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Gebundene Zellen mit Penicillinacylaseaktivität,
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ihre Herstellung und Verwendung Die Erfindung betrifft gebundene
Zellen mit Penicillinacylaseaktivität und ihre Herstellung, die zur biochemischen
Hydrolyse nativer Penicilline zu 6-Aminopenicillansäure geeignet sind, die ein außerordentlich
wichtiges Zwischenprodukt für die Herstellung einer Reihe halbsynthetischer Penicilline,
insbesondere ausgehend von Benzylpenicillin, darstellt.
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Bei herkömmlichen Verfahren zur Bindung von Zellen werden verschiedene
in Wasser unlösliche organische, anorganische
oder natürliche Träger
zur Verbesserung der Sedimentations- und dadurch der Separationseigenschaften gebundener
Zellenpräparate verwendet.
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Nach dem Verfahren der CS-Patentanmeldung PV 2318-77 (vgl. den CS-Urheberschein
werden zB zur Bindung der Zellen sphärische Teilchen aus synthetischen Polymeren
verwendet, die durch gezielt geführte Polymerisation von Monomeren auf der Basis
von Methacrylaldehyd, Glycidylmethacrylat, Hydroxyalkylmethacrylaten udgl hergestellt
sind. Diese Polymeren müssen zuvor durch Anküpfung von distalen räumlichen Kupplungsgruppen
mit Aminoendgruppen chemisch modifiziert werden; erst danach werden die Zellen auf
solchen modifizierten Polymerteilchen mit polyfunktionellen Reagentien fixiert.
In ähnlicher Weise beruht das Zellenbindungsverfahren der DE-OS 25 13 929 auf der
Reaktion der Zellen mit einem reaktiven Monomer und nachfolgender Polymerisation
oder Copolymerisation bzw. der Reaktion mit Polyglyeidylmethacrylat, ggfs in Kombination
mit einer kovalenten Fixation des Enzyms im Zellinneren durch ein bifunktionelles
Reagens.
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Diese oder ähnliche Träger sind mit hohen Gestehungskosten behaftet,
so daß ihre technische Anwendung sehr beschränkt ist.
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Einen gewissen Fortschritt in der Technologie der Bindung von Zellen
mit industrieller Bedeutung stellt das Verfahren des CS-Urheberscheins , (PV 5321-77)
dar, das im Prinzip auf der Bindung der aktiven Zellen auf
Trägermaterialien
aus verschiedenen Mikroorganismenarten beruht. Diese Trägermaterialien sind entweder
ganze, unzerstörte Zellen und/oder physikalisch, chemisch oder biochemisch mit polyfunktionellen
Reagentien kovalent gebundene Zellen oder ihre unlöslichen Fragmente.
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Bei dieser Verfahrensweise zur Bindung von Zellen sind die Gestehungskosten
deutlich niedriger, da die als Trägermaterial herangezogenen Zellen Abfallprodukte
verschiedener Fermentationsverfahren darstellen, deren Preis zumeist vernachlässigbar
niedrig ist oder die sogar ohne Kosten anfallen, wodurch eine höhere Wirtschaftlichkeit
erzielt wird. In dem obigen CS-Urheberschein ist auch angegeben, daß die aktiven
Zellen aneinander gebunden werden können, also ohne Anwendung eines Trägers.
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Bei dieser Verfahrensweise müssen die Zellen auf natürliche Weise
oder künstlich autolysiert sein, damit eine Bindung untereinander möglich ist; ferner
ist hierbei zu berücksichtigen, daß in dieser Weise behandelte Zellen schlechtere
mechanische und Sedimentationseigenschaften sowie infolge ihrer vorhergehenden partiellen
Autolyse auch eine geringere spezifische Aktivität besitzen. Dieser Nachteil wird
durch ein Verfahren der kovalenten Vernetzung individueller aktiver Zellen mit polyfunktionellen
Reagentien vermieden, das sich zur halbkontinuierlichen Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure
eignet und im CS-Urheberschein (PV 3679-77) beschrieben ist.
