ES2272115B1 - Produccion de formas quimericas de cefalosporina c acetilasa. - Google Patents
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Abstract
Producción de formas quiméricas de cefalosporina
C acetilasa.
Un procedimiento para producir una Cefalosporina
C acetilasa de Bacillus subtilis y su utilización para la
síntesis de derivados desacetilados de cefalosporinas. El
procedimiento incluye la creacción de una secuencia inédita del gen
del Bacillus subtilis mediante combinación de la secuencia de
nucleótidos correspondiente a la región de unión del sustrato de la
cepa ATCC 6633 con la secuencia de nucleótidos correspondiente a la
región catalítica de la cepa 168. Asimismo, el procedimiento
describe la traducción y sobreexpresión de dicha secuencia de
nucleótidos en una proteína híbrida con actividad cefalosporina C
acetilasa, a un nivel por encima del 65% de las proteínas de la
célula hospedante. Finalmente, se incluye un procedimiento para su
aislamiento de los medios y para generar derivados desacetilados de
cefalosporinas a partir de formas inmovilizadas de dicha enzima
quimérica.
Description
Producción de formas quiméricas de cefalosporina
C acetilasa.
Un procedimiento para producir una Cefalosporina
C acetilasa de Bacillus subtilis y su utilización para la
síntesis de derivados desacetilados de cefalosporinas.
La presente invención, se encuadra
principalmente en el área de biotecnología y más específicamente en
el área de la tecnología enzimática. La presente invención describe
la clonación de una cefalosporina C acetilasa (CCA) quimérica a
partir de las mitades estructurales de dicho gen obtenidas a partir
de dos cepas distintas de Bacillus subtilis, una mitad
N-terminal con el dominio de unión de substrato y
otra mitad C-terminal con el dominio catalítico; su
sobreexpresión en células huésped compatibles con el vector de
expresión; su aislamiento; y su uso para la preparación de
desacetil-cefalosporinas, que son usadas como
compuestos de partida en la obtención de cefalosporinas
semisintéticas con capacidad antibiótica.
Las desacetil-cefalosporinas son
compuestos de partida de gran importancia comercial en la
preparación de antibióticos \beta-lactámicos
semisintéticos. Estos se obtienen fundamentalmente a partir de
cefalosporina C o del ácido 7-aminocefalosporánico
(7-ACA) mediante procesos químicos o enzimáticos.
La hidrólisis química del resto acetilo de la posición 3 de las
cefalosporinas da un bajo rendimiento ya que, a pH básicos, el
doble enlace de la posición 3 del anillo
\beta-lactámico migra a la posición 2 (Morin R.
B. et al., 1969, J. Am. Chem. Soc. 91:
1401-1407), y a pH ácidos, se produce una reacción
irreversible de lactonización entre el
3-hidroximetil y el grupo
4-carboxilo adyacente (Kukolja, S., 1968, J.
Med. Chem. 11: 1067-1069). Por tanto, la
hidrólisis enzimática a pH 7.0 se ha convertido en el método más
efectivo para preparar estos desacetil derivados con alto
rendimiento.
El uso de esterasas para producir
desacetil-cefalosporinas fue primeramente
demostrado con la acetil esterasa de la corteza de cítricos
(Jeffrey et al., 1961, Biochem. J. 81:
591-596; US 3,202,656; EP 0 109 300).
Posteriormente, otras esterasas y lipasas (Carrea et al.,
1996, Biotechnol. Bioeng. 52: 648-652) han
sido publicadas y patentadas con la habilidad de desacetilar
compuestos \beta-lactámicos. Entre los
microorganismos donde ha sido encontrada esta actividad esterasa
están Aureobasidium (EP 0 044 736), Actinomycetes
(Demain et al., 1936, J. Bacteriol. 35:
339-344; EP 1 170 369; Cardoma et al., 2000,
Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 406-412),
Schiromycetes (US 3,239,394), Rhizobium (US
3,436,310), Rhodospiridium toruloides (GB 2,060,610;
Politino et al., 1997, Appl. Microbiol. 30:
413-419), Rhodotorula rubra (GB 1 474 519) y
algunas especies de Bacillus (WO 99/55881). Dentro de este
último género, se han descrito varias cepas de B. subtilis
en la bibliografía, pero en concreto B. subtilis SHS 0133 ó
tipo 168 (EP 0 454 478) y B. subtilis ATCC 6633 (WO
99/38982) son de especial interés industrial en sus formas clonadas
y sobreexpresadas en Escherichia coli. Sin embargo, no ha
sido posible hasta la fecha combinar en una sola secuencia de
nucleótidos codificando actividad cefalosporina C acetilasa o
desacetilasa una alta capacidad catalítica con una alta expresión
para de esa manera hacer rentable su explotación industrial.
