KR20110121208A

KR20110121208A - 수지상 세포를 포함하는 신세포암의 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20110121208A
Application number: KR1020100040697A
Authority: KR
Inventors: 이제철; 양은경
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2010-04-30
Filing date: 2010-04-30
Publication date: 2011-11-07
Also published as: KR101222439B1

Abstract

본 발명은 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물, 수지상 세포의 성숙 방법 및 성숙화된 수지상 세포를 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 인간 유래 CA9 (carbonic anhydrase Ⅸ) 단백질과 아시네토박터바우마니 (Acinetobacter baumannii) 외막 단백질 A를 융합한 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물, 수지상 세포의 성숙화 방법 및 상기 방법으로 성숙화된 수지상 세포를 포함하는 암 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

수지상 세포를 포함하는 신세포암의 치료용 조성물 {A composition comprising dendritic cells for the treatment of renal cell carcinoma}

본 발명은 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물, 수지상 세포의 성숙 방법 및 성숙화된 수지상 세포를 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

이제까지 암치료의 대부분은 수술, 항암제 그리고 방사선 치료가 주종을 이루었다. 그러나 이러한 치료는 부작용이 따르고 또한 완치가 어려워 암의 근본적인 치료법은 되지 못하는 실정이다. 특히 전이 암이나 재발 암의 경우 대부분 수술이 불가능하며 화학적 치료제에 저항성을 가지는 경우가 많아 이러한 암환자들을 위한 새로운 치료제의 개발이 절실히 요구되는 실정이다.

최근에 연구 개발되고 있는 수지상세포를 이용한 암 치료제는 기존의 어떠한 치료제 보다 환자 지향적이며, 기억면역에 의해 장기적으로 효능을 볼 수 있어 동일 암에 대한 전이나 재발 방지에 매우 효과적일 뿐 아니라 안전하며 새로운 항암 면역치료법으로 기대되어 현재 선진국에서 다양한 종류의 암에 대해 치료용 백신으로 개발되고 있다.

수지상 세포 또는 수상돌기 세포 (dendritic cell, DC)는 포유동물의 면역계의 일부를 이루는 면역 세포이다. 이 세포들은 항원 물질을 처리하여 그것을 표면에 나타나게 함으로써 면역계의 다른 세포가 인식하게 하는 항원 발현 세포의 역할을 한다. 수지상 세포는 주로 피부 (피부에 있는 세포를 특히 랑게르한스 세포라 부름), 코, 폐, 위 및 장의 내벽과 같이 외부 환경과 접하는 조직에 소량 존재한다. 그것들은 또한 혈액 중에서 미성숙한 상태로 발견될 수 있다. 일단 활성화되면 림프기관으로 이동하여 T 세포 및 B 세포와 상호작용하여 면역반응이 시작되게 한다. 특정 발달 단계에서 그것들은 수상돌기 (dendrites)라고 하는 돌기를 뻗는다.

수지상 세포는 조혈 골수 전구세포 (hemopoietic bone marrow progenitor cells)로부터 유래한다. 이 전구세포는 처음에는 미성숙 수지상 세포로 변화한다. 이 세포들은 높은 엔도싸이토시스 (endocytosis) 활성 및 T-세포 활성 능력을 특징으로 한다. 미성숙 수지상 세포는 주변에 있는 바이러스, 박테리아와 같은 병원체를 끊임없이 탐식한다. 이것은 TLR (toll-like receptor)과 같은 패턴 인식 수용체 (pattern recognition receptor, PRR)를 통해서 가능하다. TLR은 병원체의 서브셋 상에서 발견되는 특정 분자들을 인식한다. 일단 그것들이 현존하는 항원과 접하게 되면, 그것은 성숙 수지상 세포로 활성화되어 림프절로 이동한다.

모든 조력 T-세포는 하나의 특정 항원에 대해 특이적이다. 오직 전문적인 항원 발현 세포 (대식세포, B림프구 및 수지상세포)만이 맞는 항원이 존재할 때 나머지 조력 T-세포를 활성화시킨다. 수지상 세포는 메모리 및 처녀 (naive) T-세포를 모두 활성화시킬 수 있어서 가장 강력한 항원 발현 세포이다.