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Bei der Durchführung dieses Verfahrens müssen jedoch zur Abtrennung
der gebundenen Zellen bei wiederholter Benutzung groß dimensionierte Zentrifugen
verwendet werden, da die gebundenen Zellen sehr klein sind (etwa 1 um), was
zu
schlechten Sedimentationseigenschaften führt; hierauf beruht ferner auch die Notwendigkeit,
dieses Verfahren diskontinuierlich durchzuführen und diskontinuierlich arbeitende
Mischreaktoren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure einzusetzen.
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Im Rahmen der Erfindung wurde nun festgestellt, daß frische native
Zellen von Penicillinacylase produzierenden Mikroorganismen unmittelbar nach ihrer
Abtrennung aus der Fermentationsflüssigkeit ohne Anwendung eines Trägers und ohne
Notwendigkeit einer von selbst ablaufenden oder künstlichen partiellen Autolyse
gebunden werden können.
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Die Erfindung gibt ein Verfahren zur Herstellung gebundener Zellen
mit Penicillinacylseaktivität unter Verwendung bifunktioneller Aldehyde an, das
gekennzeichnet ist durch (a) Vernetzung des Zellinhalts von Penicillinacylase erzeugenden
Mikroorganismen mit einem Dialdehyd, (b) Permeabilisation der vernetzten Zellen
durch Einwirkung erhöhter Temperatur und/oder eines organischen Lösungsmittels und/oder
eines Tensids, (c) Umsetzung des intermediären Zellmaterials in wäßrigem Medium
mit einer löslichen Verbindung, die mindestens zwei primäre und/oder sekundäre Aminogruppen
aufweist, und dem Dialdehyd, (d) Abtrennung der resultierenden gebundenen Zellenpartikel
und mechanische Verfestigung durch Einwirkung von organischen, mit Wasser mischbaren
Lösungsmitteln, ggfs im Gemisch mit Wasser, bei O bis -30 OC unter gleichzeitiger
partieller Dehydratation
und (e) Überführung in die enzymatisch
aktive Form durch Rehydratation in einem wäßrigen Medium von pH 7 - 8 vor dem Gebrauch,
vorzugsweise in einem Phosphatpuffer.
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Die erfindungsgemäßen gebundenen Zellen mit Penicillinacylaseaktivität
sind demgemäß nach dem obigen Verfahren zugänglich.
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Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden Penicillinacylase enthaltende
aktive Zellen mit hoher spezifischer Penicillinacylaseaktivität, sehr guten Sedimentationseigenschaften
und vor allem sehr guten hydrodynamischen Eigenschaften erhalten. Die Teilchen der
gebundenen Zellen sind fest, kornförmig, erinnern im Aussehen an ein dunkelbraun
bis schwarz gefärbtes Harz und besitzen Eigenschaften, die ihre Anwendung zur kontinuierlichen
Herstellung von 6-Aminopenicillansäure ermöglichen.
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Die wesentlichen Verfahrensschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Herstellung gebundener Zellen mit Penicillinacylaseaktivität ohne Anwendung
eines Trägers sind: (a) Chemische Umsetzung der aktiven Zellen in wäßriger Suspension
mit bifunktionellen Vernetzungsreagentien, wodurch eine kovalente Vernetzung und
Verknüpfung des intrazellulären Zellinhalts der individuellen Zellen und dadurch
eine Fixierung und Stabilisierung der in den einzelnen Zellen enthaltenen Penicillinacylase
sowie eine erhöhte Autolysebeständigkeit der Zellen erzielt wird.
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(b) Verdünnung der Zellsuspension nach der obigen Umsetzung mit Wasser,
Eindickung in groß dimensionierten Zentrifugen und nachfolgende Permeabilisierung
der individuell vernetzten Zellen in wäßriger Suspension durch Temperatureinfluß,
durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels und/oder eines Netzmittels, ggfs durch
Kombination dieser Verfahrensparameter.
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Hierdurch kommt es zu einer Ausschwemmung derjenigen Komponenten
an Zelloberflächen und im Zellinneren, die nicht umgesetzt wurden und überwiegend
lipophile Eigenschaften aufweisen. Hierdurch werden die Diffusionseigenschaften
der vernetzten Zellen verbessert und weitere reaktionsfähige Gruppen auf der Zelloberfläche
sowie im Zellinneren freigelegt.
