiento/blanqueo de dientes o antiséptico), por nombrar algunos. Las composiciones y métodos descritos en la presente descripción pueden comprender, además, uno o más componentes dermatológicamente o cosméticamente aceptables conocidos o de cualquier otra manera eficaces para usar en el cuidado del pelo, cuidado de la piel, cuidado de las uñas u otros productos para el cuidado personal, siempre que los componentes opcionales sean física y químicamente compatibles con los componentes esenciales descritos en la presente descripción o que de cualquier otra manera no obstaculicen indebidamente la estabilidad del producto, la estética o el rendimiento. Los ejemplos no limitantes de los componentes opcionales se describen en International Cosmetic Ingredient Dictionary, novena edición, 2002 y en CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, décima edición, 2004.

En una modalidad, el portador dermatológicamente/cosméticamente aceptable puede comprender de aproximadamente 10 % en peso a aproximadamente 99.9 % en peso, alternativamente, de aproximadamente 50 % en peso a aproximadamente 95 % en peso y, alternativamente, de aproximadamente 75 % en peso a aproximadamente 95 % en peso de un portador dermatológicamente aceptable. Los portadores adecuados para usar con la o las composiciones pueden incluir, por ejemplo, aquellos usados en la formulación de rociadores para el pelo, espumas modeladoras, tónicos, geles, hidratantes de la piel, lociones y acondicionadores sin enjuague. El portador puede comprender agua; aceites orgánicos; siliconas tales como siliconas volátiles, aceites o gomas de amino o no aminosilicona, y mezclas de estos; aceites minerales; aceites vegetales tales como aceite de oliva, aceite de ricino, aceite de semilla de colza, aceite de coco, aceite de germen de trigo, aceite de almendras dulces, aceite de aguacate, aceite de macadamia, aceite de chabacano, aceite de cártamo, aceite de nuez de la india, aceite de camelina, aceite de tamanu, aceite de limón, y mezclas de estos; ceras; y compuestos orgánicos tales como alcanos de C2-C10, acetona, metil etil cetona, alcoholes de C1-C12 orgánicos volátiles, ésteres (la elección del o los ésteres puede depender de si el o los ésteres pueden actuar como sustratos éster del ácido carboxílico para las perhidrolasas) de ácidos de C1-C20 y de alcoholes de Ci-Ce tales como acetato de metilo, acetato de butilo, acetato de etilo y miristato de isopropilo, dimetoxietano, dietoxietano, alcoholes grasos de C10-C30 tales como alcohol laurílico, alcohol cetílico, alcohol estearílico, y alcohol behenílico; ácidos grasos de C10-C30 tales como ácido láurico y ácido esteárico; amidas grasas de C10-C30 tal como dietanolamina láurica; ésteres de alquilo grasos de C10-C30 tales como benzoatos de alquilo grasos de C10-C30; hidroxipropilcelulosa; y mezclas de estos. En una modalidad, el portador comprende agua, alcoholes grasos, alcoholes orgánicos volátiles, y mezclas de estos.

Además, la o las composiciones de la presente invención pueden comprender de aproximadamente 0.1 % a aproximadamente 10 % y, alternativamente, de aproximadamente 0.2 % a aproximadamente 5.0 %, de un agente gelificante para ayudar a proporcionar la viscosidad deseada para la o las composiciones. Los ejemplos no limitantes de agentes gelificantes opcionales adecuados incluyen polímeros de ácido carboxílico reticulados ,- polímeros de ácido carboxílico reticulados no neutralizados; polímeros de ácido carboxílico reticulados modificados no neutralizados; copolímeros de etileno /anhídrido maleico reticulados; copolímeros de etileno/anhídrido maleico reticulados no neutralizados (por ejemplo, EMA 81 disponible comercialmente de Monsanto) ; copolímeros de alquil éter/acrilato reticulados no neutralizados (por ejemplo, Saleare™ SC90 disponible comercialmente de Allied Colloids) ; copolímeros reticulados no neutralizados de poliacrilato de sodio, aceite mineral y PEG-1 trideceth-6 (por ejemplo, Saleare™ SC91 disponible comercialmente de Allied Colloids) ; copolímeros reticulados no neutralizados de metil vinil éter y anhídrido maleico {por ejemplo, copolímero Stabileze™ QM-PVM/MA disponible comercialmente de International Specialty Products) ; polímeros de celulosa no iónica modificados hidrófobamente; polímeros de uretano etoxilado modificados hidrófobamente (por ejemplo, serie Ucare™ Polyphobe de polímeros dilatables en álcali disponibles comercialmente de Union Carbide) ; y combinaciones de estos. En este contexto, el término "no neutralizado" significa que los materiales de agentes gelificantes poliméricos y copoliméricos opcionales contienen monómeros de ácido no neutralizados. Los agentes gelificantes preferidos incluyen copolímeros de etileno/anhldrido maleico reticulados no neutralizados solubles en agua, polímeros de ácido carboxílico reticulados no neutralizados solubles en agua, polímeros de celulosa no iónica modificados hidrófobamente solubles en agua y redes de gel de alcohol graso/tensioactivo tales como aquellas adecuadas para usar en productos de acondicionamiento del pelo.

Expresión microbiana recombinante Los genes y productos génicos de las secuencias de la presente invención se pueden producir en células hospederas heterólogas, particularmente, en las células de hospederos microbianos. Las células hospederas heterólogas preferidas para la expresión de los genes de la presente invención y moléculas de ácido nucleico son hospederos microbianos que pueden encontrarse dentro de las familias de hongos o bacterias y que crecen en un amplio intervalo de temperaturas, valores de pH y tolerancias de solventes. Por ejemplo, se contempla que cualquier bacteria, levadura y hongo filamentoso puede alojar adecuadamente la expresión de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención. La perhidrolasa se puede expresar intracelularmente, extracelularmente o en una combinación de ambas formas, intracelularmente y extracelularmente, en donde la expresión extracelular hace que la recuperación de la proteína deseada a partir de un producto de fermentación sea más simple que con los métodos para recuperar proteínas producidas por la expresión intracelular . La transcripción, traducción y el aparato biosintético de las proteínas se mantienen sin cambios con respecto a la materia prima de alimentación celular usada para generar biomasa celular; no obstante, los genes funcionales se expresarán. Los ejemplos de cepas hospederas incluyen, pero no se limitan a, especies bacterianas, fúngicas o de levadura, tales como Aspergillus, Trichoderma, Saccharomyces, Pichia, Phaffia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Yarrowia, Salmonella, Bacillus, Acinetobacter, Zymomonas, Agrobacterium, Erythrobacter, Chlorobium, Chromatium, Flavobacterium, Cytophaga, Rhodobacter, Rhodococcus, Streptomyces, Brevibacterium, Corynebacteria, Mycobacterium, Deinococcus, Escherichia, Erwinia, Pantoea, Pseudomonas, Sphingomonas, Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylosinus, Methylomicrobium, Methylocystis, Alcaligenes, Synechocystis, Synechococcus, Anabaena, Thiobacillus, Methanobacterium, Klebsiella, y Myxococcus . En una modalidad, las cepas hospederas bacterianas incluyen Escherichia, Bacillus y Pseudomonas . En una modalidad preferida, la célula hospedera bacteriana es Bacillus subtilis o Escherichia coli .

Producción industrial Para producir el catalizador de perhidrolasa se pueden aplicar varias metodologías de cultivo. La producción a gran escala de un producto génico específico sobreexpresado a partir de un hospedero microbiano recombinante se puede producir por metodologías de cultivo discontinuo, semicontinuo o continuo. Los métodos de cultivo discontinuos y de alimentación por lote son comunes y muy conocidos en la técnica y se pueden encontrar ejemplos en Thomas D. Brock, Biotechnology : A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edición, Sinauer Associates, Inc, Sunderland, MA (1989) y Deshpande, Mukund V, Appl . Biochem. Biotechnol . , 36:227 (1992) .

