JP2015520605A - 過酸生成に有用な酵素 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は2012年3月30日に出願された米国仮特許出願第61/618,383号明細書の利益を主張するものであり、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
(1)
(i)構造
[X]mR5
[式中、
X=式R6−C(O)Oのエステル基であり;
R6=ヒドロキシル基またはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C7の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、R6=C2〜C7の場合には、R6は、任意選択で1つまたは複数のエーテル結合を含み;
R5=ヒドロキシル基で置換されていてもよい、C1〜C6の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または5員環ヘテロ芳香族部分、または6員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり;ここで、R5中の各炭素原子は個々に、1個以下のヒドロキシル基または1個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み;R5は任意選択で、1つまたは複数のエーテル結合を含み;
m=1からR5中の炭素原子数までの範囲の整数である]を有し、25℃で少なくとも5ppmの水溶解性を有する1つまたは複数のエステル;
(ii)構造
(iii)式:
(iv)1つまたは複数のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類、またはアセチル化多糖類;および
(v)(i)〜(iv)の任意の組合せ
からなる群から選択される少なくとも1つの基質と、
(2)過酸素源と、ならびに
(3)過加水分解活性と、配列番号12に示すアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドを含む酵素触媒であって、触媒ヒスチジンのC末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない酵素触媒と
を含む反応成分セットを含む酵素的過酸発生系であって、適切な反応条件下で反応成分を混合すると過酸が酵素的に生成される酵素的過酸発生系を提供する。
(a)
(1)
(i)構造
[X]mR5
[式中、
X=式R6−C(O)Oのエステル基であり;
R6=ヒドロキシル基またはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C7の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、R6=C2〜C7の場合には、R6は、任意選択で1つまたは複数のエーテル結合を含み;
R5=ヒドロキシル基で置換されていてもよい、C1〜C6の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または5員環ヘテロ芳香族部分、または6員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり;ここで、R5中の各炭素原子は個々に、1個以下のヒドロキシル基または1個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み;R5は任意選択で、1つまたは複数のエーテル結合を含み;
m=1からR5中の炭素原子数までの範囲の整数である]を有し、25℃で少なくとも5ppmの水溶解性を有する1つまたは複数のエステル;
(ii)構造
(iii)式:
(iv)1つまたは複数のアシル化単糖類、アシル化二糖類、またはアシル化多糖類;および
(v)(i)〜(iv)の任意の組合せ
からなる群から選択される少なくとも1つの基質と、
(2)過酸素源と、ならびに
(3)過加水分解活性と、配列番号12に示すアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドを含む酵素触媒であって、触媒ヒスチジンのC末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない酵素触媒と
を含む反応成分セットを準備するステップと、
(b)適切な条件下で反応成分セットを混合し、それによってペルオキシカルボン酸を生成するステップと、
(c)任意選択で、ステップ(b)で生成されるペルオキシカルボン酸を希釈するステップと
を含む方法も提供する。
(a)
(1)過加水分解活性と、配列番号12に示すアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドを含む酵素触媒であって、触媒ヒスチジンのC末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない酵素触媒と
(2)
(i)構造
[X]mR5
[式中、
X=式R6−C(O)Oのエステル基であり;
R6=ヒドロキシル基またはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C7の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、R6=C2〜C7の場合には、R6は、任意選択で1つまたは複数のエーテル結合を含み;
R5=ヒドロキシル基で置換されていてもよい、C1〜C6の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または5員環ヘテロ芳香族部分、または6員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり;ここで、R5中の各炭素原子は個々に、1個以下のヒドロキシル基または1個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み;R5は任意選択で、1つまたは複数のエーテル結合を含み;
m=1からR5中の炭素原子数までの範囲の整数である]を有し、25℃で少なくとも5ppmの水溶解性を有する1つまたは複数のエステル;
(ii)構造
またはR1C(O)である]を有する1つまたは複数のグリセリド;
(iii)式:
(iv)1つまたは複数のアシル化単糖類、アシル化二糖類、またはアシル化多糖類;および
(v)(i)〜(iv)の任意の組合せ
からなる群から選択される少なくとも1つの基質と、
(3)任意選択の緩衝液と
を含む第1のコンパートメント、ならびに
(b)
(1)過酸素源と、
(2)過酸化物安定化剤と
(3)任意選択の緩衝液と
を含む第2のコンパートメント
を含むペルオキシカルボン酸の発生および送達系を提供する。
a)過加水分解活性と、配列番号12に示すアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドであって、触媒ヒスチジンのC末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではないペプチドと
b)
(i)構造
[X]mR5
[式中、
X=式R6−C(O)Oのエステル基であり;
R6=ヒドロキシル基またはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C7の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、R6=C2〜C7の場合には、R6は、任意選択で1つまたは複数のエーテル結合を含み;
R5=ヒドロキシル基で置換されていてもよい、C1〜C6の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または5員環ヘテロ芳香族部分、または6員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり;ここで、R5中の各炭素原子は個々に、1個以下のヒドロキシル基または1個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み;R5は任意選択で、1つまたは複数のエーテル結合を含み;
m=1からR5中の炭素原子数までの範囲の整数である]を有し、25℃で少なくとも5ppmの水溶解性を有する1つまたは複数のエステル;
(ii)構造
(iii)式:
(iv)1つまたは複数のアシル化単糖類、アシル化二糖類、またはアシル化多糖類;および
(v)(i)〜(iv)の任意の組合せ
からなる群から選択される少なくとも1つの基質と、
