BR122018012459B1

BR122018012459B1 - formulação, sistema desinfetante e formulação para cuidado de roupas

Info

Publication number: BR122018012459B1
Application number: BR122018012459A
Authority: BR
Inventors: Ben-Bassat Arie; S Payne Mark; Richard Zolandz Raymond; Dicosimo Robert
Original assignee: Du Pont
Priority date: 2008-10-03
Filing date: 2009-10-01
Publication date: 2020-02-04
Also published as: CN102264893B; JP5777517B2; CN102239257A; WO2010039958A1; BRPI0913702B8; US20100086510A1; JP5656845B2; US20120016025A1; JP5694938B2; CN102239256A; EP2342324A1; AU2009298420B2; BRPI0913701B1; JP5777516B2; BRPI0913701A2; US20110305683A1; JP5701762B2; ES2735230T3; EP2342326A1; JP5665747B2

Abstract

formulação, sistema desinfetante e formulação para cuidado de roupas a presente invenção refere-se a um método para estabilização da atividade de peridrolase da estearase ce-7 em uma formulação com um éster de ácido carboxílico que emprega a adição de um agente tamponante, substancialmente indissolúvel, à formulação da estearase ce-7 e do éster de ácido carboxílico. são fornecidas, ainda, formulações desinfetantes e para cuidado de roupas que compreendem os perácidos produzidos pelos processos descritos na presente invenção.

Description

“FORMULAÇÃO, SISTEMA DESINFETANTE E FORMULAÇÃO PARA CUIDADO DE ROUPAS”

DIVIDIDO DO PI 0913702-5, DEPOSITADO EM 01/10/2009 [001] Este pedido reivindica prioridade dos pedidos provisórios de patente US 61/102.505, 61/102.512, 61/102.514, 61/102.520, 61/102.531 e 61/102,539; depositados em 3 de outubro de 2008, cada uma destes está integralmente incorporado a presente invenção como referência.

Campo da Invenção [002] Esta invenção refere-se ao campo da síntese enzimática de perácidos e catálise enzimática in situ. Pelo menos um ácido carboxílico é produzido em concentrações suficientes como sendo eficiente para a desinfecção ou sanitização de superfícies, esterilização de instrumentos médicos, esterilização de equipamentos para processamento de alimentos e adequado para uso em aplicações têxteis e de lavagem de roupas como descoloração, desodorização, desinfecção ou sanitização.

Antecedentes da Invenção [003] Composições de perácido foram relatadas como sendo agentes antimicrobianos efetivos. Foram descritos métodos para limpar, desinfetar e/ou sanitizar superfícies duras, produtos de carne, tecidos vegetais vivos e dispositivos contra o crescimento microbiano (por exemplo, patente US 6.545.047, patente US 6.183.807, patente US 6.518.307, patente US 5.683.724 e pedido de patente US 2003/0026846). Perácidos também foram relatados como sendo úteis na preparação de composições alvejantes para aplicações de detergente para lavagem de roupas (patente US 3.974.082, patente US 5.296.161, patente US 5.364.554).

[004] Os perácidos podem ser preparados pela reação química de um ácido carboxílico e peróxido de hidrogênio (consulte Organic Peroxides, Daniel Swern, ed., Volume 1, páginas 313-516; Wiley Interscience, Nova York,

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1971). A reação é usualmente catalisada por um ácido inorgânico forte, como ácido sulfúrico concentrado. A reação de peróxido de hidrogênio com um ácido carboxílico é uma reação de equilíbrio, e a produção de perácidos é favorecida pelo uso de um excesso de concentração de peróxido e/ou de ácido carboxílico ou pela remoção de água.

[005] Alguns desinfetantes à base de perácido ou de agentes alvejantes são compreendidos por uma mistura de equilíbrio de perácido, peróxido de hidrogênio e do ácido carboxílico correspondente. Uma desvantagem desses sistemas comerciais de limpeza com perácido é que o perácido é muitas vezes instável na solução ao longo do tempo. Uma maneira de superar o problema de estabilidade é gerar o perácido antes do uso, pela combinação de componentes de reações múltiplas que são estáveis individualmente por períodos de tempo mais longos. Preferencialmente, os componentes individuais da reação são fáceis de armazenar, relativamente seguros para manusear e capazes de produzir rapidamente uma concentração eficiente de perácido mediante mistura.

[006] A família CE-7 de estearases de carboidrato foi recentemente relatada como tendo atividade de peridrolase. Essas enzimas “peridrolases” demonstraram ser particularmente efetivas para produzir perácidos a partir de uma variedade de substratos de ésteres de ácido carboxílico quando combinadas com uma fonte de peroxigênio (consulte publicação WO 2007/070609 e publicações de pedido de patente US 2008/0176299 e 2008/176783 para DiCosimo et al.; cada uma destas integralmente incorporada a presente invenção como referência). Alguns membros da família CE-7 de estearases de carboidrato demonstraram ter atividade peridrolítica suficiente para produzir 4000 a 5000 ppm de ácido peracético a partir de acetil ésteres de álcool, dióis e gliceróis em 1 minuto e até 9000 ppm entre 5 minutos e 30 minutos, uma vez que os componentes da

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3/105 reação foram misturados (DiCosimo et al., publicação de pedido de patente US 2009/0005590).

[007] O sistema de geração de perácido descrito pela patente US 2009/0005590 para DiCosimo et al. é tipicamente baseado no uso de componentes de reações múltiplas que permanecem separados até a solução de perácido ser necessária. Usando-se esta abordagem, superam-se as questões de instabilidade do perácido com o armazenamento de muitos desinfetantes à base de perácido e de agentes alvejantes. Entretanto, formulações específicas que fornecem estabilidade em longo prazo da atividade de peridrolase usando-se formulações multicomponentes que compreendem estearases de carboidrato CE-7 permanecem em discussão. Uma preocupação particular é a estabilidade de armazenamento em longo prazo de uma enzima CE-7 que tem atividade de peridrolase quando armazenada em um líquido orgânico ou solvente que tem um log P (isto é, o logaritmo do coeficiente de distribuição de uma substância entre octanol e água, onde P é igual a [soluto]octanol/[soluto]água) menos que dois. Diversos substratos de éster orgânico anteriormente descritos por DiCosimo et al. têm valores log P menor que 2.

[008] Líquidos orgânicos ou solventes podem ser prejudiciais à atividade de enzimas, tanto quando as enzimas estão suspensas diretamente nos líquidos orgânicos como nos solventes, como quando líquidos miscíveis de fase única orgânicos/aquoso ou solventes são empregados. Duas publicações da literatura que revisam os efeitos de solventes orgânicos sobre a atividade e estrutura enzimática são: (a) C. Laane et al., Biotechnol. Bioeng. 30:81-87 (1987) e (b) Cowan, D.A. e Plant, A., Biocatalysis em Organic Phase Systems., Ch. 7 em Biocatalysis at Extreme Temperatures, Kelly, R.W.W. e Adams, M., eds., Amer. Chem. Soc. Symposium Series, Oxford University Press, Nova York, NY, páginas 86-107 (1992). Cowan e Plant, acima, apontam (na página

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87) que a técnica geralmente reconhece que há pouco ou nenhum valor no uso de solventes orgânicos que têm um log P < 2 para estabilizar as enzimas intracelulares em um sistema de fase orgânica. Solventes orgânicos que têm um log P entre dois e quatro podem ser usados caso a caso, dependendo da estabilidade da enzima, e aqueles que têm um log P > 4 geralmente são úteis nos sistemas de fase orgânica.

[009] Cowan e Plant, acima, apontam ainda (na página 91) que o efeito da exposição direta sobre uma enzima dissolvida em um solvente aquoso de fase orgânica única depende da concentração do solvente, interações do grupo na superfície solvente/enzima, e interações da hidratação do envoltório solvente/enzima. Devido ao valor log P do solvente ter que ser suficientemente baixo para que o solvente seja completamente miscível na fase aquosa para produzir uma única fase, uma única fase orgânica-solvente aquoso contendo um solvente orgânico com log P baixo tem um efeito negativo sobre a estabilidade da enzima, exceto em aplicações com concentração baixa de solvente orgânico. A triacetina é relatada como tendo um log P de 0,25 (Y. M. Gunning, et al., J. Agric. Food Chem. 48:395-399 (2000)), similar àquele de etanol (log P -0,26) e isopropanol (log P 0,15) (Cowan e Plant); portanto espera-se que o armazenamento do pó de enzima em triacetina resultaria em perda inaceitável de atividade enzimática, como seria o uso de cosolventes adicionais com log P < 2 (por exemplo, ciclohexanona, log P = 0,94) (Cowan e Plant); 1,2-propanodiol, log P = -1,41 (Gunning, et al.); 1,3-propanodiol, log P = -1,3 (S-J. Kuo, et al., J. Am. Oil Chem. Soc. 73:1427-1433 (1996); dietileno glicol butil éter, log P = 0,56 (N. Funasaki, et al., J. Phys. Chem. 88:5786-5790 (1984); trietilenoglicol, log P = -1,75 (L. Braeken, et al., ChemPhysChem 6:1606-1612 (2005)).

[010] Dessa forma, o problema a ser solucionado é formular um produto usando-se uma mistura de uma enzima que gera perácido em um

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5/105 substrato de éster orgânico empregado para produção de perácido, onde a enzima mantém atividade de peridrolase significativa mesmo quando armazenada com o substrato de éster de ácido carboxílico.

Descrição Resumida da Invenção [011] O problema apresentado foi solucionado pela revelação de um processo para estabilização da atividade de peridrolases de pelo menos uma enzima estruturalmente classificada como enzima CE-7 e que tem atividade de peridrolase quando presente em uma formulação com um éster de ácido carboxílico. Mais especificamente, a adição de pelo menos um tampão na formulação que compreende um éster de ácido carboxílico e um pó de enzima que compreende a enzima CE-7 e pelo menos um excipiente aumenta a estabilidade da atividade de peridrolases da enzima CE-7 armazenada na formulação.

[012] Em um aspecto, é fornecido um processo para estabilizar a atividade de peridrólise de uma enzima quando presente em uma formulação compreendida por dita enzima e um éster de ácido carboxílico, cujo processo compreende:

(a) fornecer uma formulação aquosa que compreende pelo menos uma enzima estruturalmente classificada como uma enzima CE-7 que tem atividade de peridrólise, pelo menos um excipiente, e opcionalmente pelo menos um tensoativo;

(b) secar por atomização a formulação aquosa de (a) para produzir um pó de enzima que compreende dita pelo menos uma enzima, dito pelo menos um excipiente de oligossacarídeo e, opcionalmente, dito pelo menos um tensoativo; e (c) combinar o pó de enzima de (b) com pelo menos um tampão e um éster de ácido carboxílico para formar uma formulação, sendo que a adição do pelo menos um tampão na formulação aumenta a estabilidade

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6/105 da atividade de peridrólise da dita pelo menos uma enzima quando armazenada na dita formulação.

[013] Em outro aspecto, é fornecida uma formulação usada como um primeiro componente em um sistema de geração de perácido multicomponente, dita formulação compreendendo uma mistura de:

(a) pelo menos um éster de ácido carboxílico selecionado do grupo que consiste em monoacetina, diacetina, triacetina, monopropionina, dipropionina, tripropionina, monobutirina, dibutirina, tributirina, e misturas dos mesmos;

(b) um pó de enzima que compreende uma formulação seca por atomização de pelo menos uma enzima estruturalmente classificada como uma enzima CE-7 e que tem atividade de peridrólise, pelo menos um excipiente, e, opcionalmente, pelo menos um tensoativo; e (c) pelo menos um tampão, sendo que dito pelo menos um tampão aumenta a estabilidade de dita pelo menos uma enzima quando presente na dita formulação.

[014] Em um aspecto adicional, é fornecido um sistema desinfetante que compreende um primeiro componente e um segundo componente, dito primeiro componente compreendendo a formulação descrita acima, e dito segundo componente compreendendo uma fonte de peroxigênio em água e, opcionalmente, um estabilizante de peróxido de hidrogênio.

[015] Em um aspecto adicional é fornecido um processo para produzir enzimaticamente um ácido peroxicarboxílico que compreende:

(a) fornecer um conjunto de componentes de reação, ditos componentes compreendendo:

(1) a formulação descrita acima; e (2) uma fonte de peroxigênio em água; e (b) combinar ditos componentes de reação pelos quais um

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7/105 ácido carboxílico é produzido.

[016] Em outro aspecto, é fornecido um processo para desinfetar ou sanitizar uma superfície dura ou objeto inanimado utilizando-se uma composição de ácido peroxicarboxílico produzido enzimaticamente, o dito processo que compreende:

(1) a formulação descrita acima; e (2) uma fonte de peroxigênio em água;

(b) combinar ditos componentes de reação pelos quais um produto ácido peroxicarboxílico é produzido;

(c) opcionalmente diluir dito produto ácido peroxicarboxílico; e (d) colocar dita superfície dura ou objeto inanimado em contato com o ácido peroxicarboxílico produzido na etapa (b) ou etapa (c) pelo qual a dita superfície ou o dito objeto inanimado é desinfetado.

[017] Um aspecto adicional é para um processo para tratar um artigo de vestuário ou têxtil para alvejamento, remoção de manchas, redução de odor, sanitização ou desinfecção, utilizando-se uma composição de ácido peroxicarboxílico produzido enzimaticamente, o dito processo que compreende:

(1) uma formulação que compreende:

(1) a formulação descrita acima; e (ii) um éster de ácido carboxílico; e (2) uma fonte de peroxigênio;

(b) combinar os ditos componentes de reação mediante condições de reação aquosa adequadas pelas quais um produto ácido peroxicarboxílico é formado.

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8/105 (c) opcionalmente diluir dito produto ácido peroxicarboxílico; e (d) colocar dito artigo de vestuário ou têxtil em contato com o ácido peroxicarboxílico produzido na etapa (b) ou etapa (c);

em que dito artigo de vestuário ou têxtil é limpo, teve manchas removias, desodorizado, sanitizado, desinfetado ou uma combinação dos mesmos.

Breve Descrição das Sequências Biológicas [018] As sequências a seguir estão em conformidade com 37 C.F.R.1.821 - 1.825 (“Requisitos para Pedidos de Patente Contendo Divulgações de Sequências de Nucleotídeos e/ou de Aminoácidos - Os Regulamentos De Sequências”) e estão consistentes com a Norma ST. 25 (1998) da Organização Mundial de Propriedade Intelectual (WIPO) e as exigências da listagem de sequências da Convenção de Patente Europeia (EPC) e Tratado de Cooperação de Patente (PCT), Regulamentos 5.2 e 49.5(abis), e Seção 208 e Anexo C das Instruções Administrativas. Os símbolos e formatos usados para os dados de sequências de nucleotídeos e aminoácidos estão em conformidade com os regulamentos estabelecidos no 37 C.F.R. §1.822.

[019] SEQ ID NO:1 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma cefalosporina C desacetilase de Bacillus subtilis ATCC® 31954™.

[020] SEQ ID NO:2 é a sequência de aminoácido deduzida de uma cefalosporina C desacetilase de B. subtilis ATCC® 6633™.

[021] SEQ ID NO:3 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma cefalosporina C desacetilase de B. licheniformis ATCC® 14580™.

[022] SEQ ID NO:4 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma acetil xilana esterase de B. pumilus PS213.

[023] SEQ ID NO:5 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma acetil xilana esterase de Clostridium thermocellum ATCC® 27405™.

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9/105 [024] SEQ ID NO:6 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma acetil xilana esterase de Thermotoga neapolitana.

[025] SEQ ID NO:7 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma acetil xilana esterase de Thermotoga maritima MSB8.

[026] SEQ ID NO:8 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma acetil xilana esterase de Thermoanaerobacterium sp. JW/SL YS485.

[027] SEQ ID NO:9 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma cefalosporina C desacetilase de Bacillus sp. NRRL B-14911. Deve-se notar que a sequência de ácido nucleico que codifica a cefalosporina C desacetilase de Bacillus sp. NRRL B-14911 conforme relatada no GENBANK^®com número de acesso ZP_01168674 parece codificar a adição de 15 aminoácidos N-terminal que são provavelmente incorretos, com base na sequência de alinhamento com outras cefalosporina C desacetilases e uma comparação do comprimento relatado (340 aminoácidos) versus o cumprimento observado de outras enzimas CAH (tipicamente 318 a 325 aminoácidos de comprimento; consulte o pedido de patente de copropriedade, codepositada e copendente US mediante número de registro legal CL4205 US NA intitulado “ENZYMATIC PERACID PRODUCTION USING A COSOLVENT’; incorporado a presente invenção como referência) . Assim, a sequência de aminoácidos deduzida relatada na presente invenção para a sequência de cefalosporina C desacetilase de Bacillus sp. NRRL B-14911 não inclui os 15 aminoácido no N-terminal, conforme relatado no GENBANK^® com número de acesso ZP_01168674.

[028] SEQ ID NO:10 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma cefalosporina C desacetilase de halodurans C-125.

[029] SEQ ID NO:11 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma cefalosporina C desacetilase de Bacillus clausii KSM-K16.

[030] SEQ ID NO:12 é a sequência de aminoácidos deduzida de

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10/105 uma cefalosporina C desacetilase (CHA) de Bacillus subtilis ATCC® 29233™.

[031] SEQ ID NO:13 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma cefalosporina C desacetilase (CHA) de Thermoanearobacterium saccharolyticum.

[032] SEQ ID NO:14 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma acetil xilana esterase de Thermotoga lettingae.

[033] SEQ ID NO:15 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma acetil xilana esterase de Thermotoga petrophila.

[034] SEQ ID NO:16 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma primeira acetil xilana esterase de Thermotoga sp. RQ2 descrita na presente invenção como “RQ2(a)”.

[035] SEQ ID NO:17 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma segunda acetil xilana esterase de Thermotoga sp. RQ2 descrita na presente invenção como “RQ2(b)”.

[036] SEQ ID NO:18 é a sequência de aminoácidos da região que engloba resíduos de aminoácidos 118 até 299 de SEQ ID NO:1.

[037] SEQ ID NO:19 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma acetil xilana esterase variante de Thermotoga neapolitana do pedido de patente US de copropriedade, co-depositado e copendente com número de registro legal CL4392 US NA (integralmente incorporado a presente invenção como referência), onde o resíduo Xaa na posição 277 é Ala, Val, Ser ou Thr.

[038] SEQ ID NO:20 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma acetil xilana esterase variante de Thermotoga neapolitana MSB8 do pedido de patente US de co-propriedade, co-depositado e copendente com número de registro legal CL4392 US NA, onde o resíduo Xaa na posição 277 é Ala, Val, Ser ou Thr.

[039] SEQ ID NO:21 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma acetil xilana esterase variante de Thermotoga lettingae do pedido de

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11/105 patente US de co-propriedade, co-depositado e copendente com número de registro legal CL4392 US NA, onde o resíduo Xaa na posição 277 é Ala, Val, Ser ou Thr.

[040] SEQ ID NO:22 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma acetil xilana esterase variante de Thermotoga petrophila do pedido de patente US de co-propriedade, co-depositado e copendente com número de registro legal CL4392 US NA, onde o resíduo Xaa na posição 277 é Ala, Val, Ser ou Thr.

[041] SEQ ID NO:23 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma Thermotoga sp. RQ2 acetil xilana esterase variante de “RQ2(a)” do pedido de patente US de co-propriedade, co-depositado e copendente com número de registro legal CL4392 US NA, onde o resíduo Xaa na posição 277 é Ala, Val, Ser ou Thr.

[042] SEQ ID NO:24 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma Thermotoga sp. RQ2 acetil xilana esterase variante de “RQ2(b)” do pedido de patente US de co-propriedade, co-depositado e copendente com número de registro legal CL4392 US NA, onde o resíduo Xaa na posição 278 é Ala, Val, Ser ou Thr.

[043] SEQ ID NO:25 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma Thermoanaerobacterium sp. JW/SL YS485 acetil xilana estearase.

[044] SEQ ID NO:26 é a região codificadora de um gene para resistência à canamicina (kan) de Streptomyces kanamyceticus.

[045] SEQ ID NO:27 é o plasmídio pKD13, que contém o gene para resistência à canamicina.

[046] SEQ ID NO:28 é um primer forward usado para clonar katG a partir do plasmídio pKD13.

[047] SEQ ID NO:29 é um primer reverso usado para clonar katG a partir do plasmídio pKD13.

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12/105 [048] SEQ ID NO:30 é o produto de PCR da amplificação de katG a partir do plasmídio pKD13 usando-se os primers da SEQ ID NO:28 e da SEQ ID NO:29.

[049] A SEQ ID NO:31 é a região codificadora do gene da catalase-peroxidase (katG).

[050] SEQ ID NO:32 é a sequência de aminoácidos deduzida de katG [051] SEQ ID NO:33 é o plasmídio pKD46, que contém os genes da recombinase λ-Red.

[052] SEQ ID NO:34 é um primer forward usado para confirmar o rompimento de katG.

[053] SEQ ID NO:35 é um primer reverso usado para confirmar o rompimento de katG.

[054] SEQ ID NO:36 é o plasmídio pCP20 sensível à temperatura, que contém a recombinase FLP.

[055] SEQ ID NO:37 é um primer forward usado para clonar katE a partir do plasmídio pKD13.

[056] SEQ ID NO:38 é um primer reverso usado para clonar katE a partir do plasmídio pKD13.

[057] SEQ ID NO:39 é o produto de PCR da amplificação de katE a partir do plasmídio pKD13 usando-se os primers da SEQ ID NO:37 e da SEQ ID NO:38.

[058] A SEQ ID NO:40 é a região codificadora do gene da catalase HPII (katE).

[059] SEQ ID NO:41 é a sequência de aminoácidos deduzida de katE [060] SEQ ID NO:42 é um primer forward usado para confirmar o rompimento de katE.

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13/105 [061] SEQ ID NO:43 é um primer reverso usado para confirmar o rompimento de katE.

[062] SEQ ID NO:44 é uma região codificadora de um gene que codifica acetil xilana esterase de Thermotoga neapolitana conforme relatado no GENBANK® (acesso # AE000512).

[063] SEQ ID NO:45 é um primer forward usado para amplificar o gene da acetil xilana esterase de Thermotoga neapolitana.

[064] SEQ ID NO:46 é um primer reverso usado para amplificar o gene da acetil xilana esterase de Thermotoga neapolitana.

[065] SEQ ID NO:47 é o produto de PCR da amplificação de acetil xilana esterase usando-se os primers de SEQ ID NO:45 e SEQ ID NO:46.

[066] SEQ ID NO:48 é um gene que codifica acetil xilana esterase de Thermotoga neapolitana conforme relatado no GENBANK^®(acesso # NP_227893.1).

[067] SEQ ID NO:49 é um primer forward usado para amplificar o gene da acetil xilana esterase de Thermotoga maritima.

[068] SEQ ID NO:50 é um primer reverso usado para amplificar o gene da acetil xilana esterase de Thermotoga maritima.

[069] SEQ ID NO:51 é o produto de PCR da amplificação de acetil xilana esterase usando-se os primers de SEQ ID NO:49 e SEQ ID NO:50.

Descrição Detalhada da Invenção [070] É divulgado na presente invenção um método para estabilização da atividade de peridrolase de uma estearase CE-7 em uma formulação com um éster de ácido carboxílico que emprega a adição de um agente tamponador, substancialmente indissolúvel, à formulação de estearase CE-7 e do éster de ácido carboxílico. São fornecidas, ainda, formulações desinfetantes que compreendem os perácidos produzidos pelos processos descritos na presente invenção.

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14/105 [071] Nesta divulgação, são utilizados vários termos e abreviações. As definições a seguir são aplicadas, a menos que estabelecido de outra forma.

[072] Como usado na presente invenção, os artigos “um”, “uma” e “o/a” antes de um elemento ou componente da invenção têm a intenção de não restringir em relação aos números de casos (isto é, ocorrências) do elemento ou componente. Portanto “um”, “uma” e “o/a” deveriam ser entendidos como um(a) ou pelo menos um(a), e a forma da palavra no singular do elemento ou componente também inclui o plural, a menos que o número esteja no singular de forma óbvia.

