KR101524926B1 - 재조합 발현벡터, 이를 포함하는 숙주세포 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이산화탄소 저감 효과 및 생리활성물질 생산을 향상시키기 위한 재조합 발현벡터에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 세포외막 단백질을 이용한 탄산무수화효소의 세포표면 발현을 통해 탄산무수화효소가 효소로서의 안정성을 보다 쉽고 오랫동안 유지할 수 있도록 하고, 이를 통해 이산화탄소를 기반으로 다양한 유기물질을 생산할 수 있는 광합성 세균인 로도박터 스페로이드를 통한 최적의 이산화탄소 저감 효율 및 고부가가치 물질의 생산을 향상시킬 수 있는 재조합 발현벡터에 관한 것이다.

Description

재조합 발현벡터, 이를 포함하는 숙주세포 및 그 용도{Recombinant expression vectors, host cells that containing the same and their use}
본 발명은 이산화탄소 저감 효과 및 생리활성물질 생산을 향상시키기 위한 재조합 발현벡터에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 세포외막 단백질을 이용한 탄산무수화효소의 세포표면 발현을 통해 탄산무수화효소가 효소로서의 안정성을 보다 쉽고 오랫동안 유지할 수 있도록 하고, 이를 통해 이산화탄소를 기반으로 다양한 유기물질을 생산할 수 있는 광합성 세균인 로도박터 스페로이드를 통한 최적의 이산화탄소 저감 효율 및 고부가가치 물질의 생산을 향상시킬 수 있는 재조합 발현벡터에 관한 것이다.
산업화 시대 이후 증가 되는 대기 중 온실가스 농도에 의해 지구 온난화는 빠르게 진행되고 있다. 이에 따라 지구 온난화의 요소 중 가장 큰 영향을 주고 있는 이산화탄소 저감을 위한 연구 개발이 매우 시급한 실정이다. 현재까지 이산화탄소의 포집 및 보관(CCS: Carbon dioxide Capture and Storage)을 위해 다양한 방법으로 해결하고자 노력하였다.
주로 사용되는 기술 중 하나인 화학적 포집 방식으로 이산화탄소 포집제가 그 핵심이지만, 이산화탄소와 반응시켜 다른 화학물질을 전환시킨 후 급속히 포화된 포집제의 재생에 대해 많은 에너지가 소모되는 단점이 있다. 또한 물리적 흡수 방법도 있는데, 그 중 하나인 이온성 액체를 이용한 방식으로 큰 유기 양이온과 작은 무기 음이온으로 구성된 액체로 증기압이 거의 없어 환경 친화적인 공정이 된다. 이산화탄소 가스가 이온성 액체에 대한 흡수열은 약 11kJ/mole로서 화학 결합보다는 물리적 수착이라고 생각할 수 있다. 이온성 액체의 점도가 높아 용매의 손실이 적은 이점이 있지만 물질 전달이 느린 단점이 있다.
하지만 생물학적 이산화탄소 저감 방법은 광합성을 통하여 진행되며, 지금까지 지구의 생태계를 기반으로 진행되었던 방법으로 친환경적이라 할 수 있다. 특히 광합성 세균을 이용한 이산화탄소 저감 방법은 지금까지의 생물공정산업에서 활용하는 세균을 활용하기 때문에 공정개발이 쉬울 뿐만 아니라 배양 공정 조건이 용이하며, 빠르게 성장하기 때문에 성장 기간이 긴 식물보다 효율적이며, 대량 배양에 있어 조류에 비해 쉽게 배양을 할 수 있는 장점을 갖고 있다. 또한 다양한 분자생물학적 기법을 이용하기 편리하다는 장점이 있다.
한편, 이산화탄소의 고정화하는 대표적인 효소 중 하나인 탄산무수화효소는 이산화탄소를 중탄산염으로 전환시킴으로써 역할을 하며 매우 빠르게 진행된다. 하지만, 효소로서 안정성을 오랫동안 지속하지 못하는 단점을 갖고 있기 때문에 산업적으로 활용이 어렵다는 문제점이 있다.
본 발명은 상술한 문제를 해결하기 위해 안출 된 것으로, 본 발명은 첫 번째 해결하려는 과제는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 두 번째 해결하려는 과제는 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 원핵세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 세 번째 해결하려는 과제는 상기 재조합 발현백터로 형질전환된 로도박터를 이용하여 이산화탄소를 저감하고 생리활성물질을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 첫번째 과제를 달성하기 위하여, 1)프로모터를 코딩하는 핵산서열; 2)로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)의 세포 외막단백질을 코딩하는 일부 유전자 단편; 3)탄산무수화효소(Carbonic anhydrase: CA)에 포함된 전장 DNA의 일부 또는 전부 탄산무수화효소 유전자 단편;및 4)로도박터 스페로이드의 세포 외막단백질을 코딩하는 나머지 일부 유전자 단편이 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 프로모터는 로도박터 스페로이드 유래의 puc 프로모터일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일 실시예에 따르면, 세포외막 단백질은 로도박터 스페로이드 유래의 외막단백질(omp)를 포함 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 일부 외막단백질 유전자 단편은 서열번호 2의 염기서열 중 1-276번째 서열을 필수적으로 포함하고, 나머지 외막단백질 유전자 단편은 277-612 번째 염기서열을 필수적으로 포함될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 탄산무수화효소는 서열번호 1의 염기서열 중 360번째 이상의 서열을 필수적으로 포함하고, 세포 외막단백질의 두 번째 루프지점인 93아미노산 부분에 삽입되어 표면발현될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일 실시예에 따르면, 상기 재조합 발현벡터는 도 6 내지 도 9 중 어느 하나로 표시되는 개열지도를 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 두번째 과제를 달성하기 위하여, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 원핵세포를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 1) 제 1 항의 재조합 발현벡터 및 2) 프로모터를 코딩하는 핵산서열 및 탄산무수화효소에 포함된 전장 DNA의 일부 또는 전부 탄산무수화효소 유전자 단편이 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있는 제 1 재조합 발현벡터 및 프로모터를 코딩하는 핵산서열 및 포스포에놀피루브산카르복실화효소(Phosphoenolpyruvate carboxylase: PEPC)에 포함된 전장 DNA의 일부 또는 전부 포스포에놀피루브산카르복실화효소 유전자 단편이 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있는 제 2 재조합 발현벡터로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 원핵세포일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 원핵세포는 로도박터 스페로이드일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 제 1 재조합 발현벡터는 도 2로 표시되는 개열지도일 수 있고, 제 2 재조합 발현벡터는 도 3으로 표시되는 개열지도일 수 있다.
본 발명은 상기 세번째 과제를 달성하기 위하여, 상기 재조합 로도박터 스페로이드를 이용하여 이산화탄소를 저감하고 생리활성물질을 향상시키는 방법을 제공한다.
이하, 본 명세서에서 사용된 용어에 대해 간략히 설명한다.
본 발명의 용어 "핵산서열"은 당분야에 공지된 용어이다. 여기에서 "핵산"은 핵염기로 구성된 DNA, RNA 또는 이의 유도체 또는 유사체 분자(가닥)을 말한다. 예를 들면 핵염기에는 DNA에서 볼 수 있는 자연 생성 또는 유도된 퓨린 또는 피리미딘염기(가령, 아데닌 "A", 구아닌 "G", 티민 "T" 또는 시토신 "C") 또는 RNA (가령, A, G, 우라실 "U" 또는C)를 포함한다.
"~에 의해 코딩되는" 또는 "~를 코딩하는"이란 핵산 서열이 폴리펩티드 서열을 코딩하는 것을 말하며, 여기서 상기 폴리펩티드 서열은 상기 핵산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드인 적어도 3~5개 아미노산, 더 바람직하게는 적어도 8~10개 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 적어도 15~20개 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 상기 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드를 사용하여 면역학적으로 확인할 수 있는 폴리펩티드 서열도 포함된다. 따라서, 항원 "폴리펩티드", "단백질" 또는 "아미노산" 서열은 항원의 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 대해 70% 이상의 유사성, 바람직하게는 약 80% 이상의 유사성, 더 바람직하게는 약 90~95%의 유사성, 가장 바람직하게는 약 99%의 유사성을 가질 수 있다.
"유전자"는 유전적 기능이 관련되어 있는 핵산 분자(염색체, 플라스미드 등)의 뉴클레오티드 서열이다. 유전자는, 예를 들어, 유기체의 게놈 내의 특정 물리적 위치("유전자좌")를 차지하는 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 포유동물의 DNA 서열)을 포함하는, 유기체의 유전 단위이다. 유전자는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 발현 생성물을 코딩할 수 있다. 일반적으로, 유전자는 폴리펩티드 코딩 서열과 같은 코딩 서열 및 프로모터 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 조절 서열(예를 들어, 인핸서 서열)과 같은 비코딩 서열을 포함한다. 다수의 진핵생물 유전자가 "인트론"(비코딩 서열)이 개재되어 있는 "엑손"(코딩 서열)을 갖는다.
" 벡터" 라는 용어는 숙주 세포에 삽입되어 숙주 세포 게놈과 재조합되고 이에 삽입되거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제하는 컴피턴트 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 이러한 벡터로는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등이 있다.
"작동가능하게 결합되어 있는(operatively linked to)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독 과정을 조절하게 된다.
세포와 관련하여 사용되는 용어 "재조합(recombinant)"은 세포가 이형의 핵산을 복제하거나 이형의 핵산에 의해 코드화되는 펩타이드 또는 단백질을 발현하는 것을 가리킨다. 또한 재조합 세포는 세포의 본래 형태에서 발견되는 유전자를 발현시킬 수 있으나, 변형된 유전자가 인공적인 방법에 의해 세포로 재도입 되어지기도 한다.
본 발명은 이산화탄소의 고정화에 대표적인 효소 중 하나인 탄산무수화효소에 대해 세포 외막단백질을 이용한 탄산무수화효소의 세포표면 발현을 통해 탄산무수화효소가 효소로서의 안정성을 보다 쉽고 오랫동안 유지할 수 있도록 한다.
또한 이를 로도박터 스페로이드에 형질전환하는 경우, 이를 통해 이산화탄소를 기반으로 다양한 유기물질을 생산할 수 있는 광합성 세균인 로도박터 스페로이드의 종래의 이산화탄소 저감 효과 보다 본 발명의 재조합 발현벡터를 통한 현저히 우수한 이산화탄소 저감 효율 및 고부가가치 물질의 생산을 향상시킬 수 있다.
도 1은 pBBR1mcs-2 벡터에 로도박터 스페로이드 유래 puc 프로모터를 클로닝한 재조합 플라스미드 pJYKm을 나타낸 개열지도이다.