c)過酸素源と、
d)少なくとも1つの界面活性剤と
を含むランドリーケア組成物を提供する。
以下の配列は、米国特許法施行規則第1.821〜1.825条(「ヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則(Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures−the Sequence Rules)」)に準拠し、世界知的所有権機関(WIPO)標準ST.25(2009年)、ならびに欧州特許条約(EPC)および特許協力条約(PCT)の規則5.2および49.5(aの2)および実施細則の208項および付録Cの配列表の要件と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号およびフォーマットは、米国特許法施行規則第1.822条に記載の規則に準拠する。
過加水分解活性を有すると以前に報告されたCE−7エステラーゼの「シグネチャーモチーフ」は、以下の3つの保存サブモチーフで構成される(参照配列である配列番号2;野生型サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)アセチルキシランエステラーゼに関連した残基位置番号付け):
a)Arg118−Gly119−Gln120;(「RGQモチーフ)」;
b)Gly186−Xaa187−Ser188−Gln189−Gly190;(「GXSQGモチーフ」);および
c)His303−Glu304;(「HEモチーフ」)。
a)Arg118−Gly119−Gln120;(「RGQモチーフ)」;
b)Gly186−Xaa187−Ser188−Gln189−Gly190;(「GXSQGモチーフ」);および
c)His303−Xaa304;(「HXモチーフ)」;ここで、Xaaはグルタミン酸ではない。
過加水分解活性を有する酵素触媒の存在下で、カルボン酸エステルおよび無機過酸化物(過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム、または過炭酸ナトリウムなど)により、少なくとも1つのペルオキシカルボン酸を含む水性製剤を製造する方法を提供する。ここで、酵素触媒は、一実施形態では、配列番号4、6、8、10、12、14、および16からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するが、触媒ヒスチジンのC末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではないポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、過加水分解活性を有するポリペプチドは、配列番号4、6、8、10、12、14、および16から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号12のアミノ酸配列を有する。
[X]mR5
[式中、X=式R6C(O)Oのエステル基
R6=ヒドロキシル基またはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C7の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、R6=C2〜C7の場合には、R6は、任意選択で1つまたは複数のエーテル結合を含み;
R5=ヒドロキシル基で置換されていてもよい、C1〜C6の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または5員環ヘテロ芳香族部分、または6員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり;ここで、R5中の各炭素原子は個々に、1個以下のヒドロキシル基または1個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み;R5は任意選択で、1つまたは複数のエーテル結合を含み;
m=1からR5中の炭素原子数までの範囲の整数である]により示され、25℃で少なくとも5ppmの水溶解性を有する1つまたは複数のエステルを含む。
ペルオキシカルボン酸は、いったん生成すると、かなり反応性があり、これらに限定されるものではないが、温度およびpHを含む変数に依存して、長時間にわたって濃度が減少する可能性がある。そのため、特に液体製剤については、種々の反応成分を分離しておくことが望ましいことがある。一態様では、過酸化水素源を基質またはペルヒドロラーゼ触媒のいずれか、好ましくはその両方から分離する。このことは、これに限定されるものではないが、マルチコンパートメントチャンバーのあるディスペンサー(米国特許第4,585,150号明細書)の使用を含む、種々の手法を使用して達成することができ、使用時に過酸素源(過酸化水素など)および本基質とペルヒドロラーゼ触媒を物理的に混合して、水性酵素的過加水分解反応を開始させる。ペルヒドロラーゼ触媒は、任意選択で、反応チャンバーの本体内部に固定するか、または処理の対象となる表面および/または物体と接触させる前にペルオキシカルボン酸を含む反応生成物から分離(例えば、濾過等)することができる。ペルヒドロラーゼ触媒は、液体マトリックスまたは固体形態(例えば、粉末または錠剤)であっても、固体マトリックス内に埋め込まれていてもよく固体マトリックスをその後基質と混合して酵素的過加水分解反応を開始させる。さらなる態様では、ペルヒドロラーゼ触媒を、溶解性または多孔性のパウチ内に含有することができ、水性基質マトリックスに添加して、酵素的過加水分解を開始させることができる。さらにさらなる態様では、ペルヒドロラーゼ触媒は、溶解性または多孔性のパウチの別のコンパートメント内に含有される内容物を含むことができ、このパウチには、エステル基質および/または過酸化物源を含む封入内容物に対する少なくとも1つの追加のコンパートメントがある。追加のさらなる態様では、酵素触媒を含む粉末を基質(例えば、トリアセチン)中に懸濁し、使用時に水中の過酸素源と混合する。
反応物および生成物を分析するために、本方法では種々の分析法を使用することができ、その方法としては、これらに限定されるものではないが、滴定、高速液体クロマトグラフィ(HPLC)、ガスクロマトグラフィ(GC)、質量分析(MS)、キャピラリー電気泳動法(CE)、U.Karstら(Anal.Chem.,69(17):3623−3627(1997))により記載されたHPLC分析法、および米国特許第7,951,566号明細書に記載される2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾタゾリン(ethylbenzothazoline))−6−スルホネート(ABTS)アッセイ(U.Pinkernell et al.,The Analyst 122:567−571(1997);S.Minning,et al.,Analytica Chimica Acta 378:293−298(1999)および国際公開第2004/058961A1号パンフレットを参照のこと)が挙げられる。
J.Gabrielsonら(J.Microbiol.Methods 50:63−73(2002))により記載される方法を、ペルオキシカルボン酸、または過酸化水素および酵素基質の最小殺生物濃度(MBC)の決定に使用することができる。このアッセイ法は、XTTの還元阻害に基づいており、ここで、XTT((2,3−ビス[2−メトキシ−4−ニトロ−5−スルホフェニル]−5−[(フェニルアミノ)カルボニル]−2H−テトラゾリウム、分子内塩、モノナトリウム塩)は、490nmまたは450nmで測定される光学密度(OD)の変化によって微生物の呼吸活性を示す酸化還元色素である。しかしながら、消毒剤および防腐剤の活性を試験するために利用可能な種々の他の方法があり、その方法としては、これらに限定されるものではないが、生菌プレートカウント、直接顕微鏡カウント、乾燥重量、濁度測定、吸光度、および生物発光が挙げられる(例えば、Brock,Semour S.,Disinfection,Sterilization,and Preservation,第5版,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,USA;2001を参照のこと)。
