Verfahren zur Herstellung von Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure Gegenstand der Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung von Desacetyl-7-amino-cephalosporan- säure. Diese Verbindung ist ein wertvolles Ausgangs produkt für die Herstellung von therapeutisch verwend baren Desacetyl-7-acylamino-cephalosporansäuren, wie z.B. O-Desacetyl-O-(p - chloräthylcarbamoyl)-7 - [N' - (ss- -chloräthyl)-ureido]-cephalosporansäure.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch ge kennzeichnet, dass man Mikroorganismen der Klassen Schizomycetes oder Fungi auf wässrige Lösungen von 7-Amino-cephalosporansäure einwirken lässt und die Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure in fester Form aus der Lösung ausscheidet.
Es ist bekannt, dass Cephalosporin C durch Mikro organismen desacetyliert werden kann. Dieses Verfahren liefert aber nur sehr geringe Ausbeuten, so dass es prak tisch ohne Bedeutung ist. Im Gegensatz dazu ergibt das erfindungsgemässe Verfahren, bei dem nicht Cephalo- sporin C, sondern 7-Aminocephalosporansäure verwen det wird, sehr gute Ausbeuten, nämlich 50-100% der Theorie. Es bedeutet daher einen überraschenden tech nischen Fortschritt.
Zur Desacetylierung von 7-Amino-cephalosporan- säure sind vor allem Actinomyceten, insbesondere Stämme der Gattung Streptomyces, Nocardia und Mi- cromonospora, geeignet.
So lässt sich das Verfahren bei spielsweise mit Stämmen folgender Arten durchführen: Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces fradiae, Streptomyces griseus, Streptomyces griseoflavus, Strepto- myces prasinus, Streptomyces flaveolus.
Man lässt in der Regel die Zellmasse der Mikro organismen (die man durch Züchtung in üblicher Weise erhalten hat), auf eine wässrige Lösung von 7-Amino- cephalosporansäure bei Temperaturen von 20-37 C, vor zugsweise 27 C, einwirken und inkubiert solange, bis die 7-Amino-cephalosporansäure ganz oder grösstenteils in Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure übergeführt ist. Dies ist im allgemeinen nach 15-24 Stunden der Fall. Während der Inkubation wird das pH in der Regel bei 6,5 bis 7,5, vorzugsweise zwischen 6,9 und 7,3, gehalten.
Nach beendigter Reaktion filtriert man üblicherweise die Zellmasse ab, wäscht sie mit Wasser nach und engt die vereinigten Filtrate auf ein kleines Volumen ein. Beim Eindampfen wird im allgemeinen das pH bei ca. 7 ge halten. Die konzentrierte Lösung soll in der Regel einen Gehalt an Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure von 5-10 % haben. Sie kann langsam auf ein pH von 3,5 bis 4,5, vorzugsweise 4,2, gebracht werden. Vom pH 5,0 an beginnt die Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure aus zufallen. Man kühlt im allgemeinen die Lösung auf 0 C und lässt sie bei dieser Temperatur einige Zeit (1-3 Stun den) stehen.
Dann trennt man die ausgefallene Desace- tyl-7-amino-cephalosporansäure ab, beispielsweise durch Filtration oder durch Zentrifugieren, und wäscht sie mit Eiswasser.
In den nachfolgenden Beispielen sind die Tempera turen in Celsiusgraden angegeben.
Die dünnschichtchromatographische Prüfung der Überführung von 7-Amino-cephalosporansäure in Des- acetyl-7-amino-cephalosporansäure erfolgt an Silicagel im System n-Butanol-Eisessig-Pyridin-Wasser (15:3: 10:12). Die Laufzeit beträgt bei 25 C ca. 3 Stunden. Die Chromatogramme werden mit Ninhydrin-Collidin- Lösung (0,938 g Ninhydrin, 28 ml 2,4,6-Collidin, 700 ml Äthanol, 210 ml Eisessig) entwickelt.
