KR101591786B1

KR101591786B1 - 해양 박테리아 유래의 재조합 생물촉매를 포함하는 이산화탄소 포집용 조성물, 이의 제조방법 및 이를 이용한 이산화탄소의 포집방법

Info

Publication number: KR101591786B1
Application number: KR1020140048950A
Authority: KR
Inventors: 차형준; 임슬기; 조병훈
Original assignee: 포항공과대학교 산학협력단
Priority date: 2014-04-23
Filing date: 2014-04-23
Publication date: 2016-02-04
Also published as: KR20150122542A

Abstract

본 발명은 이산화탄소의 수화 반응을 촉진할 수 있는, 해양 박테리아 유래,구체적으로 하이드로게노비브리오 마리누스(Hydrogenovibrio marinus) 유래의 탄산무수화효소를 발현시킨 형질전환체, 이의 상기 형질전환 세포의 세포 파쇄액 또는 이의 분액 또는 상기 형질전환 세포에서 분리한 탄산무수화효소를 포함하는 온도와 pH에 대한 안정성이 뛰어난 생물 촉매로서의 이산화탄소 포집용 조성물, 이들의 제조방법 및 이들을 이용한 이산화탄소의 포집 방법에 관한 것이다.
본 발명의 해양 박테리아 유래의 탄산무수화효소는 다양한 pH 범위 및 높은 온도에서도 탁월한 활성을 유지할 수 있으므로, 실제 이산화탄소 포집 공정에 매우 유용하게 적용될 수 있다. 또한 대장균 시스템을 이용하여 대량생산이 가능하므로 경제성 측면에서 이점을 가지고 있다.

Description

해양 박테리아 유래의 재조합 생물촉매를 포함하는 이산화탄소 포집용 조성물, 이의 제조방법 및 이를 이용한 이산화탄소의 포집방법{Composition for CO2 capture comprising marine bacterium-derived recombinant biocatalyst, Method for preparing the same, and Method of CO2 capture using the same}

본 발명은 이산화탄소의 수화 반응을 촉진할 수 있는, 해양 박테리아 유래,구체적으로 하이드로게노비브리오 마리누스(Hydrogenovibrio marinus) 유래의 탄산무수화효소를 발현시킨 형질전환체, 이의 상기 형질전환 세포의 세포 파쇄액 또는 이의 분액 또는 상기 형질전환 세포에서 분리한 탄산무수화효소를 포함하는 온도와 pH에 대한 안정성이 뛰어난 생물 촉매로서의 이산화탄소 포집용 조성물, 이들의 제조방법 및 이들을 이용한 이산화탄소의 포집 방법에 관한 것이다.

산업화 이후 급격히 증가한 이산화탄소로 인해 지구 온난화가 가속화 되고 있다. 따라서 대기 중 이산화탄소의 농도를 줄이려는 국제적인 노력이 증대되고 있다. 가까운 미래에는 화석 연료 사용이 불가능하다는 점을 고려해볼 때, 친환경적인 신재생 에너지의 개발과 더불어, 이산화탄소의 포집과 저장하는 기술이 크게 주목 받고 있다. 이러한 이산화탄소의 포집 및 저장 방법에는 여러 가지 화학적, 물리적 흡수 방법들이 있지만, 부식, 높은 열 에너지의 사용 등의 문제점을 안고 있다. 이와 관련하여 생명체 내의 이산화탄소를 빠르게 전환시키는 효소를 이용한 이산화탄소의 생물모방적 포집 방법이 친환경적인 이산화탄소 저감 기술로 주목 받고 있다. 효소를 이용한 생물모방 이산화탄소 포집 방법은 기존의 방법과 비교해 반응이 빠르고 환경 친화적이라는 장점을 가지고 있다.

여기에 이용되는 효소가 바로 탄산무수화효소이다. 탄산무수화효소는 생명체 내에서 이산화탄소의 수화 반응 또는 그 역반응을 빠르게 촉진시킨다. 이 효소는 박테리아와 고세균를 포함하여 포유 동물까지, 실질적으로 거의 모든 생명체에 존재하며 호흡, 광합성, 바이오미네랄 형성, 이산화탄소 및 이온의 전달, 항상성 유지 등과 같은 다양한 생리적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 이 효소는 내부에 아연(Zinc) 이온을 포함하고 있는 금속 효소(metalloenzyme)이며 서열 상동성에 따라 최소 α, β, γ, δ, ζ의 다섯 가지 종류로 나뉜다.

대기중의 이산화탄소는 아래의 반응식과 같이 물에 녹아 수화 반응을 통해 탄산을 형성하고 적정 pH 조건에서 최종적으로 탄산 이온(carbonate ion, CO₃ ^2-)를 형성한다. 이것은 이후 금속 양이온과 반응하여 탄산 미네랄 침전물을 형성할 수 있다.

