CN102239264B - 含羧酸酯制剂中过水解酶的稳定 - Google Patents

Abstract

本文公开了一种用于稳定含羧酸酯制剂中CE-7酯酶的过水解活性的方法，该方法采用的方式是将基本上不溶的缓冲剂加入CE-7酯酶和羧酸酯的混合物中。此外，本发明还提供了包含通过本文所述方法产生的过酸的消毒制剂和衣物洗涤护理制剂。

Description

含羧酸酯制剂中过水解酶的稳定

相关申请的交叉引用

本专利申请要求均于2008年10月3日提交的美国临时申请61/102,505、61/102,512、61/102,514、61/102,520、61/102,531和61/102,539的优先权，它们都以引用方式全文并入本文。

发明领域

本发明涉及酶法过酸合成以及原位酶催化领域。针对以下用途，能以足够有效的浓度制备至少一种过氧羧酸：表面消毒或卫生处理、医疗器械灭菌、食品加工设备灭菌，以及适用于纺织物和衣物洗涤护理应用如漂白、脱色、除臭、消毒或卫生处理。

发明背景

过酸组合物已报道是有效的抗微生物剂。已经描述了清洁、灭菌、和/或消毒硬质表面、肉产品、活植物组织、和医疗设备以杜绝有害微生物生长的方法(例如美国专利6,545,047、美国专利6,183,807、美国专利6,518,307、美国专利5,683,724和美国专利申请公布2003/0026846)。也已报道过酸在制备用于衣物洗涤剂应用的漂白组合物中是有用的(美国专利3,974,082、美国专利5,296,161和美国专利5,364,554)。

过酸可以通过羧酸和过氧化氢的化学反应进行制备(参见Organic  Peroxides，Daniel Swern，编辑，第1卷，第313-516页；WileyInterscience，New York，1971)。此反应通常由强无机酸如浓硫酸催化。过氧化氢与羧酸的反应是平衡反应，并且过酸的产生通过使用过量浓度的过氧化物和/或羧酸，或通过去除水而得到促进。

一些过酸类消毒剂或漂白剂由过酸、过氧化氢和相应羧酸的平衡混合物构成。这些商业过酸清洁系统的一个缺点是随时间推移，过酸在溶液中往往不稳定。解决稳定性问题的一种方法是：在使用前将多种反应组分混合在一起以生成过酸，而这些组分单独放置时可长期稳定。优选地，各种反应组分容易贮存、操作相对安全，并在混合后能够快速地产生有效浓度的过酸。

最近报道CE-7糖酯酶家族具有过水解酶活性。已证实，这些“过氧水解”酶与过氧源组合时，对于从多种羧酸酯底物制备过酸尤其有效(参见授予DiCosimo等人的WO2007/070609和美国专利申请公布2008/0176299以及2008/176783，；所述专利各自以引用方式全文并入本文)。已证实，糖酯酶CE-7家族的一些成员具有足够的过水解活性，一旦将反应组分混合后，能在1分钟内由一元醇、二醇和甘油的乙酰酯生成4000至5000ppm的过乙酸，并在5分钟至30分钟内生成高达9000ppm的过乙酸(DiCosimo等人，美国专利申请公布2009/0005590)。

在授予DiCosimo等人的U.S.2009/0005590中描述的酶法过酸生成系统通常基于多个反应组分的使用，这些反应组分保持分开直至需要过酸溶液。使用该方法解决了与很多过酸类消毒剂和漂白剂贮存相关的过酸不稳定性问题。然而，当使用包含CE-7糖酯酶的多组分制剂时，可提供过水解活性长期稳定性的特定制剂仍有待解决。当贮存在log P值(例如，物质在辛醇和水之间分配系数的对数，其中P等于[溶质]_辛醇/[溶质]_水)小于2的有机液体或溶剂中时，尤为关注具有过水解活性的CE-7酶的长期贮存稳定性。DiCosimo等人以前描述的若干种有机酯底物的log P值小于2。

无论是将酶直接悬浮在有机液体或溶剂中，还是使用可混溶的有机/水单相液体或溶剂时，有机液体或溶剂都会降低酶的活性。在两篇已发表的文献中综述了有机溶剂对酶活性和结构的影响，它们是：(a)C.Laane等人，Biotechnol.Bioeng.30：81-87(1987)；(b)Cowan，D.A.和Plant，A.，“Biocatalysis in Organic Phase Systems.”，“Biocatalysisat Extreme Temperatures”第7章，Kelly，R.W.W.和Adams，M.编辑，Amer.Chem.Soc.Symposium Series，Oxford University Press，NewYork，NY，第86-107页(1992)。上文Cowan和Plant指出(第87页)：行业内一般认为，在有机相体系中使用log P≤2的有机溶剂来稳定胞内酶几乎没有意义。log P介于2和4之间的有机溶剂可根据酶的稳定性视情况使用，而那些log P＞4的有机溶剂一般可用于有机相体系。

上文的Cowan和Plant还指出(第91页)：溶于单相有机-水溶剂中的酶的直接暴露影响取决于溶剂浓度、溶剂/酶表面基团相互作用、以及溶剂/酶水化层相互作用。因为溶剂的log P值必须足够低，使得溶剂可完全与水相混溶以形成单相，因此，含有低log P值有机溶剂的单相有机-水溶剂通常会对酶的稳定性产生负面影响(在低有机溶剂浓度应用中除外)。据报道甘油三乙酸酯的log P值为0.25(Y.M.Gunning等人，J.Agric.Food Chem.48：395-399(2000))，其类似于乙醇(log P-0.26)和异丙醇(log P 0.15)(Cowan和Plant)；因此在甘油三乙酸酯中贮存酶粉预计会导致不可接受的酶活性丧失，使用log P＜2的附加共溶剂也会一样，这些共溶剂如环己酮，log P＝0.94(Cowan和Plant)；1，2-丙二醇，log P＝-1.41(Gunning等人)；1，3-丙二醇，log P＝-1.3(S-J.Kuo等人，J.Am.Oil Chem.Soc.73：1427-1433(1996))；二乙二醇丁醚，log P＝0.56(N.Funasaki等人，J.Phys.Chem.88：5786-5790(1984))；三甘醇，log P＝-1.75(L.Braeken等人，ChemPhysChem 6：1606-1612(2005))。

因此，待解决的问题是，使用过酸生成酶在用于过酸生产的有机酯底物中的混合物制成一种产品，其中所述酶即使贮存在含有羧酸酯底物的混合物中，仍保持显著的过水解酶活性。

发明概述

所述问题已通过一种方法的发明解决，所述方法用于稳定至少一种结构上归类为CE-7酶并且当在含羧酸酯的制剂中时具有过水解活性的酶的过水解活性。更具体地讲，在包含羧酸酯和包含CE-7酶的酶粉的制剂中加入至少一种缓冲剂以及至少一种赋形剂可提高贮存在该制剂中的CE-7酶的过水解活性的稳定性。

在一个方面，提供了一种当酶存在于包含所述酶和羧酸酯的制剂中时稳定酶的过水解活性的方法，所述方法包括：

(a)提供一种含水制剂，所述含水制剂包含至少一种结构上归类为CE-7酶并具有过水解活性的酶、至少一种赋形剂，并任选地包含至少一种表面活性剂；

(b)喷雾干燥(a)中的含水制剂以制备酶粉，所述酶粉包含所述至少一种酶、所述至少一种寡糖赋形剂，并任选地包含所述至少一种表面活性剂；并且

(c)将(b)中的酶粉与至少一种缓冲剂和一种羧酸酯混合形成制剂，其中加入制剂的至少一种缓冲剂可提高所述至少一种酶在贮存在所述制剂中时的过水解活性稳定性。

在另一方面，提供了一种在多组分过酸生成系统中用作第一组分的制剂，所述制剂包含以下物质的混合物：

(a)至少一种羧酸酯，所述羧酸酯选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、以及它们的混合物；

(b)酶粉，所述酶粉包含至少一种结构上归类为CE-7酶并具有过水解活性的酶、至少一种赋形剂，并任选地包含至少一种表面活性剂组成的喷雾干燥制剂；以及

(c)至少一种缓冲剂；其中所述至少一种缓冲剂提高了所述至少一种酶在存在于所述制剂中时的稳定性。

在又一个方面，提供了包含第一组分和第二组分的消毒系统，所述第一组分包含上述制剂而所述第二组分包含过氧源水溶液并任选地包含过氧化氢稳定剂。

在另一个方面，提供了酶促制备过氧羧酸的方法，所述方法包括：

(a)提供一组反应组分，所述组分包含：

(1)上述制剂；和

(2)过氧源水溶液；以及

(b)混合所述反应组分，从而制备过氧羧酸。

在另一个方面，提供了使用酶促产生的过氧羧酸组合物对硬质表面或无生命物体进行消毒或卫生处理的方法，所述方法包括：

(a)提供一组反应组分，所述组分包含：

(1)上述制剂；和

(2)过氧源水溶液；

(b)混合所述反应组分，从而制备过氧羧酸产物；

(c)任选地稀释所述过氧羧酸产物；以及

(d)使所述硬质表面或无生命物体与在步骤(b)或步骤(c)中产生的过氧羧酸接触，从而将所述表面或所述无生命物体消毒。

另一个方面是使用酶促产生的过氧羧酸组合物对衣物或纺织物进行漂白、脱色、除味、卫生处理或消毒的方法，所述方法包括：

(a)提供一组反应组分，所述组分包含：

(1)制剂，所述制剂包含：

(i)上述制剂；和

(ii)羧酸酯；以及

(2)过氧源；

(b)在合适的含水反应条件下混合所述反应组分，从而形成过氧羧酸产物；

(c)任选地稀释所述过氧羧酸产物；以及

(d)使所述衣物或纺织物与在步骤(b)或步骤(c)中产生的过氧羧酸接触；

其中所述衣物或纺织物经过清洗、脱色、除臭、卫生处理、消毒、或它们的组合。

生物序列简述

下面的序列遵循37 C.F.R.§§1.821-1.825(“Requirements forPatent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules”)，并且符合世界知识产权组织(World Intellectual Property Organization，WIPO)标准ST.25(1998)、欧洲专利公约(European Patent Convention，EPC)序列表要求、专利合作条约(Patent Cooperation Treaty，PCT)细则5.2和49.5(a-bis)、以及行政指令(Administrative Instructions)第208节和附录C。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37 C.F.R.§1.822中所列出的规定。

SEQ ID NO：1是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC

31954^TM先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：2是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)ATCC

6633^TM先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)ATCC

14580^TM先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：4是短小芽孢杆菌(B.pumilus)PS213乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：5是热纤梭菌(Clostridium thermocellum)ATCC

27405^TM乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：6是那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：7是海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：8是热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium sp.)JW/SLYS485乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：9是芽孢杆菌属(Bacillus sp.)NRRL B-14911先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。应当指出的是，在GENBANK

登录号ZP_01168674中报告的编码芽孢杆菌属NRRL B-14911先锋霉素C脱乙酰酶的核酸序列似乎会编码在N端增加的15个氨基酸，根据与其他先锋霉素C脱乙酰酶的序列比对，以及根据报告长度(340个氨基酸)与其他CAH酶的观测长度(通常为318至325个氨基酸；参见代理人档案号为CL4205 US NA、题目为“ENZYMATIC PERACIDPRODUCTION USING A COSOLVENT”的共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请；其以引用方式并入本文)的比较，此核酸序列可能不正确。因此，本文报道的芽孢杆菌属。NRRL B-14911先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列与GENBANK

登录号ZP_01168674下报道的不同，其不含N-端的15个氨基酸。

SEQ ID NO：10是耐盐嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)C-125先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：11是克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：12是枯草芽孢杆菌ATCC29233^TM先锋霉素C脱乙酰酶(CAH)的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：13是Thermoanearobacterium saccharolyticum先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：14是Thermotoga lettingae乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：15是Thermotoga petrophila乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：16是栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2第一种乙酰木聚糖酯酶(本文称为“RQ2(a)”)的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：17是栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2第二种乙酰木聚糖酯酶(本文称为“RQ2(b)”)的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：18是含SEQ ID NO：1的118至299位氨基酸残基区域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：19是那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，其为共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请代理人档案号CL4392 US NA(以引用方式全文并入本文)中所述序列的变体，其中在第277位的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：20是海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，其为共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请代理人档案号CL4392 US NA中所述序列的变体，其中在第277位的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：21是Thermotoga lettingae乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，其为共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请代理人档案号CL4392 US NA中所述序列的变体，其中在第277位的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：22是Thermotoga petrophila乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，其为共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请代理人档案号CL4392 US NA中所述序列的变体，其中在第277位的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：23是栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，其为衍生自共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请代理人档案号CL4392 US NA中“RQ2(a)”的变体，其中在第277位的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：24是栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，其为衍生自共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请代理人档案号CL4392 US NA中“RQ2(b)”的变体，其中在第278位的Xaa残基是Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：25是热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium sp.)JW/SL YS485乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：26是卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)的卡那霉素抗性基因(kan)的编码区。

SEQ ID NO：27是含卡那霉素抗性基因的质粒pKD13。

SEQ ID NO：28是用于从质粒pKD13克隆katG的正向引物。

SEQ ID NO：29是用于从质粒pKD13克隆katG的反向引物。

SEQ ID NO：30是使用SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29的引物从质粒pKD13扩增katG得到的PCR产物。

SEQ ID NO：31是过氧化氢酶-过氧化物酶基因(katG)的编码区。

SEQ ID NO：32是katG的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：33是含有λ-Red重组酶基因的质粒pKD46。

SEQ ID NO：34是用于确认katG中断的正向引物。

SEQ ID NO：35是用于确认katG中断的反向引物。

SEQ ID NO：36是含有FLP重组酶的温敏质粒pCP20。

SEQ ID NO：37是用于从质粒pKD13克隆katE的正向引物。

SEQ ID NO：38是用于从质粒pKD13克隆katE的反向引物。

SEQ ID NO：39是使用SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的引物从质粒pKD13扩增katE得到的PCR产物。

SEQ ID NO：40是过氧化氢酶HPII基因(katE)的编码区。

SEQ ID NO：41是katE的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：42是用于确认katE中断的正向引物。

SEQ ID NO：43是用于确认katE中断的反向引物。

SEQ ID NO：44是编码那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶的基因的编码区，如在GENBANK

(登录号AE000512)中报告。

SEQ ID NO：45是用于扩增那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶基因的正向引物。

SEQ ID NO：46是用于扩增那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶基因的反向引物。

SEQ ID NO：47是使用SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46的引物扩增乙酰木聚糖酯酶得到的PCR产物。

SEQ ID NO：48是编码海栖热袍菌MSB8乙酰木聚糖酯酶的基因，如在GENBANK

(登录号NP_227893.1)中报告。

SEQ ID NO：49是用于扩增海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶基因的正向引物。

SEQ ID NO：50是用于扩增海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶基因的反向引物。

SEQ ID NO：51是使用SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50的引物扩增乙酰木聚糖酯酶得到的PCR产物。

发明详述

本文公开了一种用于稳定含羧酸酯制剂中CE-7酯酶的过水解酶活性的方法，该方法采用的方式是将基本上不溶的缓冲剂加入CE-7酯酶和羧酸酯的制剂中。此外，本发明还提供了包含通过本文所述方法产生的过酸的消毒制剂。

在本公开中，使用了大量的术语和缩写。除非另外特别说明，将采用下述定义。

如本文所用，在本发明的元件或组分之前的词语“一个”、“一种”旨在表明元件或组分的实例(即出现的事物)数量为非限制性的。因此，应将“一个”和“一种”理解为包括一个(种)或至少一个(种)，并且元件或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。

如本文所用，术语“包含”意指如权利要求中提及的所述特征、整数、步骤、或组分的存在，但它不预先排除一种或多种其他特征、整数、步骤、组分或其组的存在或添加。术语“包含”旨在包括由术语“基本上由...组成”和“由...组成”涵盖的实施方案。类似地，术语“基本上由...组成”旨在包括由术语“由...组成”涵盖的实施方案。

如本文所用，修饰成分或反应物的量使用的术语“约”是指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于制备浓缩物或使用溶液的一般测量和液体处理操作；这些操作中非故意的误差；用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等等。术语“约”还包括因特定起始混合物所产生的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求都包括量的等同量。

当存在时，所有的范围都包括端值以及其中的组合。例如，当列出范围“1至5”时，所列范围应视为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2&4至5”、“1至3&5”等等。

如本文所用，术语“底物”、“合适的底物”、以及“羧酸酯底物”可互换地专指：

(a)具有以下结构的一种或多种酯

[X]_mR₅

其中

X为式R₆C(O)O的酯基；

R₆为任选地由羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链、支链或环状烃基部分，其中R₆任选地包含一个或多个醚键，其中R₆为C2至C7；

R₅为任选地由羟基取代的C1至C6直链、支链、或环状烃基部分，其中R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基，并且其中R₅任选地包含一个或多个醚键；

m为1至R₅中的碳原子数，

在25℃下，所述一种或多种酯在水中具有至少5ppm的溶解度；或者

(b)具有以下结构的一种或多种甘油酯

其中R₁为任选地由羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链或支链烷基，并且R₃和R₄分别为H或R₁C(O)；或者