本方法に従って生成した、酵素触媒により発生のペルオキシカルボン酸は、生物学的汚染物質の濃度を低減するために、種々の硬質表面/無生物体に適用して使用することができ、例えば、医療機器(例えば、内視鏡)、織物(衣服およびカーペットなど)、食品調理表面、食品貯蔵および食品包装装置、食品包装に使用される材料、鶏の孵化場および成育施設、動物の囲い、ならびに微生物および/または殺ウイルス活性を有する使用済みプロセス水の汚染除去に使用することができる。酵素により発生のペルオキシカルボン酸は、プリオン(例えば、特定のプロテアーゼ)を不活性化し、さらに殺生物活性を示すように設計された製剤に使用することができる(米国特許第7,550,420号明細書(DiCosimo et al.)を参照のこと)。
本明細書に記載する過加水分解酵素は、少し例を挙げると、ヘアケア(漂白、脱毛)、スキンケア(皮膚美白、抗微生物)、および口腔ケア用途(歯のホワイトニング/漂白または消毒)など、パーソナル用途のための過酸有益薬剤を生成するために使用することができる。本明細書に記載する組成物および方法は、ヘアケア、スキンケア、ネイルケア、または他のパーソナルケア製品での使用が公知であるか、そうでなければそれらの使用に有効な1つまたは複数の皮膚科学的にまたは美容的に許容される成分をさらに含むことができる。ただし、この任意選択の成分は、本明細書に記載する必須成分と物理的および化学的に適合性があるか、そうでなければ製品の安定性、美観、または性能を過度に損なわないものである。そのような任意選択成分の非限定例が、International Cosmetic Ingredient Dictionary,第9版,2002,およびCTFA Cosmetic Ingredient Handbook,第10版,2004に開示されている。
本発明の配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種宿主細胞、特に微生物宿主細胞において、生成させることができる。本発明の遺伝子および核酸分子の発現のための好ましい異種宿主細胞は、真菌または細菌ファミリーの中に見出すことができ、広範な温度、pH値、および溶媒耐性にわたって増殖する微生物宿主である。例えば、細菌、酵母、および糸状菌のいずれも本発明の核酸分子の発現の適切な宿主になり得ると考えられる。ペルヒドロラーゼは、細胞内、細胞外、または細胞内および細胞外の両方の組合せで発現され得るが、細胞外発現では、発酵産物からの所望のタンパク質の回収が、細胞内発現により産生されるタンパク質の回収方法よりも容易になる。転写、翻訳、およびタンパク質生合成装置は、細胞バイオマスを生成するために使用される細胞の供給原料に比較して、変化しないものであり、機能遺伝子はそれに関係なく発現される。宿主株の例としては、これらに限定されるものではないが、細菌、真菌、または酵母種、例えば、アスペルギルス属(Aspergillus)、トリコデルマ属(Trichoderma)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ピキア属(Pichia)、ファフィア属(Phaffia)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、カンジダ属(Candida)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、ヤロウィア属(Yarrowia)、サルモネラ属(Salmonella)、バチルス属(Bacillus)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、ザイモモナス属(Zymomonas)、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)、エリスロバクター属(Erythrobacter)、クロロビウム属(Chlorobium)、クロマチウム属(Chromatium)、フラボバクテリウム属(Flavobacterium)、サイトファーガ属(Cytophaga)、ロドバクター属(Rhodobacter)、ロドコッカス属(Rhodococcus)、ストレプトミセス属(Streptomyces)、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium)、コリネバクテリア属(Corynebacteria)、マイコバクテリウム属(Mycobacterium)、ディノコッカス属(Deinococcus)、エシェリキア属(Escherichia)、エルウィニア属(Erwinia)、パンテア属(Pantoea)、シュードモナス属(Pseudomonas)、スフィンゴモナス属(Sphingomonas)、メチロモナス属(Methylomonas)、メチロバクター属(Methylobacter)、メチロコッカス属(Methylococcus)、メチロサイナス属(Methylosinus)、メチロミクロビウム属(Methylomicrobium)、メチロシスティス属(Methylocystis)、アルカリゲネス属(Alcaligenes)、シネコシスティス属(Synechocystis)、シネココッカス属(Synechococcus)、アナベナ属(Anabaena)、チオバチルス属(Thiobacillus)、メタノバクテリウム属(Methanobacterium)、クレブシエラ属(Klebsiella)、およびミキソコッカス属(Myxococcus)が挙げられる。一実施形態では、細菌宿主株には、エシェリキア属(Escherichia)、バチルス属(Bacillus)、およびシュードモナス属(Pseudomonas)が含まれる。好ましい実施形態では、細菌宿主細胞は、枯草菌(Bacillus subtilis)または大腸菌(Escherichia coli)である。
ペルヒドロラーゼ触媒を製造するために種々の培養方法を適用することができる。組換え微生物宿主から過剰発現される特定の遺伝子産物の大規模生産は、バッチ培養、流加培養、および連続培養の方法によって行うことができる。バッチ培養法および流加培養法は一般的であり、当技術分野において周知であり、その例は、Thomas D.Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,第2版,Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA(1989)およびDeshpande,Mukund V.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36:227(1992)に見出すことができる。
以下の実施例は、種々の実施形態を実証するために提供するものである。以下の実施例において開示される手法は、本明細書において開示される方法の実施において十分に機能することが発明者によって発見された手法であり、したがって、その実施のための好ましい方式を構成するものとみなされ得ることを、当業者は認識すべきである。しかしながら、当業者は、本発明の開示を考慮して、開示される特定の実施形態において多くの変更がなされ得るものであり、しかもそれでも本発明で開示される方法の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを認識すべきである。
大腸菌(E.coli)における、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼのクローニングおよび産生
GENBANK(登録商標)(受託番号ACU35776.1;GI:255920265)に報告される、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)由来のアセチルキシランエステラーゼ酵素をコードする遺伝子を、大腸菌(E.coli)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)における発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。核酸生成物(配列番号3)を、PJEXPRESS404(登録商標)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)にサブクローニングして、pMP91として同定されるプラスミドを作製した。プラスミドpMP91を使用して大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許第7,723,083号明細書に記載される)を形質転換して、KLP18/pMP91として同定される菌株を作製した。KLP18/pMP91を、LB培地中、37℃で振盪しながら、OD600nm=0.4〜0.5になるまで増殖させ、その時点で、IPTGを最終濃度1mMになるように添加し、インキュベーションを2〜3時間継続した。細胞を
大腸菌(E.coli)における、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼのクローニングおよび産生