CO₂(g) → CO₂(aq)

CO₂(aq) + H₂O → H₂CO₃

H₂CO₃ → H⁺ + HCO₃ ^-

HCO₃ ^- → H⁺ + CO₃ ² ^-

CO₃ ² ^- + Ca² ⁺ → CaCO₃

여기서 두 번째 반응인 이산화탄소가 수화되는 반응이 율속 단계(rate-limiting step)이며, 탄산무수화효소는 이 반응을 자연적인 반응보다 최대 천만 배 빠르게 촉진시켜준다. 따라서 탄산무수화효소를 통해 이산화탄소를 빠르게 포집할 수 있으며, 이후 Ca 또는 Mg 등의 금속 양이온과의 결합을 통해 탄산 미네랄로 전환하여 공업적으로 다방면에서 활용 가능하다.

탄산무수화효소를 이용한 이러한 생물 모방 기술은 친환경적이고 효율적이지만 이를 실제 공정에 적용하기 위해서는 효소의 생산 단가를 낮추고 효소의 안정성을 확보해야 한다. 그 동안 주로 사용되고 있던 탄산무수화효소는 소의 혈청에서 추출한 bovine carbonic anhydrase(bCA)로 g당 약 2백만원이라는 고비용의 문제 때문에 실제 공정에서 대규모로 사용되기에는 한계를 지닌다. 또한 포집 공정은 대량으로 이산화탄소를 배출하는 제철소나 발전소에 적용되어 배기가스 내에 포함되어 있는 이산화탄소를 분리하는 곳에 적용될 것으로 기대되는데, 이러한 공정은 최소한 40℃ 내지 60℃ 정도의 고온에서 이루어진다. 따라서 탄산무수화효소를 실제 공정에 적용하기 위해서는 고온에서도 활성을 유지할 수 있는 안정성이 확보되어야 한다.

이에 본 발명자들은 해양 박테리아 유전체 정보로부터 탄산무수화효소 유전자를 탐색하고 유전자 재조합 플라스미드를 제작한 후, 대장균 내에서 발현시켜 제조한 해양 박테리아 유래 재조합 탄산무수화효소가 발현된 세포를 제조하였고, 예기치 않게 상기 세포, 이의 파쇄물 및 이들로부터 수득된 탄산무수화효소는 다양한 pH 범위 및 고온에서도 높은 이산화탄소 수화 활성을 지녀 pH 및 온도에 대한 탁월한 안정성을 가진다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 해양 박테리아 유래의 탄산무수화효소(carbonic anhydrase)의 유전자를 포함하는 발현벡터가 숙주세포에 형질전환된, 이산화탄소 포집용 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 해양 박테리아 유래 재조합 탄산무수화 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체의 전세포(whole cell); 상기 전세포의 세포 파쇄액 또는 이의 분액; 및 상기 전세포에서 분리한 탄산무수화 효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 이산화탄소 포집용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은, 해양 박테리아 유래 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제조하는 단계; 제조된 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제조하는 단계; 제조된 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 이산화탄소 포집용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 이산화탄소 포집용 조성물을 이용하여 이산화탄소를 포집하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 해양박테리아 유래의 탄산무수화효소(carbonic anhydrase)의 유전자를 포함하는 발현벡터가 숙주세포에 형질전환된, 이산화탄소 포집용 형질전환체, 및 이러한 형질전환체의 전세포(whole cell), 상기 전세포의 세포 파쇄액 또는 이의 분액 및 상기 전세포에서 분리한 탄산무수화 효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 이산화탄소 포집용 조성물에 관한 것이다.

본원에서 용어, "탄산무수화효소(carbonic anhydrase, CA)" 란 내부에 아연을 포함하고 있는 금속 효소로서 이산화탄소의 수화 반응(CO₂(aq) + H₂O → H⁺+ HCO₃ ^-)을 촉매하는 효소를 말한다. 종래에 산업적으로 사용되던 소의 혈청 유래의 탄산무수화효소(bovine carbonic anhydrase)의 경우 정제가 어렵고 고비용이 소요되는 문제가 있어 실제적으로 사용에 제한이 있었는바, 본 발명에서는 유전자 재조합적 방법으로 해양 박테리아 유래의 탄산무수화효소를 대량 발현시켜 전세포 생물 촉매 등으로 사용할 경우 저렴한 비용으로 손쉽게 이산화탄소 포집에 사용할 수 있으며, 나아가 이들 전세포 촉매 등이 기존의 소 혈청 유래의 효소와 대등한 수준의 활성을 보임을 확인하였다.

본 발명에서 탄산무수화효소는 해양 박테리아로부터 유래되어 유전자 재조합적으로 발현된 것을 특징으로 하며, 바람직하게, 본 발명에서 탄산무수화효소는 해양 박테리아인 하이드로게노비브리오 마리누스(Hydrogenovibrio marinus) 유래의 것을 유전자 재조합적으로 발현시켜 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 탄산무수화효소는, 바람직하게는 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체의 전세포, 상기 전세포의 세포 파쇄액 또는 이의 분액, 및 상기 전세포에서 분리한 탄산무수화효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 형태로 사용될 수 있다. 여기에서, 상기 분액은 상기 세포 파쇄액의 수용성 분액, 불용성 분액, 세포질 분액, 세포 간극 분액 또는 세포막 분액을 포함한다.