En una modalidad, la producción comercial del catalizador de perhidrolasa deseado se puede lograr con un cultivo continuo. Los cultivos continuos son un sistema abierto, en donde un medio de cultivo definido se agrega continuamente a un biorreactor y se extrae, simultáneamente, una cantidad igual de medio acondicionado para procesamiento. Generalmente, los cultivos continuos mantienen las células a una densidad de fase líquida alta constante, en donde las células están mayormente en crecimiento de fase logarítmica.

Alternativamente, el cultivo continuo se puede practicar con células inmovilizadas, en donde el carbono y los nutrientes se agregan continuamente y los productos valiosos, subproductos o desechos se eliminan continuamente de la masa celular. La inmovilización celular se puede realizar con una amplia variedad de soportes sólidos compuestos de materiales naturales y/o sintéticos.

La recuperación de los catalizadores de perhidrolasa deseados a partir de una fermentación discontinua o semicontinua , o el cultivo continuo puede realizarse por cualquiera de los métodos conocidos para aquellos con experiencia en la técnica. Por ejemplo, cuando el catalizador de enzimas se produce intracelularmente , la pasta celular se separa del medio de cultivo por centrifugación o filtración de membrana, opcionalmente , se lava con agua o con un amortiguador acuoso a un pH deseado y, después, una suspensión de la pasta celular en un amortiguador acuoso a un pH deseado se homogeneiza para producir un extracto celular que contiene el catalizador de enzimas deseado. Opcionalmente, el extracto celular se puede filtrar a través de un auxiliar de filtro apropiado, tal como celite o sílice, para eliminar el residuo celular antes de una etapa de tratamiento con calor para precipitar la proteína indeseada a partir de una solución catalizadora de enzimas. La solución que contiene el catalizador enzimático deseado puede separarse, después, de los detritos celulares precipitados y la proteína producida durante la etapa de tratamiento térmico por filtración de membrana o centrifugación y la solución catalizadora de enzimas parcialmente purificada resultante concentrada por filtración de membrana adicional, después, opcionalmente mezclada con un excipiente adecuado (por ejemplo, maltodextriña , trehalosa, sacarosa, lactosa, sorbitol, manitol, amortiguador fosfato, amortiguador citrato o mezclas de estos) y se seca por aspersión para producir un polvo sólido que comprende el catalizador enzimático deseado. Alternativamente, la solución catalizadora de enzimas parcialmente purificada resultante que se preparó como se describió anteriormente puede concentrarse, opcionalmente, por filtración de membrana adicional y la solución catalizadora de enzimas parcialmente purificada o el concentrado de enzimas resultante, después, se mezcla opcionalmente con uno o más agentes estabilizantes (por ejemplo, glicerol, sorbitol, propilenglicol , 1 , 3 -propanodiol , polioles, polioles poliméricos, alcohol polivinílico o mezclas de estos) , una o más sales (por ejemplo, cloruro sódico, sulfato sódico, cloruro potásico, sulfato potásico o mezclas de estos) y uno o más biocidas y se conserva como una solución acuosa hasta usar.

Cuando una cantidad, concentración u otro valor o parámetro se da ya sea como un intervalo, intervalo preferido o una lista de valores preferibles superiores y valores preferibles inferiores, esto debe entenderse como la descripción específica de todos los intervalos formados a partir de cualquier par de cualquier límite de intervalo superior o valor preferido y cualquier límite de intervalo inferior o valor preferido, independientemente de si los intervalos se describen por separado. En los casos en que en la presente invención se menciona un intervalo de valores numéricos, a menos que se establezca de cualquier otra manera, el intervalo pretende incluir los límites de este y todos los números enteros y fracciones comprendidos dentro del intervalo. No está previsto que el alcance esté limitado a los valores específicos mencionados al definir un intervalo.

Métodos generales Los siguientes ejemplos se proporcionan para demostrar modalidades diferentes. Los expertos en la técnica deberían apreciar que las técnicas descritas en los ejemplos a continuación representan técnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de los métodos descritos en la presente descripción y, por lo tanto, se puede considerar que constituyen los modos preferidos para su práctica. Sin embargo, las personas con experiencia en la técnica deberían apreciar, en vista de la presente descripción, que es posible hacer varios cambios en las modalidades específicas descritas y aún así obtener el mismo resultado o un resultado similar sin apartarse del espíritu y alcance de los métodos descritos en la presente descripción.

Todos los reactivos y materiales se obtuvieron de DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD) , TCI America (Portland, OR) , Roche Diagnostics Corporation (Indianapolis, IN) o Sigma-Aldrich Chemical Company (St. Louis, MO) , a menos que se especificara de otra manera.

Las siguientes abreviaturas en la descripción corresponden a unidades de medida, técnicas, propiedades o compuestos: "seg" o "s" significa segundo (s), "min" significa minuto (s), "h" o "hr" significa hora(s), "µ?" significa microlitro (s) , "mi" significa mililitro (s) , "1" significa litro (s), "mM" significa milimolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimol(es), "ppm" significa parte (s) por millón, "wt" significa peso, "% en peso" significa por ciento en peso, "g" significa gramo(s), "µ9" significa microgramo (s) , "ng" significa nanogramos (s) , "g" significa gravedad, "HPLC" significa cromatografía de líquidos de alto rendimiento, "H20 dd" significa agua destilada y desionizada, "dcw" significa peso seco celular, "ATCC" o "ATCC®" significa American Type Culture Collection (Manassas, VA), "U" significa unidad(es) de actividad de perhidrolasa, "rpm" significa revolución (es) por minuto, "EDTA" significa ácido etilendiaminotetraacético, "IPTG" significa isopropil^-D-tio-galactósido, "BCA" significa ácido bicinconínico y "ABTS" significa 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) .

Ejemplo 1 Clonación y producción de acetilxilano esterasa CE-7 a partir de Actinosynnema mirum en E. coli El gen que codifica la enzima acetilxilano esterasa a partir de Actinosynnema mirum como se reporta en GENBANK® (núm. de registro ACU35776.1; GI : 255920265) se sintetizó con el uso de codones optimizados para la expresión en E. coli (DNA 2.0, Menlo Park, CA) . Se subclonó el producto de ácido nucleico (sec. con núm. de ident . : 3) en pJexpress404® (DNA 2.0, Menlo Park, CA) para producir el plásmido identificado como pMP91. El plásmido pMP91 se usó para transformar KLP18 de E. coli (descrito en la patente de los Estados Unidos núm. 7,723,083) para producir la cepa identificada como KLP18/pMP91. KLP18/pMP91 se cultivó en medio LB a 37 °C con agitación hasta ??ß?? nm = 0.4 - 0.5, momento en el cual se agregó IPTG hasta una concentración final de 1 mM y la incubación se continuó durante 2-3 h. Las células se recolectaron por centrifugación a 5,000 x g durante 15 minutos, después, se suspendieron nuevamente (20 % en p/v) en amortiguador de fosfato potásico 50 mM, pH de 7.0, complementado con ditiotreitol 1.0 mM. Las células suspendidas nuevamente se pasaron por una prensa francesa dos veces. Las células Usadas se centrifugaron durante 30 minutos a 12,000 x g y la concentración proteica en el sobrenadante del extracto se determinó con el uso de un kit de ensayos BCA (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO) . Se usó SDS-PAGE para confirmar la expresión de la enzima CE-7 (sec. con núm. de ident . : 4) y el análisis de los geles con el uso de ImageJ, un programa de procesamiento de imágenes Java de dominio público, indicó que la perhidrolasa constituía 11 % de la proteína soluble total .

