DE2950985A1

DE2950985A1 - Gebundene zellen mit penicillinacylaseaktivitaet, ihre herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE2950985A1
Application number: DE19792950985
Authority: DE
Inventors: Miroslav Dr Barta; Karel Dr Culik; Vladimir Dr Vojtisek; Roman Dr Zeman
Original assignee: Spofa Vereinigte Pharma Werke
Current assignee: Spofa Vereinigte Pharma Werke
Priority date: 1978-12-18
Filing date: 1979-12-18
Publication date: 1980-07-03
Also published as: CS203607B1

Description

Gebundene Zellen mit Penicillinacylaseaktivität,
ihre Herstellung und Verwendung Die Erfindung betrifft gebundene Zellen mit Penicillinacylaseaktivität und ihre Herstellung, die zur biochemischen Hydrolyse nativer Penicilline zu 6-Aminopenicillansäure geeignet sind, die ein außerordentlich wichtiges Zwischenprodukt für die Herstellung einer Reihe halbsynthetischer Penicilline, insbesondere ausgehend von Benzylpenicillin, darstellt.
Bei herkömmlichen Verfahren zur Bindung von Zellen werden verschiedene in Wasser unlösliche organische, anorganische oder natürliche Träger zur Verbesserung der Sedimentations- und dadurch der Separationseigenschaften gebundener Zellenpräparate verwendet.
Nach dem Verfahren der CS-Patentanmeldung PV 2318-77 (vgl. den CS-Urheberschein werden zB zur Bindung der Zellen sphärische Teilchen aus synthetischen Polymeren verwendet, die durch gezielt geführte Polymerisation von Monomeren auf der Basis von Methacrylaldehyd, Glycidylmethacrylat, Hydroxyalkylmethacrylaten udgl hergestellt sind. Diese Polymeren müssen zuvor durch Anküpfung von distalen räumlichen Kupplungsgruppen mit Aminoendgruppen chemisch modifiziert werden; erst danach werden die Zellen auf solchen modifizierten Polymerteilchen mit polyfunktionellen Reagentien fixiert. In ähnlicher Weise beruht das Zellenbindungsverfahren der DE-OS 25 13 929 auf der Reaktion der Zellen mit einem reaktiven Monomer und nachfolgender Polymerisation oder Copolymerisation bzw. der Reaktion mit Polyglyeidylmethacrylat, ggfs in Kombination mit einer kovalenten Fixation des Enzyms im Zellinneren durch ein bifunktionelles Reagens.
Diese oder ähnliche Träger sind mit hohen Gestehungskosten behaftet, so daß ihre technische Anwendung sehr beschränkt ist.
Einen gewissen Fortschritt in der Technologie der Bindung von Zellen mit industrieller Bedeutung stellt das Verfahren des CS-Urheberscheins , (PV 5321-77) dar, das im Prinzip auf der Bindung der aktiven Zellen auf Trägermaterialien aus verschiedenen Mikroorganismenarten beruht. Diese Trägermaterialien sind entweder ganze, unzerstörte Zellen und/oder physikalisch, chemisch oder biochemisch mit polyfunktionellen Reagentien kovalent gebundene Zellen oder ihre unlöslichen Fragmente.
Bei dieser Verfahrensweise zur Bindung von Zellen sind die Gestehungskosten deutlich niedriger, da die als Trägermaterial herangezogenen Zellen Abfallprodukte verschiedener Fermentationsverfahren darstellen, deren Preis zumeist vernachlässigbar niedrig ist oder die sogar ohne Kosten anfallen, wodurch eine höhere Wirtschaftlichkeit erzielt wird. In dem obigen CS-Urheberschein ist auch angegeben, daß die aktiven Zellen aneinander gebunden werden können, also ohne Anwendung eines Trägers.