또한, 상기 형질전환 세포는 탄산무수화효소가 세포질(cytoplasm), 세포 간극(periplasmic space) 또는 세포 표면(cell surface)에 발현된 것일 수도 있으나, 세포질에 발현된 것이 바람직하다.

이를 위하여, 바람직한 일 예로, 하이드로게노비브리오 마리누스 유래의 탄산무수화효소로 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 사용할 수 있으며, 이는 세포질에서 발현될 수 있다. 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산은, 대표적인 예로 서열번호 2의 핵산 서열을 가지는 것이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 형질전환체는 생물 촉매, 즉 이산화탄소 포집을 위한 조성물을 위해 사용될 수 있으며, 이러한 형질전환체를 제조하기 위한 구체적인 방법은 이하의 생물 촉매 생산방법에 상세히 기술되어 있다.

유전자 재조합적 방법으로 본 발명의 생물 촉매, 즉 이산화탄소 포집을 위한 조성물을 생산하는 과정은 다음 단계를 포함할 수 있다.

첫째, 해양 박테리아 유래 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제조하는 단계이다.

상기 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산은, 바람직하게는 하이드로게노비브리오 마리누스 유래의 것을 예시할 수 있으며, 숙주세포의 세포질, 세포 간극 또는 세포 표면 등 원하는 부위에 발현할 수 있도록 당업계에 알려진 통상적인 방법에 따라 적절히 변형될 수 있다. 예를 들어, 하이드로게노비브리오 마리누스 유래의 탄산무수화효소의 전체 서열에 포함되어 있는 세포 간극으로의 분비와 관련된 신호서열을 제거하여 세포질에서 발현될 수 있도록 할 수 있다. 구체적으로는, 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산이며, 대표적으로 서열번호 2의 핵산서열을 가지는 것을 예시할 수 있다.

상기 핵산을 삽입하기 위한 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 코즈미드 등 다양한 형태의 재조합 벡터를 사용할 수 있다. 본원에서 용어, "재조합 벡터"는 통상 외래 DNA의 단편이 삽입된 캐리어로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 본원에서 용어, "외래 DNA"란 외래종으로부터 기원되는 DNA를 의미하거나, 동일한 종으로부터 기원되는 경우에는 본래의 형태로부터 실질적으로 변형된 형태를 의미하며, 외래 유전자는 전사될 특정 목적 핵산으로 폴리펩타이드를 코딩한다. 본 발명의 목적상, 본원에서 상기 외래 DNA는 해양 박테리아 유래의 탄산무수화효소를 코딩 하는 핵산을 의미한다. 재조합 벡터는 숙주세포에서 형질전환된 유전자의 발현 수준을 높이기 위해 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결될 수 있다. 상기 재조합 벡터는 개체의 세포 내에서 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물로서, 이러한 유전자 작제물을 제조하기 위해 표준 재조합 DNA 기술을 이용할 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포 등의 각종 숙주세포에서 목적하는 유전자를 발현하고, 목적하는 단백질을 생산하는 기능을 하면 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다. 재조합 벡터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자, 종결코돈 및 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하다. 그 외에 시그널 펩타이드를 코드하는 DNA, 인핸서 서열, 목적하는 유전자의 5' 말단 및 3' 말단의 비해독영역, 선별 마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 세포질에서 탄산무수화 효소를 발현하기 위해 하이드로게노비브리오 마리누스 유래의 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 벡터 pET22b(+)에 삽입한, 도 1의 개열지도를 가지는 pET22b(+)-hmCA 벡터를 제작하였다.

둘째, 상기 해양 박테리아 유래 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제조하는 단계이다.

재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하기 위한 방법은 당업계에서 핵산을 세포 내로 도입하는 통상적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있으며, 예컨대 인산칼슘법 또는 염화칼슘/염화루비듐법, 일렉트로포레이션법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), 열충격법, PEG 등의 화학적 처리 방법, 유전자총(gene gun), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(DEAEdextran), 양이온 리포좀법(cationic liposome) 등을 이용할 수 있고, 바람직하게는 열충격법을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 재조합 벡터로 형질전환될 수 있는 숙주세포는 원핵 세포와 진핵 세포를 모두 포함하며, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. 세균, 예를 들어 대장균, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC40, BMT 10 등의 동물 세포 등이 사용될 수 있는 숙주세포의 예이다. 바람직하게는 경제적인 생산을 위해 대장균이 사용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 제작된 벡터, 즉 해양 박테리아 유래의 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 pET22b(+)에 삽입한 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3) 균주에 42℃에서 2분간 방치하는 열충격 방법에 의해 도입하여, 탄산무수화효소를 대량 발현하는 형질전환체를 제조하였다.

셋째, 상기 형질전환체를 배양하여 탄산무수화효소의 발현을 유도 및 축적하는 단계이다.