[073] Como usado na presente invenção, o termo “que compreende” significa a presença das características estabelecidas, números inteiros, etapas ou componentes conforme referido nas reivindicações, mas que não exclui a presença ou adição de uma ou mais características, números inteiros, etapas, componentes ou grupos destes. O termo “que compreende” tem a intenção de incluir realizações englobadas pelos termos “que consiste essencialmente em” e “que consiste em”. De maneira similar, o termo “que consiste essencialmente em” tem a intenção de incluir realizações englobadas pelo termo “que consiste em”.

[074] Como usado na presente invenção, o termo “cerca de” modifica a quantidade de um ingrediente ou reagente e refere-se à variação na quantidade numérica que pode ocorrer, por exemplo, através de medidas típicas e procedimentos de manuseio de líquidos usados para fazer concentrados ou uso de soluções na realidade; através de erros negligentes nestes procedimentos; através de diferenças na fabricação, fonte ou pureza dos ingredientes empregados para se fazerem às composições ou realizar os métodos; e similares. O termo “cerca de” também engloba quantidades que diferem devido às diferentes condições de equilíbrio para uma composição resultante de uma mistura inicial

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15/105 específica. Se modificado ou não pelo termo “cerca de”, as reivindicações incluem equivalentes às quantidades.

[075] Quando presente, todas as faixas são inclusivas e combináveis. Por exemplo, quando uma faixa de “1 a 5” é dita, a faixa deve ser entendida como incluindo faixas de “1 a 4”, “1 a 3”, “1 a 2”, “1 a 2 e 4 a 5”, “1 a 3 e 5”, e similares.

[076] Como usado na presente invenção, os termos “substrato”, “substrato adequado” e “substrato de éster de ácido carboxílico” referem-se especificamente de modo alternado a:

(a) um ou mais ésteres que têm a estrutura [X]mR5 em que

X é um grupo éster da fórmula ReC(O)O;

R6 é um componente hidrocarbil C1 a C7 linear, ramificado ou cíclico, opcionalmente substituído por um grupo hidroxila ou grupo alcoxi C1 a C4, sendo que R6 opcionalmente compreende uma ou mais ligações de éter onde R6 é C2 a C7;

R5 é um componente hidrocarbil C1 a C6 linear, ramificado ou cíclico, opcionalmente substituído por um grupo hidroxila, sendo que cada átomo de carbono em R5 compreende individualmente não mais que um grupo hidroxila ou não mais que um grupo éster, e sendo que R5 opcionalmente compreende uma ou mais ligações de éter;

m é 1 para o número de átomos de carbono em R5, o dito um ou mais ésteres têm uma solubilidade em água de pelo menos 5 ppm a 25 °C; ou (b) um ou mais glicerídeos que têm a estrutura

O

R1---c---o—ch₂---ch---ch₂---OR4

OR3

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16/105 sendo que Ri é um alquil C1 a C7 de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituído por uma hidroxila ou um grupo alcoxi C1 a C4 e R3 e R4 são individualmente H ou RiC(O); ou (c) um ou mais ésteres da fórmula

O

R1 C O R2 em que Ri é um alquil C1 a C7 de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituído por hidroxila ou por um grupo alcoxi C1 a C4 e R2 é um alquil, alquenil, alquinil, aril, alquilaril, alquilheteroaril, heteroaril C1 a C10 de cadeia reta ou ramificada alquil, alquenil, alquinil, aril, alquilaril, alquilheteroaril, heteroaril, (CH2CH2O)n, ou (CH2CH(CH3)-O)nH e n é 1 a 10; ou (d) um ou mais monossacarídeos acetilados, dissacarídeos acetilados ou polissacrídeos acetilados; ou (e) qualquer combinação de (a) até (d).

[077] Exemplos do dito substrato de éster de ácido carboxílico podem incluir monoacetina, triacetina, monopropionina, dipropionina, tripropionina, monobutirina, dibutirina, tributirina, penta-acetato de glicose, tetra-acetato de xilose, xilana acetilado, fragmentos de xilana acetilado, β-Dribofuranose-1,2,3,5-tetraiacetate, tri-O-acetil-D-galactal, tri-O-acetil-glucal, diacetato de propilenoglicol, diacetato de etileno glicol, monoésteres ou diésteres de 1,2-etanodiol, 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiol, 1,2-butanodiol, 1,3-butanodiol, 2,3-butanodiol, 1,4-butanodiol, 1,2-pentanodiol, 2,5-pentanodiol, 1,6-pentanodiol, 1,2-hexanodiol, 2,5-hexanodiol, 1,6-hexanodiol, ou qualquer combinação dos mesmos.

[078] Como usado na presente invenção, o termo “perácido” é sinônimo de peroxiácido, ácido peroxicarboxílico, peroxiácido, ácido percarboxílico e ácido peroxóico.

[079] Como usado na presente invenção, o termo “ácido

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17/105 peracético” é abreviado como “PAA” e é sinônimo de ácido peroxiacético, ácido etanoperoxóico e todos os outros sinônimos, com Número de Registro CAS 7921-0.

[080] Como usado na presente invenção, o termo “monoacetina” é sinônimo de monoacetato de glicerol, monoacetato de glicerina e monoacetato de gliceril.

[081] Como usado na presente invenção, o termo “diacetina” é sinônimo de diacetato de glicerol, diacetato de glicerina e diacetato de gliceril, e todos os outros sinônimos com registro CAS 25395-31-7.

[082] Como usado na presente invenção, o termo “triacetina” é sinônimo de triacetato de glicerina, triacetato de glicerol e triacetato de gliceril, 1,2,3-triacetoxipropano, triacetato de 1,2,3-propanotriol e todos os outros sinônimos com registro CAS 102-76-1.

[083] Como usado na presente invenção, o termo “monobutirina” é sinônimo de monobutirato de glicerol, monobutirato de glicerina e monobutirato de gliceril.

[084] Como usado na presente invenção, o termo “dibutirina” é sinônimo de dibutirato de glicerol e dibutirato de gliceril.

[085] Como usado na presente invenção, o termo “tributirina” é sinônimo de tributirato de glicerol, 1,2,3-tributirilglicerol e todos os outros sinônimos com registro CAS 60-01-5.

[086] Como usado na presente invenção, o termo “monopropionina” é sinônimo de monopropionato de glicerol, monopropionato de glicerina e monopropionato de gliceril.

[087] Como usado na presente invenção, o termo “dipropionina” é sinônimo de dipropionato de glicerol e dipropionato de gliceril.

[088] Como usado na presente invenção, o termo “tripropionina” é sinônimo de tripropionato de gliceril, tripropionato de gliceril e 1,2,3Petição 870190093680, de 19/09/2019, pág. 29/230

18/105 tripropionilglicerol e todos os outros sinônimos com registro CAS 139-45-7.

[089] Como usado na presente invenção, o termo “acetato de etila” é sinônimo de éter acético, acetoxietano, etanoato de etila, ácido acético etil éster, ácido etanóico etil éster, éster etil acético e todos os outros sinônimos com registro CAS 141-78-6.

[090] Como usado na presente invenção, o termo “lactato de etila” é sinônimo de ácido láctico etil éster e todos os outros sinônimos com registro CAS 97-64-3.

[091] Como usado na presente invenção, os termos “açúcar acetilado” e “sacarídeo acetilado” referem-se a mono, di e polissacaríderos que compreendem pelo menos um grupo acetil. Exemplos incluem, mas não se limitam a penta-acetato de glicose, tetra-acetato de xilose, xilana acetilado, fragmentos de xilana acetilado, p-D-ribofuranose-1,2,3,5-tetra-acetato, tri-Oacetil-D-galactal e tri-O-acetil-glucal.

[092] Como usado na presente invenção, os termos “hidrocarbil”, “grupo hidrocarbil” e “componente hidrocarbil” significa um arranjo de átomos de carbono de cadeia reta, ramificada ou cíclica, conectados por ligações de carbono simples, duplas ou triplas e/ou por ligações de éter e adequadamente substituídos por átomos de hidrogênio. Esses grupos hidrocarbil podem ser alifáticos e/ou aromáticos. Exemplos de grupos hidrocarbil incluem metil, etil, propil, isopropil, butil, isobuti, t-butil, ciclopropil, ciclobutil, pentil, ciclopentil, metilciclopentil, hexil, ciclohexil, benzil e fenil. Em uma realização preferencial, o componente “hidrocarbil” é um arranjo de átomos de carbono de cadeia reta, ramificada ou cíclica, conectados por ligações de carbono simples e/ou por ligações de éter e adequadamente substituídos por átomos de hidrogênio.

[093] Como usado na presente invenção, os termos “monoésteres” e “diésteres” de 1,2-etanodiol, 1,2-propanodiol, 1,3-propanodiol, 1,2-butanodiol, 1,3-butanodiol, 2,3-butanodiol, 1,4-butanodiol, 1,2-pentanodiol,

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2,5-pentanodiol, 1,6-pentanodiol, 1,2-hexanodiol, 2,5-hexanodiol, 1,6hexanodiol, e misturas dos mesmos, referem-se aos ditos compostos que compreendem pelo menos um grupo éster de fórmula RC (O) O, em que R é um componente hidrocarbil linear C1 a C7. Em uma realização, o substrato éster de ácido carboxílico é selecionado do grupo que consiste em diacetato de propileno glicol (PGDA), diacetato de etileno glicol (EDGA) e misturas dos mesmos.

[094] Como usado na presente invenção, o termo “diacetato de propileno glicol” é sinônimo de 1,2-diacetoxipropano, diacetato de propileno, diacetato de 1,2-propanodiol, e todos os outros sinônimos com registro CAS 623-84-7.

[095] Como usado na presente invenção, o termo “diacetato de etileno glicol” é sinônimo de 1,2-diacetoxietano, diacetato de etileno, diacetato de glicol e todos os outros sinônimos com registro CAS 111-55-7.

[096] Como usado na presente invenção, os termos “mistura de reação enzimática adequada”, “componentes adequados para geração in situ de um perácido”, “componentes de reação adequados” e “mistura de reação aquosa adequada” referem-se aos materiais e água, na qual os reagentes e enzimas catalisadoras entram em contato. Os componentes adequados da mistura de reação aquosa são fornecidos na presente invenção e os técnicos no assunto apreciam as faixas de variações de componentes para este processo. Em uma realização, a mistura de reação enzimática produz perácido in situ mediante combinação dos componentes de reação. Assim, os componentes de reação podem ser fornecidos como um sistema multicomponente, sendo que um ou mais dos componentes de reação permanecem separados até o uso. Em outra realização, os componentes de reação são primeiro combinados para formar uma solução aquosa de perácido, que é subsequentemente colocada em contato com a superfície a ser

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20/105 desinfetada e/ou branqueada. O projeto de sistemas e meios para separar e combinar componentes ativos múltiplos são conhecidos na técnica e geralmente dependerão da forma física dos componentes de reação individuais. Por exemplo, sistemas fluidos de ativos múltiplos (líquido-líquido) tipicamente usam recipientes dispensadores com múltiplas câmaras ou sistemas de duas fases (por exemplo, publicação de pedido de patente US 2005/0139608, patente US 5.398.846, patente US 5.624.634, patente US 6.391.840, patente EP E0807156B1, publicação de pedido de patente US 2005/0008526 e publicação WO 00/61713), como encontrado em algumas aplicações de alvejantes em que o agente desejado é produzido mediante mistura dos fluidos reativos. Outras formas de sistemas multicomponentes usados para produzir perácidos podem incluir, mas não se limitam àqueles projetados para um ou mais componentes sólidos ou combinações de componentes sólido-líquido, como pós (por exemplo, patente US 5.116.575), pastilhas de multicamadas (por exemplo, patente US 6.210.639), pacotes solúveis em água com múltiplos compartimentos (por exemplo, patente US 6.995.125) e aglomerados sólidos que reagem mediante a adição de água (por exemplo, patente US 6.319.888). Em uma realização, uma formulação multicomponente é fornecida como dois componentes individuais por meio dos quais uma solução aquosa que compreende um ácido peroxicarboxílico é gerada mediante combinação de dois componentes. Em outra realização, é fornecida uma formulação multicomponente que compreende:

a) um primeiro componente, que compreende:

i) um pó de enzima, conforme divulgado na presente invenção; e ii) um éster de ácido carboxílico, o dito primeiro componente que compreende um ingrediente adicional selecionado do grupo que consiste em um tampão inorgânico ou orgânico, um inibidor de corrosão, um agente de umedecimento, e combinações dos mesmos.

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b) um segundo componente que compreende uma fonte de peroxigênio e água, o dito segundo componente opcionalmente compreendendo um estabilizador de peróxido de hidrogênio.

[097] Em outra realização, o éster de ácido carboxílico no primeiro componente é selecionado do grupo que consiste em monoacetina, diacetina, triacetina e combinações dos mesmos. Em outra realização, o éster de ácido carboxílico no primeiro componente é um sacarídeo acetilado. Em outra realização, o catalisador enzimático no primeiro componente é um sólido particulado. Em outra realização, o primeiro componente de reação é uma pastilha ou pó.

[098] Como usado na presente invenção, o termo “peridrólise” é definido como a reação de um substrato com peróxido para formar um perácido. Tipicamente, o peróxido inorgânico reagiu com o substrato selecionado na presença de um catalisador para produzir o perácido. Como usado na presente invenção, o termo “peridrólise química” inclui reações de peridrólise na qual um substrato (um precursor de perácido) é combinado com uma fonte de peróxido de hidrogênio em que o perácido é formado na ausência de uma catalisador enzimático.

[099] Como usado na presente invenção, o termo “atividade da peridrolase” refere-se à atividade catalisadora por unidade de massa (por exemplo, miligramas) de proteína, peso seco ou peso do catalisador imobilizado.

[0100] Como usado na presente invenção, “uma unidade de atividade enzimática” ou “uma unidade de atividade” ou “U” é definido como a quantidade de atividade peridrolase para a produção de pmol de produto perácido por minuto como uma temperatura específica.

[0101] Como usado na presente invenção, os termos “catalisador enzimático” e “catalisador peridrolase” referem-se a um catalisador que

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22/105 compreende uma enzima que tem atividade de peridrolase e pode estar sob a forma de uma célula microbiana completa, célula(s) microbiana(s) permeabilizada(s), um ou mais componentes celulares de um extrato celular microbiano, enzima parcialmente purificada ou enzima purificada. O catalisador enzimático também pode ser quimicamente modificado (por exemplo, pela reação de peguilação ou pela reação com reagentes reticulantes). O catalisador de peridrolase também pode ser imobilizado em um suporte solúvel ou insolúvel usando-se métodos conhecidos pelos técnicos no assunto, consulte, por exemplo, Immobilization of Enzymes and Cells; Gordon F. Bickerstaff, Editor; Humana Press, Totowa, NJ, EUA; 1997. Conforme descrito na presente invenção, todas as enzimas presentes que têm atividade de peridrolase são estruturalmente membros da família de carboidratos, família de enzimas estearase 7 (família CE-7) (consulte Coutinho, P.M., Henrissat, B. “Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach” em Recent Advances in Carbohydrate Bioengineering, H.J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat e B. Svensson eds., (1999) The Royal Society of Chemistry, Cambridge, páginas 3-12.). A família de enzimas CE-7 demonstrou ser particularmente efetiva para produzir perácidos a partir de uma variedade de substratos de éster de ácido carboxílico quando combinada com uma fonte de peroxigênio (consulte, publicação WO 2007/070609 e publicações de pedido de patentes US 2008/0176299, 2008/176783 e 2009/0005590 para DiCosimo et al.; cada uma destas integralmente incorporada a presente invenção como referência).

[0102] Membros da família CE-7 incluem cefalosporina C desacetilases (CAHs; E.C. 3.1.1.41) e acetil xilana esterases (AXEs; E.C. 3.1.1.72). Membros da família esterase CE-7 compartilham um motivo de assinatura conservada (Vincent et al., J. Mol. Biol., 330:593-606 (2003)). As peridrolases que compreendem um motivo de assinatura CE-7 e/ou uma estrutura substancialmente similar são adequadas para uso na presente

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23/105 invenção. Meios para identificar substancialmente moléculas biologicamente similares são conhecidos na técnica (por exemplo, protocolos de alinhamento de sequências, hibridizações de ácido nucleico e/ou a presença de um motivo de assinatura conservada). Em um aspecto, as presentes peridrolases incluem enzimas que compreendem o motivo de assinatura CE-7 e pelo menos 30%, preferencialmente pelo menos 33%, com mais preferência pelo menos 40%, ainda com mais preferência pelo menos 42%, ainda com mais preferência pelo menos 50%, ainda com mais preferência pelo menos 60%, ainda com mais preferência pelo menos 70%, ainda com mais preferência pelo menos 80%, ainda com mais preferência pelo menos 90%, e com a máxima preferência pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de aminoácidos com as sequências fornecidas na presente invenção. Em um aspecto adicional, as presentes peridrolases incluem enzimas que compreendem o motivo de assinatura CE-7 e pelo menos 30%, preferencialmente pelo menos 33%, com mais preferência pelo menos 40%, ainda com mais preferência pelo menos 42%, ainda com mais preferência pelo menos 50%, ainda com mais preferência pelo menos 60%, ainda com mais preferência pelo menos 70%, ainda com mais preferência pelo menos 80%, ainda com mais preferência pelo menos 90%, e com a máxima preferência pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de aminoácidos com a SEQ ID NO: 1.

[0103] Como usado na presente invenção, o termo “pó de enzima” refere-se ao produto de uma formulação aquosa seco por atomização que compreende (1) pelo menos uma enzima estruturalmente classificada como esterase carboidrato CE-7 que tem atividade de peridrolase, (2) pelo menos um excipiente oligossacarídeo, e opcionalmente pelo menos um tensoativo. Em algumas realizações, pelo menos um excipiente de oligossacarídeo tem um peso molecular médio numérico de pelo menos cerca

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24/105 de 1250 e um peso molecular médio ponderai de pelo menos cerca de 9000.

[0104] Como usado na presente invenção, os termos “cefalosporina C desacetilase” e “cefalosporina C acetil hidrolase” referem-se a uma enzima (E.C. 3.1.1.41) que catalisa a desacetilação de cefalosporinas como cefalosporina C e ácido 7-aminocefalosporânico (Mitsushima et al., (1995) Appl. Env. Microbiol. 61(6):2224-2229). Diversas cefalosporinas C desacetilases que têm atividade significativa de peridrolase são fornecidas na presente invenção.

[0105] Como usado na presente invenção, “acetil xilana esterases” refere-se a uma enzima (E.C. 3.1.1.72; AXEs) que catalisa a desacetilação de xilanas acetilados e outros sacarídeos acetilados. Conforme ilustrado na presente invenção, são fornecidas diversas enzimas classificadas como acetil xilana esterases que têm atividade significativa de peridrolase.

[0106] Como usado na presente invenção, o termo “Bacillus subtilis ATCC® 31954™” refere-se a uma célula bacteriana depositada na Coleção Americana de Tipo de Cultura (ATCC^®) que tem número de acesso internacional de depósito ATCC^® 31954™. Bacillus subtilis ATCC^® 31954™ foi relatado como tendo atividade de hidrolase (“diacetinase”) capaz de hidrolisar ésteres de glicerol que têm 2 a 8 grupos acil carbono especialmente diacetina (patente US 4.444.886; integralmente incorporada a presente invenção como referência). Conforme descrito na presente invenção, uma enzima que tem atividade significativa de peridrolase foi isolada de B. subtilis ATCC^® 31954™ e é fornecida como SEQ ID NO:1. A sequência de aminoácidos da enzima isolada tem 100% de identidade de aminoácido com a cefalosporina C desacetilase fornecida pelo GENBANK® com número de acesso BAA01729.1 (Mitsushima et al., acima).

[0107] Como usado na presente invenção, o termo “Bacillus subtilis ATCC^® 29233™” refere-se a uma linhagem de Bacillus subtilis

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25/105 depositada na Coleção Americana de Tipo de Cultura (ATCC®) que tem número de acesso internacional de depósito ATCC® 29233™. Conforme descrito na presente invenção, uma enzima que tem atividade significativa de peridrolase foi isolada de B. subtilis ATCC® 29233™ e é fornecida como SEQ ID NO:12.

[0108] Como usado na presente invenção, o termo “Clostridium thermocellum ATCC® 27405™” refere-se a uma linhagem de Clostridium thermocellum depositada na Coleção Americana de Tipo de Cultura (ATCC®) que tem número de acesso internacional de depósito ATCC® 27405™. A sequência de aminoácidos da enzima que tem atividade de peridrolase de C. thermocellum ATCC® 27405™ é fornecida como SEQ ID NO:5.

[0109] Como usado na presente invenção, o termo “Bacillus subtilis ATCC® 6633™” refere-se a uma célula bacteriana depositada na Coleção Americana de Tipo de Cultura (ATCC^®) que tem número de acesso internacional de depósito ATCC^® 6633™. Bacillus subtilis ATCC^® 6633™ foi relatado como tendo atividade de acetilhidrolase (patente US 6.465.233). A sequência de aminoácidos da enzima que tem atividade de peridrolase de B. subtilis ATCC® 6633™ é fornecida como SEQ ID NO:2.

[0110] Como usado na presente invenção, o termo “Bacillus licheniformis ATCC® 14580™” refere-se a uma célula bacteriana depositada na Coleção Americana de Tipo de Cultura (ATCC^®) que tem número de acesso internacional de depósito ATCC^® 14580™. Bacillus licheniformis ATCC^®

14580™ foi relatado como tendo atividade de acetilhidrolase. A sequência de aminoácidos da enzima que tem atividade de peridrolase de B. licheniformis ATCC® 14580™ é fornecida como SEQ ID NO:3.

[0111] Como usado na presente invenção, o termo “Bacillus pumilus PS213” refere-se a uma célula bacteriana relatada como tendo atividade de acetil xilana esterase (GENBANK^® AJ249957). A sequência de

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26/105 aminoácidos da enzima que tem atividade de peridrolase de Bacillus pumilus PS213 é fornecida como SEQ ID NO:4.

[0112] Como usado na presente invenção, o termo “Thermotoga neapolitana” refere-se a uma linhagem de Thermotoga neapolitana relatada como tendo atividade de acetil xilana esterase (GENBANK® AAB70869). A sequência de aminoácidos da enzima que tem atividade de peridrolase de Thermotoga neapolitana é fornecida como SEQ ID NO: 6.

[0113] Como usado na presente invenção, o termo “Thermotoga maritima MSB8” refere-se a uma célula bacteriana relatada como tendo atividade de acetil xilana esterase (GENBANK® NP_227893.1). A sequência de aminoácidos da enzima que tem atividade de peridrolase de Thermotoga maritima MSB8 é fornecida como SEQ ID NO: 7.

[0114] Como usado na presente invenção, o termo “Bacillus clausii KSM-K16” refere-se a uma célula bacteriana relatada como tendo atividade de cefalosporina-C desacetilase (GENBANK^® YP_175265). A sequência de aminoácidos da enzima que tem atividade de peridrolase de Bacillus clausii KSM-K16 é fornecida como SEQ ID NO: 11.

[0115] Como usado na presente invenção, o termo “Thermoanearobacterium saccharolyticum” refere-se a uma linhagem bacteriana relatada como tendo atividade de acetil xilana esterase (GENBANK^®S41858). A sequência de aminoácidos da enzima que tem atividade de peridrolase de Thermoanearobacterium saccharolyticum é fornecida como SEQ ID NO: 13.

[0116] Como usado na presente invenção, o termo “Thermotoga lettingae” refere-se a uma célula bacteriana relatada como tendo atividade de acetil xilana esterase (GENBANK^® CP000812). A sequência de aminoácidos deduzida da enzima que tem atividade de peridrolase de Thermotoga lettingae é fornecida como SEQ ID NO: 14.

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27/105 [0117] Como usado na presente invenção, o termo “Thermotoga petrophila” refere-se a uma célula bacteriana relatada como tendo atividade de acetil xilana esterase (GENBANK® CP000702). A sequência de aminoácidos deduzida da enzima que tem atividade de peridrolase de Thermotoga lettingae é fornecida como SEQ ID NO: 15.

[0118] Como usado na presente invenção, o termo “Thermotoga sp RQ2” refere-se a uma célula bacteriana relatada como tendo atividade de acetil xilana esterase (GENBANK® CP000969). Duas acetil xilana esterases diferentes de Thermotoga sp foram identificadas. RQ2 são referidas na presente invenção como “RQ2(a)” (a sequência de aminoácidos deduzida fornecida como SEQ ID NO: 16) e “RQ2(b)” (a sequência de aminoácidos deduzida fornecida como SEQ ID NO: 17).