도 2는 pBBR1mcs-2 벡터에 로도박터 스페로이드 유래 puc 프로모터, 탄산무수화효소를 코딩하는 탄산무수화효소 유전자 및 6x His(hexahistidine)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 클로닝한 재조합 플라스미드 pJY_CA를 나타낸 개열지도이다.
도 3은 pBBR1mcs-2 벡터에 로도박터 스페로이드 유래 puc 프로모터, 포스포에놀피루브산카복실화효소를 코딩하는 포스포에놀피루브산카복실화효소 유전자 및 6x His(hexahistidine)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 클로닝한 재조합 플라스미드 pJY-PEPC를 나타낸 개열지도이다.
도 4는 pBBR1mcs-4 벡터에 로도박터 스페로이드 유래 puc 프로모터를 클로닝한 재조합 플라스미드 pJYAp을 나타낸 개열지도이다.
도 5는 pBBR1mcs-4 벡터에 외막단백질 유전자의 일부 단편 및 외막단백질 유전자의 나머지 일부 단편을 클로닝한 재조합 플라스미드 pJY-Omp를 나타낸 개열지도이다.
도 6은 pBBR1mcs-4 벡터에 외막단백질 유전자의 일부 단편 및 외막단백질 유전자의 나머지 일부 단편 사이에 전부 탄산무수화효소 유전자를 클로닝한 재조합 플라스미드 pJY_OmpCA를 나타낸 개열지도이다.
도 7은 pBBR1mcs-4 벡터에 외막단백질 유전자의 일부 단편 및 외막단백질 유전자의 나머지 일부 단편 사이에 서열번호 1로 표시되는 염기서열중 1-447 번째 염기서열인 일부 탄산무수화효소 유전자를 클로닝한 재조합 플라스미드p JY_OmpCA1-447를 나타낸 개열지도이다.
도 8은 pBBR1mcs-4 벡터에 외막단백질 유전자의 일부 단편 및 외막단백질 유전자의 나머지 일부 단편 사이에 서열번호 1로 표시되는 염기서열중 1-360 번째 염기서열인 일부 탄산무수화효소 유전자를 클로닝한 재조합 플라스미드pJY_OmpCA1-360를 나타낸 개열지도이다.
도 9는 pBBR1mcs-4 벡터에 외막단백질 유전자의 일부 단편 및 외막단백질 유전자의 나머지 일부 단편 사이에 서열번호 1로 표시되는 염기서열중 1-225 번째 염기서열인 일부 탄산무수화효소 유전자를 클로닝한 재조합 플라스미드 pJY_OmpCA1-225를 나타낸 개열지도이다.
도 10은 로도박터 스페로이드의 외막단백질을 탄산무수화효소의 표면 발현 모체로 활용하여 제작된 재조합 균주에서 표면 발현된 탄산무수화효소의 길이에 따른 이산화탄소 저감 효율을 분석한 가스크로마토그래피 결과에 대한 그래프이다.
도 11은 6x His(hexahistidine)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 이용한 탄산무수화효소의 표면발현 재조합 발현벡터의 확인하기 위한 형광단백질을 통해 공초점 주사레이저현미경 이미지이다.
11a. 는 puc 프로모터만 발현되는 재조합 로도박터 스페로이드균주 MBTL,
11b. 는 탄산무수화효소가 세포내 유도과발현 되는 재조합 로도박터 스페로이드균주 MBTL-CA,
11c. 는 탄산무수화효소가 세포표면 발현되는 재조합 로도박터 스페로이드균주 MBTL-ompCA.
11d. 는 탄산무수화효소가 세포표면 발현 및 세포내 유도과발현이 동시에 되는 재조합 로도박터 스페로이드균주 MBTL-ompCA-CA.
도 12는 상기 재조합 로도박터 스페로이드 균주 MBTL, MBTL-CA, MBTL-OmpCA 및 MBTL-OmpCA-CA의 시간에 따른 이산화탄소의 저감 효율에 대한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 상기 재조합 로도박터 스페로이드 균주 MBTL, MBTL-CA, MBTL-OmpCA 및 MBTL-OmpCA-CA의 배양조건에 따른 박테리오클로로필에 대한 결과이다.
도 14는 상기 재조합 로도박터 스페로이드 균주 MBTL, MBTL-CA, MBTL-OmpCA 및 MBTL-OmpCA-CA의 배양조건에 따른 카로테노이드에 대한 결과이다.
도 15는 탄산무수화효소가 세포내 유도과발현 되는 재조합 로도박터 스페로이드균주 MBTL-CA, 포스포에놀피루브산카르복실화효소가 세포내 유도과발현 되는 재조합 로도박터 스페로이드균주 MBTL-PEPC, 탄산무수화효소가 세포표면 발현 및 세포내 유도과발현이 동시에 되는 재조합 로도박터 스페로이드균주 MBTL-ompCA-CA 및 탄산무수화효소가 세포표면 발현 및 포스포에놀피루브산카르복실화효소가 세포내 유도과발현이 동시에 되는 재조합 로도박터 스페로이드균주 MBTL-OmpCA-PEPC의 시간에 따른 이산화탄소의 저감 효율에 대한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16는 상기 재조합 로도박터 스페로이드균주 MBTL-CA, MBTL-PEPC, MBTL-ompCA-CA 및 MBTL-OmpCA-PEPC의 배양조건에 따른 박테리오클로로필에 대한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 상기 재조합 로도박터 스페로이드 균주 MBTL-CA, MBTL-PEPC, MBTL-OmpCA-CA 및 MBTL-OmpCA-PEPC의 배양조건에 따른 카로테노이드에 대한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 상기 재조합 로도박터 스페로이드 균주 MBTL-CA, MBTL-PEPC, MBTL-OmpCA-CA 및 MBTL-OmpCA-PEPC의 배양조건에 따른 배지 내에 존재하는 말산 생성에 대한 분석의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 19 상기 재조합 로도박터 스페로이드 균주 MBTL-CA, MBTL-PEPC, MBTL-OmpCA-CA 및 MBTL-OmpCA-PEPC의 배양조건에 따른 배지 내에 존재하는 숙신산 생성에 대한 분석의 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이 이산화탄소의 고정화에 대표적인 효소 중 하나인 탄산무수화효소는 이산화탄소를 중탄산염으로 전환시킴으로써 역할을 하며 매우 빠르게 진행된다. 하지만, 탄산무수화효소는 효소로서의 안정성을 오랫동안 지속하지 못하는 단점을 갖고 있기 때문에 산업적으로 활용이 어렵다는 문제점이 있었다.
나아가 종래의 광합성 세균인 로도박터 스페로이드를 활용한 이산화탄소 저감 효율이 미미하여 산업적으로 활용되기 어려운 문제가 있었다.
이에 본 발명의 바람직한 일구현예에 따르면, 1)프로모터를 코딩하는 핵산서열; 2)로도박터 스페로이드의 세포 외막단백질(outer membrane protein: omp)을 코딩하는 일부 유전자 단편; 3)탄산무수화효소(Carbonic anhydrase: CA)에 포함된 전장 DNA의 일부 또는 전부 탄산무수화효소 유전자 단편;및 4)로도박터 스페로이드의 세포 외막단백질을 코딩하는 나머지 일부 유전자 단편이 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있는 재조합 발현벡터를 제작하였다. 이를 통해 종래의 로도박터 스페로이드의 이산화탄소 저감 효율보다 우수한 이산화탄소 저감 효과 및 이를 기반으로 한 유용한 생리활성물질의 생산성의 향상 되었다.
먼저, 본 발명의 재조합 발현벡터는 1) 프로모터를 코딩하는 핵산서열을 포함한다.
본 발명의 용어 "프로모터"는 유전자의 발현을 조절하는 핵산 서열을 가리킨다. "프로모터 서열"은 세포 내에서 RNA 중합효소에 결합하여 코딩 서열의 하류로 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터 서열 내에는 RNA 중합효소 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인(보존 서열)뿐만 아니라 전사 개시 부위가 발견된다.
본 발명의 재조합 발현벡터에 포함되는 프로모터는 종래 알려진 임의의 프로모터가 포함될 수 있다. 상기 프로모터에는 원핵생물, 곰팡이,식물 및 동물에서 작용하는 프로모터가 포함될 수 있는데, 특히, 박테리아 벡터에서 작용하는 프로모터를 사용할 수 있다.
상기 프로모터로 바람직하게는 puc, lac, tac, lacUV5-t7 hybrid 등과 같은 Lac operon based 프로모터가 포함되나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 바람직하게는 puc 프로모터 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 로도박테 스페로이드 유래 puc 프로모터 일 수 있다. 상기 puc 프로모터는 본 발명의 재조합 발현벡터가 로도박터 스페로이드에서 발현될 수 있도록 하기 위함으로써 발현 효율을 극대화 시키는 역할을 수행한다.
다음, 2) 로도박터 스페로이드의 세포 외막단백질을 코딩하는 일부 유전자 단편을 포함한다.
본 발명에서 세포 외막단백질은 외래 단백질의 표면발현의 모체로 사용하기 위한 것으로서, 단백질이나 펩타이드등을 적절한 표면 발현 모체(surface anchoring motif)와 융합시켜서 그람 음성균, 그람 양성균, 곰팡이, 효모 및 동물세포의 표면에 발현시키기 위한 도구로 사용된다.
세포 외막단백질의 종류로는 세포 외막단백질, 지질 단백질(lipoprotein), 분비 단백질(secretory protein), 편모 단밸질과 같은 표면기관 단백질 등 크게 4가지이다. 그람 음성 세균의 경우 LamB, PhoE, OmpA 등과 같은 세포 외막에 존재하는 단백질을 주로 이용한다. 세포 외막단백질 중 omp를 사용하는 이유로는 표면 발현 모체인 omp는 매우 효율적인 분비 신호 서열틀 가지고 있고, 세포 외막 표면에 안정되게 부착될 수 있는 표적신호(targeting signal)을 갖추며, 동시에 큰 크기를 가지고 있는 외래 단백질도 전달이 가능하며, 많은 양을 안정적으로 발현시킬 수 있는 장점을 갖고 있다.
본 발명의 세포 외막단밸질은 바람직하게는 omp 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 로도박터 스페로이드 유래 omp 일 수 있다.
또한 본 발명의 세포 외막단백질을 코딩하는 일부 유전자 단편은 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중 1-276번째 서열을 포함하는 Omp-A의 첫 번째 단편 부분을 포함할 수 있다.
상기 세포 외막단백질을 코딩하는 일부 유전자 단편을 포함하는 이유는, 세포 외막단백질을 코딩하는 유전자를 일부 유전자 단편과 나머지 일부 유전자 단편으로 나누어 차례대로 각각을 삽입하여 클로닝하고, 각각의 단편 사이에 탄산무수화효소를 코딩하는 탄산무수화효소 유전자를 삽입하여 외막단백질 omp의 두 번째 루프 사이에 샌드위치 형태로 발현되게 하여 세포표면에 발현되게 하기 위함으로써, 외막단백질 omp를 나누는 기준이 되는 지점이 92번째 아미노산이 발현되는 곳이기 때문이다.