GENBANK(登録商標)(受託番号AEE71478.1;GI:332674662)に報告される、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)由来のアセチルキシランエステラーゼ酵素をコードする遺伝子を、大腸菌(E.coli)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)における発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。核酸生成物(配列番号5)を、PJEXPRESS404(登録商標)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)にサブクローニングして、pMP92として同定されるプラスミドを作製した。プラスミドpMP92を使用して大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許第7,723,083号明細書に記載される)を形質転換して、KLP18/pMP92として同定される菌株を作製した。KLP18/pMP92を、LB培地中、37℃で振盪しながら、OD600nm=0.4〜0.5になるまで増殖させ、その時点で、IPTGを最終濃度1mMになるように添加し、インキュベーションを2〜3時間継続した。細胞を
大腸菌(E.coli)における、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼのクローニングおよび産生
GENBANK(登録商標)(受託番号CAX00506.1;GI:225702544)に報告される、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)由来のアセチルキシランエステラーゼ酵素をコードする遺伝子を、大腸菌(E.coli)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)における発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。核酸生成物(配列番号7)を、PJEXPRESS404(登録商標)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)にサブクローニングして、pMP93として同定されるプラスミドを作製した。プラスミドpMP93を使用して大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許第7,723,083号明細書に記載される)を形質転換して、KLP18/pMP93として同定される菌株を作製した。KLP18/pMP93を、LB培地中、37℃で振盪しながら、OD600nm=0.4〜0.5になるまで増殖させ、その時点で、IPTGを最終濃度1mMになるように添加し、インキュベーションを2〜3時間継続した。細胞を
大腸菌(E.coli)における、スタッケブランジチア・ナッソエンシス(Stackebrandtia nassauensis)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼのクローニングおよび産生
GENBANK(登録商標)(受託番号ADD42786.1;GI:290569821)に報告される、スタッケブランジチア・ナッソエンシス(Stackebrandtia nassauensis)由来のアセチルキシランエステラーゼ酵素をコードする遺伝子を、大腸菌(E.coli)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)における発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。核酸生成物(配列番号9)を、PJEXPRESS404(登録商標)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)にサブクローニングして、pMP94として同定されるプラスミドを作製した。プラスミドpMP91を使用して大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許第7,723,083号明細書に記載される)を形質転換して、KLP18/pMP94として同定される菌株を作製した。KLP18/pMP94を、LB培地中、37℃で振盪しながら、OD600nm=0.4〜0.5になるまで増殖させ、その時点で、IPTGを最終濃度1mMになるように添加し、インキュベーションを2〜3時間継続した。細胞を
大腸菌(E.coli)における、ストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼのクローニングおよび産生
GENBANK(登録商標)(受託番号AAM98949.1;GI:22533045)に報告される、ストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)由来のアセチルキシランエステラーゼ酵素をコードする遺伝子を、大腸菌(E.coli)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)における発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。核酸生成物(配列番号11)を、PJEXPRESS404(登録商標)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)にサブクローニングして、pMP95として同定されるプラスミドを作製した。プラスミドpMP95を使用して大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許第7,723,083号明細書に記載される)を形質転換して、KLP18/pMP95として同定される菌株を作製した。KLP18/pMP95を、LB培地中、37℃で振盪しながら、OD600nm=0.4〜0.5になるまで増殖させ、その時点で、IPTGを最終濃度1mMになるように添加し、インキュベーションを2〜3時間継続した。細胞を
ペルヒドロラーゼ活性のアッセイ
抽出物上清中のペルヒドロラーゼ活性は、22.5mMのトリアセチン、22.5mMの過酸化水素、および6.25μg/mLの抽出物上清全可溶性タンパク質を含有する反応物により決定した。外気温(22〜24℃)で10分間インキュベートした。反応を、100mMのオルト−フェニレンジアミンを含有する1.25Mのリン酸を等量加えることにより停止させた。30分後、458nmの吸光度を測定した(表1)。追加のペルヒドロラーゼ活性測定を、10mMのトリアセチンおよび10mMの過酸化水素、または50mMのトリアセチンおよび50mMの過酸化水素を含有する反応物中で行った(表1)。T.マリティマ(T.maritima)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼも大腸菌(E.coli)KLP18中で産生させ(米国特許出願公開第2008−0176299号明細書に記載される)、ペルヒドロラーゼアッセイに対する陽性対照として使用した。CE−7酵素を含有しない大腸菌(E.coli)KLP18抽出物を陰性対照として使用した。
CE−7エステラーゼによる、トリアセチンおよび過酸化水素からの過酢酸の生成
反応(全容積10mL)は、トリアセチン(10mM)と、過酸化水素(20mM)と、実施例1〜5に記載するように調製された、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)(配列番号4)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)(配列番号6)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)(配列番号8)、スタッケブランジチア・ナッソエンシス(Stackebrandtia nassauensis)(配列番号10)、またはストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)(配列番号12)に由来するCE−7エステラーゼを含有する、5.0μg/mLの抽出物上清全可溶性タンパク質とを含有するリン酸カリウム緩衝液(50mM、pH7.0)中、25℃で行った。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の45秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応は、大腸菌(E.coli)KLP18(CE−7エステラーゼを発現するために使用された)から単離された、5.0μg/mLの抽出物全可溶性タンパク質を使用して、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、抽出物上清は実施例1の手順に従って調製した。さらに、第2の比較対照反応は、抽出物上清全可溶性タンパク質を添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解の結果であった。さらに、T.マリティマ(T.maritima)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼ(配列番号2)を、大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許出願公開第2008−0176299号明細書に記載される)中に産生させ、比較反応における陽性対照として使用した(細胞抽出物上清中の全可溶性タンパク質の11%)。
