JP2012504418A - 多成分過酸発生システム - Google Patents
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- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Abstract
Description
本出願は、それらのそれぞれが全体を本明細書に参照により援用される、それぞれ2008年10月3日出願の、米国仮特許出願第61/102,505号明細書、同第61/102,512号明細書、同第61/102,514号明細書、同第61/102,520号明細書、同第61/102,531号明細書、および同第61/102,539号明細書の優先権を主張するものである。
第1成分が、
(i)(a)過加水分解活性を有する少なくとも1つの酵素触媒であって、前記酵素触媒がCLUSTALWを用いて配列番号1と一致する炭水化物エステラーゼ族7(CE−7)シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、前記シグネチャーモチーフが、
(1)配列番号1の118〜120と一致するアミノ酸位置にRGQモチーフ;
(2)配列番号1の179〜183と一致するアミノ酸位置にGXSQGモチーフ;および
(3)配列番号1の298〜299と一致するアミノ酸位置にHEモチーフ
を含み;
前記酵素が配列番号1と少なくとも30%アミノ酸同一性を含む
酵素触媒;ならびに
(b)少なくとも1つの賦形剤
の調合物を含む酵素粉末;
(ii)(a)構造
[X]mR5
(式中、
Xは、式R6C(O)Oのエステル基であり;
R6は、ヒドロキシル基またはC1〜C4アルコキシ基で任意選択的に置換された、C1〜C7の線状、分岐または環式ヒドロカルビル部分であり、ここで、R6は、R6がC2〜C7である場合に1つ以上のエーテル結合を任意選択的に含み;
R5は、ヒドロキシル基で任意選択的に置換されたC1〜C6の線状、分岐または環式ヒドロカルビル部分であり、ここで、R5中の各炭素原子は個別に、1つ以下のヒドロキシル基または1つ以下のエステル基を含み、かつ、R5は1つ以上のエーテル結合を任意選択的に含み;
mは、1からR5中の炭素原子の数までである)
を有する1つ以上のエステルであって、
25℃で少なくとも5ppmの水への溶解度を有する1つ以上のエステル;
(b)構造
を有する1つ以上のグリセリド;
(c)式
の1つ以上のエステル;
(d)1つ以上のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類、もしくはアセチル化多糖類;ならびに
(e)(a)〜(d)の任意の組み合わせ
からなる群から選択されるカルボン酸エステル基質であって、
第1成分中のカルボン酸エステル基質の量が、第1および第2成分を組み合わせることによって形成される反応調合物中で0.5重量%〜10重量%の最終濃度を提供するように設計されるカルボン酸エステル基質;
(iii)重炭酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、ピロリン酸塩、メチルホスホン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、およびマレイン酸塩からなる群から選択される緩衝剤;
(iv)トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールブチルエーテル、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、1,2−プロパンジオール、N−エチル−2−ピロリジノン、イソプロパノール、エタノール、乳酸エチル、1,3−プロパンジオール、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共溶媒;ならびに
(v)任意選択的に少なくとも1つの界面活性剤
を含み;
第2成分が、水、過酸化水素および過酸化水素安定剤を含む
システムが提供される。
(i)(a)過加水分解活性を有する少なくとも1つのCE−7酵素であって、配列番号6、配列番号7、配列番号19および配列番号20からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号6、配列番号7、配列番号19もしくは配列番号20と実質的に類似のアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCE−7酵素;および
(b)少なくとも1つの賦形剤
の調合物を含む酵素粉末;
(ii)モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるカルボン酸エステル基質であって、第1成分中のカルボン酸エステル基質の量が、第1および第2成分を組み合わせることによって形成される反応調合物中で0.5重量%〜10重量%の最終濃度を提供するように設計されるカルボン酸エステル基質;
(iii)重炭酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、ピロリン酸塩、メチルホスホン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、およびマレイン酸塩からなる群から選択される緩衝剤;
(iv)トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールブチルエーテル、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、1,2−プロパンジオール、N−エチル−2−ピロリジノン、イソプロパノール、エタノール、乳酸エチル、1,3−プロパンジオール、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共溶媒;ならびに
(v)任意選択的に少なくとも1つの界面活性剤
を含み;
第2成分が、水、過酸化水素および過酸化水素安定剤を含む
システムが提供される。
(i)少なくとも1つのCE−7酵素が、配列番号6、配列番号7、配列番号19および配列番号20からなる群から選択されるアミノ酸配列であって、配列番号19または配列番号20のアミノ酸残基277が、アラニン、バリン、セリン、およびスレオニンからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み;
(ii)カルボン酸エステル基質がトリアセチンであり、ここで、第1成分中のトリアセチンの量が、第1および第2成分を組み合わせることによって形成される反応調合物中で0.5重量%〜10重量%の最終濃度を提供するように設計されるトリアセチンであり;
(iii)緩衝剤が第1成分の約0.1重量%〜約10重量%の濃度にあり;前記緩衝剤が、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、重炭酸ナトリウムと重炭酸カリウムとの混合物、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、およびリン酸ナトリウムとリン酸カリウムとの混合物からなる群から選択され;
(iv)共溶媒がトリプロピレングリコールメチルエーテルであり、第1成分の80重量%以下の濃度にあり;
(v)界面活性剤が存在し、polysorbate 80であり;そして
(vi)第2成分中の過酸化水素が、第1および第2成分を組み合わせることによって形成される反応調合物中で0.33重量%〜約30重量%の最終濃度を提供する量で存在する
多成分ペルオキシカルボン酸発生システムが提供される。
(a)第1および第2成分を混合するための手段を用い、それによって過酢酸を含む水性調合物が生成する工程と;
(b)(a)で生成した過酢酸を含む水性調合物を、漂白、汚れ除去、臭い低減、殺菌、消毒、またはそれらの組み合わせのために表面、衣料品もしくは織物に適用する工程とを含む、多成分ペルオキシカルボン酸発生システムの使用方法が提供される。
以下の配列は、37C.F.R.§§1.821−1.825(「Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures−the Sequence Rules」)に従っており、World Intellectual Property Organization(WIPO)Standard ST.25(1998)およびEuropean Patent Convention(EPC)およびPatent Cooperation Treaty(PCT)Rules 5.2 and 49.5(a−bis)の配列表規定、ならびにAdministrative InstructionsのSection 208およびAnnex Cと一致している。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データについて用いられる記号およびフォーマットは、37C.F.R.§1.822に記述されている規則に従う。
からのアセチルキシランエステラーゼ遺伝子を増幅するために使用される順方向プライマーである。
(a)構造
[X]mR5
(式中、
Xは、式R6C(O)Oのエステル基であり;
R6は、ヒドロキシル基またはC1〜C4アルコキシ基で任意選択的に置換された、C1〜C7の線状、分岐または環式ヒドロカルビル部分であり、ここで、R6は、R6がC2〜C7である場合には1つ以上のエーテル結合を任意選択的に含み;
R5は、ヒドロキシル基で任意選択的に置換されたC1〜C6の線状、分岐または環式ヒドロカルビル部分であり、ここで、R5中の各炭素原子は個別に、1つ以下のヒドロキシル基または1つ以下のエステル基を含み、かつ、R5は1つ以上のエーテル結合を任意選択的に含み;
mは、1からR5中の炭素原子の数までである)
を有する1つ以上のエステルであって、
25℃で少なくとも5ppmの水への溶解度を有するエステル;または
(b)構造
を有する1つ以上のグリセリド;または
(c)式
1つ以上のエステル;または
(d)1つ以上のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類、もしくはアセチル化多糖類;または
(e)(a)〜(d)の任意の組み合わせ
を意味する。
Culture Collection(ATCC)に預託されたクロストリジウム・サーモセラム(Clostridium thermocellum)の菌株を意味する。C.サーモセラム(C.thermocellum)ATCC(登録商標)27405TMからのペルヒドロラーゼ活性を有する酵素のアミノ酸配列は、配列番号5として提供される。
1.小さな脂肪族の、非極性または僅かに極性の残基:Ala、Ser、Thr(Pro、Gly);
2.極性の、負に帯電した残基およびそれらのアミド:Asp、Asn、Glu、Gln;
3.極性の、正に帯電した残基:His、Arg、Lys;
