BRPI0913701B1

BRPI0913701B1 - Polinucleotídeo isolado, vetor, construção de dna recombinante, célula hospedeira de micro- organismo, método de transformação de células e polipeptídeo isolado

Info

Publication number: BRPI0913701B1
Application number: BRPI0913701-7A
Authority: BR
Inventors: Yin Tyler; Dicosimo Robert; S. Payne Mark
Original assignee: E. I. Du Pont De Nemours And Company
Priority date: 2008-10-03
Filing date: 2009-10-01
Publication date: 2018-06-05
Also published as: JP2012504692A; JP5777517B2; CN102239255B; CN102264894A; EP2342325A1; CA2736907C; US8293221B2; US8337905B2; US8030038B2; US8367597B2; US8486380B2; EP2342328B1; WO2010039961A1; WO2010039958A1; JP2012504418A; US8283142B2; CN102239255A; US20120276609A1; EP2342327B1; JP5694938B2

Description

(54) Título: POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, VETOR, CONSTRUÇÃO DE DNA RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA DE MICRO-ORGANISMO, MÉTODO DE TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS E POLIPEPTÍDEO ISOLADO (51) Int.CI.: C12N 9/18; A61L 2/18; C11D 3/00; C11D 3/386; C12P 7/00; C12P 7/40 (30) Prioridade Unionista: 03/10/2008 US 61/102,512, 03/10/2008 US 61/102,505, 03/10/2008 US 61/102,514, 03/10/2008 US 61/102,520, 03/10/2008 US 61/102,531, 03/10/2008 US 61/102,539 (73) Titular(es): Ε. I. DU PONT DE NEMOURS AND COMPANY (72) Inventor(es): TYLER YIN; ROBERT DICOSIMO; MARK S. PAYNE

1/111 “POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, VETOR, CONSTRUÇÃO DE DNA RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA DE MICRO-ORGANISMO, MÉTODO DE TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS E POLIPEPTÍDEO

ISOLADO”

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados [001] O presente pedido reivindica o benefício dos Pedidos Provisórios Norte-Americanos NO 61/102.505, 61/102.512, 61/102.514, 61/102.520, 61/102.531 e 61/102.539, todos depositados em três de outubro de 2008 e integralmente incorporados ao presente como referência.

Campo da Invenção [002] A presente invenção refere-se ao campo de síntese de ácido peroxicarboxílico enzimático e catálise de enzimas in situ. Mais especificamente, são fornecidos composições e métodos relativos a catalisadores de enzimas variantes que possuem atividade de per-hidrólise aprimorada. Pelo menos um ácido peroxicarboxílico é produzido sob concentrações suficientes para que seja eficaz para a desinfecção ou sanitização de superfícies, sanitização de instrumentos médicos, sanitização de equipamentos de processamento de alimentos e apropriado para uso em aplicações de cuidados com tecidos e lavanderia, tais como branqueamento, retirada de manchas, desodorização, desinfecção ou sanitização.

Antecedentes da Invenção [003] Relatou-se que composições de ácido peroxicarboxílico são agentes antimicrobianos eficazes. Foram descritos métodos de limpeza, desinfecção e/ou sanitização de superfícies duras, produtos de carne, tecidos de plantas vivas e dispositivos médicos contra o crescimento indesejável de micróbios (tal como na Patente Norte-Americana NO 6.545.047; Patente NorteAmericana NO 6.183.807; Patente Norte-Americana NO 6.518.307; Patente Norte-Americana NO 5.683.724; e Pedido de Patente Norte-Americano

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2/111 publicado NO 2003/0026846). Também se relatou que ácidos peroxicarboxílicos são úteis na preparação de composições de branqueamento para aplicações de detergente em lavanderia (Patente Norte-Americana NO 3.974.082; Patente Norte-Americana NO 5.296.161; e Patente NorteAmericana NO 5.364.554).

[004] Ácidos peroxicarboxílicos podem ser preparados, por exemplo, por meio da reação química de um ácido carboxílico e peróxido de hidrogênio (vide Organic Peroxides, Daniel Swern, Ed., Vol. 1, págs. 313-516; Wiley Interscience, Nova Iorque, 1971). A reação normalmente é catalisada por um ácido inorgânico forte, tal como ácido sulfúrico concentrado. A reação de peróxido de hidrogênio com um ácido carboxílico é uma reação de equilíbrio e a produção de ácido peroxicarboxílico é favorecida pelo uso de uma concentração excessiva de peróxido e/ou ácido carboxílico, ou pela remoção de água.

[005] Alguns agentes branqueadores ou desinfetantes com base em ácido peroxicarboxílico são compostos de uma mistura de equilíbrio de ácido peroxicarboxílico, peróxido de hidrogênio e o ácido carboxílico correspondente. Uma desvantagem desses sistemas de limpeza de ácido peroxicarboxílico comerciais é a frequente instabilidade do ácido peroxicarboxílico em solução ao longo do tempo. Uma forma de superar o problema da estabilidade é a geração do ácido peroxicarboxílico antes do uso por meio da combinação de diversos componentes de reação que são individualmente estáveis por extensos períodos de tempo. Preferencialmente, os componentes de reação individuais são de fácil armazenagem, manipulação relativamente segura e capazes de produzir rapidamente uma concentração eficaz de ácido peroxicarboxílico durante a mistura.

[006] Relatou-se recentemente que a família CE-7 de esterases de carboidratos possui atividade de per-hidrolase. Demonstrou-se que essas

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3/111 enzimas de “per-hidrolase” são particularmente eficazes para a produção de ácidos peroxicarboxílicos a partir de uma série de substratos éster de ácido carboxílico quando combinadas com uma fonte de peroxigênio (vide WO 2007/070609 e Pedidos de Patente Norte-Americanos publicados NO 2008/0176299, 2008/176783 e 2009/0005590 de DiCosimo et al, cada qual integralmente incorporado ao presente como referência). Demonstrou-se que alguns membros da família CE-7 de esterases de carboidrato possuem atividade per-hidrolítica suficiente para produzir 4000 a 5000 ppm de ácido peracético a partir de acetil ésteres de álcoois, dióis e gliceróis em um minuto e até 9000 ppm de cinco a trinta minutos após a mistura dos componentes de reação (DiCosimo et al, Pedido de Patente Norte-Americano publicado NO 2009/0005590).

[007] A capacidade de comercializar muitos produtos de branqueamento e/ou desinfecção com base em per-hidrólise enzimática pode depender do custo de produção do catalisador de enzima. O uso de catalisadores de enzimas que possuem atividade per-hidrolítica aprimorada pode reduzir a quantidade de catalisador de enzima no produto comercial e pode reduzir significativamente o custo de produção. Desta forma, permanece a necessidade de identificar catalisadores de enzimas que possuam atividade per-hidrolítica aprimorada.

[008] Além disso, per-hidrólise enzimática é tipicamente conduzida utilizando condições de reação aquosa. Os catalisadores de enzimas que possuem atividade per-hidrolítica exibem tipicamente atividade hidrolítica, formando ácidos carboxílicos que podem reduzir o pH da mistura de reação. Desta forma, é desejável utilizar uma per-hidrolase que possua alta seletividade para per-hidrólise de um éster em ácido peroxicarboxílico com relação à hidrólise do mesmo éster em ácido carboxílico; a razão “P/H” (taxa de per-hidrólise/taxa de hidrólise) é um método de caracterização da seletividade

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4/111 de uma per-hidrolase para per-hidrólise.

[009] O problema a ser solucionado é o fornecimento de catalisadores de enzimas caracterizados pela atividade per-hidrolítica aprimorada. O aprimoramento pode ser um aumento da atividade específica de per-hidrolase para ésteres de ácido carboxílico e/ou um aumento da seletividade para per-hidrólise sobre hidrólise ao produzirem-se ácidos peroxicarboxílicos a partir de ésteres de ácido carboxílico.

Descrição Resumida da Invenção [010] O problema indicado foi solucionado por meio do fornecimento de catalisadores de enzimas que possuem atividade específica de per-hidrolase e/ou seletividade aprimorada para per-hidrólise sobre hidrólise ao produzirem-se ácidos peroxicarboxílicos a partir de ésteres de ácido carboxílico. Mais especificamente, são fornecidas variantes de CE-7 perhidrolase que possuem atividade específica de per-hidrolase aprimorada e/ou aumento da seletividade (ou seja, aumento da razão entre atividade de perhidrólise e hidrólise). São também fornecidos composições e processos que compreendem as variantes do presente.

[011] Um aspecto é um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo que possui atividade de per-hidrólise, em que o mencionado polipeptídeo é classificado estruturalmente como uma enzima da família de carboidrato esterase 7 e (a) que possui identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos 95% com a SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 15, SEQ ID N° 20 ou SEQ ID NO 25, desde que uma substituição do resíduo de aminoácido 277 de SEQ ID NO 5, SEQ ID N° 10, SEQ ID NO 15, SEQ ID N° 20 ou SEQ ID NO 25 seja selecionada a partir do grupo que consiste de serina, treonina, valina e alanina ou (b) que possui identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos 95% com SEQ ID NO 30, desde que uma substituição do resíduo de aminoácido 278 de SEQ ID NO 30 seja

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5/111 selecionada a partir do grupo que consiste de serina, treonina, valina e alanina. Em algumas realizações, o polipeptídeo compreende SEQ ID NO 5, 10, 15, 20, 25 ou 30. Em algumas realizações, a sequência de nucleotídeos compreende SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 24, 26, 27, 28 ou 29.

[012] Um outro aspecto é um polipeptídeo isolado que possui atividade de per-hidrólise e é classificado estruturalmente como uma enzima da família das carboidrato esterases 7, em que o mencionado polipeptídeo possui identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos 95% com (a) SEQ ID NO 5, SEQ ID N° 10, SEQ ID NO 15, SEQ ID N° 20 ou SEQ ID NO 25, desde que uma substituição do resíduo de aminoácido 277 de SEQ ID NO 5, SEQ ID N° 10, SEQ ID NO 15, SEQ ID N° 20 ou SEQ ID NO 25 seja selecionada a partir do grupo que consiste em serina, treonina, valina e alanina; ou (b) SEQ ID NO 30, desde que uma substituição do resíduo de aminoácido 278 de SEQ ID NO 30 seja selecionada a partir do grupo que consiste de serina, treonina, valina e alanina. Em algumas realizações, o polipeptídeo compreende SEQ ID NO 5, 10, 15, 20, 25 ou 30.

[013] Em um aspecto adicional, é fornecido um processo de produção de um ácido peroxicarboxílico a partir de um éster de ácido caboxílico, que compreende:

(a) o fornecimento de um conjunto de componentes de reação, em que os mencionados componentes compreendem:

(1) um éster de ácido carboxílico selecionado a partir do grupo que consiste de:

(i) um ou mais ésteres que possuem a estrutura:

[X]mR5 em que:

- X é um grupo éster da fórmula R6C(O) O;

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- R6 é uma porção hidrocarbila Ci a C7 linear, ramificada ou cíclica, opcionalmente substituída por um grupo hidroxila ou grupo alcóxi C1 a C4, em que R6 compreende opcionalmente uma ou mais ligações éter em que R6 é C2 a C7;

- R5 é uma porção hidrocarbila C1 a C6 linear, ramificada ou cíclica opcionalmente substituída por um grupo hidroxila, em que cada átomo de carbono em R5 individualmente compreende não mais de um grupo hidroxila ou não mais de um grupo éster e em que R5 compreende opcionalmente uma ou mais ligações éter;

- m é 1 até o número de átomos de carbono em R5;

em que os mencionados um ou mais ésteres possuem solubilidade em água de pelo menos 5 ppm a 25 °C;

(ii) um ou mais glicérides que possuem a estrutura:

O

R₁-C-O-CH₂-CH-CH₂-OR₄

OR3 em que R1 é um alquila C1 a C7 de cadeia linear ou ramificada opcionalmente substituído por um grupo hidroxila ou alcóxi C1 a C4 e R3 e R4 são individualmente H ou R1C(O);

(iii) um ou mais ésteres da fórmula:

O

R₁-C-O-R₂ em que R1 é um alquila C1 a C7 de cadeia linear ou ramificada opcionalmente substituído por um grupo hidroxila ou alcóxi C1 a C4 e R2 é um alquila, alquenila, alquinila, arila, alquilarila, alquil-heteroarila, heteroarila C1 a C10 de cadeia linear ou ramificada, (CH2CH2O)n ou (CH2CH(CH3)-O)nH e n é 1 a 10;

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7/111 (iv) um ou mais monossacarídeos acetilados, dissacarídeos acetilados ou polissacarídeos acetilados; e (v) qualquer combinação de (i) a (iv);

(2) uma fonte de peroxigênio; e (3) em que o polipeptídeo possui atividade de per-hidrólise conforme descrito acima; e (b) a combinação dos mencionados componentes de reação sob condições de reação aquosas apropriadas, em que é produzido um ácido peroxicarboxílico. (R 10).

[014] Em um aspecto adicional, é fornecido um processo para desinfetar ou sanitizar uma superfície dura ou objeto inanimado utilizando uma composição de ácido peroxicarboxílico produzido enzimaticamente, em que o mencionado processo compreende:

(i) um ou mais ésteres que possuem a estrutura:

[X]mR5 em que:

- X é um grupo éster da fórmula R6C(O)O;

- R6 é uma porção hidrocarbila C1 a C7 linear, ramificada ou cíclica, opcionalmente substituída por um grupo hidroxila ou grupo alcóxi C1 a C4, em que R6 compreende opcionalmente uma ou mais ligações éter em que R6 é C2 a C7;

- R5 é uma porção hidrocarbila C1 a C6 linear, ramificada ou cíclica opcionalmente substituída por um grupo hidroxila, em que cada átomo de carbono em R5 compreende individualmente não mais de um grupo hidroxila

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8/111 ou não mais de um grupo éster e em que R5 compreende opcionalmente uma ou mais ligações éter;

- m é 1 até o número de átomos de carbono em R5; em que os mencionados um ou mais ésteres possuem solubilidade em água de pelo menos 5 ppm a 25 °C;

(ii) um ou mais glicérides que possuem a estrutura:

O

R₁-C-O-CH₂-CH-CH₂-OR₄

(iii) um ou mais ésteres da fórmula:

O

R1 C O R2 em que R1 é um alquila C1 a C7 de cadeia linear ou ramificada opcionalmente substituído por um grupo hidroxila ou alcóxi C1 a C4 e R2 é um alquila, alquenila, alquinila, arila, alquilarila, alquil-heteroarila, heteroarila C1 a C10 de cadeia linear ou ramificada, (CH2CH2O)n ou (CH2CH(CH3)-O)nH e n é 1 a 10;

(iv) um ou mais monossacarídeos acetilados, dissacarídeos acetilados ou polissacarídeos acetilados; e (v) qualquer combinação de (i) a (iv);

(2) uma fonte de peroxigênio; e (3) em que o polipeptídeo possui atividade de per-hidrólise conforme descrito acima;

(b) a combinação dos mencionados componentes de reação

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9/111 sob condições de reação aquosas apropriadas, em que é formado um produto de ácido peroxicarboxílico;

(c) a diluição opcional do mencionado produto de ácido peroxicarboxílico; e.

(d) o contato da mencionada superfície dura ou objeto inanimado com o ácido peroxicarboxílico produzido na etapa (b) ou etapa (c), em que a mencionada superfície ou o mencionado objeto inanimado é desinfetado.

[015] Um outro aspecto é um sistema de geração de ácido peroxicarboxílico que compreende:

(a) um substrato selecionado a partir do grupo que consiste de:

(i) um ou mais ésteres que possuem a estrutura:

[X]mR5 em que:

- X é um grupo éster da fórmula R6C(O)O;

- R5 é uma porção hidrocarbila C1 a C6 linear, ramificada ou cíclica opcionalmente substituída por um grupo hidroxila, em que cada átomo de carbono em R5 compreende individualmente não mais de um grupo hidroxila ou não mais de um grupo éster e em que R5 compreende opcionalmente uma ou mais ligações éter;

- m é 1 até o número de átomos de carbono em R5;

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10/111 (ii) um ou mais glicérides que possuem a estrutura:

O r₁-c-o-ch₂-ch-ch₂-or₄

(iii) um ou mais ésteres da fórmula:

O

(b) uma fonte de peroxigênio; e (c) em que o polipeptídeo possui atividade de per-hidrólise conforme descrito acima.

[016] Um aspecto adicional é um processo de tratamento de um artigo de vestuário ou tecido para branqueamento, remoção de manchas, redução de odores, sanitização ou desinfecção utilizando uma composição de ácido peroxicarboxílico produzido enzimaticamente, em que o mencionado processo compreende:

(a) O fornecimento de um conjunto de componentes de

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11/111 reação, em que os mencionados componentes compreendem:

(i) um ou mais ésteres que possuem a estrutura:

[X]mR5 em que:

- X é um grupo éster da fórmula R6C(O)O;

- m é 1 até o número de átomos de carbono em R5;

(ii) um ou mais glicérides que possuem a estrutura:

O r₁-c—o—ch₂-ch-ch₂-or₄

(iii) um ou mais ésteres da fórmula:

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12/111

O

(b) a combinação dos mencionados componentes de reação sob condições de reação aquosas apropriadas, por meio do quê é formado um produto de ácido peroxicarboxílico.

(c) a diluição opcional do mencionado produto de ácido peroxicarboxílico; e (d) o contato do mencionado artigo de vestuário ou tecido com o ácido peroxicarboxílico produzido na etapa (b) ou etapa (c);

em que o mencionado artigo de vestuário ou tecido tem as manchas retiradas, é desodorizado, desinfetado, branqueado ou uma de suas combinações.

[017] Em um aspecto adicional, é fornecida uma formulação que compreende (a) uma primeira mistura que compreende um catalisador de enzima que compreende o polipeptídeo que possui atividade de perhidrólise descrita acima e um éster de ácido carboxílico selecionado a partir do grupo

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13/111 que consiste de monoacetina, diacetina, triacetina e suas misturas; em que a mencionada primeira mistura compreende opcionalmente um componente adicional selecionado a partir do grupo que consiste de um tampão orgânico ou inorgânico, um inibidor de corrosão, um agente umectante e suas combinações; e (b) uma segunda mistura que compreende uma fonte de peroxigênio e água, em que a mencionada segunda mistura compreende ainda opcionalmente um estabilizante de peróxido de hidrogênio.

[018] Em um aspecto adicional, é fornecida uma formulação que compreende (a) uma primeira mistura que compreende um catalisador de enzima que compreende o polipeptídeo que possui atividade de per-hidrólise descrito acima e um sacarídeo acetilado selecionado a partir do grupo que consiste de monossacarídeos acetilados, dissacarídeos acetilados, polissacarídeos acetilados e suas combinações; em que a mencionada primeira mistura compreende ainda opcionalmente um tampão orgânico ou inorgânico, um inibidor da corrosão e um agente umectante; e (b) uma segunda mistura que compreende uma fonte de peroxigênio e água, em que a mencionada segunda mistura compreende opcionalmente um estabilizante de peróxido de hidrogênio.

[019] Em um outro aspecto, é fornecido um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo acetil xilano esterase de Thermotoga que possui atividade de per-hidrólise, em que o polipeptídeo compreende a região conservada C-terminal de SEQ ID NO 31, desde que o polipeptídeo possua uma substituição para o aminoácido 93 de SEQ ID NO 31 selecionada a partir do grupo que consiste de serina, treonina, valina e alanina.

[020] Em um aspecto adicional, é fornecido um polipeptídeo acetil xilano esterase de Thermotoga isolado, em que o mencionado polipeptídeo possui atividade de per-hidrólise e compreende a região conservada C-terminal de SEQ ID NO 31, desde que o polipeptídeo possua

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14/111 uma substituição para o aminoácido 93 de SEQ ID NO 31 selecionada a partir do grupo que consiste de serina, treonina, valina e alanina.

Breve Descrição das Figuras [021] A Figura 1 é uma comparação de sequências CLUSTALW entre acetil xilano esterases de Thermotoga neapolitana (SEQ ID NO 32) e Thermotoga maritima MSB8 (SEQ ID NO 36).

[022] A Figura 2 é uma comparação de sequências CLUSTALW entre acetil xilano esterases de seis espécies de Thermotoga.

Breve Descrição das Sequências Biológicas [023] As sequências a seguir estão de acordo com 37 C. F. R. §§ 1.821-1.825 (Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures - The Sequence Rules) e consistentes com o Padrão ST.25 (1998) da Organização Mundial da Propriedade Intelectual (OMPI) e as exigências de listagens de sequências da Convenção Europeia de Patentes (EPC) e do Tratado de Cooperação de Patentes (PCT), Regras 5.2 e 49.5 (a-bis) e Capítulo 208 e Anexo C das Instruções Administrativas. Os símbolos e formato utilizados para dados de sequências de aminoácidos e de nucleotídeos atendem às regras definidas em 37 C. F. R. § 1.822.

[024] SEQ ID NO 1, 2, 3 e 4 são sequências de ácidos nucleicos de regiões de codificação de acetil xilano esterase variante derivadas da sequência do tipo selvagem de uma acetil xilano esterase de Thermotoga neapolitana.

[025] SEQ ID NO 5 representa a sequência de aminoácidos deduzida das variantes de acetil xilano esterase derivadas da sequência de tipo selvagem de uma acetil xilano esterase de Thermotoga neapolitana, em que o resíduo Xaa na posição 277 é Ala, Val, Ser ou Thr.

[026] SEQ ID NO 6, 7, 8 e 9 são sequências de ácidos nucleicos

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15/111 de regiões de codificação de acetil xilano esterase variante derivadas da sequência do tipo selvagem de uma acetil xilano esterase de Thermotoga maritima MSB8.

[027] SEQ ID NO 10 representa a sequência de aminoácidos deduzida das variantes de acetil xilano esterase derivadas da sequência de tipo selvagem de uma acetil xilano esterase de Thermotoga maritima, em que o resíduo Xaa na posição 277 é Ala, Val, Ser ou Thr.

[028] SEQ ID NO 11, 12, 13 e 14 são sequências de ácidos nucleicos de regiões de codificação de acetil xilano esterase variante derivadas da sequência do tipo selvagem de uma acetil xilano esterase de Thermotoga lettingae.

[029] SEQ ID NO 15 representa a sequência de aminoácidos deduzida das variantes de acetil xilano esterase derivadas da sequência de tipo selvagem de uma acetil xilano esterase de Thermotoga lettingae, em que o resíduo Xaa na posição 277 é Ala, Val, Ser ou Thr.

[030] SEQ ID NO 16, 17, 18 e 19 são sequências de ácidos nucleicos de regiões de codificação de acetil xilano esterase variante derivadas da sequência do tipo selvagem de uma acetil xilano esterase de Thermotoga petrophila.

[031] SEQ ID NO 20 representa as sequências de aminoácidos deduzidas das variantes de acetil xilano esterase derivadas da sequência de tipo selvagem de uma acetil xilano esterase de Thermotoga petrophila, em que o resíduo Xaa na posição 277 é Ala, Val, Ser ou Thr.

[032] SEQ ID NO 21, 22, 23 e 24 são sequências de ácidos nucleicos de regiões de codificação de acetil xilano esterase variante derivadas da sequência do tipo selvagem de uma acetil xilano esterase de Thermotoga sp. RQ2 descrito no presente como “RQ2(a)”.

[033] SEQ ID NO 25 representa a sequência de aminoácidos

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16/111 deduzida das variantes de acetil xilano esterase derivada da sequência de tipo selvagem de uma acetil xilano esterase de Thermotoga sp. RQ2 descrito no presente como “RQ2(a)”, em que o resíduo de Xaa na posição 277 é Ala, Val, Ser ou Thr.

[034] SEQ ID NO 26, 27, 28 e 29 são sequências de ácidos nucleicos de uma segunda região de codificação de acetil xilano esterase variante derivada de Thermotoga sp. RQ2.

[035] SEQ ID NO 30 representa a sequência de aminoácidos deduzida das variantes de acetil xilano esterase derivada da sequência de tipo selvagem de acetil xilano esterase de Thermotoga sp. RQ2 descrito no presente como “RQ2(b)”, em que o resíduo de Xaa na posição 278 é Ala, Val, Ser ou Thr.

[036] SEQ ID NO 31 representa uma região conservada Cterminal de acetil xilano esterases de Thermotoga.

[037] SEQ ID NO 32 é uma acetil xilano esterase de Thermotoga neapolitana (acesso GENBANK® NO AAB70869).

[038] SEQ ID NO 33 e 34 são primers descritos no Exemplo 1.

[039] SEQ ID NO 35 é o produto de ácido nucleico de Thermotoga neapolitana amplificada e otimizada por códons descrito no Exemplo 1.

[040] SEQ ID NO 36 é uma acetil xilano esterase de Thermotoga maritima (acesso GENBANK® NO NP_227893.1).

[041] SEQ ID NO 37 é o produto de ácido nucleico de Thermotoga maritima amplificado descrito no Exemplo 10.

[042] SEQ ID NO 38 e 39 são primers descritos no Exemplo 10.

[043] SEQ ID NO 40 é a sequência otimizada por códons de uma acetil xilano esterase de T. neapolitana.

[044] SEQ ID NO 41 é a sequência otimizada por códons de

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17/111 uma acetil xilano esterase de T. maritima.

[045] SEQ ID NO 42 a 193 são primers frontal e reverso encontrados na Tabela 1.

[046] SEQ ID NO 194 a 201 são primers frontal e reverso encontrados na Tabela 6.

[047] SEQ ID NO 202 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma acetil xilano esterase de Thermotoga lettingae.

[048] SEQ ID NO 203 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma acetil xilano esterase de Thermotoga petrophila.

[049] SEQ ID NO 204 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma primeira acetil xilano esterase de Thermotoga sp. RQ2 descrito no presente como “RQ2(a)”.

[050] SEQ ID NO 205 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma segunda acetil xilano esterase de Thermotoga sp. RQ2 descrito no presente como “RQ2(b)”.

[051] SEQ ID NO 206 e 207 são primers frontal e reverso conforme descrito no Exemplo 10.

[052] SEQ ID NO 208 é a sequência de ácidos nucleicos do produto de ácido nucleico amplificado por SEQ ID NO 206 e 207 que foi utilizado para a preparação do plasmídeo pSW207.

Descrição Detalhada da Invenção [053] São descritas no presente enzimas variantes que são classificadas estruturalmente como enzimas CE-7 e possuem atividade de perhidrólise. Também é descrito no presente um processo de produção de ácidos peroxicarboxílicos a partir de ésteres de ácido carboxílico utilizando as enzimas variantes mencionadas acima, bem como diversos processos de uso das variantes em aplicações de desinfecção e cuidados de lavagem. Além disso, são fornecidas formulações desinfetantes e/ou de cuidados de lavanderia que

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18/111 compreendem os ácidos peroxicarboxílicos produzidos por meio dos processos descritos no presente.

[054] No presente relatório descritivo, são utilizados diversos termos e abreviações. As definições a seguir aplicam-se a menos que indicado especificamente em contrário.

[055] Da forma utilizada no presente, os artigos “um”, “uma” e “o/a” antes de um elemento ou componente de acordo com a presente invenção destinam-se a ser não restritivos com relação ao número de casos (ou seja, ocorrências) do elemento ou componente. “Um”, “uma” e “o/a” deverão ser lidos, portanto, como incluindo um ou pelo menos um e a forma da palavra no singular do elemento ou componente também inclui o plural, a menos que o número obviamente destine-se a ser singular.