Bei dieser Verfahrensweise müssen die Zellen auf natürliche Weise oder künstlich autolysiert sein, damit eine Bindung untereinander möglich ist; ferner ist hierbei zu berücksichtigen, daß in dieser Weise behandelte Zellen schlechtere mechanische und Sedimentationseigenschaften sowie infolge ihrer vorhergehenden partiellen Autolyse auch eine geringere spezifische Aktivität besitzen. Dieser Nachteil wird durch ein Verfahren der kovalenten Vernetzung individueller aktiver Zellen mit polyfunktionellen Reagentien vermieden, das sich zur halbkontinuierlichen Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure eignet und im CS-Urheberschein (PV 3679-77) beschrieben ist.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens müssen jedoch zur Abtrennung der gebundenen Zellen bei wiederholter Benutzung groß dimensionierte Zentrifugen verwendet werden, da die gebundenen Zellen sehr klein sind (etwa 1 um), was zu schlechten Sedimentationseigenschaften führt; hierauf beruht ferner auch die Notwendigkeit, dieses Verfahren diskontinuierlich durchzuführen und diskontinuierlich arbeitende Mischreaktoren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure einzusetzen.
Im Rahmen der Erfindung wurde nun festgestellt, daß frische native Zellen von Penicillinacylase produzierenden Mikroorganismen unmittelbar nach ihrer Abtrennung aus der Fermentationsflüssigkeit ohne Anwendung eines Trägers und ohne Notwendigkeit einer von selbst ablaufenden oder künstlichen partiellen Autolyse gebunden werden können.
Die Erfindung gibt ein Verfahren zur Herstellung gebundener Zellen mit Penicillinacylseaktivität unter Verwendung bifunktioneller Aldehyde an, das gekennzeichnet ist durch (a) Vernetzung des Zellinhalts von Penicillinacylase erzeugenden Mikroorganismen mit einem Dialdehyd, (b) Permeabilisation der vernetzten Zellen durch Einwirkung erhöhter Temperatur und/oder eines organischen Lösungsmittels und/oder eines Tensids, (c) Umsetzung des intermediären Zellmaterials in wäßrigem Medium mit einer löslichen Verbindung, die mindestens zwei primäre und/oder sekundäre Aminogruppen aufweist, und dem Dialdehyd, (d) Abtrennung der resultierenden gebundenen Zellenpartikel und mechanische Verfestigung durch Einwirkung von organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, ggfs im Gemisch mit Wasser, bei O bis -30 OC unter gleichzeitiger partieller Dehydratation und (e) Überführung in die enzymatisch aktive Form durch Rehydratation in einem wäßrigen Medium von pH 7 - 8 vor dem Gebrauch, vorzugsweise in einem Phosphatpuffer.
Die erfindungsgemäßen gebundenen Zellen mit Penicillinacylaseaktivität sind demgemäß nach dem obigen Verfahren zugänglich.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden Penicillinacylase enthaltende aktive Zellen mit hoher spezifischer Penicillinacylaseaktivität, sehr guten Sedimentationseigenschaften und vor allem sehr guten hydrodynamischen Eigenschaften erhalten. Die Teilchen der gebundenen Zellen sind fest, kornförmig, erinnern im Aussehen an ein dunkelbraun bis schwarz gefärbtes Harz und besitzen Eigenschaften, die ihre Anwendung zur kontinuierlichen Herstellung von 6-Aminopenicillansäure ermöglichen.
Die wesentlichen Verfahrensschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung gebundener Zellen mit Penicillinacylaseaktivität ohne Anwendung eines Trägers sind: (a) Chemische Umsetzung der aktiven Zellen in wäßriger Suspension mit bifunktionellen Vernetzungsreagentien, wodurch eine kovalente Vernetzung und Verknüpfung des intrazellulären Zellinhalts der individuellen Zellen und dadurch eine Fixierung und Stabilisierung der in den einzelnen Zellen enthaltenen Penicillinacylase sowie eine erhöhte Autolysebeständigkeit der Zellen erzielt wird.
(b) Verdünnung der Zellsuspension nach der obigen Umsetzung mit Wasser, Eindickung in groß dimensionierten Zentrifugen und nachfolgende Permeabilisierung der individuell vernetzten Zellen in wäßriger Suspension durch Temperatureinfluß, durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels und/oder eines Netzmittels, ggfs durch Kombination dieser Verfahrensparameter.