4.大きな脂肪族の、非極性残基:Met、Leu、Ile、Val(Cys);ならびに
5.大きな芳香族残基:Phe、Tyr、およびTrp。
a)Arg118−Gly119−Gln120;
b)Gly179−Xaa180−Ser181−Gln182−Gly183;および
c)His298−Glu299。
Leu267−Xaa268−Asp269
と定義される第4の保存モチーフが含まれる。
ペルオキシカルボン酸は非常によく反応し、一般に時間とともに濃度が低下する。これは、多くの場合長期安定性を欠く市販の予め形成されたペルオキシカルボン酸組成物についてとりわけ真実である。予め形成されたペルオキシカルボン酸の水溶液はまた、とりわけ大きいコンテナおよび/または高濃度のペルオキシカルボン酸溶液をより長い距離にわたって輸送するときに、ハンドリングおよび/または輸送困難性を提示する可能性がある。さらに、予め形成されたペルオキシカルボン酸溶液は、特定の目標用途向けに所望濃度のペルオキシカルボン酸を提供することができない可能性がある。従って、とりわけ液体調合物について、様々な反応成分を別々に保つことが非常に望ましい。
一実施形態では、多成分発生システムは、CE−7酵素として構造上分類され、過加水分解活性を有する少なくとも1つの酵素と少なくとも1つの賦形剤との調合物を含む酵素粉末を含む。一実施形態では、酵素粉末は噴霧乾燥によって形成される(すなわち、噴霧乾燥調合物である)。一実施形態では、賦形剤は、酵素粉末の約95重量%〜約25重量%の範囲の量で酵素粉末中に存在する。さらなる態様では、賦形剤はオリゴ糖賦形剤である。さらなる態様では、オリゴ糖賦形剤は、少なくとも約1250の数平均分子量および少なくとも約9000の重量平均分子量を有し、任意選択的に少なくとも1つの界面活性剤を有する。
るアミノ酸配列を含む。
本発明の一態様では、過加水分解活性を有する酵素触媒の存在下に、カルボン酸エステルを、(過酸化水素、過ホウ酸ナトリウムまたは過炭酸ナトリウムを含むが、それらに限定されない)過酸素源と反応させることによってペルオキシカルボン酸を含む水性調合物を生成するための方法が提供される。一実施形態では、酵素触媒は、過加水分解活性を有する少なくとも1つの酵素であって、CE−7炭水化物エステラーゼ族(CE−7;Coutinho,P.M.およびHenrissat,B.、上記を参照)のメンバーとして構造上分類される酵素を含む。別の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、セファロスポリンCデアセチラーゼとして構造上分類される。別の実施形態では、ペルヒドロラーゼ触媒は、アセチルキシランエステラーゼとして構造上分類される。
a)アミノ酸残基118〜120でRGQモチーフ;
b)アミノ酸残基179〜183でGXSQGモチーフ;および
c)CLUSTALWを用いて基準配列の配列番号1に整列させられるときにアミノ酸残基298〜299にHEモチーフ
を含むシグネチャーモチーフとを有する酵素を含む。
(a)構造
[X]mR5
(式中、
Xは、式R6C(O)Oのエステル基であり;
R6は、ヒドロキシル基またはC1〜C4アルコキシ基で任意選択的に置換された、C1〜C7の線状、分岐または環式ヒドロカルビル部分であり、ここで、R6は、R6がC2〜C7である場合に1つ以上のエーテル結合を任意選択的に含み;
R5は、ヒドロキシル基で任意選択的に置換されたC1〜C6の線状、分岐または環式ヒドロカルビル部分であり、ここで、R5中の各炭素原子は個別に、1つ以下のヒドロキシル基または1つ以下のエステル基を含み、かつ、R5は1つ以上のエーテル結合を任意選択的に含み;
mは、1からR5中の炭素原子の数までである)
を有する1つ以上のエステルであって、
25℃で少なくとも5ppmの水への溶解度を有するエステル;または
(b)構造
を有する1つ以上のグリセリド;または
(c)式
の1つ以上のエステル;または
(d)1つ以上のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類、もしくはアセチル化多糖類;または
(e)(a)〜(d)の任意の組み合わせ
が含まれてもよい。
セファロスポリンCデアセチラーゼ(E.C.3.1.1.41;系統名セファロスポリンCアセチルヒドロラーゼ;CAH)は、セファロスポリンC、7−アミノセファロスポラン酸、および7−(チオフェン−2−アセトアミド)セファロスポラン酸などのセファロスポリン上に結合したアセチルエステルを加水分解する能力を有する酵素である。Abbott,B.and Fukuda,D.,Appl.Microbiol.30(3):413−419(1975))。CAHは、炭水化物エステラーゼ族7と言われる構造上関連したより大きい族の酵素に属する(CE−7;Coutinho,P.M.,Henrissat,B.、上記を参照)。
滴定、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、ガスクロマトグラフィー(GC)、質量分析法(MS)、キャピラリー電気泳動法(CE)、U.Karst et al.によって記載されている分析手順(Anal.Chem.、69(17):3623−3627(1997))、および本実施例に記載されるような2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン)−6−スルホネート(ABTS)アッセイ(S.Minning,et al.、Analytica Chimica Acta 378:293−298(1999)および国際公開第2004/058961 A1号パンフレット)を含むが、それらに限定されない様々な分析方法を、反応剤および生成物を分析するために本方法に用いることができる。
J.Gabrielson、et al.によって記載されている方法(J.Microbiol.Methods 50:63−73(2002))を、ペルオキシカルボン酸の、または過酸化水素および酵素基質の最低殺生濃度(MBC)の測定のために用いることができる。このアッセイ方法は、XTT還元阻害に基づいており、ここで、XTT((2,3−ビス[2−メトキシ−4−ニトロ−5−スルホフェニル]−5−[(フェニルアミノ)カルボニル]−2H−テトラゾリウム、分子内塩、モノナトリウム塩)は、490nmまたは450nmで測定される光学密度(OD)の変化によって微生物呼吸活性を示すレドックス染料である。しかしながら、生存プレートカウント、直接顕微鏡カウント、乾燥重量、濁度測定、吸光度、およびバイオルミネセンス(例えば、Brock,Semour S.,Disinfection,Sterilization,and Preservation,5th edition,Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia,PA,USA;2001を参照されたい)を含むが、それらに限定されない、消毒剤および防腐剤の活性を試験するために利用可能な様々な他の方法がある。
本方法に従って生成した酵素触媒発生ペルオキシカルボン酸は、医療機器(例えば、内視鏡)、織物(例えば、衣料品、衣服、カーペット)、食品調理表面、食品貯蔵および食品包装設備、食品の包装のために使用される材料、鶏孵化場および養鶏設備、動物囲い地、ならびに微生物および/または殺ウィルス活性を有する使用済みプロセス廃水の除染などの、生物学的汚染物質の濃度の低減のための様々な硬表面/無生物物体用途に使用することができる。酵素発生ペルオキシカルボン酸は、殺生物活性をさらに提供するためにプリオン(例えば、ある種のプロテアーゼ)を不活性化するように設計された調合物に使用されてもよい。好ましい態様では、本ペルオキシカルボン酸組成物は特に、オートクレーブ処理できない医療機器および食品包装設備用の消毒剤として有用である。本ペルオキシカルボン酸含有調合物はGRASまたは食品グレード成分(酵素、酵素基質、過酸化水素、および緩衝剤)を使用して調製できるので、本酵素発生ペルオキシカルボン酸はまた、動物死骸、肉、果物および野菜の除染のために、または調理食品の除染のために使用されてもよい。本酵素発生ペルオキシカルボン酸は、その最終形態が粉末、液体、ゲル、フィルム、固体またはエアゾールである製品へ組み込まれてもよい。本酵素発生ペルオキシカルボン酸は、有効な除染を依然として提供する濃度に希釈されてもよい。
インスタント配列の遺伝子および遺伝子生成物は、異種宿主細胞で、特に微生物宿主の細胞で生産されてもよい。インスタント遺伝子および核酸分子の発現のための好ましい異種宿主細胞は、真菌類またはバクテリア族内に見いだすことができ、かつ、広範囲の温度、pH値、および溶媒耐性にわたって増殖する微生物宿主である。例えば、バクテリア、酵母、および糸状菌のいずれかが本核酸分子の発現を好適にホストする可能性があると考えられる。ペルヒドロラーゼは、細胞内に、細胞外に、または細胞内および細胞外の両方の組み合わせで発現されてもよく、ここで、細胞外発現は、発酵生成物から所望のタンパク質の回収を、細胞内発現によって生産されるタンパク質の回収のための方法より容易なものにする。転写、トランスレーションおよびタンパク質生合成装置は、細胞バイオマスを発生させるために使用される細胞供給原料に関連して変わらないままであり;機能性遺伝子はとにかく発現されるであろう。宿主菌株の例には、アスペルギルス属(Aspergillus)、トリコデルマ属(Trichoderma)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ピチア属(Pichia)、ファフィア属(Phaffia)、クルイベロマイセス属(Kluyveromyces)、カンジダ属(Candida)、ハンセヌラ(Hansenula)、ヤロワイヤ(Yarrowia)、サルモネラ(Salmonella)、バチルス属(Bacillus)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、ジモモナス属(Zymomonas)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、エリスロバクター属(Erythrobacter)、クロロビウム属(Chlorobium)、クロマチウム(Chromatium)、フラボバクテリウム属(Flavobacterium)、サイトファガ(Cytophaga)、ロドバクター属(Rhodobacter)、ロドコッカス属(Rhodococcus)、ストレプトミセス(Streptomyces)、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium)、コリネバクテリア(Corynebacteria)、マイコバクレリウム属(Mycobacterium)、ディノコックス(Deinococcus)、エシェリキア属(Escherichia)、エルヴィニア属(Erwinia)、パントエア(Pantoea)、シュードモナス(Pseudomonas)、スフィンゴモナス(Sphingomonas)、メチロモナス属(Methylomonas)、メチロバクター属(Methylobacter)、メチロコッカス属(Methylococcus)、メチロシナス属(Methylosinus)、メチロミクロビウム属(Methylomicrobium)、メチロシスチス属(Methylocystis)、アルカリゲネス属(Alcaligenes)、シネコシスティス属(Synechocystis)、シネココッカス属(Synechococcus)、アナベナ属(Anabaena)、チオバチルス属(Thiobacillus)、メタノバクテリウム(Methanobacterium)、クレブシエラ属(Klebsiella)、およびミキソコッカス属(Myxococcus)などのバクテリア種、真菌種または酵母種が挙げられるが、それらに限定されない。一実施形態では、バクテリア宿主菌株には、エシェリキア属(Escherichia)、バチルス属(Bacillus)、クルイベロマイセス属(Kluyveromyces)、およびシュードモナス(Pseudomonas)が含まれる。好ましい実施形態では、バクテリア宿主細胞は大腸菌(Escherichia coli)である。