[0119] Como usado na presente invenção, uma “molécula de ácido nucléico isolada” um “fragmento isolado de ácido nucléico” serão usados alternadamente e referem-se um polímero de RNA ou DNA de fita simples ou dupla, opcionalmente contendo bases de nucleotídeos sintéticos, não naturais ou alterados. Uma molécula de ácido nucléico isolada sob a forma de um polímero de DNA pode ser compreendida por um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico, DNA sintético.

[0120] O termo “aminoácido” refere-se à unidade de estrutura química básica de uma proteína ou polipeptídio. As abreviações a seguir são usadas na presente invenção para identificar aminoácidos específicos:

Aminoácido	Abreviação com Três Letras	Abreviação com Uma Letra
Alanina	Ala	A
Arginina	Arg	R
Asparagina	Asn	N

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Aminoácido	Abreviação com Três Letras	Abreviação com Uma Letra
Ácido Aspártico	Asp	D
Cisteína	Cys	C
Glutamina	Gln	Q
Ácido Glutâmico	Glu	E
Glicina	Gly	G
Histidina	His	H
Isoleucina	Ile	I
Leucina	Leu	L
Lisina	Lys	K
Metionina	Met	M
Fenilalanina	Phe	F
Prolina	Pro	P
Serina	Ser	S
Treonina	Thr	T
Triptofano	Trp	W
Tirosina	Tyr	Y
Valina	Val	V
Qualquer aminoácido ou conforme definido na presente invenção	Xaa	X

[0121] Como usado na presente invenção, “substancialmente similar” refere-se às moléculas de ácido nucléico em que alterações em uma ou mais bases de nucleotídeos resultam na adição, substituição ou deleção de um ou mais aminoácidos, mas não afetam as propriedades funcionais (isto é, atividade peridrolítica) da proteína codificada pela sequência de DNA. Como usado na presente invenção, “substancialmente similar” também se refere a

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29/105 uma enzima que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 30%, preferencialmente pelo menos 33%, com mais preferência pelo menos 40%, com mais preferência pelo menos 50%, ainda com mais preferência pelo menos 60%, ainda com mais preferência pelo menos 70%, ainda com mais preferência pelo menos 80%, com a máxima preferência pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica às sequências relatadas na presente invenção, sendo que a enzima resultante retém as presentes propriedades funcionais (isto é, atividade peridrolítica). “Substancialmente similar” também pode se referir a uma enzima que tem atividade peridrolítica codificada pelas moléculas de ácido nucléico que hibridizam, mediante condições de estringência, com as moléculas de ácido nucléico relatadas na presente invenção. Entende-se, portanto, que a invenção engloba mais que as sequências exemplares específicas.

[0122] Por exemplo, é comum e bem conhecido na técnica que alterações em um gene resultam na produção de um aminoácido equivalente quimicamente em um dado sítio, mas não afeta as propriedades funcionais da proteína codificada. Para os propósitos da presente invenção, substituições são definidas como trocas dentro dos cinco grupos a seguir:

1. Resíduos alifáticos pequenos, não-polares ou levemente polares: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);

2. Resíduos polares, carregados negativamente e suas amidas: Asp, Asn, Glu, Gln;

3. Resíduos polares, carregados positivamente: His, Arg, Lys;

4. Resíduos alifáticos grandes, não polar: Met, Leu, Ile, Val (Cys); e

5. Resíduos aromáticos grandes: Phe, Tyr e Trp.

[0123] Dessa forma, um códon para o aminoácido alanina, um aminoácido hidrofóbico, pode ser substituído por um códon que codifica outro resíduo menos hidrofóbico (como glicina), ou um resíduo mais hidrofóbico

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30/105 (como valina, leucina ou isoleucina). De maneira similar, espera-se que as alterações que resultam na substituição de um resíduo carregado negativamente por outro resíduo (como ácido aspártico por ácido glutâmico) ou um resíduo carregado positivamente por outro resíduo (como lisina por arginina), também possam gerar um produto equivalente de forma funcional. Em muitos casos, não seria esperado que as trocas nos nucleotídeos que resultam na alteração das porções N-terminal e C-terminal da molécula polipeptídica alterassem a atividade da proteína.

[0124] Cada uma das modificações propostas está dentro da rotina dos técnicos no assunto, conforme determinação da retenção da atividade biológica dos produtos codificados. Além disso, um técnico no assunto reconhece que sequências substancialmente similares são englobadas pela presente invenção. Em uma realização, sequências substancialmente similares são definidas pela sua capacidade de hibridizar com as sequências exemplificadas na presente invenção, mediante condições de estringência (0,1X SSC, 0,1% SDS, 65°C e lavagens com 2X SSC, 0,1% SDS seguida por 0,1X SSC, 0,1% SDS, 65°C).

[0125] Como usado na presente invenção, uma molécula de ácido nucléico é “hibridizável” a outra molécula de ácido nucléico, como um cDNA, DNA genômico ou RNA, quando uma fita simples da primeira molécula pode anelar com outra molécula mediante condições apropriadas de temperatura e força iônica da solução. Condições de hibridização e lavagem são conhecidas e exemplificadas em Sambrook, J. e Russell, D., T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001). As condições de temperatura e força iônica determinam a “estringência” da hibridização. Condições de estringência podem ser ajustadas para selecionar moléculas moderadamente similares, como sequências homólogas de organismos relacionados de forma distante, até

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31/105 moléculas altamente similares, como genes que duplicam enzimas funcionais de organismos intimamente relacionados. A pós-hibridização tipicamente lava determinadas condições de estringência. Um conjunto de condições preferenciais usa uma série de lavagens iniciando com 6X SSC, SDS a 0,5% em temperatura ambiente por 15 min, e então repetido com 2X SSC, SDS a 0,5% a 45°C por 30 min, e então repetido 0,2 X SSC, SDS a 0,5% a 50°C por 30 min. Um conjunto de condições mais preferenciais usa temperaturas mais altas, cujas lavagens são idênticas àquelas acima, exceto a temperatura das duas lavagens finais de 30 minutos em 0,2X SSC, SDS a 0,5% que foi aumentada para 60°C. Outro conjunto preferencial de condições estringentes de hibridização é 0,1X SSC, SDS a 0,1%, 65°C e lavados com 2X SSC, SDS a 0,1% seguido por uma lavagem final de 0,1X SSC, SDS a 0,1%, 65°C com as sequências exemplificadas na presente invenção. Em uma realização adicional, as presentes composições e métodos empregam uma enzima que tem atividade de peridrolase codificada pela molécula de ácido nucléico isolada que hibridiza, mediante condições de estringência, com uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, e SEQ ID NO: 25.

[0126] A hibridização necessita que dois ácidos nucleicos contenham sequências complementares, embora dependentes da estringência da hibridização, o emparelhamento mal sucedido entre as bases é possível. A estringência apropriada para hibridizar os ácidos nucleicos depende do comprimento dos ácidos nucleicos e do grau de complementação, variáveis

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32/105 bem conhecidas na técnica. Quanto maior o grau de similaridade ou homologia entre as sequências de nucleotídeos, maior o valor de Tm para híbridos de ácidos nucleicos que têm essas sequências. A estabilidade relativa (que corresponde a Tm maior) de ácidos nucleicos diminui na seguinte ordem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos maiores que 100 nucleotídeos de comprimento, as equações para cálculo de Tm foram derivadas (Sambrook e Russel, acima). Para hibridizações com ácidos nucleicos mais curtos, isto é, oligonucleotídeos, a posição de emparelhamentos mal sucedidos torna-se mais importante, e o comprimento do oligonucleotídeo determina sua especificidade (Sambrook e Russel, acima). Em um aspecto, o comprimento para um ácido nucléico hibridizável é de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos. Preferencialmente, o comprimento mínimo para um ácido nucléico hibridizável é de pelo menos cerca de 15 nucleotídeos em comprimento, com mais preferência cerca de pelo menos 20 nucleotídeos em comprimento, ainda com mais preferência pelo menos 30 nucleotídeos em comprimento, ainda com mais preferência pelo menos 300 nucleotídeos em comprimento, e com a máxima preferência pelo menos 800 nucleotídeos em comprimento. Além disso, o técnico no assunto reconhecerá que a temperatura e concentração da solução salina de lavagem podem ser ajustadas conforme necessário, de acordo com fatores como comprimento da sonda.

[0127] Como usado na presente invenção, o termo “porcentagem de identidade” é uma relação entre duas ou mais sequências de polipeptídeos ou duas ou mais sequências de polinucleotídeos, conforme determinado pela comparação das sequências. Na técnica, “identidade” significa o grau de parentesco entre as sequências de polipeptídeos e polinucleotídeos, conforme o caso pode ser determinado pela correspondência entre as fitas dessas sequências. “Identidade” e “similaridade” podem ser facilmente calculadas por métodos conhecidos incluindo, mas não se limitando aos métodos descritos

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33/105 em: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, NY (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, NY (1993j; Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds.) Humana Press, NJ (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., eds.) Stockton Press, NY (1991). Métodos para determinar a identidade e a similaridade são codificados nos programas de computação publicamente disponíveis. Os alinhamentos de sequências e os cálculos de porcentagem de identidade podem ser realizados usando-se o programa Megalign do conjunto de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI), o programa AlignX do Vector NTI v. 7.0 (Informax, Inc., Bethesda, MD), ou o conjunto de Programa de Computação EMBOSS (EMBL-EBI; Rice et al., Trends in Genetics 16, (6):276-277 (2000)). Múltiplos alinhamentos das sequências podem ser realizados usando-se o método de alinhamento Clustal (e.g., CLUSTALW; por exemplo, a versão 1.83) (Higgins e Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989); Higgins et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-4680 (1994); e Chenna et al., Nucleic Acids Res 31 (13):3497-500 (2003)), disponível junto ao European Molecular Biology Laboratory através do European Bioinformatics Institute) com os parâmetros padrão. Parâmetros adequados para o alinhamento de proteínas CLUSTALW incluem penalidade existente para GAP = 15, extensão de GAP = 0,2, matriz = Gonnet (por exemplo, Gonnet250), proteína ENDGAP = -1, Proteína GAPDIST = 4, e KTUPLE=1. Em uma realização, um alinhamento rápido ou lento é usado com configurações padrão, nas quais um alinhamento lento é preferencial. Alternativamente, os parâmetros que usam o método CLUSTALW (versão 1.83) também podem ser modificados para usar KTUPLE = 1, PENALIDADE PARA GAP = 10, Extensão de GAP = 1, matriz = BLOSUM (por exemplo, BLOSUM64), JANELA = 5, e

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DIAGONIAS SUPERIORES SALVAS = 5.

[0128] Em um aspecto, moléculas de ácido nucléico isoladas adequadas codificam um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 30%, preferencialmente pelo menos 33%, preferencialmente pelo menos 40%, preferencialmente pelo menos 50%, preferencialmente pelo menos 60%, com mais preferência pelo menos 70%, com mais preferência pelo menos 80%, ainda com mais preferência pelo menos 85%, ainda com mais preferência pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica às sequências de aminoácidos relatadas na presente invenção. Moléculas de ácido nucléico adequadas não apenas têm a homologia acima, como também codificam um polipeptídeo que tem cerca de 300 a cerca de 340 aminoácidos, com mais preferência cerca de 310 a cerca de 330 aminoácidos, e com a máxima preferência cerca de 318 aminoácidos.

[0129] Como usado na presente invenção, os termos “motivo de assinatura”, “motivo de assinatura CE-7” e “motivo de diagnóstico” referem-se às estruturas conservadas compartilhadas entre uma família de enzimas que tem uma atividade definida. O motivo de assinatura pode ser usado para definir e/ou identificar a família de enzimas estruturalmente relacionada que tem atividade enzimática similar para uma família definida de substratos. O motivo de assinatura pode ser uma sequência de aminoácidos contígua ou uma coleção de descontíguas, motivos conservados que formam juntos o motivo de assinatura. Tipicamente, o(s) motivo(s) conservado(s) é(são) representado(s) por uma sequência de aminoácidos. Conforme descrito na presente invenção, as presentes enzimas que têm atividade de peridrolase (“peridrolases”) pertencem à família de esterases de carboidrato CE-7 (DiCosimo et al., acima). Como usado na presente invenção, a frase “enzima é estruturalmente classificada como uma enzima CE-7” ou “peridrolase CE-7” será usada para se

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35/105 referir a enzimas que têm atividade de peridrolase que são estruturalmente classificadas como esterase de carboidrato CE-7. Esta família de enzimas pode ser definida pela presença de um motivo de assinatura (Vincent et al., acima). Conforme definido na presente invenção, o motivo de assinatura para esterases CE-7 compreende motivos conservados (numeração de posição de resíduo relativa à sequência de referência SEQ ID NO:1):

a) Arg118-Gly119-Gln120;

b) Gly179-Xaa180-Ser181-Gln182-Gly183; e

c) His298-Glu299.

[0130] Tipicamente, o Xaa na posição de resíduo de aminoácido 180 é glicina, alanina, prolina, triptofano ou treonina. Dois dos três resíduos aminoácidos que pertencem à tríade catalítica estão em negrito. Em uma realização, o Xaa na posição de resíduo de aminoácido 180 é selecionado do grupo que consiste em glicina, alanina, prolina, triptofano e treonina.

[0131] Análises adicionais dos motivos conservados na família esterase de carboidratos indica a presença de um motivo conservado adicional (LXD nas posições de aminoácidos 267 a 269 da SEQ ID NO:1) que pode ser usado, ainda, para definir uma peridrolase pertencente à família esterase de carboidrato CE-7. Em uma realização adicional, o motivo de assinatura definido acima inclui um quarto motivo conservado definido como:

Leu267-Xaa268-Asp269.

[0132] Xaa na posição de resíduo de aminoácido 268 é tipicamente isoleucina, valina, ou metionina. O quarto motivo inclui o resíduo ácido aspártico (negrito) pertencente à tríade catalítica (Ser181-Asp269His298).

[0133] Diversos algoritmos de alinhamento globais conhecidos podem ser usados para alinhar duas ou mais sequências de aminoácidos que representam enzimas que têm atividade de peridrolase para determinar se a

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36/105 enzima é compreendida pelo presente motivo de assinatura. A(s) sequência(s) alinhadas são comparadas à sequência de referência (SEQ ID NO:1) para determinar a existência do motivo de assinatura. Em uma realização, um alinhamento CLUSTAL (como CLUSTALW) que usa uma sequência de aminoácidos de referência (como usado na presente invenção a sequência da peridrolase (SEQ ID NO:1) de Bacillus subtilis ATCC® 31954™) é usada para identificar peridrolases pertencentes à família de esterase CE-7. A numeração relativa dos resíduos de aminoácidos conservados está baseada na numeração de resíduos da sequência de aminoácidos de referência para explicar pequenas inserções ou deleções (por exemplo, cinco aminoácidos ou menos) na sequência alinhada.

[0134] Exemplos de outros algoritmos adequados que podem ser usados para identificar sequências que compreendem o presente motivo de assinatura (em comparação à sequência de referência) incluem, mas não se limitam a, Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970); uma ferramenta global de alinhamento) e Smith-Waterman (J. Mol. Biol. 147:195197 (1981); uma ferramenta local de alinhamento). Em uma realização, um alinhamento Smith-Waterman é implementado usando-se parâmetros padrão. Um exemplo de parâmetros padrão adequados incluem o uso de uma matriz de pontuação BLOSUM62 com penalidade para GAP aberto = 10 e uma penalidade para extensão de GAP = 0.5.

[0135] Uma comparação da identidade percentual geral entre peridrolases exemplificadas na presente invenção indica que as enzimas que têm menos que 33% de identidade com a SEQ ID NO:1 (ao mesmo tempo mantendo o motivo de assinatura) exibem atividade de peridrolase significativa e são estruturalmente classificadas como esterases de carboidratos CE-7. Em uma realização adequada, as presentes peridrolases incluem enzimas que compreendem o motivo de assinatura CE-7 e pelo menos 30%,

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37/105 preferencialmente pelo menos 33%, com mais preferência pelo menos 40%, ainda com mais preferência pelo menos 42%, ainda com mais preferência pelo menos 50%, ainda com mais preferência pelo menos 60%, ainda com mais preferência pelo menos 70%, ainda com mais preferência pelo menos 80%, ainda com mais preferência pelo menos 90%, e com a máxima preferência pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de aminoácidos com a SEQ ID NO: 1.

[0136] Alternativamente, uma sequência de aminoácidos contígua que compreende a região que engloba os motivos conservados também pode ser usada para identificar os membros da família CE-7.

[0137] Como usado na presente invenção, “degeneração de códon” refere-se à natureza do código genético que permite variação da sequência de nucleotídeos sem afetar a sequência de am inoácidos de um polipeptídeo codificado. Consequentemente, a presente invenção refere-se a qualquer molécula de ácido nucléico que codifica toda ou uma porção substancial das sequências de aminoácidos que codificam os presentes polipeptídeos microbianos. O técnico no assunto está bem informado sobre a “preferência de uso de códon” exibida por uma célula hospedeira específica, referente ao uso dos códons de nucleotídeos para especificar um dado aminoácido. Portanto, na síntese de um gene para melhorar a expressão em uma célula hospedeira, é desejável criar o gene, de modo que sua frequência de uso de códon se aproxime da frequência preferencial de uso de códon da célula hospedeira.

[0138] Como usado na presente invenção, o termo “códonotimizado” quando se refere a genes ou regiões codificadoras de moléculas de ácido nucléico para transformação de vários hospedeiros, refere-se à alteração de códons no gene ou regiões codificadoras das moléculas de ácido nucléico, para refletir o uso típico do códon do organismo hospedeiro, sem alterar o

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38/105 polipeptídeo codificado pelo DNA.

[0139] Como usado na presente invenção “genes sintéticos” podem ser uma montados a partir de blocos de construção de oligonucleotídeo que são quimicamente sintetizados usando procedimentos conhecidos por um técnico no assunto. Esses blocos de construção são ligados e anelados para formar segmentos de genes que são então montados enzimaticamente a fim de construir o gene inteiro. “Quimicamente sintetizado”, com relação a uma sequência de DNA, significa que os nucleotídeos componentes foram montados in vitro. A síntese química manual de DNA pode ser realizada usando-se procedimentos bem estabelecidos, ou pode ser realizada a síntese química automatizada, usando-se um dos diversos equipamentos comercialmente disponíveis. Consequentemente, os genes podem ser adaptados para a expressão gênica ideal, com base na otimização das sequências de nucleotídeos para que reflita a preferência de uso de códon da célula hospedeira. O técnico no assunto avalia a possibilidade de expressão gênica bem sucedida se o uso do códon é induzido para o uso desses códons preferenciais pelo hospedeiro. A determinação de códons preferidos pode estar baseada em uma análise de genes derivados da célula hospedeira quando a informação sobre a sequência está disponível.

[0140] Como usado na presente invenção, gene “refere-se” a uma molécula de ácido nucléico que expressa uma proteína específica, incluindo sequências reguladoras anteriores (sequências não codificadoras 5') e posteriores (sequências não codificadoras 3') à sequência codificadora. “Gene nativo” refere-se a um gene como encontrado na natureza, com suas próprias sequências reguladoras. “Gene quimérico” refere-se a qualquer gene não nativo, que compreende sequências reguladoras e codificadoras que não são encontradas juntas na natureza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender sequências reguladoras e sequências codificadoras derivadas de

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39/105 diferentes fontes, ou sequências reguladoras e sequências codificadoras derivadas da mesma fonte, mas organizadas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. “Gene endógeno refere-se a um gene nativo em sua localização natural no genoma de um organismo. Um gene “estranho” refere-se a um gene não encontrado normalmente no organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro por transferência gênica. Genes estranhos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo, ou genes quiméricos. Um “transgenia” é um gene que foi introduzido no genoma por um processo de transformação.

[0141] Como usado na presente invenção, “sequência codificadora” refere-se a uma sequência de DNA que codifica uma sequência específica de aminoácidos. “Sequências reguladoras adequadas” referem-se às sequências de nucleotídeos localizadas a montante (sequências não codificadoras 5'), dentro, ou a jusante (sequências não codificadoras 3') de uma sequência codificadora, e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade do RNA, ou tradução da sequência codificadora associada. Sequências reguladoras podem incluir promotores, sequências líder de tradução, sítio de processamento de RNA, sítio de ligação efetora e estrutura derivada da alça.

[0142] Como usado na presente invenção, “promotor” refere-se a uma sequência de DNA capaz de controlar a expressão de uma sequência codificadora de RNA ou funcional. Em geral, a sequência codificadora está localizada 3' de uma sequência promotora. Promotores podem ser derivados em sua totalidade de um gene nativo ou podem ser compostos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou até compreender segmentos sintéticos de DNA. Os técnicos no assunto entendem que diferentes promotores podem dirigir a expressão de um gene em diferentes estágios do desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições

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40/105 ambientais ou psicológicas. Promotores que induzem um gene a se expressar na maioria dos tipos celulares são comumente denominados “promotores constitutivos”. Sabe-se, ainda, que visto que em muitos casos os limites exatos das sequências reguladoras não foram completamente definidos, fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem ter atividade idêntica àquela do promotor.

[0143] Como usado na presente invenção, “sequências não codificadoras 3'”, refere-se às sequências de DNA localizadas a jusante de uma sequência codificadora e inclui sequências de reconhecimento de poliadenilação (normalmente limitadas aos eucariontes) e outras sequências que codificam sinais reguladores capazes de afetar o processamento do mRNA ou expressão gênica. O sinal de poliadenilação é usualmente caracterizado por afetar a adição de trechos de ácido poliadenílico (normalmente limitado aos eucariontes) à extremidade 3' do mRNA precursor.

[0144] Como usado na presente invenção, o termo “ligado de maneira funcional” refere-se à associação de sequências de ácido nucléico com uma única molécula de ácido nucléico, de modo que a função de uma seja afetada pelo outra. Por exemplo, um promotor está ligado de maneira funcional a uma sequência codificadora quando este é capaz de influenciar a expressão desta sequência codificadora, isto é, a sequência codificadora está sob o controle de transcrição do promotor. Sequências codificadoras podem estar ligadas de maneira funcional às sequências reguladoras na orientação sense ou antisense.

[0145] Como usado na presente invenção, o termo “expressão refere-se à transcrição e acúmulo estável de (mRNA) sense ou RNA antisense, derivados de um fragmento de ácido nucléico da invenção”. A expressão também pode se referir à tradução de RNAm para um polipeptídeo.

[0146] Como usado na presente invenção, “transformação”

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41/105 refere-se à transferência de uma molécula de ácido nucléico no genoma de um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Na presente invenção, o genoma da célula hospedeira inclui genes cromossômicos e extracromossômicos (por exemplo, plasmídios). Organismos hospedeiros que contêm as moléculas transformadas de ácido nucléico são chamados de organismos “transgênicos”, “recombinantes” ou “transformados”.

[0147] Como usado na presente invenção, os termos “plasmídio”, “vetor” e “cassete” referem-se a um elemento extracromossômico que frequentemente carrega genes que não são parte do metabolismo central da célula, e usualmente está sob a forma de moléculas de DNA de fita dupla circular. Esses elementos podem ser sequências de replicação autônomas, sequências de integração de genoma, sequências de nucleotídeos ou de fago, lineares ou circulares, de DNA ou RNA dupla fita ou simples, derivadas de qualquer fonte, em que várias sequências de nucleotídeos foram recombinadas ou unidas em uma única construção capaz de introduzir um fragmento promotor e uma sequência de DNA para um produto do gene selecionado, junto com a sequência não traduzida 3' apropriada em uma célula. “Cassete de transformação” refere-se a um vetor específico que contém um gene estranho e que possui elementos além do gene estranho, que facilita a transformação de uma célula hospedeira específica. “Cassete de expressão” refere-se a um vetor específico que contém um gene estranho e possui elementos, além do gene estranho, que permite aumentar a expressão desse gene em um hospedeiro estranho.

