CN102264894A

CN102264894A - 酶催化法过酸生成制剂

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Publication number: CN102264894A
Application number: CN2009801485810A
Authority: CN
Inventors: R·迪科西莫; A·本-巴萨; W·R·卡希尔; D·G·迪皮特罗; E·C·罕; M·S·佩恩; R·A·雷诺; R·R·佐兰兹
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2008-10-03
Filing date: 2009-10-01
Publication date: 2011-11-30
Anticipated expiration: 2029-10-01
Also published as: EP2342324A1; EP2342326B1; CA2736907C; US20100086621A1; US8148314B2; US20100086534A1; JP5777516B2; AU2009298420A1; CN102264894B; WO2010039960A1; DK2342324T3; US20110300121A1; CN102264893A; US20110306667A1; JP2012504419A; BRPI0913701A2; US8334120B2; ES2735230T3; MX2011003528A; JP2012504692A

Abstract

本文公开了用于酶法制备适用于例如消毒和/或漂白应用的过氧羧酸水溶液的多组分制剂。所述多组分过氧羧酸制剂包含粉末形式的至少一种具有过水解活性的糖酯酶家族7酶、赋形剂、缓冲剂和共溶剂、以及过氧化氢。

Description

酶催化法过酸生成制剂

相关申请的交叉引用

本专利申请要求于2008年10月3日提交的美国临时专利申请61/102,505、61/102,512、61/102,514、61/102,520、61/102,531和61/102,539的优先权，以上文献以引用方式全文并入本文。

发明领域

本发明涉及酶法过氧羧酸合成以及原位酶催化领域。具体地讲，本发明提供了一种多组分制剂，用于以酶法制备过氧羧酸的水溶液。针对以下用途，能以足够有效的浓度制备至少一种过氧羧酸：表面消毒或卫生处理、医疗器械灭菌、食品加工设备灭菌，以及适用于衣物洗涤护理应用如漂白、脱色、除臭和灭菌。

发明背景

据报道，过氧羧酸组合物是有效的抗微生物剂。针对不希望有的微生物生长，对硬质表面、肉制品、活植物组织和医疗设备进行清洁、消毒和/或卫生处理的方法已有所描述(如美国专利6,545,047、美国专利6,183,807、美国专利6,518,307、美国专利5,683,724和美国专利申请公布2003/0026846)。过氧羧酸可用于制备衣物洗涤剂所用的漂白组合物也有所报道(如美国专利3,974,082、美国专利5,296,161和美国专利5,364,554)。

过氧羧酸可通过羧酸与过氧化氢的化学反应制备(参见Organic Peroxides，Daniel Swern编辑，第1卷，第313-516页；WileyInterscience，New York，1971)。此反应通常由强无机酸如浓硫酸催化。过氧化氢与羧酸的反应是一个平衡反应，通过使用过剩浓度的过氧化物和/或羧酸或通过除去水将有利于过氧羧酸的制备。

一些过氧羧酸类消毒剂或漂白剂由过氧羧酸、过氧化氢和相应羧酸的平衡混合物构成。这些商业过氧羧酸清洁体系的一个缺点在于：处于溶液状态时过氧羧酸常常会随着时间的推移而不稳定。解决稳定性问题的一种方法是：在使用前将多种反应组分混合在一起以生成过氧羧酸，而这些组分单独放置时可长期稳定。优选地，各种反应组分容易贮存、操作相对安全，并在混合后能够快速地产生有效浓度的过氧羧酸。

克服过氧羧酸化学法制备缺点的一种方法是使用具有过水解活性的酶催化剂。授予DiCosimo等人的美国专利申请11/638,635和美国专利申请公布2008/0176783、2008/0176299和2009/0005590公开了在结构上归类为糖酯酶CE-7家族成员的酶(即先锋霉素C脱乙酰酶[CAH]和乙酰木聚糖酯酶[AXE])，糖酯酶的特征在于具有明显的过水解活性，在足以用作消毒剂和/或漂白剂够的浓度下，可将羧酸酯(在合适的过氧源存在下，如存在过氧化氢)转化为过氧羧酸。已证实，糖酯酶CE-7家族的一些成员具有足够的过水解活性，一旦将反应组分混合后，能在1分钟内由一元醇、二醇和甘油的乙酰酯生成4000至5000ppm的过乙酸，并在5分钟至30分钟内生成高达9000ppm的过乙酸(DiCosimo等人，U.S.2009/0005590)。

DiCosimo等人在各引用的专利申请公布中描述的酶法过氧羧酸生成体系可以基于双组分体系，其中在使用前将各组分贮存在单独的隔室中。通常将具有过水解活性的酶催化剂与羧酸酯底物贮存在一个隔室中，而将过氧源(通常使用过氧化氢的水溶液)贮存在第二隔室中。将两个隔室的多种反应组分混合以生成所需的过氧羧酸水溶液。

然而，多组分酶法过酸生成体系也会存在某些问题。一个问题可能是将两种组分混合后，使用的一种或多种羧酸酯底物不溶于水或部分不溶于水。某些羧酸酯底物的有限溶解性会导致至少以下三种情况，它们会影响有效地生成和得到过氧羧酸产物的能力：首先，酶催化剂/底物组分的粘度会过高，而不能与含有过氧源的第二组分有效地混合，这会降低过氧羧酸的生成速率；其次，酶催化剂/底物组分的粘度会过高，而不能以某些方式得到包含酶催化剂/底物组分与过氧源的混合物的产物，如不能通过喷雾方式得到；第三，与在水溶液中含有过氧源的第二组分混合后，酶/底物组分中底物的溶解速率过低，而不能获得令人满意的过氧羧酸生成速率。在需要按特定的比率使用含有水性过氧源的组分与含有酶催化剂/底物的组分时，羧酸酯的溶解性问题也会变得明显。就此而论，涉及在进行所需时间的反应前对具有过水解活性的酶催化剂和底物与过氧源分开贮藏的商用多组分体系仍无法用于某些应用。

使用有机共溶剂以促进混合和/或改变羧酸酯在水中的粘度也可能产生问题。无论是将酶直接悬浮在有机溶剂中时，还是使用可混溶的有机/水单相溶剂时，有机溶剂都会降低酶的活性。在两篇已发表的文献中综述了有机溶剂对酶活性和结构的影响，它们是：(a)C.Laane等人，Biotechnol.Bioeng.30：81-87(1987)；(b)Cowan，D.A.和Plant，A.，“Biocatalysis in Organic Phase Systems.”，“Biocatalysis at ExtremeTemperatures”第7章，Kelly，R.W.W.和Adams，M.编辑，Amer.Chem.Soc.Symposium Series，Oxford University Press，New York，NY，第86-107页(1992)。Cowan和Plant指出(第87页)：在有机相体系中使用log P≤2的有机溶剂来稳定胞内酶几乎没有意义。log P介于2和4之间的有机溶剂可根据酶的稳定性视情况使用，而那些log P＞4的有机溶剂一般可用于有机相体系。

上文的Cowan和Plant还指出(第91页)：溶于单相有机-水溶剂中的酶的直接暴露影响取决于溶剂浓度、溶剂/酶表面基团相互作用、以及溶剂/酶水化层相互作用。因为溶剂的log P值必须足够低，使得溶剂可完全与水相混溶以形成单相，因此，含有低log P值有机溶剂的单相有机-水溶剂通常会对酶的稳定性产生负面影响(在低有机溶剂浓度应用中除外)。

当贮存于羧酸酯底物中或羧酸酯与一种或多种分配系数(以log P值度量，即底物在辛醇和水之间的分配系数的对数，P＝[溶质]_辛醇/[溶质]_水)为2或更小的共溶剂的混合物中时，具有过水解活性的CE-7酶的贮存稳定性是个问题。DiCosimo等人在U.S.2009/0005590中描述的若干种有机酯底物的log P值小于2。例如，据报道甘油三乙酸酯的log P值为0.25(Y.M.Gunning等人，J.Agric.Food Chem.48：395-399(2000))，其类似于乙醇(log P-0.26)和异丙醇(log P 0.15)(Cowan和Plant)；因此在甘油三乙酸酯中贮存酶粉预计会导致不可接受的酶活性丧失，使用log P＜2的附加共溶剂也会一样，这些共溶剂如环己酮，log P＝0.94(Cowan和Plant)；1，2-丙二醇，log P＝-1.41(Gunning等人)；1，3-丙二醇，log P＝-1.3(S-J.Kuo等人，J.Am.OilChem.Soc.73：1427-1433(1996))；二甘醇丁醚，log P＝0.56(N.Funasaki等人，J.Phys.Chem.88：5786-5790(1984))；三甘醇，log P＝-1.75(L.Braeken等人，ChemPhysChem 6：1606-1612(2005))。

代理人档案号为CL4205 US NA、标题为“ENZYMATIC PERACIDPRODUCTION USING A COSOLVENT”的共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请描述了利用log P值为约2或更小的有机共溶剂，在不引起酶催化剂的过水解活性显著丧失的情况下，控制含底物组分的粘度以及增加含水反应混合物中底物的溶解度。

代理人档案号为CL4386 US NA和CL4387 US NA、标题均为“STABILIZATION OF PERHYDROLASES”的共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请描述了：当酶粉存在于多组分过氧羧酸生成体系的羧酸酯底物组分中时，使酶粉的过水解活性稳定的多种方法。

代理人档案号为CL4392 US NA的共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请(“IMPROVED PERHYDROLASES FORENZYMATIC PERACID GENERATION”)描述了具有改善的过水解活性的变体CE-7酶。

需要解决的问题是提供多组分过氧羧酸生成制剂，其包含多种成分的组合，这些成分的特征在于：CE-7催化剂的过水解活性具有增强的贮存稳定性，和/或含羧酸酯底物的组分具有改进的混合和/或粘度特性。在另一个实施方案中，多组分过氧羧酸生成制剂优选地包含具有改善的过水解活性的变体CE-7酶。

发明概述

通过提供特征在于具有增强的贮存稳定性和/或改善的混合特性的多组分制剂，已解决了上述问题。

在一个实施方案中，提供了用于生成过氧羧酸的多组分制剂，其包含：

(a)第一组分，所述第一组分包含：

(i)酶粉，所述酶粉包含：

(1)至少一种具有过水解活性的酶催化剂，其中所述酶催化剂包含具有糖酯酶家族7(CE-7)特征基序的酶，用CLUSTALW将所述特征基序与SEQ ID NO：1比对，所述特征基序包含：

(A)与SEQ ID NO：1的118至120对应的氨基酸位置处的RGQ基序；

(B)与SEQ ID NO：1的179至183对应的氨基酸位置处的GXSQG基序；以及

(C)与SEQ ID NO：1的298至299对应的氨基酸位置处的HE基序；

所述酶包含与SEQ ID NO：1至少30％的氨基酸同一性；以及

(2)至少一种赋形剂；

(ii)羧酸酯底物，所述羧酸酯底物选自：

(1)一种或多种具有下列结构的酯：

[X]_mR₅

其中

X为式R₆C(O)O的酯基；

R₆为任选地由羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链、支链或环状烃基部分，其中R₆任选地包含一个或多个醚键，其中R₆为C2至C7；

R₅为任选地由羟基取代的C1至C6直链、支链、或环状烃基部分，其中R₅中的每个碳原子各自包含不超过一个羟基或不超过一个酯基，并且其中R₅任选地包含一个或多个醚键；

m为1至R₅中的碳原子数，

在25℃下，所述一种或多种酯在水中具有至少5ppm的溶解度；

(2)一种或多种具有下列结构的甘油酯：

其中R₁为任选地由羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；

(3)一种或多种下式的酯

其中R₁为任选地由羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链或支链烷基，并且R₂为C1至C10直链或支链烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH₂CH₂O)_n、或(CH₂CH(CH₃)-O)_nH，且n为1至10；

(4)一种或多种乙酰化单糖、乙酰化二糖、或乙酰化多糖；以及

(5)(1)至(4)的任意组合；

其中第一组分中羧酸酯底物的量被设计成在通过混合第一和第二组分而形成的反应制剂中提供0.5重量％至10重量％的终浓度；

(iii)选自以下的缓冲剂：碳酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、甲基磷酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐和马来酸盐；

(iv)选自以下的共溶剂：三丙二醇甲醚、二丙二醇甲醚、丙二醇甲醚、二乙二醇丁醚、二丙二醇、三乙二醇、1，2-丙二醇、N-乙基-2-吡咯烷酮、异丙醇、乙醇、乳酸乙酯、1，3-丙二醇、以及它们的任意组合；以及

(v)任选地，至少一种表面活性剂；以及

(b)第二组分，所述第二组分包含水、过氧化氢和过氧化氢稳定剂。

在另一个实施方案中，提供了用于生成过氧羧酸的双组分制剂，其包含：

(a)第一组分，所述第一组分包含：

(i)酶粉；所述酶粉包含：

(1)至少一种具有过水解活性的CE-7酶，其中所述至少一种CE-7酶含有：选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：19和SEQ IDNO：20的氨基酸序列或基本上类似于SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的氨基酸序列；以及

(2)至少一种赋形剂；

(ii)羧酸酯底物，所述羧酸酯底物选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它们的混合物；其中，第一组分中羧酸酯底物的量被设计成在通过混合第一和第二组分而形成的反应制剂中提供0.5重量％至10重量％的终浓度；

(iii)缓冲剂，所述缓冲剂选自碳酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、甲基磷酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐和马来酸盐；

(iv)共溶剂，所述共溶剂选自三丙二醇甲醚、二丙二醇甲醚、丙二醇甲醚、二乙二醇丁醚、二丙二醇、三乙二醇、1，2-丙二醇、N-乙基-2-吡咯烷酮、异丙醇、乙醇、乳酸乙酯、1，3-丙二醇、以及它们的任意组合；以及

(v)任选地，至少一种表面活性剂；以及

(a)含有以下物质的制剂的第一组分：

(i)作为酶粉的约0.1重量％至约5重量％的所述第一组分，所述第一组分包含：

(1)约20重量％至约33重量％的酶粉，所述酶粉含有至少一种CE-7酶并具有过水解活性，其中所述至少一种CE-7酶包含选自SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的氨基酸序列；

(2)约67重量％至约80重量％的酶粉，所述酶粉含有数均分子量为至少约1250以及重均分子量为至少约9000的至少一种寡糖赋形剂；其中所述至少一种寡糖赋形剂选自：麦芽糖糊精、木聚糖、甘露聚糖、岩藻依聚糖、半乳甘露聚糖、脱乙酰壳多糖、棉子糖、水苏糖、果胶、胰岛素、左聚糖(levan)、支链型果聚糖(graminan)、支链淀粉、以及它们的混合物；

(ii)羧酸酯底物，所述羧酸酯底物选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它们的混合物；其中，第一组分中羧酸酯底物的量被设计成在通过混合两反应组分而形成的反应制剂中提供0.5重量％至10重量％的终浓度；

(iii)约0.1重量％至约10重量％的第一组分，所述第一组分包含选自以下的缓冲剂：碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠和碳酸氢钾的混合物、磷酸钠、磷酸钾、以及磷酸钠和磷酸钾的混合物；

(iv)最多80重量％的第一组分，所述第一组分包含log P值小于2的共溶剂，所述共溶剂选自：三丙二醇甲醚、二丙二醇甲醚、丙二醇甲醚、二乙二醇丁醚、二丙二醇、三乙二醇、1，2-丙二醇、N-乙基-2-吡咯烷酮、异丙醇、乙醇、乳酸乙酯、1，3-丙二醇、以及它们的任意组合；以及

(v)至少一种表面活性剂，所述表面活性剂基于酶粉中存在的总蛋白的重量在约0.1重量％至约5重量％的范围内；以及

(b)第二组分，所述第二组分包含

(i)至少70重量％的水；

(ii)过氧化氢，其量在反应制剂中提供0.33重量％至约30重量％范围内的过氧化氢终浓度；以及

(iii)约0.01重量％至约1％的过氧化氢稳定剂；

其中将所述第一和所述第二反应组分混合生成过乙酸的含水制剂。

在一个方面，酶粉通过喷雾干燥形成。

在另一方面，赋形剂的含量在酶粉(优选喷雾干燥法酶粉)的约95重量％至约25重量％的范围内。在一个优选的方面，赋形剂为寡糖赋形剂。在另一个优选的方面，寡糖赋形剂具有至少约1250的数均分子量和至少约9000的重均分子量。在另一方面，赋形剂为麦芽糖糊精。

在一个优选的方面，缓冲剂选自：碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠和碳酸氢钾的混合物、磷酸钠、磷酸钾、以及磷酸钠和磷酸钾的混合物。

在本发明的另一方面，提供了一种对表面、衣物或纺织物制品进行漂白、除臭、去污或消毒的方法，所述方法包括

(a)提供上列制剂；

(b)混合第一组分和第二组分从而制备含有过氧羧酸的反应制剂；以及

(c)将反应制剂应用于表面、衣物或纺织物制品上，以进行漂白、脱色、除臭、卫生处理、消毒、或它们的组合。

附图简述

图1a和1b示出了使用双室喷雾瓶根据本发明制备过氧羧酸的示例性系统。参见图1a，一般性喷雾瓶系统包括：含有第一组分[2]的第一室[1]和含有第二组分[4]的第二室[3]。输送管[5]用于将第一和第二组分传输至流量控制元件[6]和[7]，后者优选地具有单个调节控制旋钮[8]，它允许两种组分以所需的体积比或重量比混合。图1a示出了泵[9]，它用于泵送和混合两种液体组分，再从喷雾嘴[10]中喷出。图1b类似于图1a，但不同的是泵[9]和喷嘴[10]被构造成将第一和第二组分的混合延迟在喷雾嘴处或目标表面上进行。

图2a和2b示出了利用具有多个隔室的制备过氧羧酸的示例性系统。对于形成多室系统的外部屏障[11]和/或将第一组分[2]与第二组分[4]分开的内室屏障[12]的阻挡材料，将其设计成易于降解/破碎(通过机械、化学和/或热作用)，以生成含水过氧羧酸混合物。参见图2a，该递送系统包括：可溶性包装和内室，其中可溶性包装包括可破碎的外部屏障[11]，内室具有内室屏障[12]并包含第一组分[2]，而第一组分被第二组分[4]包围。内室屏障[12]被设计为可破碎和/或可降解的，以混合两种组分而生成所需的过氧羧酸。图2b示出了具有平行分开的双室的可溶性包。如图2b所示，“双室包”包括可溶解和/或可破碎的外部屏障[11]以及第一隔室[1]和第二隔室[3]，它们分别包含组分[2]和[4]。第一和第二隔室以屏障[13]分开。

图3a和图3b示出了利用多室、柔性挤压包/瓶根据本发明制备过氧羧酸的示例性系统。参见图3a，手压变形容器[16]包括非刚性壁[14]。容器[16]中是含有第一组分的可手压破裂/破碎的内室[15]，其中内室[15]被第二组分[4]包围。内室[15]的破裂可让组分混合并生成活性物质。如图3a所示，手压变形容器(如塑料挤压瓶)还包括具有可移除的塞子[17]的定向喷口。图3b示出了非刚性容器[16]，其包括含有第一组分[2]的第一隔室[1]和含有第二组分[4]的第二隔室[3]，其中两个隔室以平行构型分开。在图3b中，也示出了手压变形瓶具有定向喷口[18]和可移除的塞子[17]，其中两种组分在瓶外混合。

生物序列简述

下面的序列遵循37 C.F.R.§§1.821-1.825(“Requirements forPatent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino AcidSequence Disclosures-the Sequence Rules”)，并且符合世界知识产权组织(World Intellectual Property Organization，WIPO)标准ST.25(1998)、欧洲专利公约(European Patent Convention，EPC)序列表要求、专利合作条约(Patent Cooperation Treaty，PCT)细则5.2和49.5(a-bis)、以及行政指令(Administrative Instructions)第208节和附录C。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中所列出的规定。

SEQ ID NO：1是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC

31954^TM先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：2是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)ATCC

6633^TM先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：3是地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)ATCC

14580^TM先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：4是短小芽孢杆菌(B.pumilus)PS213乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：5是热纤梭菌(Clostridium thermocellum)ATCC

27405^TM乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：6是那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：7是海栖热袍菌(Thermotoga maritima)MSB8乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：8是热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium sp.)JW/SLYS485乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：9是芽孢杆菌属(Bacillus sp.)NRRL B-14911先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。应当指出的是，在GENBANK

登录号ZP_01168674中报告的编码芽孢杆菌属NRRL B-14911先锋霉素C脱乙酰酶的核酸序列似乎会编码在N端增加的15个氨基酸，根据与其他先锋霉素C脱乙酰酶的序列比对，以及根据报告长度(340个氨基酸)与其他CAH酶的观测长度(通常为318至325个氨基酸；参见代理人档案号为CL4205US NA、标题为“ENZYMATIC PERACIDPRODUCTION USING A COSOLVENT”的共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请；其以引用方式并入本文)的比较，此核酸序列可能不正确。因此，本文报道的芽孢杆菌属NRRL B-14911先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列与GENBANK

登录号ZP_01168674下报道的不同，其不含N-端的15个氨基酸。

SEQ ID NO：10是耐盐嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)C-125先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：11是克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)KSM-K16先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：12是枯草芽孢杆菌ATCC

29233^TM先锋霉素C脱乙酰酶(CAH)的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：13是Thermoanearobacterium saccharolyticum先锋霉素C脱乙酰酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：14是Thermotoga lettingae乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：15是Thermotoga petrophila乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：16是栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2第一种乙酰木聚糖酯酶(本文称为“RQ2(a)”)的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：17是栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2第二种乙酰木聚糖酯酶(本文称为“RQ2(b)”)的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：18是含SEQ ID NO：1的118至299位氨基酸残基区域的氨基酸序列。

SEQ ID NO：19是那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，见代理人档案号为CL4392US NA、标题为“IMPROVEDPERHYDROLASES FOR ENZYMATIC PERACID GENERATION”的共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请(全文以引用方式并入本文)，其中第277位的Xaa残基为Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：20是海栖热袍菌MSB8乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，见代理人档案号为CL4392US NA的共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请，其中第277位的Xaa残基为Ala、Val、Ser、或Thr。

SEQ ID NO：21是Thermotoga lettingae乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，见代理人档案号为CL4392 US NA的共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请，其中第277位的Xaa残基为Ala、Val、Ser或Thr。

SEQ ID NO：22是Thermotoga petrophila乙酰木聚糖酯酶变体的推导氨基酸序列，见代理人档案号为CL4392 US NA的共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请，其中第277位的Xaa残基为Ala、Val、Ser或Thr。

SEQ ID NO：23是栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2乙酰木聚糖酯酶变体(衍生自“RQ2(a)”)的推导氨基酸序列，见代理人档案号为CL4392 US NA的共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请，其中第277位的Xaa残基为Ala、Val、Ser或Thr。

SEQ ID NO：24是栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2乙酰木聚糖酯酶变体(衍生自“RQ2(b)”)的推导氨基酸序列，见代理人档案号为CL4392 US NA的共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请，其中第278位的Xaa残基为Ala、Val、Ser或Thr。