다음, 3) 탄산무수화효소에 포함된 전장 DNA의 일부 또는 전부 탄산무수화효소 유전자 단편을 포함한다.
상기 탄산무수화효소는 이산화탄소와 물을 탄산수소이온과 수소이온으로 전환하는 것을 촉매하는 효소이다. 탄산무수화 효소에 의한 반응은 다음과 같다.
CO2 + H2O ----------> H2CO3 HCO3 - + H+
이러한 반응은 주로 이산화탄소의 농도가 높은 조직에서 일어나며 속도는 효소에 의해 일어나는 반응 중 가장 빠른 것으로 알려져 있다. 이 반응의 역반응은 빠르지만 촉매를 필요로 하지 않고 이산화탄소 농도가 낮은 폐 신장(kidney)의 네프론(nephron)이나 식물의 세포에서 일어난다. 이와 같은 탄산무수화효소는 탄산탈수효소라고도 하며, 자연계에는 α, β, γ, δ, ε형 등 몇 가지 종류의 서로 다른 탄산무수화효소가 존재하며, 동물에 존재하는 α형 탄산무수화효소, 식물에 존재하는 β형 탄산무수화효소, 규조류(diatoms)에는 아연 대신 카드뮴을 가진 δ형 탄산무수화효소가 존재한다.
본 발명에서 상기 탄산무수화효소는 바람직하게는 미생물 유래의 β형 탄산무수화 효소이며, 보다 바람직하게는 광합성 미생물 유래의 β형 탄산무수화 효소이며, 가장 바람직하게는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides) 유래의 β형 탄산무수화효소를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 탄산무수화효소를 코딩하는 탄산무수화효소 유전자는 탄산무수화효소를 코딩하는 탄산무수화효소 유전자 전부 또는 일부 일 수 있다. 표면발현이 되는 탄산무수화효소의 경우 외막단백질의 외부로 나와 있는 두 번째 루프 사이에 샌드위치 형태로 들어가기 때문에 긴 길이를 갖는 단백질의 발현에 어려움이 있을 수 있으므로 최적의 발현과 활성을 갖는 탄산무수화효소의 염기서열 전부 또는 활성을 갖는 특정 염기서열을 포함할 수 있다.
다음, 4) 로도박터 스페로이드의 세포 외막단백질을 코딩하는 나머지 일부 유전자 단편을 포함한다.
상기 나머지 일부 유전자 단편이라 함은 세포 외막단백질을 코딩하는 일부 유전자 단편과 동일한 종류의 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 단편이 omp라면 나머지 부분도 omp일 수 있으며, 이 경우 omp의 나머지 부분을 모두 포함하거나 일부 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 omp의 경우 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중 277-612번째 서열을 포함하는 일부 또는 나머지 전부를 포함할 수 있다.
상기 세포 외막단백질을 코딩하는 일부 유전자 단편과 세포 외막단백질을 코딩하는 나머지 일부 유전자 단편 사이에 탄산무수화효소를 코딩하는 유전자가 삽입될 수 있다. 이렇게 로도박터 스페로이드의 세포 외막단백질을 표면발현 모체로하여 샌드위치 형태로 삽입된 탄산무수화효소는 외막단백질의 외부로 나와 있는 두 번째 루프 사이에 샌드위치 형태로 발현됨으로써 보다 안정적으로 탄산무수화효소의 활성을 유지하기 위함이며, 실시예 3 및 도 10에 나타난 바와 같이 이를 통해 광합성 세균인 로도박터 스페로이드의 외막단백질을 탄산무수화효소의 표면 발현 모체로 활용하여 재조합된 로도박터 스페로이드가 이산화탄소를 저감하는데 있어 현저하게 증가된 효율을 보임을 확인할 수 있었다.
만약, 본 발명에서 샌드위치 형태가 아닌 표면 발현 모체의 C-말단(C-terminal)부분을 결실(deletion) 시키고 바로 외래 단백질을 결합(C-terminal deletion fusion) 시키는 방법으로 재조합 발현벡터를 제작할 경우, 우리가 원하는 외래 단백질이 세포 밖으로 들어내게 되는 것은 가능하나 표면 발현 모체가 세포에서 전혀 기능을 발휘할 수 없는 경우가 많기 때문에 세포가 정상적으로 성장할 수 없거나 죽는 경우가 있다. 반면, 샌드위치 결합(sandwich fusion) 방법의 경우는 앞에서 말한 방법보다 결합시키기가 매우 어렵지만, 외래 단백질이 발현 모체 단백질의 사이에 들어 있기 때문에 표면 발현 모체가 세포에서 충분히 기능을 발휘할 수 있으므로 안정적인 표면발현이 가능하다는 장점을 갖고있다.
한편, 벡터는 유전 물질(핵산)로 이루어진 구조물을 말한다. 전형적으로, 발현 벡터는 세균 숙주 세포에서 작용성인 복제 개시점, 및 발현 벡터를 포함하는 세균 숙주 세포를 검출하기 위한 선택성 마커를 함유한다.
상기 재조합 발현벡터을 구체적으로 설명하면, 본 발명의 재조합 벡터는 상술한 puc 프로모터를 코딩하는 핵산서열의 전사방향으로 탄산무수화효소에 포함된 전장 DNA의 일부 또는 전부 탄산무수화효소 유전자 단편을 코딩하는 핵산서열이 작동 가능하도록 연결된다. 본 발명의 바람직한 일구현예에서는 서열번호 1로 표시되는 탄산무수화효소 유전자(NCBI accession NO. ABA80557.1)를 클로닝 하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
도 4 내지 도 6의 본 발명의 바람직한 일구현예에 따른 재조합 발현벡터의 개열지도를 참조하면, 탄산무수화효소를 표면발현 시키기 위한 재조합 발현벡터를 제작하였다.
구체적으로, 도 5에 나타난 바와 같이 탄산무수화효소를 코딩하는 탄산무수화효소 유전자를 로도박터 스페로이드의 세포 외막단백질(omp)의 외부로 나와 있는 두 번째 루프 사이에 샌드위치 형태로 발현시키기 위해서 세포 외막단백질 유전자의 두 번째 루프지점인 92아미노산(aa)부분인 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중 1-276번째 서열을 포함하는 Omp-A의 첫 번째 파편 부분과 나머지 112 aa부분인 서열번호 2로 표시되는 염기서열 중 277-612번째 염기서열을 포함하는Omp-B의 두 번째 파편 부분을 나누어 차례대로 Omp-A와 Omp-B의 파편부분을 각각 삽입한 후, 외막단백질 사이에 탄산무수화효소 유전자를 재조합 하였다.
도 6은 본 발명의 일구현예에 따른 재조합 발현벡터의 개열지도로서, pBBR1mcs-4 벡터에 puc 프로모터 및 서열번호 2로 표시되는 로도박터 스페로이드의 세포 외막단백질을 코딩하는 일부 외막단백질 유전자 단편, 서열번호 1로 표시되는 탄산무수화효소에 포함된 전장 DNA의 일부 또는 전부 탄산무수화효소 유전자 단편 및 서열번호 2로 표시되는 로도박터 스페로이드 균주의 외막단백질을 코딩하는 나머지 외막단백질 유전자 단편이 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있다. 이를 통해 로도박터 스페로이드균의 외막단백질을 이용한 표면발현하는 탄산무수화효소를 발현할 수 있다.
또한 도 7 내지 도 9의 본 발명의 바람직한 일구현예에 재조합 발현벡터의 개열지도를 참조하면, 탄산무수화효소를 코딩하는 탄산무수화효소 유전자의 길이에 따른 가장 효율적인 이산화탄소의 저감 효과를 분석하여 최적의 이산화탄소 저감을 갖는 탄산무수화효소의 표면발현 조건을 확립하였다(실시예 1 및 3, 도 10 참조).
이를 통해 pBBR1mcs-4 벡터에 puc 프로모터 및 서열번호 2로 표시되는 로도박터 스페로이드의 세포 외막단백질을 코딩하는 일부 세포 외막단백질 유전자 단편, 서열번호 1의 염기서열 중 360번째 이상의 서열을 필수적으로 포함하는 일부 또는 전부 탄산무수화효소 유전자 단편 및 서열번호 2로 표시되는 로도박터 스페로이드의 세포 외막단백질을 코딩하는 나머지 세포 외막단백질 유전자 단편이 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있는 이산화탄소 저감 효율이 우수한 재조합 발현벡터를 제작하였다.
상기 탄산무수화효소를 코딩하는 탄산무수화효소 유전자의 길이에 따른 가장 효율적인 이산화탄소의 저감 효과에 따른 분석을 수행하는 이유는 표면발현이 되는 탄산무수화효소의 경우 외막단백질의 외부로 나와 있는 두 번째 루프 사이에 샌드위치 형태로 들어가기 때문에 긴 길이를 갖는 단백질의 발현은 어렵기 때문에 최적의 발현과 활성을 갖는 탄산무수화효소의 특정 염기서열을 분석하고자 함이다.
구체적으로, C-말단 부분이 잘려 길이가 다른 탄산무수화효소를 표면발현 시키고자 하였다. 따라서, 상기 실시예 1에 나타난 바와 같이 225bp, 360bp 및 447bp의 길이를 갖는 탄산무수화효소를 이용하여 pET-21a에 삽입한 후 6x His(hexahistidine)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 붙어있는 파편의 탄산무수화효소를 갖는 재조합 벡터를 제작하였다.
상기 제작된 표면발현 재조합 발현벡터에 따른 이산화탄소 저감 효과를 확인한 결과, 실시예 3에 나타난 바와 같이 탄산무수화효소의 길이가 전제 길이로 길어질수록 이산화탄소의 저감 효율이 증가함을 확인하였다. 따라서, 잘리지 않은 전체 길이를 갖는 탄산무수화효소가 표면 발현되었을 때 가장 좋은 이산화탄소 저감 효율을 보이는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 탄산무수화효소 유전자의 전체 길이 중 절반 길이인 120아미노산의 길이부터 이산화탄소 저감 효율이 향상된 이유는 탄산무수화효소의 활성 부위(activity site)가 탄산무수화효소의 앞부분 부터 120아미노산까지 위치해 있기 때문에 그 이하의 길이에서는 탄산무수화효소의 활성을 나타낼 수 없으며, 120아미노산 이상의 길이부터 탄산무수화효소의 활성을 보일 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 전제 길이의 탄산무수화효소를 삽입하였을 때 가장 좋은 효율을 나타내는 이유는 본 실시예에서 사용되고 있는 탄산무수화효소는 이합체(dimer) 형태를 이루고 있는데 가장 마지막 부분인 220번째 아미노산까지 이합체 인터페이스(dimer interface) 에 의한 영향을 받기 때문에 전제 길이의 탄산무수화효소에서 가장 좋은 효율의 이산화탄소 저감을 나타내는 것으로 판단된다(도 10 참조).