성숙 수지상 세포는 신체를 순환하는 백혈구인 단핵구로부터 유래할 수 있는데, 단핵구는 적절한 신호에 따라 수지상 세포로도, 대식세포로도 바뀔 수 있다. 단핵구는 골수의 줄기세포에서 유래한다. 단핵구-유래 수지상 세포는 실험실에서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 생성될 수 있다. PBMC를 조직 배양 플라스크에 심어서 단핵구가 부착되게 할 수 있는데 이 단핵구를 IL-4 (interleukin-4) 및 GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulating factor)로 처리함으로써 미성숙 수지상 세포로 분화시킬 수 있다. 이후에 TNFα로 처리하면 미성숙 수지상 세포가 성숙 수지상 세포로 분화된다.

한편, 신세포암은 신장에 발생하는 악성종양으로 병변의 크기가 단순한 외과적인 절제술이 가능한 정도라면 조직 검사를 통한 진단법과 동시에 치료를 시행할 수 있지만, 절제술이 완전하지 않거나 신세포암의 전이 등 수술이 불가능할 경우에는 화학적 요법, 방사선 요법, 면역학적 요법 등이 추천되고 있다. 신세포암으로 진단받은 환자의 약 1/3은 진단당시 전이가 일어나 수술이 불가능하고, 방사선치료 및 항암요법에 잘 반응하지 않아 예후가 매우 불량하다. 따라서 신세포암은 아직까지 외과적 수술 이외에는 확실한 효과가 있는 치료법이 없다는 것이 문제이다.

본 발명자는 신세포암을 치료할 수 있는 방법을 예의 연구한 결과, 수지상 세포의 성숙화를 유도하는 새로운 물질을 개발하고, 이로 인해 성숙된 수지상 세포가 세포독성 T 세포 (cytotoxic T cells) 또는 조력 T 세포 (helper T cells)를 활성화시키고, 암의 성장을 억제시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 본 발명의 목적은 수지상 세포의 성숙화 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 암 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기의 과제를 해결하기 위해 인간 유래 CA9 (carbonic anhydrase Ⅸ) 단백질과 세균인 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii) 외막 단백질 A를 융합한 재조합 단백질 (CA9-AbOmpA)을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공한다.

상기 재조합 단백질은 인간 유래 CA9 단백질 (GenBank Accession No.: BC014950) 중 1-120까지의 120개의 아미노산 서열 (서열번호 1)과 아시네토박터 바우마니 외막 단백질 A (AbOmpA) (GenBank Accession No.: AY485227.1) 중 1-200까지의 200개의 아미노산 서열(서열번호 2)로 융합되어 있는 것이 바람직하다.

상기 조성물에는 재조합 단백질이 0.01 내지 500 ng/ml의 양으로 포함되는 것이 바람직하다.

또한 본 발명은 미성숙 수지상 세포에 인간 유래 CA9 단백질과 아시네토박터 바우마니 외막 단백질 A를 융합한 재조합 단백질을 처리하는 수지상 세포의 성숙화 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 성숙된 수지상 세포를 함유하는 암 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

상기 성숙된 수지상 세포는 표면에 CD40, CD80, CD86, MHC classⅠ 및 MHC class Ⅱ를 발현하는 것을 특징으로 한다.

상기 암은 신세포암이 바람직하다.

본 발명에 의하면 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질로 처리하여 얻어지는 수지상 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 신세포암 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 37 kDa의 순수 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질을 전기영동한 사진이다.
도 2는 CA9을 발현하는 RENCA 세포주의 핵염색 (도 2A), Green fluorescent protein을 발현하는 CA9 (도 2B), CA9 항체를 사용하여 염색된 CA9 (도 2C) 및 도 2A, 2B, 2C를 모두 합친 그림(도 2D) 그림이다.
도 3은 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질을 처리한 수지상세포의 IL-12 (Interleukin-12)의 분비능력을 측정한 그래프이다.
도 4는 지질다당질 (lipopolysaccharide)과 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질을 처리한 수지상세포와 T 세포의 집락형성을 나타낸 도면이다.
도 5는 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질을 처리한 수지상세포와 CD4+ T 세포의 배양에서 CD4+ T 세포의 INF-γ (interferon-gamma) (도 5a) 분비 능력과 CD8+ T 세포의 TNF-α (도 5b)와 IL-2(도 5c)의 분비능력을 나타낸 그래프이다.
도 6은 CA9를 발현하는 신세포암을 가진 마우스에 각종 항원으로 처리한 수지상세포를 투여한 경우와 생리 식염수만을 투여한 경우의 신세포암의 크기를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 인간 유래 CA9 (carbonic anhydrase Ⅸ) 단백질과 세균인 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii) 외막 단백질 A를 융합한 재조합 단백질 (CA9-AbOmpA)을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물에 관한 것이다.