(c)具有下式的一种或多种酯

其中R₁为任选地由羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链或支链烷基，并且R₂为C1至C10直链或支链烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH₂CH₂O)_n、或(CH₂CH(CH₃)-O)_nH，且n为1至10；或者

(d)一种或多种乙酰化单糖、乙酰化二糖、或乙酰化多糖；或者

(e)(a)至(d)的任意组合。

所述羧酸酯底物的实例可包括甘油一乙酸酯，甘油三乙酸酯，甘油一丙酸酯，甘油二丙酸酯，甘油三丙酸酯，甘油一丁酸酯，甘油二丁酸酯，甘油三丁酸酯，葡萄糖五乙酸酯，木糖四乙酸酯，乙酰化木聚糖，乙酰化木聚糖片段，β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯，三-O-乙酰基-D-半乳醛，三-O-乙酰基-葡萄烯糖，丙二醇二乙酸酯，乙二醇二乙酸酯，1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6-己二醇的单酯或二酯，或它们的任何组合。

如本文所用，术语“过酸”与过氧酸(peroxyacid)、过氧羧酸(peroxycarboxylic acid)、过氧酸(peroxy acid)、过羧酸(percarboxylicacid)和过氧性酸(peroxoic acid)同义。

如本文所用，术语“过乙酸”缩写为“PAA”，并与过氧乙酸、乙过氧酸(ethaneperoxoic acid)以及CAS登记号79-21-0的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油一乙酸酯”与甘油单乙酸酯、甘油一醋酸酯和甘油单醋酸酯同义。

如本文所用，术语“甘油二乙酸酯”与二乙酸甘油酯、甘油二醋酸酯、二醋酸甘油酯以及CAS登记号25395-31-7的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油三乙酸酯”与三乙酸甘油酯、三醋酸甘油酯、甘油三醋酸酯、1，2，3-三乙酰氧基丙烷、1，2，3-丙三醇三乙酸酯以及CAS登记号102-76-1的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油一丁酸酯”与一丁酸甘油酯、甘油单丁酸酯和一丁酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油二丁酸酯”与二丁酸甘油酯和二丁酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油三丁酸酯”与三丁酸甘油酯、1，2，3-三丁酰基甘油以及CAS登记号60-01-5的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油一丙酸酯”与一丙酸甘油酯、甘油单丙酸酯和一丙酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油二丙酸酯”与二丙酸甘油酯和二丙酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油三丙酸酯”与三丙酸甘油基酯、三丙酸甘油酯、1，2，3-三丙酰基甘油以及CAS登记号139-45-7的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“乙酸乙酯”与醋酸乙酯、乙酰氧基乙烷、乙酸乙基酯、醋酸乙基酯、乙基乙酸酯以及CAS登记号141-78-6的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“乳酸乙酯”与乳酸乙基酯以及CAS登记号97-64-3的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“乙酰化糖”和“乙酰化多糖”是指包含至少一个乙酰基的单糖、二糖和多糖。实例包括但不限于葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙酰化木聚糖、乙酰化木聚糖片段、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛和三-O-乙酰基-葡萄烯糖。

如本文所用，术语“烃基”、“烃基基团”和“烃基部分”意指直链、支链或环状排列的碳原子，其中碳原子通过碳-碳单键、双键、或三键和/或醚键连接并且氢原子被相应取代。此类烃基基团可以是脂族的和/或芳族的。烃基基团的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、戊基、环戊基、甲基环戊基、己基、环己基、苄基和苯基。在一个优选的实施方案中，烃基部分为直链、支链或环状排列的碳原子，其中碳原子通过碳-碳单键和/或醚键连接且氢原子被相应取代。

如本文所用，术语1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6-己二醇、以及它们的混合物的“单酯”和“二酯”是指：所述化合物包含由式RC(O)O表示的至少一个酯基，其中R为C1至C7直链烃基部分。在一个实施方案中，羧酸酯底物选自：丙二醇二乙酸酯(PGDA)、乙二醇二乙酸酯(EDGA)、以及它们的混合物。

如本文所用，术语“丙二醇二乙酸酯”与1，2-二乙酰氧基丙烷、丙二醇二醋酸酯、1，2-丙二醇二乙酸酯以及CAS登记号623-84-7的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“乙二醇二乙酸酯”与1，2-二乙酰氧基乙烷、乙二醇二醋酸酯、二醋酸乙二酯以及CAS登记号111-55-7的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“合适的酶促反应混合物”、“适于原位生产过酸的组分”、“合适的反应组分”和“合适的含水反应混合物”是指其中反应物和酶催化剂发生接触的材料和水。本文提供了合适的含水反应混合物的组分，并且本领域技术人员应当理解适于本发明方法的组分变化范围。在一个实施方案中，合适的酶促反应混合物在反应组分组合后原位生产过酸。像这样，反应组分可以作为其中一种或多种反应组分保持分离直至使用的多组分系统提供。在另一个实施方案中，反应组分首先组合形成过酸水溶液，随后与待消毒和/或漂白的表面接触。用于使多种活性组分分开与混合的系统和装置的设计是本领域已知的，并且一般将取决于各反应组分的物理形式。例如，多活性流体(液-液)系统通常使用多室分配瓶或两相系统(例如，美国专利申请公布2005/0139608、美国专利5,398,846、美国专利5,624,634、美国专利6,391,840、欧洲专利0807156B1、美国专利申请公布2005/0008526以及PCT公布WO 00/61713)，例如存在于某些漂白应用中的系统，其中所需的漂白剂在将反应流体混合后制成。用于生成过酸的其他形式的多组分系统可以包括但不限于，设计用于一种或多种固体组分或固体-液体组分组合的那些，例如粉剂(例如美国专利5,116,575)、多层片(例如美国专利6,210,639)、具有多个隔室的水溶性包(例如美国专利6,995,125)和在水添加后反应的固体凝聚物(例如美国专利6,319,888)。在一个实施方案中，以两个单独组分提供了一种多组分制剂，从而组合两个组分后生成包含过氧羧酸的水溶液。在另一个实施方案中，提供了一种多组分制剂，所述多组分制剂包含：

a)第一组分，所述第一组分包含：

i)如本文所公开的酶粉；和

ii)羧酸酯，所述第一组分任选包含选自下列的附加成分：无机或有机缓冲剂、腐蚀抑制剂、润湿剂、以及它们的组合；并且

b)第二组分包含过氧源和水，所述第二组分任选包含过氧化氢稳定剂。

在另一个实施方案中，第一组分中的羧酸酯选自：甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它们的组合。在另一个实施方案中，第一组分中的羧酸酯为乙酰化多糖。在另一个实施方案中，第一组分中的酶催化剂为微粒固体。在另一个实施方案中，第一反应组分为固体片或粉末。

如本文所用，术语“过水解(perhydrolysis)”定义为所选底物与过氧化物的形成过酸的反应。一般地，无机过氧化物与所选底物在催化剂存在下反应以生成过酸。如本文所用，术语“化学过氧化水解”包括其中底物(过酸前体)与过氧化氢源组合的过水解反应，其中过酸在不存在酶催化剂的情况下形成。

如本文所用，术语“过水解酶活性”是指每单位质量(例如毫克)的蛋白、细胞干重或固定化催化剂重量所具有的催化剂活性。

如本文所用，“一个酶活性单位”或“一个活性单位”或“U”定义为，在指定温度每分钟产生1μmol过酸产物所需的过水解酶活性的量。

如本文所用，术语“酶催化剂”和“过水解酶催化剂”是指包含具有过水解活性的酶的催化剂，并且其形式可以是完整的微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞组分、部分纯化的酶、或纯化的酶。酶催化剂也可被化学改性(如通过聚乙二醇化作用，或与交联试剂反应)。还可以使用本领域技术人员熟知的方法将过水解酶催化剂固定到可溶性或不溶性载体上；参见例如：Immobilization of Enzymes and Cells，Gordon F.Bickerstaff编辑；Humana Press，Totowa，NJ，USA，1997。如本文所述，具有过水解活性的本发明的所有酶在结构上都是酶的糖酯酶家族7(CE-7家族)的成员(参见Coutinho，P.M.、Henrissat，B.，“Carbohydrate-active enzymes：an integrated database approach”，见于“Recent Advances inCarbohydrate Bioengineering”，H.J.Gilbert、G.Davies、B.Henrissat和B.Svensson编辑，The Royal Society of Chemistry，Cambridge，第3-12页，1999)。已证实，CE-7家族的酶与过氧源组合时，对于从多种羧酸酯底物制备过酸尤其有效(参见授予DiCosimo等人的PCT公布WO2007/070609和美国专利申请公布2008/0176299、2008/176783以及2009/0005590；所述专利各自以引用方式全文并入本文)。

CE-7家族的成员包括先锋霉素C脱乙酰酶(CAH，E.C.3.1.1.41)和乙酰木聚糖酯酶(AXE，E.C.3.1.1.72)。CE-7酯酶家族的成员共有一种保守的特征基序(Vincent等人，J.Mol.Biol.，330：593-606(2003))。具有CE-7特征基序和/或基本上类似结构的过水解酶都适用于本发明。用于鉴定基本上类似的生物分子的方法在本领域为人们所熟知(如序列比对方案、核酸杂交和/或保守特征基序的存在)。在一个方面，本发明的过水解酶包括含有CE-7特征基序并与本文提供的序列具有以下氨基酸同一性的酶：至少30％、优选至少33％、更优选至少40％、甚至更优选至少42％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少70％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少90％、以及最优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％。在另一个方面，本发明的过水解酶包括含有CE-7特征基序并与SEQ ID NO：1具有以下氨基酸同一性的酶：至少30％、优选至少33％、更优选至少40％、甚至更优选至少42％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少70％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少90％，以及最优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

如本文所用，术语“酶粉”是指含水制剂的喷雾干燥产物，所述含水制剂包含(1)至少一种结构上归类为CE-7糖酯酶并具有过水解活性的酶，(2)至少一种寡糖赋形剂，以及任选至少一种表面活性剂。在一些实施方案中，所述至少一种寡糖赋形剂具有至少约1250的数均分子量和至少约9000的重均分子量。

如本文所用，术语“先锋霉素C脱乙酰酶”和“先锋霉素C乙酰基水解酶”是指催化先锋霉素类例如先锋霉素C和7-氨基头孢烷酸脱乙酰化的酶(E.C.3.1.1.41)(Mitsushima等人，(1995)Appl.Env.Microbiol.61(6)：2224-2229)。本文提供了具有明显的过水解活性的若干种先锋霉素C脱乙酰酶。

如本文所用，“乙酰木聚糖酯酶”是指催化乙酰化木聚糖和其他乙酰化多糖脱乙酰化的酶(E.C.3.1.1.72，AXE)。如本文所述，提供了具有明显过水解活性的归类为乙酰木聚糖酯酶的若干种酶。

如本文所用，术语“枯草芽孢杆菌ATCC

31954^TM”是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC

)的一种细菌细胞，其国际保藏登录号为ATCC

31954^TM。据报道，枯草芽孢杆菌ATCC31954^TM具有酯水解酶(“diacetinase”)活性，能够水解具有2至8个碳酰基的甘油酯，特别是甘油二乙酸酯(美国专利4,444,886，其全文以引用方式并入本文)。如本文所述，已从枯草芽孢杆菌ATCC

31954^TM分离出了具有显著过水解酶活性的酶，称为SEQ ID NO：1。分离酶的氨基酸序列具有与GENBANK

登录号BAA01729.1提供的先锋霉素C脱乙酰酶100％的氨基酸同一性。(Mitsushima等人，上文)。

如本文所用，术语“枯草芽孢杆菌ATCC29233^TM”是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC

)的枯草芽孢杆菌菌株，其国际保藏登录号为ATCC

29233^TM。如本文所述，已从枯草芽孢杆菌ATCC

29233^TM中分离出了具有明显过水解酶活性的酶且进行了测序，并以SEQ ID NO：12提供。

如本文所用，术语“热纤梭菌ATCC

27405^TM”是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC

)的热纤梭菌菌株，其国际保藏登录号为ATCC

27405^TM。来自热纤梭菌ATCC27405^TM并具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：5提供。

如本文所用，术语“枯草芽孢杆菌ATCC6633^TM”是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC

)的一种细菌细胞，其国际保藏登录号为ATCC

6633^TM。据报道，枯草芽孢杆菌ATCC

6633^TM具有先锋霉素乙酰水解酶活性(美国专利6,465,233)。来自枯草芽孢杆菌ATCC

6633^TM并具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：2提供。

如本文所用，术语“地衣芽孢杆菌ATCC

14580^TM”是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC

)的一种细菌细胞，其国际保藏登录号为ATCC

14580^TM。据报道，地衣芽孢杆菌ATCC

14580^TM具有先锋霉素乙酰水解酶活性。来自枯草芽孢杆菌ATCC

14580^TM并具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：3提供。

如本文所用，术语“短小芽孢杆菌PS213”是指，据报道称其具有乙酰木聚糖酯酶活性的一种细菌细胞(GENBANK

AJ249957)。来自短小芽孢杆菌PS213并具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列以SEQID NO：4提供。

如本文所用，术语“那不勒斯栖热袍菌”是指，据报道称其具有乙酰木聚糖酯酶活性的那不勒斯栖热袍菌菌株(GENBANKAAB70869)。来自那不勒斯栖热袍菌并具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：6提供。

如本文所用，术语“海栖热袍菌MSB8”是指，据报道称其具有乙酰木聚糖酯酶活性的一种细菌细胞(GENBANK

NP_227893.1)。来自海栖热袍菌MSB8并具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列以SEQID NO：7提供。

如本文所用，术语“克劳氏芽孢杆菌KSM-K16”是指，据报道称其具有先锋霉素C脱乙酰酶活性的一种细菌细胞(GENBANKYP_175265)。来自克劳氏芽孢杆菌KSM-K16并具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：11提供。

如本文所用，术语“Thermoanearobacterium saccharolyticum”是指，据报道称其具有乙酰木聚糖酯酶活性的一种细菌菌株(GENBANK

S41858)。来自Thermoanearobacterium saccharolyticum并具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：13提供。

如本文所用，术语“Thermotoga lettingae”是指，据报道称其具有乙酰木聚糖酯酶活性的一种细菌细胞(GENBANKCP000812)。来自Thermotoga lettingae并具有过水解酶活性的酶的推导氨基酸序列以SEQ ID NO：14提供。

如本文所用，术语“Thermotoga petrophila”是指，据报道称其具有乙酰木聚糖酯酶活性的一种细菌细胞(GENBANK

CP000702)。来自Thermotoga lettingae并具有过水解酶活性的酶的推导氨基酸序列以SEQ ID NO：15提供。

如本文所用，术语“栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2”是指，据报道称其具有乙酰木聚糖酯酶活性的一种细菌细胞(GENBANK

CP000969)。已从栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2中鉴定出两种不同的乙酰木聚糖酯酶，本文称之为“RQ2(a)”(推导氨基酸序列以SEQID NO：16提供)和“RQ2(b)”(推导氨基酸序列以SEQ ID NO：17提供)。

如本文所用，“分离的核酸分子”和“分离的核酸片段”将可互换使用，并且指为单链或双链的，任选含有合成的、非天然的或改变了的核苷酸碱基的RNA或DNA聚合物。DNA聚合物形式的分离型核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。

术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单元。在本文中使用下列缩写来表示具体的氨基酸：

如本文所用，“基本上类似”是指下述核酸分子，其中一个或多个核苷酸碱基的改变导致一个或多个氨基酸的增加、置换、或缺失，但不影响DNA序列编码蛋白的功能性质(即过水解活性)。如本文所用，“基本上类似”也指下述酶，其具有的氨基酸序列至少30％、优选地至少33％、更优选地至少40％、更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、甚至更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％，甚至还更优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与本文报道的序列一致，其中所得的酶保留了本发明的功能性质(即过水解活性)。“基本上类似”还可以指核酸分子编码的具有过水解活性的酶，所述核酸分子能在严格条件下与本文报道的核酸分子杂交。因此，应当理解，本发明不仅仅涵盖特定的示例性序列。

例如，在本领域中熟知的是，导致在给定位点产生化学等价的氨基酸但不影响编码蛋白的功能性质的基因改变是常见的。出于本发明的目的，将置换定义为以下五组之一中的互换：

1.小的脂族非极性残基或微极性残基：Ala、Ser、Thr(Pro，Gly)；

2.极性、带负电的残基和它们的酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；

3.极性、带正电的残基：His、Arg、Lys；

4.大的脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；并且

5.大的芳族残基：Phe、Tyr和Trp。

因此，氨基酸中丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸、或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电的残基置换为另一个带负电的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电的残基替换为另一个带正电的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变预计也可以产生功能上等价的产物。在许多情况下，导致蛋白分子的N-端和C-端部分改变的核苷酸变化也预计不会改变蛋白的活性。