Ejemplo 2 Clonación y producción de acetilxilano esterasa CE-7 a partir de Propionibacterium acnés en E. coli El gen que codifica la enzima acetilxilano esterasa a partir de Propionibacterium acnés como se reporta en GENBA ® (núm. de registro AEE71478.1; GI : 332674662) se sintetizó con el uso de codones optimizados para la expresión en E. coli (DNA 2.0, Menlo Park, CA) . Se subclonó el producto de ácido nucleico (sec. con núm. de ident.: 5) se subclonó en pJexpress404® (DNA 2.0, Menlo Park, CA) para producir el plásmido identificado como pMP92. El plásmido pMP92 se usó para transformar KLP18 de E. coli (descrito en la patente de los Estados Unidos núm. 7,723,083) para producir la cepa identificada como KLP18/pMP92. KLP18/pMP92 se cultivó en medio LB a 37 °C con agitación hasta ??ß?? nm = 0.4 - 0.5, momento en el cual se agregó IPTG hasta una concentración final de 1 mM y la incubación se continuó durante 2-3 h. Las células se recolectaron por centrifugación a 5,000 x g durante 15 minutos, después, se suspendieron nuevamente (20 % en p/v) en amortiguador de fosfato potásico 50 mM, pH de 7.0, complementado con ditiotreitol 1.0 mM. Las células suspendidas nuevamente se pasaron por una prensa francesa dos veces. Las células lisadas se centrifugaron durante 30 minutos a 12,000 x g y la concentración proteica soluble total en el sobrenadante del extracto se determinó con el uso de un kit de ensayos BCA (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO) . Se usó SDS-PAGE para confirmar la expresión de la enzima CE-7 (sec. con núm. de ident.: 6) y el análisis de los geles con el uso de ImageJ, un programa de procesamiento de imágenes Java de dominio público, indicó que la perhidrolasa constituía 13 % de la proteína soluble total.

Ej emplo 3 Clonación y producción de acetilxilano esterasa CE-7 a partir de .Streptococcus equi en E. coli El gen que codifica la enzima acetilxilano esterasa a partir de Streptococcus egui como se reporta en GENBA K® (núm. de registro CAX00506.1: GI : 225702544) se sintetizó con el uso de codones optimizados para la expresión en E. coli (DNA 2.0, Menlo Park, CA) . Se subclonó el producto de ácido nucleico (sec. con núm. de ident. : 7) se subclonó en pJexpress404® (DNA 2.0, Menlo Park, CA) para producir el plásmido identificado como pMP93. El plásmido pMP93 se usó para transformar KLP18 de E. coli (descrito en la patente de los Estados Unidos núm. 7,723,083) para producir la cepa identificada como KLP18/pMP93. KLP18/pMP93 se cultivó en medio LB a 37 °C con agitación hasta ODsoo nm = 0.4 - 0.5, momento en el cual se agregó IPTG hasta una concentración final de 1 mM y la incubación se continuó durante 2-3 h. Las células se recolectaron por centrifugación a 5,000 x g durante 15 minutos, después, se suspendieron nuevamente (20 % en p/v) en amortiguador de fosfato potásico 50 mM, pH de 7.0, complementado con ditiotreitol 1.0 mM. Las células suspendidas nuevamente se pasaron por una prensa francesa dos veces. Las células lisadas se centrifugaron durante 30 minutos a 12,000 x g y la concentración proteica soluble total en el sobrenadante del extracto se determinó con el uso de un kit de ensayos BCA (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO) . Se usó SDS-PAGE para confirmar la expresión de la enzima CE-7 (sec. con núm. de ident . : 8) y el análisis de los geles con el uso de ImageJ, un programa de procesamiento de imágenes Java de dominio público, indicó que la perhidrolasa constituía 26 % de la proteína soluble total.

Ejemplo 4 Clonación y producción de acetilxilano esterasa CE-7 a partir de Stackebrandtia nassauensis en E. coli El gen que codifica la enzima acetilxilano esterasa a partir de Stackebrandtia nassauensis como se reporta en GENBANK® (núm. de registro ADD42786.1: GI : 290569821) se sintetizó con el uso de codones optimizados para la expresión en E. coli (DNA 2.0, enlo Park, CA) . Se subclonó el producto de ácido nucleico (sec. con núm. de ident . : 9) se subclonó en pJexpress404® (DNA 2.0, Menlo Park, CA) para producir el plásmido identificado como p P94. El plásmido pMP91 se usó para transformar KLP18 de E. coli (descrito en la patente de los Estados Unidos núm. 7,723,083) para producir la cepa identificada como KLP18/pMP94. KLP18/pMP94 se cultivó en medio LB a 37 °C con agitación hasta ??e?? nm = 0.4 - 0.5, momento en el cual se agregó IPTG hasta una concentración final de 1 mM y la incubación se continuó durante 2-3 h. Las células se recolectaron por centrifugación a 5,000 x g durante 15 minutos, después, se suspendieron nuevamente (20 % en p/v) en amortiguador de fosfato potásico 50 mM, pH de 7.0, complementado con ditiotreitol 1.0 mM. Las células suspendidas nuevamente se pasaron por una prensa francesa dos veces. Las células lisadas se centrifugaron durante 30 minutos a 12,000 x g y la concentración proteica soluble total en el sobrenadante del extracto se determinó con el uso de un kit de ensayos BCA (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO) . Se usó SDS-PAGE para confirmar la expresión de la enzima CE-7 (sec. con núm. de ident.: 10) y el análisis de los geles con el uso de ImageJ, un programa de procesamiento de imágenes Java de dominio público, indicó que la perhidrolasa constituía 33 % de la proteína soluble total.

Ejemplo 5 Clonación y producción de acetilxilano esterasa CE-7 a partir de Streptococcus agalactiae en E. coli El gen que codifica la enzima acetilxilano esterasa a partir de Streptococcus agalactiae como se reporta en GENBANK® (núm. de registro AAM98949.1; GI: 22533045) se sintetizó con el uso de codones optimizados para la expresión en E. coli (DNA 2.0, Menlo Park, CA) . Se subclonó el producto de ácido nucleico (sec. con núm. de ident . : 11) se subclonó en pJexpress404® (DNA 2.0, Menlo Park, CA) para producir el plásmido identificado como pMP95. El plásmido pMP95 se usó para transformar KLP18 de E. coli (descrito en la patente de los Estados Unidos núm. 7,723,083) para producir la cepa identificada como KLP18/pMP95. KLP18/pMP95 se cultivó en medio LB a 37 °C con agitación hasta ??ß?? nm = 0.4 - 0.5, momento en el cual se agregó IPTG hasta una concentración final de 1 mM y la incubación se continuó durante 2-3 h. Las células se recolectaron por centrifugación a 5,000 x g durante 15 minutos, después, se suspendieron nuevamente (20 % en p/v) en amortiguador de fosfato potásico 50 mM, pH de 7.0, complementado con ditiotreitol 1.0 mM. Las células suspendidas nuevamente se pasaron por una prensa francesa dos veces. Las células lisadas se centrifugaron durante 30 minutos a 12,000 x g y la concentración proteica soluble total en el sobrenadante del extracto se determinó con el uso de un kit de ensayos BCA (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO) . Se usó SDS-PAGE para confirmar la expresión de la enzima CE-7 (sec. con núm. de ident . : 12) y el análisis de los geles con el uso de ImageJ, un programa de procesamiento de imágenes Java de dominio público, indicó que la perhidrolasa constituía 7.3 % de la proteína soluble total.

Ejemplo 6 Ensayos de actividad de perhidrolasa La actividad de perhidrolasa en el sobrenadante del extracto se determinó por reacciones que contienen triacetina 22.5 mM, peróxido de hidrógeno 22.5 mM y 6.25 µg de proteína soluble total de sobrenadante del extracto/ml . La incubación duró 10 minutos a temperatura ambiente (22-24 °C) . Las reacciones se suspendieron al agregar un volumen igual de ácido fosfórico 1.25 M que contiene orto-fenilendiamina 100 mM. Después de 30 minutos, se determinó la absorbancia a 458 nm (Tabla 1) . Se realizó otras mediciones adicionales de la actividad de perhidrolasa en las reacciones que contienen triacetina 10 mM y peróxido de hidrógeno 10 mM o triacetina 50 mM y peróxido de hidrógeno 50 mM (Tabla 1) . La acetilxilano esterasa CE-7 a partir de T. marítima se produjo, además, en KLP18 de E. coli (descrito en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2008-0176299) y se usó como un control positivo para el ensayo de perhidrolasa . El extracto de KLP18 de E. coli que no contiene una enzima CE-7 se usó como un control negativo.