Es por tanto objetivo de esta invención generar
una secuencia de nucleótidos que codifique la secuencia de
aminoácidos de una cefalosporina C acetilasa quimérica, que
comparta la alta expresión con la alta actividad catalítica, a
partir de las mitades N-terminal y
C-terminal de las dos cepas de B. subtilis
antes mencionadas. Es otro objetivo de la presente invención el
desarrollo de vectores, en concreto de vectores de expresión que
contengan la secuencia de nucleótidos de dicha quimera, y células
huésped en las que se exprese dicho vector. Es otro objetivo
adicional de la presente invención, generar el proceso de
producción y aislamiento de dicha cefalosporina C acetilasa
quimérica desde los cultivos de células huésped. Por último, es un
objetivo de la presente invención describir un proceso de
preparación de
3-desacetil-cefalosporinas mediante
el uso de dicha cefalosporina C acetilasa quimérica.
La cefalosporina C Acetilasa (CCA) del
microorganismo Bacillus subtilis contiene en su estructura
un dominio catalítico con la secuencia
Gly-X-Ser-X-Gly
similar a la encontrada en serín proteasas, esterasas y lipasas,
siendo considerada como una serín esterasa.
Esta invención describe la construcción de una
CCA quimérica activa que está compuesta por la combinación de dos
mitades estructurales funcionalmente diferenciadas entre sí; donde
la primera mitad estructural corresponde a la primera mitad
estructural de la serín esterasa de una primera cepa de B.
subtilis, y una segunda mitad estructural que corresponde a la
segunda mitad estructural de la serín esterasa pero de una segunda
cepa de B. subtilis.
De acuerdo con la invención se entiende como
primera mitad estructural a la mitad estructural en la cual está
localizado el extremo N-terminal y como segunda
mitad estructural la mitad estructural en la cual está localizado
el extremo C-terminal.
La CCA quimérica de esta invención es una
quimera de cualquier cepa o mutante natural o artificial de B.
subtilis que contenga actividad CCA. Una característica de esta
invención es que la primera secuencia contiene la secuencia de
aminoácidos de la zona de unión al sustrato de dicha serín
esterasa. En una realización preferida, la primera secuencia que
contiene la región aminoacídica de unión al sustrato pertenece a la
secuencia aminoacídica comprendida entre los aminoácidos 1 y 141
(el número de la secuencia de aminoácidos corresponde a la
publicación de Yamane, K. et al., 1996, Microbiology
142: 3047-3056) de B. subtilis ATCC 6633.
Preferiblemente la segunda secuencia tiene una secuencia de
aminoácidos que contiene el dominio y la triada catalítica de la
serín esterasa comprendida entre los aminoácidos 142 y 318 (el
número de la secuencia de aminoácidos corresponde a la publicación
anteriormente citada de Yamane, K. et al., 1996).
En la presente invención, la proteína quimérica
tiene una secuencia de nucleótidos correspondiente a SEQ ID NO. 2 y
una secuencia de aminoácidos correspondiente a SEQ ID NO. 1. La
proteína quimérica de esta invención puede ser obtenida mediante
síntesis química o por biología molecular. Tales técnicas son
conocidas en el arte. Cuando se hace mediante técnicas de ADN
recombinante, primero se construye un vector de expresión que
contenga el gen que codifica la proteína quimérica y que es capaz
de expresarla, y luego se transforma o transfecta en una célula
huésped procariota o eucariota. Tales técnicas son bien conocidas
por los expertos. Ver por ejemplo Sambrook J. et al. (1989)
en "Molecular cloning: A laboratory Manual" (Cold Spring Harbor
Laboratory Press); y Sambrook J. y Russel, D. W. (eds.) (2001) en
"Molecular cloning: A laboratory Manual 3^{th} Ed". (Cold
Spring Harbor Laboratory Press). Esta invención también
proporciona un proceso para producir la proteína quimérica de esta
invención de manera recombinante, que consiste en expresar la
proteína en una célula huésped que contiene un vector de expresión
con la secuencia de nucleótidos que codifica dicha proteína, donde
la expresión de dicha secuencia de nucleótidos está bajo el
control de un elemento de control transcripcional, y por último el
aislamiento de la proteína expresada. Particularmente útiles como
vectores de expresión pueden ser, por ejemplo,
pKK223-2 (GenBank Access No M77749) o pK19
(Pridmore, R., D., 1987, Gene 56: 309-312), que
contienen un promotor adecuado para ser funcional en la célula
hospedante (por ejemplo Lac, Tac, Trc, Trp o P1) y una zona de
unión al ribosoma (secuencia RBS o SD). Es
particularmente preferido en esta invención un vector conteniendo
el promotor de la ARN polimerasa del bacteriofago T7 (abreviada de
aquí en adelante como T7 ARN polimerasa) y que contenga múltiples
sitios de clonaje, tales plásmidos son conocidos como pT o pET y
fueron descritos por Studier F. W. y Moffatt B.A. (1986, J. Mol.