한편, 본 발명의 표면발현 재조합 발현벡터는 그로부터 발현되는 재조합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 재조합 발현벡터의 내부에 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 결합 단백질(MBP), FLAG, 5 ~ 7x His(hexahistidine), NusA (N utilization substance A) 또는 Trx(Thioredoxin)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 추가적으로 포함될 수 있다. 그러나 가장 바람직하게는 5 ~ 7x His (hexahistidine)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 추가적으로 포함되는 경우에 발현효율을 극대화시킬 수 있다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피 등을 통하여 신속하고 간단하게 정제될 수 있는 것이다.
본 발명에서 사용한 6x His(hexahistidine)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 탄산무수화효소의 표면발현을 확인하는데 있어 용이하도록 하기 위해 적용한 것이다.
본 발명에서 6x His를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 탄산무수화효소 뒤에 위치하게 함으로써 탄산무수화효소가 표면발현이 잘 되고 있는지 확인 할 수 있는지 알아볼 수 있도록 하였다. 특히, 6x His를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 경우는 다른 뉴클레오타이드 서열들에 비해 길이가 짧아 샌드위치 방식으로 삽입하는 형태의 본 연구에서는 가장 효율적인 뉴클레오타이드 서열이라고 할 수 있다.
또한, 발현 벡터는 재조합 벡터 작제물을 함유하는 세포의 부차집단을 선택할 수 있는 선택 마커를 포함할 수 있다. 마커는 본원에 개시된 융합서열을 함유하는 동일 벡터에 함유될 수 있거나, 별도의 벡터상에 존재할 수도 있다. 선택성 마커는 발현되었을 때, 선택성 마커를 포함하지 않는 세로로부터 세포의 용이한 확인, 분리 선별을 할 수 있도록 세포에 확인가능한 특징을 부여하는 핵산 서열을 말한다. 당분야에 공지된 임의 선택성 마커도 본 발명의 핵산에서 선택성 마커로 사용될 수 있다.
본 발명의 재조합 발현벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명의 바람직한 다른 구현예에 따르면, 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 숙주세포를 제공한다.
"형질전환 또는 트랜스펙션"은 세포외부 DNA가, 수반물질이 있고 없는 상태로 숙주 세포로 들어가는 과정을 말한다. "트랜스펙션된 세포"란 세포 외부 DNA가 세포 내로 도입되어 세포 외부 DNA를 가지고 있는 세포를 가리킨다. DNA는 세포로 도입되어 핵산이 염색체에 삽입되거나 혹은 염색체 외 물질로 복제될 수 있다.
상기 형질전환은 바람직하게는 통상의 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 재조합 발현벡터를 숙주세포 내부로 운반할 수 있다.
또한, 숙주 세포로의 “형질전환” 및/또는 “형질감염”은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4)) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 예를 들어 염화칼슘법을 이용하는 칼슘 처리 또는 일렉트로포레이션은 일반적으로 원핵세포에 대해 사용될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Haror Laboratory Press)(1989)). 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 형질감염은 특정 식물 세포의 형질전환에 사용될 수 있다((Shaw et. al, Gene, 23:315(1983), 국제 공개특허 WO89/05859). 또한 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, 인산칼슘 침전법을 사용할 수 있다(Graham et .al,, Virology, 52:456-457(1978)). 포유동물 숙주 세포로의 형질전환의 일반적인 방법 및 특징은 미국 특허 제 4,399,216호에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 일반적으로 반 솔링겐(Van Solingen) 등의 문헌(J.Bact.,130:946(1977)) 및 히시아오(Hsiao) 등의 문헌(Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 76:3829(1979))의 방법에 따라 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 구현예에 따르면, 1) 제 1 항의 재조합 발현벡터 및 2) 프로모터를 코딩하는 핵산서열 및 탄산무수화효소에 포함된 전장 DNA의 일부 또는 전부 탄산무수화효소 유전자 단편이 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있는 제 1 재조합 발현벡터 및 프로모터를 코딩하는 핵산서열 및 포스포에놀피루브산카르복실화효소에 포함된 전장 DNA의 일부 또는 전부 포스포에놀피루브산카르복실화효소 유전자 단편이 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있는 제 2 재조합 발현벡터로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 재조합 발현백터로 형질전환된 재조합 숙주세포를 제공한다. 이를 통해 로도박터 스페로이드의 세포 외막단백질을 이용한 탄산무수화효소를 코딩하는 세포 외막단백질 유전자를 표면발현하고 동시에 탄산무수화효소를 코딩하는 탄산무수화효소 유전자 및 포스포에놀피루브산카르복실화효소를 코딩하는 포스포에놀피루브산카르복실화효소 유전자를 세포내 유도과발현하는 재조합 숙주세포를 얻을 수 있다.
상기 두 개의 플라스미드를 동시에 발현시키는 2플라스미드 시스템을 통해 탄산무수화효소의 표면발현과 탄산무수화효소 및 포스포에놀피루브산카르복실화효소의 유도과발현을 동시에 작동하게 하는 로도박터 스페로이드 균주를 얻었고, 이를 통해 보다 향상된 이산화탄소의 저감 효과와 증가된 유기물질의 생산을 확인할 수 있었다.
상기 "유도과발현(inducible over-expression)"은 재조합 발현벡터를 숙주세포 내에 형질전환 되어 특정 유전자의 과발현을 유도하는 것을 의미한다.
본 발명의 재조합 발현벡터 제작에 사용된 puc 프로모터의 경우는 광수확 복합체(light-harvesting complex)에서 얻어진 프로모터로서, 산소 1% 이하의 조건에서 빛이 있는 경우에 활성이 되어 프로모터로서의 기능을 시작하게 된다. 본 발명에서의 탄산무수화효소 및 포스포에놀피루부산카르복실화효소는 puc 프로모터에 의해 발현이 유도되어 보다 많은 양의 과발현이 진행됨을 의미한다.
먼저, 제 1 재조합 발현벡터는 도 2로 표시되는 본 발명의 일구현예에 따른 재조합 벡터의 개열지도를 참조하면, pBBR1mcs-2 벡터에 puc 프로모터 및 서열번호 1로 표시되는 탄산무수화효소에 포함된 전장 DNA의 일부 또는 전부 탄산무수화효소 유전자 단편이 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있다. 이를 통해 로도박터 스페로이드에 형질전환 되었을 때 세포내에서 탄산무수화효소를 유도과발현할 수 있다.
다음, 도 3으로 표시되는 본 발명의 바람직한 일구현예에 따른 제 2 재조합 발현벡터의 개열지도를 참조하면, 상기 상술한 제 1 재조합 발현벡터와 동일한 구조이며, pBBR1mcs-2 벡터에 puc 프로모터 및 서열번호 3으로 표시되는 포스포에놀피루브산카르복실화효소(NCBI accession NO. Q3J5V6.1)에 포함된 전장 DNA의 일부 또는 전부 포스포에놀피루브산카르복실화효소 유전자 단편이 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있다. 이를 통해 로도박터 스페로이드균주 내에 형질전환 되었을 때 세포내에서 포스포에놀피루브산카르복실화효소를 유도과발현할 수 있다.
상기 포스포에놀피루브산카르복실화효소는 포스포에놀피루브산과 CO2에서 옥살로아세트산을 생성하는 비가역반응을 촉매하는 효소로서, 식물이나 세균에는 널리 존재한다. 이 효소는 시트르산회로에 옥살로아세트산을공급하는 주요한 역할을 함과 동시에 광합성시 C4식물의 탄산고정반응(C4경로)이나 CAM식물의 말산 생성(꿩의 비름형 유기산대사)에도 관여하고 있다.
실시예 9에 나타난 바와 같이 탄산무수화효소의 표면발현과 함께 포스포에놀피루브산카르복실화효소의 유도과발현을 통하여 유기산인 말산 및 숙신산의 생성의 향상을 가져올 수 있음을 확인할 수 있었다(도 18 및 19 참조).
또한, 상기 두 개의 플라스미드를 동시에 발현시키는 2플라스미드 시스템을 통해 탄산무수화효소의 표면발현과 탄산무수화효소 및 포스포에놀피루브산카르복실화효소의 유도과발현을 동시에 작동하게 하는 로도박터 스페로이드 균주를 얻었고, 이를 통해 보다 향상된 이산화탄소의 저감 효과와 증가된 유기물질의 생산을 확인할 수 있었다.
실시예 7에서 확인할 수 있듯이 포스포에놀피루브산카르복실화효소의 유도과발현에 의한 이산화탄소의 저감 효과가 있었으며, 특히 탄산무수화효소의 표면발현과 함께 포스포에놀피루브산카르복실화효소의 유도과발현이 되는 경우에 보다 높은 이산화탄소의 저감 효율을 확인할 수 있었다. 따라서, 탄산무수화효소의 표면발현과 포스포에놀피루브산카르복실화효소의 유도과발현을 통해서 보다 높은 이산화탄소 저감 효율을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예 9에서 확인할 수 있듯이 탄산무수화효소의 표면발현과 함께 포스포에놀피루브산카르복실화효소의 유도과발현을 통하여 유기산인 말산 및 숙신산의 생성의 향상을 가져올 수 있음을 확인할 수 있으며, 이는 보다 높은 이산화탄소 저감을 기반으로 한 생성 결과로 판단된다.
한편, 상기 재조합 발현벡터의 숙주세포로서 로도박터 스페로이드일 수 있다.
상기 재조합 발현벡터로 형질전화된 재조합 숙주세포는 이산화탄소 저감 효과가 뛰어나고, 보다 높은 이산화탄소 저감 결과로 로도박터 스페로이드 유래의 생리활성물질의 생성이 향상됨을 알 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 구현예에 따르면, 상기 재조합 로도박터 스페로이드를 이용하여 이산화탄소를 저감하고 생리활성물질을 향상시키는 방법을 제공한다.
결국, 본 발명의 재조합 발현벡터는 이산화탄소의 고정화에 대표적인 효소 중 하나인 탄산무수화효소의 표면발현을 통해 보다 효소로서의 안정성을 쉽고 오랫동안 활용할 수 있고 이를 통해 이산화탄소를 기반으로 다양한 유용 물질을 생산할 수 있는 광합성 세균인 로도박터 스페로이드를 통한 최적의 이산화탄소 저감 효율 및 고부가가치 물질의 생산을 향상시킬 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예
실시예 1: 재조합 벡터 pJY - CA 및 pJY - PEPC 의 제조
탄산무수화효소 및 포스포에놀피루브산카르복실화효소 발현벡터를 제조하기 위하여 본 실시예에서는 광합성 세균인 로도박터 스페로이드 KCTC 1434 균주를 사용 하였으며, 단백질 발현벡터로 알려진 pET-21a(Novagen, Madison, Wi, USA) 벡터를 사용하여 클로닝을 하여 탄산무수화효소(CA) 또는 포스포에놀피루브산카르복실화효소(PEPC)에 6x His를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 결합시켰다.
