JP5777517B2 - ペルヒドロラーゼの安定化 - Google Patents
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Description
本明細書は、その各内容全体を参照によって本明細書に援用する、それぞれ2008年10月3日に出願された米国仮特許出願第61/102,505号明細書、米国仮特許出願第61/102,512号明細書、米国仮特許出願第61/102,514号明細書、米国仮特許出願第61/102,520号明細書、米国仮特許出願第61/102,531号明細書、および米国仮特許出願第61/102,539号明細書の優先権を主張する。
(a)構造的にCE−7酵素に分類されて過加水分解活性を有する少なくとも1つの酵素と、少なくとも1つの賦形剤と、任意選択により少なくとも1つの界面活性剤とを含む水性調合物を提供するステップと、
(b)前記(a)の水性調合物を噴霧乾燥させて、前記少なくとも1つの酵素と、前記少なくとも1つのオリゴ糖類賦形剤と、任意選択により前記少なくとも1つの界面活性剤とを含む酵素粉末を生成するステップと、
(c)前記(b)の酵素粉末を少なくとも1つの緩衝液およびカルボン酸エステルと組み合わせて調合物を形成するステップと
を含み、前記調合物への前記少なくとも1つの緩衝液の添加が、前記調合物中に保存される場合の前記少なくとも1つの酵素の過加水分解活性安定性を増強する、方法が提供される。
(a)モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン、トリプロピオニン、モノブチリン、ジブチリン、トリブチリンからなる群から選択される少なくとも1つのカルボン酸エステル、およびそれらの混合物と、
(b)構造的にCE−7酵素に分類されて過加水分解活性を有する少なくとも1つの酵素の噴霧乾燥調合物と、少なくとも1つの賦形剤と、任意選択により少なくとも1つの界面活性剤とを含む酵素粉末と、
(c)前記調合物中に存在する場合の前記少なくとも1つの酵素の安定性を増強する、少なくとも1つの緩衝液と
の混合物を含む、調合物が提供される。
(a)一揃いの反応構成要素を提供するステップであって
(1)上述の調合物と、
(2)水中の過酸素源と
を含む、一揃いの反応構成要素を提供するステップと、
(b)前記反応構成要素を組み合わせて、それによってペルオキシカルボン酸が生成されるステップと
を含む、方法が提供される。
(a)一揃いの反応構成要素を提供するステップであって
(1)上述の調合物と、
(2)水中の過酸素源と
を含む、ステップと、
(b)前記反応構成要素を組み合わせて、それによってペルオキシカルボン酸が生成されるステップと、
(c)任意選択により前記ペルオキシカルボン酸生成物を希釈するステップと、
(d)前記硬表面または無生物的対象物に前記ステップ(b)またはステップ(c)で生成されたペルオキシカルボン酸生成物を接触させて、それによって前記表面または前記無生物的対象物を消毒するステップと
を含む、方法が提供される。
(a)一揃いの反応構成要素を提供するステップであって
(1)混合物であって
(i)上述の調合物と、
(ii)カルボン酸エステルと
を含む調合物と、
(2)過酸素源と
を含む、ステップと、
(b)適切な水性反応条件下で、前記反応構成要素を組み合わせて、それによってペルオキシカルボン酸生成物が形成されるステップと、
(c)任意選択により前記ペルオキシカルボン酸生成物を希釈するステップと、
(d)前記衣料品またはテキスタイルにステップ(b)またはステップ(c)で生成されたペルオキシカルボン酸を接触させるステップと
を含み、前記衣料品またはテキスタイルが清潔にされ、脱染され、脱臭され、衛生化され、消毒され、またはその組み合わせがなされる、方法である。
以下の配列は、37C.F.R.§§1.821〜1.825(”Requirements for Patent Applications Containing Nucleotide Sequences and/or Amino Acid Sequence Disclosures − the Sequence Rules”「ヌクレオチド配列および/またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」)を満たし、世界知的所有権機関(WIPO)標準ST.25(1998)、および欧州特許条約(EPC)および特許協力条約(PCT)規則5.2および49.5(aの2)の配列表要件、および実施細則第208号および附属書Cに一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、37C.F.R.§1.822で述べられる規則に従う。
(a)式、
[X]mR5
(式中、
Xは式R6C(O)Oのエステル基であり、
R6は任意選択により水酸基またはC1〜C4アルコキシ基で置換される、C1〜C7直鎖、分枝または環式ヒドロカルビル部分であり、R6は任意選択により1つ以上のエーテル結合を含み、R6はC2〜C7であり;
R5は任意選択により水酸基で置換される、C1〜C6直鎖、分枝、または環式ヒドロカルビル部分であり、R5中の各炭素原子は個々に1つを超えない水酸基または1つを超えないエステル基を含み、R5は任意選択により1つ以上のエーテル結合を含み;
mは1からR5中の炭素原子数までである)の構造を有する、25℃で少なくとも5ppmの水への溶解度を有する1つ以上のエステル;または
(b)式、
R1は任意選択によりヒドロキシルまたはC1〜C4アルコキシ基で置換される、C1〜C7直鎖または分枝鎖アルキルであり、
R3およびR4は個々にHまたはR1C(O)である)の構造を有する1つ以上のグリセリド;または
(c)式、
R1は任意選択によりヒドロキシルまたはC1〜C4アルコキシ基で置換される、C1〜C7直鎖または分枝鎖アルキルであり、
R2はC1〜C10直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、(CH2CH2O)n、または(CH2CH(CH3)−O)nHであり、
nは1〜10である)の1つ以上のエステル;または
(d)1つ以上のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類、またはアセチル化多糖類;または
(e)(a)〜(d)のあらゆる組み合わせ
を指す。
a)第1の構成要素であって、
i)本明細書で開示される酵素粉末と、
ii)カルボン酸エステルと
を含み、任意選択により無機または有機緩衝液、腐食防止剤、湿潤剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるさらなる成分を含む第1の構成要素と、
b)過酸素源および水を含む第2の構成要素であって、任意選択により過酸化水素安定剤を含む第2の構成要素と
を含む、調合物が提供される。
ードされる、過加水分解活性を有する酵素を指す。したがって本発明は、特定の例示的な配列以上のものを包含するものと理解される。
1.小型脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基:Ala、Ser、Thr(Pro、Gly);
2.極性の負に帯電した残基およびそれらのアミド:Asp、Asn、Glu、Gln;3.極性の正に帯電した残基:His、Arg、Lys;
4.大型脂肪族、非極性残基:Met、Leu、Ile、Val(Cys);および
5.大型芳香族残基:Phe、Tyr、およびTrp。