様々な培養方法論がペルヒドロラーゼ触媒を製造するために適用されてもよい。例えば、組み換え微生物宿主から過剰発現された特有の遺伝子生成物の大規模生産は、回分、流加、および連続培養方法論によって生み出されてもよい。回分および流加培養法は当該技術分野で一般的であり、よく知られており、例は、Thomas D.Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,Second Edition,Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA(1989)およびDeshpande,Mukund V.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36:227(1992)に見いだされる可能性がある。
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために提供される。実施例に開示される技法が本発明の実施にうまく機能する技法に従っており、従ってその実施のための好ましいモードを構築すると考え得ることは、当業者によって十分理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を踏まえて、今開示される方法および実施例の精神および範囲から逸脱することなく多くの変更を開示される具体的な実施形態で行うことができ、同様のまたは類似の結果を依然とし得ることを十分理解するべきである。
katGカタラーゼ崩壊大腸菌(E.coli)菌株の構築
カナマイシン耐性遺伝子(kan;配列番号26)のコーディング領域を、配列番号30として同定されるPCR生成物を発生させるために配列番号28および配列番号29として同定されるプライマーを使用してPCR(94℃で0.5分、55℃で0.5分、70℃で1分、30サイクル)によってプラスミドpKD13(配列番号27)から増幅した。katG核酸配列は配列番号31として提供され、相当するアミノ酸配列は配列番号32である。大腸菌(E.coli)MG1655(ATCC(登録商標)47076TM)を、λ−Redリコンビナーゼ遺伝子(Datsenko and Wanner,(2000),PNAS USA 97:6640−6645)を含有する、温度感受性プラスミドpKD46(配列番号33)で形質転換し、30℃で24時間LB−ampプレート上で選択した。MG1655/pKD46を、エレクトロポレーション(BioRad Gene Pulser、0.2cmキュベット、2.5kV、200W、25μF)による50〜500ngのPCR生成物で形質転換し、37℃で24時間LB−kanプレート上で選択した。幾つかのコロニーをLB−kanプレート上へ筋状にし(streaked)、pKD46プラスミドを硬化させるために42℃で一晩培養した。コロニーを、kanR/ampSの表現型を確認するためにチェックした。ゲノムDNAを、PUREGENE(登録商標)DNA精製システム(Gentra Systems,Minneapolis,MN)を用いて幾つかのコロニーから単離し、配列番号34および配列番号35として同定されるプライマーを使用してkatG遺伝子の崩壊を確認するためにPCRによってチェックした。幾つかのkatG−崩壊菌株を、FLPリコンビナーゼを含有する、温度感受性プラスミドpCP20(配列番号36)で形質転換し、kan遺伝子を削除するために使用し、37℃で24時間LB−ampプレート上で選択した。幾つかのコロニーをLBプレート上へ筋状にし、pCP20プラスミドを硬化させるために42℃で一晩培養した。2つのコロニーを、kanS/ampSの表現型を確認するためにチェックし、MG1655 KatG1およびMG1655 KatG2と呼ぶ。
katEカタラーゼ崩壊大腸菌(E.coli)菌株の構築
カナマイシン耐性遺伝子(配列番号26)を、配列番号39として同定されるPCR生成物を発生させるために配列番号37および配列番号38として同定されるプライマーを使用してPCR(94℃で0.5分、55℃で0.5分、70℃で1分、30サイクル)によってプラスミドpKD13(配列番号27)から増幅した。katE核酸配列は配列番号40として提供され、相当するアミノ酸配列は配列番号41である。大腸菌(E.coli)MG1655(ATCC(登録商標)47076TM)を、λ−Redリコンビナーゼ遺伝子を含有する、温度感受性プラスミドpKD46(配列番号33)で形質転換し、30℃で24時間LB−ampプレート上で選択した。MG1655/pKD46を、エレクトロポレーション(BioRad Gene Pulser、0.2cmキュベット、2.5kV、200W、25μF)による50〜500ngのPCR生成物で形質転換し、37℃で24時間LB−kanプレート上で選択した。幾つかのコロニーをLB−kanプレート上へ筋状にし、pKD46プラスミドを硬化させるために42℃で一晩培養した。コロニーを、kanR/ampSの表現型を確認するためにチェックした。ゲノムDNAを、PUREGENE(登録商標)DNA精製システムを用いて幾つかのコロニーから単離し、配列番号42および配列番号43として同定されるプライマーを使用してkatE遺伝子の崩壊を確認するためにPCRによってチェックした。幾つかのkatE−崩壊菌株を、FLPリコンビナーゼを含有する、温度感受性プラスミドpCP20(配列番号36)で形質転換し、kan遺伝子を削除するために使用し、37℃で24時間LB−ampプレート上で選択した。幾つかのコロニーをLBプレート上へ筋状にし、pCP20プラスミドを硬化させるために42℃で一晩培養した。2つのコロニーを、kanS/ampSの表現型を確認するためにチェックし、MG1655 KatE1およびMG1655 KatE2と呼ぶ。
katGカタラーゼおよびkatEカタラーゼ崩壊大腸菌(E.coli)菌株(KLP18)の構築
カナマイシン耐性遺伝子(配列番号26)を、配列番号39として同定されるPCR生成物を発生させるために配列番号37および配列番号38として同定されるプライマーを使用してPCR(94℃で0.5分、55℃で0.5分、70℃で1分、30サイクル)によってプラスミドpKD13(配列番号27)から増幅した。大腸菌(E.coli)MG1655 KatG1(実施例1)を、λ−Redリコンビナーゼ遺伝子を含有する、温度感受性プラスミドpKD46(配列番号33)で形質転換し、30℃で24時間LB−ampプレート上で選択した。MG1655 KatG1/pKD46を、エレクトロポレーション(BioRad Gene Pulser、0.2cmキュベット、2.5kV、200W、25μF)による50〜500ngのPCR生成物で形質転換し、37℃で24時間LB−kanプレート上で選択した。幾つかのコロニーをLB−kanプレート上へ筋状にし、pKD46プラスミドを硬化させるために42℃で一晩培養した。コロニーを、kanR/ampSの表現型を確認するためにチェックした。ゲノムDNAを、PUREGENE(登録商標)DNA精製システムを用いて幾つかのコロニーから単離し、配列番号42および配列番号43として同定されるプライマーを使用してkatE遺伝子の崩壊を確認するためにPCRによってチェックした。幾つかのkatE−崩壊菌株(ΔkatE)を、FLPリコンビナーゼを含有する、温度感受性プラスミドpCP20(配列番号36)で形質転換し、kan遺伝子を削除するために使用し、37℃で24時間LB−ampプレート上で選択した。幾つかのコロニーをLBプレート上へ筋状にし、pCP20プラスミドを硬化させるために42℃で一晩培養した。2つのコロニーを、kanS/ampSの表現型を確認するためにチェックし、MG1655 KatG1KatE18.1およびMG1655 KatG1KatE23と呼ぶ。MG1655 KatG1KatE18.1は、大腸菌(E.coli)KLP18と称される。
サーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
GENBANK(登録商標)(登録番号AE000512;領域80481−81458;配列番号44)に報告されるようなサーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)からのアセチルキシランエステラーゼをエンコードする遺伝子のコーディング領域を、大腸菌(E.coli)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)での発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。遺伝子のコーディング領域をその後、配列番号45および配列番号46として同定されるプライマーを使用してPCR(94℃で0.5分、55℃で0.5分、70℃で1分、30サイクル)によって増幅した。生じた核酸生成物(配列番号47)を、pSW196として同定されるプラスミドを発生させるためにpTrcHis2−TOPO(登録商標)へサブクローン化した。プラスミドpSW196を使用して大腸菌(E.coli)KLP18(実施例3)を形質転換して菌株KLP18/pSW196を発生させた。KLP18/pSW196を、OD600nm=0.4〜0.5まで振盪しながら37℃でLB培地で増殖させ、その時点でIPTGを1mMの最終濃度まで添加し、培養を2〜3時間続行した。細胞を遠心分離によって収穫し、SDS−PAGEを、全可溶性タンパク質の20〜40%でペルヒドロラーゼの発現を確認するために行った。
サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)MSB8からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
