DE2560532C2

DE2560532C2 -

Info

Publication number: DE2560532C2
Application number: DE2560532A
Authority: DE
Inventors: Takeshi Tondabaya Osaka Jp Takahashi; Yoshio Toyonaka Osaka Jp Yamazaki; Koichi Neyagawa Osaka Jp Kato
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1974-11-26
Filing date: 1975-11-15
Publication date: 1988-11-10
Also published as: NL186243B; GB1531498A; DE2551438C2; FR2292714A1; US4075405A; DE2551438A1; NL7513773A; NL186243C; FR2292714B1

Description

Die Erfindung betrifft Träger-Ligand-Produkte nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs.

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, in Wasser unlösliche Träger von hoher Reaktionsfähigkeit, die sich zur Herstellung von in Wasser unlöslichen Enzymen und von Säulen für die Affinitätschromatographie eignen, verfügbar zu machen.

Als technischer Hintergrund für die vorliegende Erfindung dienen die zwei folgenden Druckschriften:

In der "Chemikerzeitung", Band 97 (1973), Seite 611 bis 619 sind trägergebundene Enzyme allgemein beschrieben und ihre Anwendung zur Hydrolyse von Proteinen zu Peptiden und Aminosäuren, die Herstellung von Käse, die Umwandlung von Maisstärke in Glucose und von Glucose in Fructose, die Klärung von Weinen und Obstsäften, die Entfernung von Glucose aus Eiweiß und zur Synthese von Penicillin.

Aus "Angewandte Chemie", Band 84 (1972), Seite 319 bis 330 sind weiterhin trägergebundene biologisch aktive Substanzen bekannt, die als Katalysator, als Enzymelektrode oder in der Affinitätschromatographie verwendet werden.

Ein allgemeines Verfahren, bei dem ein Polysaccharid mit einem Cyanhalogenid aktiviert und ein Derivat erhalten wird, das sich kovalent an Substanzen zu binden vermag, die primäre oder sekundäre Aminogruppen enthalten, wird beispielsweise in Nature 214 (1967) 1302 und in der US-PS 36 45 852 beschrieben. Die Zahl der Veröffentlichungen, die sich mit der Verwendung unlöslicher Träger zur Herstellung von in Wasser unlöslichen Enzymen und von ligandengebundenen stationären Phasen für die Affinitätschromatographie nach diesem allgemeinen Verfahren befassen, ist sehr groß. In keiner dieser Veröffentlichungen wird jedoch die Verwendung von β-1,3- Glucanen als Träger erwähnt.

Die Aktivierungsreaktion mit einem Cyanhalogenid wird im allgemeinen bei einem pH-Wert im alkalischen Bereich, insbesondere in der Nähe von pH 11 durchgeführt. Die β-1,3-Glucane sind jedoch unter diesen pH-Bedingungen in einem solchen Maße löslich, daß durch direkte Anwendung des bekannten allgemeinen Verfahrens als solchem nicht die gewünschten aktivierten, in Wasser unlöslichen β-1,3-Glucane erhalten werden.

In eingehenden Untersuchungen über die Bedingungen der Aktivierungsreaktion von in Wasser unlöslichen β-1,3- Glucanen mit einem Cyanhalogenid gelang der Anmelderin die Aktivierung der β-1,3-Glucane unter Aufrechterhaltung ihrer Form.

Die Erfindung betrifft Träger-Ligand-Produkte aus einem in Wasser unlöslichen und mit Cyanhalogenid im alkalischen pH-Bereich aktivierten Polysaccharid als Träger und einem an den Träger covalent gebundenen Ligand, die gekennzeichnet sind durch

(a) ein durch Umsetzung eines in Wasser unlöslichen β-1,3- Glucans mit Cyanhalogenid hergestelltes, aktiviertes β-1,3-Glucanderivat als Träger, wobei das in Wasser unlösliche β-1,3-Glucan erhalten wird, indem man in dem Reaktionsgemisch den pH-Wert mit wäßriger Alkalimetallhydroxidlösung um 0,2 bis 0,5 pH-Einheiten/min in der Weise erhöht, daß die Auflösung des in Wasser unlöslichen β-1,3-Glucans verhindert wird und
(b) einen primäre oder sekundäre Aminogruppen enthaltenden Ligand, nämlich Pronase, α-Amylase, α-Chymotrypsin, saure Weizenkeimphosphatase, α-Aminosäureesterhydrolase, L-Leucylglycylglycin oder Urease.

Zu den in Wasser unlöslichen β-1,3-Glucanen, die für die Zwecke der Erfindung geeignet sind, gehören beispielsweise die Polysaccharide, die von Mikroorganismen der Gattung Alcaligenes oder Agrobacterium gebildet werden. Besonders zu erwähnen sind das Polysaccharid, das von Alcaligenes faecalis var. myxogenes 10C3K gebildet wird (Agricultural Biological Chemistry 30 (1966) 196ff. von Harada u. Mitarb.), das (nachstehend als PS-1 bezeichnete) Polysaccharid, das vom Mutantenstamm NTK-u (IFO 13 140, ATCC 21 680) von Alcaligenes faecalis var. myxogenes 10C3K gebildet wird (US-PSen 3 754 925 und 3 822 250), das von Agrobacterium radiobacter (IFO 13 127, ATCC 6466) oder seinem Mutantenstamm U-19 (IFO 13 126, ATCC 21 679) gebildete (nachstehend als PS-2 bezeichnete) Polysaccharid (US-PSen 3 754 925 und 3 822 250) und Pachyman, das in der als Poria cocos bekannten rohen Droge vorkommt (Agr. Biol. Chem. 32 (1968) 1261).

Die für die Aktivierungsreaktion gemäß der Erfindung verwendeten, in Wasser unlöslichen b-1,3-Glucane können in Form von Pulver oder Formteilen vorliegen, die unter Ausnutzung der Tatsache hergestellt werden, daß in Wasser unlösliche β-1,3-Glucane auf Grund ihrer speziellen physikalischen Eigenschaften in die verschiedensten Formen, z. B. Fasern, Folien, Perlen oder kleine Kugeln oder in die Form von Mikrokapseln durch Auftragen des Glucans auf ein Kernmaterial gebracht werden können.

Die in Wasser unlöslichen β-1,3-Glucane können nach beliebigen Verfahren, die allgemein auf diesem speziellen Gebiet angewandt werden, zu Formkörpern verarbeitet werden. Um beispielsweise Fasern herzustellen, kann man ein Verfahren anwenden, bei dem man ein in Wasser unlösliches β-1,3-Glucan in einer wäßrigen Natriumhydroxydlösung löst und die erhaltene β-1,3-Glucanlösung dann aus einer Düse in eine wäßrige Chlorwasserstofflösung spinnt und hierdurch die Lösung neutralisiert und Gelierung des Glucans bewirkt (US-PS 3 899 480).