[0148] Como usado na presente invenção, o termo “programa de computação para análise de sequência” refere-se a qualquer algoritmo ou programa de computação útil para análise de sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos. O “programa de computação para análise de sequência” pode ser comercialmente disponível ou pode ser desenvolvido de forma

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42/105 independente. Programa de computação para análise de sequência típico inclui, mas não se limita ao conjunto de programas GCG (Pacote Wisconsin Versão 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), e DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA), CLUSTALW (por exemplo, versão 1.83; Thompson et al., Nucleic Acids Research, 22(22):4673-4680 (1994), e o programa FASTA que incorpora o algoritmo Smith-Waterman (W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Data do Encontro 1992, 111-20. Editores: Suhai, Sandor. Editor: Plenum, Nova York, NY), Vector NTI (Informax, Bethesda, MD) e Sequencher v. 4.05. Dentro do contexto desta aplicação, deve-se entender que onde os programas de análise de sequências forem utilizados para análise, os resultados das análises serão baseados nos “parâmetros básicos” do programa referido, a menos que especificado de outra forma. Como usado na presente invenção “parâmetros básicos” significa qualquer conjunto de valores ou parâmetros estabelecidos pelo fabricante do programa de computação, que originalmente é carregado no programa quando inicializado pela primeira vez.

[0149] Como usado na presente invenção, o termo “contaminantes biológicos” refere-se a uma ou mais entidades biológicas indesejadas e/ou patogênicas incluindo, mas não se limitando a microorganismos, esporos, vírus, príons e misturas dos mesmos. O processo produz uma concentração eficaz de pelo menos um ácido percarboxílico útil para reduzir e/ou eliminar a presença dos contaminantes biológicos viáveis. Em uma realização preferencial, o contaminante biológico é um micro-organismo patogênico viável.

[0150] Como usado na presente invenção, o temo “desinfetar” refere-se ao processo de destruição ou prevenção do crescimento de contaminantes biológicos. Como usado na presente invenção, o temo

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43/105 “desinfetante” refere-se a um agente que desinfeta pela destruição, neutralização ou inibição do crescimento de contaminantes biológicos. Tipicamente, desinfetantes são usados para tratar objetos ou superfícies inanimadas. Como usado na presente invenção, o termo “desinfecção” referese ao ato ou processo de desinfetar. Como usado na presente invenção, o termo “antisséptico” refere-se a um agente químico que inibe o crescimento de micro-organismos que transmitem doenças. Em um aspecto, os contaminantes biológicos são micro-organismos patogênicos.

[0151] Como usado na presente invenção, o termo “higiênico” significa ou refere-se à restauração ou preservação da saúde, tipicamente pela remoção, prevenção ou controle de um agente que pode ser prejudicial à saúde. Como usado na presente invenção, o termo “higienizar” significa tornar higiênico. Como usado na presente invenção, o termo “higienizar” refere-se a um agente higiênico. Como usado na presente invenção, o termo “higienização” refere-se ao ato ou processo de higienizar.

[0152] Como usado na presente invenção, o temo “virucida” refere-se a um agente que inibe ou destrói vírus, e é sinônimo de viricida. Um agente que exibe a capacidade de inibir ou destruir vírus é descrito como tendo atividade “virucida”. Perácidos podem ter atividade virucida. Virucidas alternativos típicos conhecidos na técnica que podem ser adequados para uso na presente invenção incluem, por exemplo, álcoois, éteres, clorofórmio, formaldeído, fenóis, beta propiolactona, iodo, cloro, sais de mercúrio, hidroxilamina, óxido de etileno, etilenoglicol, compostos quaternário de amônio, enzimas e detergentes.

[0153] Como usado na presente invenção, o termo “biocida” refere-se a um agente químico, tipicamente de amplo espectro, que inativa ou destrói micro-organismos. Um agente que exibe a capacidade de inativar ou destruir micro-organismos é descrito como tendo atividade “biocida”. Perácidos

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44/105 podem ter atividade biocida. Biocidas alternativos típicos conhecidos na técnica que podem ser adequados para uso na presente invenção incluem, por exemplo, cloro, dióxido de cloro, cloroisocianurteos, hipocloritos, ozônio, acroleína, aminas, fenólicos clorados, sais de cobre, compostos orgânicos de enxofre e sais de quaternário de amônio.

[0154] Como usado na presente invenção, a frase “concentração mínima de biocida” refere-se à concentração mínima de um agente biocida que, por um determinado período de contato, produzirá um efeito letal desejado, redução irreversível na população viável do micro-organismo alvo. A efetividade pode ser medida pela redução log10 dos micro-organismos viáveis após o tratamento. Em um aspecto, a redução alvo dos micro-organismos viáveis após o tratamento é uma redução de pelo menos 3-log, com mais preferência uma redução de pelo menos 4-log, e com a máxima preferência uma redução de pelo menos 5-log. Em outro aspecto, a concentração mínima de biocida é de pelo menos uma redução de 6-log nas células microbianas viáveis.

[0155] Como usado na presente invenção, os termos “fonte peroxigênio” e “fonte de peroxigênio” referem-se a compostos capazes de fornecer peróxido de hidrogênio a uma concentração de cerca de 1 mM ou mais, quando em uma solução aquosa incluindo, mas não se limitando a, peróxido de hidrogênio, adutores de peróxido de hidrogênio (por exemplo, adutores de peróxido de hidrogênio-uréia (peróxido de carbamida)), perboratos e percarbonatos. Como descrito na presente invenção, a concentração do peróxido de hidrogênio fornecida pelo composto de peroxigênio na formulação de reação aquosa é inicialmente pelo menos 1mM ou mais mediante combinação dos componentes de reação. Em uma realização, a concentração de peróxido de hidrogênio na formulação de reação aquosa é de pelo menos 10 mM. Em outra realização, a concentração de peróxido de hidrogênio na

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45/105 formulação de reação aquosa é de pelo menos 100 mM. Em outra realização, a concentração de peróxido de hidrogênio na formulação de reação aquosa é de pelo menos 200 mM. Em outra realização, a concentração de peróxido de hidrogênio na formulação de reação aquosa é de 500 mM ou mais. Em ainda outra realização, a concentração de peróxido de hidrogênio na formulação de reação aquosa é de 1000 mM ou mais. A razão molar do peróxido de hidrogênio para o substrato de enzima, por exemplo, triglicerídeo, (substrato H2O2) na formulação de reação aquosa pode ser de cerca de 0,002 a 20, preferencialmente cerca de 0,1 a 10, e com a máxima preferência cerca de 0,5 a 5.

[0156] Por “oligossacarídeo” entende-se compostos contendo entre 2 e pelo menos 24 unidades de monossacarídeos unidas por ligações glicosídicas. O termo “monossacarídeo” refere-se a um composto de fórmula empírica (CH2O)n, onde n>3, o esqueleto de carbono não é ramificado, cada átomo de carbono, exceto um deles, contém um grupo hidroxila, o átomo de carbono restante é um aldeído ou cetona no átomo de carbono 2. O termo “monossacarídeo” também se refere a formas cíclicas hemiacetais ou hemicetais intracelulares.

[0157] Como usado na presente invenção, o termo “excipiente” refere-se a uma substância inativa usada para estabilizar o ingrediente ativo em uma formulação, como estabilidade de armazenamento do ingrediente ativo. Excipientes são também algumas vezes usados para aumentar a massa das formulações que contêm os ingredientes ativos. Conforme descrito na presente invenção, o “ingrediente ativo” é um enzima catalisadora. Em uma realização, o ingrediente ativo é de pelo menos uma esterase de carboidrato CE-7 que tem atividade de peridrolase.

[0158] Como usado na presente invenção, o termo “excipiente de oligossacarídeo” significa um oligossacarídeo, que quando adicionado a uma

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46/105 solução aquosa de enzima, aprimora a recuperação/retenção da enzima ativa (isto é, atividade de peridrolase) após secagem por atomização e/ou aprimora a estabilidade de armazenamento do pó de enzima resultante seco por atomização ou de uma formulação de pó de enzima e um éster de ácido carboxílico. Em uma realização, a adição do excipiente de olissacarídeo antes da secagem por atomização aprimora a estabilidade de armazenamento da enzima quando armazenada no éster de ácido carboxílico (isto é, uma mistura de armazenamento substancialmente isenta de água). O éster de ácido carboxílico pode conter uma concentração muito baixa de água, por exemplo, a triacetina tem tipicamente entre 180 ppm e 300 ppm de água. Como usado na presente invenção, a frase “substancialmente isenta de água” refere-se a uma concentração de água em uma mistura do pó de enzima e do éster de ácido carboxílico que não afeta adversamente a estabilidade de armazenamento do pó de enzima, quando presente no éster de ácido carboxílico. Em uma realização adicional, “substancialmente isenta de água” pode significar menos que 2000 ppm, preferencialmente menos que 1000 ppm, com mais preferência menos que 500 ppm, e ainda com mais preferência menos que 250 ppm de água na formulação que compreende o pó de enzima e o éster de ácido carboxílico.

PÓ De Enzima [0159] Um aspecto é para um pó de enzima pó que compreende uma formulação com pelo menos uma enzima estruturalmente classificada como enzima CE-7 que tem atividade de peridrolase, pelo menos um excipiente, e opcionalmente pelo menos um tensoativo. Em uma realização, o pó de enzima é formado por secagem por atomização. Em algumas realizações, pelo menos um excipiente é um excipiente de oligossacarídeo tem um peso molecular médio numérico de pelo menos cerca de 1250 e um peso molecular médio ponderal de pelo menos cerca de 9000.

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47/105 [0160] Pelo menos uma enzima pode ser qualquer uma das esterases de carboidrato CE-7 descritas na presente invenção, ou pode ser qualquer uma das esterases de carboidrato CE-7 descritas nos pedidos publicados de patente US de propriedade comum e co-pendente 2008/0176299 e 2009/0005590 (cada um integralmente incorporado a presente invenção como referência). Em algumas realizações, pelo menos uma enzima é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24 e 25.

[0161] Pelo menos uma enzima está presente na formulação seca por atomização em uma quantidade na faixa de cerca de 5%, em peso, a cerca de 75%, em peso, com base no peso seco da formulação seca por atomização. Uma faixa preferencial de % de enzima, em peso, na formulação seca por atomização é de cerca de 10%, em peso, a 50%, em peso, e uma ou mais faixas preferenciais de % de enzima, em peso, na formulação seca por atomização é de cerca de 20%, em peso, a 33%, em peso.

[0162] A formulação seca por atomização compreende, ainda, pelo menos um excipiente de oligossacarídeo. Em algumas realizações, pelo menos um excipiente de oligossacarídeo tem um peso molecular médio numérico de pelo menos cerca de 1250 e um peso molecular médio ponderal de pelo menos cerca de 9000. Em algumas realizações, o excipiente de oligossacarídeo tem um peso molecular médio numérico de pelo menos cerca de 1700 e um peso molecular médio ponderal de pelo menos cerca de 15000. Oligossacarídeos úteis específicos na presente invenção incluem, mas não se limitam a, maltodextrina, xilana, manana, fucoidana, galactomanana, quitosana, rafinose, estaquiose, pectina, inulina, levan, graminana e amilopectina, sacarose, lactulose, lactose, maltose, trealose, celobiose, nigerotriose, maltotriose, melezitose, maltotrialose, rafinose, cestose, e misturas dos mesmos. Excipientes à base de oligossacarídeos úteis na presente invenção

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48/105 incluem, mas não se limitam a, éteres de celulose não iônica solúvel em água, como hidroximetil-celulose e hidroxopropil metilcelulose, e misturas dos mesmos.

[0163] O excipiente está presente na formulação em uma quantidade na faixa de cerca de 95%, em peso, a cerca de 25%, em peso, com base no peso seco da formulação seca por atomização. Uma faixa preferencial de % de excipiente, em peso, na formulação seca por atomização é de cerca de 90%, em peso, a 50%, em peso, e uma ou mais faixas preferenciais de % de excipiente, em peso, na formulação seca por atomização é de cerca de 80%, em peso, a 67%, em peso.

[0164] Em algumas realizações, a formulação compreende, ainda, pelo menos um tensoativo. Tensoativos úteis incluem, mas não se limitam a, tensoativos iônicos e não iônicos ou agentes de umedecimento como, óleo de rícino etoxilado, glicerídeos poliglicolizados, monoglicerídeos acetilados, ésteres de ácido graxo sorbitan, poloxameros, ésteres de ácido graxo polioxietileno sorbitan, derivados de polioxietileno, monoglicerídeos ou etoxilados derivados dos mesmos, diglicerídeos ou polioxietileno derivados dos mesmos, docusato de sódio, lauril sulfato de sódio, ácido cólico ou derivados do mesmo, lecitinas, fosfolipídios, copolímeros em bloco de etileno glicol e propileno glicol, e organosilicones não iônicos. Preferencialmente, o tensoativo é um éster de ácido graxo polioxietileno sorbitan, com polisorbato 80 sendo mais preferencial.

[0165] Quando faz parte da formulação, o tensoativo está presente em uma quantidade na faixa de cerca de 5%, em peso, a 0,1%, em peso, com base no peso da proteína presente na formulação seca por atomização, preferencialmente de cerca 2%, em peso, a 0,5%, em peso, com base no peso da proteína presente na formulação seca por atomização.

[0166] A formulação seca por atomização pode compreender

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49/105 adicionalmente um ou mais tampões (como sais de bicarbonato de sódio e/ou de potássio, citrato, acetato, fosfato, pirofosfato, metilfosfonato, succinato, malato, fumarato, tartarato ou maleato), e um estabilizador enzimático (por exemplo, ácido etilenodiamina tetra-acético, ácido (1hidroxietillideno)bisfosfônico).

[0167] A secagem por atomização da formulação de pelo menos uma enzima, pelo menos um excipiente de oligossacarídeo e, opcionalmente pelo menos um tensoativo é realizada, por exemplo, conforme descrito em geral em Spray Drying Handbook, 5^a ed., K. Masters, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1991), e nas publicações WO 97/41833 (1997) e WO 96/32149 (1996) para Platz, R., et al.

[0168] A secagem por atomização, em geral, consiste em reunir um líquido altamente disperso e um volume suficiente de ar quente para produzir evaporação e secagem das gotículas de líquido. Tipicamente a alimentação é pulverizada em uma corrente de ar quente filtrado que evapora o solvente e transporta o produto seco para um coletor. O ar gasto é, então, esgotado com o solvente. Os técnicos no assunto irão apreciar diversos tipos diferentes de aparelho que podem ser usados para fornecer o produto desejado. Por exemplo, secadores por atomização comerciais fabricados por Buchi Ltd. (Postfach, Switzerland) ou GEA Niro Corp. (Copenhagen, Denmark) efetivamente produzirão partículas do tamanho desejado. Será ainda apreciado que estes secadores por atomização, e especificamente os seus atomizadores, podem ser modificados ou personalizados para aplicações especializadas, como a atomização simultânea de duas soluções utilizando uma técnica de bocal duplo. Mais especificamente, uma emulsão de água em óleo pode ser atomizada a partir de um bocal, e uma solução contendo um antiaderente, como o manitol, pode ser co-atomizada a partir de um segundo bocal. Em outros casos pode ser desejável empurrar a solução de alimentação através

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50/105 um bico projetado, usando-se uma bomba de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). Contanto que as microestruturas que compreendem a morfologia correta e/ou a composição sejam produzidas, a escolha do aparelho não é essencial e deve ser aparente para o técnico no assunto, levando-se em conta os ensinamentos na presente invenção.

[0169] A temperatura de entrada e de saída do gás usado para secar o material atomizado é tal que não provoque a degradação da enzima no material atomizado. Essas temperaturas são tipicamente determinadas experimentalmente, embora geralmente, a temperatura de saída ficará na faixa de cerca de 50°C a cerca de 225°C, enquanto a temperatura de saída ficará na faixa de cerca de 30°C a cerca de 150°C. Parâmetros preferenciais incluem pressões de atomização na faixa de cerca de 20-150 psi (0,14 MPa - 1,03 MPa), e de preferência de cerca de 30-40 a 100 psi (0,21-0,28 MPa a 0,69 MPa). Tipicamente, a pressão de atomização empregada será uma das seguintes (MPa) 0,14, 0,21, 0,28, 0,34, 0,41, 0,48, 0,55, 0,62, 0,69, 0,76, 0,83 ou acima.

[0170] O pó de enzima ou a formulação do pó de enzima em éster de ácido carboxílico substancialmente mantém a sua atividade enzimática por um período prolongado de tempo, quando armazenada em temperatura ambiente. O pó de enzima ou a formulação do pó de enzima seco por atomização em éster de ácido carboxílico substancialmente mantém a sua atividade enzimática em temperaturas elevadas por um curto período de tempo. Em uma realização, “substancialmente mantém a sua atividade enzimática” significa que o pó de enzima seco por atomização ou uma formulação de pó de enzima seco por atomização em éster de ácido carboxílico mantém pelo menos cerca de 75 por cento da atividade enzimática do pó de enzima seco por atomização após um período de armazenamento prolongado em temperatura ambiente e/ou após um curto período de armazenamento a

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51/105 uma temperatura elevada (acima da temperatura ambiente) em uma formulação que compreendida por um éster de ácido carboxílico e do pó de enzima, em comparação à atividade inicial da enzima do pó de enzima antes da preparação de uma formulação compreendida por éster de ácido carboxílico e o pó de enzima. O período de armazenamento prolongado é um período de tempo de cerca de um ano a cerca de dois anos à temperatura ambiente. Em uma realização, o curto período de armazenamento é em uma temperatura elevada por um período de tempo a partir de quando a formulação compreendida por um éster do ácido carboxílico e pó de enzima é produzida a 40°C por cerca de oito semanas a 40°C. Em outra realização, a temperatura elevada está na faixa de cerca de 30°C a cerca de 52 °C. Em uma realização preferencial, a temperatura elevada está na faixa de cerca de cerca de 30°C a cerca de 40°C.

[0171] Em algumas realizações, o pó de enzima seco por atomização tem pelo menos 75 por cento da atividade enzimática de pelo menos uma enzima, após oito semanas de armazenamento a 40°C em uma formulação compreendida por um éster de ácido carboxílico e o pó de enzima, em comparação à atividade enzimática inicial do pó de enzima antes da preparação de uma formulação compreendida por éster de ácido carboxílico e o pó de enzima a 40°C. Em outras realizações, o pó de enzima tem pelo menos 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 por cento da atividade enzimática de pelo menos uma enzima, após oito semanas de armazenamento a 40°C em uma formulação compreendida por um éster de ácido carboxílico e o pó de enzima, em comparação à atividade enzimática inicial do pó de enzima antes da preparação de uma formulação compreendida por éster de ácido carboxílico e o pó de enzima a 40°C. Preferencialmente, a atividade de peridrolases é medida conforme descrito no nos Exemplos 8 a 13, abaixo, mas qualquer

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52/105 método para medir a atividade de peridrolases pode ser usado na prática da presente invenção.

[0172] Em algumas realizações, o aprimoramento adicional na atividade enzimática além dos períodos de tempo determinados pode ser alcançado pela adição de um tampão com uma capacidade de tamponamento na faixa de pH de cerca de 5,5 a cerca de 9,5 na formulação compreendida por éster de ácido carboxílico e o pó de enzima seca por atomização. Tampões adequados para uso na formulação podem incluir, mas não se limitam a, sal de sódio, sal de potássio, ou misturas de sais de bicarbonato de sódio ou de potássio, pirofosfato, fosfato, metilfosfonato, citrato, acetato, malato, fumarato, maleato de tartarato ou succinato. Tampões preferenciais para uso na formulação compreendidos por éster de ácido carboxílico e pó de enzima seco por atomização incluem o sal de sódio, sal de potássio, ou misturas de sais bicarbonato de sódio ou de potássio, fosfato, metilfosfonato ou citrato.

[0173] Em realizações onde um tampão está presente no éster de ácido carboxílico e na formulação do pó de enzima, o tampão pode estar presente em uma quantidade na faixa de cerca de 0,01%, em peso, a cerca de 50%, em peso, com base no peso de éster de ácido carboxílico na formulação compreendida por ésteres de ácidos carboxílico e pó de enzima. O tampão pode estar presente em uma faixa mais preferencial de cerca de 0,10% a cerca de 10%, com base no peso de éster de ácido carboxílico na formulação compreendida por ésteres de ácido carboxílico e pó de enzima. Além disso, nestas realizações, a comparação entre as atividades de peridrolase da enzima é determinada entre (a) um pó de enzima que mantém pelo menos 75 por cento da atividade de peridrolase da enzima de pelo menos uma enzima, após oito semanas de armazenamento a 40°C em um formulação compreendida por éster de ácido carboxílico, um tampão com uma capacidade de tamponamento na faixa de pH de cerca de 5,5 a cerca de 9,5, e o pó de enzima e (b) a

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53/105 atividade de peridrolase inicial do pó de enzima antes da preparação de uma formulação compreendida por éster de ácido carboxílico, o tampão com uma capacidade de tamponamento na faixa de pH de cerca de 5,5 a cerca de 9,5, e o pó de enzima.

[0174] Pretende-se que o pó da enzima seja armazenado como uma formulação no composto orgânico que é um substrato para pelo menos uma enzima, como triacetina. Na ausência de peróxido de hidrogênio adicionado, a triacetina normalmente é hidrolisada em solução aquosa por uma esterase de carboidrato CE-7 para produzir diacetina e ácido acético, e a produção de ácido acético resulta em uma diminuição do pH da mistura de reação. Um dos requisitos para a estabilidade de armazenamento de longo prazo da enzima em triacetina é que não haja reação significativa da triacetina com qualquer quantidade de água que possa estar presente na triacetina, a especificação para o teor de água em uma triacetina comercial (fornecida pelo Tessenderlo Group, em Bruxelas, Bélgica) é de 0,03%, em peso, de água (300 ppm). Qualquer hidrólise da triacetina que ocorre durante o armazenamento da enzima em triacetina produziria ácido acético, o que poderia resultar em uma diminuição da atividade ou inativação da atividade de peridrolase da esterase de carboidrato CE-7, a atividade de peridrolase da esterase de carboidrato CE-7 é tipicamente inativada a um pH igual ou inferior a 5,0 (consulte pedido de patente US 12/539. 025 para DiCosimo, R., et al.). O excipiente de oligossacarídeo selecionado para uso na presente invenção deve fornecer estabilidade da enzima no substrato orgânico para a enzima mediante condições onde o ácido acético é gerado devido à presença de baixas concentrações de água na formulação.

Condições Adequadas de Reação para a Preparação de Perácidos Catalisada por Enzima a Partir de Ésteres de ácido Carboxílico e Peróxido de Hidrogênio [0175] Em um aspecto da invenção, é fornecido um processo

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54/105 para produzir uma formulação aquosa que compreende um perácido pela reação de um ou mais ésteres de ácido carboxílico com a fonte de peroxigênio (peróxido de hidrogênio, perborato de sódio ou percarbonato de sódio) na presença de uma enzima catalisadora que tem atividade de peridrolase. Em uma realização, a enzima catalisadora compreende pelo menos uma enzima que tem atividade de peridrolase, sendo que a dita enzima é estruturalmente classificada como um membro da família esterase de carboidrato CE-7 (CE-7; consulte Coutinho, P.M., Henrissat, B., acima). Em outra realização, o catalisador de peridrolase é estruturalmente classificado como uma cefalosporina C desacetilase. Em outra realização, o catalisador de peridrolase é estruturalmente classificado como uma acetil xilana esterase.

[0176] Em uma realização, o catalisador de peridrolase compreende uma enzima que tem atividade de peridrolase e um motivo de assinatura que compreende:

a) um motivo RGQ como resíduos de aminoácidos 118 a 120;

b) um motivo GXSQG como resíduos de aminoácidos 179 a 183;e

c) um motivo HE como resíduos de aminoácidos 298 a 299 quando alinhado à sequência de referência SEQ ID NO:1 usando-se CLUSTALW.

[0177] Em uma realização adicional, o motivo de assinatura adicional compreende um quarto motivo conservado, definido como um motivo LXD nos resíduos de aminoácidos 267 a 269, quando alinhado à sequência de referência SEQ ID NO:1 usando-se CLUSTALW.

[0178] Em outra realização, o catalisador de peridrolase compreende uma enzima que tem o presente motivo de assinatura e pelo menos 30% dos aminoácidos para a SEQ ID NO:1.

[0179] Em outras realizações, o catalisador de peridrolase

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55/105 compreende uma enzima que tem atividade de peridrolase selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21,22, 23, 24 e 25.

[0180] Em outra realização, o catalisador de peridrolase compreende uma enzima que tem pelo menos 40% de identidade de aminoácidos com um motivo de assinatura definido como SEQ ID NO: 18, sendo que os motivos conservados descritos acima (isto é, RGQ, GXSQG, e HE, e opcionalmente, LXD) são conservados.