CE−7エステラーゼによる、プロピレングリコールジアセテートおよび過酸化水素からの過酢酸の生成
反応(全容積10mL)は、プロピレングリコールジアセテート(10mM)と、過酸化水素(20mM)と、実施例1〜4に記載するように調製された、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)(配列番号4)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)(配列番号6)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)(配列番号8)、またはスタッケブランジチア・ナッソエンシス(Stackebrandtia nassauensis)(配列番号10)に由来するCE−7エステラーゼを含有する、5.0μg/mLの抽出物上清全可溶性タンパク質とを含有するリン酸カリウム緩衝液(50mM、pH7.0)中、25℃で行った。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の45秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応は、大腸菌(E.coli)KLP18(CE−7エステラーゼを発現するために使用された)から単離された、5.0μg/mLの抽出物全可溶性タンパク質を使用して、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、抽出物上清は実施例1の手順に従って調製した。さらに、第2の比較対照反応は、抽出物上清全可溶性タンパク質を添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるプロピレングリコールジアセテートの化学的過加水分解の結果であった。さらに、T.マリティマ(T.maritima)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼ(配列番号2)を、大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許出願公開第2008−0176299号明細書に記載される)中に産生させ、比較反応における陽性対照として使用した(細胞抽出物上清中の全可溶性タンパク質の11%)。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例7に記載される方法に従った(表3)。
CE−7エステラーゼによる、α−D−グルコースペンタアセテートおよび過酸化水素か
らの過酢酸の生成
反応(全容積10mL)は、α−D−グルコースペンタアセテート(10mM)と、過酸化水素(20mM)と、実施例1、3、および5に記載するように調製された、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)(配列番号4)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)(配列番号8)、またはストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)(配列番号12)に由来するCE−7エステラーゼを含有する、5.0μg/mLの抽出物上清全可溶性タンパク質とを含有するリン酸カリウム緩衝液(50mM、pH7.0)中、25℃で行った。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の45秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応は、大腸菌(E.coli)KLP18(CE−7エステラーゼを発現するために使用された)から単離された、5.0μg/mLの抽出物全可溶性タンパク質を使用して、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、抽出物上清は実施例1の手順に従って調製した。さらに、第2の比較対照反応は、抽出物上清全可溶性タンパク質を添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるα−D−グルコースペンタアセテートの化学的過加水分解の結果であった。さらに、T.マリティマ(T.maritima)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼ(配列番号2)を、大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許出願公開第2008−0176299号明細書に記載される)中に産生させ、比較反応における陽性対照として使用した(細胞抽出物上清中の全可溶性タンパク質の11%)。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例7に記載される方法に従った(表4)。
CE−7エステラーゼによる、D−ソルビトールヘキサアセテートおよび過酸化水素から
の過酢酸の生成
反応(全容積10mL)は、D−ソルビトールヘキサアセテート(10mM)と、過酸化水素(20mM)と、実施例1および3に記載するように調製された、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)(配列番号4)またはストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)(配列番号8)に由来するCE−7エステラーゼを含有する、5.0μg/mLの抽出物上清全可溶性タンパク質とを含有するリン酸カリウム緩衝液(50mM、pH7.0)中、25℃で行った。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の45秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応は、大腸菌(E.coli)KLP18(CE−7エステラーゼを発現するために使用された)から単離された、5.0μg/mLの抽出物全可溶性タンパク質を使用して、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、抽出物上清は実施例1の手順に従って調製した。さらに、第2の比較対照反応は、抽出物上清全可溶性タンパク質を添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるD−ソルビトールヘキサアセテートの化学的過加水分解の結果であった。さらに、T.マリティマ(T.maritima)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼ(配列番号2)を、大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許出願公開第2008−0176299号明細書に記載される)中に産生させ、比較反応における陽性対照として使用した(細胞抽出物上清中の全可溶性タンパク質の11%)。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例7に記載される方法に従った(表5)。
CE−7エステラーゼによる、トリ−O−アセチル−D−グルカールおよび過酸化水素からの過酢酸の生成