Eine Folie kann aus einem solchen wasserunlöslichen β-1,3-Glucan beispielsweise hergestellt werden, indem man das in Wasser unlösliche β-1,3-Glucan in einer wäßrigen Kaliumhydroxydlösung löst, die Lösung auf eine ebene Glasplatte in gleichmäßiger Dicke aufträgt und die beschichtete Glasplatte abschließend in eine wäßrige Chlorwasserstofflösung taucht und hierdurch die Folie neutralisiert und Gelierung des Glucans bewirkt (US-PS 3 899 480).

Das β-1,3-Glucan kann beispielsweise mit Hilfe der folgenden alternativen Verfahren zu Perlen geformt werden: 1) Man führt ein Medium, das ein in Wasser unlösliches β-1,3-Glucan enthält, durch Strangpressen, Tropfenlassen oder Sprühen in ein erhitztes Ölbad ein und bewirkt hierdurch Gelierung des Glucans (japanische Offenlegungsschrift 52 953/1973); 2) man löst das in Wasser unlösliche β-1,3-Glucan in einer wäßrigen Natriumhydroxydlösung und führt die erhaltene Lösung durch eine Tropfdüse in eine wäßrige Chlorwasserstofflösung ein und neutralisiert hierbei das Glucan und bewirkt seine Gelierung (US-PS 3 899 480); 3) man dispergiert eine wäßrige Alkalilösung des in Wasser unlöslichen β-1,3- Glucans in einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser nicht leicht mischbar ist, und gibt zur erhaltenen Dispersion eine organische Säure; 4) man gibt ein Kernmaterial zu einer alkalischen wäßrigen Lösung des in Wasser unlöslichen β-1,3-Glucans und dispergiert das Gemisch in einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser nicht leicht mischbar ist, worauf man der erhaltenen Dispersion eine organische Säure zusetzt. (Die beiden letztgenannten Verfahren werden in der japanischen Patentanmeldung 127 197/75) beschrieben).

Nachstehend werden als spezielle Beispiele zwei Verfahren zur Herstellung von Gelen in Form von Perlen aus in Wasser unlöslichem β-1,3-Glucan gemäß der Prioritätsanmeldung vom 21.10.1975 beschrieben.

a) Zu 9 g pulverförmigem PS-1 wurden 270 ml destilliertes Wasser gegeben. Das Gemisch wurde gerührt, wobei es die Konsistenz eines Breies annahm. Diesem Brei wurden 30 ml wäßrige 1 n-Natriumhydroxydlösung zugesetzt, wobei das PS-1 sich löste. In ein 2 l-Becherglas wurden 1200 ml Toluol und 6 g eines Derivats von Polyoxyäthylen und hydriertem Rizinusöl als oberflächenaktive Verbindung ("Emalex® HC-30"), gegeben. Unter Rühren mit 800 min^-1 mit einem schneckenförmigen Rührer wurde die oben genannte alkalische Lösung von PS-1 bei Raumtemperatur zugetropft.
Während weiter mit 800 min^-1 gerührt wurde, wurde die erhaltene PS-1-Dispersion einem Gemisch von 2000 ml Toluol und 100 ml Essigsäure zugesetzt. Dann wurde noch eine weitere Stunde gerührt und das System etwa 3 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Während dieser Zeit setzte sich das Gelbildungsprodukt ab.
Das Lösungsmittel wurde durch Dekantieren entfernt und das Sediment fünfmal mit je 2 l destilliertem Wasser gespült. Durch diese Behandlung wurde das Sediment neutralisiert und vom organischen Lösungsmittel befreit. Hierbei wurden 240 ml PS-1-Gel in Form von Perlen erhalten.
b) Zu 3 g pulverförmigem PS-1 wurden 144 ml destilliertes Wasser sowie 16 ml wäßrige 1 n-Natriumhydroxydlösung gegeben, wobei das Pulver sich löste. Dieser Lösung wurden 9 g SIRASU®-Perlen (0,177-0,42 mm, gegeben, worauf gerührt wurde. Während mit 360 min^-1 gerührt wurde, wurde das oben genannte Gemisch tropfenweise zu einer Lösung von 2 g der oberflächenaktiven Verbindung "Emalex® HC-30" in 600 ml Toluol gegeben und darin dispergiert. Zum erhaltenen Gemisch wurden 15 ml Essigsäure gegeben. Das gebildete Gel wurde durch Filtration durch ein Nylonfiltertuch als Kuchen isoliert. Der Kuchen wurde mit Wasser gespült. Die Untersuchung des erhaltenen Festkörpers unter dem Mikroskop ergab, daß er aus Perlen (0,42 bis 0,84 mm) bestand, die "SIRASU®" als Kern im PS-1-Gel enthielten.

Als Cyanhalogenide, die als Aktivierungsmittel dienen, eignen sich normalerweise die Brom-, Chlor- und Jodverbindungen oder Gemische dieser Verbindungen.

Als Alkalimetallhydroxide eignen sich für die Zwecke der Erfindung Ätzalkalien, z. B. Natriumhydroxid und Kaliumhydroxyd. Bevorzugt werden normalerweise wäßrige 1 n- bis 5 n-Lösungen. Das Alkalihydroxid wird zweckmäßig bis zu einem pH-Wert von 9 bis 13 zugesetzt, wobei ein pH-Wert von etwa 11 besonders bevorzugt wird. Das Alkalihydroxid wird allmählich so zugesetzt, daß Auflösung des in Wasser unlöslichen β-1,3-Glucan verhindert wird. Die Zugabe erfolgt vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 0,2 bis 0,5 pH-Einheiten/Min.

Nachstehend wird die Aktivierungsreaktion eines in Wasser unlöslichen β-1,3-Glucan mit einem Cyanhalogenid als spezielles Beispiel beschrieben.