로도박터 스페로이드의 유전체 데이터로부터 탄산무수화효소 및 포스포에놀피루브산카르복실화효소의 유전자 서열을 NCBI의 genebank (www.ncbi.nlm.nih.gov)로부터 확보한 후, 표 1에 나타낸 in-CA-F, in-CA-R, in-PEPC-F, in-PEPC-R을 갖는 프라이머를 제작하였다(Bioneer Co. Korea). 다음으로, 로도박터 스페로이드 균주로부터 게놈 DNA를 추출하고, 이를 주형으로 하여 상기의 프라이머 쌍을 사용하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여 탄산무수화효소 유전자와 포스포에놀피루브산카르복실화효소 유전자를 증폭하였다. PCR 증폭산물을 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동한 결과, 탄산무수화효소는 0.67kb, 포스포에놀피루브산카르복실화효소는 1.60kb의 단편을 가지는 유전자를 확인하였다. 상기 유전자들은 모두 GeneAll PCR DNA purification kit로 정제한 후 사용하였다. 상기에서 얻어진 탄산무수화효소와 포스포에놀피루브산카르복실화효소를 대장균-단백질 발현벡터인 pET-21a를 기본 벡터로 사용하여 pET21-CA와 pET21-PEPC를 제작하였으며, 제작과정은 다음과 같다.
상기에서 증폭한 탄산무수화효소 절편은 BamH I과 Hind III(Enzynomics Inc. Korea)로, 포스포에놀피루브산카르복실화효소 절편은 EcoR I과 Hind III(Enzynomics Inc. Korea) 로 각각 절단하여 동일한 제한 부위를 절단한 pET-21a 벡터에 도입하였으며, 이를 pET21-CA와 pET21-PEPC로 각각 명명하였다. 본 실시예에서 제조한 벡터 pET21-CA와 pET21-PEPC를 대장균인 Escherichia coli BL21(DE3)에 전기천공법(Electroporation)으로 형질전환하였고, 암피실린이 함유된 LB 고체평판배지에서 얻은 콜로니를 새로운 배지에 옮겨 단일 콜로니를 얻었다. DNA 시퀀싱(Sequancing) 방법으로 pET21-CA와 pET21-PEPC에 삽입된 탄산무수화효소 및 포스포에놀피루브산카르복실화효소의 유전자 염기서열을 정확히 확인하였다.
또한 이렇게 얻어진 재조합 플라스미드를 로도박터 스페로이드에서 발현시킬 수 있도록 하기위해 그람 음성균에 광범위 호스트 범위 벡터인 pBBR1mcs-2(Kovach et al., 1995)를 사용하고자 하였다. 하지만 pBBR1mcs-2벡터에는 발현을 진행시킬 수 있는 프로모터가 없기 때문에 로도박터 스페로이드에 있는 puc 프로코터를 이용하고자 하였다. 따라서 본 실시예의 상기 내용에 있는 방법과 동일하게 puc 프로모터를 얻었으며, 사용한 프라이머는 표1에 나와있는 puc promoter-F와 puc promoter-R 이다. 또한 사용한 제한효소의 자리는 Kpn I과 Sal I이며 벡터 또한 동일하게 하여 최종적으로 puc 프로모터가 삽입된 pJYKm 벡터를 얻을 수 있었다(도 1).
이렇게 얻어진 재조한 플라스미드에서 본 실시예에서 시행한 동일한 방법으로 표 1에 나타낸 in-CA-his-F와 in-CA-his-R의 프라이머로 탄산무수화효소에 6x His(hexahistidine)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 연결된 CA-his 유전자와 in-PEPC-his-F와 in-PEPC-his-R 의 프라이머로 포스포에놀피루브산카르복실화효소에 6x His(hexahistidine)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 연결된 PEPC-his 유전자를 PCR을 통해 얻을 수 있었다. 또한 그람 음성균에 광범위 호스트 범위 벡터인 pBBR1mcs-2(Kovach et al., 1995)에 puc 프로모터가 들어간 pJYKm벡터에 CA-his와 PEPC-his 각각 Sal I과 Xba I으로 제한효소를 통해 절단하여 삽입을 시켰다. 이렇게 CA-his가 삽입된 벡터를 pJY-CA라고 명명하였고, PEPC-his가 삽인된 벡터를 pJY-PEPC라 명명하였다. 본 실시예에서 제조한 벡터 pJY-CA와 pJY-PEPC를 로도박터 스페로이드에 형질전환 시켜 얻어진 재조합 미생물을 MBTL-CA와 MBTL-PEPC라 명명하였다(도 2 및 도 3). 로도박터 스페로이드에 의해 형질전환된 재조합 미생물 MBTL-CA 및 MBTL-PEPC는 2013년 5월 31일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁번호 KACC91803P 및 KACC91804P로 기탁되었다.
플라스미드 벡터 제조를 위한 프라이머 세트
프라이머 염기서열 서열번호 제한효소
puc promoter-F tatggtaccgcagaggggtcttgcggcacc 서열번호 5 Kpn I
puc promoter-R acagtcgacttgtactctcccgaatgtgct 서열번호 6 Sal I
Omp-A-F caggtcgacatgcagatgcacacgatgatt 서열번호 7 Sal I
Omp-A-R atactgcagaccgtccagcgacacgtcatg 서열번호 8 Pst I
CA-his-F tatctgcaggtggacctgactgaggacgac 서열번호 9 Pst I
CA-his-R ataggatccgtggtggtggtggtggtgctc 서열번호 10 BamH I
Omp-B-F tatggatccctgggcaaaatcggctcggtc 서열번호 11 BamH I
Omp-B-R ctgtctagatcagaacttccagatgtagga 서열번호 12 Xba I
CA1 -447-F ataggatccgtggacctgactgaggacgac 서열번호 13 BamH I
CA1 -447-R acaaagcttgatgtccatccagaggccgac 서열번호 14 Hind III
CA1 -360-F ataggatccgtggacctgactgaggacgac 서열번호 15 BamH I
CA1 -360-R tgtaagcttgccgcagttggaatggccgag 서열번호 16 Hind III
CA1 -225-F ataggatccgtggacctgactgaggacgac 서열번호 17 BamH I
CA1 -225-R ctgaagcttgatgaagaattcgccctcgtc 서열번호 18 Hind III
in-PEPC-F caggaagtggacctgactgaggacgac 서열번호 19 EcoR I
in-PEPC-R agtaagcttgccgatcgcggccgccttcac 서열번호 20 Hind III
in-PEPC-his-F actgtcgacatgaatttcggacgcgtgaac 서열번호 21 Sal I
in-PEPC-his-R atatctagatcagtggtggtggtggtggtg 서열번호 22 Xba I
in-CA-his-F actgtcgacgtggacctgactgaggacgac 서열번호 23 Sal I
in-CA-his-R atatctagatcagtggtggtggtggtggtg 서열번호 24 Xba I
in-CA-F tatggatccgtggacctgactgaggacgac 서열번호 25 BamH I
in-CA-R tataagcttgaccggcacgaagccctgtcc 서열번호 26 Hind III
사용된 플라스미드 및 균주
균주 또는
플라스미드
관련 유전자형(Relevant genotype) 		원천 또는
참고자료
pET-21a Apr,f1origin,6x hitidylfusionvector Novagen, Madison, WI, USA
pET21-CA pET21a, CA from R. sphaeroides This study
pET21-PEPC pET21a, PEPC from R. sphaeroides This study
pBBR1mcs-2 Broad-host-range vector; Kmr Kovach et al., 1995
pJYKm pBBR1mcs-2, puc promoter from R. sphaeroides This study
pJY-CA pJYKm, CA and 6x hitidyl fusion from pET21-CA This study
pJY-PEPC pJYKm, PEPC and 6x hitidyl fusion from pET21-PEPC This study
pBBR1mcs-4 Broad-host-range vector; Apr Kovach et al., 1995
pJYAp pBBR1mcs-4, puc promoter from R. sphaeroides This study
pJY-Omp pJYAp, Omp from R. sphaeroides This study
pJY-OmpCA1-225 pJY-Omp, truncated CA1-225 (8kDa) from R. sphaeroides and 6x histidne fusion from pET-21a This study
pJY-OmpCA1-360 pJY-Omp, truncated CA1-360 (13kDa) from R. sphaeroides and 6x histidine fusion from pET-21a This study
pJY-OmpCA1-447 pJY-Omp, truncated CA1-447 (16kDa) from R. sphaeroides and 6x histidine fusion from pET-21a This study
pJY-OmpCA pJY-Omp, CA(24kDa) from R. sphaeroides and
6x histidine fusion from pET-21a 		This study


균주

세부기술
R. sphaeroides KCTC1434 Wild-type strain Korean collection for type culture, Korea
R. sphaeroides MBTL KTCT 1434, pJYKm This study
R. sphaeroides MBTL-CA KTCT 1434, pJYKm-CA KACC91803P
R. sphaeroides MBTL-PEPC KTCT 1434, pJYKm-PEPC KACC91804P
R. sphaeroides MBTL-Omp KTCT 1434, pJY-Omp This study
MBTL-OmpCA1-225 KTCT 1434, pJY-OmpCA1-225 This study
MBTL-OmpCA1-360 KTCT 1434, pJY-OmpCA1-360 This study
MBTL-OmpCA1-447 KTCT 1434, pJY-OmpCA1-447 This study
MBTL-OmpCA KTCT 1434, pJY-OmpCA KACC91805P
MBTL-OmpCA-CA KTCT 1434, pJY-OmpCA, pJY-CA KACC91806P
MBTL-OmpCA-PEPC KTCT 1434, pJY-OmpCA, pJY-PEPC KACC91807P
실시예 2: 재조합 벡터 pJY - OmpCA , pJY - OmpCA 1 -225 , pJY - OmpCA 1 -360 및 pJY -OmpCA 1-447 의 제조
로도박터 스페로이드의 외막단백질을 탄산무수화효소의 표면 발현 모체로 활용하여 표면발현 시스템을 갖는 재조합 균주를 제작하였다.