反応(全容積50mL)は、トリ−O−アセチル−D−グルカール(2mM)と、過酸化水素(10mM)と、実施例1および3に記載するように調製された、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)(配列番号4)またはストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)(配列番号8)に由来するCE−7エステラーゼを含有する、5.0μg/mLの抽出物上清全可溶性タンパク質とを含有するリン酸カリウム緩衝液(10mM、pH7.0)中、25℃で行った。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の45秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応は、大腸菌(E.coli)KLP18(CE−7エステラーゼを発現するために使用された)から単離された、5.0μg/mLの抽出物全可溶性タンパク質を使用して、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、抽出物上清は実施例1の手順に従って調製した。さらに、第2の比較対照反応は、抽出物上清全可溶性タンパク質を添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるトリ−O−アセチル−D−グルカールの化学的過加水分解の結果であった。さらに、T.マリティマ(T.maritima)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼ(配列番号2)を、大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許出願公開第2008−0176299号明細書に記載される)中に産生させ、比較反応における陽性対照として使用した(細胞抽出物上清中の全可溶性タンパク質の11%)。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例7に記載される方法に従った(表6)。
CE−7エステラーゼによる、4−(アセチルオキシ)−安息香酸および過酸化水素からの過酢酸の生成
反応(全容積10mL)は、4−(アセチルオキシ)−安息香酸(CAS 2345−34−8;25mM)と、過酸化水素(20mM)と、実施例1〜4に記載するように調製された、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)(配列番号4)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)(配列番号6)、ストレプトコッカス・エクイ(Streptococcus equi)(配列番号8)、またはスタッケブランジチア・ナッソエンシス(Stackebrandtia nassauensis)(配列番号10)に由来するCE−7エステラーゼを含有する、5.0μg/mLの抽出物上清全可溶性タンパク質とを含有するリン酸カリウム緩衝液(50mM、pH7.0)中、20℃で行った。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の45秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応は、大腸菌(E.coli)KLP18(CE−7エステラーゼを発現するために使用された)から単離された、5.0μg/mLの加熱処理された抽出物全可溶性タンパク質を使用して、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、抽出物上清は実施例1の手順に従って調製した。さらに、第2の比較対照反応は、抽出物上清全可溶性タンパク質を添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素による4−(アセチルオキシ)−安息香酸の化学的過加水分解の結果であった。さらに、T.マリティマ(T.maritima)由来のCE−7アセチルキシランエステラーゼ(配列番号2)を、大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許出願公開第2008−0176299号明細書に記載される)中に産生させ、比較反応における陽性対照として使用した(細胞抽出物上清中の全可溶性タンパク質の11%)。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例7に記載される方法に従った(表7)。
アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)アセチルキシランエステラーゼ変異体のクローニングおよび産生
GENBANK(登録商標)(受託番号ACU35776.1;GI:255920265)に報告される、A.ミルム(A.mirum))由来のアセチルキシランエステラーゼ酵素の変異体をコードする遺伝子を、大腸菌(E.coli)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)における発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。核酸生成物(配列番号13)を、PJEXPRESS404(登録商標)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)にサブクローニングして、pMP91aとして同定されるプラスミドを作製した。コードされた変異体タンパク質は、Ami_C276S(配列番号14)と呼ばれる。プラスミドpMP91aを使用して大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許第7,723,083号明細書に記載される)を形質転換して、KLP18/pMP91aとして同定される菌株を作製した。KLP18/pMP91aを、LB培地中、37℃で振盪しながら、OD600nm=0.4〜0.5になるまで増殖させ、その時点で、IPTGを最終濃度1mMになるように添加し、インキュベーションを2〜3時間継続した。細胞を
アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)アセチルキシランエステラーゼ変異体のクローニングおよび産生
GENBANK(登録商標)(受託番号ACU35776.1;GI:255920265)に報告される、A.ミルム(A.mirum)由来のアセチルキシランエステラーゼ酵素の変異体をコードする遺伝子を、大腸菌(E.coli)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)における発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。核酸生成物(配列番号15)を、PJEXPRESS404(登録商標)(DNA 2.0,Menlo Park,CA)にサブクローニングして、pMP91bとして同定されるプラスミドを作製した。コードされた変異体タンパク質は、Ami_C276T(配列番号16)と呼ばれる。プラスミドpMP91bを使用して大腸菌(E.coli)KLP18(米国特許第7,723,083号明細書に記載される)を形質転換して、KLP18/pMP91bとして同定される菌株を作製した。KLP18/pMP91bを、LB培地中、37℃で振盪しながら、OD600nm=0.4〜0.5になるまで増殖させ、その時点で、IPTGを最終濃度1mMになるように添加し、インキュベーションを2〜3時間継続した。細胞を
ペルヒドロラーゼ活性のアッセイ
抽出物中のペルヒドロラーゼ活性は、22.5mMのトリアセチン、22.5mMの過酸化水素、および1.5μg/mLの全タンパク質を含有する反応物により決定した。外気温(22〜24℃)で10分間インキュベートした。反応を、100mMのオルト−フェニレンジアミンを含有する1.25Mのリン酸を等量加えることにより停止させた。30分後、458nmの吸光度を測定した(表8)。アセチルキシランエステラーゼ酵素を含有しない大腸菌(E.coli)KLP18抽出物を陰性対照として使用した。
CE−7エステラーゼ変異体による、トリアセチンおよび過酸化水素からの過酢酸の生成