a)Arg118−Gly119−Gln120;
b)Gly179−Xaa180−Ser181−Gln182−Gly183;およびc)His298−Glu299。
一態様は、構造的にCE−7酵素に分類されて過加水分解活性を有する少なくとも1つの酵素と、少なくとも1つの賦形剤と、任意選択により少なくとも1つの界面活性剤との調合物を含む、酵素粉末に関する。一実施態様では、噴霧乾燥によって酵素粉末が形成される。いくつかの実施態様では、少なくとも1つの賦形剤は、少なくとも約1250の数平均分子量および少なくとも約9000の重量平均分子量を有する、オリゴ糖類賦形剤である。
本発明の一態様では、過加水分解活性を有する酵素触媒存在下で、1つ以上のカルボン酸エステルと過酸素源(過酸化水素、過ホウ酸ナトリウムまたは過炭酸ナトリウム)とを反応させることで過酸を含む水性調合物を生成する方法が提供される。一実施態様では、酵素触媒は過加水分解活性を有する少なくとも1つの酵素を含み、前記酵素は構造的にCE−7炭水化物エステラーゼファミリーのメンバーに分類される(CE−7;Coutinho,P.M.,Henrissat,B.、前出を参照されたい)。別の実施態様では、ペルヒドロラーゼ触媒は構造的にセファロスポリンCデアセチラーゼに分類される。別の実施態様では、ペルヒドロラーゼ触媒は構造的にアセチルキシランエステラーゼに分類される。
CLUSTALWを使用して参照配列配列番号1と位置合わせすると、
a) アミノ酸残基118〜120としてのRGQモチーフ;
b) アミノ酸残基179〜183としてのGXSQGモチーフ;および
c) アミノ酸残基298〜299としてのHEモチーフ。
式、
[X]mR5
(式中、
X=式、R6C(O)Oのエステル基であり、
R6=水酸基またはC1〜C4アルコキシ基で任意選択により置換された、C1〜C7の直鎖、分枝または環式ヒドロカルビル部分であり;R6は任意選択によりR6=C2〜C7のための1つ以上のエーテル結合を含み、
R5=水酸基で任意選択により置換された、C1〜C6直鎖、分枝、または環式ヒドロカルビル部分であり;R5中の各炭素原子は個々に1つを超えない水酸基または1つを超えないエステル基を含み;R5は任意選択により1つ以上のエーテル結合を含み、
m=1〜R5中の炭素原子数である)によって提供されるエステルを含んでもよく、前記エステルは25℃で少なくとも5ppmの水への溶解度を有する。
式、
R1=ヒドロキシルまたはC1〜C4アルコキシ基で任意選択により置換されるC1〜C7の直鎖または分枝鎖アルキルであり、
R2=C1〜C10直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、(CH2CH2−O)nHまたは(CH2CH(CH3)−O)nHであり、
n=1〜10である)のエステルを含んでもよい。
式、
R1=ヒドロキシルまたはC1〜C4アルコキシ基で任意選択により置換されるC1〜C7直鎖または分枝鎖アルキルであり、
R3およびR4は個々にHまたはR1C(O)である)のグリセリドを含んでもよい。
セファロスポリンCデアセチラーゼ(E.C.3.1.1.41;系統名セファロスポリンCアセチルヒドロラーゼ;CAH)は、セファロスポリンC、7−アミノセファロスポラン酸、および7−(チオフェン−2−アセトアミド)セファロスポラン酸などのセファロスポリン上のアセチルエステル結合を加水分解する能力を有する酵素である(Abbott,B.およびFukuda,D.,Appl.Microbiol.30(3):413−419(1975))。CAHは、炭水化物エステラーゼファミリー7と称される、構造的に関連した酵素のより大きなファミリーに属する(「CE−7」;Coutinho,P.M.,Henrissat,B.、前出)。
本明細書の実施例で記載されるように、本方法では反応物質および生成物を分析するために、滴定、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、ガスクロマトグラフィー(GC)、質量分光分析(MS)、キャピラリー電気泳動法(CE)、U.Karstら(Anal.Chem.,69(17):3623−3627(1997))によって記載された分析手順、および2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾタゾリン(ethylbenzothazoline)−6−スルホン酸(ABTS)アッセイ(S.Minningら、Analytica Chimica Acta 378:293−298(1999)、および国際公開第2004/058961 A1号パンフレット)をはじめとするが、これに限定されるものではない、多様な分析法を使用し得る。
過酸または過酸化水素および酵素基質の最小殺生物性濃度(MBC)を判定するために、J.Gabrielsonら(J.Microbiol.Methods 50:63−73(2002))によって記載される方法を用い得る。アッセイ方法はXTT還元の阻害に基づき、XTT((2,3−ビス[2−メトキシ−4−ニトロ−5−スルホフェニル]−5−[(フェニルアミノ)カルボニル]−2H−テトラゾリウム、分子内塩、一ナトリウム塩)は、490nmまたは450nmで測定される光学濃度(OD)の変化によって微生物の呼吸活性を示す酸化還元染料である。しかし生菌平板計数、直接顕鏡計数、乾燥重量、濁度測定、吸光度、およびバイオルミネセンスをはじめとするが、これに限定されるものではない、消毒剤および滅菌剤の活性を試験するために利用できる多様なその他の方法がある(例えばBrock,Semour S.,Disinfection,Sterilization,and Preservation,5th edition,Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia,PA,USA;2001を参照されたい)。
本方法に従って生成される酵素触媒発生ペルオキシカルボン酸は、医療器具(例えば内視鏡)、テキスタイル(例えば被服、カーペット)、食品調理表面、食品保存および食品包装機器、食品包装のために使用される材料、孵化場および飼育設備、動物舎、および微生物および/または殺ウィルス性活性を有する使用済みプロセス水の汚染除去など、生物学的汚染物質濃度の低下のために、多様な硬表面/無生物的対象物用途で使用し得る。プリオンを不活性化するようにデザインされた調合物(例えば特定のプロテアーゼ)中で酵素生成されたペルオキシカルボン酸を使用して、殺生物性活性をさらに提供してもよい。好ましい態様では、本ペルオキシカルボン酸組成物は、加圧滅菌器処理できない医療器具および食品包装機器のための消毒剤として特に有用である。ペルオキシカルボン酸含有調合物はGRASまたは食品等級構成要素(酵素、酵素基質、過酸化水素、および緩衝液)を使用して調製してもよいので、酵素生成されたペルオキシカルボン酸はまた、動物屠体、肉、果物および野菜の汚染除去のため、または加工食品の汚染除去のために使用してもよい。酵素生成されたペルオキシカルボン酸は、その最終形態が粉末、液体、ゲル、フィルム、固体またはエアロゾルである生成物中に組み込んでもよい。酵素生成されたペルオキシカルボン酸は、有効な汚染除去をなおも提供する濃度に希釈してもよい。