Biol. 189: 113-130). Estos últimos se pueden
obtener comercialmente de Novagen (Madison, Wisconsi, USA). Los
vectores pET se clasifican en series desde pET 3 hasta pET 46,
siendo particularmente preferidos en esta invención los de la serie
pET 28 debido a que incluyen resistencia al antibiótico kanamicina,
no interfiriendo con el método de medida de actividad de la enzima.
El plásmido pET28a es particularmente preferido.
Células hospedantes típicas para dichos vectores
de expresión son cepas bacterianas como por ejemplo Escherichia
coli y preferiblemente aquellas que son lisógenas del
bacteriófago \lambdaDE3, ya que contiene al gen de la ARN
polimerasa del bacteriófago T7 bajo el control de un promotor
inducible LacUV5. En este sistema, la adición de
isopropiltiogalactosa (IPTG) al cultivo induce la transcripción de
la polimerasa, la cual a su vez comienza a transcribir la secuencia
clonada en el plásmido. Un gran número de cepas de E. coli
compatibles con dicho sistema de expresión están disponibles
comercialmente, incluyendo DH5\alpha, las cepas HMS174(DE3)
y las lisogénicas BL21(DE) y sus derivadas. Entre estas
últimas cepas, BL21(DE)Lys es particularmente
preferida con los plásmidos pET, y en concreto la cepa Rosetta,
derivada de BL21(DE3)Lys, es particularmente preferida
en esta invención.
Después de la inducción de la T7 ARN polimerasa,
la cepa de E. coli se crece durante un tiempo bajo las
condiciones suficientes para producir la proteína sobreexpresada en
el cultivo. Cualquier tipo de medio sólido o liquido que permita el
crecimiento y reproducción de E. coli será útil para
desarrollar el método de esta invención, pero el medio liquido es
preferido por facilitar el aislamiento de las proteínas
sobreexpresadas. Son conocidos por el experto en la materia,
numerosos medios de cultivo bacteriano, y una ventaja de la presente
invención es que E. coli es relativamente fácil y barata de
crecer. Los medios de cultivo típicos incluyen ambos medios mínimos
y ricos. Entre los medios ricos están el medio LB, el NZL, el
superbroth, el TY, el TYGPN y el TB. Los medios preferidos en esta
invención son LB y TB.
Después del crecimiento de los cultivos, las
células de E. coli son usualmente lisadas mediante
"shocks" osmótico, sonicación, perlas de cristal u otras
formas establecidas y la serín esterasa quimérica expresada es
aislada de la fracción soluble. Cualquier método de purificación de
proteínas puede ser usado para dicho propósito, como diálisis,
ultrafiltración, nanofiltración, cromatografia de intercambio
iónico o de afinidad o combinación de varios de estos métodos.
Según una realización preferida de la presente invención, la
fracción soluble obtenida después de centrifugación y decantación
de la fase acuosa de los restos celulares es la eliminación de los
ácidos nucleicos con un polianión como polietilenimina (PEI) y
posterior concentración por ultrafiltración tangencial sobre
membranas con un corte molecular de 10000 Daltons, que son
fácilmente disponibles comercialmente.
Una ventaja de esta invención es que la T7 ARN
polimerasa sintetiza ARN a una velocidad varias veces mayor que la
ARN polimerasa de E. coli y termina la transcripción con
menor frecuencia. Además la T7 ARN polimerasa es altamente
selectiva para su propio promotor y no inicia la transcripción de
secuencias de DNA de E. coli, de esta manera la expresión de
la serín esterasa quimérica puede ser maximizada.
Otra ventaja de la presente invención es que,
bajo condiciones óptimas, pueden ser alcanzados
extraordinariamente altos rendimientos de proteína expresada. Por
ejemplo en la práctica de la invención, la CCA quimérica se acumula
por encima del 50% de la proteína bacteriana total en el cultivo.