反応(10mL全容積)は、トリアセチン(0.75mM)と、過酸化水素(1.4mM)と、野生型アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)(配列番号4、実施例1に記載されるように調製された)、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)C276S変異体(配列番号14、実施例13に記載されるように調製された)、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)C276T変異体(配列番号16、実施例14に記載されるように調製された)、T.マリティマ(T.maritima)C277S(配列番号17、米国特許第8,062,875号明細書に記載される大腸菌(E.coli)KLP18中で産生された)、およびT.マリティマ(T.maritima)C277T(配列番号18、米国特許第8,062,875号明細書に記載される大腸菌(E.coli)KLP18中で産生された)に由来する、1.0μg/mLまたは2.0μg/mLのいずれかのCE−7エステラーゼとを含有するリン酸カリウム緩衝液(20mM、pH7.0)中、25℃で行った。ImageJ(パブリックドメインのJava画像処理プログラム)を使用するゲル分析と組み合わせてSDS−PAGEゲルによるCE−7エステラーゼ含有細胞抽出物の分析を使用して、全可溶性タンパク質のパーセントとして細胞抽出物中のCE−7エステラーゼ濃度を算出した。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の45秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応を、CE−7エステラーゼを添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解の結果であった。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例7に記載される方法に従った(表9)。
CE−7エステラーゼ変異体による、トリアセチンおよび過酸化水素からの過酢酸の生成
反応(10mL全容積)は、トリアセチン(10mM)と、過酸化水素(20mM)と、野生型アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)(配列番号4、実施例1に記載されるように調製された)、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)C276S変異体(配列番号14、実施例13に記載されるように調製された)、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)C276T変異体(配列番号16、実施例14に記載されるように調製された)、T.マリティマ(T.maritima)C277S(配列番号17)、およびT.マリティマ(T.maritima)C277T(配列番号18)に由来する、0.5μg/mLのCE−7エステラーゼとを含有するリン酸カリウム緩衝液(50mM、pH7.0)中、25℃で行った。ImageJ(パブリックドメインのJava画像処理プログラム)を使用するゲル分析と組み合わせてSDS−PAGEゲルによるCE−7エステラーゼ含有細胞抽出物の分析を使用して、全可溶性タンパク質のパーセントとして細胞抽出物中のCE−7エステラーゼ濃度を算出した。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の45秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応を、CE−7エステラーゼを添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解の結果であった。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例7に記載される方法に従った(表10)。
CE−7エステラーゼ変異体による、トリアセチンおよび過酸化水素からの過酢酸の生成
反応(10mL全容積)は、トリアセチン(0.75mM)と、過酸化水素(1.4mM、過炭酸ナトリウム由来)と、野生型アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)(配列番号4、実施例1に記載されるように調製された)、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)C276S変異体(配列番号14、実施例13に記載されるように調製された)、アクチノシンネマ・ミルム(Actinosynnema mirum)C276T変異体(配列番号16、実施例14に記載されるように調製された)、T.マリティマ(T.maritima)C277S(配列番号17)、およびT.マリティマ(T.maritima)C277T(配列番号18)に由来する、1.0μg/mLまたは2.0μg/mLのいずれかのCE−7エステラーゼとを含有する炭酸ナトリウム緩衝液(20mM、pH10.5)中、25℃で行った。ImageJ(パブリックドメインのJava画像処理プログラム)を使用するゲル分析と組み合わせてSDS−PAGEゲルによるCE−7エステラーゼ含有細胞抽出物の分析を使用して、全可溶性タンパク質のパーセントとして細胞抽出物中のCE−7エステラーゼ濃度を算出した。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の45秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応を、CE−7エステラーゼを添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解の結果であった。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例7に記載される方法に従った(表11)。
Claims (16)
- ペルオキシカルボン酸を生成するための方法であって、
(a)
(1)
(i)構造
[X]mR5
[式中、
X=式R6−C(O)Oのエステル基であり;
R6=ヒドロキシル基またはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C7の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、R6=C2〜C7の場合には、R6は、任意選択で1つまたは複数のエーテル結合を含み;
R5=ヒドロキシル基で置換されていてもよい、C1〜C6の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または5員環ヘテロ芳香族部分、または6員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり;ここで、R5中の各炭素原子は個々に、1個以下のヒドロキシル基または1個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み;R5は任意選択で、1つまたは複数のエーテル結合を含み;
m=1からR5中の炭素原子数までの範囲の整数である]を有し、25℃で少なくとも5ppmの水溶解性を有する1つまたは複数のエステル;
(ii)構造
(iii)式:
(iv)1つまたは複数のアシル化単糖類、アシル化二糖類、またはアシル化多糖類;および
(v)(i)〜(iv)の任意の組合せ
からなる群から選択される少なくとも1つの基質と、
(2)過酸素源と、
(3)過加水分解活性と、配列番号12に示すアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドを含む酵素触媒であって、触媒ヒスチジンのC末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない酵素触媒と
を含む反応成分セットを準備するステップと、
(b)適切な条件下で前記反応成分セットを混合し、それによってペルオキシカルボン酸を生成するステップと、
(c)任意選択で、ステップ(b)で生成される前記ペルオキシカルボン酸を希釈するステップと
を含む方法。 - d)硬質表面または無生物体をステップ(b)またはステップ(c)で生成された前記ペルオキシカルボン酸と接触させるステップであって、それによって前記硬質表面または前記無生物体が消毒、漂白、脱染、またはそれらの組合せを受けるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記無生物体が医療機器である、請求項1に記載の方法。
- d)衣類または織物を、ステップ(b)またはステップ(c)で生成されたペルオキシカルボン酸と接触させるステップであって、それによって衣類または織物が有益性を得るステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記有益性が、消毒、衛生化、漂白、脱染、脱臭、およびそれらの組合せから選択される、請求項4に記載の方法。