상기 인간 유래 CA9 단백질의 GenBank Accession No.는 BC014950이다.

상기의 CA9는 인간의 신세포암 (Clear Cell Renal Cell Carcinoma) 조직의 94%에서 암세포의 표면에 발현되지만, 정상조직에서는 모낭 (hair follicle), 담관 (bile ducts), 췌관 (pancreatic ducts), 담낭 (gall bladder), 브루너 샘 (Brunner's gland), 십이지장의 크립틱 세포 (cryptic cells of duodenum) 등에 국한되어 아주 미약하게 발현되므로 인간 신세포암에 특이적인 암관련 항원 (tumor-associated antigen)이다.

상기 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii) 외막 단백질 A (AbOmpA)의 GenBank Accession No. 는 AY485227.1이다.

AbOmpA는 세균단백질인 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii)의 외막단백 A를 말하는데, 상기의 세균 아시네토박터 바우마니에서 직접 추출하는 과정이 어려울 뿐만 아니라 AbOmpA 단백질의 N-말단이 세포독성이 있어서 세포독성이 있는 부분을 제거한 재조합 단백질을 사용하여야 한다.

상기 CA9-AbOmpA는 인간 CA9 유전자와 세균의 AbOmpA 유전자를 클로닝하여 새롭게 만들어진 재조합 유전자를 단백질 발현벡터 플라스미드(protein expression vector plasmid)에 삽입하여 새로운 형태의 플라스미드를 만들고, 상기의 플라스미드를 대장균 (Escherichia coli)에 집어넣어 대량으로 만든 재조합 단백질이다.

상기 재조합 단백질 CA9-AbOmpA은 459개의 아미노산으로 구성된 CA9 단백질(GenBank Accession No.: BC014950) 중 1-120까지의 120개의 아미노산 및 356개의 아미노산으로 구성된 AbOmpA 단백질 (GenBank Accession No.: AY485227.1) 중 1-200까지의 200개의 아미노산을 융합한 도합 320개의 아미노산으로 구성된 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질로 구성되는 것이 바람직하다.

상기 재조합 단백질의 분자량은 37 kDa이다.

상기 CA9 단백질의 아미노산 부분은 서열번호 1로 표기된 서열이다. 또한 상기 AbOmpA의 아미노산 부분은 서열번호 2로 표기된 서열이다.

융합단백질의 아미노산 서열은 하기와 같다.

MAPLCPSPWLPLLIPAPAPGLTVQLLLSLLLLMPVHPQRLPRMQEDSPLGGGSSGEDDPLGEEDLPSEEDSPREEDPPGEEDLPGEEDLPGEEDLPEVKPKSEEEGSLKLEDLPTVEAPG-MKLSRIALATMLVAAPLAAANAGVTVTPLLLGYTFQDSQHNNGGKDGNLTNGPELQDDLFVGAALGIELTPWLGFEAEYNQVKGDVDGASAGAEYKQKQINGNFYVTSDLITKNYDSKIKPYVLLGAGHYKYDFDGVNRGTRGTSEEGTLGNAGVGAFWRLNDALSLRTEARATYNADEEFWNYTALAGLNVVLGGHLKP

상기 재조합 단백질은 0.01 내지 500 ng/ml의 양으로 조성물에 포함될 수 있다. 바람직하게는 400 ng/ml의 양으로 포함되어, 미성숙 수지상 세포를 성숙시키는 것이다.