SEQ ID NO：25是热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium sp.)JW/SLYS485乙酰木聚糖酯酶的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：26是卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)的卡那霉素抗性基因(kan)的编码区。

SEQ ID NO：27是含卡那霉素抗性基因的质粒pKD13。

SEQ ID NO：28是用于从质粒pKD13克隆katG的正向引物。

SEQ ID NO：29是用于从质粒pKD13克隆katG的反向引物。

SEQ ID NO：30是使用SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29的引物从质粒pKD13扩增katG得到的PCR产物。

SEQ ID NO：31是过氧化氢酶-过氧化物酶基因(katG)的编码区。

SEQ ID NO：32是katG的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：33是含有λ-Red重组酶基因的质粒pKD46。

SEQ ID NO：34是用于确认katG中断的正向引物。

SEQ ID NO：35是用于确认katG中断的反向引物。

SEQ ID NO：36是含有FLP重组酶的温敏质粒pCP20。

SEQ ID NO：37是用于从质粒pKD13克隆katE的正向引物。

SEQ ID NO：38是用于从质粒pKD13克隆katE的反向引物。

SEQ ID NO：39是使用SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的引物从质粒pKD13扩增katE得到的PCR产物。

SEQ ID NO：40是过氧化氢酶HPII基因(katE)的编码区。

SEQ ID NO：41是katE的推导氨基酸序列。

SEQ ID NO：42是用于确认katE中断的正向引物。

SEQ ID NO：43是用于确认katE中断的反向引物。

SEQ ID NO：44是编码那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶的基因的编码区，如在GENBANK

(登录号AE000512)中报告。

SEQ ID NO：45是用于扩增那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶基因的正向引物。

SEQ ID NO：46是用于扩增那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶基因的反向引物。

SEQ ID NO：47是使用SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46的引物扩增乙酰木聚糖酯酶得到的PCR产物。

SEQ ID NO：48是编码海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶的基因，如在GENBANK

(登录号NP_227893.1)中报告。

SEQ ID NO：49是用于扩增海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶基因的正向引物。

SEQ ID NO：50是用于扩增海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶基因的反向引物。

SEQ ID NO：51是使用SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50的引物扩增乙酰木聚糖酯酶得到的PCR产物。

SEQ ID NO：52和53是实例25中所述的正向和反向引物。

SEQ NO：54是通过SEQ ID NO：52和53扩增得到的核酸产物的核酸序列，其用于制备质粒pSW207。SEQ ID NO：55和56是实例25中所述的正向和反向引物。

SEQ NO：57是密码子优化的海栖热袍菌编码序列，用于制备质粒pSW228。

SEQ ID NO 58至65是用于制备实例26中海栖热袍菌变体的编码序列的正向和反向引物。

发明详述

在本公开中，使用了大量的术语和缩写。除非另外特别说明，将采用下述定义。

如本文所用，在本发明的元件或组分之前的词语“一个”、“一种”旨在表明元件或组分的实例(即出现的事物)数量为非限制性的。因此，应将“一个”和“一种”理解为包括一个(种)或至少一个(种)，并且元件或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。

如本文所用，术语“包含”意指如权利要求中提及的所述特征、整数、步骤、或组分的存在，但它不预先排除一种或多种其他特征、整数、步骤、组分或其组的存在或添加。术语“包含”旨在包括由术语“基本上由...组成”和“由...组成”涵盖的实施方案。类似地，术语“基本上由...组成”旨在包括由术语“由...组成”涵盖的实施方案。

如本文所用，修饰成分或反应物的量使用的术语“约”是指可以通过例如以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于制备浓缩物或使用溶液的一般测量和液体处理操作；这些操作中非故意的误差；用于制备组合物或执行方法的成分的制造、来源或纯度中的差异；等等。术语“约”还包括因特定起始混合物所产生的组合物的不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语“约”来修饰，权利要求都包括量的等同量。

当存在时，所有的范围都包括端值以及其中的组合。例如，当列出范围“1至5”时，所列范围应视为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等等。

如本文所用，术语“底物”、“合适的底物”、以及“羧酸酯底物”可互换地专指：

(a)具有以下结构的一种或多种酯

[X]_mR₅

其中

X为式R₆C(O)O的酯基；

m为1至R₅中的碳原子数，

在25℃下，所述一种或多种酯在水中具有至少5ppm的溶解度；或者

(b)具有以下结构的一种或多种甘油酯

其中R₁为任选地由羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链或支链烷基，并且R₃和R₄各自为H或R₁C(O)；或者

(c)具有下式的一种或多种酯

其中R₁为任选地由羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链或支链烷基，并且R₂为C1至C10直链或支链烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH₂CH₂O)_n、或(CH₂CH(CH₃)-O)_nH，且n为1至10；或者

(d)一种或多种乙酰化单糖、乙酰化二糖、或乙酰化多糖；或者

(e)(a)至(d)的任意组合。

所述羧酸酯底物的实例可包括甘油一乙酸酯，甘油三乙酸酯，甘油一丙酸酯，甘油二丙酸酯，甘油三丙酸酯，甘油一丁酸酯，甘油二丁酸酯，甘油三丁酸酯，葡萄糖五乙酸酯，木糖四乙酸酯，乙酰化木聚糖，乙酰化木聚糖片段，β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯，三-O-乙酰基-D-半乳醛，三-O-乙酰基-葡萄烯糖，丙二醇二乙酸酯，乙二醇二乙酸酯，1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6-己二醇的单酯或二酯，或它们的任何组合。

如本文所用，术语“过酸”与过氧酸(peroxyacid)、过氧羧酸(peroxycarboxylic acid)、过氧酸(peroxy acid)、过羧酸(percarboxylicacid)和过氧性酸(peroxoic acid)同义。

如本文所用，术语“过乙酸”缩写为“PAA”，并与过氧乙酸、乙过氧酸(ethaneperoxoic acid)以及CAS登记号79-21-0的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油一乙酸酯”与甘油单乙酸酯、甘油一醋酸酯和甘油单醋酸酯同义。

如本文所用，术语“甘油二乙酸酯”与二乙酸甘油酯、甘油二醋酸酯、二醋酸甘油酯以及CAS登记号25395-31-7的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油三乙酸酯”与三乙酸甘油酯、三醋酸甘油酯、甘油三醋酸酯、1，2，3-三乙酰氧基丙烷、1，2，3-丙三醇三乙酸酯以及CAS登记号102-76-1的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油一丁酸酯”与一丁酸甘油酯、甘油单丁酸酯和一丁酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油二丁酸酯”与二丁酸甘油酯和二丁酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油三丁酸酯”与三丁酸甘油酯、1，2，3-三丁酰基甘油以及CAS登记号60-01-5的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“甘油一丙酸酯”与一丙酸甘油酯、甘油单丙酸酯和一丙酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油二丙酸酯”与二丙酸甘油酯和二丙酸甘油基酯同义。

如本文所用，术语“甘油三丙酸酯”与三丙酸甘油基酯、三丙酸甘油酯、1，2，3-三丙酰基甘油以及CAS登记号139-45-7的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“乙酸乙酯”与醋酸乙酯、乙酰氧基乙烷、乙酸乙基酯、醋酸乙基酯、乙基乙酸酯以及CAS登记号141-78-6的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“乳酸乙酯”与乳酸乙基酯以及CAS登记号97-64-3的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“乙酰化糖”和“乙酰化多糖”是指包含至少一个乙酰基的单糖、二糖和多糖。实例包括但不限于葡萄糖五乙酸酯、木糖四乙酸酯、乙酰化木聚糖、乙酰化木聚糖片段、β-D-呋喃核糖-1，2，3，5-四乙酸酯、三-O-乙酰基-D-半乳醛、和三-O-乙酰基-葡萄烯糖。

如本文所用，术语“烃基”、“烃基基团”和“烃基部分”意指直链、支链或环状排列的碳原子，其中碳原子通过碳-碳单键、双键、或三键和/或醚键连接并且氢原子被相应取代。此类烃基基团可以是脂族的和/或芳族的。烃基基团的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丙基、环丁基、戊基、环戊基、甲基环戊基、己基、环己基、苄基和苯基。在一个优选的实施方案中，烃基部分为直链、支链或环状排列的碳原子，其中碳原子通过碳-碳单键和/或醚键连接且氢原子被相应取代。

如本文所用，术语1，2-乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，2-丁二醇、1，3-丁二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇、1，2-戊二醇、2，5-戊二醇、1，6-戊二醇、1，2-己二醇、2，5-己二醇、1，6-己二醇、以及它们的混合物的“单酯”和“二酯”是指：所述化合物包含由式RC(O)O表示的至少一个酯基，其中R为C1至C7直链烃基部分。在一个实施方案中，羧酸酯底物选自：丙二醇二乙酸酯(PGDA)、乙二醇二乙酸酯(EDGA)、以及它们的混合物。

如本文所用，术语“丙二醇二乙酸酯”与1，2-二乙酰氧基丙烷、丙二醇二醋酸酯、1，2-丙二醇二乙酸酯以及CAS登记号623-84-7的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“乙二醇二乙酸酯”与1，2-二乙酰氧基乙烷、乙二醇二醋酸酯、二醋酸乙二酯以及CAS登记号111-55-7的所有其他同义词同义。

如本文所用，术语“合适的酶促反应混合物”、“适于原位生成过氧羧酸的组分”、“合适的反应组分”、“合适的含水反应混合物”和“反应混合物”是指反应物和酶催化剂在其中发生接触的材料和水。本文提供了合适的含水反应混合物的组分，并且本领域技术人员应当理解适于本发明方法的组分变化范围。在一个实施方案中，合适的酶促反应混合物在反应组分混合后原位生成过氧羧酸。就此而论，反应组分可以作为其中反应组分在使用前仍保持分开的多组分体系提供。用于使多种活性组分分开与混合的系统和装置的设计是本领域已知的，并且一般将取决于各反应组分的物理形式。例如，多活性流体(液-液)系统通常使用多室分配瓶或两相系统(如美国专利申请公布2005/0139608、美国专利5,398,846、美国专利5,624,634、美国专利6,391,840、欧洲专利0807156B1、美国专利申请公布2005/0008526和PCT公开WO 00/61713)，例如存在于某些漂白应用中，其中所需的漂白剂在将反应流体混合后制成。用于生成过氧羧酸的其他形式的多组分系统可包括但不限于，设计用于一种或多种固体组分或固-液组分组合的那些，例如粉末(如美国专利5,116,575)、多层片(如美国专利6,210,639)、具有多个隔室的水溶性包(如美国专利6,995,125)和加水后发生反应的固体附聚物(如美国专利6,319,888)。

在另一个实施方案中，第一组分中的羧酸酯选自：甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯以及它们的组合。在另一个实施方案中，第一组分中的羧酸酯为乙酰化糖类。在另一个实施方案中，第一组分中的酶催化剂为微粒固体。在另一个实施方案中，第一反应组分为固体片或粉末。

如本文所用，将术语“过水解(perhydrolysis)”定义为所选的底物与过氧化物反应形成过氧羧酸。通常，在催化剂存在下，让无机过氧化物与所选底物反应以生成过氧羧酸。如本文所用，术语“化学过水解”包括其中将底物(过氧羧酸的前体)与过氧化氢源组合的过水解反应，其中在不存在酶催化剂的情况下形成过氧羧酸。

如本文所用，术语“过水解酶活性”是指每单位质量(例如毫克)的蛋白、细胞干重或固定化催化剂重量所具有的催化剂活性。

如本文所用，将“一个酶活性单位”或“一个活性单位”或“U”定义为：在指定的温度下，每分钟产生1μmol过氧羧酸产物所需的过水解酶活性的量。

如本文所用，术语“酶催化剂”和“过水解酶催化剂”是指包含具有过水解活性的酶的催化剂，并且其形式可以是完整的微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物的一种或多种细胞组分、部分纯化的酶、或纯化的酶。酶催化剂也可被化学改性(如通过聚乙二醇化作用，或与交联试剂反应)。还可以使用本领域技术人员熟知的方法将过水解酶催化剂固定到可溶性或不溶性载体上；参见例如：Immobilization of Enzymes and Cells，Gordon F.Bickerstaff编辑；Humana Press，Totowa，NJ，USA，1997。如本文所述，具有过水解活性的本发明的所有酶在结构上都是酶的糖酯酶家族7(CE-7家族)的成员(参见Coutinho，P.M.、Henrissat，B.，“Carbohydrate-active enzymes：an integrated database approach”，见于“Recent Advances inCarbohydrate Bioengineering”，H.J.Gilbert、G.Davies、B.Henrissat和B.Svensson编辑，The Royal Society of Chemistry，Cambridge，第3-12页，1999)。当与过氧源组合时，已证实酶的CE-7家族尤其能有效地由多种羧酸酯底物制备过氧羧酸(授予DiCosimo等人的WO2007/070609以及美国专利申请公布2008/0176299、2008/176783和2009/0005590；它们均以引用方式并入本文)。

CE-7家族的成员包括先锋霉素C脱乙酰酶(CAH，E.C.3.1.1.41)和乙酰木聚糖酯酶(AXE，E.C.3.1.1.72)。CE-7酯酶家族的成员共有一种保守的特征基序(Vincent等人，J.Mol.Biol.，330：593-606(2003))。具有CE-7特征基序和/或基本上类似结构的过水解酶都适用于本发明。用于鉴定基本上类似的生物分子的方法在本领域为人们所熟知(如序列比对方案、核酸杂交和/或保守特征基序的存在)。在一个方面，过水解酶包括含有CE-7特征基序的酶，并与本文提供的序列之一具有至少30％、优选至少33％、更优选至少40％、甚至更优选至少42％、甚至更优选至少50％、甚至更优选至少60％、甚至更优选至少70％、甚至更优选至少80％、甚至更优选至少90％、以及最优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的氨基酸同一性。

如本文所用，术语“先锋霉素C脱乙酰酶”和“先锋霉素C乙酰基水解酶”是指催化先锋霉素类例如先锋霉素C和7-氨基头孢烷酸脱乙酰化的酶(E.C.3.1.1.41)(Mitsushima等人，(1995)Appl.Env.Microbiol.61(6)：2224-2229)。如本文所述，提供了具有明显的过水解活性的若干种先锋霉素C脱乙酰酶。

如本文所用，“乙酰木聚糖酯酶”是指催化乙酰化木聚糖和其他乙酰化多糖脱乙酰化的酶(E.C.3.1.1.72，AXE)。如本文所述，提供了具有明显过水解活性的归类为乙酰木聚糖酯酶的若干种酶。

如本文所用，术语“枯草芽孢杆菌ATCC31954^TM”是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的一种细菌细胞，其国际保藏登录号为ATCC

31954^TM。据报道，枯草芽孢杆菌ATCC31954^TM具有酯水解酶(“diacetinase”)活性，能够水解具有2至8个碳酰基的甘油酯，特别是甘油二乙酸酯(美国专利4,444,886，其全文以引用方式并入本文)。如本文所述，已从枯草芽孢杆菌ATCC

31954^TM中分离出了具有明显过水解酶活性的酶，并以SEQ ID NO：1提供。分离出的酶的氨基酸序列与GENBANk

登录号BAA01729.1(Mitsushima等人，同上)提供的先锋霉素C脱乙酰酶具有100％的氨基酸同一性。

如本文所用，术语“枯草芽孢杆菌ATCC

29233^TM”是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的枯草芽孢杆菌菌株，其国际保藏登录号为ATCC

29233^TM。如本文所述，已从枯草芽孢杆菌ATCC

29233^TM中分离出了具有明显过水解酶活性的酶且进行了测序，并以SEQ ID NO：12提供。

如本文所用，术语“热纤梭菌ATCC

27405^TM”是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的热纤梭菌菌株，其国际保藏登录号为ATCC

27405^TM。来自热纤梭菌ATCC

27405^TM并具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：5提供。

如本文所用，术语“枯草芽孢杆菌ATCC

6633^TM”是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的一种细菌细胞，其国际保藏登录号为ATCC

6633^TM。据报道，枯草芽孢杆菌ATCC6633^TM具有先锋霉素乙酰水解酶活性(美国专利6,465,233)。来自枯草芽孢杆菌ATCC6633^TM并具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：2提供。

如本文所用，术语“地衣芽孢杆菌ATCC

14580^TM”是指保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)的一种细菌细胞，其国际保藏登录号为ATCC

14580^TM。据报道，地衣芽孢杆菌ATCC14580^TM具有先锋霉素乙酰水解酶活性。来自枯草芽孢杆菌ATCC

14580^TM并具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：3提供。

如本文所用，术语“短小芽孢杆菌PS213”是指，据报道称其具有乙酰木聚糖酯酶活性的一种细菌细胞(GENBANKAJ249957)。来自短小芽孢杆菌PS213并具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列以SEQID NO：4提供。

如本文所用，术语“那不勒斯栖热袍菌”是指，据报道称其具有乙酰木聚糖酯酶活性的那不勒斯栖热袍菌菌株(GENBANK

AAB70869)。来自那不勒斯栖热袍菌并具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：6提供。

如本文所用，术语“海栖热袍菌MSB8”是指，据报道称其具有乙酰木聚糖酯酶活性的一种细菌细胞(GENBANK

NP_227893.1)。来自海栖热袍菌MSB8并具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列以SEQID NO：7提供。

如本文所用，术语“克劳氏芽孢杆菌KSM-K16”是指，据报道称其具有先锋霉素C脱乙酰酶活性的一种细菌细胞(GENBANK

YP_175265)。来自克劳氏芽孢杆菌KSM-K16并具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：11提供。

如本文所用，术语“Thermoanearobacterium saccharolyticum”是指，据报道称其具有乙酰木聚糖酯酶活性的一种细菌菌株(GENBANKS41858)。来自Thermoanearobacterium saccharolyticum并具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列以SEQ ID NO：13提供。

如本文所用，术语“Thermotoga lettingae”是指，据报道称其具有乙酰木聚糖酯酶活性的一种细菌细胞(GENBANK

CP000812)。来自Thermotoga lettingae并具有过水解酶活性的酶的推导氨基酸序列以SEQ ID NO：14提供。

如本文所用，术语“Thermotoga petrophila”是指，据报道称其具有乙酰木聚糖酯酶活性的一种细菌细胞(GENBANKCP000702)。来自Thermotoga petrophila并具有过水解酶活性的酶的推导氨基酸序列以SEQ ID NO：15提供。

如本文所用，术语“栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2”是指，据报道称其具有乙酰木聚糖酯酶活性的一种细菌细胞(GENBANK

CP000969)。已从栖热袍菌属(Thermotoga sp.)RQ2中鉴定出两种不同的乙酰木聚糖酯酶，本文称之为“RQ2(a)”(推导氨基酸序列以SEQID NO：16提供)和“RQ2(b)”(推导氨基酸序列以SEQ ID NO：17提供)。

如本文所用，“分离的核酸分子”、“分离的多核苷酸”和“分离的核酸片段”将可以互换使用，并指单链或双链RNA或DNA的聚合物，任选地含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离型核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个片段构成。

术语“氨基酸”是指蛋白质或多肽的基本化学结构单元。在本文中使用下列缩写来表示具体的氨基酸：

如本文所用，“基本上类似”是指下述核酸分子，其中一个或多个核苷酸碱基的改变导致一个或多个氨基酸的增加、置换、或缺失，但不影响DNA序列编码蛋白的功能性质(即过水解活性)。如本文所用，“基本上类似”也指下述酶，其具有的氨基酸序列至少30％、优选地至少33％、更优选地至少40％、更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、甚至更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％，甚至还更优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与本文报道的序列一致，其中所得的酶保留了本发明的功能性质(即过水解活性)。“基本上类似”还可以指核酸分子编码的具有过水解活性的酶，所述核酸分子能在严格条件下与本文报道的核酸分子杂交。因此，应当理解，本发明不仅仅涵盖特定的示例性序列。

例如，在本领域中熟知的是，导致在给定位点产生化学等价的氨基酸但不影响编码蛋白的功能性质的基因改变是常见的。出于本发明的目的，将置换定义为以下五组之一中的互换：

1.小的脂族、非极性残基或微极性残基：Ala、Ser、Thr(Pro，Gly)；

2.极性、带负电的残基和它们的酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；

3.极性、带正电的残基：His、Arg、Lys；

4.大的脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；以及

5.大的芳族残基：Phe、Tyr和Trp。

因此，氨基酸中丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸、或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电的残基置换为另一个带负电的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电的残基替换为另一个带正电的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变预计也可以产生功能上等价的产物。在许多情况下，导致蛋白分子的N-端和C-端部分改变的核苷酸变化也预计不会改变蛋白的活性。

所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定编码产物生物活性的保留情况。此外，技术人员将认识到本发明涵盖了基本上类似的序列。在一个实施方案中，将基本上类似的序列定义为它们在严格条件下(0.1X SSC、0.1％SDS、65℃处理，再用2X SSC、0.1％SDS洗涤，最后用0.1X SSC、0.1％SDS、65℃处理)能够与本文的示例性序列杂交。

如本文所用，一个核酸分子可与另一个核酸分子(例如cDNA、基因组DNA、或RNA)杂交是指在适当的温度和溶液离子强度条件下，第一分子的单链可与其他分子退火。杂交和洗涤条件为人们所熟知，并示例于Sambrook，J.和Russell，D.，T.，“Molecular Cloning：ALaboratory Manual”，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(2001)。温度和离子强度条件决定了杂交的“严格度”。可调整严格条件来筛选中度类似的分子，例如来自远缘生物的同源序列；与高度类似的分子，例如来自近缘生物的复制功能酶的基因。杂交后洗涤通常决定了严格条件。一组优选的条件使用一系列洗涤步骤，开始是6X SSC、0.5％SDS在室温下洗涤15分钟，然后用2X SSC、0.5％SDS在45℃下重复30分钟，再用0.2X SSC、0.5％SDS在50℃下重复洗涤两次，每次30分钟。一组更优选的条件使用更高的温度，其中洗涤步骤与上述步骤相同，不同的是将最后两次用0.2XSSC、0.5％SDS洗涤30分钟的洗涤温度提高到了60℃。另一组优选的严格杂交条件为：用0.1X SSC、0.1％SDS在65℃下处理，然后用2X SSC、0.1％SDS洗涤，最后用0.1X SSC、0.1％SDS在65℃下洗涤本文的示例性序列。

杂交需要两种核酸含有互补序列，但是取决于杂交的严格度，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格度取决于核酸的长度和互补的程度，它们是本领域内熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经导出了用于计算Tm的公式(Sambrook和Russell，同上)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更为重要，而且寡核苷酸的长度确定了其特异性(Sambrook和Russell，同上)。在一个方面，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸，更优选地为至少约20个核苷酸，甚至更优选地为至少30个核苷酸，甚至更优选地为至少300个核苷酸，最优选地为至少800个核苷酸。此外，技术人员将认识到，必要时可根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液的盐浓度。