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(c) Verdünnung der Suspension der vernetzten und ausgewaschenen Zellen
mit Wasser nach ihrer Permeabilisation, Eindickung auf groß dimensionierten Zentrifugen
und nachfolgende chemische Umsetzung mit bifunktionellen Vernetzungsreagentien in
Gegenwart einer wasserlöslichen Verbindung, die wenigstens zwei primäre und/oder
sekundäre Aminogruppen enthält, Unter Abkühlung des Reaktionsgemischs unter den
Gefrierpunkt, wodurch es zu einem engen Kontakt der Zellen und nach einer bestimmten
Zeit zur Bildung miteinander verbundener, kovalent verknüpfter Zellpartikel kommt.
Nach der Bindung der Zellen aneinander wird das gefrorene Material auftauen gelassen
und anschließend in Wasser dispergiert, einige Male mit Wasser dekantiert und danach
filtriert, beispielsweise durch ein Textilfilter oder andere geeignete Filtermaterialien.
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(d) Eintragen des gut abgesaugten feuchten Materials der gefüllten
Zellen unter Mischen in vorgekühltes Aceton oder Propanol oder entsprechende Gemische
mit Wasser, kurzes leichtes Mischen und anschließendes Absaugen, wodurch es zu einer
raschen partiellen Dehydratation der gebundenen Zellen sowie einer mechanischen
Verfestigung der Partikel kommt. Das Material wird anschließend in wäßrigem Medium
gequollen, nach der Quellung abgesaugt und ggfs bei etwa 60 % relativer Feuchte
bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
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Durch das erfindungsgemäße Verfahren können gebundene Zellen mit
Penicillinacylaseaktivität ohne Verwendung eines Trägers und unter Erzielung einer
hohen spezifischen Enzymaktivität erhalten werden. Die spezifische Aktivität beträgt
bis 90 % des Wertes der spezifischen Aktivität nativer Zellen. Die hohe Ausbeute
der gebundenen enzymatischen Aktivität geträgt bis zu 70 %, bezogen auf das Gewicht
der nativen Produktionszellen vor der Bindung.
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Die erhaltenen Zellen besitzen ausgezeichnete Sedimentations- und
insbesondere hydrodynamische Eigenschaften bei guter Stabilität der Enzymaktivität
bei Langzeitverwendung, wobei sich die Partikelgröße in gewissen Grenzen durch die
Konzentration der Zellen und die angewandten Reaktionsbedingungen einstellen läßt.
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Das erfindungsgemäße Material zeichnet sich auch durch gute Stabilität
gegenüber mechanischem Abrieb beim Mischen sowie durch Partikelreibung aus. Das
Material eignet sich somit für die wiederholte Verwendung und
insbesondere
die kontinuierliche Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch saure Hydrolyse
von Penicillinen, insbesondere Benzylpenicillin.
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Für die enzymatische Hydrolyse unter Verwendung des erfindungsgemäßen
Materials kann eine wäßrige Lösung des Natrium- oder Kaliumsalzes des entsprechenden
Penicillins, beispielsweise von Benzylpenicillin, verwendet werden, ggfs auch eine
rohe Lösung des entsprechenden Penicillins in der Säureform, die bei der Aufarbeitung
der fermentierten Nährböden nach Beendigung der Kultivierung anfällt. Die erhaltene
6-Aminopenicillansäure ist rein und frei von Eiweißverunreinigungen; aus ihr hergestellte
halbsynthetische Penicilline rufen keine allergischen Reaktionen im lebenden Organismus
hervor.
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Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die Umsetzung der vernetzten und permeabilisierten Zellen mit der wasserlöslichen,
Aminogruppen enthaltenden Verbindung und dem bifunktionellen Aldehyd bei einer Temperatur
unter dem Gefrierpunkt des Reaktionsgemischs vorgenommen.
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Nach der Entstehung der gebundenen Zellpartikel werden diese gewaschen,
dekantiert, abgesaugt und unter Dehydratation mechanisch verfestigt, wobei vorzugsweise
Aceton oder Propanol oder ein entsprechendes Gemisch mit Wasser verwendet wird.