Una característica preferida de esta invención es que la CCA
quimérica se acumula por encima del 65% de la proteína bacteriana
total.
Sorprendentemente, en la presente invención la
quimera producida, al contrario de las serín esterasas iniciales y
debido a su alta expresión comparada con el resto de las proteínas
de E. coli, es muy fácil de purificar, permitiendo así una
producción económica a gran escala de la misma para su uso
industrial. En otra característica de la invención, la forma
quimérica de CCA puede ser empleada en forma libre, o también puede
ser inmovilizada en soportes sólidos, los cuales son de gran
utilidad industrial para los procesos de bioconversión de
cefalosporinas naturales o sintéticas que contengan en su posición
3 un grupo acetoximetil, en particular el ácido
7-amino cefalosporánico (7-ACA),
cefalosporina C o cualquier acil derivado de 7-ACA.
Compuestos usados de forma preferible en esta invención son
7-ACA y cefalosporina C, que son convertidos en el
ácido
7-amino-3-desacetil
cefalosporánico (7-DACA) y
3-desacetil cefalosporina C. Las condiciones de
reacción son familiares para un especialista y corresponden a las
descritas para la acción de una cefalosporina C acetilasa nativa
(no recombinante) (ver por ejemplo las descritas por Fujisawa Y.
et al., 1973, Nat. New Biol. 246:
154-155).
Esta invención será detallada a continuación,
mediante los siguientes ejemplos ilustrativos, que en ningún caso
limitarán el alcance de la misma. En particular, los ejemplos están
relacionados con las caracteristicas preferidas de la presente
invención.
El ADN genómico de dos cepas de B.
subtilis (cepa 168 y ATCC 6633) se aisló por métodos estándar
(DNeasy system, Qiagen, Valencia, CA, USA) o cualquier otro método
fiable, y se usó como molde para la reacción de PCR (reacción en
cadena de la polimerasa) llevada a cabo según el método estándar
(Thamomsub, B. et al., 1995, Microb. Util. Renewable
Resour. 9: 395-399). Oligonucleótidos cebadores
(primer) fueron diseñados basándose en la secuencia nucleotidica
del gen CCA de B. subtilis (Yamane, K. et al., 1996,
Microbiology 142: 3047-3056; número de
acceso al NCIB Entrez Nucleotide Database D50453). Los
oligonucleótidos cebadores específicamente diseñados N1 (SEQ ID NO.
3) y N2 (SEQ ID NO. 4)
- N1: 5'-GCGGCCGCATGCAACTATTCGATCTGCCGCTCGAC
- N2: 5'-GCGGCCGCTCAGCCTTTAAGATGCTGCTTAAAGAA
incluyen el sitio de restricción
para el enzima NotI. De este modo puede hacerse uso
posterior del sitio de restricción para dicha enzima que posee el
vector pET28a en el sitio de clonación
múltiple.
Tras la reacción de PCR el producto obtenido se
purifica, se digiere con la enzima de restricción NotI,
obteniendo fragmentos de aproximadamente 957 pares de bases tanto
para el ADN de B. subtilis 168 como para el de B.
subtilis ATCC 6633. Tras estimar la concentración, los dos
productos de PCR fueron ligados en el vector de expresión pET28a
previamente digerido con la misma enzima de restricción
NotI. Los productos de la ligación se transformaron en E.
coli. DH5\alpha, se sembraron sobre placas
LB-agar conteniendo 25 \mug/mL de kanamicina y se
incubaron durante 16 horas a 37ºC. Las colonias resultantes son
analizadas para confirmar la clonación correcta del gen
recombinante de CCA de ambas cepas mediante PCR de colonias y por
análisis de restricción. Los plásmidos considerados positivos, que
se designaron respectivamente como pET28a-BsCCA168 y
pET28a-BsCCA6633, fueron secuenciados, observándose que la
secuencia insertada en pET28a-BsCCA168 corresponde a la
publicada en la patente EP 0 454 478 para cefalosporina C
desacetilasa (número de acceso al NCIB Entrez Nucleotide
Database D10935) y que la secuencia insertada en
pET28a-BsCCA6633 corresponde a la publicada en la patente US
6,465,233 (número de acceso al NCIB Entrez Nucleotide
Database AR236734) para cefalosporina acetilesterasa.