상기 재조합 벡터가 발현되는 형질전환체를 영양배지에서 배양하면 유용한 단백질을 대량으로 제조 및 분리할 수 있다. 배지와 배양조건은 숙주세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택하여 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양 시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다. 발현유도인자로 IPTG(isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside)를 사용하여 단백질 발현을 유도할 수 있고 유도시간은 단백질의 양이 최대화될 수 있도록 조절할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 형질전환된 대장균을 암피실린이 첨가된 LB 배지에 접종하여 배양하고, 배양액의 흡광도(OD₆₀₀)가 600 nm에서 0.6 내지 0.8이 되었을 때 단백질의 발현 유도물질인 IPTG 1mM과 단백질 활성 부위(active site)에 아연을 도입하기 위해 ZnSO₄ 0.1mM 을 첨가한 후, 추가로 37℃에서 6시간 동안 배양하여 발현시켰으며, 배양된 세포를 4000×g에서 10분간 원심 분리한 다음 상등액을 제거하고 세포를 회수하였는데, 이때 배양조건이나 회수조건은 상기에 한정되지 않으며, 적절히 조절될 수 있다.

상기의 방법으로 발현시킨 탄산무수화효소의 발현 여부는, 공지의 발현 확인 방법이라면 제한없이 사용하여 확인할 수 있다. 구체적인 일례로서, 상기와 같은 공정에 따라 회수된 형질전환체 세포를 세포 파쇄를 위한 용액(예를 들어, 50mM 소듐 포스페이트 버퍼, 300mM 염화나트륨, pH 8, 10mM 이미다졸)에 부유시킨 다음 초음파 분쇄기를 이용하여 파쇄하고, 이후 파쇄된 세포의 단백질 총체를 통상의 SDS-PAGE로 확인할 수 있다.

또한, 발현이 확인된 효소를 갖는 형질전환체를 전세포 생물촉매로 이용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 형질전환체 자체(전세포), 상기 형질전환 세포의 세포 파쇄액 또는 이의 분액, 및 상기 형질전환 세포에서 분리한 탄산무수화효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 형태를 생물촉매, 즉 이산화탄소 포집용 조성물로 사용할 수 있다.

바람직한 양태로서, 해양 박테리아 유래 탄산무수화효소를 분리 및 정제하는 과정 없이 재조합 탄산무수화효소가 세포질, 세포간극 또는 세포표면, 더욱 바람직하게는 세포질에 발현된 전세포 생물 촉매로 사용할 수 있다.

또 하나의 바람직한 양태로서, 탄산무수화효소를 발현하는 형질전환 세포는 동결-해동 반복, 초음파 처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제와 같은 다양한 물질적 또는 화학적 수단에 의해 파쇄할 수 있으며, 이러한 세포 파쇄물을 포함하는 세포 파쇄액을 생물 촉매로 바로 사용할 수 있다.

또 하나의 바람직한 양태로서, 상기와 같은 세포 파쇄물을 포함하는 세포 파쇄액을 수용성 분액과 불용성 분액으로 나눌 수 있으며, 이들 수용성 분액 또는 불용성 분액을 생물 촉매로 사용할 수 있다. 나아가, 세포질 분액, 세포 간극 분액 또는 세포막 분액 역시 생물 촉매로 사용할 수 있다.

또 하나의 바람직한 양태로서, 상기 형질전환체 내에서 발현에 의하여 생산된 탄산무수화효소를 분리 및 정제하여 생물 촉매로 사용할 수 있다. 발현된 탄산무수화효소는 형질전환 세포 파쇄 후 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리 및 정제 가능하다. 예를 들어, 이러한 분리 및 정제 방법으로 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 면역흡착 친화력 크로마토그래피, 역상 HPLC, 겔 침투 HPLC), 등전성 포커스 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 하이드로게노비브리오 마리누스 유래의 탄산무수화효소의 회수된 형질전환 세포를 초음파 분쇄기로 파쇄한 후 파쇄된 세포의 수용성 분액을 니켈 레진이 충진된 컬럼을 이용한 친화도 크로마토그래피를 실시하여 탄산무수화효소를 분리 및 정제하였다. 정제된 단백질은 Tris-sulfate buffer(pH 9)를 이용한 투석을 통해 단백질 수용액에 남아있는 염을 제거하였으며, 최종적인 탄산무수화효소의 정제여부는 통상의 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다(도 4 참조).