Nach dem Absaugen wird in wäßrigem Milieu gequollen und danach ggfs abgesaugt und
getrocknet, vorzugsweise bei hinreichender Luftfeuchtigkeit.
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Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird das Reaktionsgemisch anstelle der Abkühlung unter den Gefrierpunkt in Schritt
(c) bei Temperaturen über O °C, vorzugsweise bei 15 bis 25 0^ verarbeitet, wobei
vorsichtig gemischt und/oder ohne Mischen bzw. Rühren umgesetzt wird.
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Als Ausgangsmaterial für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
eignen sich prinzipiell beliebige Mikroorganismen, die Penicillinacylase synthetisieren
und bei denen das Enzym im periplasmatischen Raum oder im Zellinneren lokalisiert
ist, beispielsweise Mikroorganismen der Gattung Escherichia coli, Alcaligenes faecalis,
Proteus rettgeri ua. Dabei ist es erfindungsgemäß vorteilhaft, solche Mutanten von
Mikroorganismenstämmen auszunutzen, die durch gezielte genetische Manipulationen
gewonnen wurden und hohe Gehalte an Penicillinacylase aufweisen. Die erhaltenen
gebundenen Zellen besitzen dann eine entsprechend hohe spezifische Enzymaktivität.
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Durch Anwendung anderer Mikroorganismen bzw. Stämme können erfindungsgemäß
gebundene Zellaggregate hergestellt werden, die qualitativ wie auch quantitativ
unterschiedliche Enzymaktivität aufweisen.
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Die Größe der gebundenen Zellpartikel wurde lichtmikroskopisch mit
einem kalibrierten Meßokular bei verschiedener Vergrößerung untersucht. Zur Analyse
der Partikelgröße wurde ferner auch eine Siebanalyse unter Verwendung von Metallsieben
herangezogen; die gebundenen Zellpartikel wurden unter Verwendung von drei Siebsätzen
klassiert, deren Maschenweite im Bereich von 0,03 bis 2,0 mm lag.
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Die Penicillinacylaseaktivität wurde spektralphotometrisch durch
Farbreaktion von p-Dimethylaminobenzaldehyd mit 6-Aminopenicillansäure (6-APS) nach
dem Verfahren der CS-PS 116 959 in der Modifizierung nach Balasingham et al. (Biochim.
Biophys. Acta 276 (1972) 250) bei 24 OC und pH 7,6 im Bereich der Reaktionskinetik
nullter Ordnung bestimmt. Die Anfangskonzentration des Substrats und des Kalium-
oder Natriumsalzes des Benzylpenicillins bei der Bestimmung betrug 2 % (G/V). Unter
der Einheit der Enzymaktivität wird diejenige Enzymmenge verstanden, die katalytisch
die Entstehung von 1 Xumol 6-APS aus Benzylpenicillin oder seinen Salzen in einer
Stunde bewirkt.
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Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen
näher erläutert, die nicht einschränkend sind.
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Beispiel 1 Zu 25 kg einer feuchten Zellpaste von Escherichia coli-Zellen
(spezifische Aktivität der Penicillinacylase 9,0 /umol 6-APS/h.mg feuchte Zellmasse)
wurden 50 1 Trinkwasser zugegeben; anschließend wurde 1 h mit einem Vibrationsmischer
gemischt. Die homogene Zellsuspension wurde in einen Mischkessel aus rostfreiem
Stahl gepumpt, in dem der pEI-Wert der Suspension mit 2 N NaOEl-Lösung von 5,9 auf
7,0 eingestellt wurde; das Gesamtvolumen der Suspension betrug 75 1.
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Nach der pEs-Einstellung wurden unter ununterbrochenem Mischen 3
1 einer 25%igen wäßrigen Glutardialdehydlösung zugegeben, wonach 3 h bei Raumtemperatur
gemischt wurde.
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Danach wurde das Reaktionsgemisch mit Trinkwasser auf ein Gesamtvolumen
von 300 1 verdünnt und abzentrifugiert (Sharples-Separator).
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Es wurden 24 kg feuchte Masse einzelner vernetzter Zellen aus dem
Produzentenstamm gewonnen.