Nach dem Besprü hen mit der Lösung hält man 5 bis 10 Min. bei 90 . 7- -Amino-cephalosporansäure hat einen Rf-Wert von 0,43, Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure Rf = 0,37. Die Mikroorganismen sind unter der angegebenen Bezeich nung an der Eidgenössischen Technischen Hochschule, Institut für spezielle Botanik, sowie in unseren Labora torien hinterlegt.
Die Mikroorganismen werden unter submersen Bedingungen bei 27 während 72 Stunden auf folgender Nährlösung gezüchtet: Glucose 5 g Rohrzucker 10 g Bacto-Trypton 5 g Hefeextrakt 2,5 g Leitungswasser ad. 1000 ml <I>Beispiel 1</I> 5 g 7-Amino-cephalosporansäure werden in einem mit Rührer und Glaselektrode versehenen 1-Liter-Ge- fäss in 400 ml Wasser aufgeschlemmt. Hierauf wird eine frisch bereitete gesättigte Kaliumbicarbonatlösung trop fenweise unter Rühren zugegeben, bis ein pH-Wert von 7 erreicht wird.
Zu der so erhaltenen klaren Lösung fügt man 100 g feuchtes Mycel, das man durch Züchtung von Streptomyces fraveolus A 28213 gewonnen und mehr mals mit destilliertem Wasser gewaschen hat. Die Auf- schlemmung wird bei Raumtemperatur ca. 15 Std. mäs- sig gerührt. Während dieser Zeit wird das pH zwischen 6,9 und 7,3 gehalten, indem man nötigenfalls 2-n. Na tronlauge oder 2-n. Salzsäure zufügt. Durch Dünn schichtchromatographie stellt man fest, wann die Des- acetylierung beendet ist.
Dann filtriert man das Mycel ab und wäscht es zweimal mit destilliertem Wasser nach. Die vereinigten Filtrate werden bei 25-30 und pH 7 im Hochvakuum auf 50 ml eingeengt. Das Konzentrat wird unter Rühren und pH-Kontrolle mittels Glaselektrode tropfenweise mit Eisessig versetzt, bis ein pH-Wert von 4,2 erreicht ist. Hierauf kühlt man auf 0 und lässt eine Stunde bei 0 stehen. Dann filtriert man die körnig aus gefallene Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure ab und wäscht sie mit wenig Eiswasser. Falls der Niederschlag sehr feinkörnig ist, wird er abzentrifugiert. Das Filtrat bzw. Zentrifugat wird getrocknet.
Ausbeute: 3 g Desace- tyl-7-amino-cephalosporansäure.
Der erwähnte Stamm von S. flaveolus (Waksman), Waksman et Henrici (Bergey Manual of Determinative Bacteriology , Baltimore, 6. Aufl. [1948], S. 936), bil det ein aschgraues Luftmycel; die Tresner-Danger-Reak- tion ist negativ; auf peptonhaltigem Nährboden wird kein Melanin gebildet.
Sporen mit bis 1 #t langen, feinen, zerbrechlichen Haaren, Sporenketten in ziemlich kur zen, regelmässigen Spiralen, monopodial verzweigt, mit langer gerader Hauptachse.
<I>Beispiel 2</I> 1 g gut gewaschenes feuchtes Mycel des Stammes A 28759 von Streptomyces viridochromogenes (Krains- ky), Waksman et Henrici (Bergey, 1.c. S. 942), wird in 2 ml 0,05 mol. Phosphatpuffer vom pH 7, der 2 mg 7-Amino-cephalosporansäure enthält, vermischt und 24 Std.
bei 27 inkubiert. Anschliessend wird das Mycel abzentrifugiert und die klare Lösung dünnschichtchro- matographisch geprüft. Die 7-Amino-cephalosporansäure ist vollständig in Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure übergeführt. Der Stamm hat folgende Kennzeichen: Sporen rundlich-ellipsoid oder länglich-oval, 0,4-1,3 X 0,3-1,0 R, gross, mit meist 0,2-0,4 p, langen, selten ca. 1 messenden, steifen Stacheln besetzt.