本配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種性宿主細胞中、特に微生物宿主細胞中で生成されてもよい。本遺伝子および核酸分子の発現のための好ましい異種性宿主細胞は、真菌または細菌科内に見出し得て、広範囲の温度、pH値、および溶剤耐性範囲にわたって成長する微生物宿主である。例えば細菌、酵母、および糸状菌のいずれかが、本核酸分子の発現を適切にホストしてもよいことが考察される。ペルヒドロラーゼは、細胞内で、細胞外で、または細胞内および細胞外双方の組み合わせで発現されてもよく、細胞外発現は、細胞内発現によって生成されるタンパク質を回収する方法よりも、発酵産物からの所望タンパク質の回収をより容易にする。転写、翻訳およびタンパク質生合成装置は、細胞性生物由来資源を発生させるのに使用される細胞性原材料に対して不変のままであり、機能的遺伝子は関係なく発現される。宿主株の例としては、アスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(トリchoderma)、サッカロミセス(Saccharomyces)、ピチア(Pichia)、ファフィア(Phaffia)、クリヴェロミセス(Kluyveromyces)、カンジダ(Candida)、ハンゼヌラ(Hansenula)、ヤロウィア(Yarrowia)、サルモネラ(Salmonella)、バシラス(Bacillus)、アシネトバクター(Acinetobacter)、ザイモモナス(Zymomonas)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、エリスロバクター(Erythrobacter)、クロロビウム(Chlorobium)、クロマチウム(Chromatium)、フラボバクテリウム(Flavobacterium)、サイトファガ(Cytophaga)、ロドバクター(Rhodobacter)、ロドコッカス(Rhodococcus)、ストレプトミセス(Streptomyces)、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)、コリネバクテリウム(Corynebacteria)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、デイノコッカス(Deinococcus)、エシェリキア(Escherichia)、エルウィニア(Erwinia)、パントエア(Pantoea)、シュードモナス(Pseudomonas)、スフィンゴモナス(Sphingomonas)、メチロモナス(Methylomonas)、メチロバクター(Methylobacter)、メチロコッカス(Methylococcus)、メチロサイナス(Methylosinus)、メチロマイクロビウム(Methylomicrobium)、メチロシスティス(Methylocystis)、アルカリゲネス(Alcaligenes)、シネコシスティス(Synechocystis)、シネココッカス(Synechococcus)、アナベナ(Anabaena)、チオバシラス(Thiobacillus)、メタノバクテリウム(Methanobacterium)、クレブシエラ(Klebsiella)、およびミクソコッカス(Myxococcus)などの細菌、真菌または酵母種が挙げられるが、これに限定されるものではない。一実施態様では、細菌宿主株としては、エシェリキア(Escherichia)、バシラス(Bacillus)、クリヴェロミセス(Kluyveromyces)、およびシュードモナス(Pseudomonas)が挙げられる。好ましい実施態様では、細菌宿主細胞は大腸菌(Escherichia coli)である。
多様な培養法を応用してペルヒドロラーゼ触媒を生成してもよい。例えば組み換え微生物宿主から過剰発現される特定遺伝子産物の大量生産は、バッチ、流加、および連続培養法によって生じてもよい。バッチおよび流加培養法は当該技術分野で一般的良く知られており、実例はThomas D.Brock,Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,Second Edition,Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA(1989)およびDeshpande,Mukund V.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36:227(1992)に見られる。
以下の例は、好ましい実施態様実証するために提供される。続く実施例で開示される技術は、発明者によって発見された技術が本明細書で開示される方法の実施において良好に機能することを示し、したがってその実施のために好ましい様式を構成すると見なし得ることが、当業者には理解されるであろう。しかし当業者は、本開示に照らしてここで開示される方法の精神と範囲を逸脱することなく、開示される特定の実施態様に多くの変更を加えて、類似したまたは同様の結果がなおも得られることを理解する。
katGカタラーゼ中断大腸菌(E.coli)株の構築
配列番号28および配列番号29と同定されるプライマーを使用して、PCR(94℃で0.5分間、55℃で0.5分間、70℃で1分間、30サイクル)によって、プラスミドpKD13(配列番号27)からカナマイシン抵抗性遺伝子(kan;配列番号26)のコード領域を増幅し、配列番号30と同定されるPCR産物を発生させた。katG核酸配列は配列番号31として、対応するアミノ酸配列は配列番号32として提供される。大腸菌(E.coli)MG1655(ATCC(登録商標)47076(商標))をλ−Redリコンビナーゼ遺伝子(DatsenkoおよびWanner(2000)、PNAS USA 97:6640−6645)を含有する温度感受性プラスミドpKD46(配列番号33)で形質転換し、30℃で24時間LB−ampプレート上で選択した。電気穿孔(BioRad Gene Pulser、0.2cmキュベット、2.5kV、200W、25μF)によって、50〜500ngのPCR産物でMG1655/pKD46を形質転換し、37℃で24時間LB−kanプレート上で選択した。いくつかのコロニーをLB−kanプレート上に画線塗抹し、42℃で一晩インキュベートしてpKD46プラスミドを硬化させた。コロニーをチェックしてkanR/ampSの表現型を確認した。PUREGENE(登録商標)DNA精製システム(Gentra Systems,(Minneapolis,M))を使用していくつかのコロニーからゲノムDNAを単離し、配列番号34および配列番号35と同定されるプライマーを使用してPCRによりチェックしてkatG遺伝子の中断を確認した。いくつかのkatG−中断株をkan遺伝子を切除するのに使用されるFLPリコンビナーゼを含有する温度感受性プラスミドpCP20(配列番号36)で形質転換して、37℃で24時間LB−ampプレート上で選択した。いくつかのコロニーをLBプレート上に画線塗抹して42℃で一晩インキュベートし、pCP20プラスミドをキュアした。2つのコロニーをチェックしてkanS/ampSの表現型を確認し、MG1655 KatG1およびMG1655
KatG2と称した。
katEカタラーゼ中断大腸菌(E.coli)株の構築