如本文所用，术语“百分比同一性”是两条或更多条多肽序列之间或两条或更多条多核苷酸序列之间的关系，该关系通过对序列进行比较确定。在本领域中，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，根据具体情况，通过此类序列串之间的匹配情况进行测定。“同一性”和“相似性”能够通过已知的方法容易地计算，包括但不限于以下文献中所述的方法：Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)，Oxford University Press，NY(1988)；Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.编辑)，Academic Press，NY(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑)，Humana Press，NJ(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje，G.编辑)，Academic Press(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)，Stockton Press，NY(1991)。确定同一性和相似性的方法在可公开获得的计算机程序中编成了代码。序列比对和百分比同一性计算可通过LASERGENE生物信息学计算套件中的Megalign程序(DNASTAR Inc.，Madison，WI)、Vector NTI v.7.0的AlignX程序(Informax，Inc.，Bethesda，MD)、或EMBOSS Open SoftwareSuite(EMBL-EBI；Rice等人，Trends in Genetics 16，(6)：276-277(2000))进行。序列的多重比对可通过CLUSTAL比对法(例如CLUSTALW；如1.83版)使用默认参数进行(Higgins和Sharp，CABIOS，5：151-153(1989)；Higgins等人，Nucleic Acids Res.22：4673-4680(1994)；以及Chenna等人，Nucleic Acids Res 31(13)：3497-500(2003)，可通过European Bioinformatics Institute得自European Molecular BiologyLaboratory)。CLUSTALW蛋白比对的合适参数包括GAP Existencepenalty＝15、GAP extension＝0.2、matrix＝Gonnet(如Gonnet250)、protein ENDGAP＝-1、Protein GAPDIST＝4和KTUPLE＝1。在一个实施方案中，以默认设置使用快速或慢速比对，其中慢速比对是优选的。作为另外一种选择，可将使用CLUSTALW法(如1.83版)的参数修改为也使用KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝10、GAP extension＝1、matrix＝BLOSUM(如BLOSUM64)、WINDOW＝5和TOP DIAGONALSSAVED＝5。

在一个方面，合适的分离型核酸分子编码下述多肽，其具有的氨基酸序列至少约30％、优选地至少33％、优选地至少40％、优选地至少50％、优选地至少60％、更优选地至少70％、更优选地至少80％、甚至更优选地至少85％，甚至更优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％与本文报道的氨基酸序列具有同一性。合适的核酸分子不仅具有上述同源性，而且还通常编码具有约300至约340个氨基酸、更优选约310至约330个氨基酸、并且最优选约318至约325个氨基酸的多肽。

如本文所用，术语“特征基序”、“CE-7特征基序”和“标签基序”是指具有定义活性的酶家族共有的保守结构。特征基序可用于定义和/或鉴定对限定的底物家族具有类似酶活性的、在结构上相关的酶家族。特征基序可以是单个邻接的氨基酸序列，或者可以是一起形成所述特征基序的非邻接保守基序的集合。通常，保守基序以氨基酸序列表示。

如本文所述，具有过水解活性的本发明的酶(“过水解酶”)属于CE-7糖酯酶家族(DiCosimo等人，美国专利申请公布2009/0005590)。如本文所用，短语“酶在结构上归类为CE-7”、“CE-7过水解酶”、或“在结构上归类为糖酯酶家族7的酶”将用于指代具有过水解活性并在结构上归类为CE-7糖酯酶的酶。该酶家族可通过特征基序的存在而定义(Vincent等人，上文)。CE-7酯酶的特征基序包含三个保守基序(相对于参考序列SEQ ID NO：1的残基位置编号)：

a)Arg118-Gly119-Gln120；

b)Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183；以及

c)His298-Glu299。

通常，第180氨基酸残基位置的Xaa为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、或苏氨酸。属于催化三联体的三个氨基酸残基中的其中两个以粗体表示。在一个实施方案中，第180氨基酸残基位置的Xaa选自：甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和苏氨酸。

对CE-7糖酯酶家族中保守基序的进一步分析表明存在额外的保守基序(在SEQ ID NO：1第267至269氨基酸位置的LXD)，该保守基序可用于进一步定义属于CE-7糖酯酶家族的过水解酶。在另一个实施方案中，上面定义的特征基序包含第四个保守基序，其定义为：

Leu267-Xaa268-Asp269。

第268氨基酸残基位置的Xaa通常为异亮氨酸、缬氨酸、或甲硫氨酸。第四个基序包含属于催化三联体(Ser181-Asp269-His298)的天冬氨酸残基(粗体)。

许多熟知的全局比对算法(即序列分析软件)可用于比对两个或更多个代表具有过水解酶活性的酶的氨基酸序列，以确定酶是否包含本发明的特征基序。将比对的序列与参考序列(SEQ ID NO：1)进行比较，以确定特征基序的存在。在一个实施方案中，将利用参考氨基酸序列(如本文所用的得自枯草芽孢杆菌ATCC

31954^TM的过水解酶序列(SEQ ID NO：1))的CLUSTAL比对(例如CLUSTALW)用于鉴定属于CE-7酯酶家族的过水解酶。保守氨基酸残基的相对编号基于参考氨基酸序列的残基编号，用以说明在比对序列中的小插入或缺失(例如，少于五个氨基酸)。

可用于鉴定包含本发明特征基序(当与参考序列进行比较时)的序列的其他合适算法的实例包括但不限于Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48，443-453(1970)；一种全局比对工具)和Smith-Waterman(J.Mol.Biol.147：195-197(1981)；一种局部比对工具)。在一个实施方案中，采用默认参数进行Smith-Waterman比对。合适的默认参数的实例包括使用BLOSUM62计分矩阵，其中GAP open penalty＝10和GAP extension penalty＝0.5。

在本文示例的过水解酶之间对整体百分比同一性的比较表明，与SEQ ID NO：1具有少至33％同一性的酶(但保留了特征基序)表现出显著的过水解酶活性，并且在结构上归为CE-7糖酯酶。在一个实施方案中，合适的过水解酶包括含有CE-7特征基序并与SEQ ID NO：1具有以下氨基酸同一性的酶：至少30％、优选地至少33％、更优选地至少40％、甚至更优选地至少42％、甚至更优选地至少50％、甚至更优选地至少60％、甚至更优选地至少70％、甚至更优选地至少80％、甚至更优选地至少90％，以及最优选地至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

作为另外一种选择，所含的区域涵盖了保守基序的邻接氨基酸序列也可用于鉴定CE-7家族成员。

如本文所用，“密码子简并性”是指允许核苷酸序列在不影响所编码的多肽的氨基酸序列的情况下发生变化的遗传密码的性质。因此，本发明涉及编码全部或大部分氨基酸序列的任何核酸分子，其中所述氨基酸序列编码本发明的微生物多肽。技术人员将充分意识到：特定宿主细胞在使用核苷酸密码子以确定给定氨基酸时所表现出的“密码子偏好性”。因此，当合成基因用以改善在宿主细胞中的表达时，希望对基因进行设计，使得其密码子使用频率接近该宿主细胞优选的密码子使用频率。

如本文所用，术语“密码子优化的”在其涉及用于转化不同宿主的核酸分子的基因或编码区时是指在不改变由DNA编码的多肽的情况下，改变核酸分子的基因或编码区中的密码子以反映宿主生物体典型的密码子使用情况。

如本文所用，“合成的基因”可由使用本领域技术人员已知的方法化学合成的寡核苷酸基本单位组装而成。将这些基本单位连接并退火以形成基因片段，然后进行酶法组装以构建整个基因。“化学合成”涉及DNA序列时是指将核苷酸组分在体外组装。可以采用完善建立的方法来完成DNA的人工化学合成，或者可使用许多可商购获得的机器的其中一种来完成自动化学合成。因此，基于核苷酸序列的优化以反映宿主细胞的密码子偏好性，可以定制基因用以优化基因表达。如果密码子使用偏向于宿主偏好的那些密码子，则技术人员会理解成功的基因表达的可能性。优选密码子的确定可基于对来源于宿主细胞的基因(其中可获得序列信息)的检测。

如本文所用，“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，包括在编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列。“天然基因”是指与其自身调控序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”是指天然基因之外的任何基因，其包含非天然一起存在的调控序列和编码序列。因此，嵌合基因可包含得自不同来源的调控序列和编码序列，或者得自相同来源、但是排列方式与天然存在的排列方式不同的调控序列和编码序列。“内源性基因”是指在生物体基因组中的天然位置的天然基因。“外来基因”是指正常情况下不存在于宿主生物中的基因，它通过基因转移导入宿主生物内。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因，或嵌合基因。“转基因”是已通过转化方法导入基因组内的基因。

如本文所用，“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”是指位于编码序列上游(5′非编码序列)、中间、或下游(3′非编码序列)并影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎-环结构。

如本文所用，“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA表达的DNA序列。一般来讲，编码序列位于启动子序列的3′端。启动子可整体源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至可包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件或生理条件而引导基因的表达。在大部分时间下都可导致基因表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。还应当进一步认识到，由于在大多数情况下调控序列的确切边界尚未完全确定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。

如本文所用，“3′非编码序列”是指位于编码序列下游的DNA序列，并包括多腺苷酸化识别序列(通常限于真核细胞)以及编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的其他序列。多腺苷酸化信号的特征通常在于影响多腺苷酸片(通常限于真核细胞)往mRNA前体3′端的添加。

如本文所用，术语“可操作地连接”是指单个核酸分子上核酸序列的结合，使得其中一个核酸序列的功能受到另一个核酸序列的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，该编码序列受到该启动子的转录控制)时，则该启动子与该编码序列可操作地连接。编码序列可以按有义或反义的取向可操作地连接至调节序列。

如本文所用，术语“表达”是指源于本发明的核酸分子的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积聚。表达也可指将mRNA翻译成多肽。

如本文所用，“转化”是指将核酸分子转移至宿主生物的基因组内，导致基因稳定遗传。在本发明中，宿主细胞的基因组包括染色体和染色体外(如质粒)基因。含有转化核酸分子的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物。

如本文所用，术语“质粒”、“载体”和“盒”是指通常携带有不属于细胞中央代谢一部分的基因的染色体外元件，并且常常是环状双链DNA分子的形式。此类元件可以是任何来源的自主复制的序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环状的单链或双链DNA或RNA，其中将许多核苷酸序列连接或重组成独特的构造，该构造能将选定基因产物的启动子片段和DNA序列与适当的3′未翻译序列一起引入细胞。“转化盒”是指包含外源基因并且除外源基因外还具有可促进特定宿主细胞转化的元件的特定载体。“表达盒”是指包含外源基因并且除外源基因外还具有可增强该基因在外源宿主中表达的元件的特定载体。

如本文所用，术语“序列分析软件”是指可用于核苷酸或氨基酸序列分析的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可商购获得或独立开发。典型的序列分析软件将包括但不限于：GCG程序包(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))、DNASTAR(DNASTAR，Inc.1228 S.Park St.Madison，WI 53715 USA)、CLUSTALW(例如1.83版；Thompson等人，Nucleic Acids Research，22(22)：4673-4680(1994))、包括Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.MethodsGenome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，会议日期1992年，111-20。编辑：Suhai、Sandor。出版社：Plenum，New York，NY)、Vector NTI(Informax，Bethesda，MD)和Sequencher v.4.05。在本专利申请的背景下，应当理解，将序列分析软件用于分析时，分析的结果将基于提及程序的“默认值”，除非另外指明。如本文所用，“默认值”将指在首次初始化时由软件制造商为软件最初加载的任何值或参数集。

如本文所用，术语“生物污染物”是指一种或多种不想要的和/或病原性的生物实体，包括但不限于微生物、孢子、病毒、朊病毒、以及它们的混合物。本发明的方法可制备有效浓度的至少一种过氧羧酸，可用于减少和/或消除活体生物污染物的存在。在一个优选的实施方案中，生物污染物为活体病原性微生物。

如本文所用，术语“消毒”是指破坏或防止生物污染物生长的方法。如本文所用，术语“消毒剂”是指通过破坏、中和、或抑制生物污染物的生长而消毒的试剂。通常，将消毒剂用于处理无生命的物体或表面。如本文所用，术语“消毒处理”是指消毒的行为或过程。如本文所用，术语“防腐剂”是指抑制带病微生物生长的化学试剂。在一个方面，生物污染物为病原性微生物。

如本文所用，术语“卫生的”意指或涉及通常通过除去、预防或控制可能对健康有害的药剂而恢复或维持健康。如本文所用，术语“对...作卫生处理”是指清洁卫生。如本文所用，术语“卫生处理剂”是指卫生处理用试剂。如本文所用，术语“卫生处理”是指搞卫生的行为或过程。

如本文所用，术语“杀病毒剂”是指抑制或破坏病毒的药剂，并与“病毒杀灭剂”同义。将表现出抑制或破坏病毒能力的药剂称为具有“杀病毒”活性。过氧羧酸具有杀病毒活性。本领域已知的可适用于本发明的典型备选杀病毒剂包括例如醇、醚、氯仿、甲醛、苯酚、β-丙内酯、碘、氯、汞盐、羟胺、环氧乙烷、乙二醇、季铵化合物、酶、以及洗涤剂。

如本文所用，术语“生物杀灭剂”是指灭活或破坏微生物的通常为广谱的化学试剂。将表现出灭活或破坏微生物能力的化学试剂称为具有“生物杀灭”活性。过氧羧酸具有生物杀灭活性。本领域已知的可适用于本发明的典型备选生物杀灭剂包括例如氯、二氧化氯、氯异氰尿酸盐、次氯酸盐、臭氧、丙烯醛、胺、氯酚、铜盐、有机硫化合物和季铵盐。

如本文所用，短语“最低生物杀灭浓度”是指在特定的接触时间内，生物杀灭剂导致目标微生物活体种群数发生所需的致死、不可逆转性减少的最低浓度。效力可通过处理后活体微生物减少的数量级来度量。在一个方面，处理后活体微生物的目标减少值为至少3个数量级、更优选地为至少4个数量级、以及最优选地为至少5个数量级。在另一方面，最低生物杀灭浓度为活体微生物细胞减少至少6个数量级。

如本文所用，术语“过氧源”和“过氧的来源”是指当在水溶液中时能够提供约1mM或更高浓度过氧化氢的化合物，包括但不限于过氧化氢、过氧化氢加合物(如尿素-过氧化氢加合物(过氧化脲))、过硼酸盐、以及过碳酸盐。如本文所述，在将反应组分组合后，通过含水反应制剂中的过氧化合物提供的过氧化氢初始浓度为至少1mM或更高。在一个实施方案中，含水反应制剂中过氧化氢浓度为至少10mM。在另一个实施方案中，含水反应制剂中过氧化氢浓度为至少100mM。在另一个实施方案中，含水反应制剂中过氧化氢浓度为至少200mM。在另一个实施方案中，含水反应制剂中过氧化氢浓度为500mM或更高。在另一个实施方案中，含水反应制剂中过氧化氢浓度为1000mM或更高。含水反应制剂中过氧化氢与酶底物(如甘油三酯)的摩尔比(H₂O₂∶底物)可从约0.002至20、优选从约0.1至10、以及最优选从约0.5至5。

所谓“寡糖”是指包含2到至少24个通过糖苷键连接的单糖单元的化合物。术语“单糖”是指具有经验式(CH₂O)_n的化合物，其中n≥3，碳骨架无支链，除了一个碳原子外每个都包含羟基，而剩余的那个碳原子则为2号碳并形成醛或酮。术语“单糖”也指细胞内的环状半缩醛或半缩酮形式。

如本文所用，术语“赋形剂”是指用于稳定制剂中的活性成分的非活性物质，例如活性成分的贮存稳定性。赋形剂有时也用于为含活性成分的制剂增量(bulk up)。如本文所述，“活性成分”为酶催化剂，其包含至少一种具有过水解活性的酶。在一个实施方案中，活性成分为具有过水解活性的至少一种CE-7糖酯酶。

如本文所用，术语“寡糖赋形剂”是指这样一种寡糖，当将其加入酶的水溶液中时，可提高喷雾干燥后活性酶的回收/保留率(即过水解酶活性)和/或提高所得喷雾干燥酶粉或酶粉与有机底物制剂的贮存稳定性。在一个实施方案中，当将酶贮存于羧酸酯中时(即基本上不含水的贮藏混合物)，在喷雾干燥前添加寡糖赋形剂可改善酶的贮存稳定性。羧酸酯可包含极低浓度的水，例如，甘油三乙酸酯通常具有介于180ppm和300ppm之间的水。如本文所用，短语“基本上不含水”将指酶粉和羧酸酯制剂中的水浓度不会对存在于羧酸酯中的酶粉的贮存稳定性产生不利影响。在另一个实施方案中，“基本上不含水”可指包含酶粉和羧酸酯的制剂中水含量低于2000ppm、优选地低于1000ppm、更优选地低于500ppm、甚至更优选地低于250ppm。

多组分过氧羧酸生成体系

过氧羧酸反应性极强，其浓度通常会随着时间降低。尤其是市售的预先形成的过氧羧酸组合物更是如此，其通常缺乏长期稳定性。预先形成的过氧羧酸水溶液还可能存在处理和/或运输方面的困难，尤其是长距离运输大型容器和/或高浓度过氧羧酸溶液时。此外，预先形成的过氧羧酸溶液可能无法提供特定目标应用所需的过氧羧酸浓度。因此，非常有必要将各种反应组分分开，尤其是液体制剂。

通过将两种或更多种组分相结合来制备所需的过氧羧酸的多组分过氧羧酸生成体系已有所报道。各组分应操作安全、易于运输、并长期稳定(即，用混合后制备的过氧羧酸的浓度进行衡量)。在一个实施方案中，多组分酶法过氧羧酸生成体系的贮存稳定性可以用酶催化剂的稳定性衡量。

用于使多种活性组分分开与混合的系统和装置的设计是本领域已知的，并且一般将取决于各反应组分的物理形式。例如，多活性流体(液-液)系统通常使用多室分配瓶或两相系统(如美国专利申请公布2005/0139608、美国专利5,398,846、美国专利5,624,634、美国专利公开6,391,840、欧洲专利0807156B1、美国专利申请公布2005/0008526和PCT公开WO 00/61713)，例如存在于某些漂白应用中的系统，其中所需的漂白剂在将反应流体混合后制成。用于生成过氧羧酸的其他形式的多组分系统可包括但不限于，设计用于一种或多种固体组分或固-液组分组合的那些，例如粉末(如美国专利5,116,575)、多层片(如美国专利6,210,639)、具有多个隔室的水溶性包(如美国专利6,995,125)和加水后发生反应的固体附聚物(如美国专利6,319,888)。

已公布的美国专利申请2004-0127381(授予Scialla等人)描述了含水双组分洗衣用产品。两部分洗衣用产品的一部分包含液体清洁组合物，而第二部分包含漂白组合物；其中漂白组合物包含平衡的过氧羧酸溶液，其含有羧酸、过氧源和相应的过氧羧酸。

本文提供了一种多组分过氧羧酸生成制剂，其使用酶催化剂以快速地生成具有所需过氧羧酸浓度的过氧羧酸水溶液。可以在临近使用前和/或在应用场所(原位)进行混合。该制剂由至少两种在使用前保持分离的组分构成。通过混合各组分将快速地形成过氧羧酸水溶液。每种组分的组成被设计为，可使得所得的过氧羧酸水溶液具有适于预期最终用途(如，消毒、脱色、除臭或漂白应用)的有效过氧羧酸浓度。各组分的组成应被设计为：(1)可提供长期的贮存稳定性，并(2)能够促进由过氧羧酸构成的合适含水反应制剂的形成。

在一个实施方案中，多组分过氧羧酸生成制剂包含双组分制剂。已报道了多种双组分制剂。在另一个实施方案中，双组分制剂基本上为双液体组分制剂。至少，本发明的多组分过氧羧酸制剂包含：(1)至少一种具有过水解活性的酶催化剂，其中所述至少一种酶在结构上归类为CE-7酯酶，(2)羧酸酯底物，以及(3)含水过氧源，其中将组分混合后制剂可以酶法产生所需的过氧羧酸。

应仔细地选择和平衡双组分制剂中各组分的成分和浓度，以提供：(1)各组分的贮存稳定性，尤其是酶催化剂的过水解活性，以及(2)能提高溶解度的物理特性和/或有效形成所需过氧羧酸水溶液的能力(如，可提高酯底物在含水反应混合物中的溶解度的成分和/或可改变液体组分中至少一者的粘度和/或浓度的成分[即，对酶的过水解活性无显著不良影响的至少一种共溶剂])。

本文提供了多组分过氧羧酸制剂。该多组分制剂由至少两种基本上为液体的组分构成。在一个实施方案中，该多组分制剂为包含第一液体组分和第二液体组分的双组分制剂。术语“第一”或“第二”液体组分的使用是相对而言的，前提条件是包含指定成分的两种不同液体组分在使用前保持分离。

代理人档案号为CL4205 US NA、标题为“ENZYMATIC PERACIDPRODUCTION USING A COSOLVENT”的共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请描述了使用至少一种共溶剂来改善酯底物的溶解度和/或混合特性。包含羧酸酯底物和过水解酶催化剂的组分含有Log P值小于约2的有机溶剂，其中将Log P定义为物质在辛醇和水之间的分配系数的对数，表示为P＝[溶质]_辛醇/[溶质]_水。描述了对酶活性无显著不良影响的log P值为2或更小的若干种共溶剂。在一个实施方案中，共溶剂在包含羧酸酯底物和酶的反应组分中的含量为约20重量％至约70重量％。

代理人档案号为CL4386 US NA、标题为“STABILIZATION OFPERHYDROLASES”的共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请描述了一种双组分体系的用途，其中第一组分包含液体羧酸酯和固体酶粉制剂，而固体酶粉则包含(a)至少一种具有过水解活性的CE-7酯酶，和(b)至少一种寡糖赋形剂；以及第二组分包含具有过氧源和过氧化氢稳定剂的水。在一个实施方案中，该至少一种寡糖具有至少约1250的数均分子量和至少约9000的重均分子量。在另一个实施方案中，该寡糖赋形剂具有至少约1700的数均分子量和至少约15000的重均分子量。在另一个实施方案中，该寡糖为麦芽糖糊精。

代理人档案号为CL4387 US NA、标题为“STABILIZATION OFPERHYDROLASES”的共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请描述了一种双组分体系的用途，其中第一组分包含液体羧酸酯和固体酶粉制剂，而固体酶粉包含以下制剂：(a)含有至少一种具有过水解活性的CE-7酯酶的酶粉和至少一种寡糖赋形剂，以及至少一种表面活性剂；和(b)至少一种缓冲剂，其中在优选的实施方案中，缓冲剂作为单独的(即与酶粉分开的)不溶性组分添加到羧酸酯底物中；以及第二组分包含具有过氧源和过氧化氢稳定剂的水。在一个实施方案中，该至少一种赋形剂为具有至少约1250数均分子量和至少约9000重均分子量的寡糖。在另一个实施方案中，该至少一种赋形剂为具有至少约1700数均分子量和至少约15000重均分子量的寡糖。在另一个实施方案中，该寡糖为麦芽糖糊精。在另一个实施方案中，pH缓冲剂为碳酸氢盐缓冲剂。在另一个实施方案中，过氧化氢稳定剂为TURPINAL