所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定编码产物生物活性的保留情况。此外，技术人员将认识到本发明涵盖了基本上类似的序列。在一个实施方案中，将基本上类似的序列定义为它们在严格条件下(0.1X SSC、0.1％SDS、65℃处理，再用2X SSC、0.1％SDS洗涤，最后用0.1X SSC、0.1％SDS、65℃处理)能够与本文的示例性序列杂交。

如本文所用，一个核酸分子可与另一个核酸分子(例如cDNA、基因组DNA、或RNA)杂交是指在适当的温度和溶液离子强度条件下，第一分子的单链可与其他分子退火。杂交和洗涤条件为人们所熟知，并示例于Sambrook，J.和Russell，D.，T.，“Molecular Cloning：ALaboratory Manual”，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(2001)。温度和离子强度条件决定了杂交的“严格度”。可调整严格条件来筛选中度类似的分子，例如来自远缘生物的同源序列；与高度类似的分子，例如来自近缘生物的复制功能酶的基因。杂交后洗涤通常决定了严格条件。一组优选的条件采用一系列如下洗涤：开始采用6X SSC、0.5％SDS在室温下持续洗涤15分钟，然后再使用2X SSC、0.5％SDS在45℃下洗涤30分钟，最后使用0.2XSSC、0.5％SDS在50℃下重复洗涤30分钟两次。更优选的一组条件采用更高的温度，其中洗涤与上述洗涤相同，不同的是最后两次在0.2X SSC、0.5％SDS中洗涤30分钟时的温度被增加到60℃。另一组优选的严格杂交条件为：用0.1X SSC、0.1％SDS在65℃下处理，然后用2X SSC、0.1％SDS洗涤，最后用0.1X SSC、0.1％SDS在65℃下洗涤本文的示例性序列。在另一个实施方案中，本发明的组合物和方法使用由分离的核酸分子编码的具有过水解活性的酶，所述分离的核酸分子在严格条件下杂交到编码具有过水解活性的多肽的核酸分子，所述多肽具有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24以及SEQ ID NO：25。

杂交需要两种核酸含有互补序列，但是取决于杂交的严格度，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格度取决于核酸的长度和互补的程度，它们是本领域内熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经导出了用于计算Tm的公式(Sambrook和Russell，同上)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更为重要，而且寡核苷酸的长度确定了其特异性(Sambrook和Russell，同上)。在一个方面，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸，更优选地为至少约20个核苷酸，甚至更优选地为至少30个核苷酸，甚至更优选地为至少300个核苷酸，最优选地为至少800个核苷酸。此外，技术人员将认识到，必要时可根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液的盐浓度。

如本文所用，术语“百分比同一性”是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。本领域中，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，根据具体情况，通过此类线性序列的匹配情况进行测定。“同一性”和“相似性”能够通过已知方法容易地计算，所述方法包括但不限于下述方法：Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)，Oxford University Press，NY(1988)；Biocomputing： Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.编辑)，Academic Press，NY(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)，Humana Press，NJ(1994)；Sequence Analysis  in Molecular Biology(von Heinje，G.编辑)，Academic Press(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)，Stockton Press，NY(1991)。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和百分比同一性计算可通过LASERGENE生物信息学计算套件中的Megalign程序(DNASTAR Inc.，Madison，WI)、Vector NTI v.7.0的AlignX程序(Informax，Inc.，Bethesda，MD)、或EMBOSS Open Software Suite(EMBL-EBI；Rice等人，Trendsin Genetics 16，(6)：276-277(2000))进行。序列多重比对可使用默认参数的Clustal比对方法进行(例如CLUSTALW；例如1.83版)(Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins等人，Nucleic Acids Res.22：4673-4680(1994)；以及Chenna等人，Nucleic Acids Res 31(13)：3497-500(2003)，可通过European Bioinformatics Institute得自European Molecular Biology Laboratory)。CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括空位存在罚分(GAP Existence penalty)＝15、空位延伸＝0.2、矩阵＝Gonnet(如Gonnet250)、蛋白ENDGA＝-1、蛋白GAPDIST＝4和KTUPLE＝1。在一个实施方案中，以默认设置使用快速或慢速比对，其中慢速比对是优选的。作为另外一种选择，也可将使用CLUSTALW方法的参数(1.83版)修改成KTUPLE＝1，空位罚分＝10，空位延伸＝1，矩阵＝BLOSUM(例如BLOSUM64)，窗口＝5，TOP DIAGONALSSAVED＝5。

在一个方面，合适的分离型核酸分子编码下述多肽，其氨基酸序列具有至少约30％、优选至少33％、优选至少40％、优选至少50％、优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、甚至更优选至少85％，甚至更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与本文报道的氨基酸序列的同一性。合适的核酸分子不仅具有上述同源性，而且还通常编码具有约300至约340个氨基酸、更优选约310至约330个氨基酸、并且最优选约318个氨基酸的多肽。

如本文所用，术语“特征基序”、“CE-7特征基序”和“标签基序”是指具有定义活性的酶家族共有的保守结构。特征基序可用于定义和/或鉴定对限定的底物家族具有类似酶活性的、在结构上相关的酶家族。特征基序可以是单个邻接的氨基酸序列，或者可以是一起形成所述特征基序的非邻接保守基序的集合。通常，保守基序以氨基酸序列表示。如本文所述，具有过水解活性的本发明的酶(“过水解酶”)属于CE-7糖酯酶家族(DiCosimo等人，上文)。如本文所用，短语“酶在结构上归类为CE-7酶”或“CE-7过水解酶”将用于指代具有过水解活性并在结构上归类为CE-7糖酯酶的酶。该酶家族可通过特征基序的存在而定义(Vincent等人，上文)。如本文定义，CE-7酯酶的特征基序包含三个保守基序(相对于参考序列SEQ ID NO：1的残基位置编号)：

a)Arg118-Gly119-Gln120；

b)Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183；以及

c)His298-Glu299。

通常，第180氨基酸残基位置的Xaa为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、或苏氨酸。属于催化三联体的三个氨基酸残基中的其中两个以粗体表示。在一个实施方案中，第180氨基酸残基位置的Xaa选自：甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和苏氨酸。

对CE-7糖酯酶家族中保守基序的进一步分析表明存在额外的保守基序(在SEQ ID NO：1第267至269氨基酸位置的LXD)，该保守基序可用于进一步定义属于CE-7糖酯酶家族的过水解酶。在另一个实施方案中，上面定义的特征基序包含第四个保守基序，其定义为：

Leu267-Xaa268-Asp269。

第268氨基酸残基位置的Xaa通常为异亮氨酸、缬氨酸、或甲硫氨酸。第四个基序包含属于催化三联体(Ser181-Asp269-His298)的天冬氨酸残基(粗体)。

许多熟知的全局比对算法可用于比对两个或更多个代表具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列，以确定酶是否包含本发明的特征基序。将比对的序列与参考序列(SEQ ID NO：1)进行比较，以确定特征基序的存在。在一个实施方案中，将利用参考氨基酸序列(如本文所用的得自枯草芽孢杆菌ATCC31954^TM的过水解酶序列(SEQ ID NO：1))的CLUSTAL比对(例如CLUSTALW)用于鉴定属于CE-7酯酶家族的过水解酶。保守氨基酸残基的相对编号基于参考氨基酸序列的残基编号，用以说明在比对序列中的小插入或缺失(例如，少于五个氨基酸)。

可用于鉴定包含本发明特征基序(当与参考序列进行比较时)的序列的其他合适算法的实例包括但不限于Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48，443-453(1970)；一种全局比对工具)和Smith-Waterman(J.Mol.Biol.147：195-197(1981)；一种局部比对工具)。在一个实施方案中，采用默认参数进行Smith-Waterman比对。合适的默认参数的实例包括使用BLOSUM62计分矩阵，其中空位开放罚分＝10和空位延伸罚分＝0.5。

在本文示例的过水解酶之间对整体百分比同一性的比较表明，与SEQ ID NO：1具有少至33％同一性的酶(但保留了特征基序)表现出显著的过水解酶活性，并且在结构上归类为CE-7糖酯酶。在一个实施方案中，合适的过水解酶包括含有CE-7特征基序并与SEQ ID NO：1具有以下氨基酸同一性的酶：至少30％、优选地至少33％、更优选地至少40％、甚至更优选地至少42％、甚至更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、甚至更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％，以及最优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

作为另外一种选择，所含的区域涵盖了保守基序的邻接氨基酸序列也可用于鉴定CE-7家族成员。

如本文所用，“密码子简并性”是指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。因此，本发明涉及编码全部或大部分氨基酸序列的任何核酸分子，其中所述氨基酸序列编码本发明的微生物多肽。技术人员将充分意识到：特定宿主细胞在使用核苷酸密码子以确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏好性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。

如本文所用，术语“密码子优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的基因或编码区时是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映宿主生物体典型的密码子使用情况。

如本文所用，“合成的基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸基本单位组装而成。将这些基本单位连接并退火以形成基因片段，然后进行酶法组装以构建整个基因。“化学合成”涉及DNA序列时是指将核苷酸组分在体外组装。可以采用完善建立的方法来完成DNA的人工化学合成，或者可使用许多可商购获得的机器的其中一种来完成自动化学合成。因此，基于核苷酸序列的优化以反映宿主细胞的密码子偏好性，可以定制基因用以优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员会理解成功的基因表达的可能性。优选密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中可获得序列信息)的检测。

如本文所用，“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，包括在编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列。“天然基因”是指与其自身调控序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”是指天然基因之外的任何基因，其包含非天然一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含得自不同来源的调控序列和编码序列，或者得自相同来源、但是排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源性基因”是指在生物体基因组中的天然位置的天然基因。“外来基因”是指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物内。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。

如本文所用，“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”是指位于编码序列上游(5′非编码序列)、中间、或下游(3′非编码序列)并影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。

如本文所用，“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整体源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至可包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。在大部分时间下都可导致基因表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。

如本文所用，“3′非编码序列”是指位于编码序列下游的DNA序列，并包括多腺苷酸化识别序列(通常限于真核细胞)以及编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其他序列。多腺苷酸化信号的特征通常在于影响多腺苷酸片(通常限于真核细胞)往mRNA前体3′端的添加。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指单个核酸分子上核酸序列的结合，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调节序列。

如本文所用，术语“表达”是指源于本发明的核酸分子的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。

如本文所用，“转化”是指将核酸分子转移至宿主生物的基因组内，导致基因稳定遗传。在本发明中，宿主细胞的基因组包括染色体和染色体外(例如质粒)基因。含有转化核酸分子的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物。

如本文所用，术语“质粒”、“载体”和“盒”是指通常携带有不属于细胞中央代谢一部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形式。此类元件可以是任何来源的自主复制的序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环状的单链或双链DNA或RNA，其中将许多核苷酸序列连接或重组成独特的构造，该构造能将选定基因产物的启动子片段和DNA序列与适当的3′未翻译序列一起引入细胞。“转化盒”是指包含外源基因并且除外源基因外还具有可促进特定宿主细胞转化的元件的特定载体。“表达盒”是指包含外源基因并且除外源基因外还具有可增强该基因在外源宿主中表达的元件的特定载体。

如本文所用，术语“序列分析软件”是指可用于核苷酸或氨基酸序列分析的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：GCG程序包(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)、和DNASTAR(DNASTAR，Inc.1228 S.ParkSt.Madison，WI 53715 USA)、CLUSTALW(例如1.83版；Thompson等人，Nucleic Acids Research，22(22)：4673-4680(1994))、包括Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.MethodsGenome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，会议日期1992年，111-20。编辑：Suhai、Sandor。出版社：Plenum，New York，NY)、Vector NTI(Informax，Bethesda，MD)和Sequencher v.4.05。在本专利申请的背景下，应当理解，将序列分析软件用于分析时，分析的结果将基于提及程序的“默认值”，除非另外指明。如本文所用，“默认值”将指在首次初始化时由软件制造商为软件最初加载的任何值或参数集。

如本文所用，术语“生物污染物”是指一种或多种不想要的和/或病原性的生物实体，包括但不限于微生物、孢子、病毒、朊病毒、以及它们的混合物。本发明的方法可制备有效浓度的至少一种过氧羧酸，可用于减少和/或消除活体生物污染物的存在。在一个优选的实施方案中，生物污染物为活体病原性微生物。

如本文所用，术语“消毒”是指破坏或防止生物污染物生长的方法。如本文所用，术语“消毒剂”是指通过破坏、中和、或抑制生物污染物的生长而消毒的试剂。通常，将消毒剂用于处理无生命的物体或表面。如本文所用，术语“消毒处理”是指消毒的行为或过程。如本文所用，术语“防腐剂”是指抑制带病微生物生长的化学试剂。在一个方面，生物污染物为病原性微生物。

如本文所用，术语“卫生的”意指或涉及通常通过除去、预防或控制可能对健康有害的药剂而恢复或维持健康。如本文所用，术语“对...作卫生处理”是指搞卫生。如本文所用，术语“卫生处理剂”是指卫生处理用试剂。如本文所用，术语“卫生处理”是指搞卫生的行为或过程。

如本文所用，术语“杀病毒剂”是指抑制或破坏病毒的药剂，并与“病毒杀灭剂”同义。将表现出抑制或破坏病毒能力的药剂称为具有“杀病毒”活性。过酸可具有杀病毒活性。本领域已知的可适用于本发明的典型备选杀病毒剂包括例如醇、醚、氯仿、甲醛、苯酚、β-丙内酯、碘、氯、汞盐、羟胺、环氧乙烷、乙二醇、季铵化合物、酶、以及洗涤剂。

如本文所用，术语“生物杀灭剂”是指灭活或破坏微生物的通常为广谱的化学试剂。将表现出灭活或破坏微生物能力的化学试剂称为具有“生物杀灭”活性。过酸可具有生物杀灭活性。本领域已知的可适用于本发明的典型备选生物杀灭剂包括例如氯、二氧化氯、氯异氰尿酸盐、次氯酸盐、臭氧、丙烯醛、胺、氯酚、铜盐、有机硫化合物和季铵盐。

如本文所用，短语“最低生物杀灭浓度”是指在特定的接触时间内，生物杀灭剂导致目标微生物活体种群数发生所需的致死、不可逆转性减少的最低浓度。效力可通过处理后活体微生物减少的数量级来度量。在一个方面，处理后活体微生物的目标减少值为至少3个数量级、更优选地为至少4个数量级、以及最优选地为至少5个数量级。在另一方面，最低生物杀灭浓度为活体微生物细胞减少至少6个数量级。

如本文所用，术语“过氧源”和“过氧的来源”是指当在水溶液中时能够提供约1mM或更高浓度过氧化氢的化合物，包括但不限于过氧化氢、过氧化氢加合物(如尿素-过氧化氢加合物(过氧化脲))、过硼酸盐、以及过碳酸盐。如本文所述，在将反应组分组合后，通过含水反应制剂中的过氧化合物提供的过氧化氢初始浓度为至少1mM或更高。在一个实施方案中，含水反应制剂中过氧化氢浓度为至少10mM。在另一个实施方案中，含水反应制剂中过氧化氢浓度为至少100mM。在另一个实施方案中，含水反应制剂中过氧化氢浓度为至少200mM。在另一个实施方案中，含水反应制剂中过氧化氢浓度为500mM或更高。在另一个实施方案中，含水反应制剂中过氧化氢浓度为1000mM或更高。含水反应制剂中过氧化氢与酶底物如甘油三酯的摩尔比(H₂O₂∶底物)从约0.002至20、优选从约0.1至10，以及最优选从约0.5至5。

所谓“寡糖”是指包含2到至少24个通过糖苷键连接的单糖单元的化合物。术语“单糖”是指具有经验式(CH₂O)_n的化合物，其中n≥3，碳骨架无支链，除了一个碳原子外每个都包含羟基，而剩余的那个碳原子则为2号碳并形成醛或酮。术语“单糖”也指细胞内的环状半缩醛或半缩酮形式。

如本文所用，术语“赋形剂”是指用于稳定制剂中的活性成分的非活性物质，例如活性成分的贮存稳定性。赋形剂有时也用于为含活性成分的制剂增量(bulk up)。如本文所述，“活性成分”为酶催化剂，其包含至少一种具有过水解活性的酶。在一个实施方案中，活性成分为具有过水解活性的至少一种CE-7糖酯酶。

如本文所用，术语“寡糖赋形剂”是指这样一种寡糖，当将其加入酶的水溶液中时，可提高喷雾干燥后活性酶的回收/保留率(即过水解酶活性)和/或提高所得喷雾干燥酶粉或酶粉与羧酸酯制剂的贮存稳定性。在一个实施方案中，当将酶贮存于羧酸酯中时(即基本上不含水的贮藏混合物)，在喷雾干燥前添加寡糖赋形剂可改善酶的贮存稳定性。羧酸酯可包含极低浓度的水，例如，甘油三乙酸酯通常具有介于180ppm和300ppm之间的水。如本文所用，短语“基本上不含水”将指酶粉和羧酸酯混合物中的水浓度不会对存在于羧酸酯中的酶粉的贮存稳定性产生不利影响。在另一个实施方案中，“基本上不含水”可指包含酶粉和羧酸酯的制剂中水含量低于2000ppm、优选地低于1000ppm、更优选地低于500ppm、甚至更优选地低于250ppm。