[056] Da forma utilizada no presente, a expressão “que compreende” indica a presença das características, números inteiros, etapas ou componentes indicados conforme referência às reivindicações, mas não exclui a presença ou adição de uma ou mais de suas outras características, números inteiros, etapas, componentes ou grupos. A expressão “que compreende” destina-se a incluir realizações englobadas pelas expressões “que consiste essencialmente de” e “que consiste de”. De forma similar, a expressão “que consiste essencialmente de” destina-se a incluir realizações englobadas pela expressão “que consiste de”.

[057] Da forma utilizada no presente, a expressão “cerca de” que modifica a quantidade de um ingrediente ou reagente de acordo com a presente invenção ou empregado indica a variação da quantidade numérica que pode ocorrer, por exemplo, por meio de procedimentos típicos de medição e manipulação de líquidos utilizados para a elaboração de concentrados ou soluções de uso no mundo real; por meio de erros inadvertidos nesses procedimentos; por meio de diferenças de fabricação, fonte ou pureza dos

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19/111 ingredientes empregados para elaborar as composições ou conduzir os métodos; e similares. A expressão “cerca de” também engloba quantidades que diferem devido a condições de equilíbrio diferentes para uma composição que resulta de uma mistura inicial específica. Sejam ou não modificadas pela expressão “cerca de”, as reivindicações incluem equivalentes das quantidades.

[058] Quando presente, todas as faixas são inclusivas e combináveis.

[059] Ao indicar-se, por exemplo, uma faixa de “1 a 5”, a faixa indicada deverá ser interpretada como incluindo faixas de “1 a 4”, “1 a 3”, “1 e 2”, “1-2 e 4-5”, “1 a 3 e 5” e similares.

[060] Da forma utilizada no presente, as expressões “substrato”, “substrato apropriado” e “substrato éster de ácido carboxílico” designam especificamente, de forma intercambiável:

(a) um ou mais ésteres que possuem a estrutura:

[X]mR5 em que:

- X é um grupo éster da fórmula R6C(O)O;

- m é 1 até o número de átomos de carbono em R5;

em que os mencionados um ou mais ésteres possuem

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20/111 solubilidade em água de pelo menos 5 ppm a 25 °C; ou (b) um ou mais glicérides que possuem a estrutura:

O r₁-c—o—ch₂-ch-ch₂-or₄

OR3 em que R1 é um alquila C1 a C7 de cadeia linear ou ramificada opcionalmente substituído por um grupo hidroxila ou alcóxi C1 a C4 e R3 e R4 são individualmente H ou R1C(O); ou (c) um ou mais ésteres da fórmula:

O

R1 C O R2 em que R1 é um alquila C1 a C7 de cadeia linear ou ramificada opcionalmente substituído por um grupo hidroxila ou alcóxi C1 a C4 e R2 é um alquila, alquenila, alquinila, arila, alquilarila, alquil-heteroarila, heteroarila C1 a C10 de cadeia linear ou ramificada, (CH2CH2O)n ou (CH2CH(CH3)-O)nH e n é 1 a 10; ou (d) um ou mais monossacarídeos acetilados, dissacarídeos acetilados ou polissacarídeos acetilados; ou (e) qualquer combinação de (a) até (d).

[061] Exemplos do mencionado substrato éster de ácido carboxílico podem incluir monoacetina; triacetina; monopropionina; dipropionina; tripropionina; monobutirina; dibutirina; tributirina; penta-acetato de glicose; tetra-acetato de xilose; xilano acetilado; fragmentos de xilano acetilado;

1,2,3,5-tetra-acetato de β-D-ribofuranose; tri-O-acetil-D-galactal; tri-Oacetilglucal; diacetato de propileno glicol; diacetato de etileno glicol; monoésteres ou diésteres de 1,2-etanodiol; 1,2-propanodiol; 1,3-propanodiol;

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21/111

1,2-butanodiol; 1,3-butanodiol; 2,3-butanodiol; 1,4-butanodiol; 1,2-pentanodiol;

2,5-pentanodiol; 1,6-pentanodiol; 1,2-hexanodiol; 2,5-hexanodiol; 1,6hexanodiol; ou qualquer de suas combinações.

[062] Da forma utilizada no presente, o termo “perácido” é sinônimo de peroxiácido, ácido peroxicarboxílico, ácido peróxi, ácido percarboxílico e ácido peroxoico.

[063] Da forma utilizada no presente, a expressão “ácido peracético” é abreviada “PAA” e é sinônimo de ácido peroxiacético, ácido etanoperoxoico e todos os outros sinônimos do Registro CAS NO 79-21-0.

[064] Da forma utilizada no presente, o termo “monoacetina” é sinônimo de monoacetato de glicerol, monoacetato de glicerina e monoacetato de glicerila.

[065] Da forma utilizada no presente, o termo “diacetina” é sinônimo de diacetato de glicerol, diacetato de glicerina, diacetato de glicerila e todos os outros sinônimos de Registro CAS NO 25395-31-7.

[066] Da forma utilizada no presente, o termo “triacetina” é sinônimo de triacetato de glicerina, triacetato de glicerol, triacetato de glicerila, 1,2,3-triacetoxipropano, triacetato de 1,2,3-propanotriol e todos os outros sinônimos de Registro CAS NO 102-76-1.

[067] Da forma utilizada no presente, o termo “monobutirina” é sinônimo de monobutirato de glicerol, monobutirato de glicerina e monobutirato de glicerila.

[068] Da forma utilizada no presente, o termo “dibutirina” é sinônimo de dibutirato de glicerol e dibutirato de glicerila.

[069] Da forma utilizada no presente, o termo “tributirina” é sinônimo de tributirato de glicerol, 1,2,3-tributirilglicerol e todos os outros sinônimos de Registro CAS NO 60-01-5.

[070] Da forma utilizada no presente, o termo “monopropionina”

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22/111 é sinônimo de monopropionato de glicerol, monopropionato de glicerina e monopropionato de glicerila.

[071] Da forma utilizada no presente, o termo “dipropionina” é sinônimo de dipropionato de glicerol e dipropionato de glicerila.

[072] Da forma utilizada no presente, o termo tripropionina é sinônimo de tripropionato de glicerila, tripropionato de glicerol, 1,2,3tripropionilglicerol e todos os outros sinônimos de Registro CAS NO 139-45-7.

[073] Da forma utilizada no presente, a expressão “acetato de etila” é sinônimo de éter acético, acetoxietano, etanoato de etila, etil éster de ácido acético, etil éster de ácido etanoico, éster etil acético e todos os outros sinônimos de Registro CAS NO 141-78-6.

[074] Da forma utilizada no presente, a expressão “lactato de etila” é sinônimo de etil éster de ácido láctico e todos os outros sinônimos de Registro CAS NO 97-64-3.

[075] Da forma utilizada no presente, as expressões “açúcar acetilado” e “sacarídeo acetilado” designam mono, di e polissacarídeos que compreendem pelo menos um grupo acetila. Exemplos incluem, mas sem limitações, penta-acetato de glicose, tetra-acetato de xilose, xilano acetilado, fragmentos de xilano acetilado, 1,2,3,5-tetra-acetato de β-D-ribofuranose, tri-Oacetil-D-galactal e tri-O-acetilglucal.

[076] Da forma utilizada no presente, as expressões “hidrocarbila”, “grupo hidrocarbila” e “porção hidrocarbila” indicam uma disposição de cadeia linear, ramificada ou cíclica de átomos de carbono conectados por carbono simples, duplo ou triplo a ligações de carbono e/ou por ligações de éter e adequadamente substituídos por átomos de hidrogênio. Esses grupos hidrocarbila podem ser alifáticos e/ou aromáticos. Exemplos de grupos hidrocarbila incluem metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, tbutila, ciclopropila, ciclobutila, pentila, ciclopentila, metilciclopentila, hexila,

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23/111 ciclo-hexila, benzila e fenila. Em uma realização preferida, a porção hidrocarbila é uma disposição de cadeia linear, ramificada ou cíclica de átomos de carbono conectados por um único carbono a ligações de carbono e/ou por ligações de éter e adequadamente substituídos por átomos de hidrogênio.

[077] Da forma utilizada no presente, as expressões “monoésteres” e “diésteres” de 1,2-etanodiol, 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiol, 1,2-butanodiol, 1,3-butanodiol, 2,3-butanodiol, 1,4-butanodiol, 1,2-pentanodiol,

2,5-pentanodiol, 1,6-pentanodiol, 1,2-hexanodiol, 2,5-hexanodiol, 1,6hexanodiol e suas misturas designam os mencionados compostos que compreendem pelo menos um grupo éster da fórmula RC(O)O, em que R é uma porção hidrocarbila C1 a C7 linear. Em uma realização, o substrato éster de ácido carboxílico é selecionado a partir do grupo que consiste de diacetato de propileno glicol (PGDA), diacetato de etileno glicol (EDGA) e suas misturas.

[078] Da forma utilizada no presente, a expressão “diacetato de propileno glicol” é sinônimo de 1,2-diacetoxipropano, diacetato de propileno, diacetato de 1,2-propanodiol e todos os outros sinônimos de Registro CAS NO 623-84-7.

[079] Da forma utilizada no presente, a expressão “diacetato de etileno glicol é sinônimo de 1,2-diacetoxietano, diacetato de etileno, diacetato de glicol e todos os outros sinônimos de Registro CAS NO 111-55-7.

[080] Da forma utilizada no presente, “mistura de reação enzimática apropriada”, “componentes apropriados para geração de um perácido in situ”, “componentes de reação apropriados” e “mistura de reação aquosa apropriada” designam materiais e água nos quais os reagentes e o catalisador de enzima entram em contato. Os componentes da mistura de reação aquosa apropriada são fornecidos no presente e os técnicos no assunto apreciam a série de variações de componentes apropriados para esse processo. Em uma realização, a mistura de reação enzimática apropriada

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24/111 produz ácido peroxicarboxílico in situ mediante combinação dos componentes de reação. Desta forma, os componentes de reação podem ser fornecidos na forma de um sistema com múltiplos componentes, em que um ou mais dos componentes de reação permanecem separados até o uso. Em uma outra realização, os componentes de reação são combinados em primeiro lugar para formar uma solução aquosa de ácido peroxicarboxílico que é colocada em contato em seguida com a superfície a ser desinfetada e/ou branqueada. O projeto de sistemas e meios de separação e combinação de diversos componentes ativos é conhecido na técnica e geralmente dependerá da forma física dos componentes de reação individuais. Diversos sistemas de fluidos ativos (líquido-líquido), por exemplo, utilizam tipicamente garrafas liberadoras de múltiplas câmaras ou sistemas de duas fases (por exemplo, Pedido de Patente Norte-Americano publicado NO 2005/0139608; Patente NorteAmericana NO 5.398.846; Patente Norte-Americana NO 5.624.634; Patente Norte-Americana n° 6.391.840; Patente Europeia 0807156B1; Pedido de Patente Norte-Americano publicado NO 2005/0008526; e Patente PCT n° WO 00/61713A1), tal como encontrado em algumas aplicações de branqueamento, em que o agente de branqueamento desejado é produzido mediante mistura dos fluidos reativos. Outras formas de sistemas com múltiplos componentes utilizados para gerar ácido peroxicarboxílico podem incluir, mas sem limitações, os projetados para um ou mais componentes sólidos ou combinações de sólidos e líquidos, tais como pós (por exemplo, Patente Norte-Americana NO 5.116.575), pastilhas com múltiplas camadas (por exemplo, Patente NorteAmericana NO 6.210.639), pacotes solúveis em água que contêm diversos compartimentos (por exemplo, Patente Norte-Americana NO 6.995.125) e aglomerados sólidos que reagem mediante adição de água (por exemplo, Patente Norte-Americana n° 6.319.888). Em uma realização, é fornecida uma formulação com múltiplos componentes na forma de dois componentes

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25/111 individuais por meio da qual é gerado um desinfetante ácido peroxicarboxílico mediante combinação dos dois componentes. Em uma outra realização, é fornecida uma formulação que compreende:

a. um primeiro componente que compreende:

i. uma enzima em pó conforme descrito no presente; e ii. um substrato éster de ácido carboxílico, em que o mencionado primeiro componente compreende opcionalmente um ingrediente adicional selecionado a partir do grupo que consiste de um tampão orgânico ou inorgânico, um inibidor da corrosão, um agente de umectação e suas combinações; e

b. um segundo componente que compreende uma fonte de peroxigênio e água, em que o mencionado segundo componente compreende opcionalmente um estabilizante de peróxido de hidrogênio.

[081] Em uma outra realização, o éster de ácido carboxílico na primeira mistura é selecionado a partir do grupo que consiste de monoacetina, diacetina, triacetina e suas combinações. Em uma outra realização, o éster de ácido carboxílico na primeira mistura é um sacarídeo acetilado. Em uma outra realização, o catalisador de enzima na primeira mistura é um sólido particulado. Em uma outra realização, a primeira mistura de reação é uma pastilha sólida ou pó.

[082] Da forma utilizada no presente, o termo “per-hidrólise” é definido como a reação de um substrato selecionado com peróxido para formar um ácido peroxicarboxílico. Tipicamente, peróxido inorgânico reage com o substrato selecionado na presença de um catalisador para produzir o ácido peroxicarboxílico. Da forma utilizada no presente, a expressão “per-hidrólise química” inclui reações de per-hidrólise nas quais um substrato (precursor de ácido peroxicarboxílico) é combinado com uma fonte de peróxido de hidrogênio em que é formado ácido peroxicarboxílico na ausência de um catalisador de

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26/111 enzima.

[083] Da forma utilizada no presente, as expressões atividade específica de per-hidrolase ou atividade de per-hidrolasse designam a atividade catalisadora por unidade de massa (tal como miligrama) de proteína, peso de células secas ou peso de catalisador imobilizado.

[084] Da forma utilizada no presente, “uma unidade de atividade enzimática”, “uma unidade de atividade” ou “U” é definida como a quantidade de atividade de per-hidrolase necessária para a produção de 1 pmol de produto ácido peroxicarboxílico por minuto sob uma temperatura especificada.

[085] Da forma utilizada no presente, as expressões “catalisador de enzima” e “catalisador de per-hidrolase” designam um catalisador que compreende uma enzima que possui atividade de perhidrólise e pode apresentar-se na forma de uma célula microbiana inteira, célula(s) microbiana(s) permeabilizada(s), um ou mais componentes celulares de um extrato de células microbianas, enzima parcialmente purificada ou enzima purificada. O catalisador de enzimas pode também ser modificado quimicamente (tal como por meio de pegilação ou de reação com reagentes reticulantes). O catalisador de per-hidrolase pode também ser imobilizado sobre um suporte solúvel ou insolúvel utilizando métodos bem conhecidos dos técnicos no assunto; vide, por exemplo, Immobilization of Enzymes and Cells, Gordon, F. Bickerstaff, Editor; Humana Press, Totowa, NJ, Estados Unidos; 1997. Conforme descrito no presente, todas as enzimas do presente que possuem atividade de per-hidrólise são estruturalmente membros da família de carboidrato esterases 7 (família CE-7) de enzimas (vide Coutinho, P. M., Henrissat, B., Carbohydrate-Active Enzymes: an Integrated Database Approach em Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering, H. J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat e B. Svensson, eds., (1999) The Royal Society of Chemistry, Cambridge, págs. 3-12). Demonstrou-se que a família CE-7 de

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27/111 enzimas é particularmente eficaz para a produção de ácidos peroxicarboxílicos a partir de uma série de substratos éster de ácido carboxílico quando combinada com uma fonte de peroxigênio (vide Patente PCT NO WO2007/070609 e Pedidos de Patente Norte-Americanos publicados NO 2008/0176299, 2008/176783 e 2009/0005590 de DiCosimo et al, cada qual integralmente incorporado ao presente como referência). A família de enzimas CE-7 inclui cefalosporina C desacetilases (CAHs; E. C. 3.1.1.41) e acetil xilano esterases (AXEs; E. C. 3.1.1.72). Membros da família de enzimas CE-7 compartilham um motivo de assinatura conservado (Vincent et al, J. Mol. Biol., 330: 593-606 (2003)).

[086] Da forma utilizada no presente, as expressões “motivo de assinatura”, “motivo de assinatura CE-7” e “motivo de diagnóstico” designam estruturas conservadas compartilhadas entre uma família de enzimas que possuem uma atividade definida. O motivo de assinatura pode ser utilizado para definir e/ou identificar a família de enzimas com estrutura relacionada que possui atividade enzimática similar para uma família de substratos definida. O motivo de assinatura pode ser uma única sequência de aminoácidos contíguos ou uma coleção de motivos conservados não contíguos que juntos formam o motivo de assinatura. Tipicamente, o(s) motivo(s) conservado(s) é(são) representado(s) por uma sequência de aminoácidos. As enzimas variantes do presente que possuem atividade de per-hidrólise (“per-hidrolases”) pertencem à família de carboidrato esterases CE-7 (ou seja, todas as variantes do presente retêm o motivo de assinatura CE-7).

[087] Da forma utilizada no presente, “estruturalmente classificada como enzima CE-7”, “estruturalmente classificada como enzima da família de carboidrato esterases 7”, “estruturalmente classificada como carboidrato esterase CE-7” e “per-hidrolase CE-7” serão utilizadas para designar enzimas que possuem atividade de per-hidrólise que são

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28/111 estruturalmente classificadas como carboidrato esterases CE-7 com base na presença do motivo de assinatura CE-7 (Vincent et al, acima). O “motivo de assinatura” de esterases CE-7 compreende três motivos conservados (numeração da posição de resíduo com relação à sequência de referência SEQ ID NO 32):

a. Arg118-Gly119-Gln120;

b. Gly186-Xaa187-Ser188-Gln189-Gly190; e

c. His303-Glu304.

[088] Tipicamente, o Xaa na posição de resíduo de aminoácido 187 é glicina, alanina, prolina, triptofano ou treonina. Dois dos três resíduos de aminoácidos pertencentes à tríade catalítica encontram-se em negrito. Em uma real ização, o Xaa na posição 180 de resíduo de aminoácido é selecionado a partir do grupo que consiste de glicina, alanina, prolina, triptofano e treonina.

[089] Análise adicional dos motivos conservados na família de carboidrato esterases CE-7 indica a presença de um motivo conservado adicional (LXD nas posições de aminoácidos 272 a 274 de SEQ ID NO 32) que pode ser utilizado para definir adicionalmente um membro da família de carboidrato esterases CE-7. Em uma realização adicional, o motivo de assinatura definido acima inclui um quarto motivo conservado, definido como:

Leu272-Xaa273-Asp274.

[090] O Xaa na posição de resíduo de aminoácido 273 é tipicamente isoleucina, valina ou metionina. O quarto motivo inclui o resíduo de ácido aspártico (negrito) pertencente à tríade catalítica (Ser188-Asp274His303).

[091] Foram encontrados motivos conservados com perhidrolases CE-7 de diversas espécies de Thermotoga do tipo selvagem.

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Tabela A

Motivos Conservados Encontrados no Interior das Enzimas que Possuem

Atividade de Per-Hidrolase

Sequência de	Motivo RGQ^a	Motivo GXSQG^a	Motivo LXD^b	Motivo HE^a
per-hidrolase	(Resíduo NO)	(Resíduo NO)	(Resíduo NO)	(Resíduo NO)
SEQ ID NO 32	118-120	186-190	272-274	303-304
SEQ ID NO 36	118-120	186-190	272-274	303-304
SEQ ID NO 202	118-120	186-190	272-274	303-304
SEQ ID NO 203	118-120	186-190	272-274	303-304
SEQ ID NO 204	118-120	186-190	272-274	303-304
SEQ ID NO 205	119-121	187-191	273-275	304-305
a	Motivos conservados definidos	por Vincent	et al, acima,

utilizados para definir o motivo de assinatura;

^b Motivo adicional que pode ser útil na definição adicional do motivo de assinatura definido por Vincent et al, acima.

[092] Da forma utilizada no presente, as expressões “cefalosporina C desacetilase” e “cefalosporina C acetil hidrolase” designam uma enzima (E. C. 3.1.1.41) que catalisa a desacetilação de cefalosporinas, tais como cefalosporina C e ácido 7-aminocefalosporânico (Mitsushima et al (1995), Appl. Env. Microbiol. 61 (6): 2224-2229).

[093] Conforme utilizado no presente, “acetil xilano esterases” designa uma enzima (E. C. 3.1.1.72; AXEs) que catalisa a desacetilação de xilanos acetilados e outros sacarídeos acetilados.

[094] Da forma utilizada no presente, a expressão “Thermotoga neapolitana” designa uma linhagem de Thermotoga neapolitana descrita como possuindo atividade de acetil xilano esterase (GENBANK® AAB70869). A sequência de aminoácidos da enzima que possui atividade de per-hidrolase de Thermotoga neapolitana é fornecida como SEQ ID NO 32.

[095] Da forma utilizada no presente, a expressão “Thermotoga marítima’ designa uma célula bacteriana descrita como possuindo atividade de acetil xilano esterase (GENBANK® NP_227893.1). A sequência de aminoácidos

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30/111 da enzima que possui atividade de per-hidrolase de Thermotoga maritima é fornecida como SEQ ID NO 36.

[096] Da forma utilizada no presente, a expressão “Thermotoga lettingae” designa uma célula bacteriana descrita como possuindo atividade de acetil xilano esterase (GENBANK® CP000812). A sequência de aminoácidos deduzida da enzima que possui atividade de per-hidrolase de Thermotoga lettingae é fornecida como SEQ ID NO 202.

[097] Da forma utilizada no presente, a expressão “Thermotoga petrophila” designa uma célula bacteriana descrita como possuindo atividade de acetil xilano esterase (GENBANK® CP000702). A sequência de aminoácidos deduzida da enzima que possui atividade de per-hidrolase de Thermotoga lettingae é fornecida como SEQ ID NO 203.

Da forma utilizada no presente, a expressão “Thermotoga sp.

[098] RQ2” designa uma célula bacteriana descrita como possuindo atividade de acetil xilano esterase (GENBANK^® CP000969). Duas acetil xilano esterases diferentes foram identificadas a partir de Thermotoga sp. RQ2 e são designadas no presente “RQ2(a)” (a sequência de aminoácidos deduzida fornecida como SEQ ID NO 204) e “RQ2(b)” (a sequência de aminoácidos deduzida fornecida como SEQ ID NO 205).

[099] Da forma utilizada no presente, “molécula de ácido nucleico isolado” e “fragmento de ácido nucleico isolado” serão utilizados de forma intercambiável e designam um polímero de RNA ou DNA que possui fita simples ou dupla, que opcionalmente contém bases de nucleotídeos sintéticas, não naturais ou alteradas. Uma molécula de ácido nucleico isolada na forma de polímero de DNA pode ser composta de um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico ou DNA sintético.

[0100] O termo “aminoácido designará a unidade estrutural química básica de uma proteína ou polipeptídeo. As abreviações a seguir são

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31/111 utilizadas no presente para identificar aminoácidos específicos:

Aminoácido	Abreviação de três letras	Abreviação de uma letra
Alanina	Ala	A
Arginina	Arg	R
Asparagina	Asn	N
Ácido aspártico	Asp	D
Cisteína	Cys	C
Glutamina	Gln	Q
Ácido glutâmico	Glu	E
Glicina	Gly	G
Histidina	His	H
Isoleucina	Ile	I
Leucina	Leu	L
Lisina	Lys	K
Metionina	Met	M
Fenilalanina	Phe	F
Prolina	Pro	P
Serina	Ser	S
Treonina	Thr	T
Triptofano	Trp	W
Tirosina	Tyr	Y
Valina	Val	V
Qualquer aminoácido ou	Xaa	X

conforme definido no presente [0101] Da forma utilizada no presente, “substancialmente similar” designa moléculas de ácido nucleico nas quais alterações em uma ou mais bases de nucleotídeos resultam na adição, substituição ou exclusão de um ou

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32/111 mais aminoácidos, mas não afetam as propriedades funcionais (ou seja, atividade per-hidrolítica) da proteína codificada pela sequência de DNA. Da forma utilizada no presente, “substancialmente similar” também designa uma enzima que contém uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 40%, preferencialmente pelo menos 50%, de maior preferência pelo menos 60%, de maior preferência pelo menos 70%, de preferência ainda maior pelo menos 80%, de preferência ainda maior pelo menos 90% e, de preferência superior, pelo menos 95% idêntica às sequências relatadas no presente, em que a enzima resultante mantém as propriedades funcionais (ou seja, atividade perhidrolítica) do presente. “Substancialmente similar” pode também designar uma enzima que possui atividade per-hidrolítica codificada por moléculas de ácido nucleico que se hibridiza sob condições estringentes nas moléculas de ácido nucleico relatadas no presente. Compreende-se, portanto, que a presente invenção engloba mais que os exemplos de sequências específicos.

[0102] Sabe-se bem na técnica, por exemplo, que alterações em um gene que resultam na produção de um aminoácido quimicamente equivalente em um dado local, mas não afetam as propriedades funcionais da proteína codificada, são comuns. Para os propósitos da presente invenção, substituições são definidas como trocas dentro de um dos cinco grupos a seguir:

1. resíduos alifáticos pequenos, não polares ou levemente polares: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);

2. resíduos polares com carga negativa e suas amidas: Asp, Asn, Glu, Gln;

3. resíduos polares com carga positiva: His, Arg, Lys;

4. resíduos não polares alifáticos grandes: Met, Leu, Ile, Val (Cys); e

5. resíduos aromáticos grandes: Phe, Tyr e Trp.

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33/111 [0103] Desta forma, um códon para o aminoácido alanina, um aminoácido hidrofóbico, pode ser substituído por um códon que codifica um outro resíduo menos hidrofóbico (tal como glicina) ou um resíduo mais hidrofóbico (tal como valina, leucina ou isoleucina). De forma similar, pode-se também esperar que alterações que resultem na substituição de um resíduo com carga negativa por outro (tal como ácido aspártico por ácido glutâmico) ou um resíduo com carga positiva por outro (tal como lisina por arginina) gerem um produto funcionalmente equivalente. Em muitos casos, também não se esperaria que alterações de nucleotídeos que resultem na alteração das partes N-terminal e C-terminal da molécula de proteína alterassem a atividade da proteína.

[0104] Cada uma das modificações propostas encontra-se bem dentro do conhecimento rotineiro da ténica, bem como a determinação da retenção da atividade biológica dos produtos codificados. Além disso, os técnicos no assunto reconhecem que sequências substancialmente similares são englobadas pela presente invenção. Em uma realização, sequências substancialmente similares são definidas pela sua capacidade de hibridização, sob condições estringentes (0,1X SSC, 0,1% SDS, 65 °C e lavadas com 2X SSC, 0,1% SDS seguido por 0,1X SSC, 0,1% SDS, 65 °C), com as sequências exemplificadas no presente.