GENBANK(登録商標)(登録#NP_227893.1;配列番号48)に報告されるようなサーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)MSB8からのアセチルキシランエステラーゼをエンコードする遺伝子のコーディング領域を合成した(DNA 2.0,Menlo Park.CA)。遺伝子のコーディング領域をその後、配列番号49および配列番号50として同定されるプライマーを使用してPCR(94℃で0.5分、55℃で0.5分、70℃で1分、30サイクル)によって増幅した。生じた核酸生成物(配列番号51)を制限酵素PstIおよびXbaIでカットし、pSW207として同定されるプラスミドを発生させるためにpUC19中のPstIおよびXbaIサイトの間でサブクローン化した。プラスミドpSW207を使用して大腸菌(E.coli)KLP18(実施例3)を形質転換してKLP18/pSW207として同定される菌株を発生させた。KLP18/pSW207を、OD600nm=0.4〜0.5まで振盪しながら37℃でLB培地で増殖させ、その時点でIPTGを1mMの最終濃度まで添加し、培養を2〜3時間続行した。細胞を遠心分離によって収穫し、SDS−PAGEを、全可溶性タンパク質の20〜40%でペルヒドロラーゼ酵素の発現を確認するために行った。
ペルヒドロラーゼを発現する大腸菌(E.coli)KLP18形質転換体の発酵
発酵槽種培養物を、酵母抽出物(Amberex 695、5.0g/L)、K2HPO4(10.0g/L)、KH2PO4(7.0g/L)、クエン酸ナトリウム二水和物(1.0g/L)、(NH4)2SO4(4.0g/L)、MgSO4七水和物(1.0g/L)およびクエン酸第二鉄アンモニウム(0.10g/L)を含有する0.5Lの種培地を2Lの振盪フラスコに装入することによって調製した。培地のpHを6.8に調整し、培地をフラスコ中で滅菌した。ポスト滅菌添加物は、グルコース(50重量%、10.0mL)および1mLアンピシリン(25mg/mL)原液を含んだ。種培地を、20%グリセロール中の大腸菌(E.coli)KLP18/pSW196または大腸菌(E.coli)KLP18/pSW207の1mL培養物で植菌し、35℃および300rpmで培養した。種培養物を、KH2PO4(3.50g/L)、FeSO4七水和物(0.05g/L)、MgSO4七水和物(2.0g/L)、クエン酸ナトリウム二水和物(1.90g/L)、酵母抽出物(Amberex 695、5.0g/L)、Biospumex153K消泡剤(0.25mL/L、Cognis Corporation,Monheim,Germany)、NaCl(1.0g/L)、CaCl2二水和物(10g/L)、およびNIT微量要素溶液(10mL/L)を含有する35℃での8Lの培地と共に約1〜2OD550nmで14L発酵槽(Braun Biotech,Allentown,PA)に移した。微量要素溶液は、クエン酸一水和物(10g/L)、MnSO4水和物(2g/L)、NaCl(2g/L)、FeSO4七水和物(0.5g/L)、ZnSO4七水和物(0.2g/L)、CuSO4五水和物(0.02g/L)およびNaMoO4二水和物(0.02g/L)を含有した。ポスト滅菌添加物は、グルコース溶液(50%w/w、80.0g)およびアンピシリン(25mg/mL)原液(16.00mL)を含んだ。グルコース溶液(50%w/w)を流加のために使用した。グルコース供給は、グルコース濃度が0.5g/Lに低下したときに開始し、0.31g供給/分でスタートし、漸次それぞれ毎時0.36、0.42、0.49、0.57、0.66、0.77、0.90、1.04、1.21、1.41、および1.63g/分に増やし;速度はその後一定のままであった。培地中のグルコース濃度を監視し、その濃度が0.1g/Lを超えた場合、供給速度を下げるかまたは一時的に停止した。誘導は、様々な菌株について16mLのIPTG(0.5M)の添加でOD550nm=56とOD550nm=80との間で開始した。溶解酸素(DO)濃度を、空気飽和の25%で制御した。DOは、先ず羽根車かき混ぜ速度(400〜1400rpm)によって、その後曝気速度(2〜10slpm)によって制御した。pHを6.8に調整した。NH4OH(29%w/w)およびH2SO4(20%w/v)をpH調整のために使用した。頭部圧力は0.5バールであった。細胞をIPTG添加16時間後に遠心分離によって収穫した。
CE−7エステラーゼ/ペルヒドロラーゼ熱処理細胞抽出物の調製
サーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)(KLP18/pSW196)またはサーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)MSB8(KLP18/pSW207)からのペルヒドロラーゼを発現する大腸菌(E.coli)形質転換体の細胞抽出物を、ジチオスレイトール(1mM)を含有する0.05Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)中の細胞ペーストの懸濁液(20重量%湿潤細胞重量)を2回、16,000psi(約110MPa)の作動圧力を有するFrenchプレスに通すことによって調製した。粗抽出物を次に、20,000×gで遠心分離して細胞破片を除去し、浄化細胞抽出物を生成し、それを全可溶性タンパク質についてアッセイした(Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination,Sigma Aldrichカタログ# BCA1−KT)。浄化サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)MSB8またはサーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)ペルヒドロラーゼ含有抽出物を75℃で20分間加熱し、引き続き氷/水浴中で5℃に直ちに冷却した。生じた混合物を遠心分離して沈澱タンパク質を除去し、上澄液を集め、全可溶性タンパク質について前述の通り分析した。熱処理上澄液のSDS−PAGEは、ペルヒドロラーゼが上澄液中に存在する全可溶性タンパク質の少なくとも約90%を構成することを示した。
T.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/トレハロース噴霧乾燥酵素粉末の温度安定性
重炭酸ナトリウム緩衝液(50mM、pH=8.1)中の大腸菌(E.coli)KLP18/pSW196の様々な濃度の熱処理細胞抽出物タンパク質(PAGEにより≧90%T.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ)、トレハロース(Cargill)、および、任意選択的に、界面活性剤としてのpolysorbate 80(p80)を含有する10セットの水性混合物を調製した(表1)。これらの溶液を、Buchi B−290ガラス室噴霧乾燥機(入口温度=170℃、出口温度=90℃、供給速度=3mL/分〜10mL/分)を用いて噴霧乾燥して10個の噴霧乾燥酵素粉末を製造し;粉末中の重量パーセントタンパク質を、BCA(ビシンコニン酸)タンパク質アッセイを用いて測定し、これらの粉末のガラス転移温度(Tg)を、変調示差走査熱量測定法を用いて測定した(表1)。
T.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/トレハロース噴霧乾燥酵素粉末の酵素粉末とトリアセチンとの混合物中での温度安定性
実施例8に記載されるように調製された噴霧乾燥酵素粉末を、トリアセチン中の噴霧乾燥粉末の混合物として40℃で8週間貯蔵されたときの安定性について評価した。噴霧乾燥酵素粉末をトリアセチンに加えて87.2gのトリアセチン中に0.200gのタンパク質を含有する混合物を生成した。生じた混合物を40℃で貯蔵し、十分撹拌された混合物の2.19gサンプルを、トリアセチンおよびタンパク質の生じた濃度が、それぞれ、100mMおよび50μg/mLである、pH7.2の50mM重炭酸ナトリウム緩衝液中に100mM過酸化水素およびTURPINAL(登録商標)SL(500ppm)を含有する100mL反応液中25℃で毎週アッセイした。表4のデータと実施例8、表3のデータとの比較は、トリアセチンとの混合物として貯蔵されたときにT.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/トレハロース噴霧乾燥酵素粉末の不安定性を実証する。
T.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の温度安定性
50mM重炭酸ナトリウム(pH=8.1)中の大腸菌(E.coli)KLP18/pSW196の熱処理細胞抽出物タンパク質(34gタンパク質/L、PAGEにより≧90%T.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ)および賦形剤としてのマルトデキストリン(66.7g/LのMALTRIN(登録商標)M100マルトデキストリン、14.7g/LのMALTRIN(登録商標)M250、14.7g/LのMALTRIN(登録商標)M040、Grain Processing Corporation,Muscatine,IA)を含有する水性混合物を調製した。この溶液を、噴霧乾燥機(GEA Niro、3−フィート直径、入口温度=226℃、出口温度=76℃、供給速度=60g/分)を用いて噴霧乾燥して噴霧乾燥酵素粉末を製造し;粉末中の重量パーセントタンパク質(20.3重量%)を、BCA(ビシンコニン酸)タンパク質アッセイを用いて測定し、この粉末のガラス転移温度(Tg=54℃)を、変調示差走査熱量測定法を用いて測定した。この溶液を噴霧乾燥して粉末を製造し、それを次に40℃で9週間貯蔵中の安定性について試験した。噴霧乾燥酵素粉末(40℃で貯蔵される)を1週間間隔でサンプリングし、25℃で50mM重炭酸塩緩衝液(pH7.2)中の50μgタンパク質/mLのT.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ、H2O2(100mM)、トリアセチン(100mM)およびTURPINAL(登録商標)SL(500ppm)を使用して活性についてアッセイし、Karstら(上記を参照)によって報告された分析方法の修正を用いて過酢酸の生成について分析した。T.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン噴霧乾燥粉末の過加水分解活性は、40℃での8週間の貯蔵にわたって
安定であった(表5)。
酵素粉末とトリアセチンとの混合物中で貯蔵されるT.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の温度安定性