配列番号37および配列番号38と同定されるプライマーを使用して、PCR(94℃で0.5分間、55℃で0.5分間、70℃で1分間、30サイクル)によって、プラスミドpKD13(配列番号27)からカナマイシン抵抗性遺伝子(配列番号26)を増幅し、配列番号39と同定されるPCR産物を発生させた。katE核酸配列は配列番号40として、対応するアミノ酸配列は配列番号41として提供される。大腸菌(E.coli)MG1655(ATCC(登録商標)47076(商標))をλ−Redリコンビナーゼ遺伝子を含有する温度感受性プラスミドpKD46(配列番号33)で形質転換し、30℃で24時間LB−ampプレート上で選択した。電気穿孔(BioRad Gene Pulser、0.2cmキュベット、2.5kV、200W、25μF)によって、50〜500ngのPCR産物でMG1655/pKD46を形質転換し、37℃で24時間LB−kanプレート上で選択した。いくつかのコロニーをLB−kanプレート上に画線塗抹し、42℃で一晩インキュベートしてpKD46プラスミドを硬化させた。コロニーをチェックしてkanR/ampSの表現型を確認した。PUREGENE(登録商標)DNA精製システムを使用していくつかのコロニーからゲノムDNAを単離し、配列番号42および配列番号43と同定されるプライマーを使用してPCRによりチェックしてkatE遺伝子の中断を確認した。いくつかのkatE−中断株をkan遺伝子を切除するのに使用されるFLPリコンビナーゼを含有する温度感受性プラスミドpCP20(配列番号36)で形質転換して、37℃で24時間LB−ampプレート上で選択した。いくつかのコロニーをLBプレート上に画線塗抹して42℃で一晩インキュベートし、pCP20プラスミドをキュアした。2つのコロニーをチェックしてkanS/ampSの表現型を確認し、MG1655 KatE1およびMG1655 KatE2と称した。
katGカタラーゼおよびkatEカタラーゼ中断大腸菌(E.coli)株(KLP18)の構築
配列番号37および配列番号38と同定されるプライマーを使用して、PCR(94℃で0.5分間、55℃で0.5分間、70℃で1分間、30サイクル)によって、プラスミドpKD13(配列番号27)からカナマイシン抵抗性遺伝子(配列番号26)を増幅し、配列番号39と同定されるPCR産物を発生させた。大腸菌(E.coli)MG1655 KatG1(実施例1)をλ−Redリコンビナーゼ遺伝子を含有する温度感受性プラスミドpKD46(配列番号33)で形質転換し、30℃で24時間LB−ampプレート上で選択した。電気穿孔(BioRad Gene Pulser、0.2cmキュベット、2.5kV、200W、25μF)によって、50〜500ngのPCR産物でMG1655 KatG1/pKD46を形質転換し、37℃で24時間LB−kanプレート上で選択した。いくつかのコロニーをLB−kanプレート上に画線塗抹し、42℃で一晩インキュベートしてpKD46プラスミドを硬化させた。コロニーをチェックしてkanR/ampSの表現型を確認した。PUREGENE(登録商標)DNA精製システムを使用していくつかのコロニーからゲノムDNAを単離し、配列番号42および配列番号43と同定されるプライマーを使用してPCRによりチェックしてkatE遺伝子の中断を確認した。いくつかのkatE−中断株(ΔkatE)をkan遺伝子を切除するのに使用されるFLPリコンビナーゼを含有する温度感受性プラスミドpCP20(配列番号36)で形質転換して、37℃で24時間LB−ampプレート上で選択した。いくつかのコロニーをLBプレート上に画線塗抹して42℃で一晩インキュベートし、pCP20プラスミドをキュアした。2つのコロニーをチェックしてkanS/ampSの表現型を確認し、MG1655 KatG1KatE18.1およびMG1655 KatG1KatE23と称した。MG1655 KatG1KatE18.1は大腸菌(E.coli)KLP18と称される。
サーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
大腸菌(E.coli)中での発現のために最適化されたコドン(DNA2.0,(Menlo Park,CA))を使用して、GENBANK(登録商標)で報告されるサーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)由来のアセチルキシランエステラーゼをコードする遺伝子のコード領域(登録番号AE000512;領域80481〜81458;配列番号44)を合成した。引き続いて配列番号45および配列番号46と同定されたプライマーを使用して、PCR(94℃で0.5分間、55℃で0.5分間、70℃で1分間、30サイクル)によって遺伝子のコード領域を増幅した。得られた核酸生成物(配列番号47)をpTrcHis2−TOPO(登録商標)にサブクローンして、pSW196と同定されるプラスミドを発生させた。プラスミドpSW196を使用して大腸菌(E.coli)KLP18(実施例3)を形質転換し、KLP18/pSW196株を発生させた。LB培地中でKLP18/pSW196を振盪しながら37℃でOD600nm=0.4〜0.5まで成長させ、その時点でIPTGを1mMの最終濃度に添加して、インキュベーションを2〜3時間継続した。細胞を遠心分離によって収集し、SDS−PAGEを実施して、総可溶性タンパク質の20〜40%のペルヒドロラーゼの発現を確認した。
サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)MSB8からのペルヒドロラーゼのクローニングおよび発現
GENBANK(登録商標)で報告されるサーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)MSB8からのアセチルキシランエステラーゼをコードする遺伝子のコード領域(登録番号NP_227893.1;配列番号48)を合成した(DNA
2.0、Menlo Park,CA)。引き続いて配列番号49および配列番号50と同定されたプライマーを使用して、遺伝子のコード領域をPCR(94℃で0.5分間、55℃で0.5分間、70℃で1分間、30サイクル)によって増幅した。得られた核酸生成物(配列番号51)を制限酵素PstIおよびXbaIで切断し、pUC19中のPstIおよびXbaI部位の間にサブクローンし、pSW207と同定されるプラスミドを発生させた。プラスミドpSW207を使用して大腸菌(E.coli)KLP18(実施例3)を形質転換し、KLP18/pSW207と同定される株を発生させた。LB培地中でKLP18/pSW207を振盪しながら37℃でOD600nm=0.4〜0.5まで成長させ、その時点でIPTGを1mMの最終濃度に添加して、インキュベーションを2〜3時間継続した。細胞を遠心分離によって収集し、SDS−PAGEを実施して総可溶性タンパク質の20〜40%のペルヒドロラーゼ酵素の発現を確認した。
ペルヒドロラーゼを発現する大腸菌(E.coli)KLP18形質転換体の発酵