酶粉

就酶粉的一个方面而言，酶粉包含至少一种结构上归类为CE-7酶并具有过水解活性的酶、至少一种赋形剂以及任选至少一种表面活性剂组成的制剂。在一个实施方案中，酶粉通过喷雾干燥形成。在一些实施方案中，所述至少一种赋形剂为具有至少约1250的数均分子量和至少约9000的重均分子量的寡糖赋形剂。

所述至少一种酶可以是本文所述的CE-7糖酯酶中的任何一种，或者可以是共同拥有的、共同未决的已公布的美国专利申请2008/0176299和2009/0005590(所述专利申请各自以引用方式全文并入本文)中所述的CE-7糖酯酶中的任何一种。在一些实施方案中，所述至少一种酶选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、22、23、24以及25。

按喷雾干燥制剂的干重计，所述至少一种酶在喷雾干燥制剂中的含量在约5重量％至约75重量％的范围内。喷雾干燥制剂中酶的优选重量％范围是从约10重量％至50重量％，喷雾干燥制剂中酶的更优选重量％范围是从约20重量％至33重量％

喷雾干燥制剂还包含至少一种寡糖赋形剂。在一些实施方案中，所述至少一种寡糖赋形剂具有至少约1250的数均分子量和至少约9000的重均分子量。在一些实施方案中，寡糖赋形剂具有至少约1700的数均分子量和至少约15000的重均分子量。可用于本发明的具体的寡糖包括但不限于麦芽糖糊精、木聚糖、甘露聚糖、岩藻依聚糖、半乳甘露聚糖、脱乙酰壳多糖、棉子糖、水苏糖、果胶、菊粉、左聚糖、支链型果聚糖(graminan)、支链淀粉、蔗糖、乳果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、黑曲霉三糖、麦芽三糖、松三糖、maltotriulose、棉子糖、蔗果三糖、以及它们的混合物。可用于本发明的寡糖类赋形剂包括但不限于水溶性非离子型纤维素醚，如羟甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素、以及它们的混合物。

按喷雾干燥制剂的干重计，所述赋形剂在制剂中的含量在约95重量％至约25重量％的范围内。喷雾干燥制剂中赋形剂的优选重量％范围是从约90重量％至50重量％，喷雾干燥制剂中赋形剂的更优选重量％范围是从约80重量％至67重量％。

在一些实施方案中，所述制剂还包含至少一种表面活性剂。可用的表面活性剂包括但不限于离子型和非离子型表面活性剂或润湿剂，如乙氧基化蓖麻油、多糖酵解型甘油酯、乙酰化单酸甘油酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、泊洛沙姆、聚氧化乙烯脂肪酸山梨糖醇酐酯、聚氧乙烯衍生物、单酸甘油酯或其乙氧基化衍生物、甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物、多库酯钠、十二烷基硫酸钠、胆酸或其衍生物、卵磷脂、磷脂、乙二醇和丙二醇的嵌段共聚物、以及非离子有机硅树脂。优选的是，表面活性剂为聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪族酯，更优选的是聚山梨酸酯80。

当作为制剂的一部分时，按喷雾干燥制剂中存在的蛋白的重量计，表面活性剂的含量在约5重量％至0.1重量％的范围内，优选地在约2重量％至0.5重量％的范围内。

喷雾干燥制剂还可以包含一种或多种缓冲剂(如以下钠盐和/或钾盐：碳酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、甲基磷酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐或马来酸盐)以及酶稳定剂(如乙二胺四乙酸、(1-羟基亚乙基)二膦酸)。

按照如以下文献中大致描述的方法进行至少一种酶、至少一种寡糖赋形剂以及任选至少一种表面活性剂的制剂的喷雾干燥：Spray  Drying Handbook，第5版，K.Masters，John Wiley & Sons，Inc.，NY，N.Y.(1991)和授予Platz，R.等人的PCT专利公布WO 97/41833(1997)和WO 96/32149(1996)。

一般来讲，喷雾干燥包括将高度分散的液体和足量的热空气结合在一起，从而使液滴蒸发和干燥。通常将进料喷入经过滤的热空气流中，使溶剂蒸发，并将干燥产物送至收集器。然后将废气与溶剂一起排出。本领域的技术人员将会知道，可以用若干种不同类型的设备来提供所需的产物。例如，由Buchi Ltd.(Postfach，Switzerland)或GEANiro Corp.(Copenhagen，Denmark)制造的市售喷雾干燥机可有效制备期望大小的颗粒。还将认识到，可以对这些喷雾干燥机进行改动或定制，特别是它们的雾化器，以用于专门的应用，例如采用双喷嘴技术同时喷雾两种溶液。更具体地讲，可从一个喷嘴中使油包水乳液雾化，同时可从第二喷嘴中使含防粘剂(如甘露糖醇)的溶液雾化。在其他情况下，可能期望的是用高压液相色谱(HPLC)泵通过定制的喷嘴推出料液。只要能够制备出具有正确形态和/或组成的微结构，那么设备的选择就不是关键性因素，根据本文的教导，其对技术人员而言将是显而易见的。

对用于干燥喷雾材料的气体而言，其入口和出口温度均应使得不会导致喷雾材料中的酶发生降解。此类温度通常以实验方法确定，但一般来讲入口温度将在约50℃至约225℃的范围内，而出口温度将在约30℃至约150℃的范围内。优选的参数包括约20至150psi(0.14MPa至1.03MPa)范围内的雾化压力，优选地在约30-40至100psi(0.21-0.28MPa至0.69MPa)的范围内。使用的雾化压力通常为以下中的一者(MPa)：0.14、0.21、0.28、0.34、0.41、0.48、0.55、0.62、0.69、0.76、0.83或以上。

当贮存在环境温度下时，酶粉或羧酸酯中的酶粉制剂可长时间地基本上保留酶活性。酶粉或羧酸酯中的喷雾干燥酶粉制剂在高温下可短时间地基本上保留酶活性。在一个实施方案中，“基本上保留酶活性”是指：与制备包含羧酸酯和酶粉的制剂之前酶粉的初始酶活性相比，喷雾干燥酶粉或羧酸酯中的喷雾干燥酶粉制剂在环境温度下长期贮存和/或在高温(高于环境温度)下短期贮存后可保留至少约75％的酶活性。长期贮存是指在环境温度下贮存约一年到约两年。在一个实施方案中，短期贮存是指高温下的一段时间，即从40℃下制备包含羧酸酯和酶粉的制剂起至40℃下约8周。在另一个实施方案中，高温在约30℃至约52℃的范围内。在一个优选的实施方案中，高温在约30℃至约40℃的范围内。

在一些实施方案中，与40℃下制备包含羧酸酯和酶粉的制剂之前酶粉的初始酶活性相比，喷雾干燥酶粉在40℃下贮存8周后在包含羧酸酯和酶粉的制剂中，具有所述至少一种酶的至少75％的酶活性。在其他实施方案中，与40℃下制备包含羧酸酯和酶粉的制剂之前酶粉的初始酶活性相比，酶粉在40℃下贮存8周后在包含羧酸酯和酶粉的制剂中，具有所述至少一种酶的至少76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的酶活性。优选地，按下文实例8至13中所述的方法测量过水解活性，但在本发明的实践中可以使用测量过水解活性的任何方法。

在一些实施方案中，可以通过以下方法进一步改善指定时间内的酶活性：将在约5.5至约9.5pH值范围内具有缓冲能力的缓冲剂添加到包含羧酸酯和喷雾干燥的酶粉的制剂中。适用于制剂中的缓冲剂可以包括但不限于以下钠盐、钾盐、或者钠盐或钾盐的混合物：碳酸氢盐、焦磷酸盐、磷酸盐、甲基磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐、马来酸盐或琥珀酸盐。在包含羧酸酯和喷雾干燥的酶粉的制剂中使用的优选缓冲剂包括以下钠盐、钾盐或者钠盐或钾盐的混合物：碳酸氢盐、磷酸盐、甲基磷酸盐或柠檬酸盐。

在羧酸酯和酶粉制剂中存在缓冲剂的实施方案中，按包含羧酸酯和酶粉的制剂中羧酸酯的重量计，缓冲剂的含量在约0.01重量％至约50重量％的范围内。按包含羧酸酯和酶粉的制剂中羧酸酯的重量计，缓冲剂的含量可在约0.10％至约10％的更优选范围内。此外，在这些实施方案中，经测定，比较了以下两者的酶过水解活性：(a)在40℃下贮存8周后在包含羧酸酯、缓冲剂(在约5.5至约9.5pH值范围内具有缓冲能力)和酶粉的制剂中可保留至少一种酶的至少75％的过水解活性的酶粉，以及(b)在制备包含羧酸酯、缓冲剂(在约5.5至约9.5pH值范围内具有缓冲能力)和酶粉的制剂之前酶粉的初始过水解活性。

本发明意在将酶粉作为混在有机化合物中的制剂进行贮存，其中有机化合物为所述至少一种酶的底物，如甘油三乙酸酯。在不存在外加的过氧化氢的情况下，甘油三乙酸酯在水溶液中通常会被CE-7糖酯酶水解，生成甘油二乙酸酯和乙酸，而乙酸的生成则会导致反应混合物的pH值下降。酶在甘油三乙酸酯中保持长期贮存稳定性的一个必要条件是甘油三乙酸酯与甘油三乙酸酯中可能存在的任何水无明显的反应；在一种市售的甘油三乙酸酯(由Tessenderlo Group，Brussels，Belgium提供)中，水含量规范为0.03重量％(300ppm)。将酶贮存于甘油三乙酸酯中时所发生的甘油三乙酸酯的任何水解会生成乙酸，这会导致CE-7糖酯酶的过水解活性降低或失活；CE-7糖酯酶的过水解活性通常在pH值等于或低于5.0时失活(参见授予DiCosimo，R.等人的美国专利申请12/539,025)。为用于本发明而选择的寡糖赋形剂必须在由于制剂中存在低浓度的水而可能生成乙酸的条件下为有机底物中的酶提供稳定性。

用于通过酶催化从羧酸酯和过氧化氢制备过酸的合适反应条件

在本发明的一个方面，提供了通过让一种或多种羧酸酯与过氧源(过氧化氢、过硼酸钠或过碳酸钠)在具有过水解活性的酶催化剂存在下进行反应来制备包含过酸的含水制剂的方法。在一个实施方案中，酶催化剂包含至少一种具有过水解活性的酶，其中所述酶在结构上归类为CE-7糖酯酶家族的成员(CE-7；参见上文Coutinho，P.M.、Henrissat，B.)。在另一个实施方案中，过水解酶催化剂在结构上被归类为先锋霉素C脱乙酰酶。在另一个实施方案中，过水解酶催化剂在结构上被归类为乙酰木聚糖酯酶。

在一个实施方案中，过水解酶催化剂包含具有过水解活性和特征基序的酶，所述特征基序包含：

a)第118至120氨基酸残基位置的RGQ基序；

b)第179至183氨基酸残基位置的GXSQG基序；以及

c)当用CLUSTALW比对参考序列SEQ ID NO：1时，第298至299氨基酸残基位置的HE基序。

在另一个实施方案中，该特征基序还包含第四保守基序，其被定义为当用CLUSTALW比对参考序列SEQ ID NO：1时在第267-269氨基酸残基位置的LXD基序。

在另一个实施方案中，过水解酶催化剂包含下述酶，其具有本发明的特征基序以及与SEQ ID NO：1至少30％的氨基酸同一性。

在另一个实施方案中，过水解酶催化剂包含的酶具有选自SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、22、23、24和25的过水解酶活性。

在另一个实施方案中，过水解酶催化剂包含与如SEQ ID NO：18定义的邻接特征基序具有至少40％氨基酸同一性的酶，其中上述保守基序(即RGQ、GXSQG和HE以及任选地LXD)被保留。

在另一个实施方案中，过水解酶催化剂包含的酶具有选自SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、22、23、24和25的氨基酸序列，其中所述酶可具有一个或多个增加、缺失、或置换，只要保留特征基序并保持过水解活性即可。

合适的羧酸酯底物可以包括由下式提供的酯：

[X]_mR₅

其中X＝式R₆C(O)O的酯基

R₆＝C1至C7的直链的、支链的或环状的烃基部分，其任选地用羟基或C1至C4烷氧基取代，其中当R6＝C2至C7时，R₆任选地包含一个或多个醚键；

R₅＝C1至C6的直链的、支链的或环状的烃基部分，其任选地用羟基取代；其中R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基；其中R₅任选地包含一个或多个醚键；

m＝1至R₅中的碳原子数；并且

其中所述酯具有在25℃至少5ppm的水中溶解度。

在其他实施方案中，合适底物还可以包括下式的酯：

其中R₁＝任选被羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链或支链烷基，并且R₂＝C1至C10直链或支链烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH₂CH₂-O)_nH或(CH₂CH(CH₃)-O)_nH，并且n＝1至10。

在其他实施方案中，合适的羧酸酯底物可包括下式的甘油酯：

其中R₁＝任选被羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链或支链烷基，并且R₃和R₄分别为H或R₁C(O)。

在其他实施方案中，R₆为任选地被羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7支链的烃基部分，任选地包含一个或多个醚键。在其他优选实施方案中，R₆为任选地被羟基取代的C2至C7直链的烃基部分，和/或任选地包含一个或多个醚键。

在其他实施方案中，合适的羧酸酯底物还可包括选自乙酰化单糖、二糖和多糖的乙酰化糖类。在优选的实施方案中，乙酰化糖类包括乙酰化单糖、二糖和多糖。在其他实施方案中，乙酰化糖类选自乙酰化木聚糖、乙酰化木聚糖片段、乙酰化木糖(例如木糖四乙酸酯)、乙酰化葡萄糖(例如葡萄糖五乙酸酯)、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-邻-乙酰基-D-半乳醛、三-邻-乙酰基-D-葡萄烯糖，以及乙酰化纤维素。在优选的实施方案中，乙酰化糖类选自β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-邻-乙酰基-D-半乳醛、三-邻-乙酰基-D-葡萄烯糖，以及乙酰化纤维素。因此，乙酰化糖类可以是用于使用本发明的方法和系统(即在过氧源的存在下)产生过羧酸的合适底物。

在其他实施方案中，羧酸酯底物可以是甘油一乙酸酯，甘油三乙酸酯，甘油一丙酸酯，甘油二丙酸酯，甘油三丙酸酯，甘油一丁酸酯，甘油二丁酸酯，甘油三丁酸酯，葡萄糖五乙酸酯，木糖四乙酸酯，乙酰化木聚糖，乙酰化木聚糖片段，β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯，三-O-乙酰基-D-半乳醛，三-O-乙酰基-葡萄烯糖，丙二醇二乙酸酯，乙二醇二乙酸酯，1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6-己二醇的单酯或二酯，以及它们的混合物。在本发明的方法和系统的优选实施方案中，底物包含甘油三乙酸酯。

羧酸酯在反应制剂中存在的浓度当酶催化过氧化水解时足以产生期望浓度的过酸。羧酸酯不需要在反应制剂中完全溶解，但是其溶解度足以通过过水解酶催化剂将酯转化成相应的过酸。羧酸酯在反应制剂中的浓度为0.05重量％至40重量％，优选地为0.1重量％至20重量％，更优选地为0.5重量％至10重量％。

过氧源可包括但不限于过氧化氢、过氧化氢加合物(如尿素-过氧化氢加合物(过氧化脲))、过硼酸盐和过碳酸盐。过氧化合物在反应制剂中的浓度可在0.0033重量％至约50重量％的范围内，优选地在0.033重量％至约40重量％的范围内，更优选地在0.33重量％至约30重量％的范围内。

据报道，许多过水解酶催化剂(全细胞、透化的全细胞和部分纯化的全细胞提取物)都具有过氧化氢酶活性(EC 1.11.1.6)。过氧化氢酶可催化过氧化氢向氧和水的转化。在一个方面，过氧化水解催化剂缺乏过氧化氢酶活性。在另一方面，将过氧化氢酶抑制剂加到反应制剂中。过氧化氢酶抑制剂的实例包括但不限于叠氮化钠和硫酸羟胺。本领域的技术人员可以根据需要调节过氧化氢酶抑制剂的浓度。过氧化氢酶抑制剂的浓度通常在0.1mM至约1M的范围内；优选地在约1mM至约50mM的范围内；更优选地在约1mM至约20mM的范围内。在一个方面，叠氮化钠的浓度通常在约20mM至约60mM的范围内，而硫酸羟胺的浓度通常为约0.5mM至约30mM，优选地为约10mM。