Tabla 1.

Ejemplo 7 Producción de ácido peracético a partir de triacetina y peróxido de hidrógeno por esterasas CE-7 Las reacciones (10 mi del volumen total) se llevaron a cabo a 25 °C en amortiguador de fosfato potásico (50 mM, pH de 7.0) que contiene triacetina (10 mM) , peróxido de hidrógeno (20 mM) y 5.0 pg/ml de la proteína soluble total del sobrenadante del extracto que contiene la esterasa CE-7 a partir de Actinosynnema mirum (sec. con núm. de ident . : 4), Propionibacterium acnés (sec. con núm. de ident.: 6), Streptococcus equi (sec. con núm. de ident . : 8), Stackebrandtia nassauensis (sec. con núm. de ident.: 10) o Streptococcus agalactiae (sec. con núm. de ident.: 12), que se prepara como se describe en los Ejemplos 1-5. Las reacciones se agitaron durante únicamente los primeros 45 segundos de reacción para mezclar inicialmente los reactantes y la enzima. Una reacción de control comparativa se llevó a cabo en condiciones idénticas a las descritas inmediatamente arriba con el uso de 5.0 ug/ml de proteína soluble total del extracto aislada de KLP18 de E. coli (que se usa para expresar las esterasas CE-7) , en donde el sobrenadante del extracto se preparó de conformidad con el procedimiento del Ejemplo 1. Se llevó a cabo, además, una segunda reacción de control comparativa en condiciones idénticas a las descritas inmediatamente arriba sin agregar nada de proteína soluble total del sobrenadante del extracto, en donde el ácido peracético producido sin esterasa agregada fue el resultado de la perhidrólisis química de triacetina por peróxido de hidrógeno en las condiciones de reacción especificadas. La acetilxilano esterasa CE-7 a partir de T. marítima (sec. con núm. de ident.: 2) se produjo, además, en KLP18 de E. coli (descrito en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2008-0176299) y se usó como un control positivo en una reacción comparativa (11 % de la proteína soluble total en el sobrenadante del extracto celular) .

El análisis de las muestras de reacción para la producción de ácido peracético se realizó de conformidad con el método descrito en Pinkernell et. al. (Analyst, 122:567 (1997)) con el uso de la detección colorimétrica de oxidación de ABTS por ácido peracético. Una muestra de reacción de 50 µ? se agregó a 950 µ? de H3PO4 5 mM para detener la reacción enzimática (pH final entre 2 y 3) y 50 µ? de la solución resultante se agregó en un pocilio de una placa de microtitulación de 96 pocilios que contiene 200 µ? de una solución acuosa que contiene ácido acético 0.25 M, 0.125 g/1 de ABTS y 5.0 mg/1 de KI . Se dejó que la solución se desarrollara durante 5 min, después, la absorbancia de la solución se determinó a 405 nm con el uso de un lector de microplacas. La concentración de ácido peracético en cada muestra se calculó a partir de una curva estándar desarrollada simultáneamente con el uso de una solución de reactivo de ácido peracético (Tabla 2).

Tabla 2. Producción de ácido peracético (PAA) catalizada por perhidrolasas CE-7 a partir de triacetina y peróxido de hidrógeno en amortiguador de fosfato potásico (50 mM, pH de 7.0) a 25 °C.

Ejemplo 8 Producción de ácido peracético a partir de diacetato de propilenglicol y peróxido de hidrógeno por esterasas CE-7 Las reacciones (10 mi del volumen total) se llevaron a cabo a 25 °C en amortiguador de fosfato potásico (50 mM, pH de 7.0) que contienen diacetato de propilenglicol (10 mM) , peróxido de hidrógeno (20 mM) y 5.0 pg/ml de proteína soluble total del sobrenadante del extracto que contiene la esterasa CE-7 a partir de Actinosynnema mirum (sec. con núm. de ident . : 4), Propionibacterium acnés (sec. con núm. de ident.: 6), Streptococcus equi (sec. con núm. de ident.: 8) o Stackebrandtia nassauensis (sec. con núm. de ident.: 10) que se prepara como se describió en los Ejemplos 1-4. Las reacciones se agitaron durante únicamente los primeros 45 segundos de reacción para mezclar inicialmente los reactantes y la enzima. Una reacción de control comparativa se llevó a cabo en condiciones idénticas a las descritas inmediatamente arriba con el uso de 5.0 pg/ml de proteína soluble total del extracto aislada de KLP18 de E. coli (que se usa para expresar las esterasas CE-7) , en donde el sobrenadante del extracto se preparó de conformidad con el procedimiento del Ejemplo 1. Se llevó a cabo, además, una segunda reacción de control comparativa en condiciones idénticas a las descritas inmediatamente arriba sin agregar nada de proteína soluble total del sobrenadante del extracto, en donde el ácido peracético producido sin esterasa agregada fue el resultado de la perhidrolisis química de diacetato de propilenglicol por peróxido de hidrógeno en las condiciones de reacción especificadas. La acetilxilano esterasa CE-7 a partir de T. marítima (sec. con núm. de ident . : 2) se produjo, además, en KLP18 de E. coli (descrito en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2008-0176299) y se usó como un control positivo en una reacción comparativa (11 % de la proteína soluble total en el sobrenadante del extracto celular) . El análisis de las muestras de reacción para la producción de ácido peracético se realizó de conformidad con el método descrito en el Ejemplo 7 (Tabla 3) .

Tabla 3. Producción de ácido peracético (PAA) catalizada por perhidrolasas CE- 7 a partir de diacetato de propilenglicol y peróxido de hidrógeno en amortiguador de fosfato potásico (50 mM, pH de 7.0) a 25 °C.

Ejemplo 9 Producción de ácido peracético a partir de pentaacetato de g-D-glucosa y peróxido de hidrógeno por esterasas CE- 7 Las reacciones (10 mi del volumen total) se llevaron a cabo a 25 °C en amortiguador de fosfato potásico (50 mM, pH de 7.0) que contiene pentaacetato de a-D-glucosa (10 mM) , peróxido de hidrógeno (20 mM) y 5.0 g/ml de proteína soluble total del sobrenadante del extracto que contiene la esterasa CE-7 a partir de Actinosynnema mirum (sec. con núm. de ident.: 4), Streptococcus equi (sec. con núm. de ident.: 8) o Streptococcus agalactiae (sec. con núm. de ident.: 12) que se preparó como se describió en los Ejemplos 1, 3 y 5. Las reacciones se agitaron durante únicamente los primeros 45 segundos de reacción para mezclar inicialmente los reactantes y la enzima. Una reacción de control comparativa se llevó a cabo en condiciones idénticas a las descritas inmediatamente arriba con el uso de 5.0 µ9/p\1 de proteína soluble total del extracto aislada de KLP18 de E. coli (que se usa para expresar las esterasas CE-7) , en donde el sobrenadante del extracto se preparó de conformidad con el procedimiento del Ejemplo 1. Se llevó a cabo, además, una segunda reacción de control comparativa en condiciones idénticas a las descritas inmediatamente arriba sin agregar nada de proteína soluble total del sobrenadante del extracto, en donde el ácido peracético producido sin esterasa agregada fue el resultado de la perhidrólisis química de pentaacetato de a-D-glucosa por peróxido de hidrógeno en las condiciones de reacción especificadas. La acetilxilano esterasa CE-7 a partir de T. marítima (sec. con núm. de ident.: 2) se produjo, además, en KLP18 de E. coli (descrito en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2008-0176299) y se usó como un control positivo en una reacción comparativa (11 % de la proteína soluble total en el sobrenadante del extracto celular) . El análisis de las muestras de reacción para la producción de ácido peracético se realizó de conformidad con el método descrito en el Ejemplo 7 (Tabla 4) .