또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 먼저 상기한 공정을 통해 정제된 효소를 사용하여 이산화탄소 수화에 관한 pH 및 온도에 따른 활성을 확인하였다. 이 때, 대조군으로는 소의 혈청에서 추출해 상업적으로 판매가 되고 있는 효소(bovine carbonic anhydrase, bCA)를 사용하였고, 상기 정제된 단백질과 상업적으로 판매되는 정제된 bCA 단백질을 pH 5~10의 완충 용액에 일정 시간 방치한 뒤 탄산무수화 효소 활성을 측정하였다. 또한, 두 효소를 60°C에서 방치하면서 일정 시간 후, 남아 있는 탄산무수화효소 활성을 측정하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 해양 박테리아 유래의 탄산무수화효소가 발현된 형질전환체는 다양한 pH 범위에서 상업적으로 판매되는 탄산무수화효소와 대등한 수준의 우수한 안정성을 보여주었을 뿐 아니라(도 6 참조), 고온에 장기간 방치한 경우에도 탄산무수화효소의 활성을 유지하여 상업적으로 판매되는 탄산무수화효소에 비해 월등하게 우수한 이산화탄소 포집 활성을 나타내었다(도 5 참조).

따라서, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 이산화탄소 포집용 조성물을 이용하여 이산화탄소를 포집하는 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명에 따른 이산화탄소 포집 방법은 상기 이산화탄소 포집용 조성물을 제조하는 단계; 및 상기 이산화탄소 포집용 조성물에 이산화탄소를 공급하는 단계를 포함할 수 있다.

이산화탄소 포집용 조성물을 제조하는 단계는, 상기에서 기술한 바와 같이, (a) 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 벡터로 형질전환된 형질전환 세포를 제조하는 단계; (c) 상기 형질전환체를 배양하여 탄산무수화효소의 발현을 유도 및 축적하는 단계; 및 (d) 상기 형질전환체 자체, 상기 형질전환 세포의 세포 파쇄액 또는 이의 분액, 및 상기 형질전환 세포에서 분리한 탄산무수화효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 제조하는 단계로 구체화할 수 있다.

상기 이산화탄소 포집용 조성물에 이산화탄소를 공급하는 방법으로는 특별한 제한이 없으며, 이산화탄소를 다량 함유하고 있으며 이산화탄소를 제거할 필요가 있는 공급원, 예를 들면 폐수 또는 연도가스 등의 형태로 공급할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이와 같이 본 발명의 이산화탄소 포집용 조성물을 이용하여 이산화탄소를 포집한 다음에는, 금속 양이온 공급원을 추가하여 포집된 이산화탄소를 최종적으로 탄산염 또는 중탄산염 침전물로 전환하여 산업적으로 다양하게 사용할 수도 있다.

본 발명에 따른 해양 박테리아 유래의 탄산무수화효소를 암호화하는 형질전환벡터로 형질전환된 형질전환체, 이러한 형질전환체를 이용한 이산화탄소 포집용 조성물을 사용하여 이산화탄소를 포집하는 경우, 상기 탄산무수화효소가 다양한 pH 범위 및 60℃ 이상의 고온에 장시간 노출되는 경우에도 탁월한 활성을 나타내는바, 고온 환경에 노출될 기회가 높은 이산화탄소 포집 공정에서 급격한 활성의 저감 없이 좋은 효율로 이산화탄소를 포집할 수 있어 매우 유용하다.

본 발명의 해양 박테리아 유래의 탄산무수화효소는 다양한 pH 범위 및 높은 온도에서도 탁월한 활성을 유지할 수 있으므로, 실제 이산화탄소 포집 공정에 매우 유용하게 적용될 수 있다. 또한 대장균 시스템을 이용하여 대량생산이 가능하므로 경제성 측면에서 이점을 가지고 있다.

도 1은 세포질에서 발현하기 위한 탄산무수화효소 발현 벡터, pET22b(+)-hmCA의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 2는 재조합 탄산무수화효소를 세포질에 발현한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸다. M은 분자량 표준 마커이고, hmCA는 본 발명에 따른 Hydrogenovibrio marinus 유래 탄산무수화효소를 의미한다.
도 3은 세포 파쇄액을 이용하여 이산화탄소 포집에 관한 재조합 탄산무수화효소의 활성을 측정한 결과를 나타낸다. Blank는 탄산무수화효소가 들어 있지 않은 비교군을 의미하고, hmCA는 Hydrogenovibrio marinus 유래 탄산무수화효소를 의미한다.
도 4는 재조합 탄산무수화효소를 분리정제한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. hmCA는 본 발명에 따른 Hydrogenovibrio marinus 유래 탄산무수화효소를 의미한다.
도 5는 탄산무수화효소의 60°C에서의 고온 안정성을 측정한 결과이다. hmCA는 본 발명에 따른 Hydrogenovibrio marinus 유래 탄산무수화효소를 의미하고, bCA는 시판되는 소 혈청 유래 탄산무수화효소를 의미한다.
도 6은 pH에 따른 탄산무수화 효소의 안정성을 측정한 결과이다. hmCA는 본 발명에 따른 Hydrogenovibrio marinus 유래 탄산무수화효소를 의미하고, bCA는 시판되는 소 혈청 유래 탄산무수화효소를 의미한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

실시예 1. 탄산무수화효소 발현 벡터의 제조

하이드로게노비브리오 마리누스(Hydrogenovibrio marinus) 유전체 정보를 토대로 탄산무수화효소 유전자를 탐색하고 Hydrogenovibrio marinus genomic DNA를 두 개의 프라이머 forward primer: 5'- CAT ATG CAT AGC AAT GCC CCA TTG -3', backward primer: 5'- CTC GAG GTA ATA TTG ATA GTA ACG -3'를 이용하여 Hydrogenovibrio marinus의 탄산무수화효소 유전자를 증폭하였고, 이를 NdeI, XhoI 제한 효소를 이용하여 pET-22b(+) 벡터에 도입하였다. 만들어진 최종 발현 벡터에서 각 탄산무수화효소 유전자들은 C 말단에 Ni 이온과 결합이 가능한 histidine tag를 갖게 된다.