[0105] Da forma utilizada no presente, uma molécula de ácido nucleico é “hibridizável” em uma outra molécula de ácido nucleico, tal como cDNA, DNA genômico ou RNA, quando uma fita isolada da primeira molécula puder ligar-se à outra molécula sob condições apropriadas de temperatura e resistência iônica de solução. As condições de hibridização e lavagem são bem conhecidas e exemplificadas em Sambrook, J. e Russell, D. T., Molecular Cloning:_A Laboratory Manual, terceira edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001). As condições de temperatura e resistência

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34/111 iônica determinam a “estringência da hibridização. As condições de estringência podem ser ajustadas para selecionar fragmentos moderadamente similares, tais como sequências homólogas de organismos com relação distante, até fragmentos altamente similares, tais como genes que duplicam enzimas funcionais de organismos com relação próxima. Lavagens póshibridização determinam tipicamente as condições de estringência. Um conjunto de condições preferidas utiliza uma série de lavagens a partir de 6X SSC, 0,5% SDS à temperatura ambiente por quinze minutos, repetida em seguida com 2X SSC, 0,5% SDS a 45 °C por trinta minutos e repetida em seguida por duas vezes com 0,2X SSC, 0,5% SDS a 50 °C por trinta minutos. Um conjunto de condições de maior preferência utiliza temperaturas mais altas nas quais as lavagens são idênticas às acima, exceto pela temperatura das duas lavagens finais de trinta minutos em 0,2X SSC, 0,5% SDS, que aumentou para 60 °C. Um outro conjunto preferido de condições de hibridização estringente é 0,1X SSC, 0,1% SDS, 65 °C, e lavagem com 2X SSC, 0,1% SDS, seguido por uma lavagem final de 0,1X SSC, 0,1% SDS, 65 °C com as sequências exemplificadas no presente.

[0106] A hibridização necessita que os dois ácidos nucleicos contenham sequências complementares e, embora dependentes da estringência da hibridização, são possíveis faltas de coincidência entre as bases. A estringência apropriada de ácidos nucleicos em hibridização depende do comprimento dos ácidos nucleicos e do grau de complementação, variáveis bem conhecidas na técnica. Quanto maior o grau de similaridade ou homologia entre duas sequências de nucleotídeos, maior o valor de Tm para híbridos de ácidos nucleicos que contenham essas sequências. A estabilidade relativa (correspondente a Tm mais alta) de hibridizações de ácidos nucleicos é reduzida na ordem a seguir: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos com mais de cem nucleotídeos de comprimento, foram derivadas equações

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35/111 para cálculo da Tm (Sambrook e Russell, acima). Para hibridizações com ácidos nucleicos mais curtos, ou seja, oligonucleotídeos, a posição de falta de coincidência torna-se mais importante e o comprimento do oligonucleotídeo determina a sua especificidade (Sambrook e Russell, acima). Em um aspecto, o comprimento de um ácido nucleico hibridizável é de pelo menos cerca de dez nucleotídeos. Preferencialmente, um comprimento mínimo de um ácido nucleico hibridizável é de pelo menos cerca de quinze nucleotídeos de comprimento, de maior preferência pelo menos cerca de vinte nucleotídeos de comprimento, de preferência ainda maior pelo menos trinta nucleotídeos de comprimento, de preferência ainda maior pelo menos trezentos nucleotídeos de comprimento e, de preferência superior, preferencialmente pelo menos oitocentos nucleotídeos de comprimento. Além disso, os técnicos no assunto reconhecerão que a temperatura e a concentração de sal da solução de lavagem podem ser ajustadas conforme o necessário, de acordo com fatores tais como o comprimento da sonda.

[0107] Da forma utilizada no presente, a expressão “percentual de identidade” é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos ou duas ou mais sequências de polinucleotídeos, conforme determinado por meio de comparação das sequências. Na técnica, “identidade” também indica o grau de relação de sequências entre sequências de polipeptídeos ou polinucleotídeos, conforme venha a ser o caso, conforme determinado pela coincidência entre conjuntos dessas sequências. “Identidade” e “similaridade” podem ser facilmente calculadas por meio de métodos conhecidos, incluindo, mas sem limitações, os descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.), Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing:_Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.), Academic Press, Nova Iorque (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I (Griffin, A. M. e Griffin, H. G., Eds.), Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von

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Heinje, G., Ed.), Academic (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., Eds.), Stockton Press, Nova Iorque (1991). Métodos de determinação da identidade e similaridade são codificados em programas de computador disponíveis ao público. Os cálculos de alinhamentos de sequências e percentuais de identidade podem ser realizados utilizando o programa Megalign da suíte de computação bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison WI), o programa AlignX da Vector NTI versão 7.0 (Informax, Inc., Bethesda MD) ou a Suíte de Software Aberto EMBOSS (EMBLEBI; Rice et al, Trends in Genetics 16 (6): 276-277 (2000)). Pode-se realizar alinhamento múltiplo das sequências utilizando o método Clustal (ou seja, CLUSTALW; tal como a versão 1.83) de alinhamento (Higgins e Sharp, CABIOS, 5: 151-153 (1989); Higgins et al, Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680 (1994); e Chenna et al, Nucleic Acids Res. 31 (13): 3497-500 (2003)), disponível por meio do Laboratório Europeu de Biologia Molecular por meio do Instituto Europeu de Bioinformática) com os parâmetros padrão. Os parâmetros apropriados de alinhamentos de proteínas CLUSTALW incluem penalidade de existência de intervalos = 15, extensão de intervalo = 0,2, matriz = Gonnet (por exemplo, Gonnet 250), proteína FINAL DE INTERVALO = -1, proteína DISTÂNCIA DE INTERVALO = 4 e COMPRIMENTO DE PALAVRA = 1. Em uma realização, utiliza-se alinhamento rápido ou lento com as configurações padrão, sendo preferido um alinhamento lento. Alternativamente, os parâmetros que utilizam o método CLUSTALW (versão 1.83) podem ser modificados para também utilizar COMPRIMENTO DE PALAVRA = 1, PENALIDADE DE INTERVALO = 10, EXTENSÃO DO INTERVALO = 1, MATRIZ = BLOSUM (por exemplo, BLOSUM64), VISUALIZAÇÃO DO MELHOR RESULTADO = 5 e ESPAÇAMENTO EM DIAGONAIS = 5.

[0108] Em um aspecto da presente invenção, moléculas de ácido nucleico isoladas apropriadas (polinucleotídeos isolados de acordo com a

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37/111 presente invenção) codificam um polipeptídeo que contém uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 50%, preferencialmente pelo menos 60, de maior preferência pelo menos 70%, de maior preferência pelo menos 80%, de preferência ainda maior pelo menos 85%, de preferência ainda maior pelo menos 90% e, de preferência superior, pelo menos 95% idêntica às sequências de aminoácidos relatadas no presente. As moléculas de ácido nucleico apropriadas de acordo com a presente invenção não apenas possuem as homologias acima, mas também codificam tipicamente um polipeptídeo que contém cerca de 300 a cerca de 340 aminoácidos, de maior preferência cerca de 310 a cerca de 330 aminoácidos e, de preferência superior, cerca de 325 aminoácidos.

[0109] Da forma utilizada no presente, “degeneração de códons” designa a natureza do código genético que permite a variação da sequência de nucleotídeos sem afetar a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo codificado. Consequentemente, a presente invenção refere-se a qualquer molécula de ácido nucleico que codifica, no todo ou em parte substancial, as sequências de aminoácidos que codificam o polipeptídeo microbiano do presente. Os técnicos no assunto conhecem bem a “orientação de códon” exibida por uma célula hospedeira específica no uso de códons de nucleotídeos para especificar um dado aminoácido. Ao sintetizar um gene para aumento da expressão em uma célula hospedeira, portanto, é desejável projetar o gene de tal forma que a sua frequência de uso de códons aproximese da frequência de uso de códons preferida da célula hospedeira.

[0110] Da forma utilizada no presente, a expressão “otimizado por códons”, ao referir-se a genes ou regiões de codificação de moléculas de ácido nucleico para transformação de diversos hospedeiros, designa a alteração de códons no gene ou regiões de codificação das moléculas de ácido nucleico para que reflitam o uso de códons típico do organismo hospedeiro sem alterar

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38/111 o polipeptídeo codificado pelo DNA.

[0111] Da forma utilizada no presente, “genes sintéticos” podem ser reunidos a partir de blocos de construção de oligonucleotídeos que são sintetizados quimicamente utilizando procedimentos conhecidos dos técnicos no assunto. Esses blocos de construção são ligados e combinados para formar segmentos de genes que são montados enzimaticamente em seguida para construir o gene completo. “Quimicamente sintetizado”, com referência a uma sequência de DNA, significa que os nucleotídeos componentes foram montados in vitro. A síntese química manual de DNA pode ser realizada utilizando procedimentos bem estabelecidos ou pode-se realizar síntese química automática utilizando uma dentre uma série de máquinas disponíveis comercialmente. Consequentemente, os genes podem ser elaborados para expressão genética ideal com base na otimização de sequências de nucleotídeos para refletir a orientação de códons da célula hospedeira. Os técnicos no assunto apreciam a probabilidade de expressão genética bem sucedida caso o uso do códon seja orientado para os códons favorecidos pelo hospedeiro. A determinação de códons preferidos pode ser baseada em uma pesquisa de genes derivados da célula hospedeira, na qual as informações de sequências são disponíveis.

[0112] Da forma utilizada no presente, “gene” indica uma molécula de ácido nucleico que expressa uma proteína específica, incluindo sequências reguladoras anteriores (sequências não codificadoras 5') e posteriores (sequências não codificadoras 3') à sequência de codificação. “Gene nativo” designa um gene conforme encontrado na natureza com as suas próprias sequências reguladoras. “Gene quimérico” indica qualquer gene que não seja um gene nativo, que compreende sequências reguladoras e de codificação que não são encontradas juntas na natureza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender sequências reguladoras e sequências

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39/111 de codificação que são derivadas de fontes diferentes ou sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma forma diferente da encontrada na natureza. “Gene endógeno” indica um gene nativo no seu local natural no genoma de um organismo. Gene “exógeno” indica um gene normalmente não encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro por meio de transferência genética. Genes exógenos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo ou genes quiméricos. “Transgene” é um gene que foi introduzido no genoma por meio de um procedimento de transformação.

[0113] Da forma utilizada no presente, “sequência de codificação” designa uma sequência de DNA que codifica uma sequência de aminoácidos específica. “Sequências reguladoras apropriadas” designam sequências de nucleotídeos localizadas acima no fluxo (sequências não codificadoras 5'), no interior ou abaixo no fluxo (sequências não codificadoras 3') de uma sequência de codificação e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA ou tradução da sequência de codificação associada. Sequências reguladoras podem incluir promotores, sequências líderes de tradução, local de processamento de RNA, local de ligação de efetores e estrutura de circuito e haste.

[0114] Da forma utilizada no presente, “promotor” designa uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência de codificação ou RNA funcional. Geralmente, uma sequência de codificação está localizada a 3' de uma sequência promotora. Promotores podem ser completamente derivados de um gene nativo ou ser compostos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou mesmo compreender segmentos de DNA sintéticos. Os técnicos no assunto compreendem que diferentes promotores podem dirigir a expressão de um

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40/111 gene em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais ou fisiológicas. Promotores que causam a expressão de um gene na maior parte das vezes são comumente denominados “promotores constitutivos”. Reconhece-se ainda que, como na maior parte dos casos as fronteiras exatas de sequências reguladoras não foram completamente definidas, fragmentos de DNA com comprimentos diferentes podem possuir atividade promotora idêntica.

[0115] Da forma utilizada no presente, as “sequências não codificadoras 3'” designam sequências de DNA localizadas abaixo no fluxo de uma sequência de codificação e incluem sequências de reconhecimento de poliadenilação (normalmente limitadas a eucariotes) e outras sequências que codificam sinais reguladores capazes de afetar o processamento de mRNA ou a expressão genética. O sinal de poliadenilação normalmente é caracterizado por afetar a adição de características de ácido poliadenílico (normalmente limitadas a eucariotes) à extremidade 3' do precursor de mRNA.

[0116] Da forma utilizada no presente, a expressão “ligado operavelmente” designa a associação de sequências de ácidos nucleicos sobre uma única molécula de ácido nucleico, de tal forma que a função de uma seja afetada pelo outra. Um promotor é ligado operavelmente a uma sequência de codificação, por exemplo, quando for capaz de afetar a expressão daquela sequência de codificação, ou seja, aquela sequência de codificação encontrase sob o controle transcricional do promotor. Sequências de codificação podem ser ligadas operavelmente a sequências reguladoras em orientação sense ou antisense.

[0117] Da forma utilizada no presente, o termo “expressão” indica a transcrição e o acúmulo estável de RNA sense (mRNA) ou antisense derivado da molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

Expressão pode também designar a tradução de mRNA em um polipeptídeo.

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41/111 [0118] Da forma utilizada no presente, “transformação” designa a transferência de uma molécula de ácido nucleico para o genoma de um organismo hospedeiro, o que resulta em herança geneticamente estável. Na presente invenção, o genoma da célula hospedeira inclui genes cromossômicos e extracromossômicos (tais como de plasmídeos). Os organismos hospedeiros que contêm as moléculas de ácidos nucleicos transformadas são denominados organismos “transgênicos”, “recombinantes” ou “transformados”.

[0119] Da forma utilizada no presente, os termos “plasmídeo”, “vetor” e “conjunto” designam um elemento extracromossômico que frequentemente conduz genes que não são parte do metabolismo central da célula e, normalmente, encontram-se na forma de moléculas de DNA de fita dupla circulares. Esses elementos podem ser sequências reprodutoras autônomas, sequências integrantes de genomas, sequências de fagos ou nucleotídeos, lineares ou circulares, de um RNA ou DNA de fita simples ou dupla, derivados de qualquer fonte, em que uma série de sequências de nucleotídeos uniu-se ou recombinou-se em uma construção exclusiva que é capaz de introduzir um fragmento promotor e sequência de DNA para um produto genético selecionado junto com sequência não traduzida 3' apropriada em uma célula. “Conjunto de transformação” designa um vetor específico que contém um gene exógeno e que contém elementos além do gene exógeno que possibilitam a transformação de uma célula hospedeira específica. “Conjunto de expressão” designa um vetor específico que contém um gene exógeno e possui elementos além do gene exógeno que permitem expressão aprimorada daquele gene em um hospedeiro exógeno.

[0120] Da forma utilizada no presente, a expressão “software de análise de sequências” designa qualquer algoritmo de computador ou programa de software que seja útil para análise de sequências de nucleotídeos

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42/111 ou de aminoácidos. “Software de análise de sequências” pode ser disponível comercialmente ou desenvolvido independentemente. Software de análise de sequências incluirá, mas sem limitações, a suíte GCG de programas (Pacote Wisconsin Versão 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) e DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715, Estados Unidos), CLUSTALW (por exemplo, versão 1.83; Thompson et al, Nucleic Acids Research, 22 (22): 4673-4680 (1994), e o programa FASTA que incorpora o algoritmo Smith-Waterman (W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., (Proc. Int. Symp.) (1994), data da reunião 1992, 111-20. Editor(es): Suhai, Sandor, Editora: Plenum, Nova Iorque NY), Vector NTI (Informax, Bethesda MD) e Sequenciador v. 4.05. Dentro do contexto do presente pedido, compreender-se-á que, ao utilizar-se software de análise de sequências para análise, os resultados da análise serão baseados nos “valores padrão” do programa indicado, a menos que especificado em contrário. Da forma utilizada no presente, “valores padrão” indicarão qualquer conjunto de valores ou parâmetros definidos pelo fabricante de software que são carregados originalmente com o software quando inicializado em primeiro lugar.

[0121] Da forma utilizada no presente, a expressão “contaminantes biológicos” designa uma ou mais entidades biológicas patogênicas e/ou indesejadas, incluindo, mas sem limitações, microorganismos, esporos, vírus, príons e suas misturas. Os processos descritos no presente produzem concentração eficaz de pelo menos um ácido percarboxílico útil para reduzir e/ou eliminar a presença dos contaminantes biológicos viáveis. Em uma realização preferida, o contaminante biológico é um micro-organismo patogênico viável.

[0122] Conforme utilizado no presente, o termo “desinfecção” designa o processo de destruição ou prevenção do crescimento de

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43/111 contaminantes biológicos. Da forma utilizada no presente, o termo desinfetante designa um agente que desinfeta por meio de destruição, neutralização ou inibição do crescimento de contaminantes biológicos. Tipicamente, desinfetantes são utilizados para tratar superfícies ou objetos inanimados. Da forma utilizada no presente, o termo “desinfecção” designa o ato ou processo de desinfecção. Da forma utilizada no presente, o termo “antisséptico” designa um agente químico que inibe o crescimento de micro organismos que conduzem doenças. Em um aspecto, os contaminantes biológicos são micro-organismos patogênicos.

[0123] Da forma utilizada no presente, o termo “sanitário” indica ou refere-se à restauração ou preservação da saúde, tipicamente por meio de remoção, prevenção ou controle de um agente que pode ser prejudicial à saúde. Da forma utilizada no presente, o termo “sanitizar” indica tornar sanitário. Da forma utilizada no presente, o termo sanitizador designa um agente sanitizador. Da forma utilizada no presente, o termo “sanitização” designa o ato ou processo de sanitizar.

[0124] Da forma utilizada no presente, o termo “virucida” indica um agente que inibe ou destrói vírus e é sinônimo de “viricida”. Um agente que exibe a capacidade de inibir ou destruir vírus é descrito como possuindo atividade “virucida”. Os perácidos podem possuir atividade virucida. Virucidas alternativos típicos conhecidos na técnica que podem ser apropriados para uso com a presente invenção incluem, por exemplo, álcoois, éteres, clorofórmio, formaldeído, fenóis, betapropiolactona, iodo, cloro, sais de mercúrio, hidroxilamina, óxido de etileno, etileno glicol, compostos de amônio quaternário, enzimas e detergentes.

[0125] Da forma utilizada no presente, o termo “biocida” designa um agente químico, tipicamente de amplo espectro, que desativa ou destrói micro-organismos. Um agente químico que exibe a capacidade de desativar ou

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44/111 destruir micro-organismos é descrito como possuindo atividade “biocida”. Os perácidos podem possuir atividade biocida. Biocidas alternativos típicos conhecidos na técnica, que podem ser apropriados para uso na presente invenção, incluem, por exemplo, cloro, dióxido de cloro, cloroisocianuratos, hipocloritos, ozônio, acroleína, aminas, fenólicos clorados, sais de cobre, compostos de organoenxofre e sais de amônio quaternário.

[0126] Da forma utilizada no presente, a expressão “concentração biocida mínima” designa a concentração mínima de um agente biocida, por um tempo de contato específico, que produzirá uma redução letal irreversível desejada na população viável dos micro-organismos desejados. A eficácia pode ser medida por meio da redução log10 em micro-organismos viáveis após o tratamento. Em um aspecto, a redução desejada dos micro-organismos viáveis após tratamento é de pelo menos uma redução 3-log, de maior preferência pelo menos uma redução 4-log e, de preferência superior, pelo menos uma redução 5-log. Em outro aspecto, a concentração biocida mínima é pelo menos uma redução 6-log em células de micróbios viáveis.

[0127] Da forma utilizada no presente, as expressões “fonte de peroxigênio” e “peroxigênio fonte” designam compostos capazes de fornecer peróxido de hidrogênio sob concentração de cerca de 1 mM ou mais quando em solução aquosa, incluindo, mas sem limitações, peróxido de hidrogênio, adutos de peróxido de hidrogênio (tais como aduto de peróxido de hidrogênio e ureia (peróxido de carbamida)), perboratos e percarbonatos. Conforme descrito no presente, a concentração do peróxido de hidrogênio fornecido pelo composto de peroxigênio na formulação de reação aquosa é inicialmente de pelo menos 1 mM ou mais mediante combinação dos componentes de reação. Em uma realização, a concentração de peróxido de hidrogênio na formulação de reação aquosa é de pelo menos 10 mM. Em uma outra realização, a concentração de peróxido de hidrogênio na formulação de reação aquosa é de

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45/111 pelo menos 100 mM. Em uma outra realização, a concentração de peróxido de hidrogênio na formulação de reação aquosa é de pelo menos 200 mM. Em uma outra realização, a concentração de peróxido de hidrogênio na formulação de reação aquosa é de 500 mM ou mais. Em ainda outra realização, a concentração de peróxido de hidrogênio na formulação de reação aquosa é de 1000 mM ou mais. A razão molar entre o peróxido de hidrogênio e substrato de enzima, tal como triglicéride (H2O2:substrato) na formulação de reação aquosa pode ser de cerca de 0,002 a 20, preferencialmente cerca de 0,1 a 10 e, de preferência superior, cerca de 0,5 a 5.

[0128] Variantes de polipeptídeos que possuem atividade de perhidrólise e que são estruturalmente classificados como enzimas CE-7.

[0129] Um objeto da presente invenção é o de fornecer perhidrolases com atividade aprimorada para produção de uma concentração eficaz de ácido percarboxílico para desinfecção (tal como para desativação de bactérias, vírus e esporos), com relação às enzimas do tipo selvagem das quais foram derivadas. Um segundo objeto da presente invenção é o de fornecer per-hidrolases com atividade aprimorada ao longo de toda a faixa de pH de atividade com relação às enzimas do tipo selvagem, em que o aumento da atividade específica resulta na redução da quantidade de enzima necessária para produzir uma concentração eficaz de ácido peroxicarboxílico (e redução concomitante do custo da enzima em uma formulação). Um terceiro objeto da presente invenção é o de fornecer per-hidrolases com razão de perhidrólise/hidrólise (razão P/H) aprimorada com relação às enzimas do tipo selvagem.

[0130] A estrutura de cristal de raio X para CE-7 acetil xilano esterase de T. maritima foi publicada (vide o banco de dados de proteínas

Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB)). A sequência de aminoácidos de per-hidrolase CE-7 de T. neapolitana possui 91% de identidade

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46/111 com a acetil xilano esterase de T. maritima, o que permite o seu mapeamento na estrutura de cristal de raio X de T. maritima. Além da tríade catalítica canônica (H303, S188 e D274), diversos resíduos também se encontram dentro do local ativo de T. neapolitana e substituições nesses locais foram selecionadas para determinar se as enzimas variantes resultantes apresentaram alterações benéficas no pKa do local ativo e no Kcat e Km gerais para substratos, bem como no aumento da relação entre per-hidrólise e hidrólise (razão P/H) com relação às enzimas do tipo selvagem. Com base na atividade de per-hidrólise observada, foram criadas diversas enzimas CE-7 variantes que possuem maior atividade de geração de ácido peracético com relação às enzimas CE-7 do tipo selvagem.

[0131] O processo de aumento da atividade de per-hidrólise envolve a construção de um vetor de expressão que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que é classificado estruturalmente como enzima CE-7, mutagênese da sequência de codificação de enzimas e, por fim, isolamento de variantes com aumento da atividade de geração de ácido peracético. Tipicamente, a abordagem envolve a criação e o isolamento de enzimas variantes que aumentam a atividade de geração de ácido peracético na presença de acetato, triacetina e peróxido de hidrogênio. Rodadas subsequentes de mutagênese, se desejadas, permitem a evolução da sequência de codificação de enzimas.

[0132] Bibliotecas de enzimas mutantes podem ser preparadas utilizando qualquer sequência de nucleotídeos do tipo selvagem (ou substancialmente similares) que codifica um polipeptídeo que é classificado estruturalmente como enzima CE-7 como material de partida de mutagênese. Métodos de mutação de sequências são bem estabelecidos na literatura. Mutagênese e seleção in vitro, mutagênese dirigida a local, PCR à prova de erros (Melnikov et al, Nucleic Acids Res. 27 (4): 1056-62 (1999)), “comutação

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47/111 de genes” ou outros meios, por exemplo, podem ser empregados para a obtenção de mutações de sequências de enzimas. Isso poderá permitir a produção de um polipeptídeo que possui, por exemplo com relação às enzimas do tipo selvagem e/ou razão P/H aprimorada com relação à enzima do tipo selvagem.

[0133] Se desejado, as regiões de uma enzima importantes para atividade enzimática podem ser determinadas por meio de mutagênese dirigida a local rotineira, expressão dos polipeptídeos variantes resultantes e determinação das suas atividades. Os mutantes podem incluir exclusões, inserções e mutações pontuais ou suas combinações.

[0134] Conforme discutido nos Exemplos abaixo, um resíduo de cisteína chave foi identificado em acetil xilano esterases de Thermotoga que, quando alterado para uma alanina, valina, serina ou treonina, aumenta inesperadamente a atividade de per-hidrólise do polipeptídeo variante em comparação com a acetil xilano esterase do tipo selvagem que não possui a substituição de aminoácido especificada. Devido à alta homologia entre acetil xilano esterases ao longo do gênero Thermotoga, espera-se que uma substituição dessa cisteína por uma alanina, valina, serina ou treonina em qualquer gênero de Thermotoga produza resultados similares aos descritos nos exemplos de trabalho. Desta forma, em algumas realizações, os polipeptídeos variantes e os polinucleotídeos que codificam esses polipeptídeos são derivados de acetil xilano estereases de Thermotoga do tipo selvagem que possuem atividade de per-hidrólise, em que a acetil xilano esterase de Thermotoga compreende a região C-terminal descrita em SEQ ID NO 31, em que o polipeptídeo variante contém um resíduo de alanina, valina, serina ou treonina no lugar do resíduo de cisteína na posição de aminoácido 93 de SEQ ID NO 31. A região C-terminal descrita em SEQ ID NO 31 é altamente conservada entre acetil xilano esterases de Thermotoga (vide Figura 2 para

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48/111 alinhamento entre seis acetil xilano esterases) e, portanto, pode servir de identificador de acetil xilano esterases que são propensas a mutação do resíduo cisteína chave descrito no presente.

[0135] Muito embora diversos resíduos em SEQ ID NO 31 sejam indicados como “quaisquer” resíduos, existem aminoácidos típicos que surgem em muitos desses resíduos. Os aminoácidos típicos nas posições marcadas como Xaa em SEQ ID NO 31, por exemplo, são glicina na posição 2, serina na posição 13, lisina na posição 18, lisina na posição 20, leucina na posição 23, cisteína na posição 24, ácido aspártico na posição 25, fenilalanina na posição 32, arginina na posição 33, leucina na posição 38, valina ou treonina na posição 39, treonina na posição 41, histidina na posição 42, alanina na posição 45, treonina na posição 48, asparagina na posição 49, fenilalanina ou tirosina na posição 50, leucina na posição 51, treonina na posição 53, arginina na posição 55, ácido glutâmico na posição 58, isoleucina na posição 60, alanina ou valina na posição 75, isoleucina na posição 79, glicina na posição 86, arginina na posição 90, isoleucina na posição 91, histidina ou tirosina na posição 104, prolina na posição 108, ácido glutâmico na posição 110, arginina na posição 112, isoleucina na posição 113, tirosina na posição 116, arginina na posição 118, glicina na posição 123, glutamina na posição 126, alanina na posição 127, isoleucina na posição 128, glutamina na posição 130, valina ou leucina na posição 131, lisina na posição 132, leucina na posição 134 e arginina ou lisina na posição 136.

[0136] A adição e/ou exclusão de um ou mais aminoácidos na região C-terminal de acetil xilano esterase de Thermotoga são permitidas desde que essa(s) adição(ões) e/ou exclusão(ões) não afete(m) as propriedades funcionais da enzima.

[0137] Em realizações mais específicas, os polipeptídeos variantes descritos no presente possuem identidade de sequências de

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49/111 aminoácidos de pelo menos 95% (ou, em várias realizações, identidade de sequências de 96%, 97%, 98% ou 99%) com base, por exemplo, no método CLUSTAL de alinhamento com parâmetros padrão de alinhamento em pares de COMPRIMENTO DE PALAVRA = 1, PENALIDADE DO INTERVALO = 3, VISUALIZAÇÃO DO MELHOR RESULTADO = 5 e ESPAÇAMENTO EM DIAGONAIS = 5, em comparação com:

(a) SEQ ID NO 5, 10, 15, 20 ou 25, desde que uma substituição do aminoácido 277 de SEQ ID NO 5, 10, 15, 20 ou 25 seja selecionada a partir do grupo que consiste de serina, treonina, valina e alanina;

ou (b) SEQ ID NO 30, desde que uma substituição do aminoácido 278 de SEQ ID NO 30 seja selecionada a partir do grupo que consiste de serina, treonina, valina e alanina.