In 20 Raumteilen Wasser wurde 1 Teil eines pulverförmigen, in Wasser unlöslichen β-1,3-Glucan suspendiert. Zur Suspension wurden 20 Raumteile Wasser gegeben, das 0,1 bis 3 Teile eines Cyanhalogenids enthielt. Unter Rühren bei einer beliebigen Temperatur von 0° bis 50°C wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches durch tropfenweise Zugabe einer 2 n-Natriumhydroxydlösung mit einer Geschwindigkeit, bei der keine Auflösung des Glucans stattfindet (etwa 0,5 pH-Einheiten/Min.) auf 11 erhöht. Das Reaktionsgemisch wurde dann 15 Minuten bei pH 11 gehalten, wodurch die Aktivierungsreaktion zur Vollendung gebracht wurde. Nach der Reaktion wurde die feste Fraktion abfiltriert und mit 100 Raumteilen Wasser gespült. Hierbei wurde ein pulverförmiges aktiviertes b-1,3-Glucan erhalten. Dieses aktivierte β-1,3-Glucan ist in Wasser und Alkalilösungen unlöslich. Es ist thermisch nicht gelierbar und hydrophil. Es besteht aus Teilchen, die eine solche Größe und Festigkeit haben, daß sie ausreichend fließfähig sind, wenn sie in Kolonnen gefüllt werden. Dieses β-1,3-Glucan kann daher in Verfahren zur Herstellung wasserunlöslicher Enzyme, die ausgezeichnete Eigenschaften aufweisen, oder für die erfindungsgemäßen Träger-Ligand-Produkte, die sich für die Affinitätschromatographie eignen, verwendet werden.

Ein solches wasserunlösliches Enzym oder Träger-Ligand- Produkt für die Affinitätschromatographie wird durch Umsetzung des in der beschriebenen Weise aktivierten β-1,3-Glucan mit einer Substanz, die primäre oder sekundäre Aminogruppen enthält, nämlich Pronase, α-Amylase, α-Chymotrypsin, saure Weizenkeimphosphatase, α-Aminosäureesterhydrolase, L-Leucylglycylglycin oder Urease, vorzugsweise in schwach alkalischer wäßriger Lösung bei einer beliebigen Temperatur im Bereich von etwa 0° bis 50°C hergestellt.

Ein an aktiviertes β-1,3-Glucan gebundenes Enzym kann in ein Bett oder in eine Schicht gepackt und als Reaktor für chemische Reaktionen verwendet werden. Hierbei kann eine Lösung eines Substrats durch das Enzymbett geleitet werden, um das Substrat in ein wertvolles Produkt umzuwandeln. Die Reaktion wird automatisch abgebrochen, wenn die Lösung das Bett verläßt. Das feste Enzym kann für lange Zeiträume in kontinuierlichem Betrieb verwendet werden.

Ein weiteres gutes Beispiel sind Antikörper, die an wasserunlösliche β-1,3-Glucane gebunden sind. Diese Produkte können speziell mit dem entsprechenden Antigen, z. B. zur analytischen Bestimmung des Antigens, kombiniert werden.

Beispielsweise kann ein in Wasser unlösliches Enzym von α-Aminosäureesterhydrolase hergestellt werden, indem eine durch einen Mikroorganismus gebildete α-Aminosäure- esterhydrolase kovalent an ein mit einem Cyanhalogenid aktiviertes, in Wasser unlösliches β-1,3-Glucan gebunden wird.

Es ist bekannt, daß viele Bakterien der Familie Pseudomonadaceae a-Aminosäureester einschließlich 2-Phenylglycinmethylester zu hydrolysieren vermögen und in Gegenwart eines geeigneten Acylakzeptors eine Transacylierungsreaktion auslösen, und daß halbsynthetische Penicilline oder halbsynthetische Cephalosporine durch Ausnutzung des Vorteils dieser Bakterien hergestellt werden können (T. Takahashi und Mitarbeiter, J. Amer. Chem. Soc. 94 (1972) 4035; T. Takahashi und Mitarbeiter, Biochem. J. 137 (1974) 497 und US-PSen 3 749 642 und 3 816 253). Da jedoch bei den bisher vorgeschlagenen Verfahren in jedem Fall Bakterienzellen für eine Enzymquelle erforderlich sind, findet Autolyse oder ein Aktivitätsverlust durch Alterung statt, wodurch die Zellen von einer wiederholten Verwendung völlig ausgeschlossen sind und das Enzym nur mit geringem Wirkungsgrad ausgenutzt wird. Ferner haben diese Verfahren den Nachteil, daß das Reaktionssystem verschmutzt oder in anderer Weise durch teilweise Elution oder Eindringen von Zellkomponenten in das System oder durch Infiltration der Bestandteile des Mediums, die sich häufig an die Bakterienzellen geheftet haben, verunreinigt wird. Die Folge ist, daß bei der Herstellung von Penicillinen oder Cephalosporinen für die Verwendung in Injektionslösungen viel Zeit und Mühe für die Reinigung der hergestellten Verbindungen erforderlich ist.

In dem Bemühen, die vorstehenden Nachteile auszuschalten, wurde von der Anmelderin ein Verfahren zur Umwandlung von α-Aminosäureesterhydrolasen in eine in Wasser unlösliche Form entwickelt.

Als Bakterien, die α-Aminosäureesterhydrolasen zu bilden vermögen, können für die Zwecke der Erfindung beispielsweise die Bakterien der folgenden Gattungen verwendet werden: Xanthomonas, Acetobacter, Gluconobacter, Pseudomonas, Aeromonas, Protaminobacter, Mycoplana. Dieses Enzym ist ein hydrolytisches Enzym das α-Aminosäureester, z. B. D-Phenylglycinmethylester, zu hydrolysieren vermag und gleichzeitig die Fähigkeit hat, Celphalexin aus D-Phenylglycinmethylester und 7-Amino-3-desacetoxycephalosporansäure (nachstehend kurz als 7-ADCA bezeichnet) zu synthetisieren. Ferner hat dieses Enzym die Fähigkeit, Ampicillin und Amoxicillin aus D-Phenylglycinmethylester bzw. D-p-Hydroxyphenylglycinmethylester und 6-Aminopenicillansäure (nachstehend kurz als 6-APA bezeichnet) zu synthetisieren sowie die Fähigkeit, racemische α-Aminosäureester mit optischer Spezifität zu hydrolysieren. Da das jeweilige Enzym intracellulär gebildet wird, ist es zunächst notwendig, die Zellen zu zerreißen und einen zellfreien Extrakt herzustellen. Dieses Zerreißen kann mit Hilfe eines der hierfür bekannten Verfahren, z. B. nach dem Lysocym-EDTA-Verfahren, nach dem Ultraschallverfahren, nach dem French-Pressverfahren usw., oder mit Hilfe einer geeigneten Kombination von zwei oder mehreren dieser Verfahren erreicht werden. Die erhaltene Suspension von zerrissenen Zellen wird zentrifugiert, wobei eine zellfreier Extrakt erhalten wird. Diese Flüssigkeit kann unmittelbar der Kupplungsreaktion mit einem in Wasser unlöslichen hochmolekularen Polysaccharid oder einer einfachen teilweisen Reinigung nach einem bekannten Enzymreinigungsverfahren unterworfen werden, bevor sie der Immobilisierungsreaktion unterworfen wird.