본 발명의 명세서에서 용어 “수지상세포”는 MHC (major histocompatibility complex)를 통하여 T 세포에 항원을 제시할 수 있는 세포를 의미한다. 수지상세포는 성숙도 정도에 따라, 미성숙 수지상세포(immature dendritic cells) 및 성숙 수지상세포(mature dendritic cells)로 나뉜다. “미성숙 수지상세포”는 다양한 전구세포로부터 분화 유도되어 형성된 수지상세포로서, 하기의 성숙 수지상세포의 표면 형질(surface phenotypes) 중 CD80 또는 CD86 등의 공동자극분자 (costimulatory molecule)의 발현이 낮은 수지상세포를 의미한다.

“성숙 수지상세포”는 미성숙 수지상세포가 성숙화되어 형성된 세포를 의미하며, 다음과 같은 표면 형질들 중 적어도 하나 이상을 나타내는 세포를 의미한다: 감소된 CD115, CD14 또는 CD68의 발현; 및 증가된 CD11c, CD80, CD86, CD40, MHC 클래스 Ⅱ, p55 및 CD83의 발현.

또한 본 발명은 미성숙 수지상 세포에 인간 유래 CA9 단백질과 아시네토박터바우마니 외막 단백질 A를 융합한 재조합 단백질 (CA9-AbOmpA) 을 처리하는 수지상 세포의 성숙화 방법에 관한 것이다.

본 발명의 수지상 세포의 성숙화 유도를 확인하는 방법은 수지상 세포에 성숙화가 유도되는 과정에서 단백질 표면인자의 발현과 사이토카인의 분비 및 T 림프구의 활성을 측정하는 것을 포함한다.

본 발명의 명세서에서 용어“사이토카인”은 면역시스템에 관련된 세포에 의해 생성되는 단백질 또는 펩타이드들로서, 면역반응을 조절하는 작용을 한다. 이러한 면역반응의 조절은 체액성 면역반응 또는 세포성 면역반응에서 행해지며, 구체적으로 T 세포, B 세포, NK(Natural Killer) 세포, 식세포, 항원제시세포 또는 다른 면역세포의 효능 기능(effector function)을 조절함으로서 행해진다. 사이토카인은 통상 약 30 kDa 보다 적은 분자량을 갖는 작은 단백질 또는 당단백질이다.

본 발명의 미성숙 수지상 세포의 성숙화 방법에 있어서, 상기 재조합 단백질 CA9-AbOmpA를 0.01~ 500 ng/ml의 양으로 처리하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 400 ng/ml의 양으로 처리하는 것이다.

또한 본 발명은 상기 성숙화 방법에 의해 성숙된 수지상 세포를 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

상기 성숙화된 수지상 세포는 표면에 CD40, CD80, CD86, MHC classⅠ 및 MHC class Ⅱ를 발현하는 것을 특징으로 한다.

성숙된 수지상 세포는 Th1 유도 능력이 있는 IL-12 (interleukin-12)를 분비하였다 (실시예 1-1).

본 발명의 명세서에서 용어 “인터루킨-12(IL-12)”는 40 kDa 서브유닛(p40 서브유닛) 및 35 kDa 서브유닛(p35 서브유닛)이 다이설파이드(disulfide) 결합에 의해 결합되어 이루어진 75 kDa 분자량을 갖는 헤테로다이머의 사이토카인을 의미한다. IL-12는 대식세포와 같은 항원제시세포에 의해 생성되어 활성화된 T 세포, B 세포 및 NK세포들의 세포표면의 수용체에 결합한다. 상기 IL-12는 ⅰ) T 세포와 NK 세포들의 증식을 촉진하며, ⅱ) T 세포, NK 세포 및 대식세포의 세포독성 효과를 증진시키며, ⅲ) IFN-γ, TNF-α 및 GM-CSF의 생성을 유도하고, ⅳ) Th1 세포의 활성화를 유도하는 작용을 한다.