[0138] Ainda mais especificamente, o polipeptídeo variante que posui atividade per-hidrolítica aprimorada (atividade per-hidrolítica e/ou aumento da razão P/H) compreende SEQ ID NO 5, 10, 15, 20, 25 ou 30. Em uma outra realização, o polipeptídeo variante compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO 5, 10, 15, 20, 25 ou 30 em que Xaa em cada sequência correspondente é selecionado a partir do grupo que consiste de alanina, serina, treonina e valina. Em uma outra realização, o polipeptídeo variante compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO 5 e 10, em que Xaa em cada sequência correspondente é selecionado a partir do grupo que consiste de alanina, serina, treonina e valina.

Elaboração de proteínas [0139] As variantes de CE-7 esterase do presente foram produzidas por meio de mutagênese. Contempla-se que os nucleotídeos do presente podem ser utilizados para gerar produtos genéticos que possuem

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50/111 atividade alterada ou aprimorada. São conhecidos diversos métodos de mutação de uma sequência genética nativa para gerar um produto genético com atividade alterada ou aumentada, incluindo, mas sem limitações, 1) mutagênese aleatória, 2) comutação de domínios (utilizando domínios de dedo de zinco ou enzimas de restrição), 3) PCR à prova de erros (Melnikov et al, Nucleic Acids Research 27 (4): 1056-1062 (1999)); 4) mutagênese dirigida a local (Coombs et al, Proteins (1998), págs. 259-311, tabela 1, Angeletti, Ruth Hogue, Ed., Academic: San Diego, Califórnia); e 5) “comutação de genes” (Patentes Norte-Americanas n° 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721 e 5.837.458, incorporadas ao presente como referência).

[0140] A reação em cadeia de polimerase (PCR) pode ser utilizada para amplificar um fragmento de DNA com a criação concomitante de diversas mutações por meio de má incorporação de nucleotídeos. Isso pode ser atingido por meio de modificação das condições de PCR tais como alteração das razões de dNTPs ou adição de diversas quantidades de cloreto de manganês à reação (Fromant et al, Anal. Biochem., 224 (1): 347-53 (1995); Lin-Goerke et al, Biotechniques, 23 (3): 409-12 (1997)). O conjunto de fragmentos de DNA que sofreram mutação pode ser clonado em seguida para gerar uma biblioteca de plasmídeos que sofreram mutação que pode ser selecionada após a expressão em um hospedeiro tal como E. coli.

[0141] O método de comutação genética é particularmente atraente devido à sua fácil implementação, alta velocidade de mutagênese e facilidade de seleção. O processo de comutação genética envolve a divisão por meio de endonuclease de restrição de um gene de interesse em fragmentos com tamanho específico na presença de populações adicionais de regiões de DNA que possuem similaridade e/ou diferença com o gene de interesse. Este conjunto de fragmentos desnaturar-se-á e recombinar-se-á em seguida para criar um gene que sofreu mutação. O gene que sofreu mutação é selecionado

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51/111 em seguida para determinar alteração da atividade.

[0142] As sequências de acordo com a presente invenção podem sofrer mutação e ser selecionadas para determinar atividade alterada ou aumentada por meio deste método. As sequências deverão possuir fita dupla e podem ser de diversos comprimentos, que variam de 50 bp a 10 kB. As sequências podem ser digeridas aleatoriamente em fragmentos que variam de cerca de 10 bp a 1000 bp, utilizando endonuclease de restrição bem conhecida na técnica (Sambrook, J. e Russell, acima). Além das sequências microbianas do presente, podem ser adicionadas populações de fragmentos que são hibridizáveis na sequência, no todo ou em parte. De forma similar, pode-se também adicionar uma população de fragmentos que não são hibridizáveis na sequência do presente. Tipicamente, essas populações de fragmentos adicionais são agregadas em excesso de cerca de dez a vinte vezes em peso em comparação com o ácido nucleico total. Geralmente, se este processo for seguido, o número de fragmentos de ácidos nucleicos específicos diferentes na mistura será de cerca de 100 a cerca de 1000. A população misturada de fragmentos de ácido nucleico aleatórios é desnaturada para formar fragmentos de ácido nucleico de fita única e recombinada em seguida. Apenas os fragmentos de ácido nucleico com fita única que possuem regiões de homologia com outros fragmentos de ácido nucleico de fita única serão recombinados. Os fragmentos de ácido nucleico aleatórios podem ser desnaturados por meio de aquecimento. Os técnicos no assunto poderão determinar as condições necessárias para a completa desnaturação do ácido nucleico de fita dupla. Preferencialmente, a temperatura é de cerca de 80 °C a 100 °C. Os fragmentos de ácido nucleico podem ser recombinados por meio de resfriamento. Preferencialmente, a temperatura é de cerca de 20 °C a 75 °C. A renaturação pode ser acelerada por meio da adição de polietlieno glicol (“PEG”) ou sal. Uma concentração de sal apropriada pode variar de 0 mM a 200 mM.

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Os fragmentos de ácido nucleico combinados são incubados em seguida na presença de uma polimerase de ácido nucleico e dNTPs (ou seja, dATP, dCTP, dGTP e dTTP). A polimerase de ácido nucleico pode ser o fragmento Klenow, a Taq polimerase ou qualquer outra polimerase de DNA conhecida na técnica. A polimerase pode ser adicionada aos fragmentos de ácido nucleico aleatórios antes da combinação, simultaneamente com a combinação ou após a combinação. O ciclo de desnaturação, renaturação e incubação na presença de polimerase é repetido por um número de vezes desejado. Preferencialmente, o ciclo é repetido por cerca de duas a cinquenta vezes e, de maior preferência, a sequência é repetida por dez a quarenta vezes. O ácido nucleico resultante é um polinucleotídeo de fita dupla maior que varia de cerca de 50 bp a cerca de 100 kB e pode ser selecionado para determinar a expressão e a atividade alterada por meio de protocolos de expressão e clonagem padrão (Sambrook, J. e Russell, acima).

[0143] Além disso, uma proteína híbrida pode ser montada por meio de fusão de domínios funcionais utilizando comutação genética (por exemplo, Nixon et al, PNAS, 94: 1069-1073 (1997)). O domínio funcional do gene do presente pode ser combinado com o domínio funcional de outros genes para criar enzimas inovadoras com função catalítica desejada. Uma enzima híbrida pode ser construída utilizando métodos de extensão de sobreposição de PCR e Clonada Em Diversos Vetores De Expressão Utilizando Os Métodos Bem Conhecidos Dos Técnicos No Assunto.

Condições De Reação Apropriadas Para Preparação Catalisada Por

Enzimas De Ácidos Peroxicarboxílicos A Partir De Ésteres De Ácido

Carboxílico E Peróxido De Hidrogênio [0144] Em um aspecto da presente invenção, é fornecido um processo de produção de uma formulação aquosa que compreende um ácido peroxicarboxílico por meio da reação de ésteres de ácido carboxílico e uma

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53/111 fonte de peroxigênio, incluindo, mas sem limitações, peróxido de hidrogênio, perborato de sódio e percarbonato de sódio, na presença de pelo menos um dos catalisadores de enzimas do presente que possui atividade de perhidrólise. Em uma realização, o catalisador de enzimas do presente compreende pelo menos uma das variantes de enzimas do presente que possui atividade per-hidrolítica, em que a mencionada enzima é classificada estruturalmente como membro da família de carboidrato esterases CE-7. Em uma outra realização, o catalisador de per-hidrolase é uma cefalosporina C desacetilase. Em uma outra realização, o catalisador de per-hidrolase é uma acetil xilano esterase.

[0145] Em uma realização, o catalisador de per-hidrolase compreende pelo menos um dos polipeptídeos variantes de CE-7 do presente que possui atividade de per-hidrólise descrita no presente.

[0146] Substratos de éster de ácido carboxílico apropriados podem incluir ésteres fornecidos pela fórmula a seguir:

[X]mR5 em que:

- X é um grupo éster da fórmula R6C(O)O;

- R6 é uma porção hidrocarbila C1 a C7 linear, ramificada ou cíclica, opcionalmente substituída por grupos hidroxila ou grupos alcóxi C1 a C4, em que R6 compreende opcionalmente uma ou mais ligações éter em que R6 é C2 a C7;

- R5 é uma porção hidrocarbila C1 a C6 linear, ramificada ou cíclica opcionalmente substituída por grupos hidroxila, em que cada átomo de carbono em R5 compreende individualmente não mais de um grupo hidroxila ou não mais de um grupo éster e em que R5 compreende opcionalmente uma ou mais ligações éter;

- m = 1 até o número de átomos de carbono em R5; e

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54/111 em que os mencionados ésteres possuem solubilidade em água de pelo menos 5 ppm a 25 °C.

[0147] Em outras realizações, substratos apropriados podem também incluir ésteres da fórmula:

O

R1-C-O-R2 em que R1 é um alquila C1 a C7 de cadeia linear ou ramificada opcionalmente substituído por um grupo hidroxila ou alcóxi C1 a C4 e R2 é um alquila, alquenila, alquinila, arila, arilalquila, alquil-heteroarila, heteroarila C1 a C10 de cadeia linear ou ramificada, (CH2CH2-O)nH ou (CH2CH(CH3)-O)nH e n = 1 a 10.

[0148] Em outras realizações, substratos éster de ácido carboxílico apropriados podem incluir glicérides da fórmula:

O r₁-c-o—ch₂-ch-ch₂-or₄

OR3 em que R1 é alquila C1 a C7 de cadeia linear ou ramificada opcionalmente substituído por um grupo hidroxila ou alcóxi C1 a C4 e R3 e R4 são individualmente H ou R1C(O).

[0149] Em outras realizações, R6 é uma porção hidrocarbila C1 a C7 linear, opcionalmente substituída por grupos hidroxila ou grupos alcóxi C1 a C4, que compreende opcionalmente uma ou mais ligações éter. Em realizações preferidas adicionais, R6 é uma porção hidrocarbila C2 a C7 linear, opcionalmente substituída por grupos hidroxila e/ou que compreende opcionalmente uma ou mais ligações éter.

[0150] Em outras realizações, substratos éster de ácido carboxílico apropriados podem também incluir sacarídeos acetilados

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55/111 selecionados a partir do grupo que consiste de mono, di e polissacarídeos acetilados. Em realizações adicionais, os sacarídeos acetilados incluem mono, di e polissacarídeos acetilados. Em realizações adicionais, os sacarídeos acetilados são selecionados a partir do grupo que consiste de xilano acetilado; fragmentos de xilano acetilado; xilose acetilada (tal como tetra-acetato de xilose); glicose acetilada (tal como penta-acetato de glicose); 1,2,3,5-tetraacetato de β-D-ribofuranose; tri-O-acetil-D-galactal; tri-O-acetil-D-glucal; e celulose acetilada. Em realizações adicionais, o sacarídeo acetilado é selecionado a partir do grupo que consiste de 1,2,3,5-tetra-acetato de β-Dribofuranose; tri-O-acetil-D-galactal; tri-O-acetil-D-glucal; e celulose acetilada. Desta forma, carboidratos acetilados podem ser substratos apropriados para a geração de ácidos percarboxílicos utilizando os métodos e sistemas do presente (ou seja, na presença de uma fonte de peroxigênio).

[0151] Em realizações adicionais, o substrato éster de ácido carboxílico é selecionado a partir do grupo que consiste de monoacetina; triacetina; monopropionina; dipropionina; tripropionina; monobutirina; dibutirina; tributirina; penta-acetato de glicose; tetra-acetato de xilose; xilano acetilado; fragmentos de xilano acetilado; 1,2,3,5-tetra-acetato de β-D-ribofuranose; tri-Oacetil-D-galactal; tri-O-acetilglucal; diacetato de propileno glicol; diacetato de etileno glicol; monoésteres ou diésteres de 1,2-etanodiol; 1,2-propanodiol; 1,3propanodiol; 1,2-butanodiol; 1,3-butanodiol; 2,3-butanodiol; 1,4-butanodiol; 1,2pentanodiol; 2,5-pentanodiol; 1,6-pentanodiol; 1,2-hexanodiol; 2,5-hexanodiol; 1,6-hexanodiol; e suas misturas. Em realizações preferidas dos métodos e sistemas do presente, o substrato compreende triacetina.

[0152] O éster de ácido carboxílico está presente na formulação de reação em concentração suficiente para produzir a concentração desejada de ácido peroxicarboxílico mediante per-hidrólise catalisada por enzimas. O éster de ácido carboxílico não necessita ser completamente solúvel na

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56/111 formulação de reação, mas possui solubilidade suficiente para permitir a conversão do éster pelo catalisador de per-hidrolase no ácido peroxicarboxílico correspondente. O éster de ácido carboxílico pode estar presente na formulação de reação em concentração de 0,05% em peso a 40% em peso da formulação de reação, preferencialmente em concentração de 0,1% em peso a 20% em peso da formulação de reação e, de maior preferência, em concentração de 0,5% em peso a 10% em peso da formulação de reação.

[0153] A fonte de peroxigênio pode incluir, mas sem limitações, peróxido de hidrogênio, adutos de peróxido de hidrogênio (tais como aduto de peróxido de hdirogênio e ureia (peróxido de carbamida)), sais de perborato e sais de percarbonato. A concentração de composto de peroxigênio na formulação de reação pode variar de 0,0033% em peso a cerca de 50% em peso, preferencialmente de 0,033% em peso a cerca de 40% em peso, de maior preferência de 0,33% em peso a cerca de 30% em peso.

[0154] Relatou-se que muitos catalisadores de per-hidrolase (células inteiras, células inteiras permeabilizadas e extratos de células inteiras parcialmente purificadas) possuem atividade de catalase (EC 1.11.1.6). Catalases catalisam a conversão de peróxido de hidrogênio em oxigênio e água. Em um aspecto, o catalisador de per-hidrólise não possui atividade de catalase. Em um outro aspecto, um inibidor de catalase é adicionado à formulação de reação. Exemplos de inibidores de catalase incluem, mas sem limitações, azida de sódio e sulfato de hidroxilamina. Os técnicos no assunto podem ajustar a concentração de inibidor de catalase conforme o necessário. Em uma realização, a concentração do inibidor de catalase varia de cerca de 0,1 mM a cerca de 1 M; preferencialmente, cerca de 1 mM a cerca de 50 mM; de maior preferência, cerca de 1 mM a cerca de 20 mM. Em um aspecto, a concentração de azida de sódio varia tipicamente de cerca de 20 mM a cerca de 60 mM, enquanto a concentração de sulfato de hidroxilamina é tipicamente

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57/111 de cerca de 0,5 mM a cerca de 30 mM, preferencialmente cerca de 10 mM.

[0155] Em uma outra realização, o catalisador de enzima não possui atividade de catalase significativa ou é elaborado para reduzir ou eliminar a atividade de catalase. A atividade de catalase em uma célula hospedeira pode ser regulada para baixo ou eliminada por meio do rompimento da expressão do(s) gene(s) responsável(is) pela atividade de catalase, utilizando métodos bem conhecidos, que incluem, mas sem limitações, mutagênese de transposson, expressão antisense de RNA, mutagênese dirigida e mutagênese aleatória. Em uma realização preferida, o(s) gene(s) que codifica(m) a atividade de catalase endógena é(são) regulado(s) para baixo ou rompido(s) (ou seja, nocauteado(s). Da forma utilizada no presente, um gene “rompido” é aquele no qual a atividade e/ou a função da proteína codificada pelo gene modificado não está mais presente. Meios de romper um gene são bem conhecidos na técnica e podem incluir, mas sem limitações, inserções, exclusões ou mutações do gene, desde que a atividade e/ou a função da proteína correspondente não esteja(m) mais presente(s). Em uma realização preferida adicional, o hospedeiro de produção é um hospedeiro de produção de E. coli que compreende um gene catalase rompido selecionado a partir do grupo que consiste de katG e katE. Em uma outra realização, o hospedeiro de produção é uma linhagem de E. coli que compreende uma regulagem para baixo e/ou rompimento nos genes de catalase katG e katE. Uma linhagem de E. coli que compreende um knockout duplo de katG e katE é descrita no presente como linhagem KLP18 de E. coli (vide o Pedido de Patente NorteAmericano publicado NO 2008/0176299).

[0156] A concentração do catalisador na formulação de reação aquosa depende da atividade catalítica específica do catalisador e é selecionada para obter a velocidade de reação desejada. O peso do catalisador nas reações de per-hidrólise tipicamente varia de 0,0001 mg a 10 mg por ml do

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58/111 volume total de reação, preferencialmente de 0,001 mg a 2,0 mg/ml. O catalisador pode também ser imobilizado sobre um suporte solúvel ou insolúvel utilizando métodos bem conhecidos dos técnicos no assunto; vide, por exemplo, Immobilization of Enzymes and Cells, Gordon, F. Bickerstaff, Editor; Humana Press, Totowa, NJ, Estados Unidos; 1997. O uso de catalisadores imobilizados permite a recuperação e a reutilização do catalisador em reações subsequentes. O catalisador de enzimas pode apresentar-se na forma de células microbianas inteiras, células microbianas permeabilizadas, extratos de células microbianas, enzimas purificadas ou parcialmente purificadas e suas misturas.

[0157] Em um aspecto, a concentração de ácido peroxicarboxílico gerada pela combinação de per-hidrólise química e per-hidrólise enzimática do éster de ácido carboxílico é suficiente para fornecer uma concentração eficaz de ácido peroxicarboxílico para desinfecção, branqueamento, sanitização, desodorização ou retirada de manchas sob pH desejado. Em um outro aspecto, os métodos do presente fornecem combinações de enzimas e substratos de enzimas para produzir a concentração efetiva desejada de ácido peroxicarboxílico, em que, na ausência de enzima adicionada, existe uma concentração significativamente mais baixa de ácido peroxicarboxílico produzido. Embora possa haver, em alguns casos, per-hidrólise química substancial do substrato de enzima por meio de reação química direta de peróxido inorgânico com o substrato de enzima, pode não haver concentração suficiente de ácido peroxicarboxílico gerado para fornecer uma concentração eficaz de ácido peroxicarboxílico nas aplicações desejadas e atinge-se aumento significativo da concentração total de ácido peroxicarboxílico por meio da adição de um catalisador de per-hidrolase apropriado à formulação de reação.

[0158] A concentração de ácido peroxicarboxílico gerada (tal

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59/111 como ácido peracético) por meio da per-hidrólise de pelo menos um éster de ácido carboxílico é de pelo menos cerca de 20 ppm, preferencialmente pelo menos 100 ppm, de maior preferência pelo menos cerca de 200 ppm de ácido peroxicarboxílico, de maior preferência pelo menos 300 ppm, de maior preferência pelo menos 500 ppm, de maior preferência pelo menos 700 ppm, de maior preferência pelo menos cerca de 1000 ppm de ácido peroxicarboxílico, de maior preferência pelo menos 2000 ppm, de preferência ainda maior pelo menos 3000 ppm e, de preferência superior, pelo menos cerca de 4000 ppm de ácido peroxicarboxílico em até dez minutos, preferencialmente até cinco minutos e, de preferência superior, em até um minuto após o início da reação de per-hidrólise (ou seja, tempo medido a partir da combinação dos componentes de reação para formar a formulação de reação). A formulação de produto que compreende o ácido peroxicarboxílico pode ser opcionalmente diluída com água ou uma solução predominantemente composta de água, para produzir uma formulação com a concentração mais baixa desejada de ácido peroxicarboxílico. Em um aspecto, o tempo de reação necessário para a produção da concentração desejada de ácido peroxicarboxílico é de não mais de cerca de duas horas, preferencialmente não mais de cerca de trinta minutos, de maior preferência não mais de cerca de dez minutos e, de preferência superior, cerca de cinco minutos ou menos. Uma superfície dura ou um objeto inanimado contaminado com uma concentração de contaminante(s) biológico(s) é colocado em contato com o ácido peroxicarboxílico formado de acordo com os processos descritos no presente. Em uma realização, a superfície dura ou o objeto inanimado é colocado em contato com o ácido peroxicarboxílico formado de acordo com os processos descritos em até cerca de cinco minutos a cerca de 168 horas após a combinação dos mencionados componentes de reação ou em até cerca de cinco minutos a cerca de 48 horas, ou até cerca de cinco minutos a duas horas

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60/111 após a combinação dos mencionados componentes de reação, ou qualquer intervalo de tempo nessa faixa.

[0159] Em um outro aspecto, o ácido peroxicarboxílico formado de acordo com os processos descritos no presente é utilizado em uma aplicação de cuidado de lavanderia, em que o ácido peroxicarboxílico é colocado em contato com um tecido para fornecer um benefício, tal como desinfecção, branqueamento, retirada de manchas, desodorização e/ou uma de suas combinações. O ácido peroxicarboxílico pode ser utilizado em uma série de produtos de cuidados de lavanderia, incluindo, mas sem limitações, tratamentos pré-lavagem de tecidos, detergentes de lavanderia, removedores de manchas, composições branqueadoras, composições desodorantes e agentes enxaguantes. Em uma realização, o presente processo de produção de um ácido peroxicarboxílico para uma superfície alvo é conduzido in situ.

[0160] No contexto de aplicações de cuidados de lavanderia, a expressão “contato de um artigo de vestuário ou tecido” indica que o artigo de vestuário ou tecido é exposto a uma formulação descrita no presente. Com este propósito, existem diversos formatos que em que a formulação pode ser utilizada para o tratamento de artigos de vestuário ou tecidos, incluindo, mas sem limitações, líquidos, sólidos, gel, pasta, barras, pastilhas, spray, espuma, pó ou grânulos, e podem ser fornecidos por meio de dosagem manual, dosagem unitária, dosagem de um substrato, pulverização e dosagem automática de uma máquina de lavar ou secar de lavanderia. Composições granulares podem também apresentar-se em forma compacta; composições líquidas podem também apresentar-se em forma concentrada.

[0161] Quando as formulações descritas no presente forem utilizadas em uma máquina de lavar, a formulação pode conter adicionalmente componentes típicos de detergentes de lavagem. Componentes típicos incluíram, por exemplo, mas sem limitações, tensoativos, agentes

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61/111 branqueadores, ativadores de branqueamento, enzimas adicionais, supressores de espuma, dispersantes, dispersantes de sabão calcário, agentes antirredeposição e de suspensão de sujeira, agentes amolecedores, inibidores da corrosão, inibidores de embaçamento, germicidas, agentes de ajuste do pH, fontes de alcalinidade não cumulativas, agentes quelantes, cargas orgânicas e/ou inorgânicas, solventes, hidrotropos, clareadores óticos, tinturas e perfumes.

[0162] As formulações descritas no presente podem também ser utilizadas como produtos aditivos de detergente em forma sólida ou líquida. Esses produtos aditivos destinam-se a suplementar ou amplificar o desempenho de composições de detergente convencionais e podem ser adicionados em qualquer estágio do processo de limpeza.

[0163] Com relação aos sistemas e métodos de cuidados de lavanderia do presente, em que o perácido é gerado para um ou mais dentre branqueamento, remoção de manchas e redução de odores, a concentração de perácido gerada (tal como ácido peracético) por meio da per-hidrólise de pelo menos um éster de ácido carboxílico pode ser de pelo menos cerca de 2 ppm, preferencialmente pelo menos 20 ppm, preferencialmente pelo menos 100 ppm e, de maior preferência, pelo menos cerca de 200 ppm de perácido. Com relação aos sistemas e métodos de cuidados de lavagem do presente, em que o perácido é gerado para desinfecção ou sanitização, a concentração de perácido gerada (tal como ácido peracético) por meio da per-hidrólise de pelo menos um éster de ácido carboxílico pode ser de pelo menos cerca de 2 ppm, preferencialmente pelo menos 20 ppm, de maior preferência pelo menos 200 ppm de ácido peroxicarboxílico, de maior preferência pelo menos 500 ppm, de maior preferência pelo menos 700 ppm, de maior preferência pelo menos cerca de 1000 ppm de perácido, de preferência superior pelo menos 2000 ppm de perácido em até dez minutos, preferencialmente até cinco minutos e, de

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62/111 preferência superior, em até um minuto após o início da reação de perhidrólise. A formulação de produto que compreende o perácido pode ser opcionalmente diluída com água ou uma solução predominantemente composta de água, para produzir uma formulação com a concentração mais baixa desejada de perácido. Em um aspecto dos métodos e sistemas do presente, o tempo de reação necessário para a produção da concentração desejada de perácido é de não mais de cerca de duas horas, preferencialmente não mais de cerca de trinta minutos, de maior preferência não mais de cerca de dez minutos, de preferência ainda maior cerca de cinco minutos e, de preferência superior, cerca de um minuto ou menos.

[0164] A temperatura da reação é selecionada para controlar a velocidade de reação e a estabilidade da atividade do catalisador de enzimas. A temperatura da reação pode variar de pouco acima do ponto de congelamento da formulação de reação (cerca de 0 °C) até cerca de 95 °C, com uma faixa preferida de temperatura de reação de cerca de 5 °C a cerca de 55 °C.

[0165] O pH da formulação de reação final que contém ácido peroxicarboxílico pode variar de cerca de 2 a cerca de 9, preferencialmente cerca de 3 a cerca de 8, de maior preferência cerca de 5 a cerca de 8, de preferência ainda maior cerca de 6 a cerca de 8 e, de preferência ainda maior, cerca de 6,5 a cerca de 7,5. Em uma outra realização, o pH da formulação de reação pode ser ácido (pH < 7). O pH da reação e da formulação de reação final pode ser opcionalmente controlado por meio da adição de um tampão apropriado, incluindo, mas sem limitações, fosfato, pirofosfato, metilfosfonato, bicarbonato, acetato ou citrato e suas combinações. A concentração de tampão, quando empregado, é tipicamente de 0,1 mM a 1,0 M, preferencialmente de 1 mM a 300 mM, de preferência superior de 10 mM a 100 mM.

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63/111 [0166] Em um outro aspecto, a formulação de reação de perhidrólise enzimática pode conter um solvente orgânico que age como dispersante para aumentar a velocidade de dissolução do éster de ácido carboxílico na formulação de reação. Esses solventes incluem, mas sem limitações, metil éter de propileno glicol, acetona, ciclo-hexanona, butil éter de dietileno glicol, metil éter de tripropileno glicol, metil éter de dietileno glicol, butil éter de propileno glicol, metil éter de dipropileno glicol, ciclo-hexanol, álcool benzílico, isopropanol, etanol, propileno glicol e suas misturas.