[0181] Em outra realizações, o catalisador de peridrolase compreende uma enzima que tem um aminoácido selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, 22, 23, 24 e 25, sendo que a dita enzima pode ter uma ou mais adições, deleções ou substituições enquanto o motivo de assinatura é conservado e a atividade de peridrolase é mantida.

[0182] Substratos de éster de ácido carboxílico adequados podem incluir ésteres fornecidos pela fórmula a seguir:

[X]mR5 em que X = um grupo éster da fórmula R6C(O)O;

R6 = a um componente hidrocarbil C1 a C7 linear, ramificado ou cíclico, opcionalmente substituído por grupos hidroxila ou grupos alcoxi C1 a C4, sendo que R6 opcionalmente compreende uma ou mais ligações de éter para R6 = C2 a C7;

R5 = a um componente hidrocarbil C1 a C6 linear, ramificado ou cíclico, opcionalmente substituído por grupos hidroxila, sendo que cada átomo de carbono em R5 compreende individualmente não mais que um grupo hidroxila ou não mais que um grupo éster; sendo que R5 opcionalmente compreende uma ou mais ligações de éter;

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56/105 m=1 para o número de átomos de carbono em R5; e sendo que os ditos ésteres têm solubilidade em água de pelo menos 5 ppm a 25 °C.

[0183] Em outras realizações, substratos adequados também podem incluir ésteres da fórmula:

O

R1 C O R2 em que Ri = a um alquil C1 a C7 de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituído por hidroxila ou por um grupo alcoxi C1 a C4 e R2 = a um alquil, alquenil, alquinil, aril, alquilaril, alquilheteroaril, heteroaril C1 a C10 de cadeia reta ou ramificada alquil, alquenil, alquinil, aril, alquilaril, alquilheteroaril, heteroaril, (CH2CH2O)n, ou (CH2CH(CH3)-O)nH e n = 1 a 10.

[0184] Em outras realizações, substratos de éster de ácido carboxílico adequados podem incluir glicerídeos da fórmula:

O

R1---C---O---CH2---CH---CH2---OR4

OR3 em que R1 = a um alquil C1 a C7 de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituído por uma hidroxila ou um grupo alcoxi C1 a C4 e R3 e R4 são individualmente H ou R1C(O).

[0185] Em outras realizações, R6 é um componente hidrocarbil linear C1 a C7 linear, opcionalmente substituído por grupos hidroxila ou grupos alcóxi C1 a C4, opcionalmente compreendendo uma ou mais ligações éter. Em outras realizações preferenciais preferidas, R6 é um componente hidrocarbil linear, opcionalmente substituído por grupos hidroxila, e/ou, opcionalmente

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57/105 compreendendo uma ou mais ligações éter.

[0186] Em outras realizações, substratos de ésteres de ácido carboxílico adequados também podem incluir sacarídeos acetilados selecionados do grupo que consiste em mono, diacetilados, e polissacarídeos. Em realizações preferenciais, os sacarídeos acetilados incluem monoacetilados, diacetilados e polissacarídeos. Em outras realizações, os sacarídeos acetilados são selecionados do grupo que consiste em xilana acetilada, fragmentos de xilana acetilada, xilose acetilada (como tetra-acetato de xilose), glicose acetilada (como penta-acetato glicose), p-D-ribofuranose-1, 2,3,5-tetra-acetato, tri-O-acetil-D-galactal, tri-O-acetil-D-glucal e celulose acetilada. Em realizações preferenciais, o sacarídeo acetilado é selecionado do grupo que consiste em p-D-ribofuranose-1,2,3,5-tetra-acetato, tri-O-acetil-Dgalactal, tri-O-acetil-D-glucal e celulose acetilada. Assim, os carboidratos acetilados podem ser substratos adequados para a geração de ácidos percarboxílicos usando-se os métodos e sistemas atuais (isto é, na presença de uma fonte de peroxigênio).

[0187] Em realizações adicionais, o substrato de éster de ácido carboxílico pode ser monoacetina, triacetina, monopropionina, dipropionina, tripropionina, monobutirina, dibutirina, tributirina, penta-acetato de glicose, xilana acetilada, tetra-acetato de xilose, fragmentos de xilana acetilada; β-Dribofuranose-1, 2, 3,5-tetra-acetato, tri-O-acetil-D-galactal, tri-O-acetil-glucal, diacetato de propilenoglicol, diacetato de etilenoglicol, monoésteres ou diésteres de 1,2-etanodiol, 1,2-propanodiol, 1, 3 propanodiol, 1,2-butanodiol, 1,3-butanodiol, 2,3-butanodiol, 1,4-butanodiol, 1,2-pentanodiol, 2,5-pentanodiol, 1,6-pentanodiol, 1,2-hexanodiol, 2,5-hexanodiol, 1,6-hexanodiol, e misturas dos mesmos. Em realizações preferenciais dos presentes métodos e sistemas, o substrato compreende triacetina.

[0188] O éster de ácido carboxílico está presente na formulação

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58/105 de reação em uma concentração suficiente para produzir a concentração desejada de perácido mediante peridrólise catalisada por enzima. O éster de ácido carboxílico não precisa ser completamente solúvel na formulação de reação, mas ter solubilidade suficiente para permitir a conversão do éster pelo catalisador de peridrolase para o perácido correspondente. O éster de ácido carboxílico está presente na formulação de reação a uma concentração de 0,05%, em peso, a 40%, em peso, da formulação de reação, de preferência em uma concentração de 0,1%, em peso, a 20%, em peso, da formulação de reação, e com mais preferência em uma concentração de 0,5%, em peso, a 10%, em peso, da formulação de reação.

[0189] A fonte de peroxigênio pode incluir, mas não se limita a, peróxido de hidrogênio, adutores de peróxido de hidrogênio (por exemplo, aduto de peróxido de uréia-hidrogênio (peróxido de carbamida)) sais de perborato e sais de percarbonato. A concentração de compostos de peroxigênio na formulação de reação estar na faixa de 0,0033%, em peso, a cerca de 50%, em peso, de preferência de 0,033%, em peso, a cerca de 40%, em peso, com mais preferência de 0,33%, em peso, a cerca de 30%, em peso.

[0190] Muitos catalisadores de peridrolase (células inteiras, células inteiras permeabilizadas, e extratos parcialmente purificados de células inteiras) foram relatados para ter a atividade da catalase (EC 1.11.1.6). Catalases catalisam a conversão de peróxido de hidrogênio em oxigênio e água. Em um aspecto, o catalisador de peridrólise carece de atividade de catalase. Em outro aspecto, um inibidor de catalase é adicionado à formulação de reação. Exemplos de inibidores da catalase incluem, mas não se limitam a, azida de sódio e sulfato de hidroxilamina. Um técnico no assunto pode ajustar a concentração de inibidor de catalase, conforme necessário. A concentração do inibidor de catalase geralmente está na faixa de 0,1 mm a cerca de 1 M, de preferência cerca de 1 mm a cerca de 50 mm, com mais preferência de cerca

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59/105 de 1 mm a cerca de 20 mm. Em um aspecto, a concentração de azida de sódio tipicamente está na faixa de cerca de 20 mm a 60 mm, enquanto a concentração de sulfato de hidroxilamina é tipicamente cerca de 0,5 mm a 30 mm, de preferência cerca de 10 mm.

[0191] Em outra realização, o catalisador da enzima não tem atividade de catalase significativa ou é projetado para diminuir ou eliminar a atividade da catalase. A atividade da catalase em células hospedeiras podem ser infrarregulada ou eliminados pelo rompimento da expressão do(s) gene(s) responsável(is) pela atividade da catalase usando-se técnicas bem conhecidas, incluindo mas não se limitando a, mutagênese transposon, expressão do RNA antisense, mutagênese alvo e mutagênese aleatória. Em uma realização preferencial, o(s) gene(s) que codifica(m) a atividade da catalase endógena é(são) infrarregulado(s) ou rompido(s) (ou seja, knocked-out). Como usado na presente invenção um gene “rompido” é aquele onde a atividade e/ou a função da proteína codificada pelo gene modificado não está mais presente. Meios para romper um gene são conhecidos na técnica e podem incluir, mas não se limitam a, inserções, deleções ou mutações no gene, desde que a atividade e/ou função da proteína correspondente não esteja mais presente. Em ainda uma realização mais preferencial, o hospedeiro de produção é um hospedeiro de produção E. coli que compreende um gene da catalase rompido selecionado do grupo que consiste em katG e KatE (consulte pedido de patente publicada PCT 20080176299). Em outra realização, o hospedeiro de produção é uma linhagam de E. coli que compreende uma infrarregulação e/ou rompimento em ambos os genes da catalase, katg1 e katE.

[0192] A concentração do catalisador na formulação de reação aquosa depende da atividade catalítica específica do catalisador, e é escolhida para obter a taxa desejada de reação. O peso do catalisador em reações de peridrólise geralmente está na faixa de 0,0001 mg a 10 mg por ml de volume

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60/105 total de reação, de preferência de 0,001 mg a 2,0 mg por ml. O catalisador de peridrolase também pode ser imobilizado em um suporte solúvel ou insolúvel usando-se métodos conhecidos pelos técnicos no assunto, consulte, por exemplo, Immobilization of Enzymes and Cells; Gordon F. Bickerstaff, Editora; Humana Press, Totowa, NJ, USA; 1997. O uso de catalisador imobilizado permite a recuperação e reuso do catalisador em reações subsequentes. O catalisador enzimático pode estar sob forma de células microbianas inteiras, células microbianas permeabilizadas, extratos de células microbianas, enzimas parcialmente purificadas ou purificadas e misturas dos mesmos.

[0193] Em um aspecto, a concentração de perácido gerada pela combinação da peridrólise química e peridrólise enzimática do éster de ácido carboxílico é suficiente para fornecer uma concentração efetiva para o alvejamento ou desinfecção em um pH desejado. Em outro aspecto, os presentes métodos fornecem combinações de enzimas e substratos de enzimas para produzir a concentração efetiva desejada de perácido, onde, na ausência de enzima adicionada, há uma concentração significativamente menor de perácido produzido. Embora, em alguns casos, a peridrólise do substrato da enzima possa ser substancialmente química pela reação química direta de peróxido inorgânico com o substrato da enzima, pode não haver uma concentração suficiente de perácidos gerados para fornecer uma concentração efetiva de perácido nas aplicações desejadas, e um aumento significativo na concentração de perácido total é obtido pela adição de um catalisador de peridrolase adequado para a formulação de reação.

[0194] A concentração de perácido gerado (como ácido peracético) pelo peridrólise de pelo menos um éster de ácido carboxílico é, pelo menos, cerca de 20 ppm, de preferência pelo menos 100 ppm, com mais preferência pelo menos cerca de 200 ppm de perácido, com mais preferência pelo menos 300 ppm, com mais preferência pelo menos 500 ppm, com mais

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61/105 preferência pelo menos 700 ppm, com mais preferência pelo menos 1000 ppm de perácido, com mais preferência pelo menos 2000 ppm de perácido em 10 minutos, de preferência em 5 minutos, com mais preferência pelo menos em 1 minuto após o início da reação de peridrólise. A formulação dos produtos que compreendem o perácido pode ser opcionalmente diluída com água ou uma solução predominantemente composta de água, para produzir uma formulação com a menor concentração desejada de perácido. Em um aspecto, o tempo de reação necessário para produzir a concentração desejada de perácido não é mais do que cerca de duas horas, de preferência não mais que cerca de 30 minutos, com mais preferência não mais que cerca de 10 minutos, e com a máxima preferência em cerca de 5 minutos ou menos. Em outros aspectos, uma superfície dura ou objeto inanimado contaminado com um contaminante biológico é colocada em contato com o perácido formado de acordo com os processos descritos na presente invenção, por cerca de 5 minutos a cerca de 168 horas de combinação dos ditos componentes de reação, ou em cerca de 5 minutos a 48 horas, ou em cerca de 5 minutos a 2 horas de combinação dos ditos componentes de reação, ou qualquer um desses intervalos de tempo.

[0195] Em outro aspecto, o ácido peroxicarboxílico formado de acordo com os processos descritos na presente invenção em uma aplicação de tratamento de roupas na qual o ácido peroxicarboxílico é colocado em contato com pelo menos um artigo de vestuário ou têxteis para fornecer um benefício, como a desinfecção, alvejamento, descoloração, higienização, desodorização ou uma combinação destes. O ácido peroxicarboxílico pode ser usado em uma variedade de produtos para tratamento de roupas incluindo, mas não se limitando a, tratamentos têxteis de pré-lavagem, detergentes para lavagem de roupas, removedores de manchas, composições para alvejamento, composições de desodorização e agentes de enxágue. Em uma realização, o presente processo para produzir um ácido peroxicarboxílico para uma

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62/105 superfície alvo é realizado in situ.

[0196] No contexto de aplicações de tratamento de roupas, o termo “colocar um artigo de vestuário ou têxtil em contato com” significa que o artigo de vestuário ou têxtil é exposto a uma formulação divulgada na presente invenção. Para este fim, há uma série de formatos de formulação que podem ser usados para tratar tecido incluindo, mas não se limitando a, líquidos, sólidos, gel, pasta, barras, comprimidos, pulverizadores, espuma, pó, ou granulados, e podem ser aplicados via dosagem manual, dosagem única, dosagem a partir de um substrato, dosagem pulverizada ou automática, a partir de uma máquina de lavar roupas ou secadora. Composições granulares também podem estar sob a forma compacta, composições líquidas também podem estar sob a forma concentrada.

[0197] Quando as formulações divulgadas na presente invenção são usadas em uma máquina de lavar, a formulação pode ainda conter elementos típicos de detergentes para lavagem de roupas. Por exemplo, componentes típicos incluem, mas não se limitam a, tensoativos, agentes de alvejamento, ativadores de alvejamento, enzimas adicionais, supressores de espuma, dispersantes, dispersantes de cal-sabão, suspensão de sujeiras e agentes anti-redeposição, agentes emolientes, inibidores de corrosão, inibidores de manchas, germicidas, agentes de ajustamento do pH, fontes de alcalinidade não-builder, agentes quelantes, preenchimentos orgânicos e/ou inorgânicas, solventes, hidrótropos, alvejantes ópticos, corantes e perfumes.

[0198] As formulações divulgadas na presente invenção também podem ser usadas como aditivo em detergentes sob a forma sólida ou líquida. Esses produtos aditivos são destinados a completar ou melhorar o desempenho de composições detergentes convencionais e podem ser adicionados em qualquer fase do processo de limpeza.

[0199] Junto com os sistemas e métodos atuais para tratamento

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63/105 de roupas onde o perácido é gerado para um ou mais dos alvejantes, remoção de manchas e redução de odores, a concentração de perácido gerada (por exemplo, ácido peracético) pela peridrólise de pelo menos um éster de ácido carboxílico podem ser de pelo menos cerca de 2 ppm, de preferência pelo menos 20 ppm, de preferência pelo menos 100 ppm, e com mais preferência pelo menos cerca de 200 ppm perácido. Junto com os sistemas e métodos atuais para tratamento de roupas onde o perácido é gerado para desinfecção ou sanitização, a concentração de perácido gerada (por exemplo, ácido peracético) pela peridrólise de pelo menos um éster de ácido carboxílico pode ser pelo menos cerca de 2 ppm, com mais preferência pelo menos 20 ppm, com mais preferência pelo menos 200 ppm, com mais preferência pelo menos 500 ppm, com mais preferência pelo menos 700 ppm, com mais preferência pelo menos cerca de 1000 ppm de perácido, com a máxima preferência pelo menos 2000 ppm de perácido em 10 minutos, de preferência em 5 minutos, e com a máxima preferência em um minuto após o início da reação de peridrólise. A mistura de produto que compõe o perácido pode ser opcionalmente diluída com água ou com uma solução predominantemente composta de água, para produzir uma mistura com a menor concentração desejada de perácido. Em um aspecto dos métodos e sistemas atuais, o tempo de reação necessário para produzir a concentração desejada de perácido não é maior do que cerca de duas horas, de preferência não mais que cerca de 30 minutos, com mais preferência não mais que cerca de 10 minutos, ainda com mais preferência não mais que cerca de 5 minutos, e com a máxima preferência em cerca de 1 minuto ou menos.

[0200] A temperatura da reação é escolhida para controlar tanto a taxa de reação como a estabilidade da atividade catalítica da enzima. A temperatura da reação pode variar desde o ponto logo acima do ponto de congelamento da formulação de reação (aproximadamente 0°C) até cerca de

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95°C, com uma faixa preferencial de temperatura de reação de cerca de 5°C a cerca de 55°C.

[0201] O pH da formulação de reação final contendo perácido é de cerca 2 a cerca de 9, preferencialmente de cerca de 3 a cerca de 8, com mais preferência de cerca de 5 a cerca de 8, até mais preferencialmente de cerca de 5,5 a cerca de 8, e ainda com mais preferência de cerca de 6,0 a cerca de 7,5. Em outra realização, o pH da formulação de reação é ácido (pH <7). O pH da reação e da formulação de reação final pode ser opcionalmente controlado pela adição de um tampão adequado, incluindo, mas não se limitando a bicarbonato, pirofosfato, fosfato, metilfosfonato, citrato, acetato, malato, fumarato, maleato de tartarato ou succinato. A concentração do tampão, quando empregado, é tipicamente de 0,1 mm a 1,0 M, de preferência de 1 mm a 300 mm, com a máxima preferência de 10 mm a 100 mm.

[0202] Em outro aspecto, a formulação de reação de peridrólise enzimática pode conter um solvente orgânico que age como um dispersante para aumentar a taxa de dissolução do éster de ácido carboxílico na formulação de reação. Esses solventes incluem, mas não se limitam a éter metílico de propileno glicol, acetona, ciclohexanona, éter butílico de dietilenoglicol, éter metílico de tripropileno glicol, éter metílico de dietilenoglicol, éter butílico de propilenoglicol, éter metílico de dipropilenoglicol, ciclohexanol, álcool benzílico, isopropanol, etanol, propilenoglicol, e misturas dos mesmos.

[0203] Em outro aspecto, o produto de peridrólise enzimática pode conter componentes adicionais que fornecem a funcionalidade desejada. Esses componentes adicionais incluem, mas não se limitam a tampões, builders de detergentes, agentes espessantes, emulsificantes, tensoativos, agentes umectantes, inibidores de corrosão (como benzotriazol), estabilizantes de enzimas e estabilizantes de peróxido (por exemplo, agentes quelantes de

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65/105 íon de metal). Muitos dos componentes adicionais são conhecidos na indústria de detergentes (consulte, por exemplo, patente US 5.932.532; incorporada à presente invenção como referência). Exemplos de emulsificantes incluem, mas não se limitam a álcool polivinílico ou polivinilpirrolidona. Exemplos de agentes espessantes incluem, mas não se limitam a LAPONITE® RD, amido de milho, PVP, Carbowax^®, CARBOPOL^®, Cabosil^®, polisorbato 20, PVA e lecitina. Exemplos de sistemas tamponantes incluem, mas não se limitam a fosfato de sódio monobásico/fosfato de sódio dibásico, ácido sulfâmico/trietanolamina, ácido cítrico/trietanolamina, ácido tartárico/trietanolamina, ácido succínico/trietanolamina e ácido acético/trietanolamina. Exemplos de tensoativos incluem, mas não se limitam a, a) tensoativos não iônicos, como copolímeros em bloco de óxido de etileno ou óxido de propileno, álcoois primários e secundários etoxilados ou propixilados lineares e ramificados, e os óxidos de fosfina alifáticos, b) tensoativos catiônicos, como compostos de quaternário de amônio, em particular compostos de quaternário de amônio tendo um grupo alquil C8-C20 ligado a um átomo de nitrogênio adicionalmente ligado a três grupos alquil C1-C2; c) tensoativos aniônicos, como alcanos ácidos carboxílicos (por exemplo, ácidos graxos C8-C20), alquil fosfonatos, alcano sulfonatos (por exemplo, dodecilsulfato de sódio SDS) ou alquil benzeno sulfonatos ramificados ou lineares, alceno sulfonatos e d) tensoativos anfotéricos e zwiteriônicos, como ácidos aminocarboxílicos, ácidos aminodicarboxílicos, alquilbetaínas e misturas dos mesmos. Os componentes adicionais podem incluir aromas, corantes, estabilizantes de peróxido de hidrogênio (por exemplo, quelantes de metais, como o ácido 1-hidroxietilideno 1,1-difosfônico (Dequest® 2010, Solutia Inc., St. Louis, MO e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)), TURPINAL® SL (CAS 2809-21-4), Dequest® 0520, Dequest^® 0531, estabilizantes da atividade enzimática (por exemplo, polietilenoglicol (PEG)), e os builders de detergente.

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Produção In Situ de Perácidos Usando-se um Catalisador de Peridrolase [0204] Cefalosporina C desacetilases (E.C. 3.1.1.41; nome sistemático cefalosporina C acetilhidrolases; CAHs) são enzimas que têm a capacidade de hidrolisar a ligação éster acetil às cefalosporinas como cefalosporina C, ácido 7-aminocefalosporânico, e ácido 7-(tiofeno-2acetamido)cefalosporânico (Abbott, B. e Fukuda, D., Appl. Microbiol. 30(3):413419 (1975)). CAHs pertence a uma ampla família de enzimas estruturalmente relacionada referida como a família esterase de carboidratos sete (“CE-7”; Coutinho, P.M., Henrissat, B., acima).

[0205] A família esterase de carboidrato CE-7 inclui tanto CAHs como acetil xilana esterases (AXEs; E.C. 3.1.1.72). Membros da família CE-7 compartilham um motivo estrutural comum e são bastante incomuns, já que eles exibem atividade de hidrólise de ésteres, tanto para xilooligosacarídeos acetilados como cefalosporina C acetilada, sugerindo que a família CE-7 representa uma única classe de proteínas com uma atividade multifuncional de desacetilase contra uma pequena gama de substratos (Vincent et al., acima). Vincent et al. descreve a semelhança estrutural entre os membros desta família e define uma motivo de sequência de assinatura característico da família CE-7.

[0206] Membros da família CE-7 são encontrados em plantas, fungos (por exemplo, Cephalosporidium acremonium), leveduras (por exemplo, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis), e bactérias como Thermoanaerobacterium sp.; Norcardia lactamdurans, e vários membros do gênero Bacillus (Politino et al., Appl. Environ. Microbiol., 63(12):4807-4811 (1997); Sakai et al., J. Ferment. Bioeng. 85:53-57 (1998); Lorenz, W. e Wiegel, J., J. Bacteriol 179:5436-5441 (1997); Cardoza et al., Appl. Microbiol.

Biotechnol., 54(3):406-412 (2000); Mitsushima et al., acima; Abbott, B. and Fukuda, D., Appl. Microbiol. 30(3):413-419 (1975); Vincent et al., acima, Takami et al., NAR, 28(21):4317-4331 (2000); Rey et al., Genome Biol., 5(10): artigo 77

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67/105 (2004); Degrassi et al., Microbiology., 146:1585-1591 (2000); patente US

6.645.233; patente US 5.281.525; patente US 5.338.676; e publicação WO 99/03984.

[0207] A publicação WO2007/070609 e as publicações de pedidos de patentes US 2008/0176299 e 2008/176783 para DiCosimo et al. divulgam várias enzimas estruturalmente classificadas como enzimas CE-7 que têm atividade de peridrolase adequada para produção de concentrações eficientes de perácidos a partir de uma variedade de substratos de éster de ácido carboxílico quando combinados com uma fonte de peroxigênio. Enzimas CE-7 variantes que têm atividade de peridrolase aprimorada também são descritas no pedido de patente US co-depositado, de co-propriedade e copendente (número de registro lega CL4392 US NA, integralmente incorporado à presente invenção como referência).

[0208] O presente método produz concentrações industrialmente úteis, concentrações eficazes de perácidos in situ mediante condições de reação aquosa usando-se a atividade de peridrolase de uma enzima pertencente à família de esterases de carboidrato CE-7.

Método de Teste HPLC para Determinar a Concentração de Perácido e Peróxido de Hidrogênio [0209] Uma variedade de métodos analíticos pode ser usada nos métodos da presente invenção para analisar os reagentes e produtos incluindo, mas não se limitando a titulação, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), cromatografia gasosa (CG), espectroscopia de massa (MS), eletroforese capilar (CE), o procedimento analítico descrito por U. Karst et al (Anal. Chem, 69(17):3623-3627 (1997)), e o teste de 2,2’-azino-bis (3etilbenzotazolina)-6-sulfonato (ABTS) (S. Minning, et al., Analytica Chimica Acta 378:293-298 (1999) e publicação WO 2004/058961 A1), conforme descrito nos presentes exemplos.