酵母抽出物(Amberex 695、5.0g/L)、K2HPO4(10.0g/L)、KH2PO4(7.0g/L)、クエン酸ナトリウム二水和物(1.0g/L)、(NH4)2SO4(4.0g/L)、MgSO4七水和物(1.0g/L)、およびクエン酸第二鉄アンモニウム(0.10g/L)を含有する0.5Lの種培地を2リットルの振盪フラスコに装入して、発酵槽種培養を調製した。培地のpHを6.8に調節し、培地をフラスコ内で滅菌した。滅菌後添加は、グルコース(50重量%、10.0mL)および1mLアンピシリン(25mg/mL)原液を含んだ。1mLの20%グリセロール中の大腸菌(E.coli)KLP18/pSW196または大腸菌(E.coli)KLP18/pSW207培養物を種培地に接種して、35℃および300rpmで培養した。種培養物を約1〜2OD550nmで、KH2PO4(3.50g/L)、FeSO4七水和物(0.05g/L)、MgSO4七水和物(2.0g/L)、クエン酸ナトリウム二水和物(1.90g/L)、酵母抽出物(Amberex 695、5.0g/L)、Biospumex153K消泡剤(0.25mL/L、CognisCorporation,(Monheim,Germany))、NaCl(1.0g/L)、CaCl2二水和物(10g/L)、およびNIT微量元素溶液(10mL/L)を含有する35℃の培地8Lと共に、14L発酵槽(Braun Biotech,Allentown,PA)に移した。微量元素溶液は、クエン酸一水和物(10g/L)、MnSO4水和物(2g/L)、NaCl(2g/L)、FeSO4七水和物(0.5g/L)、ZnSO4七水和物(0.2g/L)、CuSO4五水和物(0.02g/L)、およびNaMoO4二水和物(0.02g/L)を含有した。滅菌後添加物は。グルコース溶液(50%w/w、80.0g)およびアンピシリン(25mg/mL)原液(16.00mL)を含んだ。グルコース溶液(50%w/w)を流加培養のために使用した。グルコース濃度が0.5g/Lに低下したらグルコース供給を開始し、0.31g供給/分で始めて毎時それぞれ0.36、0.42、0.49、0.57、0.66、0.77、0.90、1.04、1.21、1.41、および1.63g/分に次第に増大させ、以後速度は一定のままであった。培地中のグルコース濃度をモニターし、濃度が0.1g/Lを超えたら供給速度を低下させまたは一時的に停止した。様々な株で16mL IPTG(0.5M)の添加によって、OD550nm=56およびOD550nm=80の間で誘発を開始した。溶解酸素(DO)濃度は、空気飽和の25%に調節した。DOは最初は回転翼撹拌速度(400〜1400rpm)によって、後からは曝気速度(2〜10slpm)によって調節した。pHは6.8に調節した。NH4OH(29%w/w)およびH2SO4(20%w/v)をpH調節のために使用した。上部圧力は0.5バールであった。IPTG添加の16時間後に、細胞を遠心分離によって収集した。
CE−7エステラーゼ/ペルヒドロラーゼの加熱処理細胞抽出物の調製
ジチオスレイトール(1mM)を含有する0.05Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)中の細胞ペースト懸濁液(20重量%湿潤細胞重量)を作動圧力16,000psi(約110MPa)のフレンチプレスに2回通過させて、サーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)(KLP18/pSW196)またはサーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)MSB8(KLP18/pSW207)からのペルヒドロラーゼを発現する大腸菌(E.coli)形質転換体の細胞抽出物を調製した。次に粗製抽出物を20,000xgで遠心分離して細胞残骸を除去し、精製細胞抽出物を生成して、それを総可溶性タンパク質についてアッセイした(タンパク質定量用ビシンコニン酸キット、Sigma Aldrichカタログ番号BCA1−KT)。精製サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)MSB8またはサーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)ペルヒドロラーゼ含有抽出物を75℃で20分間加熱し、氷/水浴中での5℃への冷却が即座に続いた。得られた混合物を前述同様遠心分離し、沈殿タンパク質を除去して上清を収集し、総可溶性タンパク質についてアッセイした。加熱処理上清のSDS−PAGEは、ペルヒドロラーゼが上清中に存在する総可溶性タンパク質の少なくとも約90%を構成することを示した。
T.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/トレハロース乾燥酵素粉末の温度安定性
大腸菌(E.coli)KLP18/pSW196(≧90%T.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ、PAGEによる)の加熱処理細胞抽出タンパク質、トレハロース(Cargill)、および任意選択により界面活性剤としてポリソルベート80(p80)を様々な濃度で炭酸水素ナトリウム緩衝液(50mM、pH=8.1)中に含有する、10種の一連の水性混合物を調製した(表1)。これらの溶液をBuchi B−290ガラスチャンバー噴霧乾燥機(入口温度=170℃、出口温度=90℃、供給速度=3mL/分〜10mL/分)を使用して噴霧乾燥させて10種の乾燥酵素粉末を生成し、BCA(ビシンコニン酸)タンパク質アッセイを使用して粉末中のタンパク質重量%を測定し、変調示差走査熱量測定を使用してこれらの粉末のガラス転移温度(Tg)を測定した(表1)。
酵素粉末とトリアセチンとの混合物中のT.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/トレハロース乾燥酵素粉末の温度安定性
トリアセチン中の噴霧乾燥粉末の混合物として40℃で8週間保存した際の安定性について、実施例8で記載されるように調製した乾燥酵素粉末を評価した。乾燥酵素粉末をトリアセチンに添加して、87.2gのトリアセチン中に0.200gのタンパク質を含有する混合物を生成した。得られた混合物を40℃で保存し、pH7.2の50mM炭酸水素ナトリウム緩衝液中に100mMの過酸化水素およびTurpinal(登録商標)SL(500ppm)を含有する100mLの反応中で、2.19gの良く撹拌した混合物サンプルを25℃で毎週アッセイし、得られたトリアセチンおよびタンパク質濃度はそれぞれ100mMおよび50μg/mLであった。表4のデータと、実施例8の表3のデータとの比較は、トリアセチンとの混合物として保存した際のT.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/トレハロース乾燥酵素粉末の不安定性を実証する。
T.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン乾燥酵素粉末の温度安定性
大腸菌(E.coli)KLP18/pSW196(34gタンパク質/L、≧90%T.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ、PAGEによる)の加熱処理細胞抽出物タンパク質、および賦形剤としてのマルトデキストリン(66.7g/LMALTRIN(登録商標)M100マルトデキストリン、14.7g/LMALTRIN(登録商標)M250、14.7g/LMALTRIN(登録商標)M040、Grain Processing Corporation,Muscatine,IA)を50mM炭酸水素ナトリウム(pH8.1)中に含有する水性混合物を調製した。この溶液を噴霧乾燥機(GEA Niro、3フィート径、入口温度=226℃、出口温度=76℃、供給速度=60g/分)を使用して噴霧乾燥させて乾燥酵素粉末を生成し、BCA(ビシンコニン酸)タンパク質アッセイを使用して粉末中のタンパク質重量%(20.3重量%)を測定し、変調を示差走査熱量測定使用してこの粉末のガラス転移温度(Tg=54℃)を測定した。この溶液を噴霧乾燥させて粉末を生成し、次に40℃で9週間の保存中の安定性について試験した。乾燥酵素粉末(40℃で保存)を1週間間隔で試料採取し、50mM炭酸水素塩緩衝液(pH7.2)中の50μgタンパク質/mLのT.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ、H2O2(100mM)、トリアセチン(100mM)、およびTURPINAL(登録商標)SL(500ppm)を使用して25℃で活性についてアッセイし、前出のKarstらが報告する分析法の変法を使用して過酢酸の生成について分析した。T.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン噴霧乾燥粉末の過加水分解活性は、40℃で8週間にわたる保存中安定していた(表5)。