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Zu 24 kg Paste der vernetzten Zellen wurden 45 1 Trinkwasser zugegeben,
wonach die Suspension 1 h mit einem Vibrationsmischer homogenisiert wurde; das Suspensionsvolumen
betrug 70 1.
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Die homogene Suspension der vernetzten Zellen wurde dann in einen
Extraktionskessel gepumpt, mit 7 1 Butylacetat versetzt und 3 h bei Raumtemperatur
intensiv gemischt.
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Anschließend wurde die Suspension unter Mischen mit 33 1 Trinkwasser
verdünnt, worauf 2,68 1 einer 25%igen wäßrigen Tensidlösung (Slovafol 909) zugegeben
wurden.
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Nach Zugabe des Tensids wurde die Suspension 30 min weiter gemischt
und danach mit Trinkwasser auf ein Gesamtvolumen von 300 1 verdünnt; anschließend
wurden die vernetzten Zellen abzentrifugiert (Sharples-Separator).
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Es wurden insgesamt 22 kg vernetzte und teilweise permeabilisierte
Zellen in Form einer feuchten Zellpaste gewonnen.
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Zu 22 kg dieser Paste wurden 88 1 Trinkwasser zugegeben; die Suspension
wurde 1 h mit einem Vibrationsmischer homogenisiert. Nach dieser Zeit wurde die
homogene Suspension in einen Mischkessel aus rostfreiem Stahl übergepumpt, darin
auf 40 OC erhitzt und bei dieser
Temperatur 72 h lang scharf gemischt.
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Im Anschluß daran wurde die Suspension der ver-0 netzten und permeabilisierten
Zellen auf 20 C abgekühlt und mit Trinkwasser auf ein Gesamtvolumen von 100 1 aufgefüllt;
nach Einstellen des pH-Werts der Suspension mit 2 n NaOH-Lösung auf 7,0 wurde unter
Mischen 0,5 kg Polyäthylenimin (Sedipur KA) zugesetzt.
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Die Suspension wurde noch etwa 15 min weiter gemischt; anschließend
wurden 4 1 einer 25%igen wäßrigen Glutardialdehydlösung zugegeben; das gemischte
Reaktionsgemisch wurde anschließend sofort in Polyäthylenbeutel zu 750 ml abgefüllt
und darin eingeschweißt.
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Unmittelbar nach dem Abfüllen der Polyäthylenbeutel wurden diese
waagerecht auf vorgekühlte Teller aus rost-0 freiem Stahl gelegt und 5 h bei -25
C in einen Gefrierschrank gestellt. Anschließend wurden die Beutel herausgenommen
und der gefrorene Beutelinhalt mechanisch in kleinere Stücke zerbrochen, die Beutel
zerschnitten und ihr Inhalt nacheinander in 150 1 Trinkwasser hineingeschüttet,
das bei Raumtemperatur in einem Kessel aus rostfreiem Stahl vorgelegt worden war.
Nach dem Einschütten des Inhalts sämtlicher Beutel wurden die gebundenen Zellen
im vorgelegten Wasser 2 h lang in Ruhe belassen. Nach dieser Zeit wurden die aufgetauten
Teilchen der gebundenen Zellen aufgemischt und auf eine mit einem Filtertuch versehene
Saugnutsche (Terylen-Filtertuch) gepumpt, durch Vakuum abgesaugt und danach dreimal
in 120 1 Trinkwasser dekantiert. Nach der letzten Dekantation wurden die Teilchen
nochmals durch Vakuum abgesaugt und im Anschluß daran gewogen.
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18 kg der feuchten Masse der gebundenen Zellen wurden unter Mischen
in 50 1 eines Aceton-Wasser-Gemischs (1:1) suspendiert, das zuvor auf -20 OC abgekühlt
worden war; die Suspension wurde 3 min lang gemischt. Danach wurden die Teilchen
sofort scharf abgesaugt, worauf auf der Nutsche noch 30 min lang Luft durchgesaugt
wurde; danach wurden sie in 50 1 0,05 M Phosphatpuffer nach Sörensen mit pH 7,6
suspendiert, über Nacht bei +8 OC aufquellen gelassen und nach dem Aufquellen wiederum
gut abgenutscht, worauf noch 30 min lang Luft durchgesaugt wurde.