Es ist jedoch zu bemerken, daß nicht immer alle α-Aminosäureesterhydrolasen für die erfindungsgemäßen Immobilisierungsreaktionen in Form von rohen enzymatischen Produkten von geringer Reinheit verwendet werden. Die Auswahl der für diese Reaktion geeigneten α-Aminosäureesterhydrolase erfolgt daher mit Hilfe des folgenden Tests: Zunächst wird ein in Wasser unlösliches Enzym nach dem nachstehend in Bezugsbeispiel 12 beschriebenen Verfahren hergestellt. Wenn die spezifische Aktivität dieses Enzyms nicht geringer ist als die zweifache spezifische Aktivität des ursprünglichen rohen Enzyms, gilt dieses Enzym als geeignet für die Zwecke dieser Reaktion.

Die Kupplungsreaktion zwischen dem rohen Präparat des in dieser Weise gewählten Enzyms und dem aktivierten hochmolekularen Polysaccharid wird in einem wäßrigen Medium, das schwach sauer, neutral oder schwach alkalisch sein kann, bei einer Reaktionstemperatur, die vorzugsweise 40°C nicht überschreitet, durchgeführt. Die Reaktionszeit liegt im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 20 Stunden, hängt jedoch von der gewählten Reaktionstemperatur ab. Nach der Reaktion wird der erhaltene, in Wasser unlösliche enzymatische Formkörper abfiltriert und zur Entfernung von daran haftenden oder adsorbierten Verunreinigungen gespült.

Die Herstellung eines halbsynthetischen Penicillins oder Cephalosporins unter Verwendung des in dieser Weise hergestellten Formkörpers aus in Wasser unlöslicher α-Aminosäureesterhydrolase kann nach beliebigen Chargenverfahren oder kontinuierlichen Reaktionsverfahren erfolgen. Beim Chargenverfahren wird das in Wasser unlösliche enzymatische Produkt in einer Lösung der Substrate suspendiert, worauf man die Reaktion bei optimalem pH-Wert und unter optimalen Temperaturbedingungen während einer gegebenen Zeit stattfinden läßt. Das Reaktionsgemisch wird dann zur Rückgewinnung des in Wasser unlöslichen enzymatischen Produkts filtriert oder zentrifugiert. In dieser Weise kann das in Wasser unlösliche enzymatische Produkt stets von neuem verwendet werden.

Beim kontinuierlichen Reaktionsverfahren werden die in Wasser unlöslichen enzymatischen Formkörper in eine Kolonne gefüllt, durch die dann eine wäßrige Lösung, die die Substrate, d. h. den α-Aminosäureester und die 6-APA- oder 7-Aminocephemverbindung, enthält, geleitet wird. Bei dieser Arbeitsweise wird ein halbsynthetisches Penicillin oder Cephalosporin kontinuierlich in hoher Ausbeute erhalten. Das erhaltene Reaktionsproduktgemisch (Chargenreaktion) oder der Ablauf der Kolonne (kontinuierliche Reaktion) besteht ausschließlich aus der als Produkt gewünschten Verbindung, nicht umgesetzten Substraten und α-Aminosäure und Alkohol als Nebenprodukte. Es ist somit nicht nur leicht möglich, die gewünschte Verbindung von hoher Reinheit herzustellen, sondern auch die Ausgangsmaterialien äußerst leicht zurückzugewinnen. Ferner erfährt das in die Kolonne gefüllte, in Wasser unlösliche Enzym keine wesentliche Verschlechterung der α-Aminosäureesterhydrolaseaktivität, auch wenn es kontinuierlich für die Synthese von Cephalosporin bei 5°C für eine Zeit von 6 Monaten verwendet wird.

Im Falle dieses Beispiels war die durch das wasserunlösliche Enzym während der Zeit von 6 Monaten gebildete Cephalosporinmenge mit der Cephalosporinmenge vergleichbar, die bei Verwendung der Mikrobienzellen, die für die Herstellung des gleichen wasserunlöslichen Enzyms verwendet wurden, in ungefähr hundertfacher Wiederholung erhalten wurde. Dieses Beispiel läßt eindeutig erkennen, wie das kontinuierliche Syntheseverfahren zur Herstellung von Cephalosporin unter Verwendung der in Wasser unlöslichen enzymatischen Formkörper auch vom Standpunkt einer wirksamen Ausnutzung des Enzyms überlegen ist.

Die Erfindung wird durch die folgenden Bezugsbeispiele und Beispiele weiter erläutert.

Bezugsbeispiel 1

In ein 500 ml-Becherglas wurden 10 g weißes PS-1-Pulver gewogen. Nach Zugabe von 200 ml destilliertem Wasser wurde die Suspension mit einem Magnetrührer gerührt, bis das PS-1 genügend gequollen war. Dann wurden 200 ml einer 5 g Cyanbromid pro 100 ml enthaltenen wäßrigen Lösung zugesetzt. Unter ständigem Rühren bei 25°C wurde eine 2 n-Natriumhydroxydlösung mit einem automatischen Titriergerät so zugesetzt, daß der pH-Wert der Suspension mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,5 pH-Einheiten/Min. stieg, bis ein pH-Wert von 11 erreicht war. Die Suspension wurde nach etwa 15 Stunden bei diesem pH-Wert gehalten, wodurch die Reaktion zur Vollendung gebracht wurde.

Nach der Reaktion wurden die PS-1-Teilchen vom Reaktionsgemisch abfiltriert und mit 1 l destilliertem Wasser gespült. Hierbei wurden 10,05 g (Trockengewicht) aktiviertes PS-1 erhalten.

Bezugsbeispiel 2

Auf die in Bezugsbeispiel 1 beschriebene Weise wurden 10 g weißes PS-2-Pulver mit Cyanbromid aktiviert, wobei 10,08 g (Trockengewicht) aktiviertes PS-2 erhalten wurden.

Bezugsbeispiel 3

Zu 1 g PS-1 wurden 20 ml Wasser gegeben. Nachdem das Polysaccharid genügend gequollen war, wurden 20 ml einer wäßrigen Lösung, die 5 g Cyanbromid pro 100 ml enthielt, zugesetzt. Unter Rühren bei Raumtemperatur wurde der pH-Wert des Reaktionsgemisches unter Verwendung eines automatischen Titriergeräts (pH-Stat.) mit einer Geschwindigkeit von 0,2 bis 0,5 pH-Einheiten/Min. auf 11 erhöht. Die Reaktion wurde 15 Minuten bei einem konstanten pH-Wert von 11 fortgesetzt. Nach dieser Zeit wurde die feste Fraktion abfiltiert und mit destilliertem Wasser gut gespült. In dieser Weise wurde ein aktiviertes PS-1 erhalten.