酵素粉末とトリアセチンとの混合物中で保存したT.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン乾燥酵素粉末の温度安定性
トリアセチン中の噴霧乾燥粉末の混合物として40℃で21週間保存した際の安定性について、実施例10で記載されるように調製した乾燥酵素粉末を評価した。乾燥酵素粉末(1.235g、タンパク質20.3重量%)を109gのトリアセチンに添加した。得られた混合物を40℃で保存し、pH7.2の50mM炭酸水素ナトリウム緩衝液中に過酸化水素(100mM)およびTurpinal(登録商標)SL(500ppm)を含有する100mLの反応中で、2.19gの良く撹拌した混合物サンプルを25℃で二連でアッセイし、得られたトリアセチンおよびタンパク質濃度はそれぞれ100mMおよび50μg/mLであった。表6のデータと、実施例10の表5のデータとの比較は、トリアセチンとの混合物として保存した際のT.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン乾燥酵素粉末の安定性を実証する。
酵素粉末と炭酸水素ナトリウムとトリアセチンとの混合物中で保存したT.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン乾燥酵素粉末の温度安定性
トリアセチンと炭酸水素ナトリウムとの混合物中の噴霧乾燥粉末の混合物として40℃で21週間保存した際の安定性について、実施例10で記載されるように調製した乾燥酵素粉末を評価した。乾燥酵素粉末(0.988g、タンパク質20.3重量%)を87.2gのトリアセチンと16.8gの炭酸水素ナトリウム(3DF等級(粉末)、Church & Dwight)との混合物に添加した。得られた混合物を40℃で保存し、過酸化水素(100mM)およびTurpinal(登録商標)SL(500ppm)を含有する100mLの反応中で、2.62gの良く撹拌した混合物サンプルを25℃で二連でアッセイし、得られたトリアセチン、炭酸水素ナトリウム、およびタンパク質濃度は、それぞれ100mM、50mM(pH7.2)、および50μg/mLであった。表7のデータと実施例11の表6のデータとの比較は、トリアセチンおよび固体炭酸水素ナトリウム混合物として40℃で21週間保存した際のT.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン乾燥酵素粉末の安定性が、トリアセチン単独との混合物として40℃で21週間保存した際のT.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン乾燥酵素粉末の安定性と比べて改善されていることを実証する。例えば21週間などのより長い保存時間では、ペルヒドロラーゼはトリアセチンと炭酸水素ナトリウムとの混合物中で、初期活性の約100%をなおも維持した。
T.マリチマ(T.maritima)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン乾燥酵素粉末の温度安定性
大腸菌(E.coli)KLP18/pSW207の加熱処理細胞抽出物タンパク質(21gタンパク質/L、≧90%T.マリチマ(T.maritima)ペルヒドロラーゼ、PAGEによる)および賦形剤としてのマルトデキストリン(31g/LマルトデキストリンDE13−17および31g/LマルトデキストリンDE4−7、Aldrich)を50mM炭酸水素ナトリウム(pH8.1)中に含有する水性混合物を調製した。この溶液をBuchi B−290ガラス−チャンバー噴霧乾燥機(入口温度=170℃、出口温度=90℃、供給速度=4.5mL/分)を使用して噴霧乾燥させて乾燥酵素粉末を生成し、BCA(ビシンコニン酸)タンパク質アッセイを使用して粉末中のタンパク質重量%(18.0重量%)を測定し、変調を示差走査熱量測定使用してこの粉末のガラス転移温度(Tg=90℃)を測定した。この溶液を噴霧乾燥させて粉末を生成し、次に40℃で7週間の保存中の安定性について試験した。乾燥酵素粉末(40℃で保存)を1週間間隔で試料採取し、50mM炭酸水素塩緩衝液(pH7.2)中の50μgタンパク質/mLのT.マリチマ(T.maritima)ペルヒドロラーゼ、H2O2(H2O2(100mM))、トリアセチン(100mM)、およびTURPINAL(登録商標)SL(500ppm)を使用して25℃で活性についてアッセイし、前出のKarstらが報告する分析法の変法を使用して過酢酸の生成について分析した。T.マリチマ(T.maritima)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン噴霧乾燥粉末の過加水分解活性は、40℃で7週間にわたる保存中安定していた(表8)。
酵素粉末とトリアセチンとの混合物中で保存したT.マリチマ(T.maritima)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン乾燥酵素粉末の温度安定性
トリアセチン中の噴霧乾燥粉末の混合物として40℃で7週間保存した際の安定性について、実施例13で記載されるように調製した乾燥酵素粉末を評価した。乾燥酵素粉末(0.556g、18.0タンパク質重量%)を43.6gのトリアセチンに添加した。得られた混合物を40℃で保存し、pH7.2の50mM炭酸水素ナトリウム緩衝液中に過酸化水素(100mM)およびTurpinal(登録商標)SL(500ppm)を含有する100mLの反応中で、2.21gの良く撹拌した混合物サンプルを25℃で二連でアッセイし、得られたトリアセチンおよびタンパク質の濃度はそれぞれ100mMおよび50μg/mLであった。表9のデータと実施例13の表8のデータとの比較は、トリアセチンとの混合物として保存した際のT.マリチマ(T.maritima)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン乾燥酵素粉末の安定性を実証する。
酵素粉末と炭酸水素ナトリウムとトリアセチンとの混合物中で保存したT.マリチマ(T.maritima)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン乾燥酵素粉末の温度安定性