상기 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 puc 프로모터를 암피실린 항생제를 사용하는 그람 음성균에 광범위 호스트 범위 벡터인 pBBR1mcs-4(Kovach et al., 1995)를 동일 프라이머를 사용하여 pJYAp 벡터를 제작하였다(도 4). 또한 외막단백질을 이용하기 위해서 로도박터 스페로이드(KCTC1434)에 존재하는 Omp 단백질의 DNA염기 서열을 통해 Omp의 두 번째 루프지점인 92 아미노산(amino acid)부분인 Omp-A의 첫 번째 파편 부분과 나머지 112 아미노산부분인 Omp-B의 두 번째 파편 부분을 나누어 차례대로 Omp-A와 Omp-B의 파편부분을 각각 삽입시켰으며, 사용한 프라이머는 Omp-A-F와 Omp-A-R 그리고 Omp-B-F와 Omp-B-R이며, 각각 Sal I과 Pst I을 Omp-A에 Pst I과 BamH I을 Omp-B의 제한효소로 사용하였다. 이렇게 Omp가 삽입된 재조합 벡터를 pJY-Omp로 명명하였으며, 상기 벡터가 들어간 재조합 균주를 MBTL-Omp로 명명하였다(도 5).
제조된 벡터 pJY-Omp에 탄산무수화효소 유전자를 삽입하기 위해서 Omp-A와 Omp-B의 사이에 존재하는 Pst I과 BamH I의 자리에 pJY-CA로부터 얻어지는 CA-his 유전자를 표 1에 표시되는 CA-his-F와 CA-his-R의 프라이머를 PCR을 통해서 유전자를 얻어 탄산무수화효소가 표면발현시스템을 갖는 재조합 벡터를 제작하였다. 다음과 같이 제작된 벡터를 pJY-OmpCA로 명명하였으며, 이 벡터가 삽입된 재조합 균주를 MBTL-OmpCA로 명명하였다(도 6). 로도박터 스페로이드에 의해 형질전환된 재조합 미생물 MBTL-OmpCA는 2013년 5월 31일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁번호 KACC91805P로 기탁되었다.
표면발현이 되는 탄산무수화효소의 경우 외막단백질의 외부로 나와 있는 두 번째 루프 사이에 샌드위치 형태로 들어가기 때문에 긴 길이를 갖는 단백질의 발현은 어렵기 때문에 최적의 발현과 활성을 갖는 탄산무수화효소의 길이를 확인하고자 상기 실시예2-2와 동일한 방법으로 C-말단 부분이 잘려 길이가 다른 탄산무수화효소를 표면발현시키고자 하였다. 따라서, 상기 실시예 1에서 진행한 방법으로 225bp, 360bp, 447bp의 길이를 갖는 탄산무수화효소를 이용하여 pET-21a에 삽입한 후 poly his tag이 붙어있는 파편의 탄산무수화효소를 pJY-Omp의 Pst I과 BamH I의 자리에 삽입하여 pJY-OmpCA와 동일한 형태를 갖는 재조합 벡터를 제작하였다. 탄산무수화효소의 길이에 따라 각각 pJY-OmpCA1 -225, pJY-OmpCA1 -360, pJY-OmpCA1 -447, 으로 명명하였으며, 이 벡터들이 삽입된 재조합 균주를 MBTL-OmpCA1 -225, MBTL-OmpCA1 -360, MBTL-OmpCA1-447, 으로 명명하였다(도 7, 도 8 및 도 9).
실시예 3: 재조합 균주 MBTL - OmpCA 1 -225 , MBTL - OmpCA 1 -360 , MBTL - OmpCA 1 -447 , MBTL-OmpCA 및 MBTL - Omp 의 이산화탄소 저감 효율 분석
상기 실시예 2에서 제작된 재조합 로도박터 스페로이드 균주MBTL-OmpCA1 -225, MBTL-OmpCA1-360, MBTL-OmpCA1 -447, MBTL-OmpCA 및 MBTL-Omp의 성장에 이산화탄소 저감 효율을 확인하고자 하였다.
하기 표 3에 나타낸 로도박터 스페로이드의 배지인 sistrom’s minimal mediun를 사용하였다. 100ml 배양용기에 60ml의 배지를 넣은 후 암피실린을 50ug/ml가 되도록 넣은 후 아르곤가스 퍼징을 7분 한 후 혼합가스(질소 95%, 이산화탄소 5%)로 퍼징을 20초 한 후 안정화를 시킨 다음, 상기 재조합 균주를 5% 접종하여 30oC, 180rpm, 빛 조건에서 배양하였다.
배양된 균주에 혼합가스(질소 95%, 이산화탄소 5%)의 퍼징으로 인해 처음 배양용기에 들어 있는 이산화탄소의 양을 60/80 carbonxen-1000 컬럼(Supelco, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 GC(gas chromatography(DS 6200, Donam Instrument INC. Korea)를 이용하여 분석하였다.
그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이 72시간 동안 배양한 결과 MBTL-Omp와 MBTL-OmpCA1-225, 의 경우는 비슷한 이산환탄소 저감효울을 보였으며, MBTL-OmpCA1 -360부터 탄산무수화효소의 길이가 전제 길이로 길어질수록 이산화탄소의 저감 효율이 증가함을 확인하였다. 따라서, 잘리지 않은 전체 길이를 갖는 탄산무수화효소가 표면 발현되었을 때 가장 좋은 이산화탄소 저감 효율을 보이는 것을 확인 할 수 있었다.
또한 탄산무수화효소의 전제 길이 중 절반 길이인 120아미노산의 길이부터 이산화탄소 저감 효율이 향상된 이유는 탄산무수화효소의 활성부위(activity site)가 탄산무수화효소의 앞부분부터 120아미노산까지 위치해 있기 때문에 그 이하의 길이에서는 탄산무수화효소의 활성을 나타낼 수 없으며, 120아미노산 이상의 길이부터 탄산무수화효소의 활성을 보일 수 있다는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 전제 길이의 탄산무수화효소를 삽입하였을 때 가장 좋은 효율을 나타내는 이유는 본 실시예에서 사용되고 있는 탄산무수화효소는 이합체(dimer) 형태를 이루고 있는데 가장 마지막 부분인 220아미노산까지 이합체 인터페이스(dimer interface)에 의한 영향을 받기 때문에 전제 길이의 탄산무수화효소에서 가장 좋은 효율의 이산화탄소 저감 효과를 보이 것으로 판단된다.
sistrom's minimal medium의 조성
KH2PO4 2.72g
(NH4)2SO4 0.5g
Succinic acid 4g
L-glutamic acid 0.1g
L-Aspartic acid 0.04g
NaCl 0.5g
Nitrilotriacetic acid 0.2g
MgSO4.7H2O 0.3g
CaCl2.2H2O 0.033g
FeSO4.7H2O 0.0002g
(NH4)6Mo7O24(1%solution) 0.2ml
미량원소용액 / 100ml EDTA 1.765g 0.1ml
ZnSO4 . 7H2O 10.95g
FeSO4 . 7H2O 5g
MnSO4 . H2O 1.54g
CuSO4 . 5H2O 0.392g
Co(NO3)2 . 6H2O 0.248g
H3BO3 0.114g
비타민 용액 / 100ml Nicotinic acid 1g 0.1ml
Thiamine HCl 0.5g
Biotin 0.01g
Casamino acid 2g
최종부피 1L
실시예 4: 재조합 균주 MBTL , MBTL - CA , MBTL - OmpCA 및 MBTL - OmpCA - CA 의 표면발현의 확인
재조합된 로도박터 스페로이드 MBTL, MBTL-CA, MBTL-OmpCA 및 MBTL-OmpCA-CA의 표면발현의 여부를 확인하기 위해서 공초점 주사레이져 현미경(LSM 510 META)을 이용하여 형광이미지를 통해 표면 발현의 여부를 확인하였다.
상기 실시예 3에서와 같은 방법으로 재조합 균주를 배양한 후, 세포의 농도가 OD600=0.5 일 때 세포를 수거하여 2% 소혈청 알부민(BSA)을 인산완충용액(PBS)에 녹인 용액으로 2시간 동안 반응을 시킨 후 1차 항체인 rabbit anti-6-His (bethyl)을 1:500의 부피비로 녹인 1% BSA/PBS 용액을 4oC에서 12시간 반응을 시켰다. 그 다음 1% BSA/PBS 용액으로 2번 세척을 하여 2차 항체인 goat anti-rabbit lgG conjugated with rhodamine(Millipore)을 1:50의 부피비로 녹인 1% BSA/PBS 용액으로 실온에서 3시간 반응을 시킨 후 PBS 용액으로 5회 세척을 하여 샘플을 제작한 후 공초점 주사레이져 현미경을 통해 543nm에서 관찰하였다.
그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이, 대조군인 MBTL의 경우는 세포표면이 발현되지 않았으며, 탄산무수화효소의 내부 발현의 경우는 보다 약하게 발현되었다. 또한 탄산무수화효소를 표면발현 시킨 경우 대부분의 세포에서 보다 뚜렷한 형광을 나타내었으며, 세포표면발현이 잘 이루어졌음을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 재조합 균주 MBTL , MBTL - CA , MBTL - OmpCA 및 MBTL - OmpCA - CA 에 의한 이산화탄소 저감 효율 분석
재조합 로도박터 스페로이드 균주 MBTL, MBTL-CA, MBTL-OmpCA 및 MBTL-OmpCA-CA의 이산화탄소 저감 효율을 확인하기 위해서 배양을 진행 후 24, 48 및 72시간에 존재하는 이산화탄소의 양을 측정하여 저감된 이산화탄소 효율에 대해 분석하였다.
상기 균주의 배양 조건은 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 진행을 하였으며, 배양을 하면서 24, 48 및 72시간에 배양용기 내부에 존재하고 있는 이산화탄소의 양을 측정하기 위해서 60/80 carbonxen-1000 컬럼(Supelco, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 GC(gas chromatography(DS 6200, Donam Instrument INC. Korea)를 이용하여 분석하였다.
그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타난 바와 같이, 대조군인 MBTL보다 탄산무수화효소의 표면발현 된 경우 또는 유도과발현 된 경우에서 보다 높은 이산화탄소의 저감 효율을 나타냈으며, 특히 탄산무수화효소의 표면발현과 함께 유도과발현이 함께 된 2플라스미드 시스템을 갖는 MBTL-OmpCA-CA의 경우 가장 좋은 이산화탄소 저감 효율을 나타냈다(도 4 참고). 따라서, 탄산무수화효소는 이산화탄소 저감 효율을 향상시키는 영향을 주며, 세포의 표면발현과 세포 내부의 유도과발현을 통해 보다 효율적인 이산화탄소 저감을 가져올 수 있음을 확인하였다.
로도박터 스페로이드에 의해 형질전환된 재조합 미생물 MBTL-OmpCA-CA는 2013년 5월 31일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁번호 KACC91806P로 기탁되었다.
실시예 6: 재조합 균주 MBTL , MBTL - CA , MBTL - OmpCA 및 MBTL - OmpCA - CA 에 의한 생리활성물질의 생성 확인
상기 실시예 5에서 배양된 재조합 로도박터 스페로이드 균주인 MBTL, MBTL-CA, MBTL-OmpCA 및 MBTL-OmpCA-CA가 표면발현된 탄산무수화효소에 의해 보다 많은 이산화탄소 고정화를 통하여 생성되는 로도박터 스페로이드 유래 생리활성물질인 박테리오 클로로필 및 카로테노이드를 측정하고자 하였다.