在另一个实施方案中，酶催化剂缺乏明显的过氧化氢酶活性，或被工程化以降低或消除过氧化氢酶活性。可以用熟知的技术通过破坏负责过氧化氢酶活性的基因的表达来下调或消除宿主细胞中的过氧化氢酶活性，这些技术包括但不限于转座子诱变、RNA反义表达、定向诱变和随机诱变。在一个优选的实施方案中，编码内源过氧化氢酶活性的基因被下调或破坏(即敲除)。如本文所用，“破坏的”基因是指由修饰基因编码的蛋白不再具有活性和/或功能的基因。破坏基因的方法是本领域熟知的，包括但不限于插入、去除、或突变，只要相应蛋白的活性和/或功能不再存在即可。在一个优选实施方案中，生产宿主为大肠杆菌(E.coli)生产宿主，其包含选自katG和katE的被破坏的过氧化氢酶基因(参见已公布的美国专利申请20080176299)。在另一个实施方案中，生产宿主为大肠杆菌菌株，它包含下调和/或破坏的katg1和katE过氧化氢酶基因。

含水反应制剂中催化剂的浓度取决于催化剂的特定催化活性，对该浓度进行选择以获得所需的反应速率。过氧化水解反应中催化剂的重量通常在每毫升总反应体积中具有0.0001mg至10mg，优选0.001mg至2.0mg。还可以使用本领域技术人员熟知的方法将催化剂固定到可溶性或不溶性载体上；参见例如：Immobilization of Enzymes and Cells，Gordon F.Bickerstaff编辑；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997。使用固定化催化剂允许在后续反应中进行回收和重复使用。酶催化剂的形式可以是完整的微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化的酶或纯化的酶、以及它们的混合物。

在一个方面，通过组合羧酸酯的化学过氧化水解和酶促过氧化水解生成的过酸浓度足以提供有效浓度的过酸用于在期望pH漂白或消毒。在另一方面，本发明的方法提供酶和酶底物的组合以生产期望有效浓度的过酸，其中在不加入酶的情况下，产生的过酸浓度显著更低。虽然在一些情况下通过无机过氧化物与酶底物的直接化学反应可基本上化学过水解酶底物，但生成的过酸浓度可能不足以在期望应用中提供有效的过酸浓度，并且加入合适的过水解酶催化剂到反应制剂中显著提高总过酸浓度。

通过过氧化水解至少一种羧酸酯生成的过酸(例如过乙酸)浓度为在过氧化水解反应开始10分钟内，优选地在5分钟内，更优选地在1分钟内达到至少约20ppm，优选地至少100ppm，更优选地至少200ppm，更优选地至少300ppm，更优选地至少500ppm，更优选地至少700ppm，更优选地至少约1000ppm，最优选地至少约2000ppm。包含过酸的产物制剂可以任选地用水或主要由水构成的溶液稀释，以制备具有所需较低过酸浓度的制剂。在一个方面，制备所需浓度过酸所需的反应时间不超过约2小时，优选地不超过约30分钟，更优选地不超过约10分钟，最优选地在约5分钟或更短的时间内。在其他方面，在混合所述反应组分后约5分钟至约168小时内，或约5分钟至约48小时内，或约5分钟至2小时内，或其中的任何此类时间间隔内，将被生物污染物污染的硬质表面或无生命物体与根据本文所述的方法形成的过酸接触。

在另一方面，将根据本文所述的方法形成的过氧羧酸用于衣物洗涤护理应用，其中让过氧羧酸与至少一种衣物或纺织物接触，以提供诸如消毒、漂白、脱色、卫生处理、除臭或它们的组合等有益效果。过氧羧酸可用于多种衣物洗涤护理产品，包括但不限于纺织物预洗处理剂、衣物洗涤剂、脱色剂、漂白组合物、除臭组合物和清洗剂。在一个实施方案中，制备用于目标表面的过氧羧酸的本发明方法是原位进行的。

在衣物洗涤护理应用的背景下，术语“接触衣物或纺织物制品”是指将衣物或纺织物制品暴露于本文所公开的制剂。为此，可以用许多形式的制剂来处理纺织物，包括但不限于液体、固体、凝胶、糊剂、条、片剂、喷剂、泡沫、粉末、或颗粒，并可以通过以下方式给予：手动给料、装置给料、从基质中给料、以及由洗衣机或烘衣机喷洒和自动给料。颗粒状组合物也可以为致密物的形式；液体组合物也可以为浓缩物的形式。

当将本文所公开的制剂用于洗衣机时，该制剂还可以包含通常用于衣物洗涤剂的组分。例如，典型的组分包括但不限于表面活性剂、漂白剂、漂白活化剂、外加酶、抑泡剂、分散剂、钙皂分散剂、土悬液和抗再沉淀剂、软化剂、腐蚀抑制剂、晦暗抑制剂、杀菌剂、pH调节剂、非助洗剂碱度来源、螯合剂、有机和/或无机填料、溶剂、水溶助长剂、光学增白剂、染料和香料。

本文所公开的制剂还可以固体或液体形式用作洗涤剂添加产品。此类添加产品旨在补充或增强常规洗涤剂组合物的性能，并可以在清洁过程的任何阶段添加。

关于用于衣物洗涤护理的本发明的系统和方法(其中生成的过酸用于漂白、脱色和减少异味中的一者或多者)，通过至少一种羧酸酯的过氧化水解而生成的过酸(如过乙酸)的浓度可以为至少约2ppm，优选至少20ppm，优选至少100ppm，更优选至少约200ppm。关于用于衣物洗涤护理的本发明的系统和方法(其中生成的过酸用于消毒或卫生处理)，在过氧化水解反应开始的10分钟内、优选5分钟内、最优选1分钟内，通过至少一种羧酸酯的过氧化水解而生成的过酸(如过乙酸)的浓度可以为至少约2ppm，更优选至少约20ppm，更优选至少200ppm，更优选至少500ppm，更优选至少700ppm，更优选至少约1000ppm，最优选至少2000ppm。包含过酸的产品混合物可以任选地用水或主要由水构成的溶液稀释，以制备具有所需较低过酸浓度的混合物。在本发明方法和系统的一个方面，制备所需浓度过酸所需的反应时间不超过约2小时，优选地不超过约30分钟，更优选地不超过约10分钟，甚至更优选地不超过约5分钟，最优选地在约1分钟或更短的时间内。

对反应温度进行选择，以控制反应速率和酶催化剂活性的稳定性。反应温度可在正好高于反应制剂凝固点(大约0℃)至约95℃的范围内，优选地在约5℃至约55℃的范围内。

包含过酸的最终反应制剂的pH值为约2至约9，优选约3至约8，更优选约5至约8，甚至更优选约5.5至约8，甚至更优选约6.0至约7.5。在另一个实施方案中，反应制剂的pH值呈酸性(pH＜7)。反应和最终反应制剂的pH可任选地通过加入合适的缓冲剂(包括但不限于碳酸氢盐、焦磷酸盐、磷酸盐、甲基磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐、马来酸盐或琥珀酸盐)控制。使用缓冲剂时，其浓度通常为0.1mM至1.0M，优选1mM至300mM，最优选10mM至100mM。

在另一方面，酶法过氧化水解反应制剂可以包含充当分散剂的有机溶剂，以提高羧酸酯在反应制剂中的溶解速率。此类溶剂包括但不限于丙二醇甲醚、丙酮、环己酮、二乙二醇丁醚、三丙二醇甲醚、二乙二醇单甲醚、丙二醇丁醚、二丙二醇甲醚、环己醇、苄醇、异丙醇、乙醇、丙二醇、以及它们的混合物。

在另一方面，酶法过氧化水解产品可以包含提供所需功能的附加组分。这些附加组分包括但不限于缓冲剂、洗涤剂助剂、增稠剂、乳化剂、表面活性剂、润湿剂、腐蚀抑制剂(如苯并三唑)、酶稳定剂和过氧化物稳定剂(如金属离子螯合剂)。许多附加组分都是洗涤剂行业熟知的(参见，例如美国专利5,932,532；据此以引用方式并入)。乳化剂的实例包括但不限于聚乙烯基醇或聚乙烯吡咯烷酮。增稠剂的实例包括但不限于LAPONITE

RD、玉米淀粉、PVP、CARBOWAX

、CARBOPOL

、CABOSIL

、聚山梨酸酯20、聚乙烯醇和卵磷脂。缓冲体系的实例包括但不限于磷酸二氢钠/磷酸氢二钠、氨基磺酸/三乙醇胺、柠檬酸/三乙醇胺、酒石酸/三乙醇胺、琥珀酸/三乙醇胺、和乙酸/三乙醇胺。表面活性剂的实例包括但不限于：a)非离子型表面活性剂，如环氧乙烷或环氧丙烷的嵌段共聚物、乙氧基化的或丙氧基化的直链和支链伯醇和仲醇、以及脂族膦氧化合物；b)阳离子表面活性剂，如季铵化合物，尤其是具有键合到氮原子上的C8-C20烷基的季铵化合物，其中氮原子另外还键合到三个C1-C2烷基上；c)阴离子表面活性剂，如烷烃羧酸(如C8-C20脂肪酸)、膦酸烷基酯、烷烃磺酸盐(如十二烷基磺酸钠“SDS”)或者直链或支链烷基苯磺酸盐、烯烃磺酸盐；以及d)两性和两性离子表面活性剂，例如氨基羧酸、氨基二羧酸、烷基甜菜碱，以及它们的混合物。附加组分可包括芳香剂、染料、过氧化氢稳定剂(如金属螯合剂，例如1-羟基亚乙基-1，1-二膦酸(DEQUEST2010，Solutia Inc.，St.Louis，MO以及乙二胺四乙酸(EDTA))、TURPINAL

SL(CAS# 2809-21-4)、DEQUEST

0520、DEQUEST0531、酶活性稳定剂(如聚乙二醇(PEG))，以及洗涤剂助剂。

使用过水解酶催化剂原位生产过酸

先锋霉素C脱乙酰酶(E.C.3.1.1.41，系统名先锋霉素C乙酰水解酶，CAH)是能够水解连接到如先锋霉素C、7-氨基头孢烷酸和7-(噻吩-2-乙酰胺基)头孢烷酸等先锋霉素类上的乙酰基酯的酶(Abbott，B.和Fukuda，D.，Appl.Microbiol.30(3)：413-419(1975))。CAH属于一个较大的结构相关酶家族，称为糖酯酶家族7(“CE-7”；Coutinho，P.M.、Henrissat，B.，上文)。

CE-7糖酯酶家族包括CAH和乙酰木聚糖酯酶(AXE；E.C.3.1.1.72)。CE-7家族成员共有一种结构基序，它们的非常独特之处在于通常对乙酰化低聚木糖和乙酰化先锋霉素C都表现出酯水解活性，从而表明CE-7家族代表对一系列小底物具有多官能脱乙酰基酶活性的单类蛋白(Vincent等人，上文)。Vincent等人描述了该家族成员间的结构相似性，并定义了CE-7家族特有的特征基序。

CE-7家族成员存在于植物、真菌(例如顶头孢霉(Cephalosporidium acremonium))、酵母(例如圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis))、和细菌如热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium sp.)；耐内酰胺诺卡氏菌(Norcardia lactamdurans)、以及芽孢杆菌属的多个成员中(Politino等人，Appl.Environ.Microbiol.，63(12)：4807-4811(1997)；Sakai等人，J.Ferment.Bioeng.85：53-57(1998)；Lorenz，W.和Wiegel，J.，J.Bacteriol 179：5436-5441(1997)；Cardoza等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，54(3)：406-412(2000)；Mitsushima等人，上文；Abbott，B.和Fukuda，D.，Appl.Microbiol.30(3)：413-419(1975)；Vincent等人，上文，Takami等人，NAR，28(21)：4317-4331(2000)；Rey等人，Genome Biol.，5(10)：第77篇(2004)；Degrassi等人，Microbiology.，146：1585-1591(2000)；美国专利6,645,233、美国专利5,281,525、美国专利5,338,676以及WO 99/03984。

授予DiCosimo等人的WO2007/070609和美国专利申请公布2008/0176299以及2008/176783公开了多种在结构上归类为CE-7酶的酶，当与过氧源混合时，它们具有的过水解活性适于由多种羧酸酯底物制备有效浓度的过酸。具有改进的过水解活性的变异的CE-7酶还描述于共同提交、共同拥有、共同未决的美国专利申请(代理人档案号CL4392 US NA，以引用方式全文并入本文)。

本发明的方法在含水反应条件下利用属于CE-7糖酯酶家族的酶的过水解活性原位生产工业上有用的、有效浓度的过酸。

用于测定过酸和过氧化氢浓度的HPLC检测分析法。

在本发明的方法中，可采用多种分析方法来分析反应物和产物，包括但不限于滴定、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、质谱(MS)、毛细管电泳(CE)、U.Karst等人描述的分析方法(Anal.Chem.，69(17)：3623-3627(1997))、以及本发明实施例中描述的2，2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸盐(ABTS)测定法(S.Minning等人，AnalyticaChimica Acta 378：293-298(1999)和WO 2004/058961 A1)。

测定过酸的最低生物杀灭浓度

可以用J.Gabrielson等人(J.Microbiol.Methods 50：63-73(2002))所述的方法可用于测定过酸或者过氧化氢和酶底物的最低生物杀灭浓度(MBC)。测定方法基于XTT还原抑制，其中XTT((2，3-二[2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基]-5-[(苯氨基)羰基]-2H-四唑鎓，内盐，单钠盐)为氧化还原染料，通过在490nm或450nm处测得的光密度(OD)的变化来表明微生物呼吸活性。然而，还有许多种其他方法可用于检测消毒剂和防腐剂的活性，包括但不限于平板活菌计数、直接显微镜计数、干重、浊度测量、吸光度和生物发光(参见，例如Brock、Semour S.，“Disinfection，Sterilization，and Preservation”，第5版，LippincottWilliams & Wilkins，Philadelphia，PA，USA；2001)。

酶促制备的过氧羧酸组合物的用途

根据本发明方法制备的酶催化剂生成的过氧羧酸可用于许多硬质表面/无生命物体应用，以降低生物污染物的浓度，例如用于医疗器械(如内窥镜)、纺织物(如衣服、地毯)、食品制备表面、食品贮存和食品包装设备、食品包装材料、鸡孵化和养成场所、动物笼舍、以及具有微生物和/或抗病毒活性的工艺废水的消毒。酶法生成的过氧羧酸可用于旨在使朊病毒(如某些蛋白酶)失活以进一步提供生物杀灭活性的制剂。在一个优选的方面，本发明的过氧羧酸组合物尤其适合用作非高压灭菌医疗器械和食品包装设备的消毒剂。由于含过氧羧酸的制剂可以用GRAS或食品级组分(酶、酶底物、过氧化氢和缓冲剂)制备而得，因此酶法生成的过氧羧酸也可用于动物尸体、肉、水果和蔬菜的消毒，或用于预制食品的消毒。可以将酶法生成的过氧羧酸掺入最终形式为粉末、液体、凝胶、薄膜、固体或气溶胶的产品中。可以将酶法生成的过氧羧酸稀释至仍能提供有效消毒的浓度。

可以使用包含有效浓度的过氧羧酸的组合物，通过使表面或物体与通过本发明方法制备的产品接触，对受生物污染物污染(或怀疑被污染)的表面和/或物体进行消毒。如本文所用，“接触”是指使包含有效浓度过氧羧酸的消毒组合物与怀疑被生物污染物污染的表面或无生命物体接触一段足以达到清洁和消毒效果的时间。接触包括通过喷洒、处理、浸入、冲洗、倾注、混合、组合、涂抹、涂覆、施加、粘附以及其他方式，使包含有效浓度过氧羧酸的过氧羧酸溶液或组合物，或者可形成有效浓度过氧羧酸的溶液或组合物与怀疑被一定浓度的生物污染物污染的表面或无生命物体相连。可以将消毒组合物与清洁组合物结合在一起，以同时提供清洁和消毒功能。作为另外一种选择，可以将清洁剂(如表面活性剂或脱色剂)掺入制剂中，以通过单一组合物同时提供清洁和消毒功能。

包含有效浓度过氧羧酸的组合物还可以含有至少一种附加的抗微生物剂、朊病毒降解蛋白酶的组合、杀病毒剂、杀孢子剂、或生物杀灭剂。当将这些药剂与通过受权利要求书保护的方法制备的过氧羧酸的组合用于对被生物污染物污染(或怀疑被污染)的表面和/或物体进行清洁和消毒时，可以提供增强和/或协同效应。合适的抗微生物剂包括羧酸酯(如，对羟基烷基苯甲酸酯和烷基肉桂酸酯)；磺酸(如十二烷基苯磺酸)；碘代化合物或活性卤素化合物(如卤素元素、卤素氧化物(如NaOCl、HOCl、HOBr、ClO₂)、碘、卤素间卤化物(interhalide)(如一氯化碘、二氯化碘、三氯化碘、四氯化碘、氯化溴、一溴化碘、或二溴化碘)、多卤化物、次氯酸盐、次氯酸、次溴酸盐、次溴酸、氯代-和溴代-乙内酰脲、二氧化氯和亚氯酸钠)；有机过氧化物，包括过氧化苯甲酰、烷基过氧化苯甲酰、臭氧、单重态氧发生器、以及它们的混合物；酚类衍生物(例如邻苯基苯酚、4-氯-2-苄基苯酚、叔戊基酚和C₁-C₆烷基羟基苯甲酸酯)；季铵化合物(例如烷基二甲基苄基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵、以及它们的混合物)；以及此类抗微生物剂的混合物，它们的量应足以提供所需的微生物防护水平。抗微生物剂的有效量包括约0.001重量％至约60重量％的抗微生物剂，约0.01重量％至约15重量％的抗微生物剂，或约0.08重量％至约2.5重量％的抗微生物剂。