トリアセチンと炭酸水素ナトリウムとの混合物中の噴霧乾燥粉末の混合物として40℃で7週間保存した際の安定性について、実施例13で記載されるように調製した乾燥酵素粉末を評価した。乾燥酵素粉末(0.556g、タンパク質18.0重量%)を43.6gのトリアセチンおよび8.4gの炭酸水素ナトリウム(3DF等級(粉末)、Church & Dwight)に添加した。得られた混合物を40℃で保存し、過酸化水素(100mM)およびTurpinal(登録商標)SL(500ppm)を含有する100mLの反応中で、2.63gの良く撹拌した混合物サンプルを25℃で二連でアッセイし、得られたトリアセチン、炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH7.2)、およびタンパク質濃度は、それぞれ100mM、50mM、および50μg/mLであった。表10のデータと実施例14の表9のデータとの比較は、トリアセチンおよび固体炭酸水素ナトリウム混合物として40℃で5、6、および7週間保存した際のT.マリチマ(T.maritima)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン乾燥酵素粉末の安定性が、トリアセチン単独との混合物として40℃で5、6、および7週間保存した際のT.ネアポリタナ(T.neapolitana)ペルヒドロラーゼ/マルトデキストリン乾燥酵素粉末の安定性と比べて改善されていることを実証する。
枯草菌(Bacillus subtilis)ATCC(登録商標)31954(商標)ペルヒドロラーゼを使用したプロピレングリコールジアセテートまたはエチレングリコールジアセテートの過加水分解
ジチオスレイトール(1mM)を含有する0.05Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)中の細胞ペースト懸濁液(20重量%湿潤細胞重量)から、枯草菌(Bacillus subtilis)ATCC(登録商標)31954(商標)(KLP18/pSW194)からの野生型ペルヒドロラーゼを発現する形質転換体のホモジェネートを調製した。粗製ホモジェネートを遠心分離して細胞残骸を除去し、精製細胞抽出物を生成してそれを65℃で30分間加熱処理した。得られた混合物を遠心分離して、30K MWCO(分子量カットオフ)膜上で加熱処理上清を総溶解固形分32mg/mLの濃度に濃縮し、精製加熱処理細胞抽出物のSDS−PAGEは、ペルヒドロラーゼが少なくとも85〜90%純粋であることを示した。次にこの濃縮物に1グラムの固形分あたり2.06グラムのNaH2PO4および1.17グラムのNa2HPO4をこの濃縮物に添加して添加し、比率(wt/wt)およそ3:1のリン酸緩衝液対加熱処理細胞抽出物タンパク質を生成した。この溶液を脱イオン水で30重量%に希釈し、次にBuchi B−290実験室噴霧乾燥機を使用して噴霧乾燥させ(180℃入口温度、70℃出口温度)、得られた噴霧乾燥粉末はタンパク質25.5重量%を含有し(Bradfordタンパク質アッセイ)、乾燥固形分94.3重量%であった。
T.マリチマ(T.maritima)およびT.ネアポリタナ(T.neapolitana)野生型および変異型ペルヒドロラーゼを使用したプロピレングリコールジアセテートまたはエチレングリコールジアセテートの過加水分解
ジチオスレイトール(1mM)を含有する0.05Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)中の細胞ペースト懸濁液(20重量%湿潤細胞重量)を作動圧力16,000psi(約110MPa)のフレンチプレスに2回通過させて、サーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)野生型ペルヒドロラーゼ(KLP18/pSW196)、サーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)C277S変異型ペルヒドロラーゼ(KLP18/pSW196/C277S)、サーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neapolitana)C277T変異型ペルヒドロラーゼ(KLP18/pSW196/C277T)、サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)野生型ペルヒドロラーゼ(KLP18/pSW228)、サーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)C277S変異型ペルヒドロラーゼ(KLP18/pSW228/C277S)、およびサーモトガ・マリチマ(Thermotoga maritima)C277T変異型ペルヒドロラーゼ(KLP18/pSW228/C277T)を発現する形質転換体の細胞抽出物をそれぞれ調製した。溶解細胞を12,000×gで30分間遠心分離して精製細胞抽出物を生成し、それを総可溶性タンパク質についてアッセイした(Bradfordアッセイ)。上清を75℃で20分間加熱し、氷浴内で2分間の急冷がそれに続いた。11,000×gで10分間の遠心分離によって、沈殿タンパク質を除去した。得られた加熱処理抽出タンパク質上清のSDS−PAGEは、調製品中でCE−7酵素が総タンパク量のおよそ85〜90%を構成することを示した。加熱処理抽出タンパク質上清をドライアイス中で凍結し、使用時まで−80℃に保存した。
Claims (24)
- 酵素とカルボン酸エステルとを含む調合物中に存在する場合の該酵素のペルヒドロリシス活性を安定化する方法であって、
(a)ペルヒドロリシス活性を有し構造的にCE−7酵素として分類される少なくとも1つの酵素と、少なくとも1つの賦形剤と、任意選択的に少なくとも1つの界面活性剤とを含む水性調合物を備えるステップと;
(b)(a)の水性調合物を噴霧乾燥して、上記少なくとも1つの酵素と、上記少なくとも1つの賦形剤と、任意選択的に上記少なくとも1つの界面活性剤とを含む酵素粉末を生成させるステップと;
(c)(b)の酵素粉末を、
(i)5.5〜9.5のpH範囲で緩衝能を有する少なくとも1つの緩衝剤および
(ii)カルボン酸エステル
と混ぜ合わせて調合物を形成させるステップと;
を含み、ここで調合物への少なくとも1つの緩衝剤の添加が、調合物中に存在する場合の上記少なくとも1つの酵素のペルヒドロリシス活性の安定性を、上記少なくとも1つの緩衝剤が存在しない場合の上記少なくとも1つの酵素のペルヒドロリシス活性と比較して増強し、そして上記調合物が実質的に水を含まない、上記方法。 - 少なくとも1つの賦形剤が酵素粉末の95質量%〜25質量%の範囲である、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの賦形剤が、マルトデキストリン、トレハロース、キシラン、マンナン、フコイダン、ガラクトマンナン、キトサン、ラフィノース、スタキオース、ペクチン、イヌリン、レバン、グラミナン、アミロペクチン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 少なくとも1つの賦形剤がマルトデキストリンである、請求項3に記載の方法。
- 少なくとも1つの賦形剤がトレハロースである、請求項3に記載の方法。
- カルボン酸エステルが、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン、トリプロピオニン、モノブチリン、ジブチリン、トリブチリン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- カルボン酸エステルがトリアセチンである、請求項6に記載の方法。
- 少なくとも1つの界面活性剤が存在し、それがポリソルベート80である、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの賦形剤が、少なくとも1250の数平均分子量および少なくとも9000の質量平均分子量を有するオリゴ糖賦形剤である、請求項2に記載の方法。