본 발명의 일 실시예에서는 상기 조성물에 의해 CD4+T 세포는 대조군에 비해 많은 양의 IFN-γ를 분비하였으며, CD8+ T 세포는 많은 양의 TNF-α와 IL-2를 분비하는 것을 확인할 수 있었다 (실시예 2). 즉, 세포독성 T 세포(보조 활성분자 CD8+ T 세포)와 조력 T 세포(보조 활성분자 CD4+ T 세포)의 항암작용을 가지는 사이토카인 생산이 증가되었다. 또한, CA9 과 AbOmpA를 함께 처리하여 성숙된 수지상 세포보다 CA9과 AbOmpA 를 융합한 단백질을 처리하여 얻은 성숙된 수지상세포에서 보다 많은 양의 사이토카인이 분비되었다.

상기 암은 정상세포가 무제한의 증식능력을 획득하여 이형성 특성을 나타내는 불멸화된 (iommortalized) 세포를 가져 생기는 질환으로, 모든 종류의 암을 포함하고, 특정 종류의 암으로 한정되지 않는다.

바람직하게는, 상기 암은 신세포암이다.

본 발명의 조성물에는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제와 함께 본 발명의 수지상세포를 포함하는데, 이러한 담체는 그 자체로 치료제를 투여 받는 개체에 유해한 반응을 일으키지 않는 임의의 담체인 것이 바람직하다. 적합한 담체는 통상적으로 크고 느리게 대사화되는 거대분자, 예를 들어 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산, 아미노산 공중합체, 지질 응집체(예를 들어, 오일 소적 또는 리포좀) 및 불활성 바이러스 입자를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 이러한 담체는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 수지상세포 자체의 면역보강제 효과 이외에 면역자극제 또는 면역보강제로서 작용할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 조성물에는 치료제의 유효성을 증강시키는 추가의 면역보강제를 포함할 수도 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 피부를 통한 국소 투여(경피 투여) 또는 피하 주입이 바람직하며, 피하주입이 가장 바람직하다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다.

이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

제조예 1:

1-1. 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질의 제조

1377개의 염기쌍으로 이루어진 전체 CA9 유전자중 1-360번까지의 유전자 염기쌍과 1069개의 염기쌍으로 이루어진 전체 AbOmpA 유전자중 1-600번까지의 유전자 염기쌍을 PCR로 각각 증폭하고, 제한효소 EcoRI으로 절단하였다. 절단된 염기쌍을 접합 (ligation)하고 염기서열을 확인한 뒤 단백질 발현벡터인 pMAL-C2X 플라스미드 (New England Biolabs) 에 재조합된 CA9-AbOmpA DNA를 삽입시켜 융합단백질이 생산되는 새로운 플라스미드를 만들었다.

이 플라스미드를 형질전환 (transformation)용 대장균인 E. coli BL21에 집어넣고, 융합단백질이 만들어지도록 LB broth에서 액체 배양하였다. 세균 배양액을 원심분리하여 배양액은 버리고 대장균만 얻었다. 상기의 LB broth는 균을 배양하는 배지를 말한다. 얻어진 대장균을 초음파 파쇄기로 분쇄하고 분쇄액을 원심분리하여 재조합 단백질이 있는 상등액만 취하였다. 상기의 상등액을 아밀로스 레진 컬럼에 통과시키고, 칼럼에 남아있는 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질은 용출 완충액 (elution buffer)으로 떼어낸 뒤, 재조합 단백질에 남아있는 여러 가지 불순물을 걸러내기 위하여 생리식염수가 들어있는 투석액에서 하룻밤 투석하였다. 마지막으로 재조합 단백질에 남아있는 지질다당질 (lipopolysaccharide)을 제거하기 위하여 폴리믹신 B 비드 (polymyxin B bead; polymyxin B는 특이적으로 지질 다당질 (lipopolysaccharide; LPS) 에 결합하는 성질을 이용하여 폴리믹신 B를 유리구슬인 비드 (bead)에 결합시켜 놓은 것)에 하룻밤 반응시켰다. 상기의 폴리믹신 B 비드는 폴리믹신 B를 유리구슬인 비드에 결합시켜 놓은 것이다. 원심분리 후 비드를 제거하고 남은 용액은 순수한 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질 용액이 되었다.

도 1은 위의 방법으로 해서 얻은 37 kDa의 순수 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질을 전기영동한 사진을 나타낸 것이다.