実施例10に記載されるように調製された噴霧乾燥酵素粉末を、トリアセチン中の噴霧乾燥粉末の混合物として40℃で21週間貯蔵されたときの安定性について評価した。噴霧乾燥酵素粉末(1.235g、20.3重量%タンパク質)を109gのトリアセチンに加えた。生じた混合物を40℃で貯蔵し、十分撹拌された混合物の2.19gサンプルを、トリアセチンおよびタンパク質の生じた濃度が、それぞれ、100mMおよび50μg/mLである、pH7.2の50mM重炭酸ナトリウム緩衝液中に過酸化水素(100mM)およびTURPINAL(登録商標)SL(500ppm)を含有する100mL反応液中25℃で二重反復試験でアッセイした。表6のデータと実施例10、表5のデータとの比較は、トリアセチンとの混合物として貯蔵されたときにT.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の安定性を実証する。
酵素粉末、重炭酸ナトリウムおよびトリアセチンの混合物中で貯蔵されるT.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の温度安定性
実施例10に記載されるように調製された噴霧乾燥酵素粉末を、トリアセチンと重炭酸ナトリウムとの混合物中の噴霧乾燥粉末の混合物として40℃で21週間貯蔵されたときの安定性について評価した。噴霧乾燥酵素粉末(0.988g、20.3重量%タンパク質)を、87.2gのトリアセチンと16.8gの重炭酸ナトリウム(グレード3DF(粉末)、Church & Dwight)との混合物に加えた。生じた混合物を40℃で貯蔵し、十分撹拌された混合物の2.62gサンプルを、トリアセチン、重炭酸ナトリウムおよびタンパク質の生じた濃度が、それぞれ、100mM、50mM(pH7.2)および50μg/mLである、過酸化水素(100mM)およびTURPINAL(登録商標)SL(500ppm)を含有する100mL反応液中25℃で二重反復試験でアッセイした。表7のデータと実施例11、表6のデータとの比較は、トリアセチンおよび固体重炭酸ナトリウムとの混合物として40℃で21週間貯蔵されたときのT.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の安定性がトリアセチン単独との混合物として40℃で21週間貯蔵されたときのT.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の安定性と比較したときに改善されることを実証する。21週などの、より長い貯蔵時間で、ペルヒドロラーゼは、トリアセチンと重炭酸ナトリウムとの混合物中で初期活性の約100%を依然として保持する。
T.マリチマ(T.maritima)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の温度安定性
50mM重炭酸ナトリウム(pH=8.1)中に大腸菌(E.coli)KLP18/pSW207の熱処理細胞抽出物タンパク質(21gタンパク質/L、PAGEにより≧90%T.マリチマ(T.maritima)ペルヒドロラーゼ)および賦形剤としてのマルトデキストリン(31g/LのマルトデキストリンDE 13−17および31g/LのマルトデキストリンDE 4−7、Aldrich)を含有する水性混合物を調製した。この溶液を、Buchi B−290ガラス室噴霧乾燥機(入口温度=170℃、出口温度=90℃、供給速度=4.5mL/分)を用いて噴霧乾燥して噴霧乾燥酵素粉末を製造し;粉末中の重量パーセントタンパク質(18.0重量%)を、BCA(ビシンコニン酸)タンパク質アッセイを用いて測定し、この粉末のガラス転移温度(Tg=90℃)を、変調示差走査熱量測定法を用いて測定した。この溶液を噴霧乾燥して粉末を製造し、それを次に40℃で7週間の貯蔵中の安定性について試験した。噴霧乾燥酵素粉末(40℃で貯蔵される)を1週間間隔でサンプリングし、25℃で50mM重炭酸塩緩衝液(pH7.2)中の50μgタンパク質/mLのT.マリチマ(T.maritima)ペルヒドロラーゼ、H2O2(100mM)、トリアセチン(100mM)およびTURPINAL(登録商標)SL(500ppm)を使用して活性についてアッセイし、Karstら(上記を参照)によって報告された分析方法の修正を用いて過酢酸の生成について分析した。T.マリチマ(T.maritima)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン噴霧乾燥粉末の過加水分解活性は、40℃での7週間の貯蔵にわたって安定であった(表8)。
酵素粉末とトリアセチンとの混合物中で貯蔵されたT.マリチマ(T.maritima)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の温度安定性
実施例13に記載されるように調製された噴霧乾燥酵素粉末を、トリアセチン中の噴霧乾燥粉末の混合物として40℃で7週間貯蔵されたときの安定性について評価した。噴霧乾燥酵素粉末(0.556g、18.0重量%タンパク質)を43.6gのトリアセチンに加えた。生じた混合物を40℃で貯蔵し、十分撹拌された混合物の2.21gサンプルを、トリアセチンおよびタンパク質の生じた濃度が、それぞれ、100mM、50μg/mLである、pH7.2の50mM重炭酸ナトリウム緩衝液中に過酸化水素(100mM)およびTURPINAL(登録商標)SL(500ppm)を含有する100mL反応液中25℃で二重反復試験でアッセイした。表9のデータと実施例13、表8のデータとの比較は、トリアセチンとの混合物として貯蔵されたときにT.マリチマ(T.maritima)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の安定性を実証する。
酵素粉末、重炭酸ナトリウムおよびトリアセチンの混合物中で貯蔵されたT.マリチマ(T.maritima)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の温度安定性
実施例13に記載されるように調製された噴霧乾燥酵素粉末を、トリアセチンと重炭酸ナトリウムとの混合物中の噴霧乾燥粉末の混合物として40℃で7週間貯蔵されたときの安定性について評価した。噴霧乾燥酵素粉末(0.556g、18.0重量%タンパク質)を、43.6gのトリアセチンおよび8.4gの重炭酸ナトリウム(グレード3DF(粉末)、Church & Dwight)に加えた。生じた混合物を40℃で貯蔵し、十分撹拌された混合物の2.63gサンプルを、トリアセチン、重炭酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)およびタンパク質の生じた濃度が、それぞれ、100mM、50mMおよび50μg/mLである、過酸化水素(100mM)およびTURPINAL(登録商標)SL(500ppm)を含有する100mL反応液中25℃で二重反復試験でアッセイした。表10のデータと実施例14、表9のデータとの比較は、トリアセチン単独との混合物として40℃で5、6および7週間貯蔵されたときのT.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の安定性と比較したとき、トリアセチンおよび固体重炭酸ナトリウムとの混合物として40℃で5、6および7週間貯蔵されたときのT.マリチマ(T.maritima)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン噴霧乾燥酵素粉末の改善された安定性を実証する。
サーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)ペルヒドロラーゼによる過酢酸生成への添加された溶媒の影響
90.0gの脱イオン水、0.350gのTURPINAL(登録商標)SL((1−ヒドロキシ−1−ホスホノエチル)ホスホン酸、水中60重量%;Thermphos International)、および3.20gの水中30重量%過酸化水素の第1混合物を50%水性水酸化ナトリウムでpH7.2に調整し、混合物の最終重量を脱イオン水で100.0gに調節した。55.76gのトリアセチン、4.20gの重炭酸ナトリウム、2.50gのCAB−O−SIL(登録商標)M5(Cabot)、0.270gの噴霧乾燥サーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)ペルヒドロラーゼ(実施例10)、ならびにトリプロピレングリコールメチルエーテル(DOWANOL(登録商標)TPM)、ジプロピレングリコールメチルエーテル(DOWANOL(登録商標)DPM)、プロピレングリコールメチルエーテル(DOWANOL(登録商標)PM)、ジエチレングリコールブチルエーテル(DOWANOL(登録商標)DB)、ジプロピレングリコール(DOWANOL(登録商標)DPG)、トリエチレングリコール、1,2−プロパンジオール、N−エチル−2−ピロリジノン、イソプロパノール、エタノール、乳酸エチル、または1,3−プロパンジオールからなる群から選択される37.43gの1つの有機溶媒の第2混合物を調製した。(未溶解固形分を懸濁させるために)速く撹拌しながら第2混合物の1.0gアリコートを取り出し、水(pH7.2)中の過酸化水素とTURPINAL(登録商標)SLとの9.00mLの第1混合物と混合し、25℃で撹拌しながら加え;生じた混合物は、255mMトリアセチン、254mM過酸化水素および0.055mgタンパク質/mLの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有した。各溶媒についての対照反応をまた、添加されたタンパク質の不存在下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解によって生成する過酢酸の濃度を測定するために行った。
Supelco Discovery C8カラム(10cm×4.0mm、5μm)(カタログ#569422−U)w/プレカラムSupelco Supelguard Discovery C8(Sigma−Aldrich;カタログ#59590−U);10マイクロリットル注入容量;;1.0mL/分および周囲温度でCH3CN(Sigma−Aldrich;#270717)および脱イオン水でのグラジエント法:
添加された溶媒の存在下または不存在下でのサーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)ペルヒドロラーゼによる過酢酸生成の比較