실시예 2. 발현 벡터를 가지는 형질전환체의 제조

상기 실시예 1에서 제조한 벡터를 대장균 BL21(DE3)(Novagen)에 도입하기 위하여 42°C에서 2분간 열충격을 가하였으며 벡터가 도입된 각각의 형질전환체는 암피실린이 첨가된 LB 배지에서 선별하였다.

실시예 3. 형질전환체를 이용한 단백질의 발현

상기 실시예 2에서 제조한 형질전환체를 50 μg/mL 암피실린 첨가된 LB 배지에서 37°C 배양하여 배양액의 흡광도(OD₆₀₀)가 0.6 내지 0.8 정도가 되었을 때 유도물질인 IPTG(isopropyl-b-D-thiogalactopyranoside, Sigma-aldrich, 최종 농도: 1 mM)을 첨가하고, 단백질 활성 부위(active site)에 아연을 도입하기 위해 ZnSO₄ 0.1 mM을 첨가한 후, 단백질의 발현을 유도하였다. IPTG 첨가 후 추가로 6시간 동안 37°C에서 배양한 후, 배양된 세포를 4000×g에서 10분간 원심 분리한 다음 상등액을 제거하고 세포를 회수하였다. 회수된 세포는 세포 파쇄를 위한 용액(50 mM sodium phosphate buffer, 300mM NaCl, pH 8, 10 mM imidazole)에 부유시킨 다음 초음파 분쇄기(Fisher Scientific)를 이용하여 파쇄하였다. 이후 파쇄된 세포의 단백질 총체를 SDS-PAGE를 통해 분석하였다. SDS-PAGE 분석을 위해, 상기 파쇄된 세포의 단백질 총체를 포함하는 샘플들은 샘플용 완충액(0.5M Tris-HCl(pH 6.8), 10% 글리세롤, 5% SDS, 5% β-머캅토에탄올, 0.25% 브로모페놀 블루)과 혼합한 후, 5분간 100℃에서 끓이고, 15% SDS-폴리아크릴아마이드겔을 사용하여 전개한 후 쿠마시 블루로 염색하여(Bio-Rad) 검출하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

실시예 4. 발현된 재조합 탄산무수화효소의 이산화탄소 포집 활성 확인

실시예 3에서 제조한 세포 파쇄액을 이용하여 발현된 탄산무수화효소의 이산화탄소 포집에 관한 활성을 측정하였다. 3 mL의 20 mM Tris sulfate buffer(pH 8.3)에 회수된 세포를 부유시킨 후 초음파로 분쇄한 50 μL의 세포 파쇄액을 첨가한 후 2mL의 이산화탄소 포화수용액(Linde-Korea)을 첨가하여 pH가 6.3까지 감소하는 양상을 보았다. pH가 빨리 떨어질수록 이산화탄소 포집에 관한 활성이 높은 것을 의미하며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 탄산무수화효소가 포함되어 있지 않은 비교군의 경우 이산화탄소 포화수용액을 첨가한 후 80초 이상이 지나서야 pH 6.3으로 감소하였음에 반해, 본 발명에 따른 재조합 탄산무수화효소를 사용하는 경우 pH 6.3으로 감소하는데 약 7초 정도의 시간만이 소요되어 탁월한 이산화탄소 포집 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5. 발현된 재조합 탄산무수화효소의 정제

세포 파쇄액을 10,000×g에서 20분간 원심 분리한 후 상등액의 탄산무수화효소를 분리, 정제하였다. 구체적으로, 니켈 레진이 충진된 컬럼(Qiagen)에 상등액을 적용하여 단백질과 컬럼이 결합하도록 하고, 세척 버퍼(50 mM sodium phosphate buffer, 300mM NaCl, 30mM imidazole, pH 8.0)로 컬럼에 결합하지 않은 단백질을 씻어 냈다. 컬럼으로부터 단백질의 용출은 50 mM sodium phosphate buffer, 300mM NaCl, 250mM imidazole(pH 8.0)을 이용하여 진행하였고, 상기 정제된 용액은 투석을 통하여 20mM Tris-sulfate (pH 9)으로 바뀌며 염이 제거되었다.

실시예 6. 정제된 재조합 탄산무수화효소의 안정성 비교

정제된 탄산무수화효소의 pH 및 온도에 따른 활성을 측정함으로써 안정성을 확인하고자 이하의 실험을 진행하였다.