SL。

具有过水解活性、在结构上归类为CE-7糖酯酶家族成员的酶的组成和使用方法已有报道。当与过氧源混合时，这些“过水解酶”可尤其有效地由多种酯底物制备过氧羧酸(参见共同未决和共同拥有的已公布的国际专利申请WO2007/070609以及美国专利申请公布2008-0176299、2008-176783和2009/0005590(授予DiCosimo等人)；它们均全文以引用方式并入本文)。在授予DiCosimo等人的已公布的专利申请中所述的过水解酶全部基于以前报道过的CE-7酯酶(该组包括乙酰木聚糖酯酶(AXE)和先锋霉素乙酰水解酶(CAH))的氨基酸序列。代理人档案号为CL4392 US NA的共同拥有、共同提交、共同未决的美国专利申请公开了若干种栖热袍菌属(Thermotogasp.)CE-7酯酶的变体，它们具有改善的过水解活性和/或改善的过水解活性与水解活性比(即P/H比)。在一个实施方案中，两种变体CE-7过水解酶具有选自SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的氨基酸序列。

酶粉

在一个实施方案中，多组分制剂包含酶粉，而酶粉包含至少一种结构上归类为CE-7酶并具有过水解活性的酶和至少一种赋形剂组成的制剂。在一个实施方案中，酶粉通过喷雾干燥法形成(即喷雾干燥的制剂)。在一个实施方案中，赋形剂在酶粉中的含量在约95重量％至约25重量％的范围内。在另一方面，赋形剂为寡糖赋形剂。在另一方面，寡糖赋形剂具有至少约1250的数均分子量和至少约9000的重均分子量，以及任选地至少一种表面活性剂。

所述至少一种酶可以是本文所述的CE-7糖酯酶中的任何一种，或者可以是共同拥有的、共同未决的已公布的美国专利申请2008/0176299(其全文以引用方式并入本文)中所述的CE-7糖酯酶中的任何一种。在一些实施方案中，所述至少一种酶选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、22、23、24和25。在一个实施方案中，所述至少一种酶包含基本上类似于SEQ ID NO：6、7、19、或20的氨基酸序列。在一个优选的实施方案中，所述至少一种酶包含选自SEQ ID NO：6、7、19和20的氨基酸序列。

按酶粉的干重计，所述至少一种酶在酶粉中的含量在约5重量％至约75重量％的范围内。在酶粉/喷雾干燥混合物中，酶的优选重量百分比范围为约10重量％至50重量％，更优选的重量百分比范围为约20重量％至33重量％。在一个实施方案中，酶粉还包含赋形剂。在一个方面，按酶粉的干重计，赋形剂的含量在约95重量％至约25重量％的范围内。酶粉中赋形剂的优选重量％范围为约90重量％至50重量％，更优选的重量％范围为约80重量％至67重量％。

在另一个实施方案中，赋形剂为至少一种寡糖赋形剂。在另一个实施方案中，至少一种寡糖赋形剂具有至少约1250的数均分子量和至少约9000的重均分子量。在一些实施方案中，寡糖赋形剂具有至少约1700的数均分子量和至少约15000的重均分子量。可用于本发明的具体的寡糖包括但不限于麦芽糖糊精、木聚糖、甘露聚糖、岩藻依聚糖、半乳甘露聚糖、脱乙酰壳多糖、棉子糖、水苏糖、果胶、胰岛素、左聚糖、支链型果聚糖、支链淀粉、蔗糖、乳果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、黑曲霉三糖、麦芽三糖、松三糖、maltotriulose、棉子糖、蔗果三糖、以及它们的混合物。在一个优选的实施方案中，寡糖赋形剂为麦芽糖糊精。可用于本发明的寡糖类赋形剂可以包括但不限于水溶性非离子型纤维素醚，如羟甲基纤维素和羟丙基甲基纤维素、以及它们的混合物。在另一个实施方案中，赋形剂选自但不限于以下化合物中的一种或多种：海藻糖、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨醇、葡萄糖、纤维二糖、α-环糊精、羧甲基纤维素。

在一些实施方案中，用于制备酶粉的制剂任选地包含至少一种表面活性剂。在一个优选的方面，存在至少一种表面活性剂。可用的表面活性剂可包括但不限于离子型和非离子型表面活性剂或润湿剂，如乙氧基化蓖麻油、多糖酵解型甘油酯、乙酰化单酸甘油酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、泊洛沙姆、聚氧化乙烯脂肪酸山梨糖醇酐酯、聚氧乙烯衍生物、单酸甘油酯或其乙氧基化衍生物、甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物、多库酯钠、十二烷基硫酸钠、胆酸或其衍生物、卵磷脂、磷脂、乙二醇和丙二醇的嵌段共聚物、以及非离子有机硅树脂。优选的是，表面活性剂为聚氧化乙烯脂肪酸山梨糖醇酐酯，更优选的是聚山梨酸酯80。

当作为制剂的一部分用于制备酶粉时，按酶粉中存在的蛋白的重量计，表面活性剂的含量在约5重量％至0.1重量％的范围内，优选地在约2重量％至0.5重量％的范围内。

酶粉还可以包含一种或多种缓冲剂(如以下钠盐和/或钾盐：碳酸氢盐、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、甲基磷酸盐、琥珀酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐和马来酸盐)以及酶稳定剂(如乙二胺四乙酸、(1-羟基亚乙基)二膦酸)。

通过对制剂进行喷雾干燥，以形成酶粉，例如大致在以下文献中所述：“Spray Drying Handbook”，第5版，K.Masters，John Wiley&Sons，Inc.，NY，N.Y.(1991)以及授予Platz，R.等人的PCT专利公布WO97/41833和WO 96/32149。

一般来讲，喷雾干燥包括将高度分散的液体、足量体积的热空气结合在一起，从而使液滴蒸发和干燥。通常将进料喷入经过滤的热空气流中，使溶剂蒸发，并将干燥产物送至收集器。然后将废气与溶剂一起排出。本领域的技术人员将会知道，可以用若干种不同类型的设备来提供所需的产物。例如，由Buchi Ltd.(Postfach，Switzerland)或GEA Niro Corp.(Copenhagen，Denmark)制造的商业喷雾干燥机将有效地制备出具有所需大小的颗粒。还将认识到，可以对这些喷雾干燥机进行改动或定制，特别是它们的雾化器，以用于专门的应用，例如采用双喷嘴技术同时喷雾两种溶液。更具体地讲，可从一个喷嘴中使油包水乳液雾化，同时可从第二喷嘴中使含防粘剂(如甘露糖醇)的溶液雾化。在其他情况下，可能期望的是用高压液相色谱(HPLC)泵通过定制的喷嘴推出料液。只要能够制备出具有正确形态和/或组成的微结构，那么设备的选择就不是关键性因素，根据本文的教导，其对技术人员而言将是显而易见的。

对用于干燥喷雾材料的气体而言，其入口和出口温度均应使得不会导致喷雾材料中的酶发生降解。此类温度通常以实验方法确定，但一般来讲入口温度将在约50℃至约225℃的范围内，而出口温度将在约30℃至约150℃的范围内。优选的参数包括约20至150psi(0.14MPa至1.03MPa)范围内的雾化压力，优选地在约30-40至100psi(0.21-0.28MPa至0.69MPa)的范围内。使用的雾化压力通常为以下中的一者(MPa)：0.14、0.21、0.28、0.34、0.41、0.48、0.55、0.62、0.69、0.76、0.83或以上。

当贮存在环境温度下时，酶粉或羧酸酯中的酶粉制剂需要能够长时间地基本上保留酶活性。酶粉或羧酸酯中的酶粉制剂在高温下可短时间地基本上保留酶活性。在一个实施方案中，“基本上保留酶活性”是指：与制备由羧酸酯和酶粉构成的制剂之前酶粉的初始酶活性相比，酶粉或羧酸酯中的酶粉制剂在环境温度下长期贮存和/或在高温(高于环境温度)下短期贮存后可保留至少约75％的酶活性。长期贮存是指在环境温度下贮存约一年到约两年。在一个实施方案中，短期贮存是指高温下的一段时间，即从40℃下制备由羧酸酯和酶粉构成的制剂起至40℃下约8周。在另一个实施方案中，高温在约30℃至约52℃的范围内。在一个优选的实施方案中，高温在约30℃至约40℃的范围内。

在一些实施方案中，与在40℃下制备由羧酸酯和酶粉构成的制剂之前酶粉的初始酶活性相比，在40℃下贮存8周后，在由羧酸酯和酶粉构成的制剂中，酶粉具有至少一种酶的至少75％的酶活性。在其他实施方案中，与在40℃下制备由羧酸酯和酶粉构成的制剂之前酶粉的初始酶活性相比，在40℃下贮存8周后，在由羧酸酯和酶粉构成的制剂中，酶粉具有至少一种酶的至少76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或100％的酶活性。优选地，按下文实例8至13中所述的方法测量过水解活性，但在本发明的实践中可以使用测量过水解活性的任何方法。

在一些实施方案中，可以通过以下方法进一步改善指定时间内的酶活性：将在约5.5至约9.5pH值范围内具有缓冲能力的缓冲剂添加到由羧酸酯和喷雾干燥的酶粉构成的制剂中。适用于制剂中的缓冲剂可以包括但不限于以下钠盐、钾盐、或者钠盐或钾盐的混合物：碳酸氢盐、焦磷酸盐、磷酸盐、甲基磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐、马来酸盐或琥珀酸盐。在由羧酸酯和喷雾干燥的酶粉构成的制剂中使用的优选缓冲剂包括以下钠盐、钾盐、或者钠盐或钾盐的混合物：碳酸氢盐、焦磷酸盐、磷酸盐、甲基磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐、马来酸盐或琥珀酸盐。在优选的实施方案中，缓冲剂包含碳酸氢钠和/或碳酸氢钾。

在羧酸酯和酶粉制剂中存在缓冲剂的实施方案中，按由羧酸酯和酶粉构成的制剂中羧酸酯的重量计，缓冲剂的含量在约0.01重量％至约50重量％的范围内。按由羧酸酯和酶粉构成的制剂中羧酸酯的重量计，缓冲剂的含量可在约0.10％至约10％的更优选范围内。此外，在这些实施方案中，经测定，酶过水解活性之间的比较为：与在制备由羧酸酯、缓冲剂(在约5.5至约9.5pH值范围内具有缓冲能力)和酶粉构成的制剂之前酶粉的初始过水解活性相比，在40℃下贮存8周后在由羧酸酯、缓冲剂(在约5.5至约9.5pH值范围内具有缓冲能力)和酶粉构成的制剂中酶粉可保留至少一种酶的至少75％的过水解活性。

本发明意在将喷雾干燥的酶粉作为混在有机化合物中的制剂进行贮存，其中有机化合物为所述至少一种酶的底物，如甘油三乙酸酯。在不存在外加的过氧化氢的情况下，甘油三乙酸酯在水溶液中通常会被CE-7糖酯酶水解，生成甘油二乙酸酯和乙酸，而乙酸的生成则会导致反应混合物的pH值下降。酶在甘油三乙酸酯中保持长期贮存稳定性的一个必要条件是甘油三乙酸酯与甘油三乙酸酯中可能存在的任何水无明显的反应；在一种市售的甘油三乙酸酯(由TessenderloGroup，Brussels，Belgium提供)中，水含量规范为0.03重量％(300ppm)。将酶贮存于甘油三乙酸酯中时所发生的甘油三乙酸酯的任何水解会生成乙酸，这会导致CE-7过水解酶活性降低或失活；过水解酶通常会在pH为5.0或以下时失去活性(参见授予DiCosimo，R.等人的美国专利申请公布2009/0005590)。为用于本发明而选择的赋形剂必须在由于制剂中存在低浓度的水而可能生成乙酸的条件下为有机底物中的酶提供稳定性。

由羧酸酯和过氧化氢通过酶催化法制备过氧羧酸的合适反应条件

在本发明的一个方面，提供了通过让羧酸酯与过氧源(包括但不限于过氧化氢、过硼酸钠或过碳酸钠)在具有过水解活性的酶催化剂存在下进行反应来制备包含过氧羧酸的含水制剂的方法。在一个实施方案中，酶催化剂包含至少一种具有过水解活性的酶，其中所述酶在结构上归类为CE-7糖酯酶家族的成员(CE-7；参见Coutinho，P.M.和Henrissat，B.，上文)。在另一个实施方案中，过水解酶催化剂在结构上被归类为先锋霉素C脱乙酰酶。在另一个实施方案中，过水解酶催化剂在结构上被归类为乙酰木聚糖酯酶。

在一个实施方案中，过水解酶催化剂包含具有过水解活性和特征基序的酶，所述特征基序包含：

a)第118-120氨基酸残基位置的RGQ基序；

b)第179-183氨基酸残基位置的GXSQG基序；以及

c)当用CLUSTALW比对参考序列SEQ ID NO：1时，在第298-299氨基酸残基位置的HE基序。

在另一个实施方案中，该特征基序还包含第四保守基序，其被定义为当用CLUSTALW比对参考序列SEQ ID NO：1时在第267-269氨基酸残基位置的LXD基序。

在另一个实施方案中，过水解酶催化剂包含下述酶，其具有本发明的特征基序以及与SEQ ID NO：1至少30％的氨基酸同一性。

在另一个实施方案中，过水解酶催化剂包含的酶具有选自SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、22、23、24和25的过水解酶活性。

在另一个实施方案中，过水解酶催化剂包含与如SEQ ID NO：18定义的邻接特征基序具有至少40％氨基酸同一性的酶，其中上述保守基序(即RGQ、GXSQG和HE，以及任选的LXD)被保留。

在另一个实施方案中，过水解酶催化剂包含的酶具有选自SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、22、23、24和25的氨基酸序列，其中所述酶可具有一个或多个增加、缺失、或置换，只要保留特征基序并保持过水解活性即可。

合适的羧酸酯底物可以包括具有下式的酯：

(a)具有以下结构的一种或多种酯

[X]_mR₅

其中

X为式R₆C(O)O的酯基；

m为1至R₅中的碳原子数，

(b)具有以下结构的一种或多种甘油酯

(c)具有下式的一种或多种酯

(e)(a)至(d)的任意组合。

在一个优选的实施方案中，羧酸酯为选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯和它们的组合(即混合物)的液体底物。羧酸酯在反应制剂中的浓度应足以在酶催化的过水解反应时生成所需浓度的过氧羧酸。羧酸酯不必完全溶于反应制剂，但具有足够的溶解度，以便通过过水解酶催化剂将酯转化成相应的过氧羧酸。羧酸酯在反应制剂中的浓度为0.05重量％至40重量％，优选地为0.1重量％至20重量％，更优选地为0.5重量％至10重量％。

过氧源可包括但不限于过氧化氢、过氧化氢加合物(如尿素-过氧化氢加合物(过氧化脲))、过硼酸盐和过碳酸盐。过氧化合物在反应制剂中的浓度可在0.0033重量％至约50重量％的范围内，优选地在0.033重量％至约40重量％的范围内，更优选地在0.33重量％至约30重量％的范围内。

据报道，许多过水解酶催化剂(全细胞、透化的全细胞和部分纯化的全细胞提取物)都具有过氧化氢酶活性(EC 1.11.1.6)。过氧化氢酶可催化过氧化氢向氧和水的转化。在一个方面，过水解催化剂缺乏过氧化氢酶活性。在另一方面，将过氧化氢酶抑制剂加到反应制剂中。过氧化氢酶抑制剂的实例包括但不限于叠氮化钠和硫酸羟胺。本领域的技术人员可以根据需要调节过氧化氢酶抑制剂的浓度。过氧化氢酶抑制剂的浓度通常在0.1mM至约1M的范围内；优选地在约1mM至约50mM的范围内；更优选地在约1mM至约20mM的范围内。在一个方面，叠氮化钠的浓度通常在约20mM至约60mM的范围内，而硫酸羟胺的浓度通常为约0.5mM至约30mM，优选地为约10mM。

在另一个实施方案中，酶催化剂缺乏明显的过氧化氢酶活性，或被工程化以降低或消除过氧化氢酶活性。可以用熟知的技术通过破坏负责过氧化氢酶活性的基因的表达来下调或消除宿主细胞中的过氧化氢酶活性，这些技术包括但不限于转座子诱变、RNA反义表达、定向诱变和随机诱变。在一个优选的实施方案中，可以使编码内源性过氧化氢酶活性的一种或多种基因下调或破坏(即敲除)。如本文所用，“破坏的”基因是指由修饰基因编码的蛋白不再具有活性和/或功能的基因。破坏基因的方法是本领域熟知的，包括但不限于插入、去除、或突变，只要相应蛋白的活性和/或功能不再存在即可。在一个优选实施方案中，生产宿主为大肠杆菌(E.coli)生产宿主，其包含选自katG和katE的被破坏的过氧化氢酶基因(参见已公布的美国专利申请2008/0176299)。在另一个实施方案中，生产宿主为大肠杆菌菌株，其包含下调或/被破坏的katG和katE过氧化氢酶基因。

含水反应制剂中催化剂的浓度取决于催化剂的特定催化活性，对该浓度进行选择以获得所需的反应速率。过水解反应中催化剂的重量通常在每毫升总反应体积中具有0.0001mg至10mg，优选0.001mg至2.0mg。还可以使用本领域技术人员熟知的方法将催化剂固定到可溶性或不溶性载体上；参见例如：Immobilization of Enzymes and Cells，Gordon F.Bickerstaff编辑；Humana Press，Totowa，NJ，USA；1997。使用固定化催化剂允许在后续反应中进行回收和重复使用。酶催化剂的形式可以是完整的微生物细胞、透化的微生物细胞、微生物细胞提取物、部分纯化的酶或纯化的酶、以及它们的混合物。

在一个方面，通过羧酸酯的化学法过水解和酶法过水解相结合生成的过氧羧酸的浓度足够以所需的pH值提供用于漂白、脱色、除臭、卫生处理或消毒的过氧羧酸有效浓度。在另一方面，本发明的方法提供了酶和酶底物的组合，以制备所需有效浓度的过氧羧酸，其中在未添加酶的情况下，制备的过氧羧酸的浓度明显更低。虽然在某些情况下，通过无机过氧化物与酶底物的直接化学反应，酶底物可发生显著的化学过水解，但生成的过氧羧酸浓度可能不足以在所需的应用中提供有效浓度的过氧羧酸，而通过在反应制剂中加入合适的过水解酶催化剂可以显著提高过氧羧酸的总浓度。

在过水解反应开始的10分钟内，优选5分钟内，通过至少一种羧酸酯的过水解而生成的过氧羧酸(如过乙酸)浓度为至少约20ppm，优选地为至少100ppm，更优选地为至少约200ppm，更优选地为至少300ppm，更优选地为至少500ppm，更优选地为至少700ppm，更优选地为至少约1000ppm，最优选地为至少2000ppm。包含过氧羧酸的产品制剂可以任选地用水，或主要由水构成的溶液稀释，从而制备具有所需更低浓度过氧羧酸的制剂。在一个方面，制备所需浓度过氧羧酸所需的反应时间不超过约2小时，优选地不超过约30分钟，更优选地不超过10分钟，最优选地在约5分钟或更短的时间内。在其他方面，在将所述反应组分结合后约5分钟至约168小时内，或约5分钟至约48小时内，或约5分钟至2小时内，或其中的任何此类时间间隔内，将被一定浓度的生物污染物污染的硬质表面或无生命物体与根据本文所述的方法形成的过氧羧酸接触。

在另一方面，将根据本文所述的方法形成的过氧羧酸用于衣物洗涤护理应用，其中让过氧羧酸与纺织物接触，以提供诸如消毒、漂白、脱色、卫生处理、除臭/减少异味或它们的组合等有益效果。过氧羧酸可用于多种衣物洗涤护理产品，包括但不限于纺织物预洗处理剂、衣物洗涤剂、去污剂、漂白组合物、除臭组合物和清洗剂。在一个实施方案中，制备用于目标表面的过氧羧酸的本发明方法是原位进行的。

关于用于衣物洗涤护理的本发明的制剂(其中生成的过酸用于漂白、去污和减少异味中的一者或多者)，通过至少一种羧酸酯的过水解而生成的过酸(如过乙酸)的浓度可以为至少约2ppm，优选至少20ppm，优选至少100ppm，更优选至少约200ppm。关于用于衣物洗涤护理的本发明的系统和方法(其中生成的过酸用于消毒或卫生处理)，在过水解反应开始的10分钟内、优选5分钟内、最优选1分钟内，通过至少一种羧酸酯的过水解而生成的过酸(如过乙酸)的浓度可以为至少约2ppm，更优选至少约20ppm，更优选至少200ppm，更优选至少500ppm，更优选至少700ppm，更优选至少约1000ppm，最优选至少2000ppm。包含过酸的产品混合物可以任选地用水或主要由水构成的溶液稀释，以制备具有所需较低过酸浓度的混合物。在本发明方法和系统的一个方面，制备所需浓度过酸所需的反应时间不超过约2小时，优选地不超过约30分钟，更优选地不超过约10分钟，甚至更优选地不超过约5分钟，最优选地在约1分钟或更短的时间内。

对反应温度进行选择，以控制反应速率和酶催化剂活性的稳定性。反应温度范围可以从仅高于反应制剂的凝固点(约0℃)至约95℃，优选的范围为5℃至约75℃，更优选的反应温度范围为约5℃至约55℃。

包含过氧羧酸的最终反应制剂的pH值为约2至约9，优选约3至约8，更优选约5至约8，甚至更优选约5.5至约8，甚至更优选约6.0至约7.5。在另一个实施方案中，反应制剂的pH值呈酸性(pH＜7)。可以任选地通过添加合适的缓冲剂，包括但不限于磷酸盐、焦磷酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、或柠檬酸盐，来控制反应和最终反应制剂的pH值。使用缓冲剂时，其浓度通常为0.1mM至1.0M，优选1mM至300mM，最优选10mM至100mM。

在另一方面，酶法过水解反应制剂可以包含充当分散剂的有机溶剂，以提高羧酸酯在反应制剂中的溶解速率。此类溶剂包括但不限于丙二醇甲醚、丙酮、环己酮、二乙二醇丁醚、三丙二醇甲醚、二乙二醇单甲醚、丙二醇丁醚、二丙二醇甲醚、环己醇、苄醇、异丙醇、乙醇、丙二醇、以及它们的混合物。

在另一方面，酶法过水解产品可以包含提供所需功能的附加组分。这些附加组分包括但不限于缓冲剂、洗涤剂助剂、增稠剂、乳化剂、表面活性剂、润湿剂、腐蚀抑制剂(如苯并三唑)、酶稳定剂和过氧化物稳定剂(如金属离子螯合剂)。许多附加组分都是洗涤剂行业熟知的(参见，例如美国专利5,932,532；据此以引用方式并入)。乳化剂的实例包括但不限于聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。增稠剂的实例包括但不限于LAPONITE