[0167] Em um outro aspecto, o produto de per-hidrólise enzimática pode conter componentes adicionais que fornecem funcionalidade desejável. Esses componentes adicionais incluem, mas sem limitações, tampões, acumuladores de detergente, agentes espessantes, emulsificantes, tensoativos, agentes umectantes, inibidores da corrosão (tais como benzotriazol), estabilizantes de enzimas e estabilizantes de peróxido (tais como agentes quelantes de íons metálicos). Muitos dos componentes adicionais são bem conhecidos na indústria de detergentes (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana NO 5.932.532, incorporada ao presente como referência). Exemplos de emulsificantes incluem, mas sem limitações, álcool polivinílico ou polivinilpirrolidona. Exemplos de agentes espessantes incluem, mas sem limitações, LAPONITE® RD, amido de milho, PVP, CARBOWAX®, CARBOPOL^®, CABOSIL^®, polissorbato 20, PVA e lecitina. Exemplos de sistemas tampão incluem, mas sem limitações, fosfato de sódio monobásico e fosfato de sódio dibásico; ácido sulfâmico e trietanolamina; ácido cítrico e trietanolamina; ácido tartárico e trietanolamina; ácido succínico e trietanolamina; e ácido acético e trietanolamina. Exemplos de tensoativos incluem, mas sem limitações a) tensoativos não iônicos tais como copolímeros de bloco de óxido de etileno ou óxido de propileno, álcoois primários e secundários lineares e ramificados etoxilados ou propoxilados e óxidos de

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64/111 fosfina alifáticos; b) tensoativos catiônicos tais como compostos de amônio quaternário, particularmente compostos de amônio quartenário que contêm um grupo alquila C8-C20 ligado a um átomo de nitrogênio adicionalmente ligado a três grupos alquila C1-C2; c) tensoativos aniônicos tais como ácidos alcano carboxílicos (tais como ácidos graxos C8-C20), fosfonatos de alquila, sulfonatos de alcano (tais como dodecilsulfato de sódio, “SDS”) ou sulfonatos de alquil benzeno lineares ou ramificados, sulfonatos de alqueno; e d) tensoativos anfotéricos e zwitteriônicos tais como ácidos aminocarboxílicos, ácidos aminodicarboxílicos, alquilbetaínas e suas misturas. Componentes adicionais podem incluir fragrâncias, tinturas, estabilizantes de peróxido de hidrogênio (tais como quelantes metálicos como ácido 1-hidroxietilideno-1,1-difosfônico (DEQUEST® 2010, Solutia Inc., St. Louis MO e ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA)), TURPINAL® SL (CAS NO 2809-21-4), DEQUEST® 0520, DEQUEST® 0531, estabilizantes da atividade enzimática (tais como polietileno glicol (PEG)) e acumuladores de detergente.

Produção In Situ De Ácidos Peroxicarboxílicos Utilizando Um Catalisador

De Per-Hidrolase [0168] Desacetilases de cefalosporina C (E. C. 3.1.1.41; cefalosporina c acetil-hidrolases sistemáticas; CAHs) são enzimas que possuem a capacidade de hidrolisar a ligação de acetil éster sobre cefalosporinas tais como cefalosporina C, ácido 7-aminocefalosporânico e ácido 7-(tiofeno-2-acetamido)cefalosporânico (Abbott, B. e Fukuda, D., Appl. Microbiol. 30 (3): 413-419 (1975)). CAHs pertencem a uma família maior de enzimas estruturalmente relacionadas denominadas família de carboidrato esterases sete (“CE-7”; vide Coutinho, P. M., Henrissat, B., acima). Da forma utilizada no presente, as expressões CE-7, esterase CE-7, carboidrato esterase CE-7, per-hidrolase CE-7 e enzima CE-7 serão utilizadas de forma intercambiável para designar uma enzima classificada estruturalmente

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65/111 como membro da família de carboidrato esterases 7.

[0169] Os membros da família de enzimas CE-7 podem ser encontrados em plantas, fungos (tais como Cephalosporidium acremonium), leveduras (tais como Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis) e bactérias tais como Thermoanaerobacterium sp.; Norcardia lactamdurans e vários membros do gênero Bacillus (Politino et al, Appl. Environ. Microbiol., 63 (12): 4807-4811 (1997); Sakai et al, J. Ferment. Bioeng. 85: 53-57 (1998); Lorenz, W. e Wiegel, J., J. Bacteriol. 179: 5436-5441 (1997); Cardoza et al, Appl. Microbiol. Biotechnol., 54 (3): 406-412 (2000); Mitsushima et al, (1995), Appl. Env. Microbiol. 61 (6): 2224-2229; Abbott, B. e Fukuda, D., Appl. Microbiol. 30 (3): 413-419 (1975); Vincent et al, acima, Takami et al, NAR, 28 (21): 4317-4331 (2000); Rey et al, Genome Biol., 5 (10): artigo 77 (2004); Degrassi et al, Microbiology, 146: 1585-1591 (2000); Patente Norte-Americana NO 6.645.233; Patente Norte-Americana NO 5.281.525; Patente NorteAmericana NO 5.338.676; e WO 99/03984. WO2007/070609 e Pedidos de Patente Norte-Americanos publicados NO 2008/0176299, 2008/176783 e 2009/0005590 de DiCosimo et al descrevem diversas enzimas classificadas estruturalmente como enzimas CE-7 que possuem atividade de per-hidrólise apropriada para a produção de concentrações eficazes de ácidos peroxicarboxílicos a partir de uma série de substratos de éster de ácido carboxílico quando combinadas com uma fonte de peroxigênio.

[0170] A família de CE-7 inclui CAHs e acetil xilano esterases (AXEs; E. C. 3.1.1.72). Os membros da família CE-7 compartilham um motivo estrutural comum e exibem tipicamente atividade de hidrólise de éster para xilooligossacarídeos acetilados e cefalosporina C, o que sugere que a família CE-7 representa uma única classe de proteínas com atividade de desacetilase multifuncional contra uma série de substratos pequenos (Vincent et al, acima).

[0171] Vincent et al analisam a similaridade estrutural entre os

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66/111 membros dessa família e definem o motivo de assinatura característico da família CE-7. O motivo de assinatura é uma combinação de pelo menos três motivos altamente conservados conforme ilustrado abaixo. Toda a numeração de sequências refere-se à numeração de uma sequência de referência (neste caso, a per-hidrolase de Thermotoga neapolitana do tipo selvagem; SEQ ID NO 32).

[0172] Segundo a numeração de resíduos de aminoácidos da sequência de referência SEQ ID NO 32, o motivo de assinatura CE-7 compreende três motivos conservados definidos como:

a. Arg118-Gly119-Gln120;

b. Gly186-Xaa187-Ser188-Gln189-Gly190; e

c. His303-Glu304.

[0173] Tipicamente, o Xaa na posição de resíduo de aminoácido 180 é glicina, alanina, prolina, triptofano ou treonina. Dois dos três resíduos de aminoácidos pertencentes à tríade catalítica encontram-se em negrito. Em uma realização, o Xaa na posição 187 de resíduo de aminoácido é selecionado a partir do grupo que consiste de glicina, alanina, prolina, triptofano e treonina.

[0174] Análise adicional dos motivos conservados na família de carboidrato esterases CE-7 indica a presença de um motivo conservado adicional (LXD nas posições de aminoácidos 272 a 274 de SEQ ID NO 32) que pode servir para definir adicionalmente uma per-hidrolase pertencente à família de carboidrato esterases CE-7 (Figuras 1 e 2). Em uma realização adicional, o motivo de assinatura definido acima inclui um quarto motivo conservado, definido como:

Leu272-Xaa273-Asp274.

[0175] O Xaa na posição de resíduo de aminoácido 273 é tipicamente isoleucina, valina ou metionina. O quarto motivo inclui o resíduo de ácido aspártico (negrito) que é o terceiro membro da tríade catalítica (Ser188Petição 870180025150, de 28/03/2018, pág. 77/125

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Asp274-His303).

[0176] Qualquer número de algoritmos de alinhamento global bem conhecidos (ou seja, software de análise de sequências) pode ser utilizado para alinhar duas ou mais sequências de aminoácidos (que representam enzimas que possuem atividade de per-hidrolase) para determinar a existência do motivo de assinatura do presente (tal como CLUSTALW ou Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol., 48: 443-453 (1970)). A(s) sequência(s) alinhada(s) é(são) comparada(s) com a sequência de referência (SEQ ID NO 32). Em uma realização, utiliza-se alinhamento CLUSTAL (CLUSTALW) empregando uma sequência de aminoácidos de referência (conforme utilizado no presente, a sequência de CAH (SEQ ID NO 32) de Thermotoga neapolitana) para identificar per-hidrolases pertencentes à família de esterases CE-7. A numeração relativa dos resíduos de aminoácidos conservados baseia-se na numeração de resíduos da sequência de aminoácidos de referência para compensar pequenas inserções ou exclusões (tipicamente cinco a seis aminoácidos ou menos) dentro da sequência alinhada conforme ilustrado na Tabela A.

Tabela A

Motivos Conservados Encontrados no Interior de Enzimas CE-7 que

Possuem Atividade de Per-Hidrolase

Sequência de per-hidrolase	Motivo RGQ^a(Resíduo NO)	Motivo GXSQG^a(Resíduo NO)	Motivo LXD^b(Resíduo NO)	Motivo HE^a(Resíduo NO)
SEQ ID NO 32	118-120	186-190	272-274	303-304
SEQ ID NO 36	118-120	186-190	272-274	303-304
SEQ ID NO 202	118-120	186-190	272-274	303-304
SEQ ID NO 203	118-120	186-190	272-274	303-304
SEQ ID NO 204	118-120	186-190	272-274	303-304
SEQ ID NO 205	119-121	187-191	273-275	304-305
a	Motivos conservados definidos	por Vincent et al, acima,
utilizados para definir o motivo de assinatura;
^b 1	otivo adicional que pode ser útil na definição	adicional do

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68/111 motivo de assinatura definido por Vincent et al, acima.

[0177] Cada uma das variantes CE-7 do presente que possuem atividade per-hidrolítica foi derivada de uma das sequências de per-hidolase do tipo selvagem na Tabela A. Cada uma das variações do presente mantém o motivo de assinatura CE-7 (ou seja, alterações introduzidas na sequência de tipo selvagem não incluem alterações dos motivos conservados fornecidos na Tabela A). Mais especificamente, as per-hidrolases do presente que possuem atividade aprimorada contêm uma substituição do resíduo de aminoácido 277, em que a cisteína do tipo selvagem é substituída por serina, treonina, valina ou alanina (de acordo com a numeração de SEQ ID NO 32, 36, 202, 203 e 204). A mesma substituição ocorre no resíduo de aminoácido 278 em SEQ ID NO 205 (ou seja, SEQ ID NO 205 contém uma única inserção de aminoácido que altera a numeração de resíduos relativa em 1).

[0178] Cada uma das variantes do presente compreende um aumento da atividade específica de per-hidrolase (U/mg de proteína), atividade volumétrica da enzima (U/ml) em uma mistura de reação e/ou aumento da razão entre a atividade de per-hidrólise e a atividade de hidrólise (ou seja, a “razão P/H”). Em uma realização, o aumento da atividade é medido como aumento de dobra da atividade (atividade específica de per-hidrolase (U/mg de proteína), atividade volumétrica de per-hidrólise (U/ml) em uma mistura de reação e/ou a razão P/H) com relação à sequência do tipo selvagem da qual foi derivada. Em uma outra realização, o aumento de dobra da atividade enzimática (atividade específica de per-hidrólise, atividade volumétrica de perhidrólise e/ou aumento da razão P/H) para uma enzima CE-7 variante que possui identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 95% com SEQ ID NO 5 é relativo à atividade medida para SEQ ID NO 32; o aumento de dobra da atividade de uma enzima CE-7 variante que possui identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 95% com SEQ ID NO 10 é relativo à atividade

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69/111 medida para SEQ ID NO 36; o aumento de dobra da atividade de uma enzima CE-7 variante que possui identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 95% com SEQ ID NO 15 é relativo à atividade medida para SEQ ID NO 202; o aumento de dobra da atividade de uma enzima CE-7 variante que possui identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 95% com SEQ ID NO 20 é relativo à atividade medida para SEQ ID NO 203; o aumento de dobra da atividade de uma enzima CE-7 variante que possui identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 95% com SEQ ID NO 25 é relativo à atividade medida para SEQ ID NO 204; e o aumento de dobra da atividade de uma enzima CE-7 variante que possui identidade de sequência de aminoácidos de pelo menos 95% com SEQ ID NO 30 é relativo à atividade medida para SEQ ID NO 205.

[0179] Em uma realização, o aumento de dobra da atividade específica de per-hidrolase para as variantes do presente é de pelo menos 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10, 11, 12 ou 13 vezes em comparação com a atividade da sequência do tipo selvagem sob condições substancialmente similares.

[0180] Em uma outra realização, o aumento de dobra da razão P/H das variantes do presente é de pelo menos 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 ou 10 vezes em comparação com a razão P/H da sequência do tipo selvagem sob condições substancialmente similares.

[0181] O método do presente produz concentrações eficazes e úteis na indústria de ácidos peroxicarboxílicos sob condições de reação aquosa utilizando a atividade de per-hidrolase de uma enzima variante pertencente à família CE-7 de carboidrato esterases. Em uma realização, o método do presente produz concentrações eficazes de um ou mais ácidos peroxicarboxílicos in situ.

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Método De Teste Hplc Para Determinação Da Concentração De Perácido

E Peróxido De Hidrogênio [0182] Diversos métodos analíticos podem ser utilizados no presente método para analisar os reagentes e produtos, incluindo, mas sem limitações, titulação, cromatografia de líquidos de alto desempenho (HPLC), cromatografia de gases (GC), espectroscopia de massa (MS), eletroforese capilar (CE), o procedimento analítico descrito por U. Karst et al (Anal. Chem., 69 (17): 3623-3627 (1997)) e o teste de 2,2’-azinobis (3-etilbenzotazolino)-6sulfonato (ABTS) (S. Minning et al, Analytica Chimica Acta 378: 293-298 (1999) e WO 2004/058961 A1) conforme descrito nos exemplos do presente.

Determinação Da Concentração Biocida Mínima De Perácidos [0183] O método descrito por J. Gabrielson et al (J. Microbiol. Methods 50: 63-73 (2002)) pode ser empregado para determinação da Concentração Biocida Mínima (MBC) de perácidos ou de peróxido de hidrogênio e substratos de enzimas. O método de teste é baseado na inibição da redução de XTT, em que XTT (sal monossódico, sal interno de (2,3-bis[2metóxi-4-nitro-5-sulfofenil]-5-[(fenilamino)carbonil]-2H-tetrazólio)) é uma tintura redox que indica atividade respiratória microbiana por meio de alteração da densidade ótica (OD) medida a 490 nm ou 450 nm. Existem, entretanto, diversos outros métodos disponíveis para teste da atividade de desinfetantes e antissépticos, incluindo, mas sem limitações, contagens de placas viáveis, contagens microscópicas diretas, peso seco, medições de turvação, absorção e bioluminescência (vide, por exemplo, Brock, Semour S., Disinfection, Sterilization and Preservation, quinta edição, Lippincott Williams & Wilkins, Filadélfia PA, Estados Unidos; 2001).

Usos De Composições De ácido Peroxicarboxílico Preparadas

Enzimaticamente [0184] O ácido peroxicarboxílico gerado por catalisador de

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71/111 enzimas produzido de acordo com o presente método pode ser utilizado em uma série de aplicações de objetos inanimados e superfícies duras para redução de concentrações de contaminantes biológicos, tais como descontaminação de instrumentos médicos (por exemplo, endoscópios), tecidos (tais como vestimentas e tapetes), superfícies de penetração de alimentos, equipamento de armazenagem de alimentos e embalagem de alimentos, materiais utilizados para embalagem de produtos alimentícios, instalações de criação e abate de galinhas, cercados para animais e águas efluentes de processos que posuam atividade microbicida e/ou virucida. Os ácidos peroxicarboxílicos gerados por enzimas podem ser utilizados em formulações projetadas para desativar príons (tais como certas proteases) para fornecer adicionalmente atividade biocida. Em um aspecto preferido, as composições de ácido peroxicarboxílico do presente são particularmente úteis como agente desinfetante para instrumentos médicos não autodivisíveis e equipamento de embalagem de alimentos. Como a formulação que contém ácido peroxicarboxílico pode ser preparada utilizando GRAS ou componentes em grau alimentício (enzima, substrato de enzima, peróxido de hidrogênio e tampão), o perácido gerado por enzimas pode também ser utilizado para descontaminação de carcaças de animais, carne, frutas e legumes, ou para a descontaminação de alimentos preparados. O ácido peroxicarboxílico gerado por enzimas pode ser incorporado em um produto cuja forma final é um pó, líquido, gel, filme, sólido ou aerossol. O ácido peroxicarboxílico gerado por enzimas pode ser diluído até uma concentração que ainda forneça descontaminação eficaz.

[0185] As composições que compreendem uma concentração eficaz de ácido peroxicarboxílico podem ser utilizadas para desinfetar superfícies e/ou objetos contaminados (ou suspeitos de estarem contaminados) com contaminantes biológicos por meio de contato da superfície ou objeto com

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72/111 os produtos elaborados por meio dos processos do presente. Da forma utilizada no presente, “contato” designa a colocação de uma composição desinfetante que compreende uma concentração eficaz de ácido peroxicarboxílico em contato com a superfície ou objeto inanimado suspeito de contaminação com uma entidade causadora de doença por um período de tempo suficiente para limpeza e desinfecção. O contato inclui a pulverização, tratamento, imersão, fluxo, despejamento sobre ou em, mistura, combinação, pintura, revestimento, aplicação, afixação e comunicação de outra forma de uma solução de ácido peroxicarboxílico ou composição que compreende uma concentração eficaz de ácido peroxicarboxílico, ou uma solução ou composição que forma uma concentração eficaz de ácido peroxicarboxílico, com a superfície ou o objeto inanimado suspeito de estar contaminado com uma concentração de contaminante biológico. As composições desinfetantes podem ser combinadas com uma composição de limpeza para fornecer limpeza e desinfecção. Alternativamente, um agente de limpeza (tal como um tensoativo ou detergente) pode ser incorporado à formulação para fornecer limpeza e desinfecção em uma única composição.

[0186] As composições que compreendem uma quantidade eficaz de ácido peroxicarboxílico podem também conter pelo menos um agente antimicrobiano adicional, combinações de proteases degradadoras de príons, um virucida, um esporicida ou um biocida. Combinações desses agentes com o ácido peroxicarboxílico produzido por meio dos processos reivindicados podem fornecer efeitos mais altos e/ou sinérgicos quando utilizados para serviços de limpeza e desinfecção e/ou objetos contaminados (ou suspeitos de serem contaminados) com contaminantes biológicos, tais como micro-organismos, esporos, vírus, fungos e/ou príons. Agentes antimicrobianos apropriados incluem ésteres carboxílicos (tais como benzoatos de p-hidróxi alquila e cinamatos de alquila); ácidos sulfônicos (tais como ácido dodecilbenzeno

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73/111 sulfônico); compostos de iodo ou compostos de halogênio ativo (tais como halogênios elementares, óxidos de halogênio (como NaOCl, HOCl, HOBr, ClO2), iodo, inter-haletos (tais como monocloreto de iodo, dicloreto de iodo, tricloreto de iodo, tetracloreto de iodo, cloreto de bromo, monobrometo de iodo ou dibrometo de iodo); póli-haletos; sais de hipoclorito; ácido hipocloroso; sais de hipobromito; ácido hipobromoso; cloro e bromo-hidantoínas; dióxido de cloro; e clorito de sódio); peróxidos orgânicos que incluem peróxido de benzoíla, peróxidos de alquil benzoíla, ozônio, geradores de oxigênio isolados e suas misturas, derivados fenólicos (tais como o-fenil fenol, o-benzil-pclorofenol, ferc-amil fenol e hidróxi benzoatos de alquila C1-C6), compostos de amônio quaternário (tais como cloreto de alquildimetilbenzil amônio, cloreto de dialquildimetil amônio e suas misturas); e misturas desses agentes antimicrobianos, em quantidade suficiente para fornecer o grau desejado de proteção microbiana. Quantidades eficazes de agentes antimicrobianos incluem cerca de 0,001% em peso a cerca de 60% em peso de agente antimicrobiano, cerca de 0,01% em peso a cerca de 15% em peso de agente antimicrobiano ou cerca de 0,08% em peso a cerca de 2,5% em peso de agente antimicrobiano.

[0187] Em um aspecto, os ácidos peroxicarboxílicos formados por meio do processo do presente podem ser utilizados para reduzir a concentração de contaminantes biológicos viáveis (tais como uma população microbiana viável) quando aplicados sobre e/ou em um local. Da forma utilizada no presente, um “local” compreende, no todo ou em parte, uma superfície alvo apropriada para desinfecção ou branqueamento. As superfícies alvo incluem todas as superfícies que podem ser potencialmente contaminadas com contaminantes biológicos. Exemplos não limitadores incluem superfícies de equipamento encontradas na indústria de alimentos ou bebidas (tais como tanques, condutores, pisos, drenos, resfriadores, congeladores, superfícies de

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74/111 equipamentos, paredes, válvulas, correias, canos, drenos, juntas, frestas, suas combinações e similares); superfícies de construções (tais como paredes, pisos e janelas); canos e drenos não relacionados com a indústria alimentícia, incluindo instalações de tratamento de água, piscinas e spas, e tanques de fermentação; superfícies veterinárias ou de hospitais (tais como paredes, pisos, leitos, equipamento (tal como endoscópios), vestimentas de uso em hospitais/veterinários e outros ambientes de cuidado com a saúde, incluindo roupas, escovas, sapatos e outras superfícies de hospital ou veterinárias); superfícies de restaurantes; superfícies de banheiros; toaletes, roupas e sapatos; superfícies de celeiros ou estábulos para animais de criação, tais como aves, bois, vacas, gansos, cavalos e porcos; abatedouros para aves ou camarões; e superfícies farmacêuticas ou biofamracêuticas (tais como equipamento de fabricação de produtos farmacêuticos ou biofarmacêuticos, ingredientes farmacêuticos ou biofarmacêuticos, excipientes farmacêuticos ou biofarmacêuticos). Superfícies duras adicionais também incluem produtos alimentícios, tais como carne de boi, aves, porco, legumes, frutas, frutos do mar, suas combinações e similares. O local pode também incluir materiais absorventes de água tais como forros infectados ou outros tecidos. O local também inclui plantas colhidas ou produtos vegetais, incluindo sementes, caules subterrâneos, tubérculos, frutos, legumes, plantas em cultivo, especialmente plantas de cultivo de safras, incluindo cereais, legumes folhosos e safras de salada, legumes de raiz, legumes, frutas em bagas, frutas cítricas e drupas.

[0188] Exemplos não limitadores de materiais de superfície dura são metais (tais como aço, aço inoxidável, cromo, titânio, ferro, cobre, latão, alumínio e suas ligas), minerais (tais como concreto), polímeros e plásticos (tais como poliolefinas, como polietileno, polipropileno, poliestireno, póli(meta)acrilato, poliacrilonitrila, polibutadieno, póli(acrilonitrila, butadieno,

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75/111 estireno), póli(acrilonitrila, butadieno), acrilonitrila butadieno; poliésteres tais como tereftalato de polietileno; e poliamidas tais como nylon). Superfícies adicionais incluem tijolos, telhas, cerâmica, porcelana, madeira, vinil, linóleo e tapete.

[0189] Os ácidos peroxicarboxílicos formados por meio do processo do presente podem ser utilizados para fornecer um benefício a um artigo de vestuário ou tecido, incluindo, mas sem limitações, desinfecção, sanitização, branqueamento, retirada de manchas e desodorização. Os ácidos peroxicarboxílicos formados por meio do presente processo podem ser utilizados em qualquer número de produtos de cuidados de lavanderia, incluindo, mas sem limitações, tratamentos prélavagem de tecidos, detergentes de lavanderia, removedores de manchas, composições branqueadoras, composições desodorantes e agentes enxaguantes.

Expressão Microbiana Recombinante [0190] Os genes e produtos genéticos das sequências do presente podem ser produzidos em células hospedeiras heterólogas, particularmente nas células de hospedeiros microbianos. As células hospedeiras heterólogas preferidas para expressão dos genes e moléculas de ácido nucleico do presente são hospedeiros microbianos que podem ser encontrados dentro das famílias fúngicas ou bacterianas e que crescem ao longo de uma ampla série de temperaturas, valores de pH e tolerâncias a solventes. Contempla-se, por exemplo, que qualquer um dentre bactérias, leveduras e fungos filamentosos possa hospedar adequadamente a expressão das moléculas de ácido nucleico do presente. A per-hidrolase pode ser expressa de forma intracelular, extracelular ou uma combinação de ambas, intracelular e extracelular, em que a expressão extracelular torna a recuperação da proteína desejada de um produto de fermentação mais fácil

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76/111 que os métodos de recuperação de proteína produzidos por meio de expressão intracelular. A transcrição, tradução e o aparelho biossintético de proteínas permanecem invariáveis com relação ao estoque de alimentação celular utilizado para gerar biomassa celular; os genes funcionais são expressos de forma independente. Exemplos de linhagens hospedeiras incluem, mas sem limitações, espécies bacterianas, fúngicas ou de levedura, tais como Aspergillus, Trichoderma, Saccharomyces, Pichia, Phaffia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Yarrowia, Salmonella, Bacillus, Acinetobacter, Zymomonas, Agrobacterium, Erythrobacter, Chlorobium, Chromatium, Flavobacterium, Cytophaga, Rhodobacter, Rhodococcus, Streptomyces, Brevibacterium, Corynebacteria, Mycobacterium, Deinococcus, Escherichia, Erwinia, Pantoea, Pseudomonas, Sphingomonas, Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylosinus, Methylomicrobium, Methylocystis, Alcaligenes, Synechocystis, Synechococcus, Anabaena, Thiobacillus, Methanobacterium, Klebsiella e Myxococcus. Em uma realização, linhagens hospedeiras bacterianas incluem Escherichia, Bacillus, Kluyveromyces e Pseudomonas. Em uma realização preferida, a célula hospedeira bacteriana é Escherichia coli.

[0191] O crescimento microbiano em larga escala e a expressão de genes funcionais podem utilizar uma ampla variedade de carbo-hidratos simples ou complexos, ácido orgânicos e álcoois ou hidrocarbonetos saturados, tais como metano ou dióxido de carbono no caso de hospedeiros fotossintéticos ou quimioautotróficos, a forma e a quantidade de nitrogênio, fósforo, enxofre, oxigênio, carbono ou qualquer micronutriente de traço, incluindo pequenos íons inorgânicos. A regulagem da velocidade de crescimento pode ser afetada pela adição, ou não, de moléculas reguladoras específicas ao cultivo e que tipicamente não são consideradas fontes de energia ou nutrientes.

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77/111 [0192] Vetores ou conjuntos úteis para a transformação de células hospedeiras apropriadas são bem conhecidos na técnica. Tipicamente, o vetor ou conjunto contém sequências que dirigem a transcrição e a tradução do gene relevante, um marcador selecionável e sequências que permitem a reprodução autônoma ou integração cromossômica. Vetores apropriados compreendem uma região 5' do gene que abriga controles de início de transcrição e uma região 3' do fragmento de DNA que controla o término de transcrição. É de preferência superior quando as duas regiões de controle são derivadas de genes homólogos à célula hospedeira transformada e/ou nativa do hospedeiro de produção, embora essas regiões de controle não necessitem ser derivadas deles.

[0193] Promotores ou regiões de controle de início, que são úteis para dirigir a expressão da região de codificação de cefalosporina C desacetilase do presente na célula hospedeira desejada, são numerosas e familiares dos técnicos no assunto. Virtualmente qualquer promotor capaz de dirigir esses genes é apropriado para a presente invenção, incluindo, mas sem limitações, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (útil para expressão em Saccharomyces); AOX1 (útil para expressão em Pichia); e lac, araB, tet, trp, IPl, IPr, T7, tac e trc (útil para expressão em Escherichia coli) bem como os promotores amy, apr, npr e diversos promotores de fagos úteis para expressão em Bacillus.