Bezugsbeispiel 4

Zu 125 ml PS-1 in Form von Perlen (Teilchendurchmesser 50 bis 200 µm) (entsprechend 5 g PS-1 als Trockengewicht) wurden 100 ml Wasser und 100 ml 5%iges (Gew.-/Vol.) Cyanbromid gegeben. Bei 25°C wurde unter Rühren eine 2 n-Natriumhydroxydlösung mit einem automatischen Titriergerät in solchen Mengen zugetropft, daß der pH-Wert allmählich mit einer Geschwindigkeit von etwa 0,5 pH- Einheiten/Minute stieg, bis ein End-pH-Wert von 11 erreicht war. Das Gemisch wurde etwa 15 Minuten bei diesem pH-Wert gehalten, wodurch die Reaktion zur Vollendung geführt wurde. Nach dieser Reaktion wurde der Feststoff abfiltriert und mit 500 ml destilliertem Wasser gespült. In der beschriebenen Weise wurde aktiviertes perlförmiges PS-1 erhalten (Trockengewicht 5,1 g).

Bezugsbeispiel 5

Auf die in Bezugsbeispiel 4 beschriebene Weise wurden 5 g faserförmiges PS-2 (Durchmesser etwa 0,2 bis 0,3 mm, Länge etwa 10 cm) gewogen und behandelt. Hierbei wurde ein faserförmiges aktiviertes PS-2 erhalten (Trockengewicht 5,15 g).

Bezugsbeispiel 6

Auf die in Bezugsbeispiel 4 beschriebene Weise wurden 5 g PS-1 in Form einer Folie (Dicke etwa 0,2 mm) behandelt. Hierbei wurde ein aktiviertes folienförmiges PS-1 erhalten (Trockengewicht 4,95 g).

Beispiel 1

Das pulverförmige PS-1, das perlförmige PS-1, das faserförmige PS-2 und das folienförmige PS-1, die mit Cyanbromid auf die in den Bezugsbeispielen 1 und 4 bis 6 beschriebene Weise aktiviert worden waren, hatten die folgenden Eigenschaften:

1) Form

Das unbehandelte pulverförmige PS-1 nahm beim Quellen in destilliertem Wasser eine Form ähnlich einem schlaffen, entleerten Gummiball mit einem Durchmesser von 20 bis 500 µm an, wobei der größte mittlere Durchmesser etwa 50 µm betrug. Es wurde gefunden, daß das aktivierte pulverförmige PS-1 in Form und Teilchengröße im wesentlichen identisch mit unbehandeltem pulverförmigem PS-1 war.

In jedem Fall des perlförmigen PS-1, des faserförmigen PS-2 und des folienförmigen PS-1 wurde praktisch keine Veränderung der Form zwischen dem nicht aktivierten Glucan und dem aktivierten Glucan festgestellt.

2) Thermische Gelierbarkeit

Im Gegensatz zu den entsprechenden nicht aktivierten Glucanen fehlte den aktivierten Glucanen völlig die Fähigkeit, thermisch zu gelieren. Selbst nach Erhitzen für 15 Minuten in siedendem Wasser fand keine Gelierung statt.

3) Löslichkeit

Im Gegensatz zu den nicht aktivierten Glucanen konnten die aktivierten Glucane in wäßrigen Lösungen von starken Alkalien, Dimethylsulfoxyd und in konzentrierten Harnstofflösungen (8-molar) überhaupt nicht gelöst werden.

4) Analyse auf Stickstoff

Die Bestimmung auf N durch Elementaranalyse ergab, daß die durch die Aktivierungsbehandlung eingeführten Zahlen (Durchschnitt) von Stickstoffatomen 0,43 pro Glucoserest im Falle von PS-1-Pulver, 0,45 für PS-1-Perlen, 0,36 für faserförmiges PS-2 und 0,29 für PS-1-Folien betrug.

5) Infrarot-Absorptionsspektren (KBr)

Das Infrarotspektrum von unbehandeltem pulverförmigem PS-1 ist in Fig. 1 und das entsprechende Spektrum von aktiviertem PS-1 in Fig. 2 dargestellt. Ein Vergleich der beiden Spektren ergab neue Absorptionsbanden bei 1730, 1625 und 780 cm^-1 im Falle von aktiviertem pulverförmigem PS-1. Offensichtlich waren die Absorption bei 1730 cm^-1 auf das Carboxyamid und die Absorptionen bei 1625 und 780 cm^-1 auf das Imidocarbonat zurückzuführen.

Das perlförmige PS-1, das faserförmige PS-2 und das folienförmige PS-1 zeigten außerdem stets Absorptionsmaxima, die für Carboxyamide (1730 cm^-1) und Imidocarbonate (1625 cm^-1, 780 cm^-1) charakteristisch sind.

1) Färbbarkeit

Die Färbbarkeit dieser aktivierten Glucane wurde unter Verwendung von wasserlöslichen Farbstoffen nach der Methode von Nakanishi und Mitarbeitern (Carbohydrate Research 32 (1974) 47-52) ermittelt. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 genannt.

Tabelle 1: Färbbarkeitstest

Beispiel 2

In destilliertem Wasser wurde 1 g (Trockengewicht) des gemäß Bezugsbeispiel 1 hergestellten aktivierten PS-1 so suspendiert, daß 20 ml einer Suspension erhalten wurden. Dieser Suspension wurden 10 ml 0,2-molarer Carbonatpuffer (pH 8,5), 2 ml einer 20 mg/ml enthaltenden Lösung von Pronase und 8 ml destilliertes Wasser zugesetzt. Das Gemisch wurde 20 Stunden unter Rühren bei 5°C und pH 8,5 umgesetzt. Nach dieser Reaktion wurde das PS-1-Gel mit Hilfe eines Glasfilters isoliert und mit 80 ml einer 0,2-molaren Glycinlösung, 80 ml einer 0,5molaren Natriumchloridlösung und 40 ml destilliertem Wasser in der genannten Reihenfolge isoliert. Hierbei wurde ein in Wasser unlösliches enzymatisches Produkt von Pronase erhalten. Unter Verwendung des p-Toluolsulfonyl-L- argininmethylesters, der ein synthetisches Substrat ist, wurde die Pronaseaktivität des erhaltenen Produkts bei 25°C und pH 8,0 bestimmt. Das Ergebnis zeigte, daß 63% der bei der Kupplungsreaktion verwendeten Pronase in das in Wasser unlösliche Enzym umgewandelt worden waren.