RD、玉米淀粉、PVP、CARBOWAX

、CARBOPOL

、CABOSIL

、聚山梨酸酯20、聚乙烯醇和卵磷脂。缓冲体系的实例包括但不限于磷酸二氢钠/磷酸氢二钠、氨基磺酸/三乙醇胺、柠檬酸/三乙醇胺、酒石酸/三乙醇胺、琥珀酸/三乙醇胺、和乙酸/三乙醇胺。表面活性剂的实例包括但不限于：a)非离子型表面活性剂，如环氧乙烷或环氧丙烷的嵌段共聚物、乙氧基化的或丙氧基化的直链和支链伯醇和仲醇、以及脂族膦氧化合物；b)阳离子表面活性剂，如季铵化合物，尤其是具有键合到氮原子上的C8-C20烷基的季铵化合物，其中氮原子另外还键合到三个C1-C2烷基上；c)阴离子表面活性剂，如烷烃羧酸(如C8-C20脂肪酸)、膦酸烷基酯、烷烃磺酸盐(如十二烷基磺酸钠“SDS”)或者直链或支链烷基苯磺酸盐、烯烃磺酸盐；和d)两性和两性离子表面活性剂，如氨基羧酸、氨基二羧酸、烷基甜菜碱、以及它们的混合物。附加组分可以包括芳香剂、染料、过氧化氢稳定剂(例如金属螯合剂，如羟基乙叉二膦酸(DEQUEST

2010，Solutia Inc.，St.Louis，MO)和乙二胺四乙酸(EDTA))、TURPINAL

SL(CAS#2809-21-4)、DEQUEST0520、DEQUEST

0531、酶活性稳定剂(如聚乙二醇(PEG))，以及洗涤剂助剂。

用过水解酶催化剂原位制备过氧羧酸

先锋霉素C脱乙酰酶(E.C.3.1.1.41，系统名先锋霉素C乙酰水解酶，CAH)是能够水解连接到如先锋霉素C、7-氨基头孢烷酸和7-(噻吩-2-乙酰胺基)头孢烷酸等先锋霉素类上的乙酰基酯的酶(Abbott，B.和Fukuda，D.，Appl.Microbiol.30(3)：413-419(1975))。CAH属于一个较大的结构相关酶家族，称为糖酯酶家族7(CE-7；参见Coutinho，P.M.、Henrissat，B.，上文)。

CE-7家族包括CAH和乙酰木聚糖酯酶(AXE，E.C.3.1.1.72)。CE-7家族成员共有一种结构基序，它们的非常独特之处在于通常对乙酰化低聚木糖和乙酰化先锋霉素C都表现出酯水解活性，从而表明CE-7家族代表对一系列小底物具有多官能脱乙酰基酶活性的单类蛋白(Vincent等人，上文)。Vincent等人描述了该家族成员间的结构相似性，并定义了CE-7家族特有的特征基序。

CE-7家族的成员存在于植物、真菌(如顶头孢霉(Cephalosporidiumacremonium))、酵母(如圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis))和细菌(如热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium sp.)、耐内酰胺诺卡氏菌(Norcardialactamdurans)、以及芽孢杆菌属的许多成员)中(Politino等人，Appl.Environ.Microbiol.，63(12)：4807-4811(1997)；Sakai等人，J.Ferment.Bioeng.85：53-57(1998)；Lorenz，W.和Wiegel，J.，J.Bacteriol179：5436-5441(1997)；Cardoza等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，54(3)：406-412(2000)；Mitsushima等人，上文；Abbott，B.和Fukuda，D.，Appl.Microbiol.30(3)：413-419(1975)；Vincent等人，上文；Takami等人，NAR，28(21)：4317-4331(2000)；Rey等人，Genome Biol.，5(10)：第77条(2004)；Degrassi等人，Microbiology.，146：1585-1591(2000)；美国专利6,645,233；美国专利5,281,525；美国专利5,338,676；和WO 99/03984。

WO2007/070609和美国专利申请公布2008/0176299、2008/176783以及2009/0005590(授予DiCosimo等人)公开了多种在结构上归类为CE-7酶的酶，当与过氧源混合时，它们具有的过水解活性适于由多种羧酸酯底物制备有效浓度的过氧羧酸。具有改善的过水解活性的变体CE-7酶还在共同提交、共同拥有、共同未决的美国专利申请(代理人档案号为CL4392 US NA，标题为“IMPROVEDPERHYDROLASES FOR ENZYMATIC PERACID GENERATION”，其全文以引用方式并入本文)中有所描述。

本发明的方法可在含水反应条件下利用属于糖酯酶CE-7家族的酶的过水解酶活性原位制备工业上可用的有效浓度的过氧羧酸。

用于测定过氧羧酸和过氧化氢浓度的HPLC测定法。

在本发明的方法中，可采用多种分析方法来分析反应物和产物，包括但不限于滴定、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、质谱(MS)、毛细管电泳(CE)、U.Karst等人描述的分析方法(Anal.Chem.，69(17)：3623-3627(1997))、以及本发明实施例中描述的2，2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸盐(ABTS)测定法(S.Minning等人，AnalyticaChimica Acta 378：293-298(1999)和WO 2004/058961A1)。

确定过氧羧酸的最低生物杀灭浓度

可以用J.Gabrielson等人(J.Microbiol.Methods 50：63-73(2002))所述的方法确定过氧羧酸或过氧化氢与酶底物的最低生物杀灭浓度(MBC)。测定方法基于XTT还原抑制，其中XTT((2，3-二[2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基]-5-[(苯氨基)羰基]-2H-四唑鎓，内盐，单钠盐)为氧化还原染料，通过在490nm或450nm处测得的光密度(OD)的变化来表明微生物呼吸活性。然而，还有许多种其他方法可用于检测消毒剂和防腐剂的活性，包括但不限于平板活菌计数、直接显微镜计数、干重、浊度测量、吸光度和生物发光(参见，例如Brock、Semour S.，“Disinfection，Sterilization，and Preservation”，第5版，LippincottWilliams&Wilkins，Philadelphia，PA，USA；2001)。

酶法制备的过氧羧酸组合物的用途

根据本发明方法制备的酶催化剂生成的过氧羧酸可用于许多硬质表面/无生命物体应用，以降低生物污染物的浓度，例如用于医疗器械(如内窥镜)、纺织物(如衣服、地毯制品)、食品制备表面、食品贮存和食品包装设备、食品包装材料、鸡孵化和养成场所、动物笼舍、以及具有微生物和/或抗病毒活性的工艺废水的消毒。酶法生成的过氧羧酸可用于旨在使朊病毒(如某些蛋白酶)失活以进一步提供生物杀灭活性的制剂。在一个优选的方面，本发明的过氧羧酸组合物尤其适合用作非高压灭菌医疗器械和食品包装设备的消毒剂。由于含过氧羧酸的制剂可以用GRAS或食品级组分(酶、酶底物、过氧化氢和缓冲剂)制备而得，因此酶法生成的过氧羧酸也可用于动物尸体、肉、水果和蔬菜的消毒，或用于预制食品的消毒。可以将酶法生成的过氧羧酸掺入最终形式为粉末、液体、凝胶、薄膜、固体或气溶胶的产品中。可以将酶法生成的过氧羧酸稀释至仍能提供有效消毒的浓度。

可以使用包含有效浓度的过氧羧酸的组合物，通过使表面或物体与通过本发明方法制备的产品接触，对受生物污染物污染(或怀疑被污染)的表面和/或物体进行消毒或卫生处理。如本文所用，“接触”是指使包含有效浓度过氧羧酸的消毒组合物与怀疑被生物污染物污染的表面或无生命物体接触一段足以达到清洁和消毒效果的时间。接触包括通过喷洒、处理、浸入、冲洗、倾注、混合、组合、涂抹、涂覆、施加、粘附以及其他方式，使包含有效浓度过氧羧酸的过氧羧酸溶液或组合物，或者可形成有效浓度过氧羧酸的溶液或组合物与怀疑被一定浓度的微生物群体污染的表面或无生命物体相连。可以将消毒组合物与清洁组合物结合在一起，以同时提供清洁和消毒功能。作为另外一种选择，可以将清洁剂(如表面活性剂或去污剂)掺入制剂中，以通过单一组合物同时提供清洁和消毒功能。

包含有效浓度过氧羧酸的组合物还可以含有至少一种附加的抗微生物剂、朊病毒-降解蛋白酶的组合、杀病毒剂、杀孢子剂、或生物杀灭剂。当将这些药剂与通过受权利要求书保护的方法制备的过氧羧酸的组合用于对被生物污染物污染(或怀疑被污染)的表面和/或物体进行清洁和消毒时，可以提供增强和/或协同效应。合适的抗微生物剂包括羧酸酯(如，对羟基烷基苯甲酸酯和烷基肉桂酸酯)；磺酸(如十二烷基苯磺酸)；碘代化合物或活性卤素化合物(如卤素元素、卤素氧化物(如NaOCl、HOCl、HOBr、ClO₂)、碘、卤素间卤化物(interhalide)(如一氯化碘、二氯化碘、三氯化碘、四氯化碘、氯化溴、一溴化碘、或二溴化碘)、多卤化物、次氯酸盐、次氯酸、次溴酸盐、次溴酸、氯代-和溴代-乙内酰脲、二氧化氯和亚氯酸钠)；有机过氧化物，包括过氧化苯甲酰、烷基过氧化苯甲酰、臭氧、单重态氧发生器、以及它们的混合物；酚类衍生物(如邻苯基苯酚、4-氯-2-苄基苯酚、叔戊基酚和C₁-C₆烷基羟基苯甲酸酯)；季铵化合物(如烷基二甲基苄基氯化铵、二烷基二甲基氯化铵、以及它们的混合物)；以及此类抗微生物剂的混合物，它们的量应足以提供所需的微生物防护水平。抗微生物剂的有效量包括约0.001重量％至约60重量％的抗微生物剂，约0.01重量％至约15重量％的抗微生物剂，或约0.08重量％至约2.5重量％的抗微生物剂。

在一个方面，当将用本发明方法形成的过氧羧酸施用到某场所上和/或某场所处时，可用于降低生物污染物(如活微生物群体)的浓度。如本文所用，本发明的“场所”包括适于消毒或漂白的部分或全部目标表面。目标表面包括有可能被生物污染物污染的所有表面。非限制性实例包括存在于食品或饮料行业中的设备表面(如槽罐、运送装置、地板、排水系统、冷却器、冷冻机、设备表面、壁、阀门、束带、管道、排水系统、接头、裂缝、它们的组合等)；建筑物表面(如墙壁、地板和窗户)；与非食品行业相关的管道和排水系统，包括水处理设施、水池和温泉浴场、以及发酵罐；与医院或兽医相关的表面(如墙壁、地板、床、设备(如内窥镜)、在医院/兽医或其他医疗保健场所穿着的衣物，包括衣服、手术服、鞋和其他医院或兽医相关表面)；餐厅表面；浴室表面；盥洗室；衣服和鞋；牲口(如家禽、牛、奶牛、山羊、马和猪)棚舍表面；家禽或虾的孵卵场；以及药物或生物药物相关表面(如药物或生物药物制造设备、药物或生物药物成分、药物或生物药物赋形剂)。其他硬质表面还可以包括食品，如牛肉、家禽肉、猪肉、蔬菜、水果、海产品、它们的组合等。场所还可以包括吸水材料，如被污染的亚麻布或其他纺织物。场所还包括收获的植物或植物产品，包括种子、球茎、块茎、水果和蔬菜；正在生长的植物，尤其是农作物生长植物，包括谷类食物、叶菜和色拉作物、根菜、豆类、浆果、柑橘类水果和硬果。

硬质表面材料的非限制性实例为金属(如钢、不锈钢、铬、钛、铁、铜、黄铜、铝和它们的合金)、矿物质(如混凝土)、聚合物和塑料(如聚烯烃，如聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯)、聚(丙烯腈-丁二烯)、丙烯腈丁二烯；聚酯，如聚对苯二甲酸乙二酯；以及聚酰胺，如尼龙)。其他表面可以包括砖块、瓦、陶瓷、瓷器、木材、聚乙烯树脂、油毡和地毯。

可使用通过本发明方法形成的过氧羧酸为衣服或纺织物制品提供有益效果，包括但不限于漂白、除臭、脱色、卫生处理和消毒。用本发明方法形成的过氧羧酸可用于许多衣物洗涤护理产品，包括但不限于纺织物/衣物预洗处理剂、衣物洗涤剂、去污剂、漂白组合物、除臭组合物和清洗剂。

在衣物洗涤护理应用的背景下，术语“接触衣物或纺织物制品”是指将衣物或纺织物制品暴露于本文所公开的制剂。为此，可以用许多形式的制剂来处理衣物或纺织物制品，包括但不限于液体、固体、凝胶、糊剂、条、片剂、喷剂、泡沫、粉末、或颗粒，并可以通过以下方式给予：手动给料、装置给料、从基质中给料、以及由洗衣机或烘衣机喷洒和自动给料。颗粒状组合物也可以为致密物的形式；液体组合物也可以为浓缩物的形式。

当将本文所公开的制剂用于洗衣机时，该制剂还可以包含通常用于衣物洗涤剂的组分。例如，典型的组分包括但不限于表面活性剂、漂白剂、漂白活化剂、外加酶、抑泡剂、分散剂、钙皂分散剂、土悬液和抗再沉淀剂、软化剂、腐蚀抑制剂、晦暗抑制剂、杀菌剂、pH调节剂、非助洗剂碱度来源、螯合剂、有机和/或无机填料、溶剂、水溶助长剂、光学增白剂、染料和香料。

本文所公开的制剂还可以固体或液体形式用作洗涤剂添加产品。此类添加产品旨在补充或增强常规洗涤剂组合物的性能，并可以在清洁过程的任何阶段添加。

重组微生物表达

本发明序列的基因和基因产物可在异源宿主细胞中产生，尤其是在微生物宿主细胞中产生。用于表达本发明基因和核酸分子的优选异源宿主细胞为微生物宿主，所述微生物宿主可在真菌或细菌家族中找到并且其可在广泛的温度、pH值和溶剂耐受性下生长。例如，预期细菌、酵母和丝状真菌中任何一种均适于作为表达本发明核酸分子的宿主。过水解酶可在细胞内、细胞外、或细胞内和细胞外两者组合的形式表达，其中细胞外表达使得从发酵产物回收所需的蛋白质比回收细胞内表达所产生的蛋白质的方法更简便。转录、翻译和蛋白质生物合成仪器相对于用来产生细胞生物质的细胞原料而言保持不变；无论如何，功能基因将被表达。宿主菌株的实例包括但不限于细菌、真菌或酵母物种例如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、糖酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、红发夫酵母属(Phaffia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、耶氏酵母属(Yarrowia)、沙门氏菌属(Salmonella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、发酵单胞菌属(Zymomonas)、农杆菌属(Agrobacterium)、赤细菌属(Erythrobacter)、绿菌属(Chlorobium)、着色菌属(Chromatium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、噬纤维菌属(Cytophaga)、红细菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacteria)、分支杆菌属(Mycobacterium)、异常球菌属(Deinococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、甲基球菌属(Methylococcus)、甲基弯菌属(Methylosinus)、甲基微菌属(Methylomicrobium)、甲基孢囊菌属(Methylocystis)、产碱菌属(Alcaligenes)、集胞蓝细菌属(Synechocystis)、聚球蓝细菌属(Synechococcus)、鱼腥蓝细菌属(Anabaena)、硫杆菌属(Thiobacillus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和粘球菌属(Myxococcus)。在一个实施方案中，细菌宿主菌株包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)以及假单胞菌属(Pseudomonas)。在一个优选的实施方案中，细菌宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)。

大规模微生物的生长和功能基因的表达可利用各种单一碳水化合物或络合碳水化合物、有机酸和醇或饱和烃(对于光合自养宿主或化能自养宿主而言，例如甲烷或二氧化碳)，并可利用各种形式和数量的氮、磷、硫、氧、碳或任何微量营养素(包括小无机离子)。可通过向培养物中加入或不加入特定的调节分子(通常不将其视为营养物质或能源)来影响生长速率的调节。

可用于转化合适的宿主细胞的载体或盒是本领域熟知的。通常，载体或盒包含指导相关基因转录和翻译的序列、选择性标记和允许自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包含含有转录起始控制的基因5′区域和控制转录终止的DNA片段3′区域。最优选的是当两个控制区都来源于与转化的宿主细胞同源的基因和/或对生产宿主是天然的基因，尽管它们无需来源于此。

可用于驱动本发明的先锋霉素C脱乙酰酶编码区在所需宿主细胞中表达的起始控制区或启动子有很多，并且为本领域技术人员所熟悉。事实上，任何能够驱动这些基因的启动子均适用于本发明，包括但不限于：CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、ENO、TPI(用于在糖酵母属中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母属中表达)；和lac、araB、tet、trp、lP_L、lP_R、T7、tac以及trc(用于在大肠杆菌属中表达)以及amy、apr、npr启动子和多个噬菌体启动子，用于在芽孢杆菌属中表达。

终止控制区也可以源于优选宿主细胞的天然的多种基因。在一个实施方案中，可任选包括终止控制区。在另一个实施方案中，嵌合基因包括源于优选宿主细胞的终止控制区。

工业生产

多种培养方法可用来生产过水解酶催化剂。例如，从重组微生物宿主过表达的特定基因产物的大规模生产可通过分批、分批补料和连续培养的方法进行。分批培养和补料分批培养方法在本领域内是常用的且众所周知，并且实例可见于如下文献：Thomas D.Brock inBiotechnology：A Textbook of Industrial Microbiology，第二版，SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA(1989)和Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227-234(1992)。

所需过水解酶催化剂的商业生产也可用连续培养的方法实现。连续培养是一种开放式系统，其中将成分确定的培养基连续加入生物反应器中，并同时移出等量条件培养基用于加工。连续培养一般使细胞维持在其中细胞主要处于对数生长期的恒定高液相密度。或者，连续培养可以用固定化细胞来进行，其中连续添加碳和营养素，且连续从细胞团块中取出有价值的产物、副产物或废弃物。细胞固定可使用范围广泛的固体载体进行，所述固体载体由天然材料和/或合成材料组成。

可通过本领域的技术人员已知的任何方法实现从分批发酵、分批补料发酵或连续培养中回收所需过水解酶催化剂。例如，当酶催化剂是细胞内产生时，可通过离心或膜过滤从培养基分离细胞沉淀物(cellpaste)，任选地可用水或所需pH的含水缓冲液洗涤，然后将所需pH的含水缓冲液中的细胞沉淀物的悬浮液混匀以产生含有所需酶催化剂的细胞提取物。细胞提取物可任选地通过合适的助滤剂例如硅藻土或二氧化硅过滤来去除细胞残片，然后进行热处理步骤，将不需要的蛋白质从酶催化剂溶液中沉淀出。然后通过膜过滤或离心将含有所需酶催化剂的溶液从沉淀的细胞残片和蛋白质分离，并且所得的部分纯化的酶催化剂溶液通过额外的膜过滤浓缩，然后任选地与合适的载体(例如，麦芽糖糊精、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液或其混合物)混合并喷雾干燥以产生含有所需酶催化剂的固体粉末。

当数量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而不管所述范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围均旨在包含其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数，除非另行指出。当定义一个范围时，不旨在将范围限定于所列举的具体数值。

一般方法

为演示本发明的优选方面，本文提供了以下实施例。本领域的技术人员应理解的是实施例中公开的技术遵循能够有效实施本发明的实践的技术，因此可将这些技术视为适合其实践的优选模式。然而，本领域的技术人员应依据本发明理解的是，在不背离本发明所公开的方法和实施例的精神和范围的情况下，可对所公开的具体实施方案进行许多更改并仍能获得相同或相似的结果。

所有试剂和材料均得自DIFCO Laboratories(Detroit，MI)，GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)，TCI America(Portland，OR)，RocheDiagnostics Corporation(Indianapolis，IN)或Sigma/Aldrich ChemicalCompany(St.Louis，MO)，除非另外说明。

说明书中的以下缩写对应于如下度量单位、技术、性能或化合物：“sec”或“s”指秒，“min”指分钟，“h”或“hr”指小时，“μL”指微升，“mL”指毫升，“L”指升，“mM”指毫摩尔每升，“M”指摩尔每升，“mmol”指毫摩尔，“ppm”指百万分率，“wt”指重量，“wt％”指重量百分比，“g”指克，“mg”指毫克，“μg”指微克，“ng”指纳克，“g”指重力，“HPLC”指高效液相色谱法，“dd H₂O”指蒸馏和去离子水，“dcw”指细胞干重，“ATCC”或“ATCC

”指于美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)，“U”指过水解酶活性的单位，“rpm”指每分钟的转速，“Tg”指玻璃化转变温度，以及“EDTA”指乙二胺四乙酸。

实施例1

katG过氧化氢酶缺陷型大肠杆菌菌株的构建

通过PCR(94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟，70℃下1分钟，30个循环)用标识为SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29的引物从质粒pKD13(SEQ ID NO：27)扩增卡那霉素抗性基因(kan；SEQ ID NO：26)的编码区，从而产生标识为SEQ ID NO：30的PCR产物。katG核酸序列以SEQ ID NO：31给出，并且对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：32。大肠杆菌MG1655(ATCC47076^TM)采用温敏质粒pKD46(SEQ IDNO：33)进行转化并于30℃在LB-amp平板上培养24小时以进行筛选，该质粒含有λ-Red重组酶基因(Datsenko和Wanner，(2000)，PNASUSA 97：6640-6645)。MG1655/pKD46采用50-500ng PCR产物通过电穿孔(BioRad Gene Pulser，0.2cm电击杯，2.5kV，200W，25μF)进行转化，并于37℃在LB-kan平板上培养24小时以进行筛选。将几个菌落划线于LB-kan平板上并在42℃下培养过夜以修复pKD46质粒。对菌落进行检查以确定kanR/ampS的表型。使用PUREGENE

DNA纯化系统(Gentra Systems，Minneapolis，MN)分离几个菌落的基因组DNA，并采用标识为SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35的引物通过PCR检查来确定katG基因的缺失。几个katG缺失的菌株采用温敏质粒pCP20(SEQ ID NO：36)进行转化，并于37℃在LB-kan平板上培养24小时以进行筛选，该质粒可表达FLP重组酶，用来切除kan基因。将几个菌落划线于LB平板上并在42℃下培养过夜以修复pCP20质粒。对两个菌落进行检查以确定kanS/ampS的表型，并将这两个菌落称为MG1655KatG1和MG1655KatG2。

实施例2

katE过氧化氢酶缺陷型大肠杆菌菌株的构建

通过PCR(94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟，70℃下1分钟，30个循环)用标识为SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的引物从质粒pKD13(SEQ ID NO：27)扩增卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO：26)，以产生标识为SEQ ID NO：39的PCR产物。katE核酸序列以SEQ ID NO：40给出，并且对应的氨基酸序列为SEQ ID NO：41。大肠杆菌MG1655(ATCC