실시예 5에서 정제된 탄산무수화효소를 60°C에서 방치하면서 일정 시간 후 남아있는 탄산무수화효소의 활성을 실시예 4에서와 같은 방식으로 측정하였다. 이때 4°C에 보관해둔 실험군(초기 열처리를 하지 않은 것)과 비교하여 활성의 감소 정도를 백분율로 표시하였다. 또한 정제된 탄산무수화효소와 판매되는 bCA를 pH 5~10의 완충 용액(pH5,6: 50 mM sodium-citrate buffer, pH7,8,9: 50 mM Tris-sulfate buffer, pH 10: 50 mM glycine-NaOH buffer)에 일정 시간 방치한 뒤 탄산무수화 효소 활성을 측정하였다. 양 실험 모두 대조군으로서 상업적으로 판매되는 bCA(bovine carbohydrase, Sigma-aldrich)를 사용하였다. 그 결과를 각각 도 5(온도) 및 도 6(pH)에 나타내었다.

도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 시판되는 bCA의 경우, 열처리 시작 후 1일도 지나기 전에 탄산무수화효소의 잔여 활성이 고갈되는데 반해, 본 발명에 따른 해양 박테리아 유래 탄산무수화효소는 열처리 시작 후 4일이 지난 후에도 여전히 탄산무수화효소의 잔여 활성이 20% 정도 남아있어, 탁월한 열 안정성을 나타냄을 알 수 있다.

또한, 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 해양 박테리아 유래 탄산무수화효소는 다양한 pH의 변화에도 bCA와 대등한 수준의 탄산무수화효소 안정성을 나타낸다.

<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> COMPOSITION FOR CO2 CAPTURE COMPRISING MARINE BACTERIUM-DERIVED RECOMBINANT BIOCATALYST, METHOD FOR PREPARING THE SAME, AND METHOD OF CO2 CAPTURE USING THE SAME <130> DPP20141366KR <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 303 <212> PRT <213> Hydrogenovibrio marinus <400> 1 Met His Ser Asn Ala Pro Leu Ile Asp Leu Gly Ala Glu Met Lys Lys 1 5 10 15 Gln His Lys Glu Ala Ala Pro Glu Gly Ala Ala Pro Ala Gln Gly Lys 20 25 30 Ala Pro Ala Ala Glu Ala Lys Lys Glu Glu Ala Pro Lys Pro Lys Pro 35 40 45 Val Val His Asn Pro His Trp Ser Tyr Ser Gly Glu Glu Gly Pro Asp 50 55 60 His Trp Gly Asp Leu Ser Pro Asp Tyr Ala Thr Cys Lys Thr Gly Lys 65 70 75 80 Asn Gln Ser Pro Ile Asn Leu Met Ala Asp Asp Ala Val Gly Thr Thr 85 90 95 Ser Leu Pro Gly Phe Asp Val His Tyr Arg Asp Thr Val Leu Lys Val 100 105 110 Ile Asn Asn Gly His Thr Leu Gln Ala Asn Val Pro Leu Gly Ser Tyr 115 120 125 Ile Lys Ile Lys Asn Gln Arg Tyr Glu Leu Leu Gln Tyr His Phe His 130 135 140 Thr Pro Ser Glu His Gln Leu Asn Gly Phe Asn Tyr Pro Met Glu Leu 145 150 155 160 His Leu Val His Arg Asp Gly Arg Gly His Tyr Leu Val Ile Gly Ile 165 170 175 Leu Phe Arg Glu Gly Lys Glu Asn Asp Ala Leu Gln Thr Ile Leu Asn 180 185 190 His Leu Pro Lys Lys Val Gly Lys Gln Glu Ile Phe Asn Gly Ile Glu 195 200 205 Phe Asn Pro Asn Val Phe Phe Pro Glu Ser Lys Lys Phe Phe Lys Tyr 210 215 220 Ser Gly Ser Leu Thr Thr Pro Pro Cys Thr Glu Gly Val Tyr Trp Met 225 230 235 240 Val Phe Lys Gln Pro Ile Glu Ala Ser Ala Glu Gln Leu Glu Lys Met 245 250 255 Asn Glu Leu Met Gly Ala Asn Ala Arg Pro Val Gln Asp Leu Glu Ala 260 265 270 Arg Ser Leu Leu Lys Ser Trp Ser Asn Pro Lys Asn Asp Ser Gln Asp 275 280 285 His Arg Tyr Tyr Gln Tyr Tyr Leu Glu His His His His His His 290 295 300 <210> 2 <211> 912 <212> DNA <213> Hydrogenovibrio marinus <400> 2 atgcatagca atgccccatt gattgacttg ggcgcggaaa tgaaaaaaca gcacaaggag 60 gcagctcccg aaggcgctgc gccggctcaa ggtaaggcac ctgccgcgga agccaaaaaa 120 gaagaagcac ctaaaccaaa acccgttgtg cataacccac attggtctta ttcgggagaa 180 gaaggccccg accattgggg agacttgtcg cctgattatg caacctgtaa aaccggcaaa 240 aatcagtcac caattaactt gatggcagat gatgccgttg gcaccacttc actaccgggc 300 tttgatgtgc actaccgtga tacggttctt aaagtcatca acaacggcca cacgctgcaa 360 gccaacgtgc ctttgggtag ctatatcaaa atcaaaaatc agcgttatga gctgttgcag 420 tatcattttc ataccccctc agaacatcag ttgaacggtt tcaattatcc gatggagttg 480 catttggttc accgagatgg tcgtgggcat tatctggtaa ttggtatttt gttcagagag 540 ggtaaagaga acgatgcgtt gcaaactatc ctgaaccact tgcctaaaaa agtcggtaaa 600 caggaaattt ttaatggcat tgaatttaat ccaaatgtct ttttccctga aagtaaaaaa 660 ttctttaaat acagcggctc tttaaccaca ccgccttgta cggaaggggt ttattggatg 720 gtgttcaaac aaccaatcga agcgtcggcg gagcaacttg aaaagatgaa cgaattaatg 780 ggggcgaatg ctcgtcctgt tcaggatttg gaagctcgct cgttgttgaa atcttggagc 840 aatcctaaaa acgatagtca ggatcaccgt tactatcaat attacctcga gcaccaccac 900 caccaccact ga 912 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying the carbonic anhydrase of H. marinus <400> 3 catatgcata gcaatgcccc attg 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Backward primer for amplifying the carbonic anhydrase of H. marinus <400> 4 ctcgaggtaa tattgatagt aacg 24