6-1. 박테리오클로로필의 확인
박테리오클로로필을 측정하기 위하여 상기 균주 배양액 10 ml을 3000rpm, 10분 동안 원심분리하여 세포만 회수하고, 아세톤 : 메탄올 : 배지 = 7 : 2 : 1의 부피비로 넣어준 뒤, 빛을 차단시키고 1시간 동안 반응시킨 후 UV spectrophotometer를 통해 772nm에서 흡광도 측정을 하였다.
그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타난 바와 같이, 탄산무수화효소가 표면발현 또는 유도과발현이 된 조건에서 보다 높은 박테리오클로로필의 농도를 확인할 수 있었다. 따라서, 탄산무수화효소의 표면발현 또는 유도과발현을 통해 보다 많은 이산화탄소의 고정화로 인하여 박테리오클로로필의 농도가 증가하였다고 판단 할 수 있다.
6-2. 카로티노이드의 확인
카로티노이드 함량을 측정하기 위하여 배양액을 10000rpm, 20분 동안 원심분리 후 세포를 멸균수로 2번 세척하고 -50oC, 48시간 동안 동결건조 하였다. 건조된 세포에 3 mol HCl 을 넣어주고 28oC, 100rpm으로 30분동안 반응시키고, 10000rpm, 20분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 아세톤을 넣고 28oC, 100rpm, 30분 동안 반응시키고, 10000rpm, 20분 동안 원심분리 하여 상층액을 회수하였다. UV spectrophotometer를 통해 480nm에서 흡광도를 측정하였으며, 하기 식에 대입하여 카로티노이드 함량을 확인하였을 때 탄산무수화효소가 표면발현 또는 유도과발현이 된 조건에서 보다 높은 카로테노이드의 농도를 확인할 수 있었다.
카로티노이드 함량(㎍/g)= 1000x(480 nm 에서의 흡광도)x(희석율)x( 아세톤양 )
0.16x(건조중량)
그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타난 바와 같이, 상기 박테리오클로로필의 측정 결과와 동일하며, 탄산무수화효소의 표면발현 또는 유도과발현을 통해 보다 많은 이산화탄소의 고정화를로 인하여 카로테노이드의 농도가 증가됨을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 재조합 균주 MBTL - CA , MBTL - PEPC , MBTL - OmpCA - CA , MBTL - OmpCA -PEPC에 의한 이산화탄소 저감 효율 분석
재조합 로도박터 스페로이드 균주인 MBTL-CA, MBTL-PEPC, MBTL-OmpCA-CA, MBTL-OmpCA-PEPC에 의한 이산화탄소 저감 효율을 확인하기 위해서 배양을 진행 후 24, 48, 72시간에 존재하고 있는 이산화탄소의 양을 측정하여 저감된 효율에 대해 분석하였다. 특히 포스포에놀피루브산카르복실화효소의 유도과발현을 통해 보다 높은 이산화탄소의 저감 효율의 향상에 대한 가능성을 확인하고자 하였다.
상기 균주의 배양 조건은 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 진행을 하였으며, 배양을 하면서 24, 48 및 72시간에 배양용기 내부에 존재하고 있는 이산화탄소의 양을 측정하기 위해서 60/80 carbonxen-1000 컬럼(Supelco, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 GC(gas chromatography(DS 6200, Donam Instrument INC. Korea)를 이용하여 분석하였다.
그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타난 바와 같이, 포스포에놀피루브산카르복실화효소의 유도과발현에 의한 이산화탄소의 저감효과가 있었으며, 특히 탄산무수화효소의 표면발현과 함께 포스포에놀피루브산카르복실화효소의 유도과발현이 되는 경우에 보다 높은 이산화탄소의 저감 효율을 확인할 수 있었다. 따라서, 탄산무수화효소의 표면발현과 포스포에놀피루브산카르복실화효소의 유도과발현을 통해서 보다 높은 이산화탄소 저감 효율을 확인할 수 있었다.
로도박터 스페로이드에 의해 형질전환된 재조합 미생물 MBTL-OmpCA-PEPC는 2013년 5월 31일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁번호 KACC91807P로 기탁되었다.
실시예 8: 재조합 균주 MBTL - CA , MBTL - PEPC , MBTL - OmpCA - CA 및 MBTL - OmpCA-PEPC에 의한 생리활성물질의 생성 확인
상기 실시예 7에서 배양된 재조합 로도박터 스페로이드 균주 MBTL-CA, MBTL-PEPC, MBTL-OmpCA-CA 및 MBTL-OmpCA-PEPC가 표면발현된 탄산무수화효소와 유도과발현된 탄산무수화효소 또는 포스포에놀피루브산카르복실화효소에 의해 보다 많은 이산화탄소 고정화를 통한 로도박터 스페로이드 유래 생리활성 물질인 박테리오클로로필 및 카로테노이드를 측정하였다.
8-1. 박테리오클로로필의 확인
박테리오클로로필을 측정하기 위하여 배양액 10 ml을 3000rpm, 10분 동안 원심분리하여 세포만 회수하고, 아세톤 : 메탄올 : 배지 = 7 : 2 : 1의 부피비로 넣어준 뒤, 빛을 차단시키고 1시간 동안 반응시킨 후 UV spectrophotometer를 통해 772nm에서 흡광도를 측정 하였다.
그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타난 바와 같이, 분석한 4개의 균주 MBTL-CA, MBTL-PEPC, MBTL-OmpCA-CA 및 MBTL- OmpCA-PEPC 모두에서 비슷한 박테리오클로로필의 농도를 확인할 수 있었다.
8-2. 카로티노이드의 확인
카로티노이드의 함량을 측정하기 위하여 배양액을 10000rpm, 20분 동안 원심분리 후 세포를 멸균수로 2번 세척하고 -50oC, 48시간 동안 동결건조 하였다. 건조된 세포에 3 mol HCl 을 넣어주고 28oC, 100rpm으로 30분 동안 반응시키고, 10000rpm, 20분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 아세톤을 넣고 28oC, 100rpm, 30분 동안 반응시키고, 10000rpm, 20분 동안 원심분리하여 상층액을 회수하였다. UV spectrophotometer를 통해 480nm에서 흡광도를 측정하여 하기 식에 대입하여 카로티노이드 함량을 확인하였다.
카로티노이드 함량(㎍/g)= 1000x(480 nm 에서의 흡광도)x(희석율)x( 아세톤양 ) 0.16x(건조중량)
그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타난 바와 같이, 탄산무수화효소가 표면발현 되고 탄산무수화효소 또는 포스포에놀피루브산카르복실화효소가 유도과발현이 된 2플라스미드 시스템 조건인 MBTL-OmpCA-CA 및 MBTL-OmpCA-PEPC 조건에서 보다 높은 카로테노이드의 농도를 확인할 수 있었으며, 그 결과 이산화탄소 저감에 따른 색소의 생산 증가에 대해서는 카로테노이드가 보다 연관 관계가 높게 나타났으며, 보다 많은 이산화탄소의 고정화를 통하여 카로테노이드의 농도가 증가됨을 확인할 수 있었다.
실시예 9: 재조합된 로도박터 스페로이드 MBTL - CA , MBTL - PEPC , MBTL - OmpCA -CA 및 MBTL - OmpCA - PEPC 에 의해 생성되는 유기산에 대한 분석
상기 실시예 7에서 배양된 재조합 로도박터 스페로이드 MBTL-CA, MBTL-PEPC, MBTL-OmpCA-CA 및 MBTL-OmpCA-PEPC에서 생성되는 유기산에 대해 분석하기 위해서 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 배지에서의 말산(Malic acid) 및 숙신산(succinic acid)의 농도를 분석하였다.
9-1. 말산(Malic acid)의 확인
포스포에놀피루브산카르복실화효소의 경우 포스포에놀피루부산이 이산화탄소와 반응하여 옥살로아세트산으로 전환시켜주는 역할을 함으로써 이산화탄소를 사용할 뿐만 아니라 트라이카복신산회로를 통해 보다 많은 유기산의 생성에 영향을 준다는 연구 보고가 알려져 있다.
따라서 고성능액체크로마토그래피를 통한 말산의 생성에 대한 분석을 진행하였으며, 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타난 바와 같이, 포스포에놀피루브산카르복실화효소가 유도과발현된 경우, 보다 높은 말산의 농도를 확인 할 수 있었다. 특히 탄산무수화효소가 표면발현 되고 포스포에놀피루브산카르복실화효소가 유도과발현이 된 2플라스미드 시스템 조건인 MBTL-OmpCA-PEPC에서 보다 높은 농도의 말산을 확인할 수 있었다.
9-2. 숙신산( succinic acid )의 확인
고성능액체크로마토그래피를 통한 숙신산의 생성에 대한 분석을 진행하였을 경우에도 포스포에놀피루브산카르복실화효소가 유도과발현 된 경우, 보다 높은 농도를 보였으며, 말산과 마찬가지로 MBTL-OmpCA-PEPC에서 가장 높은 농도를 나타내었다(도 19).
따라서, 탄산무수화효소의 표면발현과 함께 포스포에놀피루브산카르복실화효소의 유도과발현을 통하여 유기산인 말산 및 숙신산의 생성의 향상을 가져올 수 있음을 확인할 수 있으며, 이는 보다 높은 이산화탄소 저감을 기반으로 한 생성 결과로 판단된다.