47076^TM)采用温敏质粒pKD46(SEQ ID NO：33)进行转化并于30℃在LB-amp平板上培养24小时以进行筛选，该质粒含有λ-Red重组酶基因。MG1655/pKD46采用50-500ng PCR产物通过电穿孔(BioRad Gene Pulser，0.2cm电击杯，2.5kV，200W，25μF)进行转化，并于37℃在LB-kan平板上培养24小时以进行筛选。将几个菌落划线于LB-kan平板上并在42℃下培养过夜以修复pKD46质粒。对菌落进行检查以确定kanR/ampS的表型。使用PUREGENE

DNA纯化系统分离几个菌落的基因组DNA，并采用标识为SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43的引物通过PCR检查来确定katE基因的缺失。几个katE缺失的菌株采用温敏质粒pCP20(SEQ ID NO：36)进行转化，并于37℃在LB-amp平板上培养24小时以进行筛选，该质粒可表达FLP重组酶，用来切除kan基因。将几个菌落划线于LB平板上并在42℃下培养过夜以修复pCP20质粒。对两个菌落进行检查以确定kanS/ampS的表型，并将这两个菌落称为MG1655 KatE1和MG1655KatE2。

实施例3

katG过氧化氢酶和katE过氧化氢酶缺陷型大肠杆菌菌株(KLP18) 的构建

通过PCR(94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟，70℃下1分钟，30个循环)用标识为SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的引物从质粒pKD13(SEQ ID NO：27)扩增卡那霉素抗性基因(SEQ ID NO：26)，以产生标识为SEQ ID NO：39的PCR产物。大肠杆菌MG1655KatG1(实施例1)采用温敏质粒pKD46(SEQ ID NO：33)进行转化并于30℃在LB-amp平板上培养24小时以进行筛选，该质粒含有λ-Red重组酶基因。MG1655 KatG1/pKD46采用50-500ng PCR产物通过电穿孔(BioRad Gene Pulser，0.2cm电击杯，2.5kV，200W，25μF)进行转化，并于37℃在LB-kan平板上培养24小时以进行筛选。将几个菌落划线于LB-kan平板上并在42℃下培养过夜以修复pKD46质粒。对菌落进行检查以确定kanR/ampS的表型。使用PUREGENE

DNA纯化系统分离几个菌落的基因组DNA，并采用标识为SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43的引物通过PCR检查来确定katE基因的缺失。几个katE缺失的菌株(ΔkatE)采用温敏质粒pCP20(SEQ ID NO：36)进行转化，并于37℃在LB-amp平板上培养24小时以进行筛选，该质粒可表达FLP重组酶，用来切除kan基因。将几个菌落划线于LB平板上并在42℃下培养过夜以修复pCP20质粒。对两个菌落进行检查以确定kanS/ampS的表型，并将两个菌落称为MG1655 KatG1KatE18.1和MG1655 KatG1KatE23。MG1655 KatG1KatE18.1指定为大肠杆菌KLP18。

实施例4

来自那不勒斯栖热袍菌

的过水解酶的克隆和表达编码来自那不勒斯栖热袍菌的乙酰木聚糖酯酶的基因的编码区(如在GENBANK

中报道的登录号AE000512；80481-81458区；SEQ ID NO：44)采用在大肠杆菌中最优表达的密码子合成(DNA 2.0，Menlo Park，CA)。随后通过PCR(94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟，70℃下1分钟，30个循环)用标识为SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46的引物扩增该基因的编码区。将所得的核酸产物(SEQ ID NO：47)亚克隆进pTrcHis2-TOPO

以产生标识为pSW196的质粒。质粒pSW196用来转化大肠杆菌KLP18(实施例3)以产生菌株KLP18/pSW196。将KLP18/pSW196在37℃下振摇培养于LB培养基中直到OD_600nm＝0.4-0.5，达到该OD时加入终浓度为1mM的IPTG，并继续培养2-3h。离心收集细胞并进行SDS-PAGE以确定过水解酶的表达量占可溶性总蛋白的20-40％。

实施例5

来自海栖热袍菌MSB8

的过水解酶的克隆和表达将编码来自海栖热袍菌MSB8的乙酰木聚糖酯酶的基因的编码区(如在GENBANK

中报道的登录号NP_227893.1；SEQ ID NO：48)进行合成(DNA 2.0，Menlo Park，CA)。随后通过PCR(94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟，70℃下1分钟，30个循环)用标识为SEQ ID NO：49和SEQ ID NO：50的引物扩增该基因的编码区。所得的核酸产物(SEQ ID NO：51)用限制性酶PstI和XbaI切割，并亚克隆在pUC19中的PstI和XbaI位点之间以产生标识为pSW207的质粒。质粒pSW207用来转化大肠杆菌KLP18(实施例3)以产生标识为KLP18/pSW207的菌株。KLP18/pSW207在37℃下振摇培养于LB培养基中直到OD_600nm＝0.4-0.5，达到该OD时加入终浓度为1mM的IPTG，并继续培养2-3h。离心收集细胞并进行SDS-PAGE以确定过水解酶的表达量占可溶性总蛋白的20-40％。

实施例6

表达过水解酶的大肠杆菌KLP18转化体的发酵

通过向2L摇瓶中加料0.5L种子培养基来制备发酵罐种子培养物，0.5L种子培养基含有酵母提取物(Amberex 695，5.0g/L)、K₂HPO₄(10.0g/L)、KH₂PO₄(7.0g/L)、二水合柠檬酸钠(1.0g/L)、(NH₄)₂SO₄(4.0g/L)、MgSO₄七水合物(1.0g/L)和柠檬酸铁铵(0.10g/L)。将培养基的pH调节为6.8，将培养基封装于烧瓶中，然后进行灭菌。灭菌后加入的添加剂包括葡萄糖(50重量％，10.0mL)和1mL的氨苄青霉素(25mg/mL)储备液。在种子培养基上接种1mL大肠杆菌KLP18/pSW196或大肠杆菌KLP18/pSW207的培养物(含20％甘油)，并在35℃和300rpm下培养。在大约1-2OD_550nm时，将种子培养物转移到14L发酵罐中(Braun Biotech，Allentown，PA)，该发酵罐温度为35℃，并装有8L培养基，该培养基含有KH₂PO₄(3.50g/L)、FeSO₄七水合物(0.05g/L)、MgSO₄七水合物(2.0g/L)、二水合柠檬酸钠(1.90g/L)、酵母提取物(Amberex 695，5.0g/L)、Biospumex153K消泡剂(0.25mL/L，CognisCorporation，Monheim，Germany)、NaCl(1.0g/L)、CaCl₂二水合物(10g/L)和NIT痕量元素溶液(10mL/L)。痕量元素溶液含有一水合柠檬酸(10g/L)、MnSO₄水化物(2g/L)、NaCl(2g/L)、FeSO₄七水合物(0.5g/L)、ZnSO₄七水合物(0.2g/L)、CuSO₄五水合物(0.02g/L)和NaMoO₄二水合物(0.02g/L)。灭菌后加入的添加剂包括葡萄糖溶液(50％重量比，80.0g)和氨苄青霉素(25mg/mL)储备液(16.00mL)。葡萄糖溶液(50％重量比)用于分批补料。当葡萄糖浓度降低至0.5g/L时，开始补加葡萄糖，起始进料速率为0.31g/min，随后每小时分别逐渐增加至0.36、0.42、0.49、0.57、0.66、0.77、0.90、1.04、1.21、1.41和1.63g/min；之后速率保持恒定。监测培养基中的葡萄糖浓度，如果浓度超过0.1g/L，则降低进料速率或暂时停止进料。在OD_550nm＝56和OD_550nm＝80之间时启动诱导，向各种菌株加入16mL的IPTG(0.5M)。溶解氧(DO)浓度控制在25％的空气饱和度。DO开始通过叶轮搅拌速率(400至1400rpm)控制，然后通过通气速率(2至10slpm)控制。pH控制在6.8。用NH₄OH(29％重量比)和H₂SO₄(20％重量体积比)控制pH。封头压力为0.5巴。IPTG加入16小时后离心收集细胞。

实施例7

CE-7酯酶/过水解酶的热处理细胞提取物的制备

表达来自那不勒斯栖热袍菌(KLP18/pSW196)或海栖热袍菌MSB8(KLP18/pSW207)的过水解酶的大肠杆菌转化体的细胞提取物通过如下方式制备：将0.05M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)(含有二硫苏糖醇(1mM))中的细胞沉淀物(20重量％细胞湿重)的悬浮液两次经过工作压力为16,000psi(约110MPa)的弗氏压碎器。然后以20,000×g离心粗提取物以去除细胞碎片，得到澄清的细胞提取物，对所得提取物进行可溶性总蛋白的分析(二喹啉甲酸法蛋白浓度测定试剂盒，Sigma Aldrich目录号BCA1-KT)。将含有海栖热袍菌MSB8或那不勒斯栖热袍菌过水解酶的澄清的提取物在75℃加热20分钟，随即用冰/水浴冷却到5℃。离心所得混合物以去除沉淀的蛋白质，收集上清液，并如前所述进行可溶性总蛋白的分析。热处理后的上清液的SDS-PAGE表明，上清液中过水解酶占可溶性总蛋白的至少约90％。

实施例8

那不勒斯栖热袍菌过水解酶/海藻糖喷雾干燥酶粉的温度稳定性

制备一组十种含水混合物，其含有碳酸氢钠缓冲液(50mM，pH＝8.1)中的下列物质：大肠杆菌KLP18/pSW196的不同浓度的热处理细胞提取蛋白(PAGE显示那不勒斯栖热袍菌过水解酶含量≥90％)、海藻糖(Cargill)以及任选的作为表面活性剂的聚山梨酸酯80(p80)(表1)。这些溶液用Buchi B-290玻璃喷雾干燥室(入口温度＝170℃，出口温度＝90℃，进料速率＝3mL/min至10mL/min)喷雾干燥以产生十种喷雾干燥的酶粉；用BCA(二喹啉甲酸)蛋白分析测定粉末中蛋白的重量百分比，并且这些粉末的玻璃化转变温度(Tg)用调制式差示扫描量热法测量(表1)。

表1：用来产生那不勒斯栖热袍菌过水解酶/海藻糖喷雾干燥酶粉的蛋白质/赋形剂溶液组合物，和相应粉末的玻璃化转变温度(Tg)。

将喷雾干燥的酶粉于40℃保存于密封瓶中并间隔1周取样，样品用来分析碳酸氢钠缓冲液(50mM，pH 7.2)中的如下物质在25℃下反应5分钟产生的过乙酸的浓度：那不勒斯栖热袍菌过水解酶(50μg蛋白/mL)、H₂O₂(100mM)、甘油三乙酸酯(100mM)和TURPINALSL(500ppm)，并且采用改进的Karst等人所报道的分析方法(见下)分析过乙酸的产生。

在预定的时间(5min)移出反应混合物的一个样品(0.040mL)并立即与0.960mL的5mM的磷酸水溶液混合，通过将稀释的样品的pH调节至小于pH 4而终止反应。所得溶液使用ULTRAFREE

MC过滤装置(30,000标称分子量(NMWL)，Millipore Corp.，Billerica，MA；目录号UFC3LKT 00)以12,000rpm离心过滤2分钟。将一份等分(0.100mL)的所得滤液转入含有0.300mL去离子水的1.5mL HPLC螺旋盖小瓶(Agilent Technologies，Palo Alto，CA；#5182-0715)，然后加入0.100mL溶于乙腈中的20mM MTS(甲基对甲苯硫醚)，盖上小瓶，并短暂混合内容物，然后在大约25℃避光孵育10分钟。然后向小瓶中加入0.400mL的乙腈和0.100mL的三苯基膦(TPP，40mM)乙腈溶液中，再次盖上小瓶，混合所得溶液并在大约25℃避光孵育30分钟。然后向小瓶中加入0.100mL的10mM N，N-二乙基间甲苯甲酰胺(DEET；HPLC外标)，并且通过HPLC分析所得的溶液中MTSO(甲基对甲苯亚砜)，其为MTS与过乙酸反应产生的化学计量氧化产物。对照反应在没有加入提取蛋白或甘油三乙酸酯的情况下进行，以确定测试混合物中MTS被过氧化氢氧化的速率，用来校正背景MTS氧化下过乙酸的产生速率。HPLC方法：Supelco Discovery C8柱(10cm×4.0mm，5μm)(目录号569422-U)，配有Supelco SupelguardDiscovery C8前置柱(Sigma-Aldrich；目录号59590-U)；10微升进样体积；梯度法，CH₃CN(Sigma-Aldrich；目录号270717)和去离子水，速率1.0mL/min，环境温度。

表2：HPLC梯度法分析过乙酸。

时间(分钟：秒)	(％CH₃CN)
		0:00	40
3:00	40
		3:10	100
4:00	100
		4:10	40
7:00(停止)	40

那不勒斯栖热袍菌过水解酶/海藻糖喷雾干燥粉末的过水解酶活性在40℃保存8周是稳定的(表2)。

表3：那不勒斯栖热袍菌过水解酶/海藻糖喷雾干燥酶粉在40℃保存期间的温度稳定性。甘油三乙酸酯(100mM)和H₂O₂(100mM)在含有那不勒斯栖热袍菌过水解酶/海藻糖喷雾干燥粉末(50μg蛋白/mL)和TURPINAL

SL(500ppm)的碳酸氢钠缓冲液(50mM，pH 7.2)中在25℃反应5分钟产生的PAA(ppm)。

实施例9

酶粉和甘油三乙酸酯混合物中的那不勒斯栖热袍菌过水解酶/海藻糖喷雾干燥酶粉的温度稳定性

如实施例8所述制备喷雾干燥酶粉，评估甘油三乙酸酯中喷雾干燥粉末混合物在40℃保存8周时的稳定性。将喷雾干燥酶粉加入甘油三乙酸酯中以产生在87.2g甘油三乙酸酯中含有0.200g蛋白质的混合物。所得混合物保存于40℃，并每周在25℃于100mL反应体系中分析2.19g充分混合的混合物样品，此100mL反应体系含有50mM碳酸氢钠缓冲液(pH 7.2)中的100mM过氧化氢和TURPINAL

SL(500ppm)，其中所得的甘油三乙酸酯和蛋白质的浓度分别为100mM和50μg/mL。表4中的数据与表3中实施例8的数据相比显示了那不勒斯栖热袍菌过水解酶/海藻糖喷雾干燥酶粉当与甘油三乙酸酯混合保存时的不稳定性。

表4：那不勒斯栖热袍菌过水解酶/海藻糖喷雾干燥酶粉以酶粉和甘油三乙酸酯的混合物形式在40℃保存时的温度稳定性。甘油三乙酸酯(100mM)和H₂O₂(100mM)在含有那不勒斯栖热袍菌过水解酶(50μg蛋白/mL)和TURPINAL

SL(500ppm)的碳酸氢钠缓冲液(50mM，pH7.2)中在25℃反应5分钟产生的PAA(ppm)。

实施例10

那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉的温度稳定性

制备含有在50mM碳酸氢钠(pH 8.1)中的如下物质的含水混合物：大肠杆菌KLP18/pSW196热处理的细胞提取蛋白(34g蛋白/L，PAGE显示那不勒斯栖热袍菌过水解酶含量≥90％)和作为赋形剂的麦芽糖糊精(66.7g/L MALTRINM100麦芽糖糊精，14.7g/L MALTRIN

M250，14.7g/L MALTRIN

M040，Grain Processing Corporation，Muscatine，IA)。用喷雾干燥器(GEA Niro，直径3英尺，入口温度＝226℃，出口温度＝76℃，进料速率＝60g/min)喷雾干燥该溶液以产生喷雾干燥酶粉；用BCA(二喹啉甲酸)蛋白分析测定粉末中蛋白的重量百分比(20.3重量％)，并且用调制式差示扫描量热法测定该粉末的玻璃化转变温度(Tg＝54℃)。喷雾干燥该溶液以产生粉末，然后测试所得粉末在40℃保存9周的稳定性。喷雾干燥的酶粉(保存于40℃)间隔1周取样，并用50mM碳酸氢盐缓冲液(pH 7.2)中的如下物质在25℃下分析活性：50μg蛋白/mL的那不勒斯栖热袍菌过水解酶、H₂O₂(100mM)、甘油三乙酸酯(100mM)和TURPINAL

SL(500ppm)，并且采用以上改进的Karst等人所报道的分析方法分析过乙酸的产生。那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥粉末的过水解酶活性在40℃保存8周是稳定的(表5)。

表5：那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉在40℃保存期间的温度稳定性。甘油三乙酸酯(100mM)和H₂O₂(100mM)在含有那不勒斯栖热袍菌过水解酶(50μg蛋白/mL)和TURPINAL

实施例11

保存于酶粉和甘油三乙酸酯混合物中的那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉的温度稳定性

如实施例10所述制备喷雾干燥酶粉，评估甘油三乙酸酯中喷雾干燥粉末混合物在40℃保存21周时的稳定性。将喷雾干燥酶粉(1.235g，20.3重量％的蛋白质)加入109g的甘油三乙酸酯中。所得混合物保存于40℃，并以一式两份在25℃于100mL反应体系中分析2.19g充分混合的混合物样品，此100mL反应体系含有50mM碳酸氢钠缓冲液(pH 7.2)中的过氧化氢(100mM)和TURPINAL

SL(500ppm)，其中所得的甘油三乙酸酯和蛋白质的浓度分别为100mM和50μg/mL。表6中的数据与表5中实施例10的数据相比显示了那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉当与甘油三乙酸酯混合保存时的稳定性。

表6：那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉以酶粉和甘油三乙酸酯的混合物形式在40℃保存时的温度稳定性。甘油三乙酸酯(100mM)和H₂O₂(100mM)在含有那不勒斯栖热袍菌过水解酶(50μg蛋白/mL)和TURPINALSL(500ppm)的碳酸氢钠缓冲液(50mM，pH 7.2)中在25℃反应5分钟产生的PAA(ppm)。

ND＝没有进行双重分析

实施例12

保存于酶粉、碳酸氢钠和甘油三乙酸酯混合物中的那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉的温度稳定性

如实施例10所述制备喷雾干燥酶粉，评估甘油三乙酸酯和碳酸氢钠混合物中喷雾干燥粉末混合物40℃保存21周时的稳定性。将喷雾干燥酶粉(0.988g，20.3重量％蛋白)加入87.2g甘油三乙酸酯和16.8g碳酸氢钠(等级3DF(粉末)，Church&Dwight)的混合物中。所得混合物保存于40℃，并以一式两份在25℃于100mL反应体系中分析2.62g充分混合的混合物样品，此100mL反应体系含有过氧化氢(100mM)和TURPINAL

SL(500ppm)，其中所得的甘油三乙酸酯、碳酸氢钠和蛋白质的浓度分别为100mM、50mM(pH 7.2)和50μg/mL。表7中的数据与表6中实施例11的数据相比显示，那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉在以甘油三乙酸酯和固体碳酸氢钠混合物的形式在40℃保存21周时的稳定性与那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉只以单独甘油三乙酸酯混合物的形式在40℃保存21周时的稳定性相比得到了改善。在更长保存时间，例如21周时，在甘油三乙酸酯和碳酸氢钠混合物中的过水解酶仍然保留大约100％的初始活性。

表7：那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉以酶粉、固体碳酸氢钠和甘油三乙酸酯混合物的形式在40℃保存时的温度稳定性。甘油三乙酸酯(100mM)和H₂O₂(100mM)在含有那不勒斯栖热袍菌过水解酶(50μg蛋白/mL)和TURPINAL

ND＝没有进行双重分析

实施例13

海栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉的温度稳定性

制备含有在50mM碳酸氢钠(pH 8.1)中的如下物质的含水混合物：大肠杆菌KLP18/pSW207热处理的细胞提取蛋白(21g蛋白/L，PAGE显示海栖热袍菌过水解酶含量≥90％)和作为赋形剂的麦芽糖糊精(31g/L麦芽糖糊精DE 13-17和31g/L麦芽糖糊精DE 4-7，Aldrich)。用Buchi B-290玻璃喷雾干燥器(入口温度＝170℃，出口温度＝90℃，进料速率＝4.5mL/min)喷雾干燥该溶液以产生喷雾干燥酶粉；用BCA(二喹啉甲酸)蛋白分析测定粉末中蛋白的重量百分比(18.0重量％)，并且用调制式差示扫描量热法测定该粉末的玻璃化转变温度(Tg＝90℃)。喷雾干燥该溶液以产生粉末，然后测试所得粉末在40℃保存7周的稳定性。喷雾干燥的酶粉(保存于40℃)间隔1周取样，并用50mM碳酸氢盐缓冲液(pH 7.2)中的如下物质在25℃下分析活性：50μg蛋白/mL的海栖热袍菌过水解酶、H₂O₂(H₂O₂(100mM)、甘油三乙酸酯(100mM)和TURPINAL

SL(500ppm)，并且采用以上改进的Karst等人所报道的分析方法分析过乙酸的产生。海栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥粉末的过水解酶活性在40℃保存7周是稳定的(表8)。

表8：海栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉在40℃保存期间的温度稳定性。甘油三乙酸酯(100mM)和H₂O₂(100mM)在含有海栖热袍菌过水解酶(50μg蛋白/mL)和TURPINAL

实施例14

保存于酶粉和甘油三乙酸酯混合物中的海栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉的温度稳定性

如实施例13所述制备喷雾干燥酶粉，评估甘油三乙酸酯中喷雾干燥粉末混合物在40℃保存7周时的稳定性。将喷雾干燥酶粉(0.556g，18.0重量％的蛋白质)加入43.6g的甘油三乙酸酯中。所得混合物保存于40℃，并以一式两份在25℃于100mL反应体系中分析2.21g充分混合的混合物样品，此100mL反应体系含有50mM碳酸氢钠缓冲液(pH 7.2)中的过氧化氢(100mM)和TURPINAL

SL(500ppm)，其中所得的甘油三乙酸酯和蛋白质的浓度分别为100mM和50μg/mL。表9中的数据与实施例13中表8的数据相比显示了海栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉当与甘油三乙酸酯混合保存时的稳定性。

表9：海栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉以酶粉和甘油三乙酸酯的混合物形式在40℃保存期间的温度稳定性。甘油三乙酸酯(100mM)和H₂O₂(100mM)在含有海栖热袍菌过水解酶(50μg蛋白/mL)和TURPINAL

实施例15

保存于酶粉、碳酸氢钠和甘油三乙酸酯混合物中的海栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉的温度稳定性

如实施例13所述制备喷雾干燥酶粉，评估甘油三乙酸酯和碳酸氢钠混合物中喷雾干燥粉末混合物在40℃保存7周时的稳定性。将喷雾干燥酶粉(0.556g，18.0重量％蛋白)加入43.6g甘油三乙酸酯和8.4g碳酸氢钠(等级3DF(粉末)，Church&Dwight)的混合物中。所得混合物保存于40℃，并以一式两份在25℃于100mL反应体系中分析2.63g充分混合的混合物样品，此100mL反应体系含有过氧化氢(100mM)和TURPINAL