Para la realización de construcciones quiméricas
los genes de CCA clonados anteriormente se decidió fusionar la
mitad N-terminal con el dominio que contiene el
sitio de unión al sustrato de la cepa 168 con la mitad
C-terminal con el dominio catalítico de la cepa ATCC
6633 (construcción 168/6633), y viceversa (construcción 6633/168).
Para conseguir este propósito se introduce una mutación silenciosa
en la secuencia del gen recombinante contenido en el plásmido
pET28a-BsCCA6633 en la posición 426, cambiando citosina por
timina. Esto introduce un nuevo sitio de corte EcoRI sobre
el gen de ATCC 6633 en la misma posición que lo tiene la cepa 168,
para ello se usan los oligonucleótidos cebadores N3 (SEQ ID NO. 5)
y N4 (SEQ ID NO. 6)
\vskip1.000000\baselineskip
EcoRI
- N3: 5'-GGATGACGAAAGGAATtCTTGATAAAGATACATACTATTACC
\newpage
EcoRI
- N4: 5'-GTATCTTTATCAAGAATtCCTTTCGTCATCCAGCCCAAAGC
en los cuales la mutación
introducida va en
minúscula.
La mutación deseada fue introducida mediante
reacción de PCR usando el gen CCA de B. subtilis ATCC 6633
mediante las parejas de cebadores N1/N4 y N2/N3. Tras la PCR se
aislan dos productos amplificados, uno de aproximadamente 430 pares
de bases correspondiente al producto de los cebadores N1/N4; y otro
de aproximadamente 530 pares de bases correspondiente al producto
de los cebadores N2/N3. Dichos fragmentos purificados son ahora
usados como molde para una nueva PCR en presencia de los cebadores
N1 y N2, dando lugar a un nuevo gen de CCA de B. subtilis
ATCC 6633 con un sitio de EcoRI en la posición 426. Este
fragmento es aislado, purificado y digerido con NotI y
ligado al vector pET28a abierto con dicha enzima de restricción,
generando el plásmido pET28a-BsCCA6633Eco. Seguidamente este
último plásmido y el pET28a-BsCCA186 son digeridos con la
enzima de restricción EcoRI dando lugar en ambos casos a dos
fragmentos: uno pequeño de aproximadamente 450 pares de bases que
corresponde al espacio entre el sitio de corte EcoRI del
sitio de clonanación múltiple del vector y el sitio EcoRI
del gen CCA en la porción 425 situado en el extremo 5' del gen; y
un segundo segmento grande de aproximadamente 5900 pares de bases,
que es el extremo 3' del gen más el resto del vector pET28a. La
ligación cruzada de esos 4 fragmentos de ADN nos dará los plásmidos
conteniendo las enzimas quiméricas y que son designadas como
pET28a-BsCCA168/6633 para la quimera que contiene la mitad
5' del gen CCA de 168 y la mitad 3' del gen CCA de ATCC 6633; y
pET28a-BsCCA6633/168 para la que contiene la mitad 5' del gen
CCA ATCC 6633 y la mitad 3' del gen CCA de
168.
168.
Ambos productos de ligación fueron transformados
en células competentes de E. coli DH5a y sembrados sobre
placas LB-agar conteniendo 25 \mug/mL de
kanamicina durante 16 horas a 37ºC. Las colonias resultantes son
estudiadas para confirmar la correcta clonación de ambos genes
quiméricos mediante PCR de colonias y análisis de restricción.
Posteriormente, los genes fueron secuenciados, obteniéndose en el
caso del gen quimérico CCA 6633/168 un fragmento de 957 pares de
bases cuya secuencia de nucleótidos se muestra con SEQ ID NO. 2. La
traducción de dicha secuencia resulta en una proteína de 318
aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO. 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Los plásmidos recombinantes preparados en los
anteriores ejemplos 1 y 2 fueron usados para transformar las
células competentes de E. coli Rosetta (Novagen, Madison, WI,
USA), que es la cepa seleccionada en esta invención para maximizar
la expresión. Dichas células fueron cultivadas en 1000 mL de medio
LB a 37ºC durante 4 horas, siendo entonces inducidas con 0.5 mM de
IPTG durante 12 horas a 22ºC. Las células fueron recolectadas por
centrifugación a 5300 g durante 10 minutos a 4ºC y resuspendidas en
150 mL de tampón fosfato 0.1 M pH 7.0. El contenido de las células
fue liberado mediante homogeneización con perlas de vidrio en un
sistema Bead Beater® (Biospec Products, Bartlesville, OK, USA). El
extracto celular resultante fue de nuevo centrifugado bajo las
condiciones antes citadas y al sobrenadante se le añadió un
policatión (polietilenimina) al 0.1% para poder precipitar los
ácidos nucleicos del extracto. Tras su centrifugación a 5300 g
durante 10 minutos a 4ºC, el sobrenadante es concentrado mediante
ultrafiltración tangencial (corte molecular 10000 Daltons).