Tabla 4 . Producción de ácido peracético (PAA) catalizada por perhidrolasas CE- 7 a partir de pentaacetato de a-D-glucosa y peróxido de hidrógeno en amortiguador de fosfato potásico ( 50 mM, pH de 7 . 0 ) a 25 °C.

Ejemplo 10 Producción de ácido peracético a partir de D-hexaacetato de sorbitol y peróxido de hidrógeno por esterasas CE- 7 Las reacciones ( 10 mi del volumen total) se llevaron a cabo a 25 °C en amortiguador de fosfato potásico ( 50 mM, pH de 7 . 0 ) que contiene D-hexaacetato de sorbitol ( 10 mM) , peróxido de hidrógeno ( 20 mM) y 5 . 0 µg/ml de proteína soluble total del sobrenadante del extracto que contiene la esterasa CE- 7 a partir de Actinosynnema mirum (sec. con núm. de ident . : 4 ) o Streptococcus egui (sec. con núm. de ident.: 8 ) que se preparó como se describió en los Ejemplos 1 y 3 . Las reacciones se agitaron durante únicamente los primeros 45 segundos de reacción para mezclar inicialmente los reactantes y la enzima. Una reacción de control comparativa se llevó a cabo en condiciones idénticas a las descritas inmediatamente arriba con el uso de 5.0 g/ml de proteína soluble total del extracto aislada de KLP18 de E. coli (que se usa para expresar las esterasas CE- 7) , en donde el sobrenadante del extracto se preparó de conformidad con el procedimiento del Ejemplo 1. Se llevó a cabo, además, una segunda reacción de control comparativa en condiciones idénticas a las descritas inmediatamente arriba sin agregar nada de proteína soluble total del sobrenadante del extracto, en donde el ácido peracético producido sin esterasa agregada fue el resultado de la perhidrólisis química de D-hexaacetato de sorbitol por peróxido de hidrógeno en las condiciones de reacción especificadas. La acetilxilano esterasa CE-7 a partir de G. marítima (sec. con núm. de ident.: 2) se produjo, además, en KLP18 de E. coli (descrito en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2008-0176299) y se usó como un control positivo en una reacción comparativa (11 % de la proteína soluble total en el sobrenadante del extracto celular) . El análisis de las muestras de reacción para la producción de ácido peracético se realizó de conformidad con el método descrito en el Ejemplo 7 (Tabla 5) .

Tabla 5. Producción de ácido peracético (PAA) catalizada por perhidrolasas CE-7 a partir de D-hexaacetato de sorbitol y peróxido de hidrógeno en amortiguador de fosfato potásico (50 mM, pH de 7.0) a 25 °C.

Ejemplo 11 Producción de ácido peracético a partir de tri-O-acetil- D-glucal y peróxido de hidrógeno por esterasas CE-7 Las reacciones (50 mi del volumen total) se llevaron a cabo a 25 °C en amortiguador de fosfato potásico (10 mM, pH de 7.0) que contiene tri-O-acetil-D-glucal (2 mM) , peróxido de hidrógeno (10 mM) y 5.0 \xg/ml de proteína soluble total del sobrenadante del extracto que contiene la esterasa CE-7 a partir de Actinosynnema mirum (sec. con núm. de ident . : 4) o Streptococcus equi (sec. con núm. de ident.: 8) que se preparó como se describió en los Ejemplos 1 y 3. Las reacciones se agitaron durante únicamente los primeros 45 segundos de reacción para mezclar inicialmente los reactantes y la enzima. Una reacción de control comparativa se llevó a cabo en condiciones idénticas a las descritas inmediatamente arriba con el uso de 5.0 µg/ml de proteína soluble total del extracto aislada de KLP18 de E. coli (que se usa para expresar las esterasas CE- 7) , en donde el sobrenadante del extracto se preparó de conformidad con el procedimiento del Ejemplo 1. Se llevó a cabo, además, una segunda reacción de control comparativa en condiciones idénticas a las descritas inmediatamente arriba sin agregar nada de proteína soluble total del sobrenadante del extracto, en donde el ácido peracético producido sin esterasa agregada fue el resultado de la perhidrólisis química de tri-O-acetil-D-glucal por peróxido de hidrógeno en las condiciones de reacción especificadas. La acetilxilano esterasa CE-7 a partir de T. marítima (sec. con núm. de ident.: 2) se produjo, además, en KLP18 de E. coli (descrito en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2008-0176299) y se usó como un control positivo en una reacción comparativa (11 % de la proteína soluble total en el sobrenadante del extracto celular) . El análisis de las muestras de reacción para la producción de ácido peracético se realizó de conformidad con el método descrito en el Ejemplo 7 (Tabla 6) .

Tabla 6. Producción de ácido peracético (PAA) catalizada por perhidrolasas CE-7 a partir de tri-O-acetil-D-glucal y peróxido de hidrógeno en amortiguador de fosfato potásico (10 mM, pH de 7.0) a 25 °C.

Ejemplo 12 Producción de ácido peracético a partir de ácido 4-(acetiloxi) -benzoico y peróxido de hidrógeno por esterasas CE-7 Las reacciones (10 mi del volumen total) se llevaron a cabo a 20 °C en amortiguador de fosfato potásico (50 mM, pH de 7.0) que contiene ácido 4- (acetiloxi) -benzoico (CAS 2345-34-8; 25 mM) , peróxido de hidrógeno (20 mM) y 5.0 ug/ml de proteína soluble total del sobrenadante del extracto que contiene la esterasa CE-7 a partir de Actinosynnema mirum (sec. con núm. de ident.: 4), Propionibacterium acnés (sec. con núm. de ident.: 6), Streptococcus equi (sec. con núm. de ident.: 8) o Staofcejbrandtia nassauensis (sec. con núm. de ident.: 10) que se prepara como se describió en los Ejemplos 1-4. Las reacciones se agitaron durante únicamente los primeros 45 segundos de reacción para mezclar inicialmente los reactantes y la enzima. Una reacción de control comparativa se llevó a cabo en condiciones idénticas a las descritas inmediatamente arriba con el uso de 5.0 ug/ml de proteína soluble total tratada con calor del extracto aislada de KLP18 de E. coli (que se usa para expresar las esterasas CE-7) , en donde el sobrenadante del extracto se preparó de conformidad con el procedimiento del Ejemplo 1. Se llevó a cabo, además, una segunda reacción de control comparativa en condiciones idénticas a las descritas inmediatamente arriba sin agregar nada de proteína soluble total del sobrenadante del extracto, en donde el ácido peracético producido sin esterasa agregada fue el resultado de la perhidrólisis química de ácido 4- (acetiloxi) -benzoico por peróxido de hidrógeno en las condiciones de reacción especificadas. La acetilxilano esterasa CE-7 a partir de T. marítima (sec. con núm. de ident . : 2) se produjo, además, en KLP18 de E. coli (descrito en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2008-0176299) y se usó como un control positivo en una reacción comparativa (11 % de la proteína soluble total en el sobrenadante del extracto celular) . El análisis de las muestras de reacción para la producción de ácido peracético se realizó de conformidad con el método descrito en el Ejemplo 7 (Tabla 7) .

Tabla 7. Producción de ácido peracético (PAA) catalizada por perhidrolasas CE-7 a partir de ácido 4 - (acetiloxi ) -benzoico y peróxido de hidrógeno en amortiguador de fosfato potásico (50 mM, pH de 7.0) a 20 °C.