- d)木材パルプまたは製紙用パルプを、ステップ(b)またはステップ(c)で生成されたペルオキシカルボン酸と接触させるステップであって、それによって木材パルプまたは製紙用パルプが漂白されるステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記基質が、モノアセチン;ジアセチン;トリアセチン;モノプロピオニン;ジプロピオニン;トリプロピオニン;モノブチリン;ジブチリン;トリブチリン;グルコースペンタアセテート;β−D−ガラクトースペンタアセテート、ソルビトールヘキサアセテート、スクロースオクタアセテート、キシローステトラアセテート;アセチル化キシラン;アセチル化キシラン断片;β−D−リボフラノース−1,2,3,5−テトラアセテート;トリ−O−アセチル−D−ガラクタール;トリ−O−アセチル−D−グルカール;1,2−エタンジオール、1,2−プロパンジオール、1,3−プロパンジオール、1,2−ブタンジオール、1,3−ブタンジオール、2,3−ブタンジオール、1,4−ブタンジオール、1,2−ペンタンジオール、2,5−ペンタンジオール、1,6−ペンタンジオール、1,2−ヘキサンジオール、2,5−ヘキサンジオール、1,6−ヘキサンジオールのモノエステルまたはジエステル;4−アセトキシ安息香酸;およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記基質がトリアセチンである、請求項7に記載の方法。
- 前記生成されるペルオキシカルボン酸が、過酢酸、過プロピオン酸、過酪酸、過乳酸、過グリコール酸、過メトキシ酢酸、過β−ヒドロキシ酪酸、またはそれらの混合物である、請求項1に記載の方法。
- 前記酵素触媒が、微生物細胞、透過性になった微生物細胞、微生物細胞抽出物、部分精製酵素、または精製酵素の形態である、請求項1に記載の方法。
- (a)
(1)
(i)構造
[X]mR5
[式中、
X=式R6−C(O)Oのエステル基であり;
R6=ヒドロキシル基またはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C7の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、R6=C2〜C7の場合には、R6は、任意選択で1つまたは複数のエーテル結合を含み;
R5=ヒドロキシル基で置換されていてもよい、C1〜C6の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または5員環ヘテロ芳香族部分、または6員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり;ここで、R5中の各炭素原子は個々に、1個以下のヒドロキシル基または1個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み;R5は任意選択で、1つまたは複数のエーテル結合を含み;
m=1からR5中の炭素原子数までの範囲の整数である]を有し、25℃で少なくとも5ppmの水溶解性を有する1つまたは複数のエステル;
(ii)構造
(iii)式:
(iv)1つまたは複数のアシル化単糖類、アシル化二糖類、またはアシル化多糖類;および
(v)(i)〜(iv)の任意の組合せ
からなる群から選択される少なくとも1つの基質と、
(2)過酸素源と、
(3)過加水分解活性と、配列番号12に示すアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドを含む酵素触媒であって、触媒ヒスチジンのC末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない酵素触媒と
を含む反応成分セット、ならびに
(b)(a)の前記反応成分セットを混合すると形成される少なくとも1つのペルオキシカルボン酸
を含む組成物。 - 過酸の発生および送達系であって、
(a)
(1)過加水分解活性と、配列番号12に示すアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドを含む酵素触媒であって、触媒ヒスチジンのC末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない酵素触媒と
(2)
(i)構造
[X]mR5
[式中、
X=式R6−C(O)Oのエステル基であり;
R6=ヒドロキシル基またはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C7の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、R6=C2〜C7の場合には、R6は、任意選択で1つまたは複数のエーテル結合を含み;
R5=ヒドロキシル基で置換されていてもよい、C1〜C6の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または5員環ヘテロ芳香族部分、または6員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり;ここで、R5中の各炭素原子は個々に、1個以下のヒドロキシル基または1個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み;R5は任意選択で、1つまたは複数のエーテル結合を含み;
m=1からR5中の炭素原子数までの範囲の整数である]を有し、25℃で少なくとも5ppmの水溶解性を有する1つまたは複数のエステル;
(ii)構造
(iii)式:
(iv)1つまたは複数のアシル化単糖類、アシル化二糖類、またはアシル化多糖類;および
(v)(i)〜(iv)の任意の組合せ
からなる群から選択される少なくとも1つの基質と、
(3)任意選択の緩衝液と
を含む第1のコンパートメント、ならびに
(b)
(1)過酸素源と、
(2)過酸化物安定化剤と
(3)任意選択の緩衝液と
を含む第2のコンパートメント
を含む過酸の発生および送達系。 - 前記基質がトリアセチンを含む、請求項12に記載の過酸の発生および送達系。
- a)過加水分解活性と、配列番号12に示すアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドであって、触媒ヒスチジンのC末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない酵素触媒と、
b)
(i)構造
[X]mR5
[式中、
X=式R6−C(O)Oのエステル基であり;
R6=ヒドロキシル基またはC1〜C4アルコキシ基で置換されていてもよい、C1〜C7の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、R6=C2〜C7の場合には、R6は、任意選択で1つまたは複数のエーテル結合を含み;
R5=ヒドロキシル基で置換されていてもよい、C1〜C6の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または5員環ヘテロ芳香族部分、または6員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり;ここで、R5中の各炭素原子は個々に、1個以下のヒドロキシル基または1個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み;R5は任意選択で、1つまたは複数のエーテル結合を含み;
m=1からR5中の炭素原子数までの範囲の整数である]を有し、
25℃で少なくとも5ppmの水溶解性を有する1つまたは複数のエステル;
(ii)構造
(iii)式:
nHであり、nは1〜10である]の1つまたは複数のエステル;
(iv)1つまたは複数のアシル化単糖類、アシル化二糖類、またはアシル化多糖類;および
(v)(i)〜(iv)の任意の組合せ
からなる群から選択される少なくとも1つの基質と、
c)過酸素源と、
d)少なくとも1つの界面活性剤と
を含むランドリーケア組成物。 - 過加水分解活性を有するポリペプチドを含むランドリーケア製品であって、前記ポリペプチドが、配列番号12に示すアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を有するが、触媒ヒスチジンのC末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない、パーソナルケア製品。
- 前記製品が、シャンプー、ボディーローション、シャワーゲル、局所保湿剤、練り歯磨き、歯磨きゲル、マウスウォッシュ、マウスリンス、アンチプラークリンス、または局所クレンザーである、請求項15に記載のパーソナルケア製品。
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