1-2. 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질을 처리한 수지상세포의 제조

재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질 400 ng/ml을 항생제가 포함되지 않은 배지에서 성장시킨 미성숙 수지상세포에 24시간 처리하였다. 배지와 불순물을 원심분리하여 제거하여 활성화된 수지상세포를 제조하였다.

1-3. CA9 단백질을 발현하는 마우스 신세포암 세포주 확립

1377개의 DNA 염기쌍으로 구성된 CA9 유전자가 클로닝되어 있는 pOTB7 플라스미드(한국생명공학연구원)를 XbaI과 MfeI 제한효소로, hCMV IRES puro [H1.4] 벡터(Q Biogene)를 XbaI과 EcoRI 제한효소로 각각 절단한 뒤 접합(ligation)하였다. 만들어진 플라스미드 (plasmid) DNA를 뮤린 신장세포 암 (murine renal cell carcinoma) 세포주인 RENCA 세포주에 삽입시켜 CA9 단백질을 세포막에 발현하는 세포주를 만들었다. 이렇게 만들어진 세포주를 10번 계대배양 (subculture)하여 CA9 단백질을 세포막에 발현하는 순수 RENCA 세포주만을 얻었다.

도 2에 의하면 상기 방법으로 확립한 RENCA 세포주에 CA9 항체를 사용하여 CA9를 세포막에 발현하는 순수 CA9 발현 RENCA 세포를 확인한 것이다.

실시예 1: 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질을 처리한 수지상세포의 성숙 및 T 세포 결합

1-1. 수지상세포의 성숙

수컷 BALB/c 마우스의 골수에서 얻은 미성숙 수지상세포를 1 X 10⁶개/ml의 크기가 되도록 하여 400 ng/ml의 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질로 24시간 처리하였다. 그 후 T 세포의 결합 및 활성에 필요한 성숙 수지상세포의 세포표면 분자를 유세포분석기(flow cytometer)를 사용하여 측정하였다.

표 1은 아무런 처치도 하지 않은 미성숙 수지상세포의 음성대조군, 지질 다당질을 처리한 수지상세포의 양성대조군, 재조합 CA9과 재조합 AbOmpA 단백질을 함께 처리한 수지상세포, 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질을 처리한 수지상세포의 세포표면 CD40, CD80, CD86 및 주조직적합성 (major histocompatibility class) I 및 II 분자의 발현정도를 나타낸 것이다. 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질을 처리한 수지상세포는 지질 다당질을 처리한 수지상세포에 비해서는 세포표면 분자의 발현이 낮지만 재조합 CA9과 재조합 AbOmpA 단백질을 함께 처리한 수지상세포보다는 세포표면 분자 발현이 높게 나타났다.

다양한 항원을 처리하여 얻은 수지상 세포의 세포표면 분자의 발현

	형광값의 평균
	CD40	CD80	CD86	MHC class I	MHC class II
대조군	526	11,436	24,600	67,908	11,338
지질다당질	4,187	23,282	43,972	106,342	27,423
재조합 AbOmpA와 재조합 CA9 공동 처리	2,881	15,410	32,570	79,242	22,071
재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질	2,435	19,821	35,173	90,287	26,217

1-2. 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질을 처리한 수지상세포의 사이토카인 분비

미성숙 수지상세포를 1 X 10⁶개/ml의 크기가 되도록 하여 400 ng/ml의 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질로 24시간 처리한 후 수지상세포의 사이토카인 분비능을 측정하였다.

도 3을 보면 Th1 유도 능력이 있는 인터루킨-12 (interleukin-12)의 분비능을 측정한 것으로 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질은 양성대조군인 지질 다당질 및 CpG-ODN을 처치한 수지상세포와 비슷한 양의 인터루킨-12를 분비하였다.

도 3의 LPS는 지질 다당질을 처리한 양성대조군이며, CPG-ODN은 면역보조제(immunoadjuvant)인 cytosine-phosphorothionateguanine-rich oligodeoxynucleotides을 처리한 군이며, AbOmpA는 AbOmpA만을 처리한 군이며, CA9은 CA9만 처리한 군이고, CA9+AbOmpA는 CA9과 AbOmpA를 혼합하여 처리한 군이며, CA9-AbOmpA는 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질을 처리한 군을 의미한다.