Der Gesamtproteingehalt in den beim vorstehend beschriebenen Verfahren gewonnenen Waschflüssigkeiten wurde nach der Methode von Lowry (O. H. Lowry und Mitarbeiter, J. Biol. Chem. 193 (1951) 265) bestimmt und vom Proteingehalt der ursprünglich verwendeten Pronase subtrahiert. Die so berechnete Unlöslichmachung des Proteins betrug 77%.

Beispiel 3

1 g des gemäß Bezugsbeispiel 1 hergestellten aktivierten PS-1 wurde in einer solchen Menge destilliertem Wasser suspendiert, daß 20 ml einer Polysaccharidsuspension erhalten wurden. Dieser Suspension wurden 10 ml 0,2molarer Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) und 10 ml einer 2,5 mg/ml enthaltenden Lösung von kristalliner α-Amylase zugesetzt. Das Gemisch wurde 4 Stunden der Reaktion bei 5°C und pH 8,0 überlassen, worauf das Gel auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise gespült und eine in Wasser unlösliche α-Amylase erhalten wurde.

Die α-Amylaseaktivität dieses Produkts wurde ermittelt, indem es mit löslicher Stärke als Substat bei pH 5,3 und 37°C umgesetzt wurde. Die Unlöslichmachung der Aktivität wurde mit 59% und die Unlöslichmachung des Proteins mit 65% ermittelt.

Beispiel 4

1 g des gemäß Bezugsbeispiel 1 hergestellten aktivierten PS-1 wurde in einer solchen Menge destilliertem Wasser suspendiert, daß 20 ml einer Suspension erhalten wurden. Zu dieser Suspension wurden 10 ml 0,2molarer Phosphatpuffer (pH 8,0) und 10 ml einer 2,5 mg/ml enthaltenden Lösung von α-Chymotrypsin gegeben. Die Kupplungsreaktion wurde bei 5°C und pH 8 durchgeführt. Die Reaktion war in 2 Stunden beendet. In dieser Weise wurden 78% des ursprünglichen Enzymproteins an das PS-1 gekuppelt.

Unter Verwendung von L-Tyrosinäthylester als Substrat wurde die Esteraktivität in Gegenwart von 10% Äthanol bei 27°C und pH 7,8 bestimmt. Die Unlöslichmachung der Aktivität wurde mit 64% ermittelt.

Beispiel 5

In 20 ml destilliertem Wasser wurde 1 g des gemäß Bezugsbeispiel 1 hergestellten aktivierten PS-1 suspendiert. Zur Suspension wurden 10 ml 0,2molarer Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) und 10 ml einer 2,5 mg/ml enthaltenden Lösung von saurer Weizenkeimphosphatase gegeben. Das Gemisch wurde 18 Stunden bei 5°C und pH 8,0 unter Rühren umgesetzt. Nach dieser Zeit wurde das erhaltene Reaktionsprodukt wie in Beispiel 2 gespült, wobei eine in Wasser unlösliche saure Phosphatase erhalten wurde. Unter Verwendung von O-Carboxyphenylphosphat als Substrat wurde die Aktivität dieses Produkts bei 25°C und pH 5,0 bestimmt. Das Ergebnis zeigte, daß 52% der ursprünglichen Aktivität des Enzyms unlöslich gemacht worden war. Die Unlöslichmachung des Proteins wurde mit 63% ermittelt.

Beispiel 6

1 g des gemäß Bezugsbeispiel erhaltenen aktivierten PS-1 wurde in einer solchen Menge destilliertem Wasser suspendiert, daß 20 ml einer Suspension erhalten wurden. Dieser Suspension wurden 5 mg einer α-Aminosäureesterhydrolase, die aus den Zellen von Acetobacter turbidans ATCC 9325 extrahiert und teilweise gereinigt worden war (das Verfahren zur Herstellung des Enzyms und seine verschiedenen Eigenschaften werden von T. Takahashi und Mitarbeitern in Biochem. J. 137 (1974) 497 beschrieben) und 20 ml 0,1molarer Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) gegeben.

Das Gemisch wurde 4 Stunden der Reaktion bei 5°C und pH 8,0 unter Rühren überlassen. Nach dieser Reaktion wurde das PS-1-Gel abfiltriert und gespült, wie in Beispiel 2 beschrieben. Das in dieser Weise erhaltene, in Wasser unlösliche Enzyms wurde in destilliertem Wasser suspendiert, wobei 40 ml einer Suspension erhalten wurden.

Unter Verwendung von D-Phenylglycinmethylester als Substrat wurde die Aktivität dieses suspendierten unlöslichen Enzyms bestimmt. Sie wurde mit 9,83 Einheiten/ml ermittelt. Das Ergebnis zeigte, daß 84% der ursprünglichen Aktivität des Enzyms unlöslich gemacht worden waren. Die Unlöslichmachung des Proteins wurde mit 69% ermittelt.

Unter Verwendung von 25 ml dieser Suspension des in Wasser unlöslichen Enzyms wurde eine kleine Säule mit einem Bettvolumen von 5 ml hergestellt. Eine Substratlösung (pH 7,2), die 15 mg/ml D-Phenylglycinmethylesterhydrochlorid, 5 mg/ml 7-Amino-3-desacetoxycephalosporansäure und 10% (Vol./Vol.) Methanol enthielt, wurde mit einer konstanten Durchflußgeschwindigkeit von 12 ml/Std. durch die Säule geleitet. Das aus der Kolonne austretende Reaktionsgemisch enthielt 7,50 mg Cephalexin pro ml. Diese Reaktion wurde ununterbrochen 6 Monate durchgeführt. Es wurde festgestellt, daß die Aktivität der Kolonne zur Bildung von Cephalexin nach dieser Zeit völlig unverändert war.

Beispiel 7

1 g des auf die in Bezugsbeispiel 1 beschriebene Weise hergestellten aktivierten PS-1 wurde in einer solchen Menge destilliertem Wasser suspendiert, daß 20 ml einer Suspension erhalten wurden. Dieser Suspension wurden 20 ml eines 0,1molaren Tris-HCl-Puffers (pH 8,0) zugesetzt, in dem 20 mg L-Leucylglycylglycin gelöst waren. Das Gemisch wurde 16 Stunden der Reaktion bei 5°C und pH 8 unter sachtem Rühren überlassen. Anschließend wurde das PS-1-Gel abfiltriert und gespült, wie in Beispiel 2 beschrieben.