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Determinação da Concentração Mínima de Biocida de Perácidos [0210] O método descrito por J. Gabrielson, et al. (J. Microbiol. Methods 50: 63-73 (2002)) pode ser empregado para a determinação da concentração mínima de biocida de perácidos (MBC), ou de peróxido de hidrogênio e substratos de enzima. O método de teste está baseado na inibição de redução XTT ((2,3-bis[2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil]-5-[(fenilamino)carbonil]2H-tetrazólio, sal interno, sal monossódico) é um corante redox que indica a atividade respiratória microbiana pela alteração na densidade óptica (OD) medida a 490 nm ou 450 nm. Entretanto, há uma variedade de outros métodos disponíveis para testar a atividade de desinfetantes e antissépticos incluindo, mas não se limitando a contagem de placas viáveis, contagem microscópica direta, peso seco, medidas de turbidez, absorbância e bioluminescência (consulte, por exemplo, Brock, Semour S., Desinfection, Sterilization, and Preservation, 5^a edição, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, EUA; 2001).

Usos de Composições de ácido Percarboxílico Preparadas Enzimaticamente [0211] O ácido percarboxílico gerado pela enzima catalisadora produzida de acordo com o presente método pode ser usado em uma variedade de aplicações de superfícies duras/objetos inanimados para a redução das concentrações de contaminantes biológicos, como a descontaminação dos instrumentos médicos (por exemplo, endoscópios), têxteis (por exemplo, vestuário, tapetes), superfícies para preparação de alimentos, armazenamento de alimentos e equipamentos de embalagem de alimentos, materiais utilizados para o acondicionamento de produtos alimentícios, incubatórios de frango e instalações de crescimento, recintos de animais, e processos de perda de água que têm atividade microbiana e/ou virucida. Os ácidos peroxicarboxílicos gerados por enzima podem ser utilizados

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69/105 nas formulações destinadas para a inativação de príons (por exemplo, certas proteases) para fornecer adicionalmente uma atividade biocida. Em um aspecto preferencial, as presentes composições de ácido peroxicarboxílico são particularmente úteis como um agente de desinfecção para instrumentos médicos não-autoclaváveis e equipamentos de embalagem de alimentos. Como a formulação contendo ácido peroxicarboxílico pode ser preparada usando-se GRAS ou componentes de grau alimentício (enzima, substrato de enzima, peróxido de hidrogênio e tampão), o ácido peroxicarboxílico gerado por enzima também pode ser usado para a descontaminação de carcaças de animais, carnes, frutas e vegetais, ou para a descontaminação dos alimentos preparados. O ácido peroxicarboxílico gerado por enzima pode ser incorporado em um produto cuja forma final é um pó, líquido, gel, filme, sólido ou aerossol. O ácido peroxicarboxílico gerado por enzima pode ser diluído a uma concentração que forneça, ainda, uma descontaminação eficaz.

[0212] As composições que compreendem uma concentração eficaz de ácido peroxicarboxílico podem ser usadas para desinfetar superfícies e/ou objetos contaminados (ou suspeito de estar contaminado) com contaminantes biológicos pelo contato da superfície ou objeto com os produtos produzidos pelos presentes processos. Como usado na presente invenção, “contactar” refere-se colocar uma composição de desinfecção que compreende uma concentração efetiva de ácido peroxicarboxílico em contato com a superfície ou objeto inanimado suspeito de contaminação com um contaminante biológico, por um período de tempo suficiente para limpar e desinfetar. Contactar inclui a pulverização, tratamento, imersão, lavagem, derramando sobre ou dentro, misturar, combinar, pintar, revestir, aplicar, afixar e comunicar, de outra forma, uma solução de ácido peroxicarboxílico ou composição que compreende uma concentração eficaz de ácido peroxicarboxílico, ou uma solução ou composição que forma uma concentração

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70/105 eficaz de ácido peroxicarboxílico, com a superfície ou objeto inanimado, suspeito de estar contaminado com uma concentração de um contaminante biológico. As composições desinfetantes podem ser combinadas com uma composição de limpeza para fornecer a limpeza e desinfecção. Alternativamente, um agente de limpeza (por exemplo, um tensoativo ou detergente) pode ser incorporado à formulação para fornecer limpeza e desinfecção em uma única composição.

[0213] As composições que compreendem uma concentração eficaz de ácido peroxicarboxílico também podem conter pelo menos um agente antimicrobiano adicional, combinações de proteases de degradação de príons, um virucida, um esporicida ou um biocida. As combinações desses agentes com o ácido peroxicarboxílico produzidas pelos processos reivindicados podem fornecer efeitos aprimorados e/ou sinérgicos quando usadas para limpar e desinfetar as superfícies e/ou objetos contaminados (ou suspeitos de estarem contaminados) com contaminantes biológicos. Agentes antimicrobianos apropriado incluem ésteres carboxílicos (por exemplo, p-hidroxi-benzoatos de alquil cinamatos); ácidos sulfônicos (por exemplo, ácido dodecilbenzeno sulfônico), compostos de iodo ou compostos de halogênio ativo (por exemplo, halogênios elementares, óxidos de halogênio (por exemplo, NaOCl, HOCl , HOBr, ClO2), iodo, interhaletos (por exemplo, monocloreto de iodo, dicloreto de iodo, tricloreto de iodo, tetracloreto de iodo, cloro, bromo monobrometo de iodo ou dibrometo de iodo), polihaletos, sais de hipoclorito, ácido hipocloroso, sais de hipobromito, ácido hipobromoso, hidantoínas de cloro e bromo, dióxido de cloro e hipoclorito de sódio); peróxidos orgânicos, incluindo peróxido de benzoíla, alquil peróxidos de benzoíla, ozônio, geradores de oxigênio singlete, e misturas dos mesmos; derivados fenólicos (como O-fenil-fenol, O-benzil-pclorofenol, terc-amil fenol e alquil hidroxi benzoatos C1-C6); compostos quaternários de amônio (como cloreto de amônio alquildimetilbenzil, cloreto de

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71/105 amônio dialquildimetil e misturas dos mesmos) e misturas desses agentes antimicrobianos, em quantidade suficiente para fornecer o grau desejado de proteção microbiana. Quantidades efetivas de agentes antimicrobianos incluem cerca de 0,001%, em peso, a cerca de 60%, em peso, de agente antimicrobiano, cerca de 0,01%, em peso, a cerca de 15%, em peso, de agente antimicrobiano, ou cerca de 0,08%, em peso, a cerca de 2,5%, em peso, de agente antimicrobiano.

[0214] Em um aspecto, os ácidos peroxicarboxílicos formados pelo presente processo podem ser usados para reduzir a concentração de contaminantes biológicos viáveis (como uma população microbiana viável), quando aplicado sobre e/ou em um local. Como usado na presente invenção, um “local” compreende parte ou a totalidade de uma superfície alvo apropriada para desinfecção ou alvejamento. Superfícies alvo incluem todas as superfícies que podem estar potencialmente contaminadas com contaminantes biológicos. Exemplos não limitantes incluem superfícies dos equipamentos encontrados na indústria de alimentos ou bebidas (como tanques, esteiras, pisos, ralos, refrigeradores, freezers, superfícies de equipamentos, paredes, válvulas, correias, tubos, ralos, juntas, fendas, combinações dos mesmos e similares); superfícies de construção (como paredes, pisos e janelas), tubos e drenos não relacionados à indústria de alimentos, incluindo instalações de tratamento de água, piscinas e spas, e tanques de fermentação; hospital veterinário ou superfícies (como paredes, pisos, camas, equipamentos (como os endoscópios), roupas usadas em hospital/veterinário ou de outros centros de saúde, incluindo roupas, aventais, sapatos e outras superfícies hospitalares e veterinárias); superfícies de restaurante; superfícies do banheiro; sanitários, roupas e sapatos; superfícies dos celeiros ou estábulos para os animais, como aves, bois, vacas leiteiras, cabras, cavalos e suínos, incubatórios de frango ou camarão, e superfícies farmacêuticas ou biofarmacêuticas (por exemplo,

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72/105 equipamentos de produção de produtos farmacêuticos ou biofarmacêutica, ingredientes farmacêuticos e biofarmacêuticos, excipientes farmacêuticos ou biofarmacêuticos). Superfícies duras adicionais também incluem produtos alimentícios, como carne, frango, porco, legumes, frutos, frutos do mar, combinações dos mesmos e similares. O local também pode incluir materiais absorventes de água, como lençóis ou outros tecidos infectados. O local também inclui plantas colhidas e produtos vegetais, sementes, rizomas, tubérculos, frutas e produtos vegetais, plantas em crescimento e, especialmente, o crescimento das plantas de cultura, incluindo cereais, legumes de folha e culturas de salada, vegetais de raiz, legumes, frutas de bagas, frutas cítricas e frutos rígidos.

[0215] Exemplos não limitantes de materiais de superfície dura são os metais (por exemplo, aço, aço inoxidável, cromo, titânio, ferro, cobre, latão, alumínio e suas ligas), minerais (por exemplo, concreto), polímeros e plásticos (por exemplo, poliolefinas, como polietileno, polipropileno, poliestireno, poli(met)acrilato, poliacrilonitrila, polibutadieno, poli (acrilonitrila, butadieno, estireno), poli (acrilonitrila, butadieno), butadieno de acrilonitrilo, poliésteres, como tereftalato de polietileno e poliamidas como o nylon). Superfícies adicionais incluem tijolos, azulejos, cerâmica, porcelana, madeira, vinil, linóleo e carpete.

[0216] Os ácidos peroxicarboxílicos formados pelo presente processo podem ser usados para fornecer um benefício para um artigo de vestuário ou têxtil incluindo, mas não se limitando ao alvejamento, descoloração, higienização, desinfecção e desodorização. Os ácido peroxicarboxílicos podem ser formados pelo presente processo e podem ser usados em uma variedade de produtos para tratamento de roupas incluindo, mas não se limitando a tratamentos têxteis de pré-lavagem, detergentes para lavagem de roupas, removedores de manchas, composições para alvejamento,

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73/105 composições de desodorização e agentes de enxágue.

Expressão Microbiana Recombinante [0217] Os genes e produtos do gene das presentes sequências podem ser produzidos em células hospedeiras heterólogas, particularmente nas células hospedeiras microbianas. Células hospedeiras heterólogas preferenciais para expressão dos presentes genes e moléculas de ácido nucléico são hospedeiros microbianos que podem ser encontrados nas famílias de fungos ou bactérias, e que crescem em uma ampla faixa de temperatura, pH, e de tolerância a solventes. Por exemplo, é contemplado que nenhuma das bactérias, leveduras e fungos filamentosos podem ser hospedeiros adequados para expressão das presentes moléculas de ácido nucléico. A peridrolase pode ser expressa intracelularmente, extracelularmente, ou uma combinação de ambos, intracelularmente e extracelularmente, onde a expressão extracelular produz a recuperação da proteína desejada a partir de um produto de fermentação, mais fácil do que os métodos de recuperação de proteínas produzidas pela expressão intracelular. A transcrição, tradução e aparelhos de biossíntese de proteínas permanecem invariáveis em relação à matéria-prima celular usada para gerar a biomassa celular; genes funcionais serão expressos independentemente. Exemplos das linhagens hospedeiras incluem, mas não se limitam a bactérias, fungos ou espécies de leveduras como Aspergillus, Trichoderma, Saccharomyces, Pichia, Phaffia, Kluyveromyces, Candida, Hansenula, Yarrowia, Salmonella, Bacillus, Acinetobacter, Zymomonas, Agrobacterium, Erythrobacter, Chlorobium, Chromatium, Flavobacterium, Cytophaga, Rhodobacter, Rhodococcus, Streptomyces, Brevibacterium, Corynebacteria, Mycobacterium, Deinococcus, Escherichia, Erwinia, Pantoea, Pseudomonas, Sphingomonas, Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus, Methylosinus, Methylomicrobium, Methylocystis, Alcaligenes, Synechocystis, Synechococcus, Anabaena, Thiobacillus, Methanobacterium, Klebsiella e

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Myxococcus. Em uma realização, a linhagem bacteriana hospedeira inclui Escherichia, Bacillus, Kluyveromyces e Pseudomonas. Em uma realização preferencial, a célula hospedeira bacteriana é Escherichia coli.

[0218] O crescimento microbiano em grande escala e a expressão do gene funcional podem usar uma ampla variedade de carboidratos simples ou complexa, ácidos orgânicos e álcoois ou hidrocarbonetos saturados, como o metano ou dióxido de carbono no caso de hospedeiros fotossintéticos ou quimioautotróficas, a forma e a quantidade de nitrogênio, fósforo, enxofre, carbono, oxigênio ou qualquer micronutriente traço, incluindo pequenos íons inorgânicos. A regulação da taxa de crescimento pode ser afetado pela adição ou não de determinadas moléculas regulatórias para a cultura, e que normalmente não são consideradas fontes de nutrientes ou energia [0219] Vetores ou cassetes úteis para a transformação de células hospedeiras adequadas são conhecidos na técnica. Tipicamente, o vetor ou cassete contém sequências que direcionam a transcrição e a tradução dos gene relevante, um marcador selecionável e as sequências que permitem a replicação autônoma ou a integração cromossômica. Os vetores adequados compreendem uma região 5' do gene que abriga os controles de iniciação transcricional e a região 3' do fragmento de DNA, que controla a terminação da transcrição. É mais preferencial quando ambas as regiões de controle são derivadas de genes homólogos à célula hospedeira transformada e/ou nativa para o hospedeiro de produção, embora essas regiões de controle não precisem ser derivadas dessa forma.

[0220] As regiões de controle de iniciação ou promotoras, que são úteis para dirigir a expressão da presente região codificadora da cefalosporina C desacetilase da célula hospedeira desejada são numerosos e familiares para os técnicos no assunto. Praticamente qualquer promotor capaz de dirigir estes genes é adequado para a presente invenção incluindo, mas não

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75/105 se limitando a CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (útil para expressão em Saccharomyces); AOX1 (útil para expressão em Pichia); e lac, araB, tet, trp, IPl, IPr, T7, tac e trc (útil para expressão em Escherichia coli) bem como promotores amy, apr, npr e vários promotores de fago úteis para expressão em Bacillus.

[0221] As regiões de controle de terminação também podem ser derivadas de vários genes nativos para as células hospedeiras preferenciais. Em uma realização, a inclusão de uma região de controle de terminação é opcional. Em uma realização, o gene quimérico inclui uma região de controle de terminação da célula hospedeira preferencial.

Produção Industrial [0222] Uma variedade de metodologias de cultura pode ser aplicada para produzir o catalisador de peridrolase. Por exemplo, a produção em grande escala de um produto superexpresso do gene específico a partir de um hospedeiro recombinante microbiano pode ser produzida por batelada, batelada alimentada e metodologias de cultivo contínuo. Métodos de cultivo por batelada e batelada alimentada são comuns e conhecidos na técnica, e os exemplos podem ser encontrados em Thomas D. Brock em Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda Edição (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA. (1989) e Deshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol., 36:227, (1992).

[0223] A produção comercial do catalisador de peridrolase desejado também pode ser realizado com uma cultura contínua. Culturas contínuas são um sistema aberto, no qual um meio de cultura definido é adicionado continuamente a um biorreator e uma quantidade igual de meios condicionados é removida simultaneamente para processamento. As culturas contínuas geralmente mantêm as células em uma fase líquida alta constante,

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76/105 na qual as células estão principalmente em crescimento de fase logarítmica. Alternativamente, a cultura contínua pode ser praticado com células imobilizadas onde o carbono e os nutrientes são continuamente adicionados e os produtos valiosos, subprodutos ou resíduos de produtos são continuamente retirados da massa celular. A imobilização das células pode ser realizada usando-se uma grande variedade de suportes sólidos compostos por substâncias naturais e/ou materiais sintéticos.

[0224] A recuperação dos catalisadores de peridrolase desejados a partir de uma fermentação em batelada, fermentação em batelada alimentada ou cultura contínua, pode ser realizada por qualquer um dos métodos conhecidos pelos técnicos no assunto. Por exemplo, quando o catalisador enzimático é produzido intracelularmente, a pasta celular é separada do meio de cultura por centrifugação ou filtração por membranas, opcionalmente, lavada com água ou com um tampão aquoso a um pH desejado, então uma suspensão de pasta celular em tampão aquoso em um pH desejado é homogeneizada para produzir um extrato celular contendo o catalisador enzimático desejado. O extrato celular pode, opcionalmente, ser filtrado através de um filtro auxiliar apropriado, como celite ou sílica, para remover fragmentos de células, antes de uma etapa de tratamento térmico para precipitar a proteína indesejada da solução de catalisador enzimático. A solução contendo o catalisador enzimático desejado pode então ser separada do precipitado de fragmentos celulares e proteínas, por filtração em membrana ou centrifugação, e a solução resultante de catalisador enzimático parcialmente purificada da enzima pode ser concentrada por filtração de membrana adicional, em seguida, opcionalmente misturada com um carreador adequado (por exemplo, maltodextrina, tampão fosfato, tampão citrato ou misturas dos mesmos) e seca por atomização para produzir um pó sólido compreendendo o catalisador enzimático desejado.

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77/105 [0225] Quando uma quantidade, concentração ou outro valor ou parâmetro é dado como um intervalo, intervalo preferencial, ou uma lista de valores superiores preferenciais e menores valores preferenciais, esta deve ser entendida como especificamente divulgando todos os intervalos formados a partir de qualquer par de qualquer limite de intervalo superior ou valor preferencial, e qualquer limite inferior da faixa ou valor preferencial, independentemente das faixas serem divulgadas separadamente. Quando uma faixa de valores numéricos é recitada na presente invenção, a menos que estabelecido em contrário, a faixa tem a intenção de incluir os pontos extremos das mesmas, e todos os números inteiros e frações dentro desta faixa. Não há intenção de que o escopo seja limitado aos valores específicos recitados quando definindo uma faixa.

Métodos Gerais [0226] Os exemplos a seguir são fornecidos para demonstrar as realizações preferenciais. Será apreciado pelos técnicos no assunto que as técnicas divulgadas nos exemplos a seguir representem técnicas descobertas pelos inventores para funcionar de maneira adequada na prática dos métodos divulgados na presente invenção e, dessa forma, podem ser consideradas como constituintes de meios preferenciais para esta prática. Entretanto, os técnicos no assunto devem, à luz da presente divulgação, perceber que muitas mudanças podem ser feitas nas realizações específicas que são divulgadas, e ainda obter um resultado igual ou semelhante, sem se afastar do sentido e escopo dos métodos divulgados na presente invenção.

[0227] Todos os materiais e reagentes foram obtidos junto à DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD), TCI America (Portland, OR), Roche Diagnostics Corporation (Indianapolis, IN) ou Sigma-Aldrich Chemical Company (St. Louis, MO), a menos que especificado de outro modo.

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78/105 [0228] As abreviações a seguir no relatório descritivo correspondem a unidades de medida, técnicas, propriedades ou compostos, como a seguir: seg ou s significa segundo(s), min significa minuto(s), h ou hr significa hora (s) pL significa microlitro(s), mL significa mililitro(s), L significa litro(s), mm significa milimolar, M significa molar, mmol significa milimoles(s), ppm, parte(s) por milhão, p significa peso p% significa porcentagem em peso, g significa grama(s), mg significa miligrama(s) pg significa microgramas(s), ng significa nanograma(s), g significa gramas, HPLC significa cromatografia líquida de alto desempenho, dd H2O significa água destilada e deionizada, dcw significa peso celular seco ATCC ou ATCC® significa Coleção Americana de Tipo de Cultura (Manassas, VA) U significa unidade(s) de atividade de peridrolase, rpm significa revolução(ções) por minuto,Tg significa temperatura de transição vítrea, e EDTA significa ácido etilenodiaminotetracético.

Exemplo 1

Construção de uma Linhagem de E. Coli Rompida por Catalase katG [0229] A região codificadora do gene para resistência à canamicina (kan; SEQ ID NO:26) foi codificada a partir do plasmídio pKD13 (SEQ ID NO: 27) por PCR (0,5 min a 94 °C, 0,5 min a 55 °C, 1 min a 70 °C, 30 ciclos) usando-se primers identificados como SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 29 para gerar produtos de PCR identificados como SEQ ID NO: 30. A sequência de ácido nucléico katG é fornecida como SEQ ID NO: 31 e a sequência de aminoácido correspondente é SEQ ID NO: 32. E. coli MG1655 (ATCC® 47076™) foi transformada com o plasmídio pKD46 sensível à temperatura (SEQ ID NO: 33), que contém os genes para recombinase λ-Red (Datsenko e Wanner, (2000), PNAS USA 97:6640-6645), e selecionada em placas LB-amp por 24 h a 30°C. MG1655/pKD46 foi transformada com 50-500 ng do produto de PCR por eletroporação (BioRad Gene Pulser, cadinho de 0,2 cm, 2,5 kV,

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200 W, 25 pF), e selecionada nas placas LB-kan por 24 h a 37°C. Diversas colônias foram semeadas sobre as placas LB-kan e incubadas durante a noite a 42°C para curar o plasmídio pKD46. As colônias foram verificadas para confirmar um fenótipo de kanR/ampS. O DNA genômico foi isolado a partir de diversas colônias usando-se o sistema de purificação DNA PUREGENE^®(Gentra Systems, Mineápolis, MN), e verificado por PCR para confirmar o rompimento do gene katG usando-se primers identificados como SEQ ID NO:34 e SEQ ID NO:35. Diversas linhagens rompidas katG foram transformadas com o plasmídio pCP20 sensível à temperatura (SEQ ID NO:36), que contém a recombinase FLP, usada para eliminar o gene kan, e selecionadas em placas LB-amp por 24 h a 37°C. Diversas colônias foram semeadas sobre as placas LB e incubadas durante a noite a 42°C para curar o plasmídio pCP20. Duas colônias foram verificadas para confirmar um fenótipo de kanS/ampS, e chamadas de MG1655 KatG1 e MG1655 KatG2.

Exemplo 2

Construção de uma Linhagem de E. Coli Rompida por Catalase katE [0230] O gene resistente à canamicina (SEQ ID NO:26) foi amplificado a partir do plasmídio pKD13 (SEQ ID NO:27) por PCR (0,5 min a 94 °C, 0,5 min a 55 °C, 1 min a 70 °C, 30 ciclos) usando-se primers identificados como SEQ ID NO:37 e SEQ ID NO:38 para gerar o produto de PCR identificado como SEQ ID NO:39. A sequência de ácido nucléico katE é fornecida como SEQ ID NO:40 e a sequência de aminoácido correspondente é SEQ ID NO:41. E. coli MG1655 (ATCC® 47076™) foi transformada com o plasmídio pKD46 sensível à temperatura (SEQ ID NO:33), que contém os genes da recombinase λ-Red, e selecionada nas placas LB-amp por 24 h a 30°C. MG1655/pKD46 foi transformada com 50-500 ng do produto de PCR por eletroporação (BioRad Gene Pulser, cadinho de 0,2 cm, 2,5 kV, 200 W, 25 pF), e selecionada nas placas LB-kan por 24 h a 37°C. Diversas colônias foram

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80/105 semeadas sobre as placas LB-kan e incubadas durante a noite a 42°C para curar o plasmídio pKD46. As colônias foram verificadas para confirmar um fenótipo de kanR/ampS. O DNA genômico foi isolado a partir de diversas colônias usando-se o sistema de purificação DNA PUREGENE® (Gentra Systems, Mineápolis, MN), e verificado por PCR para confirmar o rompimento do gene katG usando-se primers identificados como SEQ ID NO:42 e SEQ ID NO:43. Diversas linhagens rompidas por katE foram transformadas com o plasmídio pCP20 sensível à temperatura (SEQ ID NO:36), que contém a recombinase FLP, usada para eliminar o gene kan, e selecionadas em placas LB-amp por 24 h a 37°C. Diversas colônias foram semeadas em placas LB e incubadas durante a noite a 42°C para curar o plasmídio pCP20. Duas colônias foram verificadas para confirmar um fenótipo de kanS/ampS, e chamadas de MG1655 KatE1 e MG1655 KatE2.