1-3. 성숙 수지상세포와 T 세포의 결합

미성숙 수지상세포를 1 X 10⁶개/ml의 크기가 되도록 하여 400 ng/ml의 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질로 24시간 처리하여 성숙 수지상세포로 만든 뒤 마우스 비장에서 추출한 T 세포와 10:1 (T 세포: 수지상세포)이 되게 섞어 48시간 배양하였다. 그 후 수지상세포와 T 세포의 물리적 접촉으로 집락형성 (cluster formation)을 이루게 하였다.

도 4에 의하면 양성대조군인 지질다당질을 처리한 수지상세포보다 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질을 처리한 수지상세포가 더 많은 수의 집락을 형성함을 알 수 있다.

실시예 2: 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질을 처리한 수지상세포에 의해 자극된 T 세포의 사이토카인 분비

2-1. T 세포의 사이토카인 분비

재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질을 처리하여 생산된 수지상세포의 항암 작용의 효과를 알아보기 위하여 암세포의 파괴와 관련된 세포독성 T 세포(보조 활성분자 CD8+ T 세포)와 조력 T 세포(보조 활성분자 CD4+ T 세포)의 항암작용을 가지는 사이토카인 생산이 증가되었는지 여부를 확인하는 실험을 하였다. 미성숙 수지상세포를 1 X 10⁶개/ml의 크기가 되도록 하여 400 ng/ml의 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질로 24시간 처리하여 성숙 수지상세포로 만든 후 마우스 비장에서 추출한 CD4+ T 세포와 10:1 (T 세포: 수지상세포)이 되게 섞어 24시간 배양한 후 T 세포의 IFN-γ (interferon-gamma) 분비능, CD8+ T 세포의 TNF-α (tumor necrosis factor-alpha)와 IL-2 (interleukin-2) 분비능을 ELISA로 조사하였다. ELISA 는 공지된 방법으로 수행하였다.

T 세포는 BALB/c 마우스의 비장을 적출하고 비장을 조직 분쇄기로 분쇄하였다. 분쇄액을 나일론 그물망에 통과하여 분쇄되지 않은 조직은 걸러내고 세포만을 얻었다. 얻어진 세포를 저장액에 담궈서 적혈구를 파괴하고 남은 비장세포를 세포배양액에서 4시간 배양하였다 세포독성 T 세포는 CD8항체를 가진 콜럼(column)을, 조력 T 세포는 CD4 항체를 가진 콜럼을 사용하여 얻었다.

재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질을 처리한 수지상세포에 의해 CD4+T 세포는 대조군에 비해 많은 양의 IFN-γ를 분비하는 것을 확인하였다 (도 5a). 도 5b와 5c를 보면 CD8+ T 세포는 양성대조군인 지질 다당질을 처리한 수지상세포보다 더 많은 양의 TNF-α 와 IL-2를 분비하는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 CD4+T 세포의 Th1 면역반응 유도 및 CD8+T 세포의 IL-2에 의한 세포증식 및 TNF-α 에 의한 항암면역반응이 유도되는 것을 의미한다.

실시예 3: 초기 신세포암에 대한 수지상세포의 치료효과

3-1. 암의 성장 억제 효과

CA9를 발현하는 신세포암 세포주 1 X 10⁵개를 마우스의 오른쪽 등 피부에 이식하고 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질을 처리한 수지상세포를 신세포암을 이식한 3일째부터 5일 간격으로 3회 투여하였다. 수지상세포 종류로는, 아무런 처리를 하지 않은 미성숙 수지상세포(가, iDC), CA9를 발현하는 신세포암 세포파쇄액을 수지상세포에 처리하여 생산된 성숙 수지상세포(나, Renca lysates), 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질을 처리하여 생산된 성숙 수지상세포(다, Fusion protein)가 있다. 대조군(라, PBS)으로서 생리식염수만 투여하고 암의 크기를 측정하였다.

상기의 암의 크기는 다음의 공식을 사용하여 측정하였다.

V = (A²* B) / 2

여기서 A는 암 조직의 짧은 길이(cm)를 말하며, B는 암 조직의 긴 길이(cm)를 말한다.