Luftmycel anfangs schneeweiss, weissgelb oder weiss- grau, in ausgereiftem Zustande hellblau oder himmel blau bis graublau (azureus); meist wollig.
Sporenketten in mehr oder weniger offenen, regel- mässigen Spiralen von oft bis zu 10 Windungen, selte ner in kurzen Schleifen; monopodial verzweigt und di rekt aus dem Substrat auswachsend oder an sterilen Lufthyphen gegenständig oder wechselständig entstehend.
Melaninbildung auf peptonhaltigen Nährmedien und positive Tresner-Danga-Reaktion.
Lässt man den genannten Stamm unter den gleichen Versuchsbedingungen auf Cephalosporin C einwirken, so kann papierchromatographisch weder Cephalosporin C noch Desacetyl-cephalosporin C nachgewiesen wer den.
<I>Beispiel 3</I> 7-Amino-cephalosporansäure wird wie in Beispiel 2, jedoch unter Verwendung von Mycel des Stammes A 30498 von Streptomyces fradiae (Waksman et Cur- tis), Waksman et Henrici (Bergey, 1.c._ S. 954), desace- tyliert.
Der Stamm hat folgende Kennzeichen: Sporen glatt. Luftmycel dunkelrot-zimtbraunbräun- lichgrau. Sporenketten in offenen, regelmässigen Spira len von meist mehr als 5 Windungen; monopodial ver zweigt, mit langer, gerader Hauptaches. Keine Melanin bildung.
<I>Beispiel 4</I> Wenn man 7-Amino-cephalosporansäure, wie in Bei spiel 2 beschrieben, jedoch unter Verwendung von My- cel des Stammes A 27744 von Streptomyces lavendulae (Waksman et Curtis), Waksman et Henrici (Bergey, <B>1.e.</B> S. 944), behandelt, wird 50 % des Ausgangsmaterials in Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure übergeführt.
Der Stamm hat folgende Kennzeichen: Sporen glatt. Luftmycel blasskarmin-zimtbraun. Spo- renketten monopodial verzweigt; kurze offene, unregel- mässige Spiralen erst an den Enden langer, gerader Stük- ke; Melaninbildung.
<I>Beispiel 5</I> 7-Amino-cephalosporansäure wird vollständig in die Desacetylverbindung übergeführt, wenn man nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren das Mycel folgen der Stämme auf sie einwirken lässt: 1. Streptomyces griseus Waksman et Henrici (Proc. Nat.Acad.Sc. 45, 10 [1959]), Stamm A 28613.
Kennzeichen: Sporen glatt. Luftmycel gelblichgrün- lichgrau. Sporenketten meist stark gewellt; sympodial verzweigte Büschel mit kurzer Hauptachse. Keine Mela- ninbildung.
2. Streptomyces griseoflavus (Krainsky) Waksman et Henrici (Bergey, 1.c. S. 948), Stamm A 25189. Kennzeichen: Sporen mit 0,2-0,3;#t langen, an der Basis leicht verbreiterten Stacheln. Luftmycel aschgrau. Sporenketten in offenen, regelmässigen Spiralen; mono- podial verzweigt, mit langer, gerader Hauptachse. Keine Melaninbildung.
3. Streptomyces prasinus Ettlinger et a1. (Arch. Mi- krobiol. <I>31, S.</I> 343 [1958]), Stamm A 25708.
Kennzeichen: Luftmycel anfänglich grasgrün, später dunkelgrün, keine Melaninbildung, negative Tresner- Danga-Reaktion. Sporen mit kurzen bis 0,2:i langen, an der Basis wenig verbreiterten Stacheln. Sporenketten monopodial verzweigt, mit langer, gerader Hauptachse, in offenen, kurzen Spiralen von meist nur 1-2 Windun gen.