La disolución concentrada así obtenida fue
sometida a fraccionamiento con sulfato amónico entre el 30 y el
85%, obteniéndose un extracto enzimático que tras ser dializado es
utilizado como material de evaluación de la expresión génica sobre
7-ACA como sustrato.
Una cantidad fija de enzima parcialmente
purificada según lo descrito anteriormente (300 \mug) de cada uno
de los transformantes de los Ejemplos 1 y 2 fue incubada en
presencia de 7-ACA 75 mM en tampón fosfato 100 mM pH
7.0 a 25ºC en un volumen final de 10 mL durante 30 minutos. La
cantidad de ácido
7-amino-3-desacetilcefalosporínico
(7-DACA) generado fue seguida por HPLC a 254 nm, en
una columna de fase inversa (Zorbax C8, 5 \mum 150 x 4,6 mm), con
una fase móvil compuesta por sulfato ácido de tetrabutilamonio 14
mM fosfato diácido de potásico 15 mM pH 6.5 y un 32% de metanol; y
a un flujo de 1 mL/min.
Bajo esas condiciones de HPLC, los compuestos
\beta-lactámicos desacetilados salen antes
(7-DACA a los 2.4 minutos) y los 3 acetoximetil
\beta-lactámicos después (7-ACA a
los 3.8 minutos). Las actividades expresadas por en cada una de las
construcciones fueron:
\newpage
| Plásmido | \mumoles de 7-ACA | \mumoles de 7-ACA |
| desacetilado/min\cdotmL cultivo | deacetilado/min\cdotmg | |
| de (U/mL) | (U/mg) | |
| pET28a-BsCCA 168 | 4.1 | 7.2 |
| pET28a-BsCCA 6633 | 3.4 | 10.0 |
| pET28a-BsCCA 6633/168 | 70.2 | 32.9 |
| pET28a-BsCCA 168/6633 | 2.1 | 3.7 |
\vskip1.000000\baselineskip
De la tabla anterior se deduce que la CCA
quimérica obtenida del plásmido pET28a-BsCCA 6633/168 es la
más activa (U/mg) de las ensayadas con valores entre 3 y 5 veces
más activa que las parentales. Sorprendentemente, la quimera del
plásmido pET28a-BsCCA 168/6633 tiene significativamente
menor actividad que las parentales, lo que indica que no es obvio
que la generación de quimeras traiga consigo aumento en la
actividad con respecto a las proteínas parentales. Para ver si esta
alta actividad se debía a una alta expresión de la proteína
recombinante del plásmido pET28a-BsCCA 6633/168, se realizó
una electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% en presencia de
SDS. Para ello, se usó el extracto proteico (2 \mug) obtenido tras
la ultrafiltración tangencial de las células de E. coli
Rosetta con y sin el plásmido pET28a-BsCCA 6633/168,
observándose mediante tinción de plata, que las proteínas de E.
coli Rosetta son apenas visibles tras la inducción de la forma
quimérica de CCA 6633/168, siendo esta CCA quimérica la proteína
mayoritaria, constituyendo más del 65% de la proteína total.
Por tanto, la proteína quimérica con actividad
cefalosporina C acetilasa así obtenida, está compuesta por una
primera secuencia de aminoácidos del dominio
N-terminal de unión al substrato de la cefalosporina
C acetilasa de Bacillus subtilis cepa ATCC 6633, y una
segunda secuencia de aminoácidos del dominio
C-terminal donde está el centro catalítico de la
cefalosporina C acetilasa de Bacillus subtilis cepa 168. La
primera secuencia contiene la secuencia de aminoácidos del 1 al
141 del dominio N-terminal, y la segunda secuencia
contiene la secuencia de aminoácidos del 142 al 318 del dominio
C-terminal
La reactividad de la enzima quimérica CCA
6633/168 fue estudiada con dos sustratos de interés industrial, el
T-ACA y la cefalosporina C. La reacción se siguió
mediante HPLC y se llevó a cabo a 252C variando la concentración
de 7-ACA y cefalosporina C entre 0 a 100 mM en
presencia de tampón fosfato 100 mM pH 7.5 ó pH 7.8, que son los pHs
óptimos para 7-ACA y cefalosporina C,
respectivamente. El pH se mantuvo constante mediante la tritiación
del ácido acético liberado por la acción de la enzima en un sistema
tritiador (Tritino STAT 716, Metrohm, Suiza) con una
solución 0.5 M de NaOH. Los resultados obtenidos, tras ser ajustados
los datos a la ecuación de Michaelis-Menten, fueron
los siguientes:
| Sustrato | Km (mM) | Vmax (\mumol/min*mg) |
| 7-ACA | 12.4 | 39.2 |
| Cefalosporina C | 39.2 | 21.5 |
Estos resultados indican que la enzima quimérica
es más activa sobre 7-ACA que sobre cefalosporina
C.