도 6에 의하면, 암 성장의 억제효과가 가장 큰 경우는 재조합 CA9-AbOmpA 융합단백질을 처리하여 생산된 수지상세포(다)를 투여한 군임을 확인할 수 있었다. 또한 초기 신세포암에 대하여는 (다)가 치료제로서 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명에서 제시하는 방법에 따라 제조된 수지상세포는 다양한 분야에서 유용하게 적용될 수 있으며, 본 발명은 이들 구체적인 예에 한정되는 것은 아니다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> A composition comprising dendritic cells for the treatment of renal cell carcinoma <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Pro Leu Cys Pro Ser Pro Trp Leu Pro Leu Leu Ile Pro Ala 1 5 10 15 Pro Ala Pro Gly Leu Thr Val Gln Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu 20 25 30 Met Pro Val His Pro Gln Arg Leu Pro Arg Met Gln Glu Asp Ser Pro 35 40 45 Leu Gly Gly Gly Ser Ser Gly Glu Asp Asp Pro Leu Gly Glu Glu Asp 50 55 60 Leu Pro Ser Glu Glu Asp Ser Pro Arg Glu Glu Asp Pro Pro Gly Glu 65 70 75 80 Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro Gly Glu Glu Asp Leu Pro 85 90 95 Glu Val Lys Pro Lys Ser Glu Glu Glu Gly Ser Leu Lys Leu Glu Asp 100 105 110 Leu Pro Thr Val Glu Ala Pro Gly 115 120 <210> 2 <211> 200 <212> PRT <213> Acinetobacter baumannii <400> 2 Met Lys Leu Ser Arg Ile Ala Leu Ala Thr Met Leu Val Ala Ala Pro 1 5 10 15 Leu Ala Ala Ala Asn Ala Gly Val Thr Val Thr Pro Leu Leu Leu Gly 20 25 30 Tyr Thr Phe Gln Asp Ser Gln His Asn Asn Gly Gly Lys Asp Gly Asn 35 40 45 Leu Thr Asn Gly Pro Glu Leu Gln Asp Asp Leu Phe Val Gly Ala Ala 50 55 60 Leu Gly Ile Glu Leu Thr Pro Trp Leu Gly Phe Glu Ala Glu Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Val Lys Gly Asp Val Asp Gly Ala Ser Ala Gly Ala Glu Tyr Lys 85 90 95 Gln Lys Gln Ile Asn Gly Asn Phe Tyr Val Thr Ser Asp Leu Ile Thr 100 105 110 Lys Asn Tyr Asp Ser Lys Ile Lys Pro Tyr Val Leu Leu Gly Ala Gly 115 120 125 His Tyr Lys Tyr Asp Phe Asp Gly Val Asn Arg Gly Thr Arg Gly Thr 130 135 140 Ser Glu Glu Gly Thr Leu Gly Asn Ala Gly Val Gly Ala Phe Trp Arg 145 150 155 160 Leu Asn Asp Ala Leu Ser Leu Arg Thr Glu Ala Arg Ala Thr Tyr Asn 165 170 175 Ala Asp Glu Glu Phe Trp Asn Tyr Thr Ala Leu Ala Gly Leu Asn Val 180 185 190 Val Leu Gly Gly His Leu Lys Pro 195 200

Claims

인간 유래 CA9 (carbonic anhydrase Ⅸ) 단백질과 아시네토박터 바우마니 (Acinetobacter baumannii) 외막 단백질 A를 융합한 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 수지상 세포의 성숙화 유도용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열이 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 0.01 내지 500 ng/ml 의 양으로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
미성숙 수지상 세포에 인간 유래 CA9 단백질과 아시네토박터 바우마니 외막 단백질 A를 융합한 재조합 단백질을 처리하는 수지상 세포의 성숙화 방법.
제 4항에 있어서, 상기 재조합 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열이 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항 또는 제 5항의 방법에 의해 성숙된 수지상 세포를 함유하는 암 치료용 약제학적 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 성숙된 수지상 세포는 표면에 CD40, CD80, CD86, MHC classⅠ 및 MHC class Ⅱ를 발현하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 암은 신세포암인 것을 특징으로 하는 조성물.