SL(500ppm)，其中所得的甘油三乙酸酯、碳酸氢钠缓冲液(pH 7.2)和蛋白质的浓度分别为100mM、50mM和50μg/mL。表10中的数据与实施例14中表9的数据相比显示，海栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉在以甘油三乙酸酯和固体碳酸氢钠混合物的形式在40℃保存5、6和7周时的稳定性与那不勒斯栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉只以单独甘油三乙酸酯混合物的形式在40℃保存5、6和7周时的稳定性相比得到了改善。

表10：海栖热袍菌过水解酶/麦芽糖糊精喷雾干燥酶粉以酶粉、碳酸氢钠和甘油三乙酸酯混合物的形式在40℃保存时的温度稳定性。甘油三乙酸酯(100mM)和H₂O₂(100mM)在含有海栖热袍菌过水解酶(50μg蛋白/mL)和TURPINAL

实施例16

加入的溶剂对那不勒斯栖热袍菌过水解酶产生过乙酸的影响

用50％氢氧化钠水溶液将90.0g的去离子水、0.350g的TURPINAL

SL((1-羟基-1-磷酰乙基)膦酸，60重量％水溶液；Thermphos International)和3.20g 30重量％溶于水中的过氧化氢组成的第一混合物调节至pH 7.2，并用去离子水将混合物最终重量调节至100.0g。制备由如下物质组成的第二混合物：55.76g甘油三乙酸酯，4.20g碳酸氢钠，2.50g CAB-O-SILM5(Cabot)，0.270g喷雾干燥的那不勒斯栖热袍菌过水解酶(实施例10)，和37.43g选自以下的一种有机溶剂：三丙二醇甲醚(DOWANOLTPM)、二丙二醇甲醚(DOWANOL

DPM)、丙二醇甲醚(DOWANOL

PM)、二乙二醇丁醚(DOWANOL

DB)、二丙二醇(DOWANOL

DPG)、三乙二醇、1，2-丙二醇、N-乙基-2-吡咯烷酮、异丙醇、乙醇、乳酸乙酯或1，3-丙二醇。取1.0g一份等分的第二混合物，同时快速搅拌(以悬浮未溶解固体)，并在25℃下将该份第二混合物搅拌加入到9.00mL的过氧化氢和TURPINAL

SL在水中形成的第一混合物(pH 7.2)中使两者混合；所得混合物含有255mM甘油三乙酸酯、254mM过氧化氢和0.055mg蛋白/mL的喷雾干燥的过水解酶。还进行每种溶剂的对照反应，以测定在没有加入蛋白的情况下用过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯产生的过乙酸的浓度。

反应混合物中过乙酸的浓度的测定根据Karst等人描述的方法进行。在预定的时间取出反应混合物的等分试样(0.040mL)并与0.960mL的溶于水中的5mM磷酸混合；调节稀释样品的pH至小于pH 4，立即终止反应。使用ULTRAFREE

MC-过滤装置(30,000标称分子量(NMWL)，Millipore目录号UFC3LKT 00)以12,000rpm离心2分钟来过滤所得溶液。将一份等分(0.100mL)的所得滤液转入含有0.300mL去离子水的1.5mL HPLC螺旋盖小瓶中(Agilent Technologies，PaloAlto，CA；#5182-0715)，然后加入溶于乙腈中的0.100mL 20mM的MTS(甲基对甲苯硫醚)，盖上小瓶，短暂混合内容物，然后在大约25℃避光孵育10分钟。然后向每个小瓶中加入0.400mL的乙腈和0.100mL的三苯基膦(TPP，40mM)乙腈溶液中，再次盖上小瓶，混合所得溶液并在大约25℃避光孵育30分钟。然后向每个小瓶中加入0.100mL的10mM N，N-二乙基间甲苯甲酰胺(DEET；HPLC外标)并用表2中所述的HPLC分析所得溶液。

HPLC方法：

Supelco Discovery C8柱(10cm×4.0mm，5μm)(目录号569422-U)，配有前置柱Supelco Supelguard Discovery C8(Sigma-Aldrich；目录号59590-U)；10微升进样体积；梯度法，CH₃CN(Sigma-Aldrich；#270717)和去离子水，速率1.0mL/min，环境温度：

上述反应进行0.5min、1min、2min、5min和10min产生的过乙酸浓度在下表11中列出。

表11

采用255mM甘油三乙酸酯、254mM过氧化氢和0.055mg/mL的喷雾干燥的那不勒斯栖热袍菌过水解酶得出的过乙酸(PAA)浓度对溶剂加入的依赖性。

为了证实甘油三乙酸酯和有机溶剂的混合物中的喷雾干燥的酶的稳定性，将甘油三乙酸酯、碳酸氢钠、CAB-O-SIL

M5(Cabot)、喷雾干燥的那不勒斯栖热袍菌过水解酶(实施例10)以及三丙二醇甲醚(DOWANOL

TPM)或如上所述的1，2-丙二醇形成的混合物在环境温度下保存24小时，然后取1.0g一份等分的这些混合物的每种混合物，同时快速搅拌(以悬浮未溶解的固体)，并与9.0mL新鲜配制(如上所述)的过氧化氢和TURPINAL

SL在水中形成的混合物(pH 7.2)在25℃搅拌混合；所得混合物含有255mM甘油三乙酸酯、254mM过氧化氢和0.055mg蛋白/mL的喷雾干燥的过水解酶。还进行每种溶剂的对照反应，以测定在没有加入蛋白的情况下用过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯产生的过乙酸的浓度。反应混合物中过乙酸的浓度的测定根据Karst等人描述的方法进行。(表12)。

表12

在含有255mM甘油三乙酸酯和254mM过氧化氢的反应物中测定的甘油三乙酸酯溶剂悬浮液中过水解酶的稳定性。

实施例16

在存在或不存在所加溶剂的情况下对那不勒斯栖热袍菌过水解酶产生过乙酸的比较

用50％氢氧化钠水溶液将40.0g的去离子水、0.1575g的TURPINAL

SL((1-羟基-1-磷酰乙基)膦酸，60重量％水溶液；Thermphos International)和1.44g 30重量％溶于水中的过氧化氢组成的第一混合物调节至pH 7.2，并用去离子水将混合物最终重量调节至46.87g。制备由如下物质组成的第二混合物：2.78g甘油三乙酸酯，0.210g碳酸氢钠，0.125g CAB-O-SIL

M5(Cabot)和0.0135g喷雾干燥的那不勒斯栖热袍菌过水解酶(实施例10)，并将过氧化氢和TURPINAL

SL在水中形成的第一混合物(pH 7.2)在25℃搅拌加入第二混合物中；所得混合物含有255mM甘油三乙酸酯、254mM过氧化氢和0.055mg蛋白/mL的喷雾干燥的过水解酶。反应混合物中过乙酸的浓度的测定根据以上Karst等人描述的方法进行。还进行对照反应，以测定在没有加入过水解酶的情况下用过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯产生的过乙酸的浓度。

重复如上所述反应，其中反应混合物中1.872g的丙二醇单甲醚(DOWANOL

PM)或二丙二醇单甲醚(DOWANOL

DPM)用等量的水代替。用50％氢氧化钠水溶液将40.0g的去离子水、0.175g的TURPINAL

SL和1.60g 30重量％溶于水中的过氧化氢组成的第一混合物调节至pH 7.2，并用去离子水将混合物最终重量调节至50.0g。制备由如下物质组成的第二混合物：2.78g甘油三乙酸酯、1.872g的丙二醇单甲醚(DOWANOL

PM)或二丙二醇单甲醚(DOWANOL

DPM)、0.210g的碳酸氢钠、0.125g的CAB-O-SIL

M5(Cabot)和0.0135g的喷雾干燥的那不勒斯栖热袍菌过水解酶(实施例10)，并将45.0g的过氧化氢和TURPINAL

SL在水中形成的第一混合物(pH7.2)在25℃搅拌加入第二混合物中；所得混合物(pH 6.5)含有255mM甘油三乙酸酯、254mM过氧化氢和0.055mg蛋白/mL的喷雾干燥的过水解酶。还进行对照反应，以测定在没有加入提取蛋白的情况下用过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯产生的过乙酸的浓度。上述三个反应进行0.5min、1min、2min、5min和10min产生的过乙酸浓度在下表13中列出。

表13

采用255mM甘油三乙酸酯、254mM过氧化氢和55μg/mL的喷雾干燥的那不勒斯栖热袍菌过水解酶得出的过乙酸(PAA)浓度对溶剂加入的依赖性。

实施例17

使用双隔室喷雾瓶利用溶剂原位生成过氧羧酸

与搅拌反应的比较

用50％氢氧化钠水溶液将100g含2000ppm TURPINAL

SL((1-羟基-1-磷酰乙基)膦酸，60重量％水溶液；Thermphos International)的0.20M柠檬酸钠缓冲液、280g的去离子水和5.20g 30重量％溶于水中的过氧化氢组成的第一混合物调节至pH 7.2，并用去离子水将混合物最终重量调节至400g。单独制备含有以下物质的第二混合物：83.4g甘油三乙酸酯、3.75g CAB-O-SILM5(Cabot)、0.750g的喷雾干燥的那不勒斯栖热袍菌过水解酶(实施例10)，以及62.1g的选自以下的单一溶剂：丙二醇甲醚(DOWANOL

PM)、三丙二醇甲醚(DOWANOLTPM)、二乙二醇甲醚(DOWANOL

DM)、丙二醇正丁醚(DOWANOL

PNB)、丙二醇正丙醚(DOWANOL

PnP)、丙二醇单甲醚乙酸酯(DOWANOLPMA)、二丙二醇、乙醇、异丙醇和1，2-丙二醇。在25℃下的第一反应中，搅拌1.0g第一混合物与9.0g第二混合物，进行第一个30至60秒的反应(反应pH为6.5至6.0)，取出样品，分析过乙酸产物；所得反应混合物含有255mM甘油三乙酸酯、103mM过氧化氢和100μg蛋白/mL的喷雾干燥的过水解酶。反应混合物中过乙酸的浓度(下表14)的测定根据以上Karst等人描述的方法进行。还进行对照反应，以测定在没有加入过水解酶的情况下用过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯产生的过乙酸的浓度。

将如上所述制备的第一混合物和第二混合物分别装载到双隔室喷雾瓶(定制的双液可变比率喷雾器，型号DLS 200，由Take5(RogueRiver，OR)制造)的两个隔室之一中，其中将喷雾瓶设置为可喷出9重量份的第一混合物与1重量份的第二混合物的混合物。将该两种混合物喷入12.5cm直径的结晶皿中，所得反应混合物(反应pH为6.5至6.0)含有255mM甘油三乙酸酯、100mM过氧化氢和0.100mg蛋白/mL的喷雾干燥的过水解酶。在预定的时间取样喷雾的反应混合物并根据以上Karst等人所述的方法分析过乙酸(下表14)。

表14

在分批搅拌反应中和在喷雾的双组分混合物中采用255mM甘油三乙酸酯、103mM过氧化氢和100μg/mL的喷雾干燥的那不勒斯栖热袍菌过水解酶得出的过乙酸(PAA)浓度对溶剂加入的依赖性。

实施例18

用海栖热袍菌过水解酶作为酶催化剂制备过氧羧酸

根据实施例1至3和5中所述的方法完成海栖热袍菌过水解酶的克隆和表达。根据前文的实施例6对表达海栖热袍菌过水解酶的细菌转化体进行发酵，并用实施例13中所述的方法制备喷雾干燥的海栖热袍菌过水解酶。与海栖热袍菌过水解酶的克隆、表达和制备技术相关的其他信息可参见提交于2008年6月20日的美国专利12/143,375。

对存在和不存在附加溶剂的情况下对海栖热袍菌过水解酶产生过乙酸的比较。用50％氢氧化钠水溶液将40.0g的去离子水、0.1575g的TURPINAL

SL((1-羟基-1-磷酰乙基)膦酸，60重量％水溶液；Thermphos International)和1.44g 30重量％溶于水中的过氧化氢组成的第一混合物调节至pH 7.2，并用去离子水将混合物最终重量调节至46.87g。制备由如下物质组成的第二混合物：2.78g甘油三乙酸酯、0.210g碳酸氢钠、0.125g CAB-O-SIL

M5(Cabot)和0.0135g喷雾干燥的海栖热袍菌过水解酶，并将过氧化氢和TURPINAL

SL在水中形成的第一混合物(pH 7.2)在25℃搅拌加入第二混合物中；所得混合物包含255mM甘油三乙酸酯、254mM过氧化氢和0.055mg蛋白/mL喷雾干燥的过水解酶。根据以上Karst等人所述的方法测定反应混合物中过乙酸的浓度。还进行对照反应，以测定在没有加入过水解酶的情况下用过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯产生的过乙酸的浓度。

PM)或二丙二醇单甲醚(DOWANOLDPM)用等量的水代替。用50％氢氧化钠水溶液将40.0g的去离子水、0.175g的TURPINAL

SL和1.60g 30重量％溶于水中的过氧化氢组成的第一混合物调节至pH 7.2，并用去离子水将混合物最终重量调节至50.0g。制备由如下物质组成的第二混合物：2.78g甘油三乙酸酯、1.872g丙二醇单甲醚(DOWANOLPM)或二丙二醇单甲醚(DOWANOL

DPM)、0.210g碳酸氢钠、0.125g CAB-O-SIL

M5(Cabot)和0.0135g喷雾干燥的海栖热袍菌过水解酶，并将45.0g的过氧化氢和TURPINAL

SL在水中形成的第一混合物(pH 7.2)在25℃搅拌加入第二混合物中；所得混合物(pH 6.5)含有255mM甘油三乙酸酯、254mM过氧化氢和0.055mg蛋白/mL的喷雾干燥的过水解酶。还进行对照反应，以测定在没有加入提取蛋白的情况下用过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯产生的过乙酸的浓度。测量并记录上述三个反应进行0.5min、1min、2min、5min和10min产生的过乙酸浓度。

实施例19

使用双隔室喷雾装置利用溶剂原位生成过氧羧酸与使用海栖热袍菌过水解酶的搅拌反应的比较

用50％氢氧化钠水溶液将100g含2000ppm TURPINAL

SL((1-羟基-1-磷酰乙基)膦酸，60重量％水溶液；Thermphos International)的0.20M柠檬酸钠缓冲液、280g的去离子水和5.20g 30重量％溶于水中的过氧化氢组成的第一混合物调节至pH 7.2，并用去离子水将混合物最终重量调节至400g。单独制备含有以下物质的第二混合物：83.4g甘油三乙酸酯、3.75g CAB-O-SIL

M5(Cabot)、0.750g喷雾干燥的海栖热袍菌过水解酶(实施例13)，以及62.1g选自以下的单一溶剂：丙二醇甲醚(DOWANOL

PM)、三丙二醇甲醚(DOWANOL

TPM)、二乙二醇甲醚(DOWANOL

DM)、丙二醇正丁醚(DOWANOL

PNB)、丙二醇正丙醚(DOWANOL

PnP)、丙二醇单甲醚乙酸酯(DOWANOLPMA)、二丙二醇、乙醇、异丙醇和1，2-丙二醇。在25℃下的第一反应中，搅拌1.0g第一混合物与9.0g第二混合物，进行第一个30至60秒的反应(反应pH 6.5至6.0)，取出样品，分析过乙酸产物；所得反应混合物包含255mM甘油三乙酸酯、103mM过氧化氢和100μg蛋白/mL喷雾干燥的过水解酶。根据以上Karst等人所述的方法测定反应混合物中过乙酸的浓度。还进行对照反应，以测定在没有加入过水解酶的情况下用过氧化氢化学过水解甘油三乙酸酯产生的过乙酸的浓度。

将如上所述制备的第一混合物和第二混合物分别装载到双隔室喷雾瓶(定制的双液可变比率喷雾器，型号DLS 200，由Take5(RogueRiver，OR)制造)的两个隔室之一中，其中将喷雾瓶设置为可喷出9重量份的第一混合物与1重量份的第二混合物的混合物。将该两种混合物喷入12.5cm直径的结晶皿中，所得反应混合物(反应pH为6.5至6.0)含有255mM甘油三乙酸酯、100mM过氧化氢和0.100mg蛋白/mL喷雾干燥的过水解酶。在预定的时间取样喷雾的反应混合物并根据以上Karst等人所述的方法分析过乙酸。

实施例20

示例性的双组分体系

下文描述了双组分原位过氧羧酸消毒剂制剂的一个实例。

对于上述双组分原位过氧羧酸消毒剂制剂而言，组分A占组分A和组分B合并重量的大约2.6重量％，组分B与组分A的重量比为大约38∶1。在双组分原位过氧羧酸消毒剂制剂的某些应用中，期望组分B与组分A的比率在1∶1至10∶1的范围内，其中将10份至1份(按重量计)组分B与1份(按重量计)组分A混合，制备具有有效消毒浓度的过氧羧酸。例如，在第一种应用中，使用双隔室喷雾瓶，如双液固定比率喷雾器(型号DLS100，Take5)或双液可变比率喷雾器(型号DLS200，Take5)，其中采用的组分B与组分A的最大比率为10∶1。在第二种应用中，使用包含两个被易碎密封件隔开的单独隔室的单个瓶子，其中两个单独隔室的体积比率为1∶1或5∶1或10∶1。在这些应用的每一个中，都不能以所需的组分A和组分B的比率混合双组分制剂，从而无法提供所需的反应物浓度和产物终浓度。

实施例21

那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体的过水解酶活性测定

如代理人档案号为CL4392 US NA、题目为“ImprovedPerhydrolases for Enzymatic Peracid Production”的共同拥有的、同时提交的和共同未决的美国专利申请的实施例4中所述制备那不勒斯栖热袍菌突变体文库。简而言之，在SEQ ID NO：6的氨基酸残基F213、I276、C277和N93处进行饱和诱变，以便将其他19个可能的氨基酸中的每一个单独引入每个指定的位置。

用QUIKCHANGE

(Stratagene，La Jolla，CA)试剂盒按照制造商的说明书进行突变。用1U的DpnI在37℃下将扩增质粒处理1小时。处理过的质粒用于转化化学感受态大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene)(残基213、276和277)或化学感受态大肠杆菌TOP10F’(Invitrogen，Carlsbad，CA)(残基93)。将转化体涂布在补加有0.1mg氨苄青霉素/mL的LB琼脂上，在37℃下培养过夜。挑取最多五个单独的菌落，并对质粒DNA进行测序，以确定预期的突变。

将各个突变体菌落挑取到包含0.1mL LB和0.1mg氨苄青霉素/mL的96孔板中，在37℃下培养过夜，不用摇动。将0.003mL过夜培养物转移到包含0.3mL LB、0.5mM IPTG和0.1mg氨苄青霉素/mL的“诱导板”(96深孔)上。将诱导板在37℃下振摇培养过夜。将0.01mL诱导培养物转移到包含0.09mL的56mg/mL CELYTIC^TM Express(Sigma Aldrich，St.Louis，MO)的“溶菌板”(96孔)上。首先将板轻微摇动，然后在25℃下孵育30分钟。将大约0.01mL溶菌培养物转移到包含0.09mL“pH 5.0测定溶液”(100mM甘油三乙酸酯、100mM过氧化氢、50mM pH 5.0乙酸)的“测定板”(96孔)上。将大约0.01mL的溶菌培养物转移到包含0.09mL“pH 7.5测定溶液”(100mM甘油三乙酸酯、100mM过氧化氢、50mM pH 7.5磷酸钠)的“pH 7.5测定板”(96孔)上。将板轻轻地摇动30秒，然后在环境温度下孵育10分钟。通过加入0.1mL“终止缓冲液”(100mM邻苯二胺(OPD)、500mMNaH₂PO₄ pH 2.0)结束测定。将板轻轻摇动30秒，然后在25℃下孵育30分钟。用SPECTRAMAX

Plus384 plus(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)读取无盖时458nm处的吸光度。分析结果显示，四个变体的过水解酶活性显著大于天然酶(表15和16)。四个都是半胱氨酸在残基277(C277A、C277V、C277S和C277T；参见SEQ ID NO：19)处发生变化。

表15：那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体在pH 5.0的过水解酶活性(U/mL)。

表16：那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体在pH 7.5的过水解酶活性(U/mL)。

实施例22

那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体在大肠杆菌KLP18

中的表达用具有确定的乙酰木聚糖酯酶突变的质粒转化大肠杆菌KLP18(实施例3)。将转化体涂布到LB-氨苄青霉素(100μg/mL)板上，在37℃下孵育过夜。用2.5mL补加有20％(体积比)甘油的LB培养基从板上获得细胞，并将1.0mL等分试样的所得细胞悬浮液在-80℃下冷冻。将1mL解冻的细胞悬浮液转移到含有0.7L培养基的1L APPLIKON

生物反应器(Applikon

Biotechnology，Foster City，CA)中，其中培养基包含KH₂PO₄(5.0g/L)、FeSO₄七水合物(0.05g/L)、MgSO₄七水合物(1.0g/L)、二水合柠檬酸钠(1.90g/L)、酵母提取物(Amberex 695，5.0g/L)、Biospumex153K消泡剂(0.25mL/L，CognisCorporation)、NaCl(1.0g/L)、CaCl₂二水合物(0.1g/L)和NIT痕量元素溶液(10mL/L)。痕量元素溶液含有一水合柠檬酸(10g/L)、MnSO₄水化物(2g/L)、NaCl(2g/L)、FeSO₄七水合物(0.5g/L)、ZnSO₄七水合物(0.2g/L)、CuSO₄五水合物(0.02g/L)和NaMoO₄二水合物(0.02g/L)。灭菌后加入的添加剂包括葡萄糖溶液(50％重量比，6.5g)和氨苄青霉素(25mg/mL)储备液(2.8mL)。葡萄糖溶液(50％重量比)也用于分批补料。在葡萄糖浓度降低到低于0.5g/L后40分钟，开始补加葡萄糖，起始进料速率为0.03g/分钟，随后每小时分别逐渐增加至0.04、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.12和0.14g/min；之后速率保持不变。监测培养基中的葡萄糖浓度，如果浓度超过0.1g/L，则降低进料速率或暂时停止进料。在OD₅₅₀＝50时，添加0.8mL IPTG(0.05M)开始诱导。首先通过搅拌(400至1000rpm)，然后通过通气(0.5至2slpm)将溶解氧(DO)浓度控制在25％的空气饱和度。将温度控制在37℃，将pH控制在6.8；用NH₄OH(29％重量比)和H₂SO₄(20％重量体积比)进行pH控制。在添加IPTG后20h时通过离心(5,000×g 15分钟)收获细胞。

实施例23

制备包含半纯化的那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶或那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体的细胞裂解物

如实施例6所述培养大肠杆菌KLP18/pSW196(那不勒斯栖热袍菌野生型过水解酶)的细胞培养物。将所得细胞沉淀物(以20％重量体积比)重悬于补加有1.0mM DTT的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中。将重悬的细胞两次通过弗氏压碎器，以确保＞95％的细胞裂解。将裂解的细胞以12,000×g离心30分钟，将上清液在75℃下加热20分钟，然后在冰浴中骤冷2分钟。通过11,000×g离心10分钟移除沉淀的蛋白质。SDS-PAGE显示，在热处理的提取上清液中，CE-7酶占全部蛋白质的大约85至90％。