Aus dem L-Leucylglycylglycingehalt der Waschflüssigkeiten wurde berechnet, daß 12,6 mg L-Leucylglycylglycin an das PS-1 gekuppelt waren.

Die vorstehend beschriebene Reaktion wurde in der gleichen Weise wiederholt, wobei jedoch γ-Globulin von menschlichem Serum (Fraktion II), bzw. Insulin an Stelle von L-Leucylglycylglycin verwendet wurden. An das PS-1 wurden in dieser Weise 15,1 mg γ-Globulin bzw. 11,0 mg Insulin gekuppelt.

Beispiel 8 (auf Trockenbasis)

Zu je 1g der gemäß Bezugsbeispiel 4 bis 6 hergestellten aktivierten PS-1-Perlen, der aktivierten PS-2-Fasern und der aktivierten PS-1-Folie wurden 20 ml destilliertes Wasser, 10 ml einer wäßrigen Lösung von 1 g p-Aminophenyläthylalkohol in 100 ml Wasser und 10 ml 0,04molarer Phosphatpuffer (pH 6) gegeben. Die Reaktion wurde 24 Stunden unter Rühren bei 5°C und pH 6 durchgeführt.

Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und der Feststoff mit 200 ml 0,5molarer wäßriger NaCl-Lösung gespült. Die bei dieser Reaktion gekuppelte Menge des p-Aminophenyläthylalkohols wurde aus der im Filtrat zurückgewonnenen Menge des p-Aminophenyläthylalkohols berechnet. Die in dieser Weise gekuppelten Mengen des p-Aminophenyläthylalkohols betrugen 47 mg im Falle von PS-1-Perlen, 33 mg bei PS-2-Fasern und 24 mg bei der PS-1-Folie (alle Zahlen auf je 1 g Träger bezogen). Es ist anzunehmen, daß diese Zahlen den Mengen von aktiven Gruppen (Imidocarbonatgruppe) entsprechen, die durch die Aktivierungsreaktion in den Träger eingeführt wurden.

Beispiel 9

1 g (auf Basis des Trockengewichts) der gemäß Bezugsbeispiel 4 hergestellten aktivierten PS-1-Perlen wurden in 40 ml destilliertem Wasser suspendiert. Zur Suspension wurden 10 ml 0,2molarer Carbonatpuffer (pH 8,5), 5 ml einer 20 mg/ml enthaltenden Lösung von Pronase und 5 ml destilliertes Wasser gegeben. Die Reaktion wurde 6 Stunden unter ständigem Rühren bei 5°C und pH 8,5 durchgeführt. Nach der Reaktion wurde das perlförmige PS-1-Gel auf einem Glasfilter abfiltriert und mit 120 ml 0,2molarer Glycinlösung, 120 ml 0,5molarer Natriumchloridlösung und 80 ml destilliertem Wasser in dieser Reihenfolge gespült. Hierbei wurde wasserunlöslichen Pronase erhalten. Unter Verwendung von p-Toluolsulfonyl- L-argininmethylester, einem synthetischen Substrat, wurde die Pronaseaktivität dieses Produkts bei 25°C und pH 8,0 bestimmt. Es wurde gefunden, daß 60% der ursprünglichen Pronaseaktivität durch die Kupplungsreaktion in das wasserunlösliche enzymatische Produkt übergegangen war.

Das Gesamtprotein in den genannten Waschflüssigkeiten wurde ebenfalls nach der Methode von Lowry bestimmt (O. H. Lowry und Mitarbeiter, J. Biol. Chem. 193 (1951) 265). Der gefundene Wert wurde vom Gesamtproteingehalt der ursprünglichen Pronase subtrahiert. Aus der so gefundenen Differenz wurde die Unlöslichmachung des Proteins mit 72% berechnet.

Beispiel 10

In 20 ml destilliertem Wasser wurde 1 g der gemäß Bezugsbeispiel 5 hergestellten aktivierten PS-2-Fasern suspendiert. Dieser Suspension wurden 10 ml 0,2molarer Phosphatpuffer (pH 8,0) sowie 10 ml einer 2,5 mg/ml enthaltenden Lösung von kristallinem α-Chymotrypsin zugesetzt. Diese Kupplungsreaktion wurde bei 5°C und pH 8,0 durchgeführt. Die Reaktion war in 4 Stunden beendet. Nach dieser Zeit wurde festgestellt, daß 65% des ursprünglich zugesetzten Enzymproteins mit dem Träger gekuppelt waren. Unter Verwendung von L-Tyrosinäthylester als Substrat in Gegenwart von 10% Äthanol wurde die Esteraseaktivität des Produkts bei 27°C und pH 7,8 bestimmt. Die Unlöslichmachung der Aktivität wurde mit 54% ermittelt.

Beispiel 11

Zu 1 g der gemäß Bezugsbeispiel 6 hergestellten aktivierten PS-1-Folie wurden 20 ml destilliertes Wasser sowie 5 ml einer 1%igen Ureaselösung (hergestellt aus Jack- Bohnen (Jack bean) und 5 ml 0,04molarer Phosphatpuffer (pH 7,5) gegeben. Die Reaktion wurde 18 Stunden bei 5°C unter Rühren durchgeführt. Hierbei wurden 35% der ursrprünglichen Enzymaktivität unlöslich gemacht. Die Unlöslichmachung des Proteins betrug 44%.

Beispiel 12

Stämme von Mikroorganismen mit α-Aminosäureesterhydrolase- Aktivität wurden verwendet, um jeweils einen 2 l-Schüttelkolben zu impfen, der 500 ml eines Mediums der in der Fußnote zu Tabelle 2 genannten Zusammensetzung enthielt. Die Schüttelkultur wurde 24 Stunden bei 28°C durchgeführt.