[0194] As regiões de controle de término podem também ser derivadas de diversos genes nativos da célula hospedeira preferida. Em uma realização, a inclusão de uma região de controle de término é opcional. Em uma outra realização, o gene quimérico inclui uma região de controle de término derivada da célula hospedeira preferida.

Produção Industrial [0195] Diversas metodologias de cultivo podem ser aplicadas

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78/111 para produzir o catalisador de per-hidrolase do presente. A produção em larga escala de um produto genético específico sobre-expresso a partir de um hospedeiro microbiano recombinante pode ser realizada, por exemplo, em bateladas, bateladas alimentadas e metodologias de cultivo contínuo.

[0196] Métodos de cultivo em bateladas e bateladas alimentadas são comuns, bem conhecidos na técnica e exemplos podem ser encontrados em Thomas D. Brock em Biotechnology:_A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edição, Sinauer Associates, Inc., Sunderland MA (1989) e Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36: 227-234 (1992).

[0197] A produção comercial do catalisador de per-hidrolase desejado pode também ser realizada com um cultivo contínuo. Os cultivos contínuos são sistemas abertos em que um meio de cultivo definido é adicionado continuamente a um biorreator e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simultaneamente para processamento. Os cultivos contínuos geralmente mantêm as células em uma alta densidade de fase líquida constante em que as células encontram-se principalmente em crescimento de fase de registro. Alternativamente, o cultivo contínuo pode ser praticado com células imobilizadas, em que carbono e nutrientes são adicionados continuamente, e produtos valiosos, subprodutos ou produtos residuais são removidos continuamente da massa celular. A imobilização celular pode ser realizada utilizando uma ampla variedade de suportes sólidos compostos de materiais naturais e/ou sintéticos.

[0198] A recuperação dos catalisadores de per-hidrolase desejados de uma fermentação em bateladas, fermentação em bateladas alimentadas ou cultivo contínuo pode ser realizada por meio de qualquer um dos métodos que são conhecidos dos técnicos no assunto. Quando o catalisador de enzimas for produzido por via intracelular, por exemplo, a pasta celular é separada do meio de cultivo por meio de centrifugação ou

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79/111 filtragem de membranas, opcionalmente lavado com água ou um tampão aquoso sob pH desejado e uma suspensão da pasta celular em tampão aquoso sob pH desejado é homogeneizada em seguida para produzir um extrato celular que contém o catalisador de enzima desejado. O extrato celular pode ser opcionalmente filtrado através de um auxiliar de filtragem apropriado tal como celite ou sílica para remover fragmentos celulares antes de uma etapa de tratamento a quente para precipitar proteína indesejada da solução de catalisador de enzimas. A solução que contém o catalisador de enzimas desejado pode ser separada em seguida dos fragmentos celulares precipitados e proteína por meio de filtragem ou centrifugação de membranas e a solução de catalisador de enzimas parcialmente purificada resultante concentrada por meio de filtragem de membrana adicional, opcionalmente misturada com um excipiente apropriado (tal como maltodextrina, tre-halose, sacarose, lactose, sorbitol, manitol, tampão de fosfato, tampão de citrato ou suas misturas) e seca por pulverização para produzir um pó sólido que compreende o catalisador de enzima desejado.

[0199] Quando uma quantidade, concentração ou outro valor ou parâmetro for fornecido na forma de faixa, faixa preferida ou lista de valores preferíveis superiores e valores preferíveis inferiores, deve-se compreender que isso descreve especificamente todas as faixas formadas a partir de qualquer par de qualquer limite de faixa superior ou valor preferido e qualquer limite de faixa inferior ou valor preferido, independentemente se as faixas são descritas separadamente. Ao indicar-se uma faixa de valores numéricos no presente, a menos que indicado em contrário, a faixa destina-se a incluir as suas extremidades e todos os números inteiros e frações dentro da faixa. Não se pretende que o escopo seja limitado aos valores específicos indicados ao definir-se uma faixa.

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Métodos Gerais [0200] Os exemplos a seguir são fornecidos para demonstrar realizações preferidas. Os técnicos no assunto deverão apreciar que os métodos descritos nos exemplos a seguir representam métodos descobertos pelo inventor para bom funcionamento na prática dos métodos descritos no presente e, portanto, podem ser considerados como constituindo modos preferidos para a sua prática. Os técnicos no assunto deverão, entretanto, à luz do presente relatório descritivo, apreciar que podem ser realizadas muitas alterações nas realizações específicas que são descritas e ainda obter um resultado parecido ou similar sem abandonar o espírito e o escopo dos métodos descritos no presente.

[0201] Todos os reagentes e materiais foram obtidos por meio da DIFCO Laboratories (Detroit MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg MD), TCI America (Portland OR), Roche Diagnostics Corporation (Indianápolis IN) ou SigmaAldrich Chemical Company (St. Louis MO), a menos que especificado em contrário.

[0202] As abreviações a seguir no relatório descritivo correspondem a unidades de medida, métodos, propriedades ou compostos conforme segue: “seg” ou “s” indica segundo(s), “min” indica minuto(s), “h” indica hora(s), μΙ” indica microlitro(s), “ml” indica mililitro(s), “l” indica litro(s), “mM” indica milimolar, “M” indica molar, “mmol” indica milimol(es), “ppm” indica parte(s) por milhão, “g” indica grama(s), ‘^g” indica micrograma(s), “ng” indica nanograma(s), “g” indica gravidade, “HPLC” indica cromatografia de líquidos de alto desempenho, “dd H2O” indica água destilada e deionizada, “dcw” indica peso de células secas, “ATCC” ou “ATCC®” indica a Coleção Norte-Americana de Cultivo de Tipos (Manassas VA), “U” indica unidade(s) de atividade de perhidrolase, “rpm” indica revolução(ões) por minuto e “EDTA” indica ácido etilenodiaminotetra-acético.

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Exemplo 1

Clonagem E Expressão De Acetil Xilano Esterase De Thermotoga

Neapolitana [0203] Uma região de codificação que codifica uma acetil xilano esterase de Thermotoga neapolitana (acesso GENBANK® NO AAB70869, SEQ ID NO 32) foi sintetizada utilizando códons otimizados para expressão em E. coli (DNA 2.0, Menlo Park CA). A região de codificação foi amplificada em seguida por meio de PCR (0,5 min a 94 °C, 0,5 min a 55 °C, 1 min a 70 °C, trinta ciclos) utilizando primers identificados como SEQ ID NO 33 e SEQ ID NO 34. O produto de ácido nucleico resultante (SEQ ID NO 35) foi subclonado em pTrcHis2-TOPO® (Invitrogen, Carlsbad CA) para gerar o plasmídeo identificado como pSW196. O plasmídeo pSW196 foi utilizado para transformar E. coli KLP18 para gerar a linhagem identificada como KLP18/pSW196 (vide o Pedido de Patente Norte-Americano publicado NO 2008/0176299 de DiCosimo et al, incorporado integralmente ao presente como referência). KLP18/pSW196 foi cultivado em meios LB a 37 °C com agitação até O D 600nm = 0,4-0,5, quando foi adicionado IPTG até uma concentração final de 1 mM e a incubação prosseguiu por duas a três horas. As células foram colhidas por meio de centrifugação e realizou-se SDS-PAGE para confirmar a expressão da perhidrolase a 20-40% de proteína solúvel total.

Exemplo 2

Fermentação De Transformante Klp18 De E. Coli Que Expressa Acetil

Xilano Esterase De T. Neapolitana [0204] Foi preparado um cultivo de sementes de fermentador por meio do carregamento de um frasco de agitação de dois litros com 0,5 l de meio de semente contendo extrato de levedura (Amberex 695, 5,0 g/l), K2HPO4 (10,0 g/l), KH2PO4 (7,0 g/l), di-hidrato citrato de sódio (1,0 g/l), (NH4)2SO4 (4,0 g/l), hepta-hidrato de MgSO4 (1,0 g/l) e citrato de amônio

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82/111 férrico (0,10 g/l). O pH do meio foi ajustado em 6,8 e o meio foi sanitizado no frasco. Adições após a sanitização incluíram glicose (50% em peso, 10,0 ml) e 1 ml de solução padrão de ampicilina (25 mg/ml). O meio de semente foi inoculado com um cultivo de 1 ml de E. coli KLP18/pSW196 (Exemplo 1) em glicerol a 20% e cultivado a 35 °C e 300 rpm. O cultivo de sementes foi transferido a cerca de 1-2 OD550 para um fermentador de quatorze litros (Braun Biotech, Allentown PA) com oito litros de meio a 35 °C contendo KH2PO4 (3,50 g/l), hepta-hidrato de FeSO4 (0,05 g/l), heptahidrato de MgSO4 (2,0 g/l), di-hidrato citrato de sódio (1,90 g/l), extrato de levedura (Amberex 695, 5,0 g/l), antiespumante Biospumex 153K (0,25 ml/l, Cognis Corporation, Monheim, Alemanha), NaCl (1,0 g/l), di-hidrato de CaCl2 (10 g/l) e solução de elementos de traço NIT (10 ml/l). A solução de elementos de traço continha mono-hidrato de ácido cítrico (10 g/l), hidrato de MnSO4 (2 g/l), NaCl (2 g/l), hepta-hidrato de FeSO4 (0,5 g/l), heptahidrato de ZnSO4 (0,2 g/l), penta-hidrato de CuSO4 (0,02 g/l) e di-hidrato de NaMoO4 (0,02 g/l). Adições após a sanitização incluíram solução de glicose (50% p/p, 80,0 g) e solução padrão (16,00 ml) de ampicilina (25 mg/ml). Utilizou-se solução de glicose (50% p/p) para bateladas de alimentação. A alimentação de glicose iniciou-se quando a concentração de glicose caiu para 0,5 g/l, inicialmente a 0,31 g de alimentação por minuto e aumentando progressivamente a cada hora até 0,36, 0,42, 0,49, 0,57, 0,66, 0,77, 0,90, 1,04, 1,21, 1,41 e 1,63 g/min, respectivamente; a velocidade manteve-se constante em seguida. A concentração de glucose no meio foi monitorada e, caso a concentração excedesse 0,1 g/l, a velocidade de alimentação era reduzida ou suspensa temporariamente. A indução começou entre OD550 = 56 e OD550 = 80 com a adição de 16 ml de IPTG (0,5 M) para as diversas linhagens. A concentração de oxigênio dissolvido (DO) foi controlada em 25% da saturação de ar. O DO foi controlado em primeiro lugar pela

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83/111 velocidade de agitação do impulsor (400 a 1400 rpm) e, posteriormente, pela velocidade de aeração (2 a 10 slpm). O pH foi controlado em 6,8. Utilizou-se NH4OH (29% p/p) e H2SO4 (20% p/v) para controle do pH. A pressão superior foi de 0,5 bar. As células foram colhidas por meio de centrifugação em dezesseis horas após a adição de IPTG.

Exemplo 3

Modelagem De Acetil Xilano Esterase De Thermotoga Neapolitana [0205] Sequências de aminoácidos de acetil xilano esterases de T. neapolitana (SEQ ID NO 32) e Thermotoga maritima MSB8 (SEQ ID NO 36) foram alinhadas utilizando CLUSTALW (Figura 1). A estrutura de cristal de raio X para acetil xilano esterase de T. maritima (1VLQ) foi obtida por meio do banco de dados de proteínas (PDP) Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) (vide H. M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T. N. Bhat, H. Weissig, I. N. Shindyalov, P. E. Bourne: The Protein Data Bank, Nucleic Acids Research, 28, págs. 235-242 (2000) e H. M. Berman, K. Henrick, H. Nakamura, Announcing the Worldwide Protein Data Bank, Nature Structural Biology 10 (12), pág. 980 (2003). Todos os aminoácidos de T. maritima que diferem dos aminoácidos de T. neapolitana correspondentes foram substituídos pelo aminoácido de T. neapolitana utilizando software Accelrys DISCOVERY STUDIO® 2.0 (Protocolos>Modelagem de Proteínas>Construir Mutantes; Accelrys Software Inc., San Diego CA). Além disso, selenometioninas foram substituídas por metionina. O número de modelos selecionados para a saída foi de 3, o nível de otimização foi definido em “alto” e o método de uso DOPE foi definido como “verdadeiro”. Sobreposições e visualizações de estrutura foram realizadas utilzando PyMol® versão 0.99 (DeLano Scientific LLC, Palo Alto CA). A qualidade do modelo foi julgada com base em se a tríade catalítica (H303, S188 e D274) permaneceu na posição correta e se a estrutura geral foi mantida com relação ao modelo original.

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Exemplo 4

Identificação De Resíduos De Aminoácidos Em Acetil Xilano Esterase De

Thermotoga Neapolitana Para Mutagênese De Saturação [0206] Além da tríade catalítica canônica (H303, S188 e D274), diversos resíduos também estão presentes no local ativo de acetil xilano esterase com base no modelo. Poder-se-á esperar que a substituição de um ou mais destes resíduos por um aminoácido alternativo altere a funcionalidade da enzima. Os efeitos específicos dessas substituições, entretanto, são desconhecidos a priori. Os resíduos F213 (Phe213), I276 (Ile276), C277 (Cys277) and N93 (Asn93) de SEQ ID NO 32 foram selecionados em função da mutagênese de saturação em local. O resíduo Y92 (Tyr92) não foi selecionado devido ao alto nível de conservação desse resíduo ao longo da família CE-7.

Exemplo 5

Mutagênese De Saturação Nas Posições De Resíduos De Aminoácidos

F213, 1276, C277 Ε N93 De Acetil Xilano Esterase De Thermotoga

Neapolitana [0207] Para alterar individualmente cada um dos quatro resíduos selecionados (F213, I276, C277, N93) para cada um dos outros dezenove aminoácidos possíveis, pares de primers (Tabela 1) foram projetados com base na sequência otimizada por códons de acetil xilano esterase de T. neapolitana (SEQ ID NO 35 no plasmídeo pSW196 (vide Exemplo 1 acima e Pedido de Patente Norte-Americano publicado NO 2008/0176299)).

Tabela 1

Oligonucleotídeos Utilizados para Alterar os Resíduos de Aminoácidos

277, 276, 213 Ε 93 em T. neapolitana

	5' a 3' frontal		5' a 3' reverso
C277
TNEA C277Gf	ggacactattGGCccgccgtct	TNEA C277Gr	TAGACGGCGGGCCAATAGTGTC
(SEQ ID NO 42)	a	(SEQ ID NO 43)	C

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	5' a 3' frontal		5' a 3' reverso
TNEA C277Af	ggacactattGCGccgccgtct	TNEA C277Ar	TAGACGGCGGCGCAATAGTGTC
(SEQ ID NO 44)	a	(SEQ ID NO 45)	C
TNEA C277Vf	ggacactattGTGccgccgtct	TNEA C277Vr	TAGACGGCGGCACAATAGTGTC
(SEQ ID NO 46)	a	(SEQ ID NO 47)	C
TNEA C277Lf	ggacactattCTGccgccgtct	TNEA C277Lr	TAGACGGCGGCAGAATAGTGTC
(SEQ ID NO 48)	a	(SEQ ID NO 49)	C
TNEA C277If	ggacactattATT ccgccgtct	TNEA C277Ir	TAGACGGCGGAATAATAGTGTC
(SEQ ID NO 50)	a	(SEQ ID NO 51)	C
TNEA C277Pf	ggacactattCCGccgccgtct	TNEA C277Pr	TAGACGGCGGCGGAATAGTGTC
(SEQ ID NO 52)	a	(SEQ ID NO 53)	C
TNEA C277Ff	ggacactattTTT ccgccgtct	TNEA C277Fr	TAGACGGCGGAAAAATAGTGTC
(SEQ ID NO 54)	a	(SEQ ID NO 55)	C
TNEA C277Yf	ggacactattTAT ccgccgtct	TNEA C277Yr	TAGACGGCGGATAAATAGTGTC
(SEQ ID NO 56)	a	(SEQ ID NO 57)	C
TNEA C277Wf	ggacactattTGGccgccgtct	TNEA C277Wr	TAGACGGCGGCCAAATAGTGTC
(SEQ ID NO 58)	a	(SEQ ID NO 59)	C
TNEA C277Sf	ggacactattAGCccgccgtct	TNEA C277Sr	TAGACGGCGGGCTAATAGTGTC
(SEQ ID NO 60)	a	(SEQ ID NO 61)	C
TNEA C277Tf	ggacactattACCccgccgtct	TNEA C277Tr	TAGACGGCGGGGTAATAGTGTC
(SEQ ID NO 62)	a	(SEQ ID NO 63)	C
TNEA C277Qf	ggacactattCAGccgccgtct	TNEA C277Qr	TAGACGGCGGCTGAATAGTGTC
(SEQ ID NO 64)	a	(SEQ ID NO 65)	C
TNEA C277Nf	ggacactattAACccgccgtct	TNEA C277Nr	TAGACGGCGGGTTAATAGTGTC
(SEQ ID NO 66)	a	(SEQ ID NO 67)	C
TNEA C277Df	ggacactattGAT ccgccgtct	TNEA C277Dr	TAGACGGCGGATCAATAGTGTC
(SEQ ID NO 68)	a	(SEQ ID NO 69)	C
TNEA C277Ef	ggacactattGAAccgccgtct	TNEA C277Er	TAGACGGCGGTTCAATAGTGTC
(SEQ ID NO 70)	a	(SEQ ID NO 71)	C
TNEA C277Rf	ggacactattCGT ccgccgtct	TNEA C277Rr	TAGACGGCGGACGAATAGTGTC
(SEQ ID NO 72)	a	(SEQ ID NO 73)	C
TNEA C277Hf	ggacactattCAT ccgccgtct	TNEA C277Hr	TAGACGGCGGATGAATAGTGTC
(SEQ ID NO 74)	a	(SEQ ID NO 75)	C
TNEA C277Kf	ggacactattAAAccgccgtct	TNEA C277Kr	TAGACGGCGGTTTAATAGTGTC
(SEQ ID NO 76)	a	(SEQ ID NO 77)	C
TNEA C277Mf	ggacactattATGccgccgtct	TNEA C277Mr	TAGACGGCGGCATAATAGTGTC
(SEQ ID NO 78)	a	(SEQ ID NO 79)	C

I276	5' a 3' frontal		5' a 3' reverso
TNEA I276Gf	gatggacactGGCtgtccgcc	TNEA I276Gr	ACGGCGGACAGCCAGTGTCCAT
(SEQ ID NO 80)	gt	(SEQ ID NO 81)	C
TNEA I276Af	gatggacactGCGtgtccgcc	TNEA I276Ar	ACGGCGGACACGCAGTGTCCAT
(SEQ ID NO 82)	gt	(SEQ ID NO 83)	C
TNEA I276Vf	gatggacactGTGtgtccgcc	TNEA I276Vr	ACGGCGGACACACAGTGTCCAT
(SEQ ID NO 84)	gt	(SEQ ID NO 85)	C
TNEA I276Lf	gatggacactCTGtgtccgcc	TNEA I276Lr	ACGGCGGACACAGAGTGTCCAT
(SEQ ID NO 86)	gt	(SEQ ID NO 87)	C
TNEA I276Cf	gatggacactTGCtgtccgcc	TNEA I276Cr	ACGGCGGACAGCAAGTGTCCAT
(SEQ ID NO 88)	gt	(SEQ ID NO 89)	C
TNEA I276Pf	gatggacactCCGtgtccgcc	TNEA I276Pr	ACGGCGGACACGGAGTGTCCAT
(SEQ ID NO 90)	gt	(SEQ ID NO 91)	C

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86/111

	5' a 3' frontal		5' a 3' reverso
TNEA I276Ff (SEQ ID NO 92)	gatggacactTTTtgtccgccg t	TNEA I276Fr (SEQ ID NO 93)	ACGGCGGACAAAAAGTGTCCAT C
TNEA I276Yf (SEQ ID NO 94)	gatggacactTATtgtccgccg t	TNEA I276Yr (SEQ ID NO 95)	ACGGCGGACAATAAGTGTCCAT C
TNEA I276Wf (SEQ ID NO 96)	gatggacactTGGtgtccgcc gt	TNEA I276Wr (SEQ ID NO 97)	ACGGCGGACACCAAGTGTCCAT C
TNEA I276Sf (SEQ ID NO 98)	gatggacactAGCtgtccgcc gt	TNEA I276Sr (SEQ ID NO 99)	ACGGCGGACAGCTAGTGTCCAT C
TNEA I276Tf (SEQ ID NO 100)	gatggacactACCtgtccgcc gt	TNEA I276Tr (SEQ ID NO 101)	ACGGCGGACAGGTAGTGTCCAT C
TNEA I276Qf (SEQ ID NO 102)	gatggacactCAGtgtccgcc gt	TNEA I276Qr (SEQ ID NO 103)	ACGGCGGACACTGAGTGTCCAT C
TNEA I276Nf (SEQ ID NO 104)	gatggacactAACtgtccgcc gt	TNEA I276Nr (SEQ ID NO 105)	ACGGCGGACAGTTAGTGTCCAT C
TNEA I276Df (SEQ ID NO 106)	gatggacactGATtgtccgcc gt	TNEA I276Dr (SEQ ID NO 107)	ACGGCGGACAATCAGTGTCCAT C
TNEA I276Ef (SEQ ID NO 108)	gatggacactGAAtgtccgcc gt	TNEA I276Er (SEQ ID NO 109)	ACGGCGGACATTCAGTGTCCAT C
TNEA I276Rf (SEQ ID NO 110)	gatggacactCGTtgtccgcc gt	TNEA I276Rr (SEQ ID NO 111)	ACGGCGGACAACGAGTGTCCAT C
TNEA I276Hf (SEQ ID NO 112)	gatggacactCATtgtccgcc gt	TNEA I276Hr (SEQ ID NO 113)	ACGGCGGACAATGAGTGTCCAT C
TNEA I276Kf (SEQ ID NO 114)	gatggacactAAAtgtccgcc gt	TNEA I276Kr (SEQ ID NO 115)	ACGGCGGACATTTAGTGTCCAT C
TNEA I276Mf (SEQ ID NO 116)	gatggacactATGtgtccgcc gt	TNEA I276Mr (SEQ ID NO 117)	ACGGCGGACACATAGTGTCCAT C

F213	5' a 3' frontal		5' a 3' reverso
TNEA F213Gf (SEQ ID NO 118)	cgatgttccgGGCctgtgccac t	TNEA F213Gr (SEQ ID NO 119)	AGTGGCACAGGCCCGGAACATC G
TNEA F213Af (SEQ ID NO 120)	cgatgttccgGCGctgtgccac t	TNEA F213Ar (SEQ ID NO 121)	AGTGGCACAGCGCCGGAACATC G
TNEA F213Vf (SEQ ID NO 122)	cgatgttccgGTGctgtgccac t	TNEA F213Vr (SEQ ID NO 123)	AGTGGCACAGCACCGGAACATC G
TNEA F213Lf (SEQ ID NO 124)	cgatgttccgCTGctgtgccac t	TNEA F213Lr (SEQ ID NO 125)	AGTGGCACAGCAGCGGAACATC G
TNEA F213If (SEQ ID NO 126)	cgatgttccgATTctgtgccact	TNEA F213Ir (SEQ ID NO 127)	AGTGGCACAGAATCGGAACATC G

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87/111

	5' a 3' frontal		5' a 3' reverso
TNEA F213Pf (SEQ ID NO 128)	cgatgttccgCCGctgtgccac t	TNEA F213Pr (SEQ ID NO 129)	AGTGGCACAGCGGCGGAACAT CG
TNEA F213Cf (SEQ ID NO 130)	cgatgttccgTGCctgtgccac t	TNEA F213Cr (SEQ ID NO 131)	AGTGGCACAGGCACGGAACATC G
TNEA F213Yf (SEQ ID NO 132)	cgatgttccgTATctgtgccact	TNEA F213Yr (SEQ ID NO 133)	AGTGGCACAGATACGGAACATC G
TNEA F213Wf (SEQ ID NO 134)	cgatgttccgTGGctgtgccac t	TNEA F213Wr (SEQ ID NO 135)	AGTGGCACAGCCACGGAACATC G
TNEA F213Sf (SEQ ID NO 136)	cgatgttccgAGCctgtgccac t	TNEA F213Sr (SEQ ID NO 137)	AGTGGCACAGGCTCGGAACATC G
TNEA F213Tf (SEQ ID NO 138)	cgatgttccgACCctgtgccac t	TNEA F213Tr (SEQ ID NO 139)	AGTGGCACAGGGTCGGAACATC G
TNEA F213Qf (SEQ ID NO 140)	cgatgttccgCAGctgtgccac t	TNEA F213Qr (SEQ ID NO 141)	AGTGGCACAGCTGCGGAACATC G
TNEA F213Nf (SEQ ID NO 142)	cgatgttccgAACctgtgccac t	TNEA F213Nr (SEQ ID NO 143)	AGTGGCACAGGTTCGGAACATC G
TNEA F213Df (SEQ ID NO 144)	cgatgttccgGATctgtgccac t	TNEA F213Dr (SEQ ID NO 145)	AGTGGCACAGATCCGGAACATC G
TNEA F213Ef (SEQ ID NO 146)	cgatgttccgGAActgtgccac t	TNEA F213Er (SEQ ID NO 147)	AGTGGCACAGTTCCGGAACATC G
TNEA F213Rf (SEQ ID NO 148)	cgatgttccgCGTctgtgccac t	TNEA F213Rr (SEQ ID NO 149)	AGTGGCACAGACGCGGAACATC G
TNEA F213Hf (SEQ ID NO 150)	cgatgttccgCATctgtgccact	TNEA F213Hr (SEQ ID NO 151)	AGTGGCACAGATGCGGAACATC G
TNEA F213Kf (SEQ ID NO 152)	cgatgttccgAAActgtgccact	TNEA F213Kr (SEQ ID NO 153)	AGTGGCACAGTTTCGGAACATC G
TNEA F213Mf (SEQ ID NO 154)	cgatgttccgATGctgtgccac t	TNEA F213Mr (SEQ ID NO 155)	AGTGGCACAGCATCGGAACATC G

N093	5' a 3' frontal		5' a 3' reverso
TNEA N093Gf (SEQ ID NO 156)	cattggttacGGCggtggccgt g	TNEA N093Gr (SEQ ID NO 157)	CACGGCCACCGGCGTAACCAAT G
TNEA N093Af (SEQ ID NO 158)	cattggttacGCGggtggccgt g	TNEA N093Ar (SEQ ID NO 159)	CACGGCCACCGCGGTAACCAAT G
TNEA N093Vf (SEQ ID NO	cattggttacGTGggtggccgt g	TNEA N093Vr (SEQ ID NO	CACGGCCACCGTGGTAACCAAT G

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88/111

	5' a 3' frontal		5' a 3' reverso
160)		161)
TNEA N093Lf (SEQ ID NO 162)	cattggttacCTGggtggccgt g	TNEA N093Lr (SEQ ID NO 163)	CACGGCCACCCTGGTAACCAAT G
TNEA N093If (SEQ ID NO 164)	cattggttacATTggtggccgt g	TNEA N093Ir (SEQ ID NO 165)	CACGGCCACCATTGTAACCAAT G
TNEA N093Pf (SEQ ID NO 166)	cattggttacCCGggtggccgt g	TNEA N093Pr (SEQ ID NO 167)	CACGGCCACCCCGGTAACCAAT G
TNEA N093Cf (SEQ ID NO 168)	cattggttacTGCggtggccgt g	TNEA N093Cr (SEQ ID NO 169)	CACGGCCACCTGCGTAACCAAT G
TNEA N093Yf (SEQ ID NO 170)	cattggttacTATggtggccgt g	TNEA N093Yr (SEQ ID NO 171)	CACGGCCACCTATGTAACCAAT G
TNEA N093Wf (SEQ ID NO 172)	cattggttacTGGggtggccgt g	TNEA N093Wr (SEQ ID NO 173)	CACGGCCACCTGGGTAACCAAT G
TNEA N093Sf (SEQ ID NO 174)	cattggttacAGCggtggccgt g	TNEA N093Sr (SEQ ID NO 175)	CACGGCCACCAGCGTAACCAAT G
TNEA N093Tf (SEQ ID NO 176)	cattggttacACCggtggccgt g	TNEA N093Tr (SEQ ID NO 177)	CACGGCCACCACCGTAACCAAT G
TNEA N093Qf (SEQ ID NO 178)	cattggttacCAGggtggccgt g	TNEA N093Qr (SEQ ID NO 179)	CACGGCCACCCAGGTAACCAAT G
TNEA N093Ff (SEQ ID NO 180)	cattggttacTTTggtggccgtg	TNEA N093Fr (SEQ ID NO 181)	CACGGCCACCTTTGTAACCAAT G
TNEA N093Df (SEQ ID NO 182)	cattggttacGATggtggccgt g	TNEA N093Dr (SEQ ID NO 183)	CACGGCCACCGATGTAACCAAT G
TNEA N093Ef (SEQ ID NO 184)	cattggttacGAAggtggccgt g	TNEA N093Er (SEQ ID NO 185)	CACGGCCACCGAAGTAACCAAT G
TNEA N093Rf (SEQ ID NO 186)	cattggttacCGTggtggccgt g	TNEA N093Rr (SEQ ID NO 187)	CACGGCCACCCGTGTAACCAAT G
TNEA N093Hf (SEQ ID NO 188)	cattggttacCATggtggccgt g	TNEA N093Hr (SEQ ID NO 189)	CACGGCCACCCATGTAACCAAT G
TNEA N093Kf (SEQ ID NO 190)	cattggttacAAAggtggccgt g	TNEA N093Kr (SEQ ID NO 191)	CACGGCCACCAAAGTAACCAAT G
TNEA_N093Mf (SEQ ID NO 192)	cattggttacATGggtggccgt ^g	TNEA_N093Mr (SEQ ID NO 193)	CACGGCCACCATGGTAACCAAT G

[0208] As mutações foram realizadas utilizando o kit

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QUIKCHANGE® (Stratagene, La Jolla CA) de acordo com as instruções do fabricante. Os plasmídeos amplificados foram tratados com 1 U de DpnI a 37 °C por uma hora. Os plasmídeos tratados foram utilizados para transformar XL1-Azul de E. coli quimicamente competente (Stratagene) (resíduos 213, 276 e 277) ou TOP10F’ de E. coli quimicamente competentes (Invitrogen, Carlsbad CA) (resíduo 93). Os transformadores foram colocados em placas sobre LBagar suplementado com 0,1 mg de ampicilina por ml e cultivados por uma noite a 37 °C. Até cinco colônias individuais foram tomadas e o DNA de plasmídeo foi sequenciado para confirmar as mutações esperadas.