Exemplo 3

Construção de uma Linhagem de E. Coli (KLP18) Rompida por Catalase katG e Catalase katE [0231] O gene resistente à canamicina (SEQ ID NO:26) foi amplificado a partir do plasmídio pKD13 (SEQ ID NO:27) por PCR (0,5 min a 94 °C, 0,5 min a 55 °C, 1 min a 70 °C, 30 ciclos) usando-se primers identificados como SEQ ID NO:37 e SEQ ID NO:38 para gerar o produto de PCR identificado como SEQ ID NO:39. E. coli MG1655 KatG1 (EXEMPLO 1) foi transformada com o plasmídio pKD46 sensível à temperatura (SEQ ID NO:33), que contém o gene da recombinase λ-Red, e selecionada nas placas LB-amp por 24 h a 30 °C. MG1655 KatG1/pKD46 foi transformada com 50-500 ng do produto de PCR por eletroporação (BioRad Gene Pulser, cadinho de 0,2 cm, 2,5 kV, 200 W, 25 pF), e selecionada nas placas LB-kan por 24 h a 37°C. Diversas colônias foram semeadas sobre as placas LB-kan e incubadas durante a noite a 42°C para curar o plasmídio pKD46. As colônias foram

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81/105 verificadas para confirmar um fenótipo de kanR/ampS. O DNA genômico foi isolado de diversas colônias usando-se o sistema de purificação DNA PUREGENE®, e verificado por PCR para confirmar o rompimento do gene katE usando-se primers identificados como SEQ ID NO:42 e SEQ ID NO:43. Diversas linhagens rompidas (Δ katE) foram transformadas com o plasmídio pCP20 sensível à temperatura (SEQ ID NO:36), que contém a recombinase FLP, usada para eliminar o gene kan, e selecionadas em placas LB-amp por 24 h a 37°C. Diversas colônias foram semeadas em placas LB e incubadas durante a noite a 42°C para curar o plasmídio pCP20. Duas colônias foram verificadas para confirmar um fenótipo de kanS/ampS, e chamadas de MG1655 KatG1KatE18.1 e MG1655 KatG1KatE23. MG1655 KatG1KatE18.1 é designada E. coli KLP18.

Exemplo 4 Clonagem e Expressão de Peridrolase de Thermotoga neapolitana [0232] A região codificadora do gene que codifica acetil xilana esterase de Thermotoga neapolitana foi relatada no GENBANK® (número de acesso AE000512; região 80481-81458; SEQ ID NO:44) foi sintetizada usandose os códons otimizados para expressão em E. coli (DNA 2.0, Menlo Park, CA). A região codificadora do gene foi subsequentemente amplificada por PCR (0,5 min a 94°C, 0,5 min a 55°C, 1 min a 70°C, 30 ciclos) usando-se primers identificados como SEQ ID NO:45 e SEQ ID NO:46. O produto ácido nucléico resultante (SEQ ID NO:47) foi subclonado no pTrcHis2-TOPO® para gerar o plasmídio identificado como pSW196. O plasmídio pSW196 foi usado para transformar E. coli KLP18 (EXEMPLO 3) para gerar a linhagem KLP18/pSW196. KLP18/pSW196 foi cultivada em meio LB a 37 °C com agitação até OD600nm = 0,4-0,5, neste momento foi adicionado IPTG até uma concentração final de 1 mM, e a incubação continuou por 2 a 3 h. As células foram colhidas por centrifugação e foi realizado SDS-PAGE para confirmar a

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82/105 expressão da peridrolase a 20-40% de proteínas solúveis totais.

Exemplo 5

Clonagem e Expressão de Peridrolase de Thermotoga marítima MSB8 [0233] A região codificadora do gene que codifica acetil xilano esterase de Thermotoga maritima MSB8 como reportado no GENBANK® (acesso # NP_227893.1; SEQ ID NO: 48) foi sintetizada (DNA 2.0, Menlo Park, CA). A região codificadora do gene foi subsequentemente amplificada por PCR (0,5 min a 94°C, 0,5 min a 55°C, 1 min a 70°C, 30 ciclos) usando-se primers identificados como SEQ ID NO:49 e SEQ ID NO:50. O produto ácido nucléico resultante (SEQ ID NO:51) foi cortado com enzimas de restrição PstI e XbaI e subclonado entre os sítios PstI e XbaI no pUC19 para gerar o plasmídio identificado como pSW207. O plasmídio pSW207 foi usado para transformar E. coli KLP18 (EXEMPLO 3) para gerar a linhagem identificada como KLP18/pSW207. KLP18/pSW207 foi cultivada em meio LB a 37°C com agitação até OD600nm = 0,4-0,5, neste momento foi adicionado IPTG até uma concentração final de 1 mM, e a incubação continuou por 2 a 3 h. As células foram colhidas por centrifugação e SDS-PAGE foi realizado para confirmar a expressão da enzima peridrolase em 20-40% de proteínas solúveis totais.

Exemplo 6

Fermentação de Transformantes E. coli KLP18 que Expressam Peridrolase [0234] Um fermentador de cultura de sementes foi preparado por carregamento de um frasco agitador de 2-L com 0,5 l de meio de sementes contendo extrato de levedura (Amberex 695, 5,0 g/l), K2HPO4 (10,0 g/l), KH2PO4 (7,0 g/l), citrato de sódio dihidratado (1,0 g/l), (NH4)2SO4 (4,0 g/l), MgSO4 heptahidratado (1,0 g/l) e citrato de amônio férrico (0,10 g/l). O pH do meio foi ajustado para 6,8 e o meio foi esterilizado no frasco. Adições de esterilização posteriores incluíram glicose (50 %, em peso, 10,0 ml) e 1 ml de

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83/105 solução estoque de ampicilina (25 mg/ml). O meio de sementes foi inoculado com um 1ml de cultura de E. coli KLP18/pSW196 ou E. coli KLP18/pSW207 em 20% de glicerol, e cultivado a 35°C e 300 rpm. A cultura de sementes foi transferida a ca. 1-2 OD550nm para um fermentador de 14-L (Braun Biotech, Allentown, PA) com 8 L de meio a 35°C contendo KH2PO4 (3.50 g/L), FeSO4 heptahidratado (0,05 g/L), MgSO4 heptahidratado (2,0 g/l), citrato de sódio dihidratado (1,90 g/l), extrato de levedura (Amberex 695, 5.0 g/L), antiespumante Biospumex153K (0,25 ml/l, Cognis Corporation, Monheim, Alemanha), NaCl (1.0 g/L), CaCl2 dihidratado (10 g/l), e solução de elementos traço NIT (10 ml/l). A solução de elementos traço continha ácido cítrico monohidratado (10 g/l), hidrato de MnSO4 (2 g/l), NaCl (2 g/l), FeSO4 heptahidratado (0,5 g/l), ZnSO4 heptahidratado (0,2 g/l), CuSO4 pentahidratado (0,02 g/L) e NaMoO4 dihidratado (0,02 g/l). Adições de esterilização posteriores incluíram solução de glicose (50% peso/peso, 80,0 g) e ampicilina (25 mg/ml) de solução estoque (16,00 ml). Solução de glicose (50% peso/peso) foi usada para batelada alimentada. A alimentação de glicose foi iniciada quando a concentração de glicose diminuiu para 0,5 g/l, iniciando em 0,31 g de alimentação/min e aumentando progressivamente a cada hora para 0,36, 0,42, 0,49, 0,57, 0,66, 0,77, 0,90, 1,04, 1,21, 1,41, e 1,63 g/min respectivamente; a taxa manteve-se constante depois disso. A concentração de glicose no meio foi monitorada e se a concentração excedesse 0,1 g/l a faixa de alimentação seria diminuída ou interrompida temporariamente. A indução foi iniciada entre OD550nm = 56 e OD550nm = 80 com a adição de 16 ml de IPTG (0,5 M) para as várias linhagens. A concentração de oxigênio dissolvido (OD) foi controlada a 25% de saturação do ar. A OD foi controlada primeiro pela taxa de agitação do impulsor (400 a 1400 rpm) e depois pela taxa de aeração (2 a 10 slpm). O pH foi controlado a 6,8. NH4OH (29% peso/peso) e H2SO4 (20% peso/volume) foram usados para controle do pH. A pressão principal foi de 0,5 bar. As células

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84/105 foram colhidas por centrifugação 16 h após a adição de IPTG.

Exemplo 7

Preparação de Extratos Celulares de Esterases/Peridrolase CE-7 Tratados por Calor [0235] Um extrato celular de um transformante de E. coli que expressa peridrolase de Thermotoga neapolitana (KLP18/pSW196) ou Thermotoga maritima MSB8 (KLP18/pSW207) foi preparado pela passagem de uma suspensão de pasta celular (20 %, em peso, de célula úmida) em tampão fosfato de potássio a 0,05 M (pH 7,0) que continha ditiotreitol (1 mM) duas vezes através de uma prensa francesa que tem uma pressão de trabalho de 16.000 psi (aproximadamente 110 MPa). O extrato bruto foi então centrifugado a 20.000 x g para remover fragmentos celulares, produzindo um extrato celular clarificado que foi testado para proteína solúvel total (Bicinchoninic Acid Kit for Protein Determination, Sigma Aldrich catálogo # BCA1-KT). A Thermotoga maritima MSB8 clarificada ou o extrato contendo peridrolase de Thermotoga neapolitana foi aquecido por 20 min a 75°C, seguido imediatamente por resfriamento em um banho de gelo/água a 5°C. A mistura resultante foi centrifugada para remover proteína precipitada, e o sobrenadante coletado e testado para proteína solúvel total, como anteriormente. SDS-PAGE do sobrenadante tratado com calor indicou que a peridrolase constituiu pelo menos ca. 90% da proteína solúvel total presente no sobrenadante.

Exemplo 8

Temperatura de Estabilidade do pó de enzima Seca por Atomização Peridrolase/Trealose de T. Neapolitana [0236] Foi preparado um conjunto de dez misturas aquosas que continham diferentes concentrações de proteína de extrato celular tratada por calor de E. coli KLP18/pSW196 (> 90 % peridrolase T. neapolitana por PAGE),

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85/105 trealose (Cargill), e, opcionalmente, polisorbato 80 (p80) como tensoativo em tampão bicarbonato de sódio (50 mM, pH = 8,1) (Tabela 1). Essas soluções foram secas por atomização usando-se um secador por atomização com câmara de vidro Buchi B-290 (temperatura de entrada = 170 °C, temperatura de saída = 90 °C, taxa de alimentação = 3 ml/min a 10 ml/min) para produzir dez pós de enzimas secas por atomização, a porcentagem de peso de proteína foi determinada usando-se o teste de proteína BCA (Ácido Bicinconínico); e as temperaturas de transição vítrea (Tg) desses pós foram medidas usando-se calorimetria diferencial de varredura modulada (Tabela 1).

Tabela 1

Composição das Soluções de Proteína/Excipiente Usadas para Produzir pó de ENZIMA SECO POR ATOMIZAÇÃO PERIDROLASE/TREALOSE DE T. NEAPOLITANA, E Tg de Pós Correspondentes

proteína/ solução excipiente	trealose (g/l)	proteína (g/l)	excipiente/ proteína	p80 (g/l)	proteína/ excipiente	%p de proteína em proteína/ excipiente em pó	Tg de proteína/ excipiente em pó (°C)
S1-1	52,5	35	1,5	0,25	P1-2	39,2	42
S2-1	100	50	2,0	0	P2-2	32,5	48
S3-1	100	50	2,0	0,50	P3-2	33,2	40
S4-1	50	50	1,0	0	P4-2	45,1	40
S5-1	50	50	1,0	0,50	P5-2	46,7	54
S6-1	40	20	2,0	0	P6-2	31,4	44
S7-1	40	20	2,0	0,50	P7-2	32,5	45
S8-1	20	20	1,0	0	P8-2	47,8	38
S9-1	20	20	1,0	0,50	P9-2	46,6	58

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proteína/ solução excipiente	trealose (g/l)	proteína (g/l)	excipiente/ proteína	p80 (g/l)	proteína/ excipiente	%p de proteína em proteína/ excipiente em pó	Tg de proteína/ excipiente em pó (°C)
S10-1	52,5	35	1,5	0,25	P10-2	37,8	21

[0237] Os pós de enzima secos por atomização foram armazenados em frascos fechados a 40°C e foram tiradas amostras em intervalos de uma semana, e as amostras testadas para a concentração de ácido peracético produzido em 5 minutos em reações contendo peridrolase de T. neapolitana (50 pg de proteína/ml), H2O2 (100 mM), triacetina (100 mM) e TURPINAL® SL (500 ppm) em tampão bicarbonato de sódio (50 mM, pH 7,2) a 25°C, e analisadas para produção de ácido peracético usando-se uma modificação do método analítico relatado por Karst et al. (abaixo).

[0238] Uma amostra (0,040 ml) da mistura da reação foi removida por um período pré-determinado (5 min) e imediatamente misturada com 0,960 ml de 5 mM de ácido fosfórico na água para finalizar a reação, ajustando-se o pH da amostra diluída para pH menor que 4. A solução resultante foi filtrada usando-se uma unidade de filtro MC ULTRAFREE® (Limite de Peso Molecular Normal 30.000 (NMWL), Millipore Corp., Billerica, MA, cat # UFC3LKT 00) por centrifugação por 2 min a 12.000 rpm. Uma alíquota (0,100 ml) do filtrado resultante foi transferida para um frasco de tampa de rosca 1,5-ml HPLC (Agilent Technologies, Palo Alto, CA; #5182-0715) contendo 0,300 ml de água deionizada, então 0,100 ml de 20 mM MTS (sulfeto metil-p-tolil) em acetonitrilo foi adicionado, o frasco tampado, e o conteúdo brevemente misturado antes a 10 min de incubação a ca. 25 °C na ausência de luz. Ao frasco foi então adicionado 0,400 ml de acetonitrilo e 0,100 ml de uma solução de trifenilfosfina (TPP, 40 mM) em acetonitrilo, o frasco retampado, e a solução resultante misturada e incubada a ca. 25 °C por 30 min na ausência de luz. Ao frasco foi então adicionado 0,100 ml de 10 mM de N, N-dietilm-toluamida (DEET; HPLC padrão externo) e a solução resultante analisada por

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HPLC para MTSO ( metil-p-tolil sulfóxido), o produto de oxidação estequiométrico produzido pela reação de MTS com ácido peracético. Uma reação de controle foi executada na ausência da adição de extrato de proteína ou triacetina para determinar a taxa de oxidação de MTS na mistura teste por peróxido de hidrogênio, para correção da taxa de produção de ácido peracético para oxidação MTS de fundo. Método HPLC: Coluna Supelco Discovery C8 (10-cm X 4.0-mm, 5 pm) (cat. #569422-U) com Supelco Supelguard Discovery C8 precolumn (SigmaAldrich; cat # 59590-U); volume de injeção de 10 microlitros; método gradiente com CH3CN (Sigma-Aldrich; catálogo #270717) e água deionizada em 1,0 ml/min e temperatura ambiente.

Tabela 2

Gradiente HPLC para Análise de Ácido Peracético·

Tempo (min:seg)	(% de CH3CN)
0:00	40
3:00	40
3:10	100
4:00	100
4:10	40
7:00 (parada)	40

[0239] A atividade peridrolítica do pó seco por atomização de peridrolase/trealose de T. Neapolitana ficou estável durante oito semanas de armazenamento a 40 °C (Tabela 3).

Tabela 3

Temperatura de Estabilidade do pó de enzima Seco por Atomização Peridrolase/Trealose de T. neapolitana Durante Armazenamento a 40 °C [0240] PAA (ppm) produzido em 5 min a 25 °C por reação de

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88/105 triacetina (100 mM) e H2O2 (100 mM) em tampão bicarbonate de sódio (50 mM, pH 7,2) contendo pó seco por atomização de peridrolase/trealose de T. Neapolitana (50 pg proteína/ml) e SL (500 ppm) TURPINAL®.

Período a 40 °C	PAA (ppm) em 5 minutos
P1-2	P2-2	P3-2	P4-2	P5-2	P6-2	P7-2	P8-2	P9-2	P10-2
inicial	1855	1983	2075	2025	1769	1891	1902	1777	1880	1945
semana 1	1872	2019	2060	1785	1776	1887	2013	1903	2046	2204
semana 2	1830	1899	1870	1771	1833	1930	1987	1933	2146	2222
semana 3	1888	1974	1887	1973	1977	2223	2102	1924	2080	2104
semana 4	1894	1878	2035	1881	1712	1918	1902	1793	1720	1988
semana 5	1595	1744	1706	1565	1871	2052	1933	1783	1908	1985
semana 6	1908	1760	1538	1545	1825	1864	1756	1675	1659	1758
semana 7	1562	1797	1614	1487	1551	1774	1879	1927	1866	1957
semana 8	1881	1959	1792	1753	1939	2123	1972	1907	1902	2095

Exemplo 9

Temperatura de Estabilidade do pó de enzima Seco por Atomização Peridrolase/Trealose de T. Neapolitana em uma Mistura de pó de enzima e Triacetina [0241] As enzimas em pó secas por atomização preparadas conforme descrito no Exemplo 8 foram avaliadas quanto à estabilidade quando armazenadas por oito semanas a 40 °C como uma mistura do pó seco por atomização em triacetina. Enzimas em pó secas por atomização foram adicionadas à triacetina para produzir uma mistura contendo 0,200 g de proteína em 87,2 g de triacetina. As misturas resultantes foram armazenadas a 40°C, e uma amostra de 2,19 g da mistura bem agitada foi testada semanalmente a 25°C em uma reação de 100 ml contendo 100 mM de peróxido de hidrogênio e SL (500 ppm) TURPINAL® em 50 mM de tampão

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89/105 bicarbonato de sódio a pH 7,2, onde a concentração resultante de triacetina e proteína foi de 100 mM e 50 pg/ml, respectivamente. A comparação dos dados na Tabela 4 com os dados no Exemplo 8, Tabela 3, demonstra a instabilidade do pó de enzima seco por atomização peridrolase/trealose de T. Neapolitana quando armazenada como uma mistura com triacetina.

Tabela 4

Temperatura de Estabilidade do pó de enzima Seca por Atomização

Peridrolase/Trealose de T. neapolitana Durante Armazenamento em uma Mistura de pó de enzima e Triacetina a 40°C [0242] PAA (ppm) produzido em 5 min a 25°C por reação de triacetina (100 mM) e H2O2 (100 mM) em tampão bicarbonato de sódio (50 mM, pH 7,2) contendo peridrolase de T. Neapolitana (50 pg proteína/ml) e SL (500 ppm) TURPINAL®.

Período a 40 °C	PAA (ppm) em 5 minutos
P1-2	P2-2	P3-2	P4-2	P5-2	P6-2	P7-2	P8-2	P9-2	P10-2
inicial	1650	1495	1539	1569	1666	1735	1552	1327	1712	1816
semana 1	1214	1359	1597	1599	1589	1632	1515	1469	1421	1577
semana 2	1303	1609	1580	1316	1293	1682	1353	971	1402	1483
semana 3	1092	1573	1568	1233	1293	1245	1268	849	1324	1388
semana 4	828	1563	1420	1226	1199	1608	1361	961	1172	1273
semana 5	622	1340	1114	1294	1154	1663	1163	739	815	667
semana 6	636	1301	990	970	895	1318	514	313	699	372
semana 7	281	998	1140	841	798	962	259	188	831	521
semana 8	254	569	659	563	567	483	414	323	494	321

Exemplo 10

Temperatura de Estabilidade do pó de enzima Seco por Atomização

Peridrolase/Maltodextrina de T. Neapolitana [0243] Uma mistura aquosa foi preparada contendo extrato de proteína de célula termotratada de E. coli KLP18/pSW196 (34 g de proteína/l, > 90% de peridrolase de T. Neapolitana por PAGE) e maltodextrina (66,7 g/l de

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90/105 maltodextrina M100 MALTRIN® , 14,7 g/l de M250MALTRIN®, 14,7 g/l de M040 MALTRIN®, Grain Processing Corporation, Muscatine, IA) como excipiente em 50 mM de bicarbonato de sódio (pH 8,1). Essa solução foi seca por atomização usando-se um secador por atomização (GEA Niro, diâmetro de 3 pés, temperatura de entrada = 226 °C, temperatura de saída = 76 °C, taxa de alimentação = 60 g/min) para produzir um pó de enzima seco por atomização; o percentual, em peso, de proteína no pó (20,3 wt%) foi determinado usandose o teste de proteína BCA (Ácido Bicinconínico), e a temperatura de vitrificação desse pó (Tg = 54 °C) foi medida usando-se um calorímetro diferencial de varredura modulado. Essa solução foi seca por atomização para produzir um pó que foi então testado quanto à estabilidade durante armazenamento a 40°C por 9 semanas. O pó de enzima seco por atomização (armazenado a 40 °C) foi amostrado em intervalos de uma semana e testado para atividade usando-se 50 pg proteína/ml de peridrolase T. Neapolitana, H2O2 (100 mM), triacetina (100 mM) e SL (500 ppm) TURPINAL® em 50 mM de tampão bicarbonato (pH 7,2) a 25°C, e analisada para produção de ácido peracético usando-se uma modificação do método analítico relatado por Karst et al., acima. A atividade peridrolítica do pó seco por atomização de peridrolase/maltodextrina de T. neapolitana ficou estável durante oito semanas de armazenamento a 40 °C (Tabela 5).

Tabela 5

Temperatura de Estabilidade do pó de enzima Seco por Atomização Peridrolase/Maltodextrina de T. Neapolitana Durante Armazenamento a 40 °C [0244] PAA (ppm) produzido em 5 min a 25 °C pela reação de triacetina (100 mM) e H2O2 (100 mM) em tampão bicarbonato de sódio (50 mM, pH 7,2) contendo peridrolase de T. Neapolitana (50 pg proteína/ml) e SL (500 ppm) TURPINAL^®.

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91/105

Período a 40 °C	PAA (ppm) em 5 min
Inicial	1142
semana 1	1117
semana 2	1135
semana 3	1087
semana 4	964
semana 5	1153
semana 6	930
semana 7	1025
semana 8	964

Exemplo 11

Temperatura de Estabilidade do pó de enzima Seco por Atomização Peridrolase/Maltodextrina de T. Neapolitana em uma Mistura de pó de enzima e Triacetina [0245] O pó de enzima seco por atomização preparado como descrito no Exemplo 10 foi avaliado quanto à estabilidade quando armazenado por vinte e uma semanas a 40 °C como uma mistura do pó seco por atomização em triacetina. O pó de enzima seco por atomização (1,235 g, 20,3%, em peso, de proteína) foi adicionado a 109 g de triacetina. A mistura resultante foi armazenada a 40°C, e uma amostra de 2,19 g da mistura bem agitada testada em duplicata a 25°C em uma reação de 100 ml contendo (100 mM) de peróxido de hidrogênio e SL (500 ppm) TURPINAL® em 50 mM de tampão bicarbonato de sódio a pH 7,2, onde a concentração resultante de triacetina e proteína foi de 100 mM e 50 pg/ml, respectivamente. A comparação dos dados na Tabela 6 com os dados no Exemplo 10, Tabela 5, demonstra a estabilidade do pó de enzima seco por

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92/105 atomização peridrolase/maltodextrina de T. Neapolitana quando armazenada como uma mistura com triacetina.

Tabela 6

Temperatura de Estabilidade do pó de enzima Seco por Atomização Peridrolase/maltodextrina de T. neapolitana Durante Armazenamento em uma Mistura de pó de enzima e Triacetina a 40 °C [0246] PAA (ppm) produzido em 5 min a 25°C pela reação de triacetina (100 mM) e H2O2 (100 mM) em tampão bicarbonato de sódio (50 mM, pH 7,2) contendo peridrolase de T. Neapolitana (50 pg proteína/ml) e SL (500 ppm) TURPINAL®.