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Die Teilchen wurden anschließend in einem Polyäthylenbehälter aufbewahrt,
gewogen und bei +8 OC und 57 % relativer Feuchte (40 % H2S04) 72 h lang getrocknet.
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Es wurden insgesamt 15,5 kg feuchte Masse der gebundenen Zellen gewonnen,
was einem Trockengewicht von 6,2 kg und einer Ausbeute von 62 %, bezogen auf die
nativen Zellen, entspricht; der Feuchtigkeitsgehalt des gebundenen Zellmaterials
betrug 60 %.
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Die spezifische Penicillinacylaseaktivität der gebundenen Zellen
betrug 7,8 /umol 6-APS/h.mg feuchte Masse, was einer Ausbeute der spezifiscnen Enzymaktivität
von 86,7 %, bezogen auf die nativen Zellen, entspricht.
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2,5 g der feuchten Masse der gebundenen, in 25 ml Wasser suspendierten
Zellen sedimentierten während 3 min quantitativ; diese Menge im angegebenen Volumen
nahm nach der Sedimentitation ein Volumen von 8 ml ein.
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Die Partikelgrößenverteilung lag im Bereich von 150 bis 250 /um (0,15
bis 0,225 mm).
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Das Material bestand aus kleinen, dunkelbraunen Plättchen mit sandartigem
Charakter.
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Die Stabilität des Materials wurde bei der nach dem angegebenen Verfahren
erhaltenen feuchten Teilchenmasse in verschlossenen Polyäthylenflaschen bei +2 bis
+8 OC getestet. Innerhalb von 2 Monaten unter den angegebenen Lagerbedingungen kam
es zu keinerlei Abfall der Enzymaktivität der aus gebundenen Zellen bestehenden
Partikel.
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Die mechanische Abriebfestigkeit wurde 2 Monate lang an einer Suspension
von 20 g der feuchten Masse in 100 ml destilliertem Wasser untersucht; die Suspension
wurde in gläserne Siedekolben von 500 ml Inhalt eingefüllt und mit Aluminiumfolie
abgedeckt; die Kolben wurden bei 30 OC auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 260
U/min geschüttelt. Die spezirische Aktivität der Partikel betrug nach 2 Monaten
ununterbrochenem Schütteln unter den angegebenen Bedingungen 93,8 % der Ausgangsaktivität
bei einem Gesamtrückstand der feuchten Partikelmasse von 16,5 g (82,5 %).
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Die hydrodynamischen Eigenschaften des Materials wurden ebenfalls
untersucht. 50 g der feuchten Masse der gebundenen Zellen wurden in eine gläserne
Säule von 2,6 cm Durchmesser mit Thermostatisiermantel bei 37 OC eingefüllt.
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Durch das Material wurde 0,05 M Phosphatpuffer von pil 7,6 von unten
nach oben mit einer Geschwindigkeit von 1846 ml/h hindurchgepumpt. Das Volumen des
in der Schwebe befindlichen Materials betrug bei dieser Durchflußgeschwindigkeit
220,3 ml, die Höhe des Materials 41,5 cm.
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Bei dieser Anordnung wurden fünf wiederholte Umwandlungen von 0,5
1 einer 6,5%igen Lösung des Kaliumsalzes
von Benzylpenicillin zu
6-APS durch Rückführung des Reaktionsgemischs bei kontinuierlicher Korrektur des
pH-Werts mit verdünntem Ammoniakwasser in einem außerhalb der Säule vorgesehenen
gläsernen Mischgefäß durchgeführt. Der durchschnittliche Umsatz betrug 95,2 % in
2,5 h.
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Beispiel 2 25 kg einer Zellpaste von E. coli wurden wie in Beispiel
1 vernetzt. Nach Beendigung der Reaktion, Verdünnung und Abtrennung der Zellen wurden
die vernetzten Zellen im gleichen Volumen homogenisiert und in einen Mischkessel
aus rostfreiem Stahl eingebracht, in dem die Suspension auf 40 OC temperiert wurde.