Exemplo 6

Teste De Atividade De Per-Hidrolase De Mutantes De Acetil Xilano

Esterase De Thermotoga Neapolitana [0209] Colônias individuais de mutantes foram tomadas em placas com 96 cavidades contendo 0,1 ml de LB com 0,1 mg de ampicilina por ml e cultivadas por uma noite a 37 °C sem agitação. O cultivo por uma noite (0,003 ml) foi transferido para uma “placa de indução” (96 cavidades profundas) contendo 0,3 ml de LB, 0,5 mM de IPTG e 0,1 mg de ampicilina por ml. Placas de indução foram cultivadas por uma noite a 37 °C com agitação. 0,01 ml de cultivo de indução foram transferidos para “placa de lise” (96 cavidades) contendo 0,09 ml de 56 mg/ml de CELYTIC® Express (Sigma-Aldrich, St. Louis MO). As placas foram levemente agitadas em primeiro lugar, antes da incubação a 25 °C por trinta minutos. Cerca de 0,01 ml de cultivo de lise foram transferidos para “placa de teste” (96 cavidades) contendo 0,09 ml de “solução de teste com pH 5,0” (100 mM de triacetina, 100 mM de peróxido de hidrogênio, 50 mM de ácido acético, pH 5,0). Cerca de 0,01 ml de cultivo de lise foram transferidos para “placa de teste com pH 7,5 (96 cavidades) contendo 0,09 ml de “solução de teste com pH 7,5” (100 mM de triacetina, 100 mM de peróxido de hidrogênio, 50 mM de fosfato de sódio, pH 7,5). As placas foram suavemente agitadas por trinta segundos antes da

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90/111 incubação à temperatura ambiente por dez minutos. O teste foi resfriado por meio da adição de 0,1 ml de “tampão de parada” (100 mM de ortofenilenodiamina (OPD), 500 mM de NaH2PO4, pH 2,0). As placas foram suavemente agitadas por trinta segundos antes da incubação a 25 °C por trinta minutos. A absorção foi lida a 458 nm sem tampa utilizando SPECTRAMAX® Plus³⁸⁴ (Molecular Devices, Sunnyvale CA). Análise dos resultados indicou quatro mutantes que demonstraram atividade de per-hidrolase significativamente maior em comparação com a enzima nativa (Tabelas 2 e 3). Todas as quatro são alterações da cisteína no resíduo 277 (C277A, C277V, C277S e C277T; vide SEQ ID NO 5) que aumentaram a atividade de per-hidrolase.

Tabela 2

Atividade de Per-Hidrolase (U/ml) sob pH 5,0 de Mutantes de Acetil Xilano

Esterase de T. neapolitana

Mutante	U/ml	Mutante	U/ml	Mutante	U/ml	Mutante	U/ml
F213S	0,17	I276W	0,18	C277N	0,17	N093R	0,11
F213N	0,18	I276R	0,18	C277I	0,17	N093I	0,10
F213G	0,17	I276L	0,18	C277S	0,43	N093Q	0,10
F213C	0,21	I276K	0,18	C277A	0,51	N093K	0,11
F213V	0,17	I276M	0,18	C277Q	0,17	N093M	0,10
F213M	0,17	I276V	0,26	C277L	0,17	N093C	0,12
F213T	0,17	I276S	0,17	C277K	0,17	N093D	0,10
F213Y	0,23	I276N	0,18	C277V	0,35	N093S	0,12
F213I	0,18	I276C	0,29	C277E	0,17	N093G	0,11
F213Q	0,17	I276Q	0,17	C277P	0,17	N093V	0,10
F213H	0,22	I276F	0,27	C277D	0,17	N093L	0,13
F213R	0,20	I276H	0,18	C277M	0,17	N09E	0,10
F213W	0,17	I276D	0,17	C277F	0,17	N093F	0,10
F213P	0,17	I276E	0,18	C277T	0,33	N09A	0,11
F213D	0,17	I276G	0,17	C277Y	0,17	N093H	0,11
F213K	0,17	I276Y	0,23	C277H	0,17	N093W	0,10
F213L	0,18	I276T	0,29	C277W	N/A	N093P	0,10
F213E	N/A	I276A	N/A	C277R	N/A	N093Y	0,10
F213A	N/A	I276P	N/A	C277G	N/A	N093T	N/A
	nativo	0,16

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Tabela 3

Atividade de Per-Hidrolase sob pH 7,5 de Mutantes de Acetil Xilano

Esterase de T. neapolitana

Mutante	U/ml	Mutante	U/ml	Mutante	U/ml	Mutante	U/ml
F213S	1,80	I276W	2,00	C277N	3,50	N093R	0,13
F213N	1,90	I276R	1,90	C277I	3,60	N093I	0,10
F213G	1,70	I276L	2,00	C277S	9,30	N093Q	0,11
F213C	3,00	I276K	1,90	C277A	7,50	N093K	0,13
F213V	1,70	I276M	1,90	C277Q	3,50	N093M	0,12
F213M	1,90	I276V	3,40	C277L	3,60	N093C	0,15
F213T	1,80	I276S	1,90	C277K	3,50	N093D	0,10
F213Y	2,60	I276N	2,10	C277V	6,10	N093S	0,23
F213I	1,80	I276C	3,40	C277E	3,50	N093G	0,18
F213Q	1,80	I276Q	2,00	C277P	3,60	N093V	0,10
F213H	2,30	I276F	2,70	C277D	3,70	N093L	0,22
F213R	2,20	I276H	2,10	C277M	3,60	N09E	0,12
F213W	1,80	I276D	1,90	C277F	3,60	N093F	0,10
F213P	3,50	I276E	1,90	C277T	9,60	N09A	0,13
F213D	3,60	I276G	3,60	C277Y	3,60	N093H	0,18
F213K	3,60	I276Y	4,40	C277H	3,60	N093W	0,16
F213L	5,00	I276T	3,00	C277W	N/A	N093P	0,12
F213E	N/A	I276A	N/A	C277R	N/A	N093Y	0,15
F213A	N/A	I276P	N/A	C277G	N/A	N093T	N/A
	nativo	0,23

Exemplo 7

Expressão De Variantes De Acetil Xilano Esterase De Thermotoga

Neapolitana Em E. Coli Klp18 [0210] Plasmídeos com mutações de acetil xilano esterase confirmadas foram utilizados para transformar E. coli KLP18 (Exemplo 1). Os transformantes foram colocados em placas sobre LB-ampicilina (100 pg/ml) e incubados por uma noite a 37 °C. As células foram colhidas de uma placa utilizando 2,5 ml de meios LB suplementados com 20% (v/v) glicerol e parcelas de 1,0 ml da suspensão celular resultante congelada a 80 °C. Um mililitro da suspensão celular descongelada foi transferido para

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92/111 um biorreator de um litro APPLIKON® (Applikon® Biotechnology, Foster City CA) com 0,7 l de meio contendo KH2PO4 (5,0 g/l), hepta-hidrato de FeSO4 (0,05 g/l), hepta-hidrato de FeSO4 (0,05 g/l), hepta-hidrato de MgSO4 (1,0 g/l), di-hidrato citrato de sódio (1,90 g/l), extrato de levedura (Amberex 695, 5,0 g/l), antiespumante Biospumex 153K (0,25 ml/l, Cognis Corporation), NaCl (1,0 g/l), di-hidrato de CaCl2 (0,1 g/l) e solução de elementos de traço de NIT (10 ml/l). A solução de elementos de traço continha mono-hidrato de ácido cítrico (10 g/l), hidrato de MnSO4 (2 g/l), NaCl (2 g/l), hepta-hidrato de FeSO4 (0,5 g/l), hepta-hidrato de ZnSO4 (0,2 g/l), penta-hidrato de CuSO4 (0,02 g/l) e di-hidrato de NaMoO4 (0,02 g/l). Adições após a sanitização incluíram solução de glicose (50% p/p, 6,5 g) e solução padrão (2,8 ml) de ampicilina (25 mg/ml). Utilizou-se solução de glicose (50% p/p) para bateladas de alimentação. A alimentação de glicose iniciou-se em quarenta minutos após a queda da concentração de glicose abaixo de 0,5 g/l, inicialmente a 0,03 g de alimentação por minuto e aumentando progressivamente a cada hora para 0,04, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,12 e 0,14 g/min, respectivamente; a velocidade manteve-se constante em seguida. A concentração de glicose no meio foi monitorada e, caso a concentração excedesse 0,1 g/l, a velocidade de alimentação era reduzida ou suspensa temporariamente. A indução foi iniciada a OD550 = 50 com adição de 0,8 ml de IPTG (0,05 M). A concentração de oxigênio dissolvido (DO) foi controlada em 25% de saturação em ar, primeiramente por meio de agitação (400-1000 rpm), seguida por aeração (0,5 a 2 slpm). A temperatura foi controlada a 37 °C e o pH foi controlado em 6,8; NH4OH (29% p/p) e H2SO4 (20% p/v) foram utilizados para controle do pH. As células foram colhidas por meio de centrifugação (5000 x g por quinze minutos) em vinte horas após a adição de IPTG.

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Exemplo 8

Preparação De Lisatos Celulares Que Contêm Acetil Xilano Esterase De

T. Neapolitana Ou Acetil Xilano Esterases Variantes De T. Neapolitana [0211] Cultivo celular de E. coli KLP18/pSW196 (per-hidrolase do tipo selvagem de Thermotoga neapolitana de E. coli KLP18/pSW196 cresceu conforme descrito no Exemplo 2. A pasta celular resultante foi novamente suspensa (20% p/v) em 50 mM de tampão de fosfato, pH 7,0, suplementada com 1,0 mM de DTT. Células novamente suspensas passaram através de uma célula de pressão francesa duas vezes para garantir mais de 95% de lise celular. As células lisadas foram centrifugadas por trinta minutos a 12.000 x g e o sobrenadante foi aquecido a 75 °C por vinte minutos, seguido por resfriamento em um banho de gelo por dois minutos. Proteína precipitada foi removida por meio de centrifugação por dez minutos a 11.000 x g. SDS-PAGE indicou que a enzima CE-7 compreendeu cerca de 85 a 90% do total de proteína no sobrenadante de extrato tratado a quente.

[0212] Cultivos celulares de E. coli KLP18/pSW196/C277S (perhidrolase variante de Thermotoga neapolitana C277S), E. coli KLP18/pSW196/C277V (per-hidrolase variante de Thermotoga neapolitana C277V), E. coli KLP18/pSW196/C277A (per-hidrolase variante de Thermotoga neapolitana C277A) e E. coli KLP18/pSW196/C277T (per-hidrolase variante de Thermotoga neapolitana C277T) foram cultivados conforme descrito no Exemplo 7. As pastas celulares resultantes foram novamente suspensas (20% p/v) em 50 mM de tampão de fosfato, pH 7,0, suplementado com 1,0 mM de DTT. Células novamente suspensas passaram através de uma célula de pressão francesa duas vezes para garantir mais de 95% de lise celular. As células lisadas foram centrifugadas por trinta minutos a 12.000 x g e o sobrenadante foi aquecido a 75 °C por vinte minutos, seguido por resfriamento em um banho de gelo por dois minutos. Proteína precipitada foi removida por

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94/111 meio de centrifugação por dez minutos a 11.000 x g. SDS-PAGE indicou que a enzima CE-7 compreendeu cerca de 85 a 90% do total de proteína no sobrenadante de extrato tratado a quente.

Exemplo 9

Atividade Específica E Razão Entre Per-Hidrólise E Hidrólise De Variantes

De C277 Esterase E Acetil Xilano Esterase Do Tipo Selvagem De T.

Neapolitana [0213] Foram conduzidas reações (volume total de 40 ml) a 25 °C em tampão de fosfato (50 mM, pH 7,2) contendo triacetina (100 mM), peróxido de hidrogênio (100 mM) e um dos mutantes de acetil xilano esterase a seguir: per-hidrolase variante C277S de T. neapolitana (0,010 mg/ml de extrato de proteína total tratado a quente de E. coli KLP18/pSW196/C277S), per-hidrolase variante C277T de T. neapolitana (0,010 mg/ml de extrato tratado a quente de proteína total de E. coli KLP18/pSW196/C277T), per-hidrolase variante C277A de T. neapolitana (0,0125 mg/ml de extrato total tratado a quente de proteína de E. coli KLP18/pSW196/C277A) e per-hidrolase variante C277V de T. neapolitana (0,0125 mg/ml de extrato tratado a quente de proteína total de E. coli KLP18/pSW196/C277V) (preparado conforme descrito no Exemplo 8). As reações foram agitadas apenas pelos primeiros trinta segundos de reação para misturar inicialmente os reagentes e enzima.

[0214] Foi também conduzida uma reação sob condições idênticas às descritas imediatamente acima utilizando 0,050 mg/ml de extrato tratado a quente de proteína total isolado de E. coli KLP18/pSW196 (que expressa acetil xilano esterase do tipo selvagem de Thermotoga neapolitana (Exemplo 1)), em que o sobrenadante de extrato tratado a quente foi preparado de acordo com o procedimento do Exemplo 8.

[0215] Duas amostras de cada uma das misturas de reação descritas acima foram retiradas simultaneamente após o primeiro minuto de

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95/111 cada reação e a cada dois minutos seguintes por quinze minutos, em que uma das duas amostras foi analisada para determinar ácido peracético e a segunda amostra foi analisada para determinar ácido acético total produzido por meio de hidrólise enzimática de triacetina e de conversão subsequente de ácido peracético em amostra em ácido acético por meio de reação com sulfeto de metil-p-tolila (MTS, vide abaixo).

[0216] A medição da velocidade de produção de ácido peracético na mistura de reação foi realizada utilizando uma modificação do método descrito por Karst et al, acima. Uma amostra (0,040 ml) da mistura de reação fio removida em um tempo previamente determinado e imediatamente misturada com 0,960 ml de 5 mM ácido fosfórico em água para encerrar a reação por meio de ajuste do pH da amostra diluída em pH de menos de 4. A solução resultante foi filtrada utilizando uma unidade de filtro MC ULTRAFREE® (limite de peso molecular normal (NMWL) de 30.000, Millipore Corp., Billerica MA; cat. NO UFC3LKT 00) por meio de centrifugação por dois minutos a 12.000 rpm. Uma parcela (0,100 ml) do filtrado resultante foi transferida para uma ampola de HPLC de tampa de rosca de 1,5 ml (Agilent Technologies, Palo Alto CA, NO 5182-0715) contendo 0,300 ml de água deionizada, adicionou-se em seguida 0,100 ml de 20 mM MTS (sulfeto de metilp-tolila) em acetonitrila, a ampola foi tampada e o conteúdo foi rapidamente misturado antes de incubação por dez minutos a cerca de 25 °C na ausência de luz. À ampola, foram adicionados em seguida 0,400 ml de acetonitrila e 0,100 ml de uma solução de trifenilfosfina (TPP, 40 mM) em acetonitrila, a ampola foi novamente tampada e a solução resultante foi misturada e incubada a cerca de 25 °C por trinta minutos na ausência de luz. À ampola, foram adicionados em seguida 0,100 ml de 10 mM de N,N-dietil-m-toluamida (DEET; padrão externo de HPLC) e a solução resultante foi analisada por meio de HPLC para MTSO (sulfóxido de metil-p-tolila), o produto de oxidação

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96/111 estequiométrica elaborado por meio de reação de MTS com ácido peracético. Foi conduzida uma reação de controle na ausência de adição de extrato de proteína ou triacetina para determinar a velocidade de oxidação de MTS na mistura de teste por peróxido de hidrogênio, para correção da velocidade de produção de ácido peracético para oxidação de MTS de fundo. Método HPLC: coluna Supelco Discovery C8 (10 cm x 4,0 mm, 5 pm) (catálogo NO 569422-U) com coluna prévia Supelco Supelguard Discovery C8 (Sigma-Aldrich: catálogo NO 59590-U); volume de injeção de dez microlitros; método de gradiente com CH3CN (Sigma-Aldrich; catálogo NO 270717) e água deionizada a 1,0 ml/min e temperatura ambiente (Tabela 4).

Tabela 4

Gradiente de HPLC para Análise de Ácido Peracético

Tempo (min: seg)	(% CH3CN)
0:00	40
3:00	40
3:10	100
4:00	100
4:10	40
7:00 (parada)	40

[0217] Para determinação da velocidade de produção de ácido acético catalisado por per-hidrolase na reação, uma amostra (0,900 ml) da mistura de reação foi removida em um tempo previamente determinado e adicionada imediatamente a um tubo microcentrifugador de 1,5 ml contendo 0,040 ml de 0,75 M de H3PO4 e a solução resultante foi rapidamente misturada para encerrar a reação sob pH 3,0 a 4,0. Foram adicionados ao tubo 0,020 ml de uma solução de 10 mg/ml de catalase de Aspergillus niger (Sigma-Aldrich; C3515) em 50 mM de tampão de fosfato (pH 7,2) e a solução resultante foi misturada e mantida em reação por quinze minutos à temperatura ambiente para desproporcionar peróxido de hidrogênio não reagido em água e oxigênio. Ao tubo, adicionou-se 0,040 ml de 0,75 M de

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H3PO4 e a solução resultante foi misturada e filtrada utilizando uma unidade de filtro MC ULTRAFREE® (limite de peso molecular normal (NMWL) de 30.000, Millipore Corp., cat. NO UFC3LKT 00) por meio de centrifugação por dois minutos a 12.000 rpm. Uma parcela (0,100 ml) do filtrado resultante foi misturada com 0,150 ml de 20 mM de MTS (sulfeto de metil-p-tolila) em acetonitrila e a solução resultante foi incubada por dez minutos a cerca de 25 °C na ausência de luz. A concentração de ácido acético na amostra produzida por meio de hidrólise enzimática de triacetina e conversão de ácido peracético em ácido acético por meio de reação com MTS foi determinada utilizando um cromatógrafo de gases (GC) equipado com um detector de ionização de chama (FID) e uma coluna DB-FFAP (comprimento, 15 m; diâmetro interno, 0,530 mm; espessura de filme, 1,00 pm); um forro de porta de injeção novo foi empregado para cada determinação de velocidade (total de oito análises de amostras) para evitar o acúmulo de ácido fosfórico no forro da porta de injeção ao longo do tempo.

[0218] As variantes de acetil xilano esterase de Thermotoga neapolitana apresentaram uma atividade específica significativamente mais alta de per-hidrólise de triacetina que a esterase do tipo selvagem (Tabela

5). As razões entre per-hidrólise e hidrólise para as variantes de acetil xilano esterase de T. neapolitana foram determinadas por meio de divisão da velocidade de produção de PAA (velocidade de per-hidrólise) pela velocidade de hidrólise de triacetina em ácido acético (velocidade de hidrólise) (calculada a partir da velocidade de produção de ácido acético total no método de teste de PAA e ácido acético e corrigida pela velocidade de produção de ácido peracético); a razão P/H das variantes de acetil xilano esterase de T. neapolitana foi aproximadamente igual ou maior que a razão P/H para a acetil xilano esterase de tipo selvagem de T. neapolitana (Tabela 5).

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Tabela 5

Per-hidrolase de Thermotoga neapolitana	Concentração de enzimas (pg/ml)	Velocidade de per-hidrólise (mM/min)	Velocidade de hidrólise (mM/min)	Razão P/H	Atividade específica (U/mg de proteína)
tipo selvagem	50	3,61	1,22	3,0	72
C277S	10	4,40	1,61	2,7	440
C277T	10	4,24	0,81	5,2	424
C277A	12,5	4,14	1,43	2,9	331
C277V	12,5	3,70	0,88	4,2	296

Exemplo 10

Clonagem E Expressão De Acetil Xilano Esterase De Thermotoga

Marítima [0219] Foi sintetizado um gene que codifica acetil xilano esterase de T. maritima conforme relatado em GENBANK® (acesso NO NP_227893.1) (DNA 2.0, Menlo Park CA). O gene foi amplificado em seguida por meio de PCR (0,5 min a 94 °C, 0,5 min a 55 °C, 1 min a 70 °C, trinta ciclos) utilizando primers identificados como SEQ ID NO 206 e SEQ ID N° 207. O produto de ácido nucleico resultante (SEQ ID NO 208) foi cortado com enzimas de restrição PstI e Xbal e subclonado entre os locais PstI e Xbal em pUC19 para gerar o plasmídeo identificado como pSW207. Foi sintetizado um gene que codifica uma acetil xilano esterase de T. maritima MSB8 conforme relatado em GENBANK® (acesso NO NP_227893.1; SEQ ID NO 36) foi sintetizado utilizando códons otimizados para expressão em E. coli (DNA 2.0, Menlo Park CA). O gene foi amplificado em seguida por meio de PCR (0,5 min a 94 °C, 0,5 min a 55 °C, 1 min a 70 °C, trinta ciclos) utilizando primers identificados como SEQ ID NO 38 e SEQ ID NO 39. O produto de ácido nucleico resultante (SEQ ID NO 37) foi cortado com as enzimas de restrição EcoRI e PstI e subclonado entre os locais EcoRI e PstI em pTrc99A (Acesso GENBANK® NO M22744) para gerar o plasmídeo identificado como pSW228 (que contém a sequência de codificação de T. maritima otimizada por códons SEQ ID NO 41). Os plasmídeos pSW207 e pSW228 foram utilizados para transformar E. coli KLP18

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99/111 (Pedido de Patente Norte-Americano publicado NO 2008/0176299) para gerar a linhagem identificada como KLP18/pSW207 e KLP18/pSW228, respectivamente. KLP18/pSW207 e KLP18/pSW228 foram cultivados em meios LB a 37 °C com agitação até OD600nm = 0,4-0,5, quando foi adicionado IPTG até uma concentração final de 1 mM e a incubação prosseguiu por duas a três horas. As células foram colhidas por meio de centrifugação e realizou-se SDSPAGE para confirmar a expressão da per-hidrolase a 20-40% de proteína solúvel total.

Exemplo 11

Construção De Variantes De Acetil Xilano Esterase De Thermotoga

Marítima No Resíduo C277 [0220] A posição C277 (Cys277) de acetil xilano esterase de T. maritima foi alterada para cada um dentre Val, Ala, Ser e Thr, utilizando pares de primers de oligonucleotídeos (Tabela 6) que foram projetados com base na sequência otimizada por códons de acetil xilano esterase de T. maritima (SEQ ID NO 41) no plasmídeo pSW228. As mutações foram realizadas utilizando QUIKCHANGE® (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. Os plasmídeos amplificados foram tratados com 1 U de DpnI a 37 °C por uma hora. Os plasmídeos tratados foram utilizados para transformar E. coli XL1-Azul quimicamente competente (Stratagene). Os transformadores foram colocados em placas sobre LB-agar suplementado com 0,1 mg de ampicilina por ml e cultivados por uma noite a 37 °C. Até cinco colônias individuais foram tomadas e o DNA de plasmídeo foi sequenciado para confirmar as mutações esperadas.

Tabela 6

Oligonucleotídeos Utilizados para Alterar o Resíduo 277 em T. maritima.

5' a 3' frontal

5' a 3' reverso

Tma_C277Vf (SEQ ID NO 194) ggacaacatcGTGcctccttct a

Tma_C277Vr (SEQ ID NO 195)

TAGAAGGAGGCACGATGTTGTC

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100/111

5' a 3' frontal

5' a 3' reverso

Tma_C277Af (SEQ ID NO 196) ggacaacatcGCGcctccttct a

Tma_C277Ar (SEQ ID NO 197)

Tma_C277Sf (SEQ ID NO 198) ggacaacatcTCAcctccttct a

Tma_C277Sr (SEQ ID NO 199)

Tma_C277Tf (SEQ ID NO 200) ggacaacatcACCcctccttct a

Tma_C277Tr (SEQ ID NO 201)

TAGAAGGAGGCGCGATGTTGTC

C

TAGAAGGAGGTGAGATGTTGTC

C

TAGAAGGAGGGGTGATGTTGTC

C

Exemplo 12

Expressão De Variantes De Acetil Xilano Esterase De Thermotoga

Maritima Em E. Coli Klp18 [0221] Plasmídeos com mutações de acetil xilano esterase confirmadas foram utilizados para transformar E. coli KLP18 (Exemplo 1). Transformadores foram cultivados em meios LB a 37 °C com agitação até OD600nm = 0,4-0,5, quando foi adicionado IPTG até uma concentração final de 1 mM e a incubação prosseguiu por duas a três horas. As células foram colhidas por meio de centrifugação e realizou-se SDS-PAGE para confirmar a expressão da acetil xilano esterase a 20-40% de proteína solúvel total.