40.0gの脱イオン水、0.1575gのTURPINAL(登録商標)SL((1−ヒドロキシ−1−ホスホノエチル)ホスホン酸、水中60重量%;Thermphos International)、および1.44gの水中30重量%過酸化水素の第1混合物を50%水性水酸化ナトリウムでpH7.2に調整し、混合物の最終重量を脱イオン水で46.87gに調節した。2.78gのトリアセチン、0.210gの重炭酸ナトリウム、0.125gのCAB−O−SIL(登録商標)M5(Cabot)および0.0135gの噴霧乾燥サーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)ペルヒドロラーゼ(実施例10)の第2混合物を調製し、水(pH7.2)中の過酸化水素とTURPINAL(登録商標)SLとの第1混合物を、25℃で撹拌しながら第2混合物に加え;得られた生じた混合物は、255mMトリアセチン、254mM過酸化水素および0.055mgタンパク質/mLの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有した。反応混合物中の過酢酸の濃度の測定は、Karstら(上記を参照)によって記載された方法に従って行った。対照反応をまた、添加されたペルヒドロラーゼの不存在下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解によって生成する過酢酸の濃度を測定するために行った。
撹拌反応と比較して2区画スプレー・ボトルを使用するその場ペルオキシカルボン酸発生のための溶媒の使用
2000ppmのTURPINAL(登録商標)SL((1−ヒドロキシ−1−ホスホノエチル)ホスホン酸、水中60重量%;Thermphos International)を含有する100gの0.20Mクエン酸ナトリウム緩衝液;280gの脱イオン水、および5.20gの水中30重量%過酸化水素の第1混合物を50%水性水酸化ナトリウムでpH7.2に調整し、混合物の最終重量を脱イオン水で400gに調節した。83.4gのトリアセチン、3.75gのCAB−O−SIL(登録商標)M5(Cabot)、0.750gの噴霧乾燥サーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)ペルヒドロラーゼ(実施例10)、ならびにプロピレングリコールメチルエーテル(DOWANOL(登録商標)PM)、トリプロピレングリコールメチルエーテル(DOWANOL(登録商標)TPM)、ジエチレングリコールメチルエーテル(DOWANOL(登録商標)DM)、プロピレングリコールn−ブチルエーテル(DOWANOL(登録商標)PNB)、プロピレングリコールn−プロピルエーテル(DOWANOL(登録商標)PnP)、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート(DOWANOL(登録商標)PMA)、ジプロピレングリコール、エタノール、イソプロパノール、および1,2−プロパンジオールから選択される62.1gの単一溶媒を含有する、第2混合物を別々に調製した。25℃での第1反応で、1.0gの第1混合物を9.0gの第2混合物と反応の最初の30〜60秒間撹拌し(6.5〜6.0の反応pH)、サンプルを抜き取り、過酢酸生成について分析し;生じた反応混合物は、255mMトリアセチン、103mM過酸化水素および100μgタンパク質/mLの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有した。反応混合物中の過酢酸の濃度(下の表14)の測定は、Karstら(上記を参照)によって記載された方法に従って行った。対照反応をまた、添加されたペルヒドロラーゼの不存在下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解によって生成する過酢酸の濃度を測定するために行った。
酵素触媒としてサーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)ペルヒドロラーゼを使用するペルオキシカルボン酸生成
サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現は、実施例1〜3および5に記載された方法に従って成し遂げる。サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)ペルヒドロラーゼを発現するバクテリア形質転換体の発酵は、先行実施例6に従って行い、噴霧乾燥サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)ペルヒドロラーゼの調製は、実施13に記載された方法を用いて成し遂げる。サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)ペルヒドロラーゼのクローニング、発現、および調製のための技法に関する追加情報は、2008年6月20日出願の米国特許出願第12/143,375号明細書で入手可能である。
撹拌反応と比較して2区画スプレー・デバイスを使用するおよびサーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)ペルヒドロラーゼを使用するその場ペルオキシカルボン酸発生のための溶媒の使用
2000ppmのTURPINAL(登録商標)SL((1−ヒドロキシ−1−ホスホノエチル)ホスホン酸、水中60重量%;Thermphos International)を含有する100gの0.20Mクエン酸ナトリウム緩衝液、280gの脱イオン水、および5.20gの水中30重量%過酸化水素の第1混合物を50%水性水酸化ナトリウムでpH7.2に調整し、混合物の最終重量を脱イオン水で400gに調節する。83.4gのトリアセチン、3.75gのCAB−O−SIL(登録商標)M5(Cabot)、0.750gの噴霧乾燥サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)ペルヒドロラーゼ(実施例13)、ならびにプロピレングリコールメチルエーテル(DOWANOL(登録商標)PM)、トリプロピレングリコールメチルエーテル(DOWANOL(登録商標)TPM)、ジエチレングリコールメチルエーテル(DOWANOL(登録商標)DM)、プロピレングリコールn−ブチルエーテル(DOWANOL(登録商標)PNB)、プロピレングリコールn−プロピルエーテル(DOWANOL(登録商標)PnP)、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート(DOWANOL(登録商標)PMA)、ジプロピレングリコール、エタノール、イソプロパノール、および1,2−プロパンジオールから選択される62.1gの単一溶媒を含有する、第2混合物を別々に調製する。25℃での第1反応では、1.0gの第1混合物を9.0gの第2混合物と反応の最初の30〜60秒間撹拌し(6.5〜6.0の反応pH)、サンプルを抜き取り、過酢酸生成について分析し;生じた反応混合物は、255mMトリアセチン、103mM過酸化水素および100μgタンパク質/mLの噴霧乾燥ペルヒドロラーゼを含有する。反応混合物中の過酢酸の濃度の測定は、Karstら(上記を参照)によって記載された方法に従って行う。対照反応をまた、添加されたペルヒドロラーゼの不存在下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解によって生成する過酢酸の濃度を測定するために行う。
例示的な2成分系
2成分その場ペルオキシカルボン酸消毒調合物の一例を以下に記載する。
サーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)アセチルキシランエステラーゼ変異株のペルヒドロラーゼ活性アッセイ
サーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)突然変異体のライブラリーを、「Improved Perhydrolases for Enzymatic Peracid Production」という表題の代理人整理番号CL4392 US NAを有する共同所有される、共同出願された、そして同時係属の米国特許出願の実施例4に記載されているように調製した。手短に言えば、飽和突然変異生成は、他の19個の可能なアミノ酸のそれぞれが各指定位置に個別に導入されるように、配列番号6のアミノ酸残基F213、I276、C277、およびN93で行った。
大腸菌(E.coli)KLP18でのサーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)アセチルキシランエステラーゼ変異株の発現
確認されたアセチルキシランエステラーゼ突然変異のプラスミドを使用して大腸菌(E.coli)KLP18(実施例3)を形質転換した。形質転換体を、LB−アンピシリン(100μg/mL)プレート上へ延ばし、37℃で一晩培養した。細胞を、20%(v/v)グリセロールを補足された2.5mLのLB培地を使用してプレートから収穫し、生じた細胞懸濁液の1.0mLアリコートを−80℃で凍結させた。1mLの解凍した細胞懸濁液を、KH2PO4(5.0g/L)、FeSO4七水和物(0.05g/L)、MgSO4七水和物(1.0g/L)、クエン酸ナトリウム二水和物(1.90g/L)、酵母抽出物(Amberex 695、5.0g/L)、Biospumex153K消泡剤(0.25mL/L、Cognis Corporation)、NaCl(1.0g/L)、CaCl2二水和物(0.1g/L)、およびNIT微量要素溶液(10mL/L)を含有する0.7L培地と共に1LのAPPLIKON(登録商標)Bioreactor(Applikon Biotechnology,Foster City,CA)に移した。微量要素溶液は、クエン酸一水和物(10g/L)、MnSO4水和物(2g/L)、NaCl(2g/L)、FeSO4七水和物(0.5g/L)、ZnSO4七水和物(0.2g/L)、CuSO4五水和物(0.02g/L)およびNaMoO4二水和物(0.02g/L)を含有した。ポスト滅菌添加物は、グルコース溶液(50%w/w、6.5g)およびアンピシリン(25mg/mL)原液(2.8mL)を含んだ。グルコース溶液(50%w/w)をまた流加のために使用した。グルコース供給は、グルコース濃度が0.5g/Lより下に低下した40分後に開始し、0.03g供給/分でスタートし、漸次それぞれ毎時0.04、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.12、および0.14g/分に増やし;速度はその後一定のままであった。培地中のグルコース濃度を監視し、濃度が0.1g/Lを超えた場合、供給速度を下げるかまたは一時的に停止した。誘導は、0.8mLのIPTG(0.05M)の添加でOD550=50で開始した。溶解酸素(DO)濃度は、先ずかき混ぜ(400〜1000rpm)によって、引き続き曝気(0.5〜2slpm)によって、空気飽和の25%で制御した。温度を37℃に制御し、pHを6.8に調整し;NH4OH(29%w/w)およびH2SO4(20%w/v)をpH調整のために使用した。細胞をIPTG添加20時間後に遠心分離(5,000×g15分間)によって収穫した。