Hierdurch kommt es zu einer Ausschwemmung derjenigen Komponenten an Zelloberflächen und im Zellinneren, die nicht umgesetzt wurden und überwiegend lipophile Eigenschaften aufweisen. Hierdurch werden die Diffusionseigenschaften der vernetzten Zellen verbessert und weitere reaktionsfähige Gruppen auf der Zelloberfläche sowie im Zellinneren freigelegt.
(c) Verdünnung der Suspension der vernetzten und ausgewaschenen Zellen mit Wasser nach ihrer Permeabilisation, Eindickung auf groß dimensionierten Zentrifugen und nachfolgende chemische Umsetzung mit bifunktionellen Vernetzungsreagentien in Gegenwart einer wasserlöslichen Verbindung, die wenigstens zwei primäre und/oder sekundäre Aminogruppen enthält, Unter Abkühlung des Reaktionsgemischs unter den Gefrierpunkt, wodurch es zu einem engen Kontakt der Zellen und nach einer bestimmten Zeit zur Bildung miteinander verbundener, kovalent verknüpfter Zellpartikel kommt. Nach der Bindung der Zellen aneinander wird das gefrorene Material auftauen gelassen und anschließend in Wasser dispergiert, einige Male mit Wasser dekantiert und danach filtriert, beispielsweise durch ein Textilfilter oder andere geeignete Filtermaterialien.
(d) Eintragen des gut abgesaugten feuchten Materials der gefüllten Zellen unter Mischen in vorgekühltes Aceton oder Propanol oder entsprechende Gemische mit Wasser, kurzes leichtes Mischen und anschließendes Absaugen, wodurch es zu einer raschen partiellen Dehydratation der gebundenen Zellen sowie einer mechanischen Verfestigung der Partikel kommt. Das Material wird anschließend in wäßrigem Medium gequollen, nach der Quellung abgesaugt und ggfs bei etwa 60 % relativer Feuchte bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren können gebundene Zellen mit Penicillinacylaseaktivität ohne Verwendung eines Trägers und unter Erzielung einer hohen spezifischen Enzymaktivität erhalten werden. Die spezifische Aktivität beträgt bis 90 % des Wertes der spezifischen Aktivität nativer Zellen. Die hohe Ausbeute der gebundenen enzymatischen Aktivität geträgt bis zu 70 %, bezogen auf das Gewicht der nativen Produktionszellen vor der Bindung.
Die erhaltenen Zellen besitzen ausgezeichnete Sedimentations- und insbesondere hydrodynamische Eigenschaften bei guter Stabilität der Enzymaktivität bei Langzeitverwendung, wobei sich die Partikelgröße in gewissen Grenzen durch die Konzentration der Zellen und die angewandten Reaktionsbedingungen einstellen läßt.
Das erfindungsgemäße Material zeichnet sich auch durch gute Stabilität gegenüber mechanischem Abrieb beim Mischen sowie durch Partikelreibung aus. Das Material eignet sich somit für die wiederholte Verwendung und insbesondere die kontinuierliche Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch saure Hydrolyse von Penicillinen, insbesondere Benzylpenicillin.
Für die enzymatische Hydrolyse unter Verwendung des erfindungsgemäßen Materials kann eine wäßrige Lösung des Natrium- oder Kaliumsalzes des entsprechenden Penicillins, beispielsweise von Benzylpenicillin, verwendet werden, ggfs auch eine rohe Lösung des entsprechenden Penicillins in der Säureform, die bei der Aufarbeitung der fermentierten Nährböden nach Beendigung der Kultivierung anfällt. Die erhaltene 6-Aminopenicillansäure ist rein und frei von Eiweißverunreinigungen; aus ihr hergestellte halbsynthetische Penicilline rufen keine allergischen Reaktionen im lebenden Organismus hervor.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Umsetzung der vernetzten und permeabilisierten Zellen mit der wasserlöslichen, Aminogruppen enthaltenden Verbindung und dem bifunktionellen Aldehyd bei einer Temperatur unter dem Gefrierpunkt des Reaktionsgemischs vorgenommen.