Das Kulturmedium wurde zentrifugiert. Den hierbei abgetrennten Zellen wurde 0,1molarer Phosphatpuffer (pH 6,0) in einer solchen Menge zugesetzt, daß 50 ml Suspension erhalten wurden. Die Zellen in der Suspension wurden durch Ultraschallbehandlung bei 150 W für 50 Minuten zerrissen. Der erhaltene zellfreie Extrakt der α-Aminosäureesterhydrolase wurde zentrifugiert. Zum Überstand wurden je 0,1 Raumteil 1molares sekundäres Kaliumphosphat und 1molares Calciumacetat zugesetzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei 5°C stehen gelassen. Das erhaltene Calciumphosphatgel wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, wobei ein Überstand erhalten wurde. 1 ml dieses mit Calciumphosphat behandelten Überstandes wurde in ein kleines mit einem Stopfen verschlossenes Reagenzglas gegeben, worauf 0,1 g des gemäß Bezugsbeispiel 3 hergestellten aktivierten PS-1 und 1 ml 2molarer Phosphatpuffer (pH 8,0) zugesetzt wurden und mit destilliertem Wasser auf 4 ml aufgefüllt wurde. Die Reaktion wurde 4 Stunden unter Schütteln bei 5°C durchgeführt. Das PS-1 wurde dann mit Hilfe eines Glasfilters abgetrennt und mit 18 ml 0,2molarer Glycinlösung und 18 ml 0,5molarer Natriumchloridlösung gespült. Hierbei wurden 40 ml Waschflüssigkeit gewonnen. Das erhaltene unlöslich gemachte Enzym wurde in 4 ml destilliertem Wasser suspendiert. Die enzymatische Aktivität wurde durch Messen der Hydrolysegeschwindigkeit mit einem automatischen Titriergerät (pH-Stat) bei 27°C und pH 6,0 unter Verwendung von 20 mMol D-Phenylglycinmethylesterlösung als Substrat bestimmt. Die Enzymmenge, die 1 µ-Mol des Substrats pro Minute hydrolysierte, wurde als Einheit (E) genommen. Die Proteinmenge in den vorstehend genannten Waschflüssigkeiten wurde bestimmt und die Menge an gebundenem Protein aus dem Prozentsatz der Rückgewinnung berechnet. Außerdem wurde die prozentuale Rückgewinnung der PS-1-gebundenen Aktivität durch die prozentuale Rückgewinnung von PS-1-gebundenem Protein dividiert. Dieser relative Wert stellte das Verhältnis der spezifischen Aktivität des immobilisierten Enzyms zur spezifischen Aktivität des Überstandes dar, der nach der Calciumphosphatbehandlung erhalten wurde. Wie Tabelle 2 zeigt, wurden als Enzyme, bei denen das oben erläuterte Verhältnis über zwei lag, die Enzyme der folgenden fünf Stämme von Mikroorganismen ausgewählt: Acetobacter pasteurianus (IFO 3223, ATCC 6033), Acetobacter turbidans (IFO 3225, ATCC 9325), Mycoplana sp. (IFO 13 213, ATCC 21 759), Gluconobacter suboxidans (IFO 3432, ATCC 621) und Xanthomonas sp. (IFO 13 215, ATCC 21 764).

Tabelle 2

Beispiel 13

In 40 ml destilliertem Wasser wurde 1 g (auf Basis der Trockengewichts) des nach dem in Bezugsbeispiel 3 beschriebenen Verfahrens aktivierten PS-1 suspendiert. Zur Suspension wurden 20 ml 0,2molarer Tris-HCl-Puffer (pH 8) und 20 ml des Überstandes gegeben, der durch Behandlung der zerrissenen Zellen von Xanthomonas sp. (IFO 13 215, ATCC 21 764) mit Calciumphosphat auf die in Beispiel 12 beschriebene Weise erhalten worden waren. Die Reaktion wurde 20 Stunden unter Rühren bei 5°C und pH 8,0 durchgeführt. Nach dieser Zeit wurde das Reaktionsgemisch durch ein Glasfilter filtriert, um die feste Fraktion zu isolieren. Diese feste Fraktion wurde mit 100 ml 0,2molarer Glycinlösung, 100 ml 0,5molarer Natriumchloridlösung und 200 ml destilliertem Wasser in dieser Reihenfolge gespült. Das in dieser Weise erhaltene, in Wasser unlösliche Enzymprodukt wurde erneut in destilliertem Wasser in einer solchen Menge suspendiert, daß 40 ml Suspension erhalten wurden. Die Aktivität und die Menge an gebundenem Protein in dem erhaltenen wasserunlöslichen Enzymprodukt wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 genannt.
TrägerPS-1 Unlöslich gemachte Aktivität (µ-ml)6,38 Ausbeute74% Unlöslich gemachtes Protein (mg/ml)3,53 Ausbeute34% Ausbeute an unlöslich gemachter Aktivität/
Ausbeute an unlöslich gemachtem Protein2,2

Beispiel 14

Zu 500 ml des flüssigen Überstandes, der durch Behandlung von Acetobacter turbidans (IFO 3225, ATCC 9325) mit Calciumphosphat auf die in Beispiel 12 beschriebene Weise erhalten worden war, wurden 25 g des mit Cyanbromid auf die in Bezugsbeispiel 3 beschriebene Weise voraktivierten PS-2 und 250 ml 0,2molarer Phosphatpuffer (pH 8,0) gegeben. Das Gemisch wurde mit destilliertem Wasser auf 1 l aufgefüllt. Die Reaktion wurde 18 Stunden bei einer konstanten Temperatur von 5°C und einem konstanten pH-Wert von 8,0 durchgeführt, worauf das Reaktionsgemisch durch ein Glasfilter filtriert wurde. Die feste Fraktion wurde mit 2 l 0,2molarer Glycinlösung, 2 l 0,5molarer Natriumchloridlösung und 2 l destilliertem Wasser in dieser Reihenfolge gespült. Das erhaltene unlöslich gemachte Enzym wurde in 1 l 0,01molarem Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert. Die Aktivität dieses Produkts betrug 8,30 µ/ml und die Aktivitätsausbeute etwa 81%. Der Proteingehalt betrug 5,10 mg/ml und die Ausbeute an unlöslich gemachtem Protein 33%, d. h. die spezifische Aktivität war 2,5fach gestiegen.

Claims

Träger-Ligand-Produkte aus einem in Wasser unlöslichen und mit Cyanhalogenid im alkalischen pH-Bereich aktivierten Polysaccharid als Träger und einem an den Träger covalent gebundenen Ligand, gekennzeichnet durch
- (a) ein durch Umsetzung eines in Wasser unlöslichen β-1,3- Glucans mit Cyanhalogenid hergestelltes, aktiviertes β-1,3-Glucanderivat als Träger, wobei das in Wasser unlösliche β-1,3-Glucan erhalten wird, indem man in dem Reaktionsgemisch den pH-Wert mit wäßriger Alkalihydroxidlösung um 0,2 bis 0,5 pH-Einheiten/min in der Weise erhöht, daß die Auflösung des in Wasser unlöslichen β-1,3-Glucans verhindert wird und
- (b) einen primäre oder sekundäre Aminogruppen enthaltenden Ligand, nämlich Pronase, α-Amylase, α-Chymotrypsin, saure Weizenkeimphosphatase, α-Aminosäureesterhydrolase, L-Leucylglycylglycin oder Urease.