半精製されたT.ネアポリタナ(T.neapolitana)アセチルキシランエステラーゼまたはT.ネアポリタナ(T.neapolitana)変異株アセチルキシランエステラーゼを含有する細胞溶解液の調製
大腸菌(E.coli)KLP18/pSW196(サーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)野生型ペルヒドロラーゼ)の細胞培養物を実施例6に記載されるように増殖させた。生じた細胞ペーストを、1.0mMのDTTで補足された50mMリン酸塩緩衝液pH7.0中に再懸濁させた(20%w/v)。再懸濁細胞を、>95%細胞溶解を確実にするために2回French圧力セルに通した。溶解細胞を12,000×gで30分間遠心分離し、上澄液を75℃で20分間加熱し、引き続き氷浴中で2分間急冷した。沈澱タンパク質を11,000×gで10分間の遠心分離によって除去した。SDS−PAGEは、CE−7酵素が熱処理抽出物上澄液中の全タンパク質のおおよそ85〜90%を占めることを示した。
T.ネアポリタナ(T.neapolitana)アセチルキシラン野生型エステラーゼおよびC277エステラーゼ変異株の比活性度および過加水分解/加水分解比
反応(40mL総容積)を、トリアセチン(100mM)、過酸化水素(100mM)および次のアセチルキシランエステラーゼ突然変異体の1つを含有するリン酸塩緩衝液(50mM、pH7.2)中25℃で行った:(実施例23に記載された通り調製された)T.ネアポリタナ(T.neapolitana)C277S変異株ペルヒドロラーゼ(0.010mg/mLの大腸菌(E.coli)KLP18/pSW196/C277Sからの熱処理抽出物全タンパク質)、T.ネアポリタナ(T.neapolitana)C277T変異株ペルヒドロラーゼ(0.010mg/mLの大腸菌(E.coli)KLP18/pSW196/C277Tからの熱処理抽出物全タンパク質)、T.ネアポリタナ(T.neapolitana)C277A変異株ペルヒドロラーゼ(0.0125mg/mLの大腸菌(E.coli)KLP18/pSW196/C277Aからの熱処理抽出物全タンパク質)、およびT.ネアポリタナ(T.neapolitana)C277V変異株ペルヒドロラーゼ(0.0125mg/mLの大腸菌(E.coli)KLP18/pSW196/C277Vからの熱処理抽出物全タンパク質)。反応液は、反応剤および酵素を初めに混合するために反応の最初の30秒だけ撹拌した。
サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)からのアセチルキシランエステラーゼのクローニングおよび発現
GENBANK(登録商標)(登録#NP_227893.1)に報告されているようなT.マリチマ(T.maritima)からのアセチルキシランエステラーゼをエンコードする遺伝子を合成した(DNA 2.0,Menlo Park CA)。この遺伝子をその後、配列番号52および配列番号53として同定されるプライマーを使用してPCR(94℃で0.5分、55℃で0.5分、70℃で1分、30サイクル)によって増幅した。生じた核酸生成物(配列番号54)を制限酵素PstIおよびXbaIでカットし、pUC19でのPstIサイトとXbaIサイトとの間にサブクローンしてpSW207として同定されるプラスミドを発生させた。GENBANK(登録商標)(登録番号NP_227893.1)に報告されているようなT.マリチマ(T.maritima)MSB8からのアセチルキシランエステラーゼをエンコードする遺伝子を、大腸菌(E.coli)での発現のために最適化されたコドンを使用して合成した(DNA 2.0,Menlo Park CA)。この遺伝子をその後、配列番号55および配列番号56として同定されるプライマーを使用してPCR(94℃で0.5分、55℃で0.5分、70℃で1分、30サイクル)によって増幅した。生じた核酸生成物を制限酵素EcoRIおよびPstIでカットし、pTrc99A(GENBANK(登録商標)登録番号M22744)でのEcoRIサイトとPstIサイトとの間にサブクローンしてpSW228として同定されるプラスミド(コドン最適化T.マリチマ(T.maritima)コード配列の配列番号57を含有する)を発生させた。プラスミドpSW207およびpSW228を使用して大腸菌(E.coli)KLP18を形質転換し(米国特許出願公開第2008/0176299号明細書)、それぞれ、KLP18/pSW207およびKLP18/pSW228として同定される菌株を発生させた。KLP18/pSW207およびKLP18/pSW228を、OD600nm=0.4〜0.5まで振盪しながら37℃でLB培地で増殖させ、その時点でIPTGを1mMの最終濃度まで添加し、培養を2〜3時間続行した。細胞を遠心分離によって収穫し、SDS−PAGEを、全可溶性タンパク質の20〜40%でペルヒドロラーゼの発現を確認するために行った。
残基C277でのサーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)アセチルキシランエステラーゼ変異株の構築
T.マリチマ(T.maritima)アセチルキシランエステラーゼのC277(Cys277)位置を、プラスミドpSW228でのT.マリチマ(T.maritima)アセチルキシランエステラーゼ(配列番号57)のコドン最適化配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマー・ペア(表19)を使用してVal、Ala、SerおよびThrのそれぞれに変更した。突然変異は、製造業者の指示書に従ってQUIKCHANGE(登録商標)(Stratagene)を使用して行った。増幅されたプラスミドを、37℃で1時間1UのDpnIで処理した。処理したプラスミドを使用して化学的に有能な大腸菌(E.coli)XL1−Blue(Stratagene)を形質転換した。形質転換体を、0.1mgアンピシリン/mLが補足されるLB−寒天上で平板培養し、37℃で一晩増殖させた。5つ以下の個々のコロニーを選別し、予期される突然変異を確認するためにプラスミドDNAの配列を決定した。
大腸菌(E.coli)KLP18でのサーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)アセチルキシランエステラーゼ変異株の発現
確認されたアセチルキシランエステラーゼ突然変異のプラスミドを使用して大腸菌(E.coli)KLP18(実施例3)を形質転換した。形質転換体を、OD600nm=0.4〜0.5まで振盪しながら37℃でLB培地で増殖させ、その時点でIPTGを1mMの最終濃度まで添加し、培養を2〜3時間続行した。細胞を遠心分離によって収穫し、SDS−PAGEを、全可溶性タンパク質の20〜40%でアセチルキシランエステラーゼの発現を確認するために行った。
半精製T.マリチマ(T.maritima)アセチルキシランエステラーゼ突然変異体を含有する細胞溶解液の調製
細胞培養物(実施例27に記載されるように調製された)を、1L規模(Applikon)で実施例7に記載されるものと類似の発酵手順を用いて増殖させた。細胞を5,000×gで15分間の遠心分離によって収穫し、次に1.0mMのDTTで補足された50mMリン酸塩緩衝液pH7.0中に再懸濁させた(20%w/v)。再懸濁細胞を、>95%細胞溶解を確実にするために2回French圧力セルに通した。溶解細胞を12,000×gで30分間遠心分離し、上澄液を75℃で20分間加熱し、引き続き氷浴中で2分間急冷した。沈澱タンパク質を11,000×gで10分間の遠心分離によって除去した。SDS−PAGEは、CE−7酵素が調製物中の全タンパク質のおおよそ85〜90%を占めることを示した。
T.マリチマ(T.maritima)アセチルキシラン野生型エステラーゼおよびC277エステラーゼ変異株の比活性度および過加水分解/加水分解比
反応(40mL全容積)は、トリアセチン(100mM)、過酸化水素(100mM)および以下のアセチルキシランエステラーゼ変異株の1つを含有するリン酸塩緩衝液(50mM、pH7.2)中25℃で行った:T.マリチマ(T.maritima)C277S変異株ペルヒドロラーゼ(0.010mg/mLの大腸菌(E.coli)KLP18/pSW228/C277Sからの熱処理抽出物全タンパク質)、T.マリチマ(T.maritima)C277T変異株ペルヒドロラーゼ(0.010mg/mLの大腸菌(E.coli)KLP18/pSW228/C277Tからの熱処理抽出物全タンパク質)、T.マリチマ(T.maritima)C277A変異株ペルヒドロラーゼ(0.0125g/mLの大腸菌(E.coli)KLP18/pSW228/C277Aからの熱処理抽出物全タンパク質)、およびT.マリチマ(T.maritima)C277V変異株ペルヒドロラーゼ(0.0125mg/mLの大腸菌(E.coli)KLP18/pSW228/C277Vからの熱処理抽出物全タンパク質)(実施例27に記載されるように調製された)。反応液は、反応剤および酵素を初めに混合するために反応の最初の30秒だけ撹拌した。
ペルヒドロラーゼを使用する過酢酸生成
トリアセチン(2mM)、過酸化水素(10mM)および0.1μg/mL〜2.0μg/mLの熱処理細胞抽出物タンパク質(熱処理が85℃で20分間行われ、上記の通り調製された)を含有する反応(100mL全容積)を、20℃で10mM重炭酸ナトリウム緩衝液(初期pH8.1)中で行った。反応混合物中の過酢酸の濃度の測定は、Karstら(上記を参照)によって記載された方法に従って行った。1分、5分、20分、40分および60分で生成した過酢酸濃度を表21にリストする。
ペルヒドロラーゼを使用する過酢酸生成
トリアセチン(20mM)、過酸化水素(10mM)および0.1μg/mL〜2.0μg/mLの熱処理細胞抽出物タンパク質(熱処理が85℃で20分間行われ、上記の通り調製された)を含有する反応(100mL全容積)を、20℃で10mM重炭酸ナトリウム緩衝液(初期pH8.1)中で行った。反応混合物中の過酢酸の濃度の測定は、Karstら(上記を参照)によって記載された方法に従って行った。1分、5分、20分、40分および60分で生成した過酢酸濃度を表22にリストする。
ペルヒドロラーゼを使用する過酢酸生成
反応(40mL全容積)は、トリアセチン(100mM)、過酸化水素(100mM)および10μg/mL〜50μg/mLの熱処理T.ネアポリタナ(T.neapolitana)またはT.マリチマ(T.maritima)野生型またはC277変異株ペルヒドロラーゼ(熱処理が75℃で20分間行われ、上記の通り調製された熱処理細胞抽出物タンパク質のような)を含有するリン酸緩衝液(50mM、pH7.2)中25℃で行った。反応液は、反応剤および酵素を初めに混合するために反応の最初の30秒だけ撹拌した。反応混合物中の過酢酸の濃度の測定は、Karstら(上記を参照)によって記載された方法に従って行った。1分、5分、および30分で生成した過酢酸濃度を表23にリストする。
ペルヒドロラーゼを使用する過酢酸生成