<I>Beispiel 6</I> Das durch Zentrifugieren einer Kultur von Strep- tomyces violaceoruber A 31529 (Waksman et Curtis) Kutzner et Waksman 1959, J. of Bacteriol. <I>78,</I> Seite 539 (l959) gewonnene feuchte Zellsediment wird im Verhält nis 1 : 3 (Vol. :
Vol.) mit 0,05-m. Phosphatpuffer nach Sörensen vom pH 7 mit 1 /00 7-Amino-cephalosporan- säure vermischt. Von der so erhaltenen Suspension wer den 3 ml 24 Stunden bei 27 in einem 50 ml-Erlen- meyerkolben geschüttelt. Dann trennt man das Mycel ab. In der klaren Lösung wird die Desacetyl-7-ami- no-cephalosporansäure dünnschichtchromatographisch nachgewiesen.
In gleicher Weise erhält man Desacetyl-7-amino-ce- phalosporansäure, wenn man das Mycel der folgenden Actinomyceten-Stämme zur Desacetylierung verwendet: Thermoactinomyces vulgaris, Tskiklinsky, 1899, Stamm A 31509, Ann.Inst.Pasteur <I>13,</I> 500, (1899); vgl.
Küster E. and R. Locci, Internat.Bull.Bact.Nomencl. Taxon 14, (3) 109 (1964); Streptomyces thermovulgaris, Henssen 1957, Stamm A 24178, Arch. Mikrobiol. 26, 373 (1957), Stamm Hens- sen R 35;
Actinopycnidium species Stamm A 28904, isoliert aus Bodenproben von Plantation de manioc, savane, konii, coll. 12.9.61 auf Salzmedium. Actinopycnidium vgl. Krassilnikov, N.A. Mikrobiologija 31, 250 (1962); Micromonospora species Stamm A 20242; Herkunft:
NRRL B-944; vgl. Orstov, J. Investigations into the mor- phology of the ray Fungi Inaug. Diss. Kopenhagen: Levin and Munksgaard 1923; Nocardia petroleophila, Hirsch et Engel 1956, Stamm A 28400 (Hirsch P. and H.
Engel, Ber. deutsch.bot.Ges. 69, 441 (1956); Streptosporangium roseum, Couch 1955, Jour. Eli- stra Mitchell Scientific Soc. <I>71,</I> 148 (1955), Stamm ATCC 12428;
Thermopolyspora polyspora, Henssen 1957, Stamm A 31521, vgl. A. Henssen 1957, Arch. Mikrobiol. 26, 373 (1957); Thermopolyspora polyspora, Henssen 1957, Stamm A 31524, vgl. A. Henssen 1957, Arch. Mikrobiol. 26, 373 (1957); Thermopolyspora polyspora, Henssen 1957, Stamm A 31525, vgl.
A. Henssen 1957, Arch. Mikrobiol. 26, <B>373(1957),</B> Thermopolyspora polyspora, Henssen 1957, Stamm A 31526, vgl.
A. Henssen 1957, Arch. Mikrobiol. 26, 373 (1957); Thermopolyspora glauca, Corbaz et a1. 1963 Stamm A 31533, Corbaz R., P.H. Gregory and M.E. Lacey, J. gen. Mikrobiol. 32, 449 (1963).
Die Stämme werden in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet. <I>Beispiel 7</I> Mycobacterium tuberculosis var. BCG wird in be kannter Weise auf Sauton-Medium gezüchtet und das feuchte Zellsediment, wie in Beispiel 6 beschrieben, mit 7-Amino-cephalosporansäure zur Reaktion gebracht. Man erhält Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure in 80%iger Ausbeute.
In gleicher Weise kann auch Mycobacterium phlei zur Desacetylierung von 7-Amino-cephalosporansäure verwendet werden. Dieses Bakterium kann z. B. in fol gender Nährlösung gezüchtet werden: Glucose 5,0 g Pepton 5,0 g Fleischextrakt 5,0 g Na2HPO,, 12 HGO 1,0 g 112O deion. ad 1000 ml Das p11 wird vor dem Sterilisieren mit Kalilauge auf 7,5 eingestellt; nach 20-minütigem Autoklavieren bei 121 beträgt es 7,0.