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Nach der Temperatureinstellung der Suspension, deren Gesamtvolumen
70 1 betrug, wurden unter kräftigem Rühren 7 1 Butylacetat und 0,5 kg Tensid (Slovafol
910) zugegeben, worauf das Gemisch bei 40 OC 10 h lang gemischt wurde.
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Anschließend wurde die Suspension der vernetzten und permeabilisierten
Zellen mit Trinkwasser auf ein Gesamtvolumen von 500 1 verdünnt und abzentrifugiert
(Sharples-Separatoren). Es wurden insgesamt 20 kg feuchte Zellpaste aus vernetzten
und permeabilisierten Zellen gewonnen.
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Die Paste wurde homogenisiert, in einen Mischkessel aus rostfreiem
Stahl gepumpt, darin auf ein Gesamtvolumen von 100 1 verdünnt und bei 20 OC mit
Polyäthylenimin (Sedipur KA) und Glutardialdehyd in gleichen Konzentrationen wie
in Beispiel 1
versetzt; die Weiterverarbeitung erfolgte ebenfalls
wie in Beispiel 1.
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Es wurden insgesamt 17 kg feuchte Zellmasse in einer Ausbeute von
68 %, bezogen auf das Gewicht der nativen Zellen, erhalten.
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Die spezifische Aktivität der Penicillinacylase betrug 8,0 ,umol
6-APS/h.mg feuchte Masse, was einer Ausbeute an spezifischer Enzymaktivität von
88,9 %, bezogen auf die nativen Zellen, entspricht.
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Die Partikelgröße lag im Bereich von 300 bis 450 /um (o,3 bis 0,45
mm).
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Das Material bestand aus dunkelbraunen bis schwarzen Plättchen mit
sandartigem Charakter.
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Unter den in Beispiel 1 angegebenen Sedimentationsbedingungen sedimentierte
das Material innerhalb 2 min quantitativ.
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Beispiel 3 Vernetzung und Permeabilisation von einzelnen Zellen von
E. coli (25 kg Zellmasse) wurden wie in Beispiel 2 vorgenommen. Es wurden wiederum
20 kg feuchte Zellpaste gewonnen. Die Paste wurde auf gleiche Weise homogenisiert
und in einem Mischkessel aus rostfreiem Stahl bei +20 C auf ein Gesamtvolumen von
100 1 verdünnt.
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Anschließend wurde anstelle des Polyäthylenimins (Sedipur KA) 0,5
kg Hexamethylendiamin sowie danach unter
ansonsten gleichen Bedingungen
Glutardialdehyd in gleicher Konzentration wie in Beispiel 1 zugesetzt. Die Weiterverarbeitung
erfolgte wie in Beispiel 1.
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Es wurden insgesamt 16,8 kg feuchte Masse der gebundenen Zellen in
einer Ausbeute von 67,2 %, bezogen auf das Gewicht der nativen Zellen, erhalten.
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Die spezifische Aktivität der Penicillinacylase betrug 5,4 /umol
6-APS/h.mg feuchte Masse, was einer Ausbeute an spezifischer Enzymaktivität von
60 %, bezogen auf die nativen Zellen, entspricht.
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Die Partikelgröße lag im Bereich von 75 bis 150 um (0,07 bis 0,15
mm).
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Das Material bestand aus unregelmäßigen Plättchen von rotbrauner
Farbe und sandartigem Charakter.
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Guter gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 kam es zu einer quantitativen
Sedimentation des Materials in 4 min.
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Beispiel 4 Die Vernetzung der einzelnen Zellen, ihre Permeabilisation
und Bindung wurde wie in Beispiel 2 vorgenommen mit dem Unterschied, daß anstelle
von Polyäthylenimin (Sedipur KA) Äthylendiamin in einer Menge von 0,75 kg eingesetzt
wurde.
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Es wurden 13,8 kg feuchte Masse der gebundenen Zellen in einer Ausbeute
von 55,2 %, bezogen auf das Gewicht der nativen Zellen, erhalten.
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Die spezifische Aktivität der Penicillinacylase betrug 3,9 umol 6-APS/h.mg
feuchte Masse, was einer Ausbeute an spezifischer Enzymaktivität von 43,3 %, bezogen
auf die nativen Zellen, entspricht.
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Die Größe der Partikel lag im Bereich von 50 bis 150 /um (0,05 bis
0,15 mm).