反応(10mL全容積)は、トリアセチン(100mMまたは150mM)、過酸化水素(100mM、250mMまたは420mM)および熱処理T.ネアポリタナ(T.neapolitana)またはT.マリチマ(T.maritima)野生型、C277SまたはC277T変異株ペルヒドロラーゼ(熱処理が75℃で20分間行われ、上記の通り調製された熱処理細胞抽出物タンパク質のような;表24にリストされるような濃度)を含有する重炭酸ナトリウム緩衝液(1mM、初期pH6.0)中25℃で行った。反応は、500ppmのTURPINAL(登録商標)SLをさらに含有する420mM過酸化水素を使用して行った。反応液は、反応剤および酵素を初めに混合するために反応の最初の30秒だけ撹拌した。反応混合物中の過酢酸の濃度の測定は、Karstら(上記を参照)によって記載された方法に従って行った。1分、5分、および30分で生成した過酢酸濃度を表24にリストする。
Claims (11)
- 第1の成分を含む第1のコンパートメントおよび第2の成分を含む第2のコンパートメントと、第1の成分および第2の成分を混合して過酢酸の水性調合物を生成させるための手段とを含む多成分ペルオキシカルボン酸発生システムであって、
第1の成分が、
(i)(a)ペルヒドロリシス活性を有する少なくとも1つの酵素触媒であって、該酵素触媒がCLUSTALWを用いて配列番号1と整列させる炭水化物エステラーゼ族7(CE−7)シグネチャーモチーフを有する酵素を含み、該シグネチャーモチーフが、
(1)配列番号1の118〜120と整列させるアミノ酸位置でRGQモチーフ;
(2)配列番号1の179〜183と整列させるアミノ酸位置でGXSQGモチーフ;および
(3)配列番号1の298〜299と整列させるアミノ酸位置でHEモチーフ
を含み;
該酵素が配列番号1と少なくとも30%のアミノ酸同一性を含む、
上記酵素触媒;および
(b)少なくとも1つの賦形剤
の調合物を含む酵素粉末;
(ii)(a)構造
[X]mR5
(式中、
Xは、式R6C(O)Oのエステル基であり;
R6は、任意選択的に、ヒドロキシル基またはC1〜C4アルコキシ基で置換される、C1〜C7の線状、分岐または環式ヒドロカルビル部分であり、ここで、R6は、任意選択的に、R6がC2〜C7である場合に1つまたはそれ以上のエーテル結合を含み;
R5は、任意選択的に、ヒドロキシル基で置換されるC1〜C6の線状、分岐または環式ヒドロカルビル部分であり、ここで、R5中の各炭素原子はそれぞれ、1つより多くないヒドロキシル基または1つより多くないエステル基を含み、そしてここで、R5は任意選択的に1つまたはそれ以上のエーテル結合を含み;
mは、1からR5中の炭素原子の数までである)
を有する1つまたはそれ以上のエステルであって、
25℃で少なくとも5ppmの水への溶解度を有する1つまたはそれ以上のエステル;
(b)構造
を有する1つまたはそれ以上のグリセリド;
(c)式
の1つまたはそれ以上のエステル;
(d)1つまたはそれ以上のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類、もしくはアセチル化多糖類;および
(e)(a)〜(d)の任意の組み合わせ
からなる群から選択されるカルボン酸エステル基質であって、
第1の成分中のカルボン酸エステル基質の量が、第1および第2の成分を組み合わせることによって形成される反応調合物中で0.5質量%〜10質量%の最終濃度を与えるように設計される、該カルボン酸エステル基質;
(iii)重炭酸、クエン酸、酢酸、リン酸、ピロリン酸、メチルホスホン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、およびマレイン酸からなる群から選択される緩衝剤;
(iv)トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールブチルエーテル、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、1,2−プロパンジオール、N−エチル−2−ピロリジノン、イソプロパノール、エタノール、乳酸エチル、1,3−プロパンジオール、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共溶媒;および
(v)任意選択的に少なくとも1つの界面活性剤
を含み;
第2の成分が、水、過酸化水素および過酸化水素安定剤を含む、
上記システム。 - 少なくとも1つの賦形剤が、酵素粉末の約95質量%〜約25質量%の範囲である請求項1に記載の多成分ペルオキシカルボン酸発生システム。
- (i)カルボン酸エステル基質がトリアセチンであり、ここで、第1の成分中のトリアセチンの量が、第1および第2の成分を組み合わせることによって形成される反応調合物中0.5質量%〜10質量%の最終濃度を与えるように設計され;
(ii)緩衝剤が第1の成分の約0.1質量%〜約10質量%の濃度にあり;該緩衝剤が、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、重炭酸ナトリウムと重炭酸カリウムとの混合物、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、およびリン酸ナトリウムとリン酸カリウムとの混合物からなる群から選択され;
(iii)該共溶媒がトリプロピレングリコールメチルエーテルであり、第1の成分の最大で80質量%までの濃度にあり;
(iv)界面活性剤が存在し、ポリソルベート 80であり;そして
(v)第2の成分中の過酸化水素が、第1および第2の成分を組み合わせることによって形成される反応調合物中0.33質量%〜約30質量%の最終濃度を与える量で存在する、
請求項1または請求項2に記載の多成分ペルオキシカルボン酸発生システム。 - 第1の成分を、重さで約1:1〜約1:10の比で第2の成分と組み合わせる請求項1または請求項2に記載の多成分ペルオキシカルボン酸発生システム。
- 2つの個々のボトル、2コンパートメント・スプレー・ボトル、2コンパートメント・パケット、または2コンパートメント非剛性絞り出しボトルの形態で提供される請求項1または請求項2に記載の多成分ペルオキシカルボン酸発生システム。
- 第1の成分を含む第1のコンパートメントおよび第2の成分を含む第2のコンパートメントと、第1のおよび第2の成分を混合して過酢酸の水性調合物を生成させるための手段とを含む多成分ペルオキシカルボン酸生成システムであって、
第1の成分が、
(i)(a)ペルヒドロリシス活性を有する少なくとも1つのCE−7酵素であって、配列番号6、配列番号7、配列番号19および配列番号20からなる群から選択されるアミノ酸配列または配列番号6、配列番号7、配列番号19もしくは配列番号20と実質的に類似のアミノ酸配列を含む、該少なくとも1つのCE−酵素;および
(b)少なくとも1つの賦形剤
の調合物を含む酵素粉末;
(ii)モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるカルボン酸エステル基質であって、第1の成分中のカルボン酸エステル基質の量が、第1のおよび第2の成分を組み合わせることによって形成される反応調合物中0.5質量%〜10質量%の最終濃度を与えるように設計される、該カルボン酸エステル基質;
(iii)重炭酸、クエン酸、酢酸、リン酸、ピロリン酸、メチルホスホン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、酒石酸、およびマレイン酸からなる群から選択される緩衝剤;
(iv)トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールブチルエーテル、ジプロピレングリコール、トリエチレングリコール、1,2−プロパンジオール、N−エチル−2−ピロリジノン、イソプロパノール、エタノール、乳酸エチル、1,3−プロパンジオール、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される共溶媒;および
(v)任意選択的に少なくとも1つの界面活性剤
を含み;
第2の成分が、水、過酸化水素および過酸化水素安定剤を含む、
上記システム。 - (i)少なくとも1つのCE−7酵素が、配列番号6、配列番号7、配列番号19および配列番号20からなる群から選択されるアミノ酸配列であり、ここで配列番号19または配列番号20のアミノ酸残基277が、アラニン、バリン、セリン、およびスレオニンからなる群から選択され;
(ii)カルボン酸エステル基質がトリアセチンであり、ここで、第1の成分中のトリアセチンの量が、第1および第2の成分を組み合わせることによって形成される反応調合物中0.5質量%〜10質量%の最終濃度を与えるように設計され;
(iii)緩衝剤が第1の成分の約0.1質量%〜約10質量%の濃度にあり;該緩衝剤が、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、重炭酸ナトリウムと重炭酸カリウムとの混合物、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、およびリン酸ナトリウムとリン酸カリウムとの混合物からなる群から選択され;
(iv)共溶媒がトリプロピレングリコールメチルエーテルであり、第1の成分の最大で80質量%までの濃度にあり;
(v)界面活性剤が存在し、ポリソルベート 80であり;そして
(vi)第2の成分中の過酸化水素が、第1および第2の成分を組み合わせることによって形成される反応調合物中0.33質量%〜約30質量%の最終濃度を与える量で存在する、
請求項6に記載の多成分ペルオキシカルボン酸発生システム。 - 第1の成分を、重さで約1:1〜約1:10の比で第2の成分と組み合わせる請求項6または請求項7に記載の多成分ペルオキシカルボン酸発生システム。
- 2つの個々のボトル、2コンパートメント・スプレー・ボトル、2コンパートメント・
パケット、または2コンパートメント非剛性絞り出しボトルの形態で提供される請求項1または請求項6に記載の多成分ペルオキシカルボン酸発生システム。 - 第1および第2の成分を混合することによって生成される過酢酸を含む水性調合物を、漂白、汚れ除去、臭気低減、衛生化、殺菌、またはそれらの組み合わせのために表面、衣料品もしくは繊維製品に適用するための手段をさらに含む、請求項1または請求項6に記載の多成分ペルオキシカルボン酸発生システム。
- (a)第1および第2の成分を混合するための手段を用い、それによって過酢酸を含む水性調合物を生成させる工程と;
(b)(a)で生成した過酢酸を含む水性調合物を、漂白、汚れ除去、臭気低減、衛生化、殺菌、またはそれらの組み合わせのために表面、衣料品もしくは繊維製品に適用する工程と
を含む請求項1または請求項6に記載の多成分ペルオキシカルボン酸発生システムの使用方法。
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