Ejemplo 13 Clonación y producción de una variante de acetilxilano esterasa de Actinosynnema mirum Un gen que codifica una variante de la enzima acetilxilano esterasa a partir de A. mirum como se reporta en GENBANK® (núm. de registro ACU35776.1: GI : 255920265) se sintetizó con el uso de codones optimizados para la expresión en E. coli (DNA 2.0, Menlo Park, CA) . Se subclonó el producto de ácido nucleico (sec. con núm. de ident . : 13) se subclonó en pJexpress404® (DNA 2.0, Menlo Park, CA) para producir el plásmido identificado como pMP91a. La variante de proteína codificada se denomina Ami_C276S (sec. con núm. de ident.: 14) . El plásmido pMP91a se usó para transformar KLP18 de E. coli (descrito en la patente de los Estados Unidos núm. 7,723,083) para producir la cepa identificada como KLP18/pMP91a. KLP18/pMP91a se cultivó en medio LB a 37 °C con agitación hasta ODeoo nm = 0.4 - 0.5, momento en el cual se agregó IPTG hasta una concentración final de 1 mM y la incubación se continuó durante 2-3 h. Las células se recolectaron por centrifugación a 5,000 x g durante 15 minutos, después, se suspendieron nuevamente (20 % en p/v) en amortiguador de fosfato potásico 50 mM, pH de 7.0, complementado con ditiotreitol 1.0 mM. Las células suspendidas nuevamente se pasaron por una prensa francesa dos veces. Las células lisadas se centrifugaron durante 30 minutos a 12,000 x g y la concentración proteica en el sobrenadante se determinó con el uso de un kit de ensayos BCA (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO) . Se usó SDS-PAGE para confirmar la expresión de la enzima y la densitometría (programa de ImageJ, National Institutes of Health, Bethesda, MD) se usó para calcular la proteína enzimática como aproximadamente 16-18 % de la proteína total.

Ejemplo 14 Clonación y producción de una variante de acetilxilano esterasa de Actinosynnema mirum Un gen que codifica una variante de la enzima acetilxilano esterasa a partir de A. mirum como se reporta en GENBANK® (núm. de registro ACU35776.1: GI : 255920265) se sintetizó con el uso de codones optimizados para la expresión en E. coli (DNA 2.0, Menlo Park, CA) . Se subclonó el producto de ácido nucleico (sec. con núm. de ident. : 15) se subclonó en pJexpress404® (DNA 2.0, Menlo Park, CA) para producir el plásmido identificado como pMP91b. La variante de proteína codificada se denomina Ami_C276T (sec. con núm. de ident.: 16) . El plásmido pMP91b se usó para transformar KLP18 de E. coli (descrito en la patente de los Estados Unidos núm. 7,723,083) para producir la cepa identificada como KLP18/pMP91b. KLP18/pMP91b se cultivó en medio LB a 37 °C con agitación hasta ??ß?? nm = 0.4 - 0.5, momento en el cual se agregó IPTG hasta una concentración final de 1 mM y la incubación se continuó durante 2-3 h. Las células se recolectaron por centrifugación a 5,000 x g durante 15 minutos, después, se suspendieron nuevamente (20 % en p/v) en amortiguador de fosfato potásico 50 mM, pH de 7.0, complementado con ditiotreitol 1.0 mM. Las células suspendidas nuevamente se pasaron por una prensa francesa dos veces. Las células lisadas se centrifugaron durante 30 minutos a 12,000 x g y la concentración proteica en el sobrenadante se determinó con el uso de un kit de ensayos BCA (Sigma-Aldrich, St . Louis, O) . Se usó SDS-PAGE para confirmar la expresión de la enzima y la densitometría (programa de ImageJ, National Institutes of Health, Bethesda, MD) se usó para calcular la proteína enzimática como aproximadamente 16-18 % de la proteína total.

Ejemplo 15 Ensayos de actividad de perhidrolasa La actividad de perhidrolasa en extractos se determinó por reacciones que contienen triacetina 22.5 mM, peróxido de hidrógeno 22.5 mM y 1.5 ]ig de proteína total/ml. La incubación duró 10 minutos a temperatura ambiente (22-24 °C) . Las reacciones se suspendieron al agregar un volumen igual de ácido fosfórico 1.25 M que contiene orto-fenilendiamina 100 mM. Después de 30 minutos, se determinó la absorbancia a 458 nm (Tabla 8) . Extracto de KLP18 de E. coli que no contiene enzima acetilxilano esterasa se usó como control negativo .

Tabla 8.

Ejemplo 16 Producción de ácido peracético a partir de triacetina y peróxido de hidrógeno por variantes de esterasas CE-7 Las reacciones (10 mi del volumen total) se llevaron a cabo a 25 °C en amortiguador de fosfato potásico (20 mM , pH de 7.0) que contiene triacetina (0.75 mM), peróxido de hidrógeno (1.4 mM) y ya sea 1.0 pg/ml o 2.0 g/ml de esterasa CE-7 a partir de Ac t inosynnema rairum silvestre (sec. con núm . de ident.: 4, que se preparó como se describió en el Ejemplo 1), la variante C276S de Act inosynnema miru (sec. con núm. de ident.: 14, que se preparó como se describió en el Ejemplo 13), variante C276T de Act inosynnema mirum (sec. con núm. de ident. : 16, que se preparó como se describió en el Ejemplo 14), C277S de T. marítima (sec. con núm. de ident.: 17, que se preparó en KLP18 de E . coli como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 8,062,875) y C277T de T. marítima (sec. con núm. de ident. :18, que se preparó en KLP18 de E. coli como se describe en la patente de los Estados Unidos núm . 8,062,875) . El análisis de extractos celulares que contienen esterasa CE-7 por geles de SDS-PAGE en combinación con el análisis de los geles con el uso de ImageJ, un programa de procesamiento de imágenes Java de dominio público, se usó para calcular la concentración de esterasa CE-7 en los extractos celulares como un porcentaje de proteína soluble total. Las reacciones se agitaron durante únicamente los primeros 45 segundos de reacción para mezclar inicialmente los reactantes y la enzima. Se llevó a cabo una reacción de control comparativa en condiciones idénticas a las descritas inmediatamente arriba sin agregar esterasa CE-7, en donde el ácido peracético producido sin esterasa agregada fue el resultado de la perhidrólisis química de triacetina por peróxido de hidrógeno en las condiciones de reacción especificadas. El análisis de las muestras de reacción para la producción de ácido peracético se realizó de conformidad con el método descrito en el Ejemplo 7 (Tabla 9) .

Tabla 9. Producción de ácido peracético (PAA) catalizada por la variante de perhidrolasas CE- 7 a partir de triacetina y peróxido de hidrógeno en amortiguador de fosfato potásico (20 mM, pH de 7.0) a 25 °C.

E emplo 17 Producción de ácido peracético a partir de triacetina y peróxido de hidrógeno por variantes de esterasas CE-7 Las reacciones (10 mi del volumen total) se llevaron a cabo a 25 °C en amortiguador de fosfato potásico (50 m , pH de 7.0) que contiene triacetina (10 mM) , peróxido de hidrógeno (20 mM) y 0.5 pg/ml de esterasa CE-7 a partir de Actinosynnema mirum silvestre (sec. con núm. de ident . : 4, que se preparó como se describió en el Ejemplo 1) , la variante C276S de Actinosynnema mirum (sec. con núm. de ident.: 14, que se preparó como se describió en el Ejemplo 13), variante C276T de Actinosynnema mirum (sec. con núm. de ident.: 16, que se preparó como se describió en el Ejemplo 14), C277S de T. marítima (sec. con núm. de ident.: 17) y C277T de T. marítima (sec. con núm. de ident.: 18). El análisis de extractos celulares que contienen esterasa CE-7 por geles de SDS-PAGE en combinación con el análisis de los geles con el uso de ImageJ, un programa de procesamiento de imágenes Java de dominio público, se usó para calcular la concentración de esterasa CE-7 en los extractos celulares como un porcentaje de proteína soluble total. Las reacciones se agitaron durante únicamente los primeros 45 segundos de reacción para mezclar inicialmente los reactantes y la enzima. Se llevó a cabo una reacción de control comparativa en condiciones idénticas a las descritas inmediatamente arriba sin agregar esterasa CE-7, en donde el ácido peracético producido sin esterasa agregada fue el resultado de la perhidrólisis química de triacetina por peróxido de hidrógeno en las condiciones de reacción especificadas. El análisis de las muestras de reacción para la producción de ácido peracético se realizó de conformidad con el método descrito en el Ejemplo 7 (Tabla 10) .