在一个方面，当将用本发明方法形成的过氧羧酸施用到某场所上和/或某场所处时，可用于降低活生物污染物(如活微生物群体)的浓度。如本文所用，“场所”包括适于进行消毒或漂白的部分或全部目标表面。目标表面包括有可能被生物污染物污染的所有表面。非限制性实例包括存在于食品或饮料行业中的设备表面(如槽罐、运送装置、地板、排水系统、冷却器、冷冻机、设备表面、壁、阀门、束带、管道、排水系统、接头、裂缝、它们的组合等)；建筑物表面(如墙壁、地板和窗户)；与非食品行业相关的管道和排水系统，包括水处理设施、水池和温泉浴场、以及发酵罐；与医院或兽医相关的表面(如墙壁、地板、床、设备(如内窥镜)、在医院/兽医或其他医疗保健场所穿着的衣物，包括衣服、手术服、鞋和其他医院或兽医相关表面)；餐厅表面；浴室表面；盥洗室；衣服和鞋；牲口(如家禽、牛、奶牛、山羊、马和猪)棚舍表面；家禽或虾的孵卵场；以及药物或生物药物相关表面(如药物或生物药物制造设备、药物或生物药物成分、药物或生物药物赋形剂)。附加的硬质表面也包括食物产品，例如牛肉、禽肉、猪肉、蔬菜、水果、海产品、它们的组合等。场所还可以包括吸水材料，如被污染的亚麻布或其他纺织物。场所还包括收获的植物或植物产品，包括种子、球茎、块茎、水果和蔬菜；正在生长的植物，尤其是农作物生长植物，包括谷类食物、叶菜和色拉作物、根菜、豆类、浆果、柑橘类水果和硬果。

硬质表面材料的非限制性实例为金属(如钢、不锈钢、铬、钛、铁、铜、黄铜、铝和它们的合金)、矿物质(如混凝土)、聚合物和塑料(如聚烯烃，如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯)、聚(丙烯腈-丁二烯)、丙烯腈丁二烯；聚酯，如聚对苯二甲酸乙二酯；以及聚酰胺，如尼龙)。附加表面包括砖块、瓷砖、陶瓷、瓷器、木质(地板)、聚乙烯树脂(地板)、油毡、和地毯。

可使用通过本发明方法形成的过氧羧酸为衣服或纺织物制品提供有益效果，包括但不限于漂白、脱色、卫生处理、消毒和除臭。用本发明方法形成的过氧羧酸可用于许多衣物洗涤护理产品，包括但不限于纺织物预洗处理剂、衣物洗涤剂、脱色剂、漂白组合物、除臭组合物和清洗剂。

重组微生物表达

本发明序列的基因和基因产物可在异源宿主细胞中产生，尤其是在微生物宿主细胞中产生。用于表达本发明基因和核酸分子的优选异源宿主细胞为微生物宿主，所述微生物宿主可在真菌或细菌家族中找到并且其可在广泛的温度、pH值和溶剂耐受性下生长。例如，预期细菌、酵母和丝状真菌中任何一种均适于作为表达本发明核酸分子的宿主。过水解酶可在细胞内、细胞外、或细胞内和细胞外两者组合的形式表达，其中细胞外表达使得从发酵产物回收所需的蛋白质比回收细胞内表达所产生的蛋白质的方法更简便。转录、翻译和蛋白质生物合成仪器相对于用来产生细胞生物质的细胞原料而言保持不变；无论如何，功能基因将被表达。宿主菌株的实例包括但不限于细菌、真菌或酵母物种例如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、糖酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红发夫酵母属(Phaffia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、耶氏酵母属(Yarrowia)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、赤细菌属(Erythrobacter)、绿菌属(Chlorobium)、着色菌属(Chromatium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、噬纤维菌属(Cytophaga)、红细菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、分支杆菌属(Mycobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯菌属(Methylosinus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、产碱菌属(Alcaligenes)、集胞蓝细菌属(Synechocystis)、聚球蓝细菌属(Synechococcus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、硫杆菌属(Thiobacillus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和粘球菌属(Myxococcus)。在一个实施方案中，细菌宿主菌株包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)以及假单胞菌属(Pseudomonas)。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。

大规模微生物的生长和功能基因的表达可利用各种单一碳水化合物或络合碳水化合物、有机酸和醇或饱和烃(对于光合自养宿主或化能自养宿主而言，例如甲烷或二氧化碳)，并可利用各种形式和数量的氮、磷、硫、氧、碳或任何微量营养素(包括小无机离子)。可通过向培养物中加入或不加入特定的调节分子(通常不将其视为营养物质或能源)来影响生长速率的调节。

可用于转化合适的宿主细胞的载体或盒是本领域熟知的。通常，载体或盒包含指导相关基因转录和翻译的序列、选择性标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的基因5′区域和控制转录终止的DNA片段3′区域。最优选的是当两个控制区都来源于与转化的宿主细胞同源的基因和/或对生产宿主是天然的基因，尽管它们无需来源于此。

可用于驱动本发明的先锋霉素C脱乙酰酶编码区在所需宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有很多，并且是本领域技术人员熟悉的。事实上，任何能够驱动这些基因的启动子均适用于本发明，包括但不限于：CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在糖酵母属中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母属中表达)；和lac、araB、tet、trp、lP_L、lP_R、T7、tac以及trc(用于在大肠杆菌属中表达)以及amy、apr、npr启动子和多个噬菌体启动子，用于在芽孢杆菌属中表达。

终止控制区也可以源于优选宿主细胞的天然的多种基因。在一个实施方案中，可任选包括终止控制区。在另一个实施方案中，嵌合基因包括源于优选宿主细胞的终止控制区。

工业生产

多种培养方法可用来生产过水解酶催化剂。例如，从重组微生物宿主过表达的特定基因产物的大规模生产可通过分批、分批补料和连续培养的方法进行。分批培养和补料分批培养方法在本领域内是常用的且众所周知，并且实例可见于如下文献：Thomas D.Brock in  Biotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA(1989)和Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227(1992)。

所需过水解酶催化剂的商业生产也可用连续培养的方法实现。连续培养是一种开放式系统，其中将成分确定的培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。或者，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养素，且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体载体进行，所述固体载体由天然材料和/或合成材料组成。

可通过本领域的技术人员已知的任何方法实现从分批发酵、分批补料发酵或连续培养中回收所需过水解酶催化剂。例如，当酶催化剂是细胞内产生时，可通过离心或膜过滤从培养基分离细胞沉淀物(cellpaste)，任选地可用水或所需pH的含水缓冲液洗涤，然后将所需pH的含水缓冲液中的细胞沉淀物的悬浮液混匀以产生含有所需酶催化剂的细胞提取物。细胞提取物可任选地通过合适的助滤剂例如硅藻土或二氧化硅过滤来去除细胞残片，然后进行热处理步骤，将不需要的蛋白质从酶催化剂溶液中沉淀出。然后通过膜过滤或离心将含有所需酶催化剂的溶液从沉淀的细胞残片和蛋白质分离，并且所得的部分纯化的酶催化剂溶液通过额外的膜过滤浓缩，然后任选地与合适的载体(例如，麦芽糖糊精、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或其混合物)混合并喷雾干燥以产生含有所需酶催化剂的固体粉末。

当数量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围均旨在包含其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数，除非另行指出。当定义一个范围时，不旨在将范围限定于所列举的具体数值。

一般方法

以下提供实施例来说明优选实施方案。本领域的技术人员应认识到下文实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本文所公开方法的实施中功能良好的技术，因此可认为其构成实施的优选模式。然而，本领域的技术人员应依据本发明理解的是，在不背离本发明所公开方法的精神和范围的情况下，可对所公开的具体实施方案进行许多更改并仍能获得相同或相似的结果。

所有试剂和材料均得自DIFCO Laboratories(Detroit，MI)，GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)，TCI America(Portland，OR)，RocheDiagnostics Corporation(Indianapolis，IN)或Sigma-Aldrich ChemicalCompany(St.Louis，MO)，除非另外说明。

说明书中的以下缩写对应于如下度量单位、技术、性能或化合物：“sec”或“s”指秒，“min”指分钟，“h”或“hr”指小时，“μL”指微升，“mL”指毫升，“L”指升，“mM”指毫摩尔每升，“M”指摩尔，“mmol”指毫摩尔，“ppm”指百万分率，“wt”指重量，“wt％”指重量百分比，“g”指克，“mg”指毫克，“μg”指微克，“ng”指纳克，“g”指重力，“HPLC”指高效液相色谱法，“dd H₂O”指蒸馏和去离子水，“dcw”指细胞干重，“ATCC”或“ATCC

”指于美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，“U”指过水解酶活性的单位，“rpm”指每分钟的转速，“Tg”指玻璃化转变温度，以及“EDTA”指乙二胺四乙酸。

实施例1

katG过氧化氢酶缺陷型大肠杆菌菌株的构建

通过PCR(94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟，70℃下1分钟，30个循环)用标识为SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29的引物从质粒pKD13(SEQ ID NO：27)扩增卡那霉素抗性基因(kan；SEQ ID NO：26)的编码区，从而产生标识为SEQ ID NO：30的PCR产物。katG核酸序列以SEQ ID NO：31给出，并且对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：32。大肠杆菌MG1655(ATCC

47076^TM)采用温敏质粒pKD46(SEQ IDNO：33)进行转化并于30℃在LB-amp平板上培养24小时以进行筛选，该质粒含有λ-Red重组酶基因(Datsenko和Wanner，(2000)，PNASUSA 97：6640-6645)。MG1655/pKD46采用50-500ng PCR产物通过电穿孔(BioRad Gene Pulser，0.2cm电击杯，2.5kV，200W，25μF)进行转化，并于37℃在LB-kan平板上培养24小时以进行筛选。将几个菌落划线于LB-kan平板上并在42℃下培养过夜以修复pKD46质粒。对菌落进行检查以确定kanR/ampS的表型。使用PUREGENE

DNA纯化系统(Gentra Systems，Minneapolis，MN)分离几个菌落的基因组DNA，并采用标识为SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35的引物通过PCR检查来确定katG基因是否被破坏。几个katG遭破坏的菌株采用温敏质粒pCP20(SEQ ID NO：36)进行转化，并于37℃在LB-kan平板上培养24小时以进行筛选，该质粒可表达FLP重组酶，用来切除kan基因。将几个菌落划线于LB平板上并在42℃下培养过夜以修复pCP20质粒。对两个菌落进行检查以确定kanS/ampS的表型，并将这两个菌落称为MG1655 KatG1和MG1655 KatG2。

实施例2

katE过氧化氢酶缺陷型大肠杆菌菌株的构建

通过PCR(94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟，70℃下1分钟，30个循环)用标识为SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的引物从质粒pKD13(SEQ ID NO：27)扩增卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO：26)，以生成标识为SEQ ID NO：39的PCR产物。katE核酸序列以SEQ ID NO：40给出，并且对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：41。大肠杆菌MG1655(ATCC47076^TM)采用温敏质粒pKD46(SEQ ID NO：33)进行转化并于30℃在LB-amp平板上培养24小时以进行筛选，该质粒含有λ-Red重组酶基因。MG1655/pKD46采用50-500ng PCR产物通过电穿孔(BioRad Gene Pulser，0.2cm电击杯，2.5kV，200W，25μF)进行转化，并于37℃在LB-kan平板上培养24小时以进行筛选。将几个菌落划线于LB-kan平板上并在42℃下培养过夜以修复pKD46质粒。对菌落进行检查以确定kanR/ampS的表型。使用PUREGENEDNA纯化系统分离几个菌落的基因组DNA，并采用标识为SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43的引物通过PCR检查来确定katE基因是否被破坏。几个katE遭破坏的菌株采用温敏质粒pCP20(SEQ ID NO：36)进行转化，并于37℃在LB-amp平板上培养24小时以进行筛选，该质粒可表达FLP重组酶，用来切除kan基因。将几个菌落划线于LB平板上并在42℃下培养过夜以修复pCP20质粒。对两个菌落进行检查以确定kanS/ampS的表型，并将这两个菌落称为MG1655 KatE1和MG1655KatE2。

实施例3

katG过氧化氢酶和katE过氧化氢酶缺陷型大肠杆菌菌株(KLP18) 的构建

通过PCR(94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟，70℃下1分钟，30个循环)用标识为SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的引物从质粒pKD13(SEQ ID NO：27)扩增卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO：26)，以生成标识为SEQ ID NO：39的PCR产物。大肠杆菌MG1655 KatG1(实施例1)采用温敏质粒pKD46(SEQ ID NO：33)进行转化并于30℃在LB-amp平板上培养24小时以进行筛选，该质粒含有λ-Red重组酶基因。MG1655 KatG1/pKD46采用50-500ng PCR产物通过电穿孔(BioRad Gene Pulser，0.2cm电击杯，2.5kV，200W，25μF)进行转化，并于37℃在LB-kan平板上培养24小时以进行筛选。将几个菌落划线于LB-kan平板上并在42℃下培养过夜以修复pKD46质粒。对菌落进行检查以确定kanR/ampS的表型。使用PUREGENE

DNA纯化系统从若干个菌落中分离基因组DNA，并且通过PCR进行检验以确认katE基因是否被破坏，所述PCR使用引物SEQ ID NO：42和SEQ IDNO：43。若干个katE遭破坏的菌株(ΔkatE)用温敏质粒pCP20(SEQID NO：36)转化，该质粒表达FLP重组酶，用于切除kan基因，并且在37℃下在LB-amp平板上选择24小时。将几个菌落划线于LB平板上并在42℃下培养过夜以修复pCP20质粒。对两个菌落进行检查以确定kanS/ampS的表型，并将两个菌落称为MG1655 KatG1KatE18.1和MG1655 KatG1KatE23。MG1655 KatG1KatE18.1指定为大肠杆菌KLP18。

实施例4

来自那不勒斯栖热袍菌的过水解酶的克隆和表达

编码来自那不勒斯栖热袍菌的乙酰木聚糖酯酶的基因的编码区(如在GENBANK

中报道的登录号AE000512；80481-81458区；SEQID NO：44)采用在大肠杆菌中最优表达的密码子合成(DNA 2.0，MenloPark，CA)。随后通过PCR(94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟，70℃下1分钟，30个循环)用标识为SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46的引物扩增该基因的编码区。将所得的核酸产物(SEQ ID NO：47)亚克隆进pTrcHis2-TOPO

以生成标识为pSW196的质粒。质粒pSW196用来转化大肠杆菌KLP18(实施例3)以产生菌株KLP18/pSW196。将KLP18/pSW196在37℃下振摇培养于LB培养基中直到OD_600nm＝0.4-0.5，达到该OD时加入终浓度为1mM的IPTG，并继续培养2-3h。离心收集细胞并进行SDS-PAGE以确定过水解酶的表达量占可溶性总蛋白的20-40％。

实施例5

来自海栖热袍菌MSB8的过水解酶的克隆和表达

将编码来自海栖热袍菌MSB8的乙酰木聚糖酯酶的基因的编码区(如在GENBANK

中报道的登录号NP_227893.1；SEQ ID NO：48)进行合成(DNA 2.0，Menlo Park，CA)。随后通过PCR(94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟，70℃下1分钟，30个循环)用标识为SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50的引物扩增该基因的编码区。所得的核酸产物(SEQID NO：51)用限制性酶PstI和XbaI切割，并亚克隆在pUC19中的PstI和XbaI位点之间以生成标识为pSW207的质粒。质粒pSW207用来转化大肠杆菌KLP18(实施例3)以产生标识为KLP18/pSW207的菌株。KLP18/pSW207在37℃下振摇培养于LB培养基中直到OD_600nm＝0.4-0.5，达到该OD时加入终浓度为1mM的IPTG，并继续培养2-3h。离心收集细胞并进行SDS-PAGE以确定过水解酶的表达量占可溶性总蛋白的20-40％。