<I>Beispiel 8</I> Verschiedene Stämme der Gattungen Cephalosporium und Aspergillus werden gezüchtet und das feuchte Zelt sediment, wie in Beispiel 6 beschrieben, mit 7-Amino- cephalosporansäure zur Reaktion gebracht. Die Desace- tyl-7-amino-cephalosporansäure wird dünnschichtchroma- tographisch nachgewiesen.
Zur Züchtung verwendet man folgende Nährlösung: Saccharose 10,00 g Pepton 1,00 g MgSO, .711.0 0,30 g KH2POk 1,00 g NaCl 0,01 g CaCl,, 0,10 g FeC13 0,01 g MnCl. 0,02 g ZnSO, 1,00 g CUSO, 0,10 g H.,0 deionisiert ad 1000 ml p11 vor Sterilisation mit KOH/HCl 4,6-4,8 Autoklavieren 20', 115 p11 nach Sterilisation 4,5-5,
0 <I>Beispiel 9</I> 60 g 7-Amino-cephalosporansäure (75%ig) werden in einem 3-Liter-Gefäss, das mit Glaselektrode und Rührer versehen ist und sich in einem Wasserbad von 35 befindet, in 1200 ml deionisiertem Wasser aufge schlämmt. Unter Rühren gibt man 2-n. Natronlauge hin zu, bis ein pH-Wert von 7,2-7,5 erreicht ist. Dann ver setzt man die klare Lösung mit 15 g Zell-Lyophilisat von Bacillus subtilis ATCC 6633 und rührt die Suspen sion 4 Stunden bei 35 . Durch Zugabe von 2-n.
Natron lauge wird das p11 während dieser Zeit ständig zwi schen 7,2 und 7,5 gehalten. Mittels Dünnschichtchroma- tographie kontrolliert man den Verlauf der Desacetylie- rung. Nach beendeter Reaktion wird die Suspension auf 20 abgekühlt und unter Rühren mit 1200 ml Methanol und 30 g Hyflo versetzt. Man saugt die Suspension über weiteren 60 g Hyflo ab und wäscht den Filterkuchen mit 200 ml Methanol-Wasser (1 : 1). Das Filtrat wird im Rotationsverdampfer auf ca. 1200 ml eingeengt.
Zu dem so erhaltenen Konzentrat gibt man unter Rühren konzentrierte Salzsäure, bis ein p11 von 4,2 erreicht ist. Dabei fällt die Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure feinkörnig aus. Nach 2stündigem Stehen bei 0 saugt man den Niederschlag ab, wäscht ihn mit 50 ml Wasser und dreimal 100 ml Methanol-Wasser (2: 1) und trock net bei 35-40 im Vakuumschrank. Man erhält 32,6 g Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure.
Das Zell-Lyophilisat wird wie folgt hergestellt: 300 Liter einer 24stündigen Kultur von Bacillus sub- tilis ATCC 6633 in Glucosebouillon werden auf 4 ab gekühlt und zentrifugiert. Man erhält 2,8 kg feuchtes Sediment. Dieses homogenisiert man mit 1,4 Liter deio- nisiertem Wasser. Die erhaltene Suspension versetzt man unter Rühren mit 14 Liter Aceton und rührt noch 30 Minuten weiter. Dann lässt man die Suspension 15 Stun den bei 0-5 stehen, giesst die überstehende Lösung ab und filtriert.
Der Filterrückstand wird mit 2 Liter Ace- ton-Wasser (4: 1) und zweimal mit 2 Liter Aceton ge waschen. Dann rührt man den Filterrückstand (2,7 kg) 3 Stunden bei 20-25 , zentrifugiert, homogenisiert den Zentrifugenrückstand (2,24 kg) mit 2,2 Liter deionisier- tem Wasser und lyophilisiert.
Man erhält 360 g Lyophilisat in Form eines grauen Pulvers.