Período a 40 °C	PAA (ppm) em 5 min
duplicado A	duplicado B	média
inicial	1010	1019	1015
semana 1	983	1054	1019
semana 2	897	927	912
semana 3	1194	1137	1166
semana 4	1139	1088	1114
semana 5	1099	1069	1084
semana 6	1098	978	1038
semana 7	1018	1006	1012
semana 8	907	892	900
semana 12	925	936	931
semana 18	824	ND
semana 21	792	ND

ND = não foi realizado teste em duplicata

Exemplo 12 Temperatura de Estabilidade do pó de enzima Seco por Atomização Peridrolase/maltodextrina de T. neapolitana em uma Mistura de pó de enzima, Bicarbonato de Sódio e Triacetina [0247] O pó de enzima seco por atomização preparado como descrito no Exemplo 10 foi avaliado quanto à estabilidade quando armazenado

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93/105 por 21 semanas a 40°C como uma mistura do pó seco por atomização em uma mistura de triacetina e bicarbonato de sódio. O pó de enzima seco por atomização (0,988 g, 20,3%, em peso, de proteína) foi adicionado a uma mistura de 87,2 g de triacetina e 16,8 g de bicarbonato de sódio (Grade 3DF (pó), Church & Dwight). A mistura resultante foi armazenada a 40°C, e uma amostra de 2,62 g da mistura bem agitada foi testada em duplicata a 25°C em uma reação de 100 ml contendo peróxido de hidrogênio (100 mM) e SL (500 ppm) TURPINAL® onde as concentrações resultantes de triacetina, bicarbonato de sódio e proteína foram de 100 mM, 50 mM (pH 7,2) e 50 pg/ml, respectivamente. A comparação dos dados na Tabela 7 com os dados no Exemplo 11, Tabela 6, demonstrou a estabilidade do pó de enzima seco por atomização de peridrolase/maltodextrina de T. Neapolitana quando armazenada por vinte e uma semanas a 40°C como uma mistura com triacetina e bicarbonato de sódio sólido é melhorada em comparação à estabilidade do pó de enzima seco por atomização de peridrolase/maltodextrina de T. Neapolitana quando armazenado por vinte e uma semanas a 40 °C como uma mistura com triacentina sozinha. Nos períodos mais longos de armazenamento, por exemplo, 21 semanas, a peridrolase ainda mantém ca. 100% de atividade inicial em uma mistura de triacetina e bicarbonato de sódio.

Tabela 7

Temperatura de Estabilidade do pó de enzima Seco por Atomização Peridrolase/maltodextrina de T. Neapolitana Durante Armazenamento em uma Mistura de pó de enzima, Bicarbonato de Sódio e Triacetina a 40°C [0248] PAA (ppm) produzido em 5 min a 25°C pela reação de triacetina (100 mM) e H2O2 (100 mM) em tampão bicarbonato de sódio (50 mM, pH 7,2) contendo peridrolase de T. Neapolitana (50 pg proteína/ml) e SL (500 ppm) TURPINAL^®.

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94/105

Período a 40 °C	PAA (ppm) em 5 min
duplicado A	duplicado B	média
inicial	950	1032	991
semana 1	1060	1096	1078
semana 2	1114	1114	1114
semana 4	1044	974	1009
semana 8	1085	1046	1066
semana 12	1101	1122	1112
semana 17	1013	ND
semana 21	1162	ND

ND = não foi realizado teste em duplicata

Exemplo 13 Temperatura de Estabilidade do pó de enzima Seco por Atomização Peridrolase/Maltodextrina de T. Marítima [0249] Uma mistura aquosa foi preparada contendo extrato de proteína de célula termotratada de E. coli KLP18/pSW207 (21 g de proteína/l, > 90% de peridrolase de T. Maritima por PAGE) e maltodextrina (31 g/l de maltodextrina DE 13-17 e 31 g/l de maltodextrina DE 4-7, Aldrich) como excipiente em 50 mM de bicarbonato de sódio (pH 8,1). Essa solução foi seca por atomização usando-se um secador por atomização de câmara de vidro (temperatura de entrada = 170 °C, temperatura de saída = 90 °C, taxa de alimentação = 4,5 ml/min) para produzir um pó de enzima seco por atomização; o percentual, em peso, de proteína no pó (18,0%, em peso) foi determinado usandose o teste de proteína BCA (Ácido Bicinconínico), e a temperatura de vitrificação

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95/105 desse pó (Tg = 90 °C) foi medida usando-se um calorímetro diferencial de varredura modulado. Essa solução foi seca por atomização para produzir um pó que foi então testado quanto à estabilidade durante armazenamento a 40 °C por 7 semanas. O pó de enzima seco por atomização (armazenada a 40 °C) foi amostrada em intervalos de uma semana e testada para atividade usando-se 50 pg proteína/ml de peridrolase T. Marítima, H2O2 (100 mM), triacetina (100 mM) e SL (500 ppm) TURPINAL® em 50 mM de tampão bicarbonato (pH 7,2) a 25 °C, e analisada para produção de ácido peracético usando-se uma modificação do método analítico relatado por Karst et al., acima. A atividade peridrolítica do pó seco por atomização de peridrolase/maltodextrina de T. Marítima ficou estável durante sete semanas de armazenamento a 40 °C (Tabela 8).

Tabela 8

Temperatura de Estabilidade do pó de enzima Seco por Atomização Peridrolase/maltodextrina de T. Marítima Durante Armazenamento a 40°C [0250] PAA (ppm) produzido em 5 min a 25°C por reação de triacetina (100 mM) e H2O2 (100 mM) em tampão bicarbonato de sódio (50 mM, pH 7,2) contendo peridrolase de T. Marítima (50 pg proteína/ml) e SL (500 ppm) TURPINAL^®.

Período a 40 °C	PAA (ppm) em 5 min
Inicial	1373
semana 1	1262
semana 2	1548
semana 3	1317
semana 4	1316
semana 5	1378

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96/105

Período a 40 °C	PAA (ppm) em 5 min
semana 6	1296
semana 7	1475

Exemplo 14 Temperatura de Estabilidade do pó de enzima Seco por Atomização Peridrolase/Maltodextrina de T. Marítima em uma Mistura de pó de enzima e Triacetina [0251] O pó de enzima seco por atomização preparado como descrito no Exemplo 13 foi avaliado quanto à estabilidade quando armazenado por sete semanas a 40°C como uma mistura do pó seco por atomização em triacetina. O pó de enzima seco por atomização (0,556 g, 18,0%, em peso, de proteína) foi adicionada a 43,6 g de triacetina. A mistura resultante foi armazenada a 40°C, e uma amostra de 2,21 g da mistura bem agitada foi testada em duplicata semanalmente a 25°C em uma reação de 100 ml contendo de peróxido de hidrogênio (100 mM) e SL (500 ppm) TURPINAL® em 50 mM de tampão bicarbonato de sódio a pH 7,2, onde a concentração resultante de triacetina e proteína foi de 100 mM e 50 pg/ml, respectivamente. A comparação dos dados na Tabela 9 com os dados no Exemplo 13, Tabela 8, demonstra a estabilidade do pó de enzima seco por atomização peridrolase/maltodextrina de T. Marítima quando armazenado como uma mistura com triacetina.

Tabela 9

Temperatura de Estabilidade do pó de enzima Seco por Atomização de Peridrolase/maltodextrina de T. Marítima Durante Armazenamento em uma Mistura de pó de enzima e Triacetina a 40°C.

[0252] PAA (ppm) produzido em 5 min a 25 °C por reação de

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97/105 triacetina (100 mM) e H2O2 (100 mM) em tampão bicarbonate de sódio (50 mM, pH 7,2) contendo peridrolase de T. Maritima (50 pg proteína/ml) e SL (500 ppm) TURPINAL®.

Período a 40 °C	PAA (ppm) em 5 min
Inicial	1137
semana 1	1089
semana 2	1138
semana 3	1213
semana 4	1130
semana 5	872
semana 6	858
semana 7	1004

Exemplo 15

Temperatura de Estabilidade do pó de enzima Seco por Atomização Peridrolase/Maltodextrina de T. Maritima em uma Mistura de pó de enzima, Bicarbonato de Sódio e Triacetina [0253] O pó de enzima seco por atomização preparado como descrito no Exemplo 13 foi avaliado quanto à estabilidade quando armazenado por sete semanas a 40°C como uma mistura do pó seco por atomização em uma mistura de triacetina e bicarbonato de sódio. O pó de enzima seco por atomização (0,556 g, 18,0%, em peso, de proteína) foi adicionado a 43,6 g de triacetina e 8,4 g de bicarbonato de sódio (Grade 3DF (powder), Church & Dwight). A mistura resultante foi armazenada a 40°C, e uma amostra de 2,63 g da mistura bem agitada foi testada em duplicata a 25°C em uma reação de 100 ml contendo peróxido de hidrogênio (100 mM) e SL (500 ppm) TURPINAL® onde as concentrações resultantes de triacetina, tampão bicarbonato de sódio

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98/105 (pH 7,2) e proteína foram de 100 mM, 50 mM e 50 pg/ml, respectivamente. A comparação dos dados na Tabela 10 com os dados no Exemplo 14, Tabela 9, demonstrou a estabilidade do pó de enzima seco por atomização peridrolase/maltodextrina de T. Marítima quando armazenada por cinco, seis e sete semanas a 40°C como uma mistura com triacetina e bicarbonato de sódio sólido é melhorada quando comparada a estabilidade do pó de enzima seco por atomização peridrolase/maltodextrina de T. Marítima quando armazenada por cinco, seis e sete semanas a 40 °C como uma mistura com triacentina sozinha.

Tabela 10

Temperatura de Estabilidade do pó de enzima Seco por Atomização Peridrolase/maltodextrina de T. marítima Durante Armazenamento em uma Mistura de pó de enzima, Bicarbonato de Sódio e Triacetina a 40°C [0254] PAA (ppm) produzido em 5 min a 25 °C por reação de triacetina (100 mM) e H2O2 (100 mM) em tampão bicarbonato de sódio (50 mM, pH 7,2) contendo peridrolase de T. Marítima (50 pg proteína/ml) e SL (500 ppm) TURPINAL®.

Período a 40 °C	PAA (ppm) em 5 min
Inicial	1153
semana 1	1138
semana 2	1343
semana 3	1242
semana 4	1111
semana 5	1149
semana 6	1184
semana 7	1109

Exemplo 16

Peridrolases de Diacetato de Propilenoglicol ou Diacetato de

Etilenoglicol Usando-se Peridrolase de Bacillus subtilis ATCC® 31954™ [0255] Um homogeneizado de um transformante que expressa

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99/105 peridrolase tipo selvagem de Bacillus subtilis ATCC® 31954™ (KLP18/pSW194) foi preparado a partir de uma suspensão de pasta celular (20%, em peso, peso celular úmido) em 0,05 M de tampão fosfato de potássio (pH 7,0) contendo ditiotreitol (1 mM). O homogeneizado cru foi centrifugado para remoção de fragmentos celulares, produzindo um extrato celular clarificado que recebeu tratamento térmico a 65°C por 30 min. A mistura resultante foi centrifugada e o sobrenadante, tratado por calor, concentrado em uma membrana 30K MWCO (peso molecular de corte) até uma concentração de 32 mg/ml de sólidos totais dissolvidos; um SDS-PAGE do extrato celular tratado por calor indicou que a peridrolase estava pelo menos 85 a 90 % pura. A este concentrado foi então adicionado 2,06 gramas de NaH2PO4, e 1,17 gramas de Na2HPO4 por grama de sólidos foi adicionado a este concentrado para produzir uma razão aproximada de 3:1 (peso/peso) de tampão fosfato para o extrato de proteína celular tratado por calor. Esta solução foi diluída em 30%, em peso, com água deionizada, e então seca por atomização (180°C de temperatura de entrada, 70°C de temperatura de saída) usando-se um secador por atomização para laboratório Buchi B290); o pó seco por atomização resultante continha 25,5%, em peso, de proteína (teste de proteína Bradford) e tinha 94,3%, em peso, de sólidos secos.

[0256] As reações (10 ml de volume total) foram realizadas a 23°C em 50 mM de tampão bicarbonato de sódio (pH inicial 7,2) contendo diacetato de propilenoglicol (PGDA) ou diacetato de etilenoglicol (EGDA), peróxido de hidrogênio (100 mM) e 123 pg/ml de um extrato de proteína tratado por calor da secagem por atomização de E. coli KLP18/pSW194 (que expressa peridrolase tipo selvagem de Bacillus subtilis ATCC® 31954™) (preparado conforme descrito acima). Uma reação controle para cada condição de reação foi realizada para determinar a concentração de ácido peracético produzido por peridrólise química

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100/105 de triacetina por peróxido de hidrogênio na ausência de adição de extrato de proteína tratada por calor. As reações foram amostradas a 1, 5 e 30 minutos e as amostras analisadas para ácido peracético usando-se o protocolo de derivatização Karst (Karst et al., acima); alíquotas (0,040 mL) da mistura de reação foram removidas e misturadas com 0,960 ml de 5 mM de ácido fosfórico em água; ajuste do pH da amostra diluída para pH menor que 4 imediatamente terminada a reação. A solução resultante foi filtrada usando-se uma unidade de filtro MC ULTRAFREE® (Limite de Peso Molecular Normal 30.000 (NMWL), Millipore cat # UFC3LKT 00) por centrifugação por 2 min a 12.000 rpm. Uma alíquota (0,100 ml) do filtrado resultante foi transferida para um frasco de tampa de rosca 1,5-ml HPLC (Agilent Technologies, Palo Alto, CA; #5182-0715) contendo 0,300 ml de água deionizada, então 0,100 ml de 20 mM MTS (sulfeto metil-p-tolil) em acetonitrilo foi adicionado, o frasco tampado, e o conteúdo brevemente misturado antes a 10 min de incubação a ca. 25 °C na ausência de luz. Para cada frasco foi então adicionado 0,400 ml de acetonitrilo e 0,100 ml de uma solução de trifenilfosfina (TPP, 40 mM) em acetonitrilo, o frasco retampado, e a solução resultante misturada e incubada a ca. 25 °C por 30 min na ausência de luz. Para cada frasco foi então adicionado 0,100 ml de 10 mM de N,N-dietil-m-toluamida (DEET; HPLC padrão externo) e a solução resultante analisada por HPLC. As concentrações de ácido peracético produzidas em 1 min, 5 min e 30 min são listadas na Tabela 11.

Tabela 11

Concentração de Ácido Peracético (PAA) Produzido em Reações que Utilizam Diacetato de Propilenoglicol (PGDA) ou Diacetato de Etilenoglicol (EGDA) e Peróxido de Hidrogênio (100 mM) em Tampão Bicarbonato de Sódio (50 mM, pH Inicial 7,2) a 23 °C Usando-se 123 ug/ml de Extrato de Proteína Tratado por Calor de E. coli KLP18/pSW194 (Peridrolase de Bacillus subtilis ATCC® 31954™)

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101/105

Peridrolase (50 pg/ml)	Substrato (100 mM)	paa, 1 min (ppm)	paa, 5 min (ppm)	paa, 30 min (ppm)
sem enzima (controle)	PGDA	0	64	241
B. subtilis ATCC® 31954	PGDA	666	781	815
sem enzima (controle)	EGDA	0	18	141
B. subtilis ATCC® 31954	EGDA	747	931	963

Exemplo 17

Peridrólise de Diacetato de Propilenoglicol ou Diacetato de Etilenoglicol Usando-se T. marítima e T. neapolitana Tipo Selvagem e Peridrolases Variantes [0257] Extratos celulares de transformantes que expressam peridrolase tipo selvagem de Thermotoga neapolitana (KLP18/pSW196), peridrolase variante de Thermotoga neapolitana C277S (KLP18/pSW196/C277S), peridrolase variante de Thermotoga neapolitana C277T (KLP18/pSW196/C277T), peridrolase tipo selvagem de Thermotoga maritima (KLP18/pSW228), peridrolase variante de Thermotoga maritima C277S (KLP18/pSW228/C277S), e peridrolase variante de Thermotoga maritima C277T (KLP18/pSW228/C277T) foram preparadas, cada uma, passando-se uma suspensão de pasta celular (20%, em peso, de peso celular úmido) em 0,05 M de tampão fosfato de potássio (pH 7,0) contendo ditiotreitol (1 mM) duas vezes através de uma prensa francesa que tem uma pressão de trabalho de 16.000 psi (aproximadamente 110 MPa). As células lisadas foram centrifugadas por 30 minutos a 12.000 x g, produzindo um extrato celular clarificado que foi testado para proteína solúvel total (teste Bradford). O sobrenadante foi aquecido a 75°C por 20 minutos, seguido pela interrupção em um banho de gelo por 2 minutos. A proteína precipitada foi removida por

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102/105 centrifugação por 10 minutos a 11.000 x g. SDS-PAGE do sobrenadante de extrato de proteína tratado por calor resultante indicou que a enzima CE-7 compreendia aproximadamente 85 a 90% do total de proteína na preparação. O sobrenadante de extrato de proteína tratado por calor foi congelado em gelo seco e armazenado a -80°C até o uso.

[0258] Um primeiro conjunto de reações (10 ml de volume total) foi realizado a 20 °C em 10 mM de tampão bicarbonato de sódio (pH inicial de 8,1) contendo diacetato de propilenoglicol (PGDA) ou diacetato de etilenoglicol (EGDA) (100 mM), peróxido de hidrogênio (100 mM) e 25 pg/ml de extrato de proteína tratado por calor de E. coli KLP18/pSW196 (peridrolase tipo selvagem de Thermotoga neapolitana), E. coli KLP18/pSW196/C277S (peridrolase variante de Thermotoga neapolitana C277S), E. coli KLP18/pSW196/C277T (peridrolase variante de Thermotoga neapolitana C277T), E. coli KLP18/pSW228 (peridrolase tipo selvagem de Thermotoga maritima), E. coli KLP18/pSW228/C277S (peridrolase variante de Thermotoga maritima C277S), e E. coli KLP18/pSW228/C277T (peridrolase variante de Thermotoga maritima C277T) (preparado conforme descrito acima). Uma reação controle para cada condição de reação foi realizada para determinar a concentração de ácido peracético produzido por peridrólise química de triacetina por peróxido de hidrogênio na ausência de adição de extrato de proteína. As reações foram amostradas em 1, 5 e 30 minutos e as amostras analisadas para ácido peracético usando-se o protocolo de derivatização de Karst (Karst et al., acima) e método analítico HPLC (acima). As concentrações de ácido peracético produzidas em 1 min, 5 min e 30 min são listadas na Tabela 12.

Tabela 12

Concentração de Ácido Peracético (PAA) Produzido Usando-se Peridrolases Tipo Selvagem e Variante de T. marítima e T. neapolitana em Reações a 20°C em Tampão Bicarbonato de Sódio (10 mM, pH Inicial 8,1)

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103/105

Contendo Diacetato de Propilenoglicol (PGDA) (100 mM) ou Diacetato de

Etilenoglicol (EGDA) (100 mM), Peróxido de Hidrogênio (100 mM) e 25 uq/mi de Extrato de Proteína Tratado por Calor

Peridrolase	Substrato	Substrato Conc. (mM)	H2O2 (mM)	ΡΑΑ,Ι min (ppm)	PAA, 5 min (PPm)	PAA, 30 min (PPm)
sem enzima (controle)	PGDA	100	100	0	15	165
T. maritima WT	PGDA	100	100	534	1104	1695
T. maritima C277S	PGDA	100	100	647	1320	1864
T. maritima C277T	PGDA	100	100	656	1174	1418
T. neapolitana WT	PGDA	100	100	513	1052	1946
T. neapolitana C277S	PGDA	100	100	875	1327	1707
T. neapolitana C277T	PGDA	100	100	724	1325	1864
sem enzima (controle)	EGDA	100	100	0	70	229
T. maritima WT	EGDA	100	100	765	1182	1595
T. maritima C277S	EGDA	100	100	725	1240	1724
T. maritima C277T	EGDA	100	100	802	1218	1734
T. neapolitana WT	EGDA	100	100	603	1132	1643
T. neapolitana C277S	EGDA	100	100	680	1305	1698
T. neapolitana C277T	EGDA	100	100	688	1164	1261

[0259] Um segundo conjunto de reações (10 ml de volume total) foi realizado a 20 °C em 10 mM de tampão bicarbonato de sódio (pH inicial de 8,1) contendo diacetato de propilenoglicol (PGDA) ou diacetato de etilenoglicol (EGDA) (2 mM), peróxido de hidrogênio (10 mM) e 10 pg/ml de extrato de proteína tratado por calor de E. coli KLP18/pSW196 (peridrolase tipo selvagem de Thermotoga neapolitana), E. coli KLP18/pSW196/C277S (peridrolase variante de Thermotoga neapolitana C277S), E. coli KLP18/pSW196/C277T

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104/105 (peridrolase variante de Thermotoga neapolitana C277T), E. coli KLP18/pSW228 (peridrolase tipo selvagem de Thermotoga maritima), E. coli KLP18/pSW228/C277S (peridrolase variante de Thermotoga maritima C277S), e E. coli KLP18/pSW228/C277T (peridrolase variante de Thermotoga maritima C277T) (preparado conforme descrito acima). Uma reação controle para cada condição de reação foi realizada para determinar a concentração de ácido peracético produzido por peridrólise química de triacetina por peróxido de hidrogênio na ausência de adição de extrato de proteína. As reações foram amostradas em 5 minutos e as amostras analisadas para ácido peracético usando-se o protocolo de derivatização de Karst (Karst et al., acima) e método analítico HPLC (acima). As concentrações de ácido peracético produzidas em 5 min são listadas na Tabela 13.

Tabela 13

Concentração de Ácido Peracético (PAA) Produzido Usando-se Peridrolases

Tipo Selvagem e Variante de T. Maritima e T. Neapolitana em Reações a 20°C em Tampão Bicarbonato de Sódio (10 mM, pH Inicial 8,1) Contendo Diacetato de Propilenoglicol (PGDA) (2 mM) ou Diacetato de Etilenoglicol (EGDA) (2 mM), Peróxido de Hidrogênio (10 mM) e 10 mg/ml de Extrato de Proteína Tratado por

Calor

Peridrolase	Substrato	substrato Conc. (mM)	H2O2 (mM)	PAA, 5 min (ppm)
sem enzima (controle)	PGDA	2	10	3,6
T. maritima WT	PGDA	2	10	5,0
T maritima C277S	PGDA	2	10	7,2
T maritima C277T	PGDA	2	10	7,9
T. neapolitana WT	PGDA	2	10	5,7
T. neapolitana C277S	PGDA	2	10	7,9

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105/105

Peridrolase	Substrato	Substrato Conc. (mM)	H2O2 (mM)	PAA, 5 min (ppm)
T. neapolitana C277T	PGDA	2	10	3,9
sem enzima (controle)	EGDA	2	10	3,3
T. maritima WT	EGDA	2	10	9,9
T. marítima C277S	EGDA	2	10	13,6
T. maritima C277T	EGDA	2	10	22,9
T. neapolitana WT	EGDA	2	10	6,6
T. neapolitana C277S	EGDA	2	10	18,4
T. neapolitana C277T	EGDA	2	10	20,2

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Claims

Reivindicações

1. FORMULAÇÃO, usada como um primeiro componente em um sistema de geração de perácido multicomponente, caracterizada pela dita formulação compreender uma mistura de:

(a) pelo menos um éster de ácido carboxílico selecionado do grupo que consiste em monoacetina, diacetina, triacetina, monopropionina, dipropionina, tripropionina, monobutirina, dibutirina, tributirina, e misturas dos mesmos;

(b) um pó de enzima que compreende pelo menos uma enzima estruturalmente classificada como uma enzima CE-7 e que tem atividade de peridrólise, selecionada do grupo que consiste em enzimas de T. maritima e T. neapolitana possuindo SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:19 e SEQ ID NO:20, pelo menos um excipiente, selecionado do grupo que consiste em maltodextrina, trealose, xilana, manana, fucoidana, galactomanana, quitosana, rafinose, estaquiose, pectina, inulina, levan, graminana, amilopectina e misturas dos mesmos;

(c) pelo menos um tampão, sendo que o dito pelo menos um tampão é tampão de bicarbonato de sódio, que aumenta a estabilidade de dita pelo menos uma enzima quando presente na dita formulação.
2. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o pelo menos um excipiente ser um excipiente de oligossacarídeo que tem um peso molecular médio numérico de pelo menos cerca de 1250 e um peso molecular médio ponderal de pelo menos cerca de 9000.
3. SISTEMA DESINFETANTE, caracterizado por compreender um primeiro componente e um segundo componente, dito primeiro componente compreendendo a formulação, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, e dito segundo componente

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2/2 compreendendo uma fonte de peroxigênio em água e um estabilizante de peróxido de hidrogênio.
4. FORMULAÇÃO PARA CUIDADO DE ROUPAS, caracterizada por compreender um primeiro componente e um segundo componente, dito primeiro componente compreendendo a formulação, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 2, e dito segundo componente compreendendo uma solução aquosa de peróxido de hidrogênio e um estabilizante de peróxido de hidrogênio.