Exemplo 13

Preparação De Lisatos Celulares Que Contêm Mutantes De Acetil Xilano

Esterase De T. Marítima Semipurificados [0222] Cultivos celulares (preparados conforme descrito no Exemplo 12) cresceram utilizando um protocolo de fermentação similar ao descrito no Exemplo 7 em escala 1-L (Applikon). Foram colhidas células por meio de centrifugação a 5000 x g por quinze minutos e suspensos novamente em seguida (20% p/v) em 50 mM de tampão de fosfato com pH 7,0 suplementado com 1,0 mM de DTT. Células novamente suspensas passaram através de uma célula de pressão francesa duas vezes para garantir mais de 95% de lise celular. As células lisadas foram centrifugadas por trinta minutos a

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12.000 x g e o sobrenadante foi aquecido a 75 °C por vinte minutos, seguido por resfriamento em um banho de gelo por dois minutos. Proteína precipitada foi removida por meio de centrifugação por dez minutos a 11.000 x g. SDSPAGE indicou que a enzima CE-7 compreendeu cerca de 85 a 90% do total de proteína na preparação.

Exemplo 14

Atividade Específica E Razão Entre Per-Hidrólise E Hidrólise De Variantes

De C277 Esterase E Acetil Xilano Esterase Do Tipo Selvagem De T.

Marítima [0223] Foram conduzidas reações (volume total de 40 ml) a 25 °C em tampão de fosfato (50 mM, pH 7,2) contendo triacetina (100 mM), peróxido de hidrogênio (100 mM) e uma das variantes de acetil xilano esterase a seguir: per-hidrolase variante C277S de T. marítima (0,010 mg/ml de extrato de proteína total tratado a quente de E. coli KLP18/pSW228/C277S), per-hidrolase variante C277T de T. marítima (0,010 mg/ml de extrato tratado a quente de proteína total de E. coli KLP18/pSW228/C277T), per-hidrolase variante C277A de T. marítima (0,0125 mg/ml de extrato total tratado a quente de proteína de E. coli KLP18/pSW228/C277A) e per-hidrolase variante C277V de T. maritima (0,0125 mg/ml de extrato tratado a quente de proteína total de E. coli KLP18/pSW228/C277V) (preparado conforme descrito no Exemplo 13). As reações foram agitadas apenas pelos primeiros trinta segundos de reação para misturar inicialmente os reagentes e a enzima.

[0224] Foi também conduzida uma reação sob condições idênticas às descritas imediatamente acima utilizando 0,050 mg/ml de extrato tratado a quente de proteína total isolada de E. coli KLP18/pSW228 (que expressa acetil xilano esterase do tipo selvagem de Thermotoga maritima (Exemplo 10)), em que o sobrenadante de extrato tratado a quente foi preparado de acordo com o procedimento do Exemplo 13.

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102/111 [0225] Duas amostras de cada uma das misturas de reação descritas acima foram retiradas simultaneamente após o primeiro minuto de cada reação e a cada dois minutos seguintes por quinze minutos, em que uma das duas amostras foi analisada para determinar ácido peracético utilizando uma modificação do método descrito por Karst et al, acima, e a segunda amostra foi analisada para determinar o total de ácido acético produzido por meio de hidrólise enzimática de triacetina e de conversão subsequente de ácido peracético em amostra em ácido acético por meio de reação com sulfeto de metil-p-tolila (MTS) (vide Exemplo 9).

[0226] As variantes de acetil xilano esterase de Thermotoga maritima apresentaram uma atividade específica significativamente mais alta de per-hidrólise de triacetina que a esterase do tipo selvagem (Tabela 7). As razões entre per-hidrólise e hidrólise para as variantes de acetil xilano esterase de T. maritima foram determinadas por meio de divisão da velocidade de produção de PAA (velocidade de per-hidrólise) pela velocidade de hidrólise de triacetina em ácido acético (velocidade de hidrólise) (calculada a partir da velocidade de produção de ácido acético total no método de teste de PAA e ácido acético e corrigida pela velocidade de produção de ácido peracético); a razão P/H das variantes de acetil xilano esterase de T. maritima foi aproximadamente igual ou maior que a razão P/H para a acetil xilano esterase de tipo selvagem de T. neapolitana (Tabela 7).

Tabela 7

per-hidrolase de Thermotoga maritima	Concentração de enzimas (pg/ml)	Velocidade de per-hidrólise (mM/min)	Velocidade de hidrólise (mM/min)	Razão P/H	Atividade específica (U/mg de proteína)
tipo selvagem	50	3,06	0,47	6,5	61
C277S	10	7,77	0,48	16	777
C277T	10	6,93	1,05	6,6	693
C277A	10	4,27	0,088	48	427
C277V	10	4,25	0,062	68	425

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Exemplo 15

Produção De Ácido Peracético Utilizando Per-Hidrolases [0227] Foram conduzidas reações (volume total de 100 ml) contendo triacetina (2 mM), peróxido de hidrogênio (10 mM) e de 0,1 μg/ml a 2,0 μg/ml de extrato celular tratado a quente de proteína (preparado conforme descrito acima, em que o tratamento a quente foi realizado a 85 °C por vinte minutos) em 10 mM de tampão bicarbonato de sódio (pH inicial 8,1) a 20 °C. A determinação da concentração de ácido peracético nas misturas de reação foi realizada de acordo com o método descrito por Karst et al, acima. As concentrações de ácido peracético produzidas em 1 min, 5 min, 20 min, 40 min e 60 min encontram-se relacionadas na Tabela 8.

Tabela 8

Dependência Da Concentração De Ácido Peracético (Paa) Da Concentração De Per-Hidrolase Em Reações Que Contêm Triacetina (2

Mm) E Peróxido De Hidrogênio (10 Mm) Em Tampão Bicarbonato De sódio (10 Mm, pH Inicial 8,1) A 20 °C, Utilizando Extrato Tratado A Quente De

Proteína De E. Coli Klp18/Psw228 (Per-Hidrolase Do Tipo Selvagem De

Thermotoga Marítima) Ou E. Coli Klp18/Psw228/C277s (Variante C277s De

Per-Hidrolase De Thermotoga Marítima) (Reações Duplicadas)

per-hidrolase de Thermotoga maritima	triacetina (mM)	Concentração de enzimas (Mg/ml)	PAA, 1 min (ppm)	PAA, 5 min (ppm)	PAA, 20 min (ppm)	PAA, 40 min (ppm)	PAA, 60 min (ppm)
sem enzima	2	0	0	0	1	1	3
tipo selvagem	2	0,2	0	2	7	13	19
tipo selvagem	2	0,2	0	1	5	11	15
tipo selvagem	2	0,5	0	2	12	19	25
tipo selvagem	2	0,5	0	2	12	21	26
tipo selvagem	2	1,0	0	5	20	29	31
tipo selvagem	2	1,0	0	5	19	30	31
tipo selvagem	2	2,0	1	11	24	24	20
tipo selvagem	2	2,0	1	11	29	29	21
C277S	2	0,2	0	4	18	18	18
C277S	2	0,2	0	4	18	17	18

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per-hidrolase de Thermotoga maritima	triacetina (mM)	Concentração de enzimas (Mg/ml)	PAA, 1 min (ppm)	PAA, 5 min (ppm)	PAA, 20 min (ppm)	PAA, 40 min (ppm)	PAA, 60 min (ppm)
C277S	2	0,5	1	12	39	54	64
C277S	2	0,5	1	10	34	52	64
C277S	2	1,0	18	26	59	69	63
C277S	2	1,0	18	25	60	70	64
C277S	2	2,0	9	38	66	60	48
C277S	2	2,0	9	34	69	61	49

Exemplo 16

Produção De Ácido Peracético Utilizando Per-Hidrolases [0228] Foram conduzidas reações (volume total de 100 ml) contendo triacetina (20 mM), peróxido de hidrogênio (10 mM) e de 0,1 μg/ml a 2,0 μg/ml de extrato celular tratado a quente de proteína (preparado conforme descrito acima, em que o tratamento a quente foi realizado a 85 °C por vinte minutos) em 10 mM de tampão bicarbonato de sódio (pH inicial 8,1) a 20 °C. A determinação da concentração de ácido peracético nas misturas de reação foi realizada de acordo com o método descrito por Karst et al, acima. As concentrações de ácido peracético produzidas em 1 min, 5 min, 20 min, 40 min e 60 min encontram-se relacionadas na Tabela 9.

Tabela 9

Dependência Da Concentração De Ácido Peracético (Paa) Da Concentração De Per-Hidrolase Em Reações Que Contêm Triacetina (20

Proteína De E. Coli Klp18/Psw228 (Per-Hidrolase Do Tipo Selvagem De

Thermotoga Marítima) Ou E. Coli Klp18/Psw228/C277s (Variante C277s De

Per-Hidrolase De Thermotoga Marítima) (Reações Duplicadas)

per-hidrolase de Thermotoga maritima	triacetina (mM)	Concentração de enzimas (Mg/ml)	PAA, 1 min (ppm)	PAA, 5 min (ppm)	PAA, 20 min (ppm)	PAA, 40 min (ppm)	PAA, 60 min (ppm)
sem enzima	20	0	2	3	3	7	9
tipo selvagem	20	0,2	3	10	15	27	35

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per-hidrolase de Thermotoga maritima	triacetina (mM)	Concentração de enzimas (pg/ml)	PAA, 1 min (ppm)	PAA, 5 min (ppm)	PAA, 20 min (ppm)	PAA, 40 min (ppm)	PAA, 60 min (ppm)
tipo selvagem	20	0,2	4	9	19	32	41
tipo selvagem	20	0,5	3	9	21	39	52
tipo selvagem	20	0,5	3	8	22	39	54
tipo selvagem	20	1,0	4	13	35	62	82
tipo selvagem	20	1,0	4	12	37	67
tipo selvagem	20	2,0	9	20	52	91	122
tipo selvagem	20	2,0	10	20	52	87	114
C277S	20	0,2	7	16	67	109	148
C277S	20	0,2	9	24	67	112	144
C277S	20	0,5	16	43	140	202	260
C277S	20	0,5	17	48	148	228	272
C277S	20	1,0	24	75	230	289	353
C277S	20	1,0	26	97	232	297	372
C277S	20	2,0	32	130	318	402	443
C277S	20	2,0	37	135	323	401	430

Exemplo 17

Produção De Ácido Peracético Utilizando Per-Hidrolases [0229] Foram conduzidas reações (volume total de 40 ml) a 25 °C em tampão de fosfato (50 mM, pH 7,2) que contém triacetina (100 mM), peróxido de hidrogênio (100 mM) e de 10 pg/ml a 50 pg/ml de per-hidrolases do tipo selvagem ou variante C277 de T. maritima ou T. neapolitana tratada a quente (na forma de extrato celular de proteína tratado a quente preparado conforme descrito acima, em que o tratamento a quente foi realizado a 75 °C por vinte minutos). As reações foram agitadas apenas pelos primeiros trinta segundos de reação para misturar inicialmente os reagentes e a enzima. A determinação da concentração de ácido peracético nas misturas de reação foi realizada de acordo com o método descrito por Karst et al, acima. As concentrações de ácido peracético produzidas em 1 min, 5 min e 30 min encontram-se relacionadas na Tabela 10.

Petição 870180025150, de 28/03/2018, pág. 116/125

106/111

Tabela 10

Produção De Ácido Peracético (Paa) Em Reações Que Contêm Triacetina (100 Mm) E Peróxido De Hidrogênio (100 Mm) Em Tampão De Fosfato (50 Mm,

Ph 7,2) A 25 °C, Utilizando Per-Hidrolases Do Tipo Selvagem Ou Mutantes

C277 De T. Neapolitana Ou T. Marítima Tratadas A Quente.

per-hidrolase	triacetina (mM)	H2O2 (mM)	Concentração de enzimas (Mg/ml)	PAA, 1 min (ppm)	PAA, 5 min (ppm)	PAA, 30 min (ppm)
sem enzima	100	100	0	63	54	80
T. marítima tipo selvagem	100	100	50	529	1790	3785
T. marítima C277S	100	100	10	979	3241	4635
T. maritima C277T	100	100	10	933	2882	3527
T. maritima C277A	100	100	10	442	2018	2485
T. maritima C277V	100	100	10	577	1931	2278
T. neapolitana tipo selvagem	100	100	50	514	1837	3850
T. neapolitana C277S	100	100	10	606	2237	4609
T. neapolitana C277T	100	100	10	634	2198	3918
T. neapolitana C277A	100	100	12.5	516	2041	3735
T. neapolitana C277V	100	100	12.5	451	1813	2758

Exemplo 18

Produção de ácido peracético utilizando per-hidrolases [0230] Foram conduzidas reações (volume total de 10 ml) a 25 °C em tampão de bicarbonato de sódio (1 mM, pH inicial 6,0) que contém triacetina (100 mM ou 150 mM), peróxido de hidrogênio (100 mM, 250 mM ou 420 mM) e per-hidrolases do tipo selvagem ou variante C277S ou C277T de T. marítima ou T. neapolitana tratadas a quente (na forma de proteína de extrato celular tratada a quente preparada conforme descrito acima, em que o tratamento a quente foi realizado a 75 °C por vinte minutos; concentrações conforme relacionado na Tabela 11). Reações conduzidas utilizando 420 mM de peróxido de hidrogênio continham adicionalmente 500 ppm de TURPINAL® SL. As reações foram agitadas apenas pelos primeiros trinta segundos de reação para misturar inicialmente os reagentes e a enzima. A determinação da concentração de ácido peracético nas misturas de reação foi realizada de

Petição 870180025150, de 28/03/2018, pág. 117/125

107/111 acordo com o método descrito por Karst et al, acima. As concentrações de ácido peracético produzidas em 1 min, 5 min e 30 min encontram-se relacionadas na Tabela 11.

Tabela 11

Produção De Ácido Peracético (Paa) Em Reações Que Contêm Triacetina E

Peróxido De Hidrogênio Em Tampão De Bicarbonato (1 Mm Sob ph 6,0 Ou

100 Mm Sob pH 8,1) Ou Em Água Deionizada (ph 5,0) A 25 °C, Utilizando PerHidrolases Do Tipo Selvagem Ou Variantes C277s Ou C277t De T. Maritima.

per-hidrolase de Thermotoga maritima	triacetina (mM)	H2O2 (mM)	tampão NaHCO3	Concentração de enzimas (pg/ml)	PAA, 1 min (ppm)	PAA, 5 min (ppm)	PAA, 30 min (ppm)
sem enzima	100	100	1,0	0	28	78	141
tipo selvagem	100	100	1,0	75	434	494	608
tipo selvagem	100	100	1,0	100	449	667	643
C277S	100	100	1,0	15	989	1554	1476
C277S	100	100	1,0	20	1301	2139	2131
C277T	100	100	1,0	15	1062	1513	1393
C277T	100	100	1,0	20	996	1430	1516
sem enzima	100	250	0	0	13	71	71
tipo selvagem	100	250	0	75	512	535	533
tipo selvagem	100	250	0	100	576	668	654
C277S	100	250	0	15	653	671	675
C277S	100	250	0	20	943	927	903
C277T	100	250	0	15	717	711	765
C277T	100	250	0	20	730	755	743
sem enzima	150	420	100	0	417	810	848
tipo selvagem	150	420	100	500	6303	8627	9237
C277S	150	420	100	100	7822	10349	10197

Exemplo 19

Per-Hidrólise De Diacetato De Propileno Glicol Ou Diacetato De Etileno

Glicol Utilizando Per-Hidrolases Do Tipo Selvagem E Variantes De T.

Marítima Ε T. Neapolitana [0231] Extratos celulares de transformadores que expressam perhidrolase do tipo selvagem de Thermotoga neapolitana (KLP18/pSW196), perhidrolase variante C277S de Thermotoga neapolitana (KLP18/pSW196/C277S), per-hidrolase variante C277T de Thermotoga neapolitana

Petição 870180025150, de 28/03/2018, pág. 118/125

108/111 (KLP18/pSW196/C277T), per-hidrolase do tipo selvagem de Thermotoga maritima (KLP18/pSW228), per-hidrolase variante C277S de Thermotoga maritima (KLP1 8/pSW228/C277S) e per-hidrolase variante C277 de Thermotoga maritima (KLP18/pSW228/C277T) foram preparados por meio de passagem de uma suspensão de pasta celular (20% em peso de células úmidas) em 0,05 M de tampão fosfato de potássio (pH 7,0) contendo ditiotreitol (1 mM) duas vezes através de uma prensa francesa que possui pressão de trabalho de 16.000 psi (cerca de 110 MPa). As células lisadas foram centrifugadas por trinta minutos a 12.000 x g, produzindo um extrato celular clarificado que foi testado para determinar a proteína solúvel total (teste de Bradford). O sobrenadante foi aquecido a 75 °C por vinte minutos, seguido por resfriamento em um banho de gelo por dois minutos. Proteína precipitada foi removida por meio de centrifugação por dez minutos a 11.000 x g. SDS-PAGE do sobrenadante de extrato tratado a quente de proteína resultante indicou que a enzima CE-7 compreendeu cerca de 85 a 90% do total de proteína na preparação. O sobrenadante de proteína de extrato tratado a quente foi congelado em gelo seco e armazenado a -80 °C até o uso.

[0232] Um primeiro conjunto de reações (volume total de 10 ml) foi conduzido a 20 °C em 10 mM de tampão bicarbonato de sódio (pH inicial

8,1) contendo diacetato de propileno glicol (PGDA) ou diacetato de etileno glicol (EGDA) (100 mM), peróxido de hidrogênio (100 mM) e 25 pg/ml de extrato de proteína tratado a quente de um dentre E. coli KLP18/pSW196 (perhidrolase do tipo selvagem de Thermotoga neapolitana), E. coli KLP18/pSW196/C277S (per-hidrolase variante de Thermotoga neapolitana C277S), E. coli KLP18/pSW196/C277T (per-hidrolase variante de Thermotoga neapolitana C277T), E. coli KLP18/pSW228 (per-hidrolase do tipo selvagem de Thermotoga maritima), E. coli KLP1 8/pSW228/C277S (per-hidrolase variante de Thermotoga maritima C277S) e E. coli KLP18/pSW228/C277T (perPetição 870180025150, de 28/03/2018, pág. 119/125

109/111 hidrolase variante de Thermotoga maritima C277T) (preparados conforme descrito acima). Uma reação de controle para cada condição de reação foi conduzida para determinar a concentração de ácido peracético produzida por meio de per-hidrólise química de triacetina por peróxido de hidrogênio na ausência de adição de extrato de proteína. As reações foram amostradas após um, cinco e trinta minutos e as amostras, analisadas para determinação de ácido peracético utilizando o protocolo de derivação Karst (Karst et al, acima) e método analítico de HPLC (acima). As concentrações de ácido peracético produzidas em 1 min, 5 min e 30 min encontram-se relacionadas na Tabela 12.

Tabela 12

Concentração De Ácido Peracético (Paa) Produzida Utilizando PerHidrolases Do Tipo Selvagem E Variantes De T. Maritima E T. Neapolitana

Em Reações A 20 °C Em Tampão Bicarbonato De Sódio (10 Mm, pH Inicial

8,1) Contendo Diacetato De Propileno Glicol (Pgda) (100 Mm) Ou Diacetato De Etileno Glicol (Egda) (100 Mm), Peróxido De Hidrogênio (100

Mm) E 25 mG/Ml De Extrato De Proteína Tratado A Quente.

per-hidrolase	Substrato	conc. de substrato (mM)	H2O2 (mM)	PAA, 1 min (ppm)	PAA, 5 min (ppm)	PAA, 30 min (ppm)
sem enzima (controle)	PGDA	100	100	0	15	165
T. maritima WT	PGDA	100	100	534	1104	1695
T. maritima C277S	PGDA	100	100	647	1320	1864
T. maritima C277T	PGDA	100	100	656	1174	1418
T. neapolitana WT	PGDA	100	100	513	1052	1946
T. neapolitana C277S	PGDA	100	100	875	1327	1707
T. neapolitana C277T	PGDA	100	100	724	1325	1864
sem enzima (controle)	EGDA	100	100	0	70	229
T. maritima WT	EGDA	100	100	765	1182	1595
T. maritima C277S	EGDA	100	100	725	1240	1724
T. maritima C277T	EGDA	100	100	802	1218	1734
T. neapolitana WT	EGDA	100	100	603	1132	1643
T. neapolitana C277S	EGDA	100	100	680	1305	1698
T. neapolitana C277T	EGDA	100	100	688	1164	1261

[0233] Um segundo conjunto de reações (volume total de 10 ml) foi conduzido a 20 °C em 10 mM de tampão bicarbonato de sódio (pH inicial

Petição 870180025150, de 28/03/2018, pág. 120/125

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8,1) contendo diacetato de propileno glicol (PGDA) ou diacetato de etileno glicol (EGDA) (2 mM), peróxido de hidrogênio (10 mM) e 10 μg/ml de extrato de proteína tratado a quente de um dentre E. coli KLP18/pSW196 (per-hidrolase do tipo selvagem de Thermotoga neapolitana), E. coli KLP18/pSW196/C277S (per-hidrolase variante de Thermotoga neapolitana C277S), E. coli KLP18/pSW196/C277T (per-hidrolase variante de Thermotoga neapolitana C277T), E. coli KLP18/pSW228 (per-hidrolase do tipo selvagem de Thermotoga maritima), E. coli KLP18/pSW228/C277S (per-hidrolase variante de Thermotoga maritima C277S) e E. coli KLP18/pSW228/C277T (per-hidrolase variante de Thermotoga maritima C277T) (preparados conforme descrito acima). Uma reação de controle para cada condição de reação foi conduzida para determinar a concentração de ácido peracético produzida por meio de perhidrólise química de triacetina por peróxido de hidrogênio na ausência de adição de extrato de proteína. As reações foram amostradas após cinco minutos e as amostras, analisadas para determinação de ácido peracético utilizando o protocolo de derivação Karst (Karst et al, acima) e método analítico de HPLC (acima). As concentrações de ácido peracético produzidas em cinco minutos encontram-se relacionadas na Tabela 13.

Tabela 13

Concentração De Ácido Peracético (Paa) Produzida Utilizando PerHidrolases Do Tipo Selvagem E Variantes De T. Marítima E T. Neapolitana

Em Reações A 20 °C Em Tampão Bicarbonato De Sódio (10 Mm, pH Inicial

8,1) Contendo Diacetato De Propileno Glicol (Pgda) (2 Mm) Ou Diacetato

De Etileno Glicol (Egda) (2 Mm), Peróxido De Hidrogênio (10 Mm) E 10 uq/mL De Extrato De Proteína Tratado A Quente.

per-hidrolase conc. de

Substrato substrato (mM)

H2O2 ₆ ^PAA (mM) ^{5 min (ppm)} sem enzima (controle) T. maritima WT

PGDA 2 10 3,6

PGDA 2 10 5,0

Petição 870180025150, de 28/03/2018, pág. 121/125

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per-hidrolase	Substrato	conc. de substrato (mM)	H2O2 (mM)	PAA, 5 min (ppm)
T. maritima C277S	PGDA	2	10	7,2
T. maritima C277T	PGDA	2	10	7,9
T. neapolitana WT	PGDA	2	10	5,7
T. neapolitana C277S	PGDA	2	10	7,9
T. neapolitana C277T	PGDA	2	10	3,9
sem enzima (controle)	EGDA	2	10	3,3
T. maritima WT	EGDA	2	10	9,9
T. maritima C277S	EGDA	2	10	13,6
T. maritima C277T	EGDA	2	10	22,9
T. neapolitana WT	EGDA	2	10	6,6
T. neapolitana C277S	EGDA	2	10	18,4
T. neapolitana C277T	EGDA	2	10	20,2

Petição 870180025150, de 28/03/2018, pág. 122/125

1/1

Claims

Reivindicações

1. POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, que codifica um polipeptídeo que possui atividade de per-hidrólise, caracterizado por consistir nas SEQ ID NO: 1,2, 3 ou 4.
2. VETOR, caracterizado por compreender o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 1.
3. CONSTRUÇÃO DE DNA RECOMBINANTE, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 1, ligado operavelmente a uma sequência reguladora.
4. CÉLULA HOSPEDEIRA DE MICRO-ORGANISMO, caracterizada por compreender a construção de DNA recombinante, conforme definida na reivindicação 3.
5. MÉTODO DE TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS, caracterizado por compreender a transformação de uma célula com o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 1.
6. POLIPEPTÍDEO ISOLADO, que possui atividade de perhidrólise e é classificado estruturalmente como uma enzima da família das carboidrato esterases 7, caracterizado por consisir na SEQ ID NO: 5, desde que o resíduo de aminácido 277 da SEQ ID NO: 5 seja selecionado a partir do grupo que consiste em serina, treonina, valina e alanina.

Petição 870180025150, de 28/03/2018, pág. 123/125

1/3

SEQ ID NO:32 1 MAFFDMPLEELKKYRPERYEEKDFDEFWRETLKESEGFPLDPVFEKVDFH 50

SEQ ID NO:36 1 MAFFDLPLEELKKYRPERYEEKDFDEFWEETLAESEKFPLDPVFERMESH 50

SEQ ID NO:32 51 LKTVETYDVTFSGYRGQRIKGWLLVPKLAEEKLPCWQYIGYNGGRGFPH 100

SEQ ID NO:36 51 LKTVEAYDVTFSGYRGQRIKGWLLVPKLEEEKLPCWQYIGYNGGRGFPH 100 ***** . ********************** *♦********♦*♦***★★★*★

SEQ ID NO:32 101 DWLFWPSMGYICFVMDTRGQGSGWMKGDTPDYPEGPVDPQYPGFMTRGIL 150 SEQ ID NO:36 101 DWLFWPSMGYICFVMDTRGQGSGWLKGDTPDYPEGPVDPQYPGFMTRGIL 150 ★ · *************************

SEQ ID NO:32 151 DPGTYYYRRVFVDAVRAVEAAISFPRVDSRKVWAGGSQGGGIALAVSAL 200 SEQ ID NO:36 151 DPRTYYYRRVFTDAVRAVEAAASFPQVDQERIVIAGGSQGGGIALAVSAL 200 ** ******** ********* ***.»* . . *.****************

SEQ ID NO:32 201 SNRVKALLCDVPFLCHFRRAVQLVDTHPYVEITNFLKTHRDKEEIVFRTL 250 SEQ ID NO:36 201 SKKAKALLCDVPFLCHFRRAVQLVDTHPYAEITNFLKTHRDKEEIVFRTL 250 ★ . ************************* *★★***★★*★·**★*******

SEQ ID NO:32 251 SYFDGVNFAARAKVPALFSVGLMDTICPPSTVFAAYNHYAGPKEIRIYPY 300 SEQ ID NO:36 251 SYFDGVNFAARAKIPALFSVGLMDNICPPSTVFAAYNYYAGPKEIRIYPY 300 *************.**********.************ ************

SEQ ID NO:32 301 NNHEGGGSFQAIEQVKFLKRLFEEG 325

SEQ ID NO:36 301 NNHEGGGSFQAVEQVKFLKKLFEKG 325