- オリゴ糖賦形剤が、少なくとも1700の数平均分子量および少なくとも15000の質量平均分子量を有する、請求項9に記載の方法。
- 少なくとも1つの緩衝剤が、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウムと炭酸水素カリウムの混合物、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、またはリン酸ナトリウムとリン酸カリウムの混合物である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- (a)少なくとも1つの酵素が、配列番号6、配列番号7、配列番号19、および配列番号20からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで配列番号19または配列番号20のアミノ酸残基277が、アラニン、バリン、セリン、およびスレオニンからなる群から選択され、
(b)カルボン酸エステルがジアセチン、トリアセチン、およびそれらの混合物からなる群から選択される、
請求項11に記載の方法。 - 少なくとも1つの賦形剤がマルトデキストリンである、請求項12に記載の方法。
- (a)少なくとも1つの酵素が、配列番号6および配列番号7からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
(b)少なくとも1つの賦形剤がマルトデキストリンであり、
(c)少なくとも1つの緩衝剤が炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、およびそれらの混合物からなる群から選択され、
(d)カルボン酸エステルがトリアセチンである、
請求項11に記載の方法。 - 少なくとも1つの緩衝剤が炭酸水素ナトリウムである、請求項14に記載の方法。
- 多成分過酸発生システム中の第1の成分として使用される調合物であって、
(a)モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン、トリプロピオニン、モノブチリン、ジブチリン、トリブチリン、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1つのカルボン酸エステルと;
(b)ペルヒドロリシス活性を有し、構造的にCE−7酵素として分類される少なくとも1つの酵素と、少なくとも1つの賦形剤と、任意選択的に少なくとも1つの界面活性剤とを含む酵素粉末と;
(c)5.5〜9.5のpH範囲で緩衝能を有する少なくとも1つの緩衝剤と;
の混合物を含み、上記少なくとも1つの緩衝剤が、上記調製物中に存在する場合上記少なくとも1つの酵素の安定性を、上記少なくとも1つの緩衝剤が存在しない場合の上記少なくとも1つの酵素のペルヒドロリシス活性と比較して増強し、そして上記調合物が実質的に水を含まない、上記調合物。 - 少なくとも1つの賦形剤が、少なくとも1250の数平均分子量および少なくとも9000の質量平均分子量を有するオリゴ糖賦形剤である、請求項16に記載の調合物。
- 第1の成分と第2の成分とを含む殺菌剤システムであって、該第1の成分が請求項16または17に記載の調合物を含み、該第2の成分が水中の過酸素源および任意選択的に過酸化水素安定剤を含む、上記殺菌剤システム。
- 第1の成分と第2の成分とを含むランドリーケア調合物であって、該第1の成分が請求項16または17に記載の調合物を含み、該第2の構成要素が過酸化水素水溶液および任意選択的に過酸化水素安定剤を含む、ランドリーケア調合物。
- ペルオキシカルボン酸を酵素的に生成させる方法であって、
(a)(1)請求項16または17に記載の調合物と;
(2)水中の過酸素源と;
を含む、一式の反応成分を備えるステップと:
(b)該反応成分を混ぜ合わせて、それによってペルオキシカルボン酸を生成させるステップと:
を含む、上記方法。 - (a)少なくとも1つの酵素が、配列番号6、配列番号7、配列番号19、および配列番号20からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで配列番号19または配列番号20のアミノ酸残基277がアラニン、バリン、セリン、およびスレオニンからなる群から選択され、
(b)少なくとも1つの賦形剤がマルトデキストリンであり、
(c)少なくとも1つの緩衝剤が炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウムと炭酸水素カリウムの混合物、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、およびリン酸ナトリウムとリン酸カリウムの混合物からなる群から選択され、
(d)少なくとも1つのカルボン酸エステルがトリアセチンであり、
(e)生成されるペルオキシカルボン酸が過酢酸である、
請求項20に記載の方法。 - 酵素生成ペルオキシカルボン酸組成物を使用して硬表面または無生物的対象物を殺菌する方法であって、
(a)(1)請求項16に記載の調合物と;
(2)水中の過酸素源と;
を含む、一式の反応成分を備えるステップと:
(b)該反応成分を混ぜ合わせて、それによってペルオキシカルボン酸を生成させるステップと:
(c)任意選択的に該ペルオキシカルボン酸生成物を希釈するステップと:
(d)ステップ(b)またはステップ(c)で生成したペルオキシカルボン酸生成物を、上記硬表面または無生物的対象物に接触させて、それによって該表面または該無生物的対象物を殺菌するステップと:
を含む、上記方法。 - 酵素生成ペルオキシカルボン酸組成物を使用して、漂白、汚れ除去、臭気低減、衛生化または殺菌のために、衣料品またはテキスタイルを処理する方法であって、
(a)(1)(i)請求項16に記載の調合物と、
(ii)カルボン酸エステルと、
を含む、混合物と;
(2)過酸素源と;
を含む、一式の反応成分を備えるステップと:
(b)該反応成分を、適した水性反応条件下で混ぜ合わせて、それによってペルオキシカルボン酸生成物を形成させるステップと:
(c)任意選択的に該ペルオキシカルボン酸生成物を希釈するステップと:
(d)ステップ(b)またはステップ(c)で生成したペルオキシカルボン酸を、上記衣料品またはテキスタイルに接触させるステップと:
を含み、ここで衣料品またはテキスタイルの該物品を洗浄し、汚れを除去し、脱臭し、衛生化し、殺菌し、またはその組み合わせを行なう、上記方法。 - (a)少なくとも1つの酵素が、配列番号6、配列番号7、配列番号19、および配列番号20からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで配列番号19または配列番号20のアミノ酸残基277がアラニン、バリン、セリン、およびスレオニンからなる群から選択され、
(b)少なくとも1つの賦形剤がマルトデキストリンであり、
(c)少なくとも1つの緩衝剤が炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウムと炭酸水素カリウムの混合物、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、およびリン酸ナトリウムとリン酸カリウムの混合物からなる群から選択され、
(d)少なくとも1つのカルボン酸エステルがトリアセチンであり、
(e)生成されるペルオキシカルボン酸が過酢酸である、
請求項22または23に記載の方法。
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