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Das Material bestand aus braunen, unregelmäßig geformten Plättchen
mit sandartigem Charakter.
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Unter gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 sedimentierte das Material
während 5 min quantitativ.
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Beispiel 5 Die Vernetzung einzelner Zellen und ihre Permeabilisation
wurden nach Beispiel 2 durchgeführt. 20 kg der vernetzten und permeabilisierten
Zeilpaste wurden in 50 1 Wasser homogenisiert und danach in einen Mischkessel aus
rostfreiem Stahl übergepumpt, in dem das Gesamtvolumen bei 20 bis 25 OC auf 100
1 eingestellt wurde; nach Einstellung des pH-Werts auf 7,0 wurden 100 g Polyäthylenimin
(Sedipur KA) zugegeben und eingemischt; anschließend wurde der Mischer abgestellt
und das Reaktionsgemisch 30 min lang ruhig stehengelassen, um eine quantitative
Ausflockung der Zellen zu erzielen.
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Dnach wurde das Reaktionsgemisch langsam gerührt und die ausgeflockte
Suspension mit 4 1 einer 25%igen wäßrigen Lösung von Glutardialdehyd versetzt. Das
Reaktionsgemisch wurde bei 20 OC 2 h langsam gerührt (50 U/min).
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Danach wurde das System durch Zugabe von 400 1 Trinkwasser verdünnt,
worauf die Partikel der gebundenen Zellen abzentrifugiert
wurde
(Sharples-Separator). Die abgetrennten feuchten Partikel wurden zweimal mit Trinkwasser
dekantiert und anschließend wie in Beispiel 1 abgenutscht. Die gut abgesaugten Partikel
der gebundenen Zellen wurden danach in 30 1 reinem Aceton, das auf -25 OC abgekühlt
worden war, suspendiert, wonach die erhaltene Suspension 3 min lang gemischt wurde.
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Die Weiterverarbeitung erfolgte wie in Beispiel 1.
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Es wurden insgesamt 8,9 g feuchte Zellmasse erhalten, was einer Ausbeute
von 35,6 %, bezogen auf das Gewicht der nativen Zellen, entspricht.
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Die spezifische Aktivität der Penicillinacylase betrug 6,1 /umol
6-APS/h.mg feuchte Masse, was einer Ausbeute an spezifischer Enzymaktivität von
67 X, bezogen auf die nativen Zellen, entspricht.
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Die Partikelgröße lag im Bereich von 25 bis 100 /um (0,025 bis 0,1
mm).
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Das Material bestand aus braunen1 unregelmäßig geformten Partikeln.
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Das Material sedimentierte bei der Sedimentation wie in Beispiel
1 innerhalb 6,5 min quantitativ.
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Beispiel 6 Die Vernetzung einzelner Zellen und ihre Permeabilisation
wurden wie in Beispiel 2 durchgeführt. Danach wurde wie in Beispiel 5 verfahren
mit dem Unterschied, daß nach
Zugabe von 100 g Polyäthylenimin
(Sedipur KA), Mischen und Ausflockung der Suspension, Zugabe von Glutardialdehyd
und kurzzeitigem Aufmischen die Reaktion während 3 h ohne Mischen unter ruhigem
Stehenlassen durchgeführt wurde.
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Danach wurde das Reaktionsgemisch vorsichtig gemischt und das Material
sofort wie in Beispiel 5 weiterverarbeitet.
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Es wurden insgesamt 5 kg feuchte Zellmasse in einer Ausbeute von
20 %, bezogen auf das Gewicht der nativen Zellen, erhalten.
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Die spezifische Aktivität der Penicillinacylase betrug 4,5 ,umol
6-APS/h-mg feuchte Masse, was einer Ausbeute an spezifischer Enzymaktivität von
50 %, bezogen auf die nativen Zellen, entspricht.
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Die Partikelgröße lag im Bereich von 25 bis 100 um (0,025 bis 0,1
mm).
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Das Material bestand aus sehr kleinen, braunen Partikeln unregelmäßiger
Form.
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Bei Sedimentation wie in Beispiel 1 sedimentierte das Material innerhalb
10 min quantitativ.