Tabla 10. Producción de ácido peracético (PAA) catalizada por la variante de perhidrolasas CE-7 a partir de triacetina y peróxido de hidrógeno en amortiguador de fosfato potásico (50 mM, pH de 7.0) a 25 °C.

Ejemplo 18 Producción de ácido peracético a partir de triacetina y peróxido de hidrógeno por variantes de esterasas CE-7 Las reacciones (10 mi del volumen total) se llevaron a cabo a 25 °C en amortiguador de carbonato sódico (20 mM, pH de 10.5) que contiene triacetina (0.75 mM) , peróxido de hidrógeno (1.4 mM, a partir de percarbonato sódico) y ya sea 1.0 ug/ml o 2.0 ug/ml de esterasa CE-7 a partir de Actinosynnema mirum silvestre (sec. con núm. de ident.: 4, que se preparó como se describió en el Ejemplo 1) , la variante C276S de Actinosynnema mirum (sec. con núm. de ident.: 14, que se preparó como se describió en el Ejemplo 13) , variante de C276T de Actinosynnema mirum (sec. con núm. de ident.: 16, que se preparó como se describió en el Ejemplo 14) , C277S de T. marítima (sec. con núm. de ident.: 17) y C277T de T. marítima (sec. con núm. de ident.: 18) . El análisis de extractos celulares que contienen esterasa CE-7 por geles de SDS-PAGE en combinación con el análisis de los geles con el uso de ImageJ, un programa de procesamiento de imágenes Java de dominio público, se usó para calcular la concentración de esterasa CE-7 en los extractos celulares como un porcentaje de proteína soluble total. Las reacciones se agitaron durante únicamente los primeros 45 segundos de reacción para mezclar inicialmente los reactantes y la enzima Se llevó a cabo una reacción de control comparativa en condiciones idénticas a las descritas inmediatamente arriba sin agregar esterasa CE-7, en donde el ácido peracético producido sin esterasa agregada fue el resultado de la perhidrólisis química de triacetina por peróxido de hidrógeno en las condiciones de reacción especificadas. El análisis de las muestras de reacción para la producción de ácido peracético se realizó de conformidad con el método descrito en el Ejemplo 7 (Tabla 11) .

Tabla 11. Producción de ácido peracético (PAA) catalizada por la variante de perhidrolasas CE- 7 a partir de triacetina y peróxido de hidrógeno en amortiguador de carbonato sódico (20 mM, pH de 10.5) a 25 °C.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (23)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un proceso para producir un ácido peroxicarboxílico, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar un grupo de componentes de reacción que comprenden: (1) por lo menos un sustrato seleccionado del grupo que consiste en: (i) uno o más esteres que tienen la estructura [X] mRs en donde X = un grupo éster de la fórmula R.6-C(0)0; R.6 = una porción hidrocarbilo de Cl a C7 lineal, ramificada o cíclica sustituida opcionalmente con grupos hidroxilo o grupos alcoxi de Cl a C4 , en donde R6 comprende, opcionalmente, uno o más enlaces éter para Rs = C2 a C7 ; R5 = una porción hidrocarbilo de Cl a C6 lineal, ramificada o cíclica o porción heteroaromática cíclica de cinco miembros o una porción aromática o heteroaromática cíclica de seis miembros sustituida opcionalmente con grupos hidroxilo; en donde cada átomo de carbono en R5 comprende, individualmente, no más de un grupo hidroxilo o no más de un grupo éster o grupo ácido carboxílico; en donde R5 comprende, opcionalmente, uno o más enlaces éter; m = un entero en el intervalo de 1 al número de átomos de carbono en R5; y en donde los ésteres tienen una solubilidad en agua de por lo menos 5 ppm a 25 °C; (ii) uno o más glicéridos que tienen la estructura en donde Ri = un alquilo de Cl a C21 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi de Cl a C4 y R3 y R4 son, individualmente, H o RiC(O) ; (iii) uno o más ésteres de la fórmula: en donde Ri = un alquilo de Cl a C7 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi de Cl a C4 y R2 = un alquilo de Cl a CIO de cadena lineal o ramificada, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, heteroarilo, (CH2CH20)n, o (CH2CH (CH3) -O) nH y n es de 1 a 10; (iv) uno o más monosacáridos acilados, disacáridos acilados o polisacáridos acilados; y (v) cualquier combinación de (i) a (iv) ; (2) una fuente de peroxígeno; y (3) un catalizador enzimático que comprende un polipéptido que tiene actividad perhidrolítica y una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos que se expone en la sec. con núm. de ident . : 4, siempre que el residuo de aminoácidos unido al lado C-terminal de la histidina catalítica no es ácido glutámico; (b) combinar el grupo de componentes de reacción en condiciones de reacción adecuadas para producir ácido peroxicarboxílico; y (c) opcionalmente, diluir el ácido peroxicarboxílico producido en la etapa (b) .

2. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende, además, la etapa de: d) poner una superficie dura u objeto inanimado en contacto con el ácido peroxicarboxílico producido en la etapa (b) o etapa (c) ; por medio de lo cual la superficie dura o el objeto inanimado se desinfecta, se blanquea, se desmancha o una combinación de estos.

3. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el objeto inanimado es un instrumento médico .

4. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende, además, la etapa de: d) poner una prenda de vestir o un tejido en contacto con el ácido peroxicarboxílico producido en la etapa (b) o en la etapa (c) ; por medio de lo cual la prenda de vestir o tejido recibe un beneficio.

5. El proceso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el beneficio se selecciona del grupo que consiste en desinfección, esterilización, blanqueo, desmanchado, desodorización, y combinaciones de estos.

6. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende, además, la etapa de: d) poner pulpa de madera o pulpa de papel en contacto con el ácido peroxicarboxílico producido en la etapa (b) o en la etapa (c) ; por medio de lo cual la pulpa de madera o pulpa de papel se blanquea.

7. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sustrato se selecciona del grupo que consiste en: monoacetina ; diacetina; triacetina; monopro ionina ; dipropionina; tripropionina ; monobutirina; dibutirina; tributirina; pentaacetato de glucosa; pentaacetato de ß-D-galactosa, hexaacetato de sorbitol, octaacetato de sacarosa, tetraacetato de xilosa; xilano acetilado,- fragmentos de xilano acetilado; ß-D-ribofuranosa-1, 2 , 3 , 5-tetraacetato; tri-O-acetil-D-galactal ; tri-O-acetil-D-glucal; monoésteres o diésteres de 1, 2-etanodiol, 1,2-propanodiol, 1 , 3 -propanodiol , 1 , 2 -butanodiol , 1 , 3 -butanodiol , 2 , 3-butanodiol , 1 , 4 -butanodiol , 1 , 2 -pentanodiol , 2,5-pentanodiol, 1 , 5 -pentanodiol , 1 , 2 -hexanodiol , 2 , 5 -hexanodiol , 1 , 6 -hexanodiol ; ácido 4 -acetoxibenzoico; y mezclas de estos.

8. El proceso de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el sustrato es triacetina.

9. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido peroxicarboxílico producido es ácido peracético, ácido perpropiónico, ácido perbutírico, ácido perláctico, ácido perglicólico, ácido permetoxiacético, ácido per- -hidroxibutírico o mezclas de estos.

10. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el catalizador enzimático se encuentra en forma de una célula microbiana, una célula microbiana permeabilizada, un extracto de célula microbiana, una enzima parcialmente purificada, o una enzima purificada.