实施例6

表达过水解酶的大肠杆菌KLP18转化体的发酵

通过向2L摇瓶中加料0.5L种子培养基来制备发酵罐种子培养物，0.5L种子培养基含有酵母提取物(Amberex 695，5.0g/L)、K₂HPO₄(10.0g/L)、KH₂PO₄(7.0g/L)、二水合柠檬酸钠(1.0g/L)、(NH₄)₂SO₄(4.0g/L)、MgSO₄七水合物(1.0g/L)和柠檬酸铁铵(0.10g/L)。将培养基的pH调节为6.8，将培养基封装于烧瓶中，然后进行灭菌。灭菌后加入的添加剂包括葡萄糖(50重量％，10.0mL)和1mL的氨苄青霉素(25mg/mL)储备液。在种子培养基上接种1mL大肠杆菌KLP18/pSW196或大肠杆菌KLP18/pSW207培养物(含20％甘油)，并且在35℃和300rpm下培养。在大约1-2OD_550nm时，将种子培养物转移到14L发酵罐中(Braun Biotech，Allentown，PA)，该发酵罐温度为35℃，并装有8L培养基，该培养基含有KH₂PO₄(3.50g/L)、FeSO₄七水合物(0.05g/L)、MgSO₄七水合物(2.0g/L)、二水合柠檬酸钠(1.90g/L)、酵母提取物(Amberex 695，5.0g/L)、Biospumex153K消泡剂(0.25mL/L，CognisCorporation，Monheim，Germany)、NaCl(1.0g/L)、CaCl₂二水合物(10g/L)和NIT痕量元素溶液(10mL/L)。痕量元素溶液含有一水合柠檬酸(10g/L)、MnSO₄水化物(2g/L)、NaCl(2g/L)、FeSO₄七水合物(0.5g/L)、ZnSO₄七水合物(0.2g/L)、CuSO₄五水合物(0.02g/L)和NaMoO₄二水合物(0.02g/L)。灭菌后加入的添加剂包括葡萄糖溶液(50％重量比，80.0g)和氨苄青霉素(25mg/mL)储备液(16.00mL)。葡萄糖溶液(50％重量比)用于分批补料。当葡萄糖浓度降低至0.5g/L时，开始补加葡萄糖，起始进料速率为0.31g/min，随后每小时分别逐渐增加至0.36、0.42、0.49、0.57、0.66、0.77、0.90、1.04、1.21、1.41和1.63g/min；之后速率保持恒定。监测培养基中的葡萄糖浓度，如果浓度超过0.1g/L，则降低进料速率或暂时停止进料。在OD_550nm＝56和OD_550nm＝80之间时启动诱导，向各种菌株加入16mL的IPTG(0.5M)。溶解氧(DO)浓度控制在25％的空气饱和度。DO开始通过叶轮搅拌速率(400至1400rpm)控制，然后通过通气速率(2至10slpm)控制。pH控制在6.8。用NH₄OH(29％重量比)和H₂SO₄(20％重量体积比)控制pH。封头压力为0.5巴。IPTG加入16小时后离心收集细胞。

实施例7

CE-7酯酶/过水解酶的热处理细胞提取物的制备

表达来自那不勒斯栖热袍菌(KLP18/pSW196)或海栖热袍菌MSB8(KLP18/pSW207)的过水解酶的大肠杆菌转化体的细胞提取物通过如下方式制备：将0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)(含有二硫苏糖醇(1mM))中的细胞沉淀物(20重量％细胞湿重)的悬浮液两次经过工作压力为16,000psi(约110MPa)的弗氏压碎器。然后以20,000×g离心粗提取物以去除细胞碎片，得到澄清的细胞提取物，对所得提取物进行可溶性总蛋白的分析(二喹啉甲酸法蛋白浓度测定试剂盒，Sigma Aldrich目录号BCA1-KT)。将含有海栖热袍菌MSB8或那不勒斯栖热袍菌过水解酶的澄清的提取物在75℃加热20分钟，随即用冰/水浴冷却到5℃。离心所得混合物以去除沉淀的蛋白质，收集上清液，并如前所述进行可溶性总蛋白的分析。热处理后的上清液的SDS-PAGE表明，上清液中过水解酶占可溶性总蛋白的至少约90％。

实施例8

那不勒斯栖热袍菌过水解酶/海藻糖喷雾干燥酶粉的温度稳定性

制备一组十种含水混合物，其含有碳酸氢钠缓冲液(50mM，pH＝8.1)中的下列物质：大肠杆菌KLP18/pSW196的不同浓度的热处理细胞提取蛋白(PAGE显示那不勒斯栖热袍菌过水解酶含量≥90％)、海藻糖(Cargill)以及任选地作为表面活性剂的聚山梨酸酯80(p80)(表1)。这些溶液用Buchi B-290玻璃喷雾干燥室(入口温度＝170℃，出口温度＝90℃，进料速率＝3mL/min至10mL/min)喷雾干燥以产生十种喷雾干燥的酶粉；用BCA(二喹啉甲酸)蛋白分析测定粉末中蛋白的重量百分比，并且这些粉末的玻璃化转变温度(Tg)用调制式差示扫描量热法测量(表1)。

表1：用来产生那不勒斯栖热袍菌过水解酶/海藻糖喷雾干燥酶粉 的蛋白质/赋形剂溶液组合物，和相应粉末的Tg。

将喷雾干燥的酶粉于40℃保存于密封瓶中并间隔1周取样，样品用来分析碳酸氢钠缓冲液(50mM，pH 7.2)中的如下物质在25℃下反应5分钟产生的过乙酸的浓度：那不勒斯栖热袍菌过水解酶(50μg蛋白/mL)、H₂O₂(100mM)、甘油三乙酸酯(100mM)和TURPINAL

SL(500ppm)，并且采用改进的Karst等人所报道的分析方法(见下)分析过乙酸生成情况。

在预定的时间(5min)移出反应混合物的一个样品(0.040mL)并立即与0.960mL的5mM的磷酸水溶液混合，通过将稀释的样品的pH调节至小于pH4而终止反应。所得溶液使用ULTRAFREE

MC过滤装置(30,000标称分子量(NMWL)，Millipore Corp.，Billerica，MA，目录号UFC3LKT 00)以12,000rpm离心过滤2分钟。将所得滤液的等分试样(0.100mL)转移到1.5mL螺帽HPLC小瓶中(AgilentTechnologies，Palo Alto，CA；#5182-0715)，瓶中包含0.300mL去离子水，然后加入0.100mL在乙腈中的20mM MTS(甲基对甲苯硫醚)，给小瓶拧上螺帽，将内容物短暂混合，然后在约25℃避光孵育10分钟。然后向小瓶中加入0.400mL的乙腈和0.100mL的三苯基膦(TPP，40mM)乙腈溶液中，再次盖上小瓶，混合所得溶液并在大约25℃避光孵育30分钟。然后向小瓶中加入0.100mL的10mM N，N-二乙基间甲苯甲酰胺(DEET；HPLC外标)，并且通过HPLC分析所得的溶液中MTSO(甲基对甲苯亚砜)，其为MTS与过乙酸反应产生的化学计量氧化产物。对照反应在没有加入提取蛋白或甘油三乙酸酯的情况下进行，以确定测试混合物中MTS被过氧化氢氧化的速率，用来校正背景MTS氧化下过乙酸的产生速率。HPLC方法：Supelco Discovery C8柱(10cm×4.0mm，5μm)(目录号569422-U)，配有Supelco SupelguardDiscovery C8前置柱(Sigma-Aldrich；目录号59590-U)；10微升进样体积；梯度法，CH₃CN(Sigma-Aldrich；目录号270717)和去离子水，速率1.0mL/min，环境温度。

表2：HPLC梯度法分析过乙酸。

时间(分钟:秒)	(％CH3CN)
		0:00	40
3:00	40
		3:10	100
4:00	100
		4:10	40
7:00(停止)	40

那不勒斯栖热袍菌过水解酶/海藻糖喷雾干燥粉末的过水解酶活性在40℃保存8周是稳定的(表3)。

表3：那不勒斯栖热袍菌过水解酶/海藻糖喷雾干燥酶粉在40℃保存期间的温度稳定性。甘油三乙酸酯(100mM)和H₂O₂(100mM)在含有那不勒斯栖热袍菌过水解酶/海藻糖喷雾干燥粉末(50μg蛋白/mL)和TURPINAL

SL(500ppm)的碳酸氢钠缓冲液(50mM，pH 7.2)中在25℃反应5分钟产生的PAA(ppm)。

实施例9

那不勒斯栖热袍菌过水解酶/海藻糖喷雾干燥酶粉在以酶粉和甘 油三乙酸酯的混合物形式保存时的温度稳定性

如实施例8所述制备喷雾干燥酶粉，评估甘油三乙酸酯中喷雾干燥粉末混合物在40℃保存8周时的稳定性。将喷雾干燥酶粉加入甘油三乙酸酯中以产生在87.2g甘油三乙酸酯中含有0.200g蛋白质的混合物。所得混合物保存于40℃，并每周在25℃于100mL反应体系中分析2.19g充分混合的混合物样品，此100mL反应体系含有50mM碳酸氢钠缓冲液(pH 7.2)中的100mM过氧化氢和TURPINAL

SL(500ppm)，其中所得的甘油三乙酸酯和蛋白质的浓度分别为100mM和50μg/mL。表4中的数据与表3中实施例8的数据相比显示了那不勒斯栖热袍菌过水解酶/海藻糖喷雾干燥酶粉当与甘油三乙酸酯混合保存时的不稳定性。

表4：那不勒斯栖热袍菌过水解酶/海藻糖喷雾干燥酶粉以酶粉和甘油三乙酸酯的混合物形式在40℃保存时的温度稳定性。甘油三乙酸酯(100mM)和H₂O₂(100mM)在含有那不勒斯栖热袍菌过水解酶(50μg蛋白/mL)和TURPINAL

SL(500ppm)的碳酸氢钠缓冲液(50mM，pH7.2)中在25℃反应5分钟产生的PAA(ppm)。

实施例10

那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉的温度稳 定性

制备含有在50mM碳酸氢钠(pH 8.1)中的如下物质的含水混合物：大肠杆菌KLP18/pSW196热处理的细胞提取蛋白(34g蛋白/L，PAGE显示那不勒斯栖热袍菌过水解酶含量≥90％)和作为赋形剂的麦芽糖糊精(66.7g/L MALTRIN

M100麦芽糖糊精，14.7g/L MALTRIN

M250，14.7g/L MALTRIN

M040，Grain Processing Corporation，Muscatine，IA)。用喷雾干燥器(GEA Niro，直径3英尺，入口温度＝226℃，出口温度＝76℃，进料速率＝60g/min)喷雾干燥该溶液以产生喷雾干燥酶粉；用BCA(二喹啉甲酸)蛋白分析测定粉末中蛋白的重量百分比(20.3重量％)，并且用调制式差示扫描量热法测定该粉末的玻璃化转变温度(Tg＝54℃)。喷雾干燥该溶液以产生粉末，然后测试所得粉末在40℃保存9周的稳定性。喷雾干燥的酶粉(保存于40℃)间隔1周取样，并用50mM碳酸氢盐缓冲液(pH 7.2)中的如下物质在25℃下分析活性：50μg蛋白/mL的那不勒斯栖热袍菌过水解酶、H₂O₂(100mM)、甘油三乙酸酯(100mM)和TURPINAL

SL(500ppm)，并且采用以上改进的Karst等人所报道的分析方法分析过乙酸生成情况。那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥粉末的过水解酶活性在40℃保存8周是稳定的(表5)。

表5：那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉在40℃保存期间的温度稳定性。甘油三乙酸酯(100mM)和H₂O₂(100mM)在含有那不勒斯栖热袍菌过水解酶(50μg蛋白/mL)和TURPINAL

SL(500ppm)的碳酸氢钠缓冲液(50mM，pH 7.2)中在25℃反应5分钟产生的PAA(ppm)。

实施例11

那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉在以酶粉 和甘油三乙酸酯的混合物形式保存时的温度稳定性

如实施例10所述制备喷雾干燥酶粉，评估甘油三乙酸酯中喷雾干燥粉末混合物在40℃保存21周时的稳定性。将喷雾干燥酶粉(1.235g，20.3重量％的蛋白质)加入109g的甘油三乙酸酯中。所得混合物保存于40℃，并以一式两份在25℃于100mL反应体系中分析2.19g充分混合的混合物样品，此100mL反应体系含有50mM碳酸氢钠缓冲液(pH 7.2)中的过氧化氢(100mM)和TURPINAL

SL(500ppm)，其中所得的甘油三乙酸酯和蛋白质的浓度分别为100mM和50μg/mL。表6中的数据与表5中实施例10的数据相比显示了那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉当与甘油三乙酸酯混合保存时的稳定性。

表6：那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉以酶粉和甘油三乙酸酯的混合物形式在40℃保存时的温度稳定性。甘油三乙酸酯(100mM)和H₂O₂(100mM)在含有那不勒斯栖热袍菌过水解酶(50μg蛋白/mL)和TURPINAL

SL(500ppm)的碳酸氢钠缓冲液(50mM，pH 7.2)中在25℃反应5分钟产生的PAA(ppm)。

ND＝没有进行双重分析

实施例12

那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉在以酶粉、 碳酸氢钠和甘油三乙酸酯的混合物形式保存时的温度稳定性

如实施例10所述制备喷雾干燥酶粉，评估甘油三乙酸酯和碳酸氢钠混合物中喷雾干燥粉末混合物40℃保存21周时的稳定性。将喷雾干燥酶粉(0.988g，20.3重量％蛋白)加入87.2g甘油三乙酸酯和16.8g碳酸氢钠(等级3DF(粉末)，Church & Dwight)的混合物中。所得混合物保存于40℃，并以一式两份在25℃于100mL反应体系中分析2.62g充分混合的混合物样品，此100mL反应体系含有过氧化氢(100mM)和TURPINAL

SL(500ppm)，其中所得的甘油三乙酸酯、碳酸氢钠和蛋白质的浓度分别为100mM、50mM(pH 7.2)和50μg/mL。表7中的数据与表6中实施例11的数据相比显示，那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉在以甘油三乙酸酯和固体碳酸氢钠混合物的形式在40℃保存21周时的稳定性与那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉只以单独甘油三乙酸酯混合物的形式在40℃保存21周时的稳定性相比得到了改善。在更长保存时间，例如21周时，在甘油三乙酸酯和碳酸氢钠混合物中的过水解酶仍然保留大约100％的初始活性。

表7：那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉以酶粉、碳酸氢钠和甘油三乙酸酯混合物的形式在40℃保存时的温度稳定性。甘油三乙酸酯(100mM)和H₂O₂(100mM)在含有那不勒斯栖热袍菌过水解酶(50μg蛋白/mL)和TURPINAL

SL(500ppm)的碳酸氢钠缓冲液(50mM，pH 7.2)中在25℃反应5分钟产生的PAA(ppm)。

ND＝没有进行双重分析

实施例13

海栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉的温度稳定性

制备含有在50mM碳酸氢钠(pH 8.1)中的如下物质的含水混合物：大肠杆菌KLP18/pSW207热处理的细胞提取蛋白(21g蛋白/L，PAGE显示海栖热袍菌过水解酶含量≥90％)和作为赋形剂的麦芽糖糊精(31g/L麦芽糖糊精DE 13-17和31g/L麦芽糖糊精DE 4-7，Aldrich)。用Buchi B-290玻璃喷雾干燥器(入口温度＝170℃，出口温度＝90℃，进料速率＝4.5mL/min)喷雾干燥该溶液以产生喷雾干燥酶粉；用BCA(二喹啉甲酸)蛋白分析测定粉末中蛋白的重量百分比(18.0重量％)，并且用调制式差示扫描量热法测定该粉末的玻璃化转变温度(Tg＝90℃)。喷雾干燥该溶液以产生粉末，然后测试所得粉末在40℃保存7周的稳定性。喷雾干燥的酶粉(保存于40℃)间隔1周取样，并用50mM碳酸氢盐缓冲液(pH 7.2)中的如下物质在25℃下分析活性：50μg蛋白/mL的海栖热袍菌过水解酶、H₂O₂(H₂O₂(100mM)、甘油三乙酸酯(100mM)和TURPINALSL(500ppm)，并且采用以上改进的Karst等人所报道的分析方法分析过乙酸的产生。那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥粉末的过水解酶活性在40℃保存7周是稳定的(表8)。

表8：海栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉在40℃保存期间的温度稳定性。甘油三乙酸酯(100mM)和H₂O₂(100mM)在含有海栖热袍菌过水解酶(50μg蛋白/mL)和TURPINAL

SL(500ppm)的碳酸氢钠缓冲液(50mM，pH 7.2)中在25℃反应5分钟产生的PAA(ppm)。

实施例14

海栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉在以酶粉和甘油 三乙酸酯的混合物形式保存时的温度稳定性

如实施例13所述制备喷雾干燥酶粉，评估甘油三乙酸酯中喷雾干燥粉末混合物在40℃保存7周时的稳定性。将喷雾干燥酶粉(0.556g，18.0重量％的蛋白质)加入43.6g的甘油三乙酸酯中。所得混合物保存于40℃，并以一式两份在25℃于100mL反应体系中分析2.21g充分混合的混合物样品，此100mL反应体系含有50mM碳酸氢钠缓冲液(pH 7.2)中的过氧化氢(100mM)和TURPINAL

SL(500ppm)，其中所得的甘油三乙酸酯和蛋白质的浓度分别为100mM和50μg/mL。表9中的数据与实施例13中表8的数据相比显示了海栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉当与甘油三乙酸酯混合保存时的稳定性。

表9：海栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉以酶粉和甘油三乙酸酯的混合物形式在40℃保存期间的温度稳定性。甘油三乙酸酯(100mM)和H₂O₂(100mM)在含有海栖热袍菌过水解酶(50μg蛋白/mL)和TURPINAL