La cepa transformada E. coli Rosetta
conteniendo el plásmido pET28a-BsCCA 6633/168 fue crecida en
200 mL de medio LB hasta alcanzar una densidad óptica a 600 nm de 3.
Momento en que dichas células se utilizan como inoculo de un
fermentador de 2 L (Biostat B, Braun Biotech, Alemania)
conteniendo 1800 mL de medio TB-kanamicina (24 g/L
de extracto de levadura, 12 g/L de bactotriptona, KH_{2}PO_{4}
170 mM, K_{2}HPO_{4} 720 mM, 0.4% de glicerol con 25 \mug/mL
de kanamicina). La fermentación fue mantenida a 37ºC con agitación
(500 rpm), aireación (0.7 v.v.m) y pH (pH 7.0) constantes, hasta
que el cultivo alcanzó la fase logaritmica de crecimiento. En ese
momento se añadió 0.5 mM de IPTG para iniciar la expresión de la
CCA quimérica y se mantuvo 4 horas a 30ºC. Al final de la
fermentación se obtuvieron 20 g de peso seco y 89 U/mL sobre
7-ACA 75 mM en tampón fosfato 100 mM pH 7.0 y 37ºC,
correspondientes a 21 U/mL sobre Cefalosporina C 75 mM bajo las
mismas condiciones.
La enzima obtenida de la fermentación fue
clarificada con 0.1% de polietilenimina y ultrafiltración
tangencial. Esta solución quimérica (30 mL, 12895 U totales sobre
7-ACA) fue mezclada con 8 g de Eupergit C y 20 mL
de tampón fosfato potásico 1 M, pH 8. Después de 64 horas
agitándose suavemente a temperatura ambiente, el soporte fue
separado de la disolución y lavado con tampón fosfato 0.1 M, pH 7.
Finalmente, se obtuvieron 1205 U/g peso seco y se recuperaron 9640
U de las inicialmente puestas.
La enzima inmovilizada del Ejemplo 5 (1 g de
peso seco) fue incubada con 100 mL de 7-ACA 75 mM
en agua y tritiada a pH 7.5 con amoniaco 3 M a temperatura
ambiente. La reacción fue seguida por HPLC hasta la total
conversión de 7-ACA en 7-DACA.
Dicha reacción terminó a los 40 minutos, no dando otros productos
secundarios. La actividad recuperada tras la transformación
enzimática fue de 1203 U/g de peso seco.
El nivel de expresión del plásmido
pET28a-BsCCA 6633/168 en E. coli Roseta puede ser
comparado con otros genes de B. subtilis con actividad CCA,
previamente patentados, en la siguiente tabla:
| 7-ACA | Cefalosporina C | |||
| U/mL | U/mL | U/g peso seco | ||
| EP 0454478 | 7.4 | 7.4 | - - - - | |
| WO 9938982 | - - - - | - - - - | 455 | |
| Esta invención | 89 | 21 | 2100 |
Como se describe anteriormente, la presente
invención permite mediante la generación de una enzima quimérica a
partir de dos mitades estructurales del gen de la Cefalosporina C
acetilasa de dos cepas de B. subtilis, la sobreproducción de
dicha enzima en cantidades suficientemente altas para su aplicación
en la bioconversión de distintos substratos
\beta-lactámicos con grupos acetoximetil en su
posición 3'. Posteriormente se puede aislar el compuesto
\beta-lactámico 3-deacetilado así
obtenido, si se requiere.
La descripción realizada anteriormente tiene el
propósito de mostrar a una persona versada en el tema como llevar a
cabo la presente invención, y no intenta detallar todas aquellas
modificaciones y variaciones obvias de ella, surgidas tras su
lectura. Se entiende, sin embargo, que tales modificaciones y
variaciones obvias están incluidas en el espíritu y objetivo de la
presente invención, tal y como se definen en las reivindicaciones
adjuntas.