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 탄산무수화 효소(carbonic anhydrase).
제1항에 있어서, 상기 탄산무수화효소는 서열번호 2의 핵산 서열에 의해 암호화되는 것인, 탄산무수화 효소.
제1항에 있어서, 상기 탄산무수화 효소는 해양 박테리아로서 하이드로게노비브리오 마리누스(Hydrogenovibrio marinus) 유래인 것인, 탄산무수화 효소.
해양 박테리아로서 하이드로게노비브리오 마리누스(Hydrogenovibrio marinus) 유래이고 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 탄산무수화 효소의 유전자를 포함하는 발현벡터가 숙주세포에 형질전환된, 이산화탄소 포집용 형질전환체.
제4항에 있어서, 상기 탄산무수화효소의 유전자는 서열번호 2의 핵산 서열로 이루어진 것인 이산화탄소 포집용 형질전환체.
제4항에 있어서, 상기 발현벡터는 pET-22b(+)인 것인 이산화탄소 포집용 형질전환체.
제4항에 있어서, 상기 숙주세포는 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 이산화탄소 포집용 형질전환체.
해양 박테리아로서 하이드로게노비브리오 마리누스 유래이고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 탄산무수화 효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체의 전세포(whole cell);
상기 전세포의 세포 파쇄액 또는 이의 분액; 및
상기 전세포에서 분리한 탄산무수화효소
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 이산화탄소 포집용 조성물.
제8항에 있어서, 상기 형질전환체의 전세포는 탄산무수화효소가 세포질(cytoplasm)에 발현된 것인 이산화탄소 포집용 조성물.
제8항에 있어서, 상기 분액은 상기 세포 파쇄액의 전세포 분액, 수용성 분액, 불용성 분액, 세포질 분액, 세포 간극 분액 또는 세포막 분액인 이산화탄소 포집용 조성물.
삭제
삭제
제8항에 있어서, 상기 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산은 서열번호 2의 핵산 서열로 이루어진 것인, 조성물.
제8항에 있어서, 상기 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터는 도 1의 개열지도를 가지는 것인, 조성물.
제8항에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균인, 조성물.
(a) 해양 박테리아 하이드로게노비브리오 마리누스 유래이고, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제조하는 단계;
(b) 단계 (a)에서 제조된 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제조하는 단계;
(c) 단계 (b)에서 제조된 형질전환체를 배양하는 단계; 및
(d) 단계 (c)에서 배양된 형질전환체 자체, 상기 형질전환 세포의 세포 파쇄액 또는 이의 분액, 및 상기 형질전환 세포에서 분리한 탄산무수화효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는,
제9항, 제10항 및 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 이산화탄소 포집용 조성물의 제조방법.
삭제
삭제
제16항에 있어서, 상기 탄산무수화효소를 코딩하는 핵산은 서열번호 2의 핵산 서열로 이루어진 것인, 제조방법.
제16항에 있어서,
상기 단계 (d)는 단계 (c)에서 제조된 형질전환체를 파쇄하여 조성물을 제조하는 것인 제조방법.
제20항에 있어서,
상기 단계 (d)에서 제조된 파쇄액에서 탄산무수화 효소를 추가로 분리 및 정제하는 제조방법.
제9항, 제10항 및 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 이산화탄소 포집용 조성물을 이용하여 이산화탄소를 포집하는 방법.