국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC91803P 20130531 국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC91804P 20130531 국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC91805P 20130531 국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC91806P 20130531 국립농업과학원 농업유전자원센터 KACC91807P 20130531
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Recombinant expression vectors, host cells that containing the same and their use <130> 1040030 <160> 26 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 669 <212> DNA <213> Carbonic anhydrase of Rhodobacter sphaeroides <400> 1 gtggacctga ctgaggacga cgcaatgcac aatgcgaggc cgcttccgaa ctaccttgtc 60 cagcgtttcc acggctggcg tgccaccacc ttcgccgaca acaagtcctg gtatcgccgg 120 ctctccgaga gcgggcagca tccgcgcgcc atggtgatct cctgctgcga ctcgcgcgtg 180 catgtcacct cgatcttcgg cgcggacgag ggcgaattct tcatccaccg caacatcgcc 240 aatctggtgc cgccctacag ccccgacggg aagcagcacg gcacctcggc cgcggtcgaa 300 tatgcggtca cagcgctcgg tgtggcccat atcgtggtgc tcggccattc caactgcggc 360 ggcgtcaagg gctgccacga catgtgctcg ggcaaggcgc cgcagctcga ggaaacctcg 420 agcttcgtcg gccgctggat ggacatcctg cgccccggct acgagcgggt gaaggatctg 480 cccgaggagg agcgcgtcac cgcgctggag aaggaggccg tgctggtcag catcggcaac 540 ctgatgacct tccccttcgt gcgcgaggcg gtcgagcgcg aggtgctgac gctgcacgcg 600 ctctggaccc acatcggcga gggatcgctc gagcaataca cgcccggaca gggcttcgtg 660 ccggtctga 669 <210> 2 <211> 612 <212> DNA <213> outer membrane protein of Rhodobacter sphaeroides <400> 2 atgcagatgc acacgatgat tcccgcggcc ttcgccgcga ccctcgccct cctcgccgcg 60 gccccggtgg ccgcccagtc ggccggagac atgaccttcg gcataggcct cggcagcgtg 120 atgccgaaat ccgacaatgg cacgctcgcc ggactgggtg cggaggtggg caatgacgtg 180 cagcccacga tcaccttcga atatttcatc cgcgacaacc tcggcatcga gatcctggcc 240 gccacgccct tcaagcatga cgtgtcgctg gacggtctgg gcaaaatcgg ctcggtcaag 300 catctgccgc cgacggtgac gctgcagtat cacttcccca ccggcggcgc cttcgcgccc 360 ttcgtgggtg ccggcgtgac ctatgtcacc ttcttcgacg aagagacgcc gctcggcgat 420 ctcgagctcg acgacagctg gggcctgtcg gtccatgcgg gcttcgacta ctggctgaac 480 gaccgcaacg cgatccgggc cgacgtgcgc tggatggata tcgacagcga cgccaagctc 540 aatggcgcca gcatcggcac cgcggagatc gacccggtgg tggtgggcgt ctcctacatc 600 tggaagttct ga 612 <210> 3 <211> 1596 <212> DNA <213> Phosphoenolpyruvate carboxylase of Rhodobacter sphaeroides <400> 3 atgaatttcg gacgcgtgaa cccagcgcag acgctggacg cacaaggcat cactggactt 60 ggcgaggtgc attacaacct catcgagccc gcgctggtcg aagcggccgt gacgcgcggc 120 gaaggccggc tgggccgcgg aggcgcgttc ctctgctcga ccggtgcctt cacgggccgc 180 tcgcccaagg acaagttcgt cgtgcgcacg ccgtcggtgg aagacacgat ctggtgggaa 240 aacaacgctc ccatggatcc ggccgccttc gaccggctcc atgccgacat gctcgagcac 300 atgaagggcc gcacctactt cgtgcaggac ctgttcgccg gcgccgaccc cgagctgcgc 360 ctcgacgtgc ggatggtgac cgagctcgcc tggcacggcc tcttcatccg ccacatgctg 420 cgccgccccg agcgcgccga gctcgacagc ttcgtgcccg actggacggt catcaactgc 480 ccgtccttca aggccgaccc cgagcgccac ggctgccgca ccgacacggt gatcgtgctc 540 aacttcgagc gcaagctgat cctgatcgcc aacaccgaat atgccggcga gaacaagaag 600 tcggtcttca cgctgctgaa ctacatcctg cccggcaagg gcgtcatggc gatgcactgc 660 tcggccaacc acgcgctcgg cgacacggac gatgcggcag tgttcttcgg gctctccggc 720 accggcaaga ccacgctctc ggccgatccc tcccgcacgc tgatcggcga cgacgagcac 780 ggctggtcgg accgggggac gttcaacttc gagggcggct gctacgccaa gacgatcaat 840 ctctcggccg aagccgaacc cgagatctat gccacgacct cgaaattcgc gaccgtggtc 900 gagaacatgg tctatgacga agagacgctc gagctcgact tcaacgacga cagcctgacg 960 gcgaacacgc gctgcgccta tccgctcgac tatatctcga acgcgtccga gagcgggctc 1020 ggcgggcatc cgaagaacgt catcatgctg acctgcgacg ccttcggcgt gctgccgccc 1080 atcgcgcggc tgacgcccgc gcaggccatg tatcacttcc tgtcgggctt cacctcgaag 1140 gtggccggca ccgaacgcgg cgtgaccgag ccgcagccga ccttctcgac ctgcttcggc 1200 gcgcccttca tgccccgtcg tcccgaggtc tacggcaagc tcctgcagga gaagatcgcc 1260 aagcacggcg cgacctgctg gctcgtgaac accggctgga ccggcggcgc ctacggcacc 1320 ggcaagcgga tgccgatcaa ggccacccgc gcgctgctga ccgcggcgct cgacggctcg 1380 ctctcgggcg ttcagttccg ccgcgatccg aacttcggct tcgaggtgcc ggtggacctg 1440 catggggtag atgcgaagct gctcgatccg cgctcgacct gggccgatcc ggcggcctac 1500 gatcagcagg cgaagaagct ggtggagatg ttcgccaaca acttcgcgca atatgtcccc 1560 ttcatcgatg cggatgtgaa ggcggccgcg atcggc 1596 <210> 4 <211> 243 <212> DNA <213> puc promoter of Phosphoenolpyruvate carboxylase <400> 4 gcagaggggt cttgcggcac ccttccgggg aacgtccggc aataagtcgc acctttcaag 60 gcctatgtca tgccatgcag acattgcgaa tgtcagggat tcgatacagg gtcgaaccgt 120 cgagaattcg gtaagggcgc cgggcggcat ttggcaatca tccaggccag cgggatctgc 180 cgttttcgaa gcctagcgtg caggccctac acgcatcgag gaagcacatt cgggagagta 240 caa 243 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of puc promoter <400> 5 tatggtaccg cagaggggtc ttgcggcacc 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of puc promoter <400> 6 acagtcgact tgtactctcc cgaatgtgct 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of omp-A fraction <400> 7 caggtcgaca tgcagatgca cacgatgatt 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of omp-A fraction <400> 8 atactgcaga ccgtccagcg acacgtcatg 30 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Carbonic anhydrase-his taq <400> 9 tatctgcagg tggacctgac tgaggacgac 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of Carbonic anhydrase-his taq <400> 10 ataggatccg tggtggtggt ggtggtgctc 30 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of omp-B fraction <400> 11 tatggatccc tgggcaaaat cggctcggtc 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of omp-B fraction <400> 12 ctgtctagat cagaacttcc agatgtagga 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Carbonic anhydrase fraction coding 1-447 seqences <400> 13 ataggatccg tggacctgac tgaggacgac 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of Carbonic anhydrase fraction coding 1-447 seqences <400> 14 acaaagcttg atgtccatcc agaggccgac 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Carbonic anhydrase fraction coding 1-360 seqences <400> 15 ataggatccg tggacctgac tgaggacgac 30 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of Carbonic anhydrase fraction coding 1-360 seqences <400> 16 tgtaagcttg ccgcagttgg aatggccgag 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Carbonic anhydrase fraction coding 1-225 seqences <400> 17 ataggatccg tggacctgac tgaggacgac 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of Carbonic anhydrase fraction coding 1-225 seqences <400> 18 ctgaagcttg atgaagaatt cgccctcgtc 30 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Phosphoenolpyruvate carboxylase <400> 19 caggaagtgg acctgactga ggacgac 27 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverseprimer of Phosphoenolpyruvate carboxylase <400> 20 agtaagcttg ccgatcgcgg ccgccttcac 30 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Phosphoenolpyruvate carboxylase-his taq <400> 21 actgtcgaca tgaatttcgg acgcgtgaac 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of Phosphoenolpyruvate carboxylase-his taq <400> 22 atatctagat cagtggtggt ggtggtggtg 30 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Carbonic anhydrase -his taq <400> 23 actgtcgacg tggacctgac tgaggacgac 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of Carbonic anhydrase -his taq <400> 24 atatctagat cagtggtggt ggtggtggtg 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of Carbonic anhydrase <400> 25 tatggatccg tggacctgac tgaggacgac 30 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of Carbonic anhydrase <400> 26 tataagcttg accggcacga agccctgtcc 30

Claims (12)

1) 프로모터를 코딩하는 핵산서열;
2) 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)의 세포 외막단백질 유전자 중, 1 내지 276 번째 염기서열을 포함하는 유전자 단편;
3) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 탄산무수화효소 유전자 전체 또는 서열번호 1의 1 내지 360번째 염기서열을 필수적으로 포함하는 유전자 단편; 및
4) 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 로도박터 스페로이드(Rhodobacter sphaeroides)의 세포 외막단백질 유전자 중, 277 내지 612 번째 염기서열을 포함하는 유전자 단편;
이 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있는 재조합 발현벡터.
제1항에 있어서,
상기 프로모터는 로도박터 스페로이드 유래의 puc 프로모터이며,
서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제1항에 있어서,
상기 세포 외막단백질은 로도박터 스페로이드 유래의 omp 인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
삭제
제1항에 있어서,
상기 탄산무수화효소는 세포 외막단백질의 두 번째 루프지점인 92 아미노산 및 93 아미노산 사이에 삽입되어 표면발현되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제 1 항에 있어서,
상기 재조합 발현벡터는 도 6 내지 도 9 중 어느 하나로 표시되는 개열지도를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
제1항 내지 제3항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 원핵세포;
상기 재조합 원핵세포에 제1재조합 발현벡터가 삽입된 재조합 원핵세포;
상기 재조합 원핵세포에 제2재조합 발현벡터가 삽입된 재조합 원핵세포; 또는
상기 재조합 원핵세포에 제1재조합 발현벡터 및 제2재조합 발현벡터가 삽입된 재조합 원핵세포;를 포함하며,
상기 제1재조합 발현벡터는 프로모터를 코딩하는 핵산서열; 및 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 탄산무수화효소 유전자 전체 또는 서열번호 1의 1 내지 360번째 염기서열을 필수적으로 포함하는 유전자 단편;이 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있는 발현벡터이고,
상기 제2재조합 발현벡터는 프로모터를 코딩하는 핵산서열; 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 포스포에놀피루브산카르복실화효소 유전자 단편;이 전사방향으로 작동가능하게 연결되어 있는 발현벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 원핵세포.
삭제
제7항에 있어서,
상기 제1재조합 발현벡터는 도 2로 표시되는 개열지도를 포함하고, 제2재조합 발현벡터는 도 3으로 표시되는 개열지도를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 원핵세포.
제7항에 있어서,
상기 원핵세포는 로도박터 스페로이드인 것을 특징으로 하는 재조합 원핵세포.
제10항에 있어서,
상기 로도박터 스페로이드는 국립농업과학원 농업유전자원센터에 KACC91805P, KACC91806P 또는 KACC91807P로 기탁된 것을 특징으로 하는 재조합 원핵세포.
제 10항의 재조합 로도박터 스페로이드를 이용하여 이산화탄소를 저감하고 생리활성물질을 향상시키는 방법.
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