Nach der Entstehung der gebundenen Zellpartikel werden diese gewaschen, dekantiert, abgesaugt und unter Dehydratation mechanisch verfestigt, wobei vorzugsweise Aceton oder Propanol oder ein entsprechendes Gemisch mit Wasser verwendet wird. Nach dem Absaugen wird in wäßrigem Milieu gequollen und danach ggfs abgesaugt und getrocknet, vorzugsweise bei hinreichender Luftfeuchtigkeit.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Reaktionsgemisch anstelle der Abkühlung unter den Gefrierpunkt in Schritt (c) bei Temperaturen über O °C, vorzugsweise bei 15 bis 25 0^ verarbeitet, wobei vorsichtig gemischt und/oder ohne Mischen bzw. Rühren umgesetzt wird.
Als Ausgangsmaterial für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen sich prinzipiell beliebige Mikroorganismen, die Penicillinacylase synthetisieren und bei denen das Enzym im periplasmatischen Raum oder im Zellinneren lokalisiert ist, beispielsweise Mikroorganismen der Gattung Escherichia coli, Alcaligenes faecalis, Proteus rettgeri ua. Dabei ist es erfindungsgemäß vorteilhaft, solche Mutanten von Mikroorganismenstämmen auszunutzen, die durch gezielte genetische Manipulationen gewonnen wurden und hohe Gehalte an Penicillinacylase aufweisen. Die erhaltenen gebundenen Zellen besitzen dann eine entsprechend hohe spezifische Enzymaktivität.
Durch Anwendung anderer Mikroorganismen bzw. Stämme können erfindungsgemäß gebundene Zellaggregate hergestellt werden, die qualitativ wie auch quantitativ unterschiedliche Enzymaktivität aufweisen.
Die Größe der gebundenen Zellpartikel wurde lichtmikroskopisch mit einem kalibrierten Meßokular bei verschiedener Vergrößerung untersucht. Zur Analyse der Partikelgröße wurde ferner auch eine Siebanalyse unter Verwendung von Metallsieben herangezogen; die gebundenen Zellpartikel wurden unter Verwendung von drei Siebsätzen klassiert, deren Maschenweite im Bereich von 0,03 bis 2,0 mm lag.
Die Penicillinacylaseaktivität wurde spektralphotometrisch durch Farbreaktion von p-Dimethylaminobenzaldehyd mit 6-Aminopenicillansäure (6-APS) nach dem Verfahren der CS-PS 116 959 in der Modifizierung nach Balasingham et al. (Biochim. Biophys. Acta 276 (1972) 250) bei 24 OC und pH 7,6 im Bereich der Reaktionskinetik nullter Ordnung bestimmt. Die Anfangskonzentration des Substrats und des Kalium- oder Natriumsalzes des Benzylpenicillins bei der Bestimmung betrug 2 % (G/V). Unter der Einheit der Enzymaktivität wird diejenige Enzymmenge verstanden, die katalytisch die Entstehung von 1 Xumol 6-APS aus Benzylpenicillin oder seinen Salzen in einer Stunde bewirkt.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, die nicht einschränkend sind.
Beispiel 1 Zu 25 kg einer feuchten Zellpaste von Escherichia coli-Zellen (spezifische Aktivität der Penicillinacylase 9,0 /umol 6-APS/h.mg feuchte Zellmasse) wurden 50 1 Trinkwasser zugegeben; anschließend wurde 1 h mit einem Vibrationsmischer gemischt. Die homogene Zellsuspension wurde in einen Mischkessel aus rostfreiem Stahl gepumpt, in dem der pEI-Wert der Suspension mit 2 N NaOEl-Lösung von 5,9 auf 7,0 eingestellt wurde; das Gesamtvolumen der Suspension betrug 75 1.