<110> Universidad de Murcia
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Producción de formas quiméricas de
cefalosporina C acetilasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> cefalosporina C acetilasa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 318
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de CCA
quimérica 6633/168
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 957
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de nucleótidos de CCA
quimérica 6633/168
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggccgcat gcaactattc gatctgccgc tcgac
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcggccgctc agcctttaag atgctgctta aagaa
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial sequence
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggatgacgaa aggaattctt gataaagata catactatta cc
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<213> Artificial sequence
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtatctttat caagaattcc tttcgtcatc cagcccaaag
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (14)
1. Una proteína quimérica con actividad
cefalosporina C acetilasa, caracterizada porque está
compuesta por una primera secuencia de aminoácidos del dominio
N-terminal de unión al substrato de la cefalosporina
C acetilasa de Bacillus subtilis cepa ATCC 6633, y una
segunda secuencia de aminoácidos del dominio
C-terminal donde está el centro catalítico de la
cefalosporina C acetilasa de Bacillus subtilis cepa 168,
donde la cefalosporina C acetilasa quimérica tiene la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 1.
2. Una proteína quimérica según reivindicación
1, caracterizada porque la primera secuencia contiene la
secuencia de aminoácidos del 1 al 141 del dominio
N-terminal.
3. Una proteína quimérica según reivindicación
1, caracterizada porque la segunda secuencia contiene la
secuencia de aminoácidos del 142 al 318 del dominio
C-terminal.
4. Una secuencia de nucleótidos del gen
quimérico de cefalosporina C acetilasa según la reivindicación 1,
caracterizada porque contiene la secuencia de nucleótidos
mostrada en SEQ ID NO. 2.
5. Una secuencia de nucleótidos del gen
quimérico de cefalosporina C acetilasa según la reivindicación 1,
caracterizada porque su traducción da lugar a la secuencia
de aminoácidos SEQ ID NO. 1.
6. Un vector de expresión compatible con una
célula huésped predeterminada, caracterizado porque contiene
la secuencia de nucleótidos según las reivindicaciones 4 y 5.
7. Un vector de expresión según la
reivindicación 6, caracterizado porque contiene el promotor
de la ARN polimerasa del bacteriófago T7.
8. Una célula huésped caracterizada
porque está transformada por un vector de expresión según las
reivindicaciones 6 y 7.
9. Un procedimiento de producción de la
cefalosporina C acetilasa quimérica según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8 caracterizado porque de los
siguientes pasos:
- a)
- Cultivar bajo condiciones capaces de producir la expresión de la cefalosporina C acetilasa, células huésped transformadas con un vector según la reivindicación 5
- b)
- Expresar la proteína quimérica de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO. 1
- c)
- Recuperar la cefalosporina C acetilasa expresada del cultivo, si se considera necesario.
10. Un procedimiento para la desacetilación de
compuestos \beta-lactámicos, caracterizado
por convertir el compuesto \beta-lactámico que
tiene un grupo acetoximetil en la posición 3 usando la
cefalosporina C acetilasa quimérica, donde la cefalosporina C
acetilasa tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO.
1 y la cual es empleada en forma libre o inmovilizada.
11. Procedimiento según reivindicación 10,
caracterizado porque se aisla el compuesto lactámico
\beta-deacetilado así obtenido.
12. Un procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque el compuesto R-lactámico
con un grupo acetoximetil en la posición 3 es el ácido
7-aminocefalosporánico o un 7-acil
derivado de él.
13. Un procedimiento según la reivindicación 10,
caracterizado porque el 7-acil derivado del
ácido 7-aminocefalosporánico es cefalosporina C.
14. Uso de la cefalosporina C acetilasa
quimérica de la SEQ ID NO. 1 para la preparación de
desacetil-cefalosporinas empleadas como compuestos
de partida para obtener cefalosporinas semisintéticas con
capacidad antibiótica.
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|---|---|---|---|
| ES200400346A ES2272115B1 (es) | 2004-02-13 | 2004-02-13 | Produccion de formas quimericas de cefalosporina c acetilasa. |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| CA2040707C (en) * | 1990-04-27 | 2002-07-09 | Kenji Mitsushima | Cephalosporin acetylhydrolase gene and protein encoded by said gene |
| AT408660B (de) * | 1998-01-28 | 2002-02-25 | Biochemie Gmbh | Nukleinsäure-molekül, das für cephalosporin-acetylesterase kodiert |
-
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- 2004-02-13 ES ES200400346A patent/ES2272115B1/es not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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