11. El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es la sec con núm. de ident . : 14 o 16.

12. Una composición caracterizada porque comprende: (a) un grupo de componentes de reacción que comprenden: (1) por lo menos un sustrato seleccionado del grupo que consiste en: (i) uno o más ésteres que tienen la estructura [XJmRs en donde X = un grupo éster de la fórmula R6-C(0)0; R6 = una porción hidrocarbilo de Cl a C7 lineal, ramificada o cíclica sustituida opcionalmente con grupos hidroxilo o grupos alcoxi de Cl a C4 , en donde R6 comprende, opcionalmente, uno o más enlaces éter para R6 = C2 a C7 ; R5 = una porción hidrocarbilo de Cl a C6 lineal, ramificada o cíclica o porción heteroaromática cíclica de cinco miembros o una porción aromática o heteroaromática cíclica de seis miembros sustituida opcionalmente con grupos hidroxilo; en donde cada átomo de carbono en R5 comprende, individualmente, no más de un grupo hidroxilo o no más de un grupo éster o grupo ácido carboxílico; en donde R5 comprende, opcionalmente, uno o más enlaces éter; m = un entero en el intervalo de 1 al número de átomos de carbono en Rs; y en donde los ésteres tienen una solubilidad en agua de al menos 5 ppm a 25 °C; (ii) uno o más glicéridos que tienen la estructura en donde Ri = un alquilo de Cl a C21 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi de Cl a C4 y R3 y R4 son, individualmente, H o RiC(O) ; (iii) uno o más esteres de la fórmula: en donde Ri = un alquilo de Cl a C7 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi de Cl a C4 y R2 = un alquilo de Cl a CIO de cadena lineal o ramificada, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, heteroarilo, (CH2CH20)n, o (CH2CH(CH3) -0)nH y n es de 1 a 10; (iv) uno o más monosacáridos acilados, disacáridos acilados o polisacáridos acilados; y (v) cualquier combinación de (i) a (iv) ; (2) una fuente de peroxígeno; y (3) un catalizador enzimático que comprende un polipéptido que tiene actividad perhidrolítica y una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos que se expone en la sec. con núm. de ident . : 4, siempre que el residuo de aminoácidos unido al lado C-terminal de la histidina catalítica no es ácido glutámico; y (b) por lo menos un ácido peroxicarboxílico formado con la combinación del grupo de componentes de reacción de (a) .

13. Un sistema de producción y suministro de perácidos caracterizado porque comprende: (a) un primer compartimento que comprende (1) un catalizador enzimático que comprende un polipéptido que tiene actividad perhidrolítica y una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos que se expone en la sec. con núm. de ident.: 4, siempre que el residuo de aminoácidos unido al lado C-terminal de la histidina catalítica no es ácido glutámico; (2) por lo menos un sustrato seleccionado del grupo que consiste en: (i) uno o más ásteres que tienen la estructura [X]mRs en donde X = un grupo éster de la fórmula R6-C(0)0; R6 = una porción hidrocarbilo de Cl a C7 lineal, ramificada o cíclica sustituida opcionalmente con grupos hidroxilo o grupos alcoxi de Cl a C4 , en donde 6 comprende, opcionalmente, uno o más enlaces éter para R6 = C2 a C7 ; R5 = una porción hidrocarbilo de Cl a C6 lineal, ramificada o cíclica o porción heteroaromática cíclica de cinco miembros o una porción aromática o heteroaromática cíclica de seis miembros sustituida opcionalmente con grupos hidroxilo; en donde cada átomo de carbono en R5 comprende, individualmente, no más de un grupo hidroxilo o no más de un grupo éster o grupo ácido carboxílico; en donde R5 comprende, opcionalmente, uno o más enlaces éter; m = un entero en el intervalo de 1 al número de átomos de carbono en R5; y en donde los ésteres tienen una solubilidad en agua de al menos 5 ppm a 25 °C; (ii) uno o más glicéridos que tienen la estructura en donde Ri = un alquilo de Cl a C21 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi de Cl a C4 y R3 y R4 son, individualmente, H o RiC(O) ; (üi) uno o más ásteres de la fórmula: en donde Ri = un alquilo de Cl a C7 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi de Cl a C4 y R2 = un alquilo de Cl a CIO de cadena lineal o ramificada, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, heteroarilo, (CH2CH20)n, o (CH2CH(CH3) -0)nH y n es de 1 a 10; (iv) uno o más monosacáridos acilados, disacáridos acilados o polisacáridos acilados; y (v) cualquier combinación de (i) a (iv) ; y (3) un amortiguador opcional; y (b) un segundo compartimento que comprende: (1) una fuente de peroxígeno; (2) un estabilizante del peróxido; y (3) un amortiguador opcional.

14. El sistema de producción y suministro de perácidos de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el sustrato comprende triacetina.

15. Una molécula de ácido nucleico aislado caracterizada porque se selecciona del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad perhidrolítica; el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de la sec . con núm. de ident . : 14 o sec. con núm. de ident.: 16; (b) un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico de la sec. con núm. de ident.: 13 o sec. con núm. de ident.: 15; y (c) un polinucleótido completamente complementario para el polinucleótido de (a) o (b) .

16. Un vector caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15.

17. Un constructo de ADN recombinante caracterizado porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 15 unido operativamente a una secuencia amortiguadora adecuada.

18. Una célula hospedera recombinante caracterizada porque comprende el constructo de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 17.

19. Un método para expresar un polipéptido, caracterizado porque comprende transformar una célula hospedera con el constructo de ADN recombinante de conformidad con la reivindicación 17.

20. Un polipéptido aislado que tiene actividad perhidrolítica caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de la sec . con núm. de ident . : 14 o sec . con núm. de ident . : 16.

21. Una composición para el cuidado de ropa; caracterizado porque comprende a) un polipéptido que tiene actividad perhidrolítica y una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos que se expone en la sec. con núm. de ident.: 4, siempre que el residuo de aminoácidos unido al lado C-terminal de la histidina catalítica no es ácido glutámico; b) al menos un sustrato seleccionado del grupo que consiste en: (i) uno o más ásteres que tienen la estructura [X] mR5 en donde X = un grupo éster de la fórmula R6-C(0)0; R6 = una porción hidrocarbilo de Cl a C7 lineal, ramificada o cíclica sustituida opcionalmente con grupos hidroxilo o grupos alcoxi de Cl a C4 , en donde R6 comprende, opcionalmente, uno o más enlaces éter para R6 = C2 a C7; R5 = una porción hidrocarbilo de Cl a C6 lineal, ramificada o cíclica o porción heteroaromática cíclica de cinco miembros o una porción aromática o heteroaromática cíclica de seis miembros sustituida opcionalmente con grupos hidroxilo; en donde cada átomo de carbono en R5 comprende, individualmente, no más de un grupo hidroxilo o no más de un grupo éster o grupo ácido carboxílico; en donde R5 comprende, opcionalmente, uno o más enlaces éter; m = = un entero en el intervalo de 1 al número de átomos de carbono en R5; y en donde los esteres tienen una solubilidad en agua de al menos 5 ppm a 25 °C; (ii) uno o más glicéridos que tienen la estructura en donde Ri = un alquilo de Cl a C21 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi de Cl. a C4 y R3 y 4 son, individualmente, H o RiC(O) ; (iii) uno o más ésteres de la fórmula: en donde Ri = un alquilo de Cl a C7 de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido con un hidroxilo o un grupo alcoxi de Cl a C4 y R2 = un alquilo de Cl a CIO de cadena lineal o ramificada, alquenilo, alquinilo, arilo, alquilarilo, alquilheteroarilo, heteroarilo, (CH2CH20)n, o (CH2CH(CH3) -0)nH y n es de 1 a 10; (iv) uno o más monosacáridos acilados, disacáridos acilados o polisacáridos acilados; y (v) cualquier combinación de (i) a (iv) ; y c) una fuente de peroxígeno; y d) por lo menos un tensioactivo .

22. Un producto para el cuidado personal caracterizado porque comprende un polipéptido que tiene actividad perhidrolítica; el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos que se expone en la sec. con núm. de ident . : 4, siempre que el residuo de aminoácidos unido al lado C-terminal de la histidina catalítica no es ácido glutámico .

23. El producto para el cuidado personal de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el producto es un champú, una crema para el cuerpo, un gel de ducha, un humectante tópico, una crema dental, un gel dental, un enjuague bucal, un lavado bucal, un enjuague antisarro o un producto de limpieza tópico.