如实施例22所述分别培养大肠杆菌KLP18/pSW196/C277S(那不勒斯栖热袍菌C277S变异的过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW196/C277V(那不勒斯栖热袍菌C277V变异的过水解酶)、大肠杆菌KLP18/pSW196/C277A(那不勒斯栖热袍菌C277A变异的过水解酶)和大肠杆菌KLP18/pSW196/C277T(那不勒斯栖热袍菌C277T变异的过水解酶)的细胞培养物。将所得细胞沉淀物(以20％重量体积比)重悬于补加有1.0mM DTT的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中。将重悬的细胞两次通过弗氏压碎器，以确保＞95％的细胞裂解。将裂解的细胞以12,000×g离心30分钟，将上清液在75℃下加热20分钟，然后在冰浴中骤冷2分钟。通过11,000×g离心10分钟移除沉淀的蛋白质。SDS-PAGE显示，在热处理的提取上清液中，CE-7酶占全部蛋白质的大约85至90％。

实施例24

那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖野生型酯酶和C277酯酶变体的比活性以及过水解/水解比率

在25℃下在磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.2)中进行反应(40mL总体积)，其中缓冲液包含甘油三乙酸酯(100mM)、过氧化氢(100mM)和以下乙酰木聚糖酯酶突变体之一：那不勒斯栖热袍菌C277S变异的过水解酶(来自大肠杆菌KLP18/pSW196/C277S的0.010mg/mL热处理的提取总蛋白质)、那不勒斯栖热袍菌C277T变异的过水解酶(来自大肠杆菌KLP18/pSW196/C277T的0.010mg/mL热处理的提取总蛋白质)、那不勒斯栖热袍菌C277A变异的过水解酶(来自大肠杆菌KLP18/pSW196/C277A的0.0125mg/mL热处理的提取总蛋白质)和那不勒斯栖热袍菌C277V变异的过水解酶(来自大肠杆菌KLP18/pSW196/C277V的0.0125mg/mL热处理的提取总蛋白质)(如实施例23所述制备)。只在反应的最初30秒搅拌反应混合物，以初步混合反应物和酶。

用从大肠杆菌KLP18/pSW196(表达那不勒斯栖热袍菌野生型乙酰木聚糖酯酶(实施例1))分离的0.050mg/mL热处理的提取总蛋白质在与上文所述相同的条件下进行反应，其中热处理的提取上清液根据实施例23的步骤制备。

在每个反应1分钟后同时从上文所述的每种反应混合物中取出两个样品，之后每2分钟取一次，共进行15分钟，其中两个样品中的一个用于过乙酸分析，第二个样品用于分析通过甘油三乙酸酯的酶法水解以及后续样品中的过乙酸通过与甲基对甲苯硫醚(MTS，参见下文)的反应向乙酸的转化所产生的总乙酸。

通过以上改进的Karst等人所述的方法测量反应混合物中过乙酸的产生速率。在预定的时间移出反应混合物的一个样品(0.040mL)并立即与0.960mL的5mM的磷酸水溶液混合，通过将稀释的样品的pH调节至小于pH 4而终止反应。所得溶液使用ULTRAFREE

MC过滤装置(30,000标称分子量(NMWL)，Millipore Corp.，Billerica，MA；目录号UFC3LKT 00)以12,000rpm离心过滤2分钟。将一份等分(0.100mL)的所得滤液转入含有0.300mL去离子水的1.5mL HPLC螺旋盖小瓶(Agilent Technologies，Palo Alto，CA；#5182-0715)，然后加入0.100mL溶于乙腈中的20mM MTS(甲基对甲苯硫醚)，盖上小瓶，并短暂混合内容物，然后在大约25℃避光孵育10分钟。然后向小瓶中加入0.400mL的乙腈和0.100mL的三苯基膦(TPP，40mM)乙腈溶液中，再次盖上小瓶，混合所得溶液并在大约25℃避光孵育30分钟。然后向小瓶中加入0.100mL的10mM N，N-二乙基间甲苯甲酰胺(DEET；HPLC外标)，并且通过HPLC分析所得的溶液中MTSO(甲基对甲苯亚砜)，其为MTS与过乙酸反应产生的化学计量氧化产物。对照反应在没有加入提取蛋白或甘油三乙酸酯的情况下进行，以确定测试混合物中MTS被过氧化氢氧化的速率，用来校正背景MTS氧化下过乙酸的产生速率。HPLC方法：Supelco Discovery C8柱(10cm×4.0mm，5μm)(目录号569422-U)，配有Supelco SupelguardDiscovery C8前置柱(Sigma-Aldrich；目录号59590-U)；10微升进样体积；梯度法，CH₃CN(Sigma-Aldrich；目录号270717)和去离子水，速率1.0mL/min，环境温度(表17)。

表17：HPLC梯度法分析过乙酸。

为了确定反应中过水解酶催化的乙酸产生的速率，可在预定时间取出反应混合物样品(0.900mL)，并立即将其加入包含0.040mL 0.75MH₃PO₄的1.5mL微量离心管中，短暂混合所得溶液，pH为3.0至4.0时终止反应。然后向管中加入0.020mL的10mg/mL曲霉菌曲霉(Aspergillus niger)过氧化氢酶(Sigma-Aldrich；C3515)在50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中的溶液，混合所得溶液，让其在环境温度下反应15分钟，使未反应的过氧化氢发生歧化反应生成水和氧。然后向管中加入0.040mL 0.75M H₃PO₄，混合所得溶液，并用ULTRAFREE

MC过滤装置(30,000标称分子量(NMWL)，Millipore Corp.，目录号UFC3LKT00)以12,000rpm离心2分钟来过滤所得溶液。将一份等分(0.100mL)的所得滤液与0.150mL 20mM的溶于乙腈中的MTS(甲基对甲苯硫醚)混合，然后在大约25℃避光孵育所得溶液10分钟。用装有火焰离子化检测器(FID)和DB-FFAP柱(长15m；内径0.530mm；薄膜厚度1.00μm)的气相色谱仪(GC)测定通过甘油三乙酸酯的酶法水解以及通过过乙酸与MTS反应转化为乙酸而产生的样品中的乙酸的浓度；用新进样口衬管进行每次速率测定(共8次样品分析)，以避免随着时间推移磷酸积聚在进样口衬管上。

那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体比野生型酯酶具有显著更高的甘油三乙酸酯过水解比活性(表18)。用PAA产生速率(过水解速率)除以甘油三乙酸酯水解为乙酸的速率(水解速率)确定那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体的过水解/水解比率(用测定方法中PAA和乙酸的总乙酸产生速率计算，并校正过乙酸产生速率)；那不勒斯栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体的P/H比率大约等于或大于那不勒斯栖热袍菌野生型乙酰木聚糖酯酶的P/H比率(表18)。

表18：

实施例25

用海栖热袍菌克隆和表达乙酰木聚糖酯酶

合成GENBANK

(登录号NP_227893.1)中所报道的编码海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶的基因(DNA 2.0，Menlo Park CA)。随后通过PCR(94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟，70℃下1分钟，30个循环)用标识为SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53的引物对基因进行扩增。用限制性酶PstI和XbaI切割所得的核酸产物(SEQ ID NO：54)，并亚克隆在pUC19中的PstI与XbaI位点之间，以生成标识为pSW207的质粒。采用大肠杆菌中最优表达的密码子合成GENBANK

(登录号NP_227893.1)中所报道的海栖热袍菌中编码MSB8乙酰木聚糖酯酶的基因(DNA 2.0，Menlo Park CA)。随后通过PCR(94℃下0.5min，55℃下0.5min，70℃下1min，30个循环)用标识为SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：56的引物对基因进行扩增。用限制性酶EcoRI和PstI切割所得的核酸产物，并亚克隆在pTrc99A(GENBANK

登录号M22744)中的EcoRI和PstI位点之间，以生成标识为pSW228的质粒(包含密码子优化的海栖热袍菌编码序列SEQ ID NO：57)。分别用质粒pSW207和pSW228转化大肠杆菌KLP18(美国专利申请公布2008/0176299)，以生成标识为KLP18/pSW207和KLP18/pSW228的菌株。将KLP18/pSW207和KLP18/pSW228在37℃下振摇培养于LB培养基中直到OD_600nm＝0.4-0.5，达到该OD时加入终浓度为1mM的IPTG，并继续培养2-3h。离心收集细胞并进行SDS-PAGE以确定过水解酶的表达量占可溶性总蛋白的20-40％。

实施例26

C277残基处海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体的构建

用根据质粒pSW228中密码子优化的海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶序列(SEQ ID NO：57)设计的寡核苷酸引物对(表19)将海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶的C277(Cys277)位置变为Val、Ala、Ser和Thr中的每一个。用QUIKCHANGE

(Stratagene)按照制造商的说明书进行突变。用1U的DpnI在37℃下将扩增的质粒处理1小时。处理过的质粒用于转化化学感受态大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene)。将转化体涂布在补加有0.1mg氨苄青霉素/mL的LB琼脂上，在37℃下培养过夜。挑取最多五个单独的菌落，并对质粒DNA进行测序，以确定预期的突变。

表19：用于改变海栖热袍菌中第277位残基的寡核苷酸。

实施例27

海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体在大肠杆菌KLP18中的表达

用具有确定的乙酰木聚糖酯酶突变的质粒转化大肠杆菌KLP18(实施例3)。将转化体在37℃下振摇培养于LB培养基中直到OD_600nm＝0.4-0.5，达到该OD时加入终浓度为1mM的IPTG，并继续培养2-3h。离心收集细胞并进行SDS-PAGE以确定乙酰木聚糖酯酶的表达量占可溶性总蛋白的20-40％。

实施例28

制备包含半纯化的海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶突变体的细胞裂解物

用与实施例7所述相似的发酵方案以1L规模(Applikon)培育细胞培养物(如实施例27所述制备)。通过以5,000×g离心15分钟收获细胞，然后将细胞(以20％重量体积比)重悬于补加有1.0mM DTT的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中。将重悬的细胞两次通过弗氏压碎器，以确保＞95％的细胞裂解。将裂解的细胞以12,000×g离心30分钟，将上清液在75℃下加热20分钟，然后在冰浴中骤冷2分钟。通过11,000×g离心10分钟移除沉淀的蛋白质。SDS-PAGE显示，CE-7酶包含制剂中大约85至90％的总蛋白质。

实施例28

海栖热袍菌乙酰木聚糖野生型酯酶和C277酯酶变体的比活性和过水解/水解比率

在25℃下，在磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.2)中进行反应(40mL总体积)，其中缓冲液包含甘油三乙酸酯(100mM)、过氧化氢(100mM)和以下乙酰木聚糖酯酶变体之一：海栖热袍菌C277S变异的过水解酶(来自大肠杆菌KLP18/pSW228/C277S的0.010mg/mL热处理的提取总蛋白质)、海栖热袍菌C277T变异的过水解酶(来自大肠杆菌KLP18/pSW228/C277T的0.010mg/mL热处理的提取总蛋白质)、海栖热袍菌C277A变异的过水解酶(来自大肠杆菌KLP18/pSW228/C277A的0.0125mg/mL热处理的提取总蛋白质)和海栖热袍菌C277V变异的过水解酶(来自大肠杆菌KLP18/pSW228/C277V的0.0125mg/mL热处理的提取总蛋白质)(如实施例27中所述制备)。只在反应的最初30秒搅拌反应混合物，以初步混合反应物和酶。

还用从大肠杆菌KLP18/pSW228(表达海栖热袍菌野生型乙酰木聚糖酯酶(实施例25))分离的0.050mg/mL热处理的提取总蛋白质在与上文所述相同的条件下进行反应，其中热处理的提取上清液根据实施例27的步骤制备。

在每个反应1分钟后同时从上文所述的每种反应混合物中取出两个样品，之后每2分钟取一次，共进行15分钟，其中通过以上改进的Karst等人所述的方法对两个样品中的一个进行过乙酸分析，第二个样品用于分析通过甘油三乙酸酯的酶法水解以及后续样品中的过乙酸通过与甲基对甲苯硫醚(MTS)的反应向乙酸的转化所产生的总乙酸(参见实施例8)。

海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶突变体比野生型酯酶具有显著更高的甘油三乙酸酯过水解比活性(表20)。用PAA产生速率(过水解速率)除以甘油三乙酸酯水解为乙酸的速率(水解速率)确定海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体的过水解/水解比率(用测定方法中PAA和乙酸的总乙酸产生速率计算，并校正过乙酸产生速率)；海栖热袍菌乙酰木聚糖酯酶变体的P/H比率大约等于或大于那不勒斯栖热袍菌野生型乙酰木聚糖酯酶的P/H比率(表20)。

表20

实施例29

用过水解酶产生过乙酸

在10mM碳酸氢钠缓冲液(初始pH 8.1)中，在20℃下进行反应，反应物(100mL总体积)包含甘油三乙酸酯(2mM)、过氧化氢(10mM)和0.1μg/mL至2.0μg/mL热处理的细胞提取蛋白质(如上文所述制备，其中在85℃下进行20分钟的热处理)。反应混合物中过乙酸的浓度的测定根据以上Karst等人描述的方法进行。表21中列出了在1min、5min、20min、40min和60min内产生的过乙酸浓度。

表21：过乙酸(PAA)浓度对反应物中过水解酶浓度的依赖性，其中反应物包含碳酸氢钠缓冲液(10mM，初始pH 8.1)中的甘油三乙酸酯(2mM)和过氧化氢(10mM)，反应温度20℃，使用来自大肠杆菌KLP18/pSW228(海栖热袍菌野生型过水解酶)或大肠杆菌KLP18/pSW228/C277S(海栖热袍菌C277S变异的过水解酶)的热处理的提取蛋白质进行反应(双重反应)。

实施例30

用过水解酶产生过乙酸

在10mM碳酸氢钠缓冲液(初始pH 8.1)中，在20℃下进行反应，反应物(100mL总体积)包含甘油三乙酸酯(20mM)、过氧化氢(10mM)和0.1μg/mL至2.0μg/mL热处理的细胞提取蛋白质(如上文所述制备，其中在85℃下进行20分钟的热处理)。反应混合物中过乙酸的浓度的测定根据以上Karst等人描述的方法进行。表22中列出了在1min、5min、20min、40min和60min内产生的过乙酸浓度。

表22：过乙酸(PAA)浓度对反应物中过水解酶浓度的依赖性，其中反应物包含碳酸氢钠缓冲液(10mM，初始pH 8.1)中的甘油三乙酸酯(20mM)和过氧化氢(10mM)，反应温度20℃，使用来自大肠杆菌KLP18/pSW228(海栖热袍菌野生型过水解酶)或大肠杆菌KLP18/pSW228/C277S(海栖热袍菌C277S变异的过水解酶)的热处理的提取蛋白质进行反应(双重反应)。

实施例31

用过水解酶产生过乙酸

在25℃下，在磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.2)中进行反应(40mL总体积)，其中缓冲液包含甘油三乙酸酯(100mM)、过氧化氢(100mM)和10μg/mL至50μg/mL热处理的那不勒斯栖热袍菌或海栖热袍菌野生型或C277变异的过水解酶(如上文所述制备的热处理的细胞提取蛋白质，其中在75℃下进行20分钟的热处理)。只在反应的最初30秒搅拌反应混合物，以初步混合反应物和酶。反应混合物中过乙酸的浓度的测定根据以上Karst等人描述的方法进行。表23中列出了在1min、5min和30min内产生的过乙酸浓度。

表23：在25℃下使用热处理的那不勒斯栖热袍菌或海栖热袍菌野生型或C277突变的过水解酶在反应物中产生过乙酸(PAA)，其中反应物包含磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.2)中的甘油三乙酸酯(100mM)和过氧化氢(100mM)。

实施例32

用过水解酶产生过乙酸

在25℃下，在碳酸氢钠缓冲液(1mM，初始pH 6.0)中进行反应(10mL总体积)，其中反应物包含甘油三乙酸酯(100mM或150mM)、过氧化氢(100mM、250mM或420mM)和热处理的那不勒斯栖热袍菌或海栖热袍菌野生型、C277S或C277T变异的过水解酶(如上文所述制备的热处理的细胞提取蛋白质，其中在75℃下进行20分钟的热处理；浓度列于表24中)。用420mM过氧化氢(还另外包含500ppmTURPINAL

SL)进行反应。只在反应的最初30秒搅拌反应混合物，以初步混合反应物和酶。反应混合物中过乙酸的浓度的测定根据以上Karst等人描述的方法进行。表24中列出了在1min、5min和30min内产生的过乙酸浓度。

表24：在25℃下用热处理的海栖热袍菌野生型、C277S或C277T变异的过水解酶在反应物中产生过乙酸(PAA)，其中反应物包含碳酸氢盐缓冲液(1mM，pH 6.0或100mM，pH 8.1)或去离子水(pH 5.0)中的甘油三乙酸酯和过氧化氢。

Claims

1.用于生成过氧羧酸的多组分制剂，所述制剂包含：

(a)第一组分，所述第一组分包含：

(i)酶粉，所述酶粉包含：

(A)与SEQ ID NO：1的118-120对应的氨基酸位置处的RGQ基序；

(B)与SEQ ID NO：1的179-183对应的氨基酸位置处的GXSQG基序；和

(C)与SEQ ID NO：1的298-299对应的氨基酸位置处的HE基序；

所述酶包含与SEQ ID NO：1至少30％的氨基酸同一性；以及

(2)至少一种赋形剂；

(ii)羧酸酯底物，所述羧酸酯底物选自：

(1)一种或多种具有下列结构的酯：

[X]_mR₅

其中

X为式R₆C(O)O的酯基；

m为1至R₅中的碳原子数，

在25℃下，所述一种或多种酯在水中具有至少5ppm的溶解度；

(2)一种或多种具有下列结构的甘油酯：

(3)一种或多种下式的酯

其中R₁为任选地由羟基或C1至C4烷氧基取代的C1至C7直链或支链烷基，并且R₂为C1至C10直链或支链烷基、烯基、炔基、芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、杂芳基、(CH₂CH₂O)_n、或(CH₂CH(CH₃)-O)_nH，并且n为1至10；

(5)(1)至(4)的任意组合；

其中第一组分中的羧酸酯底物的量被设计成在通过混合第一和第二组分而形成的反应制剂中提供0.5重量％至10重量％的终浓度；

(v)任选地，至少一种表面活性剂；以及

2.权利要求1的多组分过氧羧酸制剂，其中所述至少一种赋形剂的含量在所述酶粉的约95重量％至约25重量％范围内。

3.权利要求1或权利要求2的多组分过氧羧酸制剂，其中

(a)所述羧酸酯底物为甘油三乙酸酯；其中所述第一组分中的甘油三乙酸酯的量在通过混合所述第一组分和所述第二组分而形成的反应制剂中提供0.5重量％至10重量％甘油三乙酸酯的终浓度；

(b)所述缓冲剂为所述第一组分的约0.1重量％至约10重量％，其中所述缓冲剂选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠和碳酸氢钾的混合物、磷酸钠、磷酸钾、以及磷酸钠和磷酸钾的混合物；

(d)所述共溶剂为三丙二醇甲醚，并且其浓度最高为所述第一组分的80重量％；

(e)所述表面活性剂是存在的并且为聚山梨酸酯80；并且

(f)所述第二组分中的所述过氧化氢的含量在通过混合所述第一组分和所述第二组分而形成的反应制剂中提供0.33重量％至约30重量％的终浓度。

4.权利要求1或权利要求2的多组分制剂，其中所述第一组分与所述第二组分以约1∶1至约1∶10的重量比混合。

5.用于生成过氧羧酸的双组分制剂，所述制剂包含：

(a)第一组分，所述第一组分包含：

(i)酶粉；所述酶粉包含：

(2)至少一种赋形剂；

(ii)羧酸酯底物，所述羧酸酯底物选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它们的混合物；其中所述第一组分中所述羧酸酯底物的量被设计成在通过混合所述第一组分和所述第二组分而形成的反应制剂中提供0.5重量％至10重量％的终浓度；

(v)任选地，至少一种表面活性剂；以及

6.权利要求5的双组分制剂，其中：

(a)所述至少一种CE-7酶含有选自SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的氨基酸序列，其中SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20的氨基酸残基277选自丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸和苏氨酸；

(b)所述羧酸酯底物为甘油三乙酸酯；其中所述第一组分中的甘油三乙酸酯的量被设计成在通过混合所述第一组分和所述第二组分而形成的反应制剂中提供0.5重量％至10重量％的终浓度；

(c)所述缓冲剂的浓度为所述第一组分的约0.1重量％至约10重量％，其中所述缓冲剂选自碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠和碳酸氢钾的混合物、磷酸钠、磷酸钾、以及磷酸钠和磷酸钾的混合物；

(e)所述表面活性剂是存在的并且为聚山梨酸酯80；并且

7.权利要求5或权利要求6的双组分制剂，其中所述第一组分与所述第二组分以约1∶1至约1∶10的重量比混合以生成过氧羧酸。

8.一种用于生成过氧羧酸的双组分制剂，所述制剂包含：

(a)含有以下物质的制剂的第一组分：

(i)约0.1重量％至约5重量％的所述第一组分为酶粉，所述酶粉包含：

(1)约20重量％至约33重量％的酶粉，所述酶粉包含至少一种CE-7酶并具有过水解活性，其中所述至少一种CE-7酶包含选自SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的氨基酸序列；

(2)约67重量％至约80重量％的酶粉，所述酶粉含有数均分子量为至少约1250以及重均分子量为至少约9000的至少一种寡糖赋形剂；其中所述至少一种寡糖赋形剂选自麦芽糖糊精、木聚糖、甘露聚糖、岩藻依聚糖、半乳甘露聚糖、脱乙酰壳多糖、棉子糖、水苏糖、果胶、胰岛素、左聚糖、支链型果聚糖、支链淀粉、以及它们的混合物；

(ii)羧酸酯底物，所述羧酸酯底物选自甘油一乙酸酯、甘油二乙酸酯、甘油三乙酸酯、以及它们的混合物；其中所述第一组分中的所述羧酸酯底物的含量被设计成在通过混合所述两种反应组分而形成的反应制剂中提供0.5重量％至10重量％的终浓度；

(b)第二组分，所述第二组分包含

(i)至少70重量％的水；

(iii)约0.01重量％至约1％的过氧化氢稳定剂；

9.对表面、衣物或纺织物进行漂白、脱色、除臭、卫生处理或消毒的方法，所述方法包括：

(a)提供根据权利要求1、权利要求5或权利要求8的制剂；

(b)混合所述第一组分和所述第二组分从而制备含有过氧羧酸的反应制剂；以及

(c)将所述反应制剂应用于所述表面、所述衣物或所述纺织物上，以进行漂白、脱色、除臭、卫生处理、消毒、或它们的组合。