SL(500ppm)的碳酸氢钠缓冲液(50mM，pH 7.2)中在25℃反应5分钟产生的PAA(ppm)。

实施例15

那不勒斯栖热袍菌海栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶 粉在以酶粉、碳酸氢钠和甘油三乙酸酯混合物形式保存时的温度稳定 性

如实施例13所述制备喷雾干燥酶粉，评估甘油三乙酸酯和碳酸氢钠混合物中喷雾干燥粉末混合物在40℃保存7周时的稳定性。将喷雾干燥酶粉(0.556g，18.0重量％蛋白)加入43.6g甘油三乙酸酯和8.4g碳酸氢钠(等级3DF(粉末)，Church & Dwight)的混合物中。所得混合物保存于40℃，并以一式两份在25℃于100mL反应体系中分析2.63g充分混合的混合物样品，此100mL反应体系含有过氧化氢(100mM)和TURPINAL

SL(500ppm)，其中所得的甘油三乙酸酯、碳酸氢钠缓冲液(pH 7.2)和蛋白质的浓度分别为100mM、50mM和50μg/mL。表10中的数据与实施例14中表9的数据相比显示，海栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉在以甘油三乙酸酯和固体碳酸氢钠混合物的形式在40℃保存5、6和7周时的稳定性与那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉只以单独甘油三乙酸酯混合物的形式在40℃保存5、6和7周时的稳定性相比得到了改善。

表10：海栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉以酶粉、碳酸氢钠和甘油三乙酸酯混合物的形式在40℃保存时的温度稳定性。甘油三乙酸酯(100mM)和H₂O₂(100mM)在含有海栖热袍菌过水解酶(50μg蛋白/mL)和TURPINAL

SL(500ppm)的碳酸氢钠缓冲液(50mM，pH 7.2)中在25℃反应5分钟产生的PAA(ppm)。

实施例16

乙酸酯或乙二醇二乙酸酯

用在0.05M含有二硫苏糖醇(1mM)的磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中的细胞沉淀物(20重量％细胞湿重)悬浮液制备了一种转化体匀浆，所述转化体可表达来自枯草芽孢杆菌ATCC31954^TM(KLP18/pSW194)的野生型过水解酶。粗匀浆经离心除去细胞碎片，在65℃下热处理30分钟生成澄清细胞提取物。离心所得混合物，将经热处理的上清液在30K MWCO(截留分子量)膜上浓缩到总溶解固体浓度为32mg/mL；经热处理的澄清细胞提取物的SDS-PAGE显示过水解酶达到至少85-90％的纯度。然后向该浓缩物中加入每克固体2.06克NaH₂PO₄和1.17克Na₂HPO₄，以使磷酸盐缓冲液与热处理细胞提取蛋白的重量比为约3∶1。用去离子水将该溶液稀释30重量％，然后使用Buchi B-290实验室喷雾干燥机喷雾干燥(入口温度180℃、出口温度70℃)；所得喷雾干燥粉末含有25.5重量％蛋白质(Bradford蛋白测定法)并且94.3重量％为干燥固体。

反应(总体积10mL)在23℃下在50mM碳酸氢钠缓冲液(初始pH 7.2)中进行，所述缓冲液含有丙二醇二乙酸酯(PGDA)或乙二醇二乙酸酯(EGDA)、过氧化氢(100mM)以及123μg/mL来自喷雾干燥大肠杆菌KLP18/pSW194(表达枯草芽孢杆菌ATCC

31954^TM野生型过水解酶)的热处理提取蛋白(如上所述制备)。每个反应条件进行对照反应以测定在不加入热处理提取蛋白的情况下通过过氧化氢化学过氧化水解甘油三乙酸酯制备的过乙酸的浓度。在反应的1、5和30分钟取样并使用Karst衍生方案(Karst等人，上文)分析样品中的过乙酸；取出反应混合物的等分试样(0.040mL)并与0.960mL的溶于水中的5mM磷酸混合；调节稀释样品的pH至小于pH4，立即终止反应。使用ULTRAFREE

MC过滤装置(30,000标称分子量(NMWL)，Millipore目录号UFC3LKT 00)以12,000rpm离心2分钟过滤所得溶液。将所得滤液的等分试样(0.100mL)转移到1.5-mL螺帽HPLC小瓶中(Agilent Technologies，Palo Alto，CA；#5182-0715)，瓶中包含0.300mL去离子水，然后加入0.100mL在乙腈中的20mM MTS(甲基对甲苯硫醚)，给小瓶拧上螺帽，将内容物短暂混合，然后在大约25℃避光孵育10分钟。然后向每个小瓶中加入0.400mL的乙腈和0.100mL的三苯基膦(TPP，40mM)乙腈溶液中，再次盖上小瓶，混合所得溶液并在大约25℃避光孵育30分钟。然后向每个小瓶中加入0.100mL的10mM N，N-二乙基间甲苯甲酰胺(DEET；HPLC外标)，并且通过HPLC分析所得溶液。在1分钟、5分钟和30分钟产生的过乙酸浓度在表11中列出。

表11：23℃下使用123μg/mL热处理提取蛋白，在采用碳酸氢钠缓冲液(50mM，初始pH 7.2)中的丙二醇二乙酸酯(PGDA)或乙二醇二乙酸酯(EGDA)以及过氧化氢(100mM)反应产生的过乙酸(PAA)浓度，所述热处理提取蛋白来自大肠杆菌KLP18/pSW194(枯草芽孢杆菌ATCC

31954^TM过水解酶)。

实施例17

使用海栖热袍菌和那不勒斯栖热袍菌野生型以及变异的过水解 酶过氧化水解丙二醇二乙酸酯或乙二醇二乙酸酯

表达那不勒斯栖热袍菌野生型过水解酶(KLP18/pSW196)、那不勒斯栖热袍菌C277S变异的过水解酶(KLP18/pSW196/C277S)、那不勒斯栖热袍菌C277T变异的过水解酶(KLP18/pSW196/C277T)、海栖热袍菌野生型过水解酶(KLP18/pSW228)、海栖热袍菌C277S变异的过水解酶(KLP18/pSW228/C277S)以及海栖热袍菌C277T变异的过水解酶(KLP18/pSW228/C277T)的转化体的细胞提取物均按照如下方式制备：将在含有二硫苏糖醇(1mM)的0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中的细胞沉淀物(20重量％细胞湿重)悬浮液两次通过工作压力为16,000psi(约110MPa)的弗氏压碎器。将裂解细胞以12,000×g离心30分钟，制得澄清细胞提取物并分析其可溶性总蛋白(Bradford测定法)。将上清液在75℃下加热20分钟，然后在冰浴中冷却2分钟。通过11,000×g离心10分钟移除沉淀的蛋白质。所得热处理提取蛋白上清液的SDS-PAGE显示CE-7酶在制剂中包含约85-90％的总蛋白。将经热处理的提取蛋白上清液冷冻于干冰中，并贮存在-80℃下备用。

第一组反应(总体积10mL)在20℃下在10mM碳酸氢钠缓冲液(初始pH 8.1)中进行，所述缓冲液含有丙二醇二乙酸酯(PGDA)或乙二醇二乙酸酯(EGDA)(100mM)、过氧化氢(100mM)以及25μg/mL热处理提取蛋白，所述提取蛋白来自以下大肠杆菌中的一种：大肠杆菌KLP18/pSW196(那不勒斯栖热袍菌野生型过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW196/C277S(那不勒斯栖热袍菌C277S变异的过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW196/C277T(那不勒斯栖热袍菌C277T变异的过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW228(海栖热袍菌野生型过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW228/C277S(海栖热袍菌C277S变异的过水解酶)、以及大肠杆菌KLP18/pSW228/C277T(海栖热袍菌C277T变异的过水解酶)(如上所述制备)。每个反应条件进行对照反应以测定在不加入提取蛋白的情况下通过过氧化氢化学过氧化水解甘油三乙酸酯制备的过乙酸的浓度。在反应的1、5和30分钟取样并且使用Karst衍生方案(Karst等人，上文)和HPLC分析方法(上文)分析样品中的过乙酸。在1分钟、5分钟和30分钟产生的过乙酸浓度在表12中列出。

表12：20℃下在碳酸氢钠缓冲液(10mM，初始pH 8.1)中使用海栖热袍菌和那不勒斯栖热袍菌野生型和变异的过水解酶反应产生的过乙酸(PAA)浓度，所述缓冲液含有丙二醇二乙酸酯(PGDA)(100mM)或乙二醇二乙酸酯(EGDA)(100mM)、过氧化氢(100mM)以及25μg/mL热处理提取蛋白。

第二组反应(总体积10mL)在20℃下在10mM碳酸氢钠缓冲液(初始pH 8.1)中进行，所述缓冲液含有丙二醇二乙酸酯(PGDA)或乙二醇二乙酸酯(EGDA)(2mM)、过氧化氢(10mM)以及10μg/mL热处理提取蛋白，所述提取蛋白来自以下大肠杆菌中的一种：大肠杆菌KLP18/pSW196(那不勒斯栖热袍菌野生型过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW196/C277S(那不勒斯栖热袍菌C277S变异的过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW196/C277T(那不勒斯栖热袍菌C277T变异的过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW228(海栖热袍菌野生型过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW228/C277S(海栖热袍菌C277S变异的过水解酶)以及大肠杆菌KLP18/pSW228/C277T(海栖热袍菌C277T变异的过水解酶)(如上所述制备)。每个反应条件进行对照反应以测定在不加入提取蛋白的情况下通过过氧化氢化学过氧化水解甘油三乙酸酯制备的过乙酸的浓度。在反应的5分钟取样并且使用Karst衍生方案(Karst等人，上文)和HPLC分析方法(上文)分析样品中的过乙酸。5分钟产生的过乙酸浓度在表13中列出。

表13：20℃下在碳酸氢钠缓冲液(10mM，初始pH 8.1)中使用海栖热袍菌和那不勒斯栖热袍菌野生型和变异的过水解酶反应产生的过乙酸(PAA)浓度，所述缓冲液含有丙二醇二乙酸酯(PGDA)(2mM)或乙二醇二乙酸酯(EGDA)(2mM)、过氧化氢(10mM)以及10μg/mL热处理提取蛋白。

Claims (24)

1.当酶存在于包含所述酶和羧酸酯的制剂中时稳定所述酶的过水解活性的方法，所述方法包括：

(a)提供一种含水制剂，所述含水制剂包含至少一种结构上归类为CE-7酶并具有过水解活性的酶、至少一种寡糖赋形剂，并任选地包含至少一种表面活性剂；

(b)喷雾干燥(a)中的含水制剂以制备酶粉，所述酶粉包含所述至少一种酶、所述至少一种寡糖赋形剂，并任选地包含所述至少一种表面活性剂，其中所述至少一种寡糖赋形剂在所述酶粉的95重量％至25重量％范围内；以及

(c)将(b)中的所述酶粉与(i)至少一种在5.5至9.5的pH范围内具有缓冲能力的缓冲剂和(ii)一种羧酸酯混合以形成制剂，其中在所述制剂中加入所述至少一种缓冲剂提高了所述至少一种酶当存在于所述制剂中时的过水解活性的稳定性。

2.权利要求1的方法，其中所述至少一种寡糖赋形剂选自麦芽糖糊精、海藻糖、木聚糖、甘露聚糖、岩藻依聚糖、半乳甘露聚糖、脱乙酰壳多糖、棉子糖、水苏糖、果胶、菊粉、果聚糖、支链型果聚糖、支链淀粉、以及它们的混合物。

3.权利要求2的方法，其中所述至少一种寡糖赋形剂为麦芽糖糊精。

4.权利要求2的方法，其中所述至少一种寡糖赋形剂为海藻糖。

5.权利要求1的方法，其中所述羧酸酯选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、以及它们的混合物。

6.权利要求5的方法，其中所述羧酸酯为甘油三乙酸酯。

7.权利要求1的方法，其中所述至少一种表面活性剂是存在的并且为聚山梨酸酯80。

8.权利要求1的方法，其中所述至少一种寡糖赋形剂具有至少1250的数均分子量和至少9000的重均分子量。

9.权利要求8的方法，其中所述至少一种寡糖赋形剂具有至少1700的数均分子量和至少15000的重均分子量。

10.权利要求1的方法，其中步骤(c)的所述制剂基本上不含水。

11.权利要求1至10中任一项的方法，其中所述至少一种缓冲剂为碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠和碳酸氢钾的混合物、磷酸钠、磷酸钾、或磷酸钠和磷酸钾的混合物。

12.权利要求11的方法，其中：

(a)所述至少一种酶包含选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：19和SEQ ID NO：20的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：19或SEQ IDNO：20氨基酸残基277选自丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸和苏氨酸，并且

(b)所述羧酸酯选自甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它们的混合物。

13.权利要求12的方法，其中所述至少一种寡糖赋形剂为麦芽糖糊精。

14.权利要求11的方法，其中：

(a)所述至少一种酶包含选自SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的氨基酸序列；

(b)所述至少一种寡糖赋形剂为麦芽糖糊精；

(c)所述至少一种缓冲剂选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、以及它们的混合物；并且

(d)所述羧酸酯为甘油三乙酸酯。

15.权利要求14的方法，其中所述至少一种缓冲剂为碳酸氢钠。

16.在多组分过酸生成系统中用作第一组分的制剂，所述制剂包含以下物质的混合物：

(a)至少一种羧酸酯，所述羧酸酯选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、甘油一丙酸酯、甘油二丙酸酯、甘油三丙酸酯、甘油一丁酸酯、甘油二丁酸酯、甘油三丁酸酯、以及它们的混合物；

(b)酶粉，所述酶粉包含至少一种结构上归类为CE-7酶并具有过水解活性的酶、至少一种寡糖赋形剂，并任选地包含至少一种表面活性剂，其中所述至少一种寡糖赋形剂在所述酶粉的95重量％至25重量％范围内；以及

(c)至少一种在5.5至9.5的pH范围内具有缓冲能力的缓冲剂；其中所述至少一种缓冲剂提高了所述至少一种酶当存在于所述制剂中时的稳定性。

17.权利要求16的制剂，其中所述至少一种寡糖赋形剂具有至少1250的数均分子量和至少9000的重均分子量。

18.消毒系统，所述消毒系统包含第一组分和第二组分，所述第一组分包含权利要求16或17的制剂，并且所述第二组分包含过氧源水溶液并任选地包含过氧化氢稳定剂。

19.衣物洗涤护理制剂，所述制剂包含第一组分和第二组分，所述第一组分包含权利要求16或17的制剂，并且所述第二组分包含过氧化氢水溶液并任选地包含过氧化氢稳定剂。

20.酶促制备过氧羧酸的方法，所述方法包括：

(a)提供一组反应组分，所述组分包含：

(1)权利要求16或17的制剂；和

(2)过氧源水溶液；以及

(b)混合所述反应组分，从而制备过氧羧酸。

21.权利要求20的方法，其中：

(a)所述至少一种酶包含选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：19和SEQ ID NO：20的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：19或SEQ IDNO：20的氨基酸残基277选自丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸和苏氨酸；

(b)所述至少一种寡糖赋形剂为麦芽糖糊精；

(c)所述至少一种缓冲剂选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠和碳酸氢钾的混合物、磷酸钠、磷酸钾、以及磷酸钠和磷酸钾的混合物；

(d)所述至少一种羧酸酯为甘油三乙酸酯；并且

(e)制备的过氧羧酸为过乙酸。

22.使用酶促产生的过氧羧酸组合物对硬质表面或无生命物体进行消毒的方法，所述方法包括：

(a)提供一组反应组分，所述组分包含：

(1)权利要求16的制剂；和

(2)过氧源水溶液；

(b)混合所述反应组分，从而制备过氧羧酸产物；

(c)任选地稀释所述过氧羧酸产物；以及

(d)使所述硬质表面或无生命物体与在步骤(b)或步骤(c)中制备的过氧羧酸接触，从而对所述表面或所述无生命物体消毒。

23.使用酶促产生的过氧羧酸组合物对衣物或纺织物进行漂白、脱色、除臭、卫生处理或消毒的方法，所述方法包括：

(a)提供一组反应组分，所述组分包含：

(1)一种混合物，所述混合物包含：

(i)权利要求16的制剂；和

(ii)羧酸酯；以及

(2)过氧源；

(b)在合适的含水反应条件下混合所述反应组分，从而形成过氧羧酸产物；

(c)任选地稀释所述过氧羧酸产物；以及

(d)使所述衣物或纺织物与在步骤(b)或步骤(c)中制备的过氧羧酸接触；

其中所述衣物或纺织物经过清洗、脱色、除臭、卫生处理、消毒、或它们的组合。

24.权利要求22或23的方法，其中：

(a)所述至少一种酶包含选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：19和SEQ ID NO：20的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：19或SEQ IDNO：20的氨基酸残基277选自丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸和苏氨酸；

(b)所述至少一种寡糖赋形剂为麦芽糖糊精；

(c)所述至少一种缓冲剂选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠和碳酸氢钾的混合物、磷酸钠、磷酸钾、以及磷酸钠和磷酸钾的混合物；

(d)所述至少一种羧酸酯为甘油三乙酸酯；并且

(e)制备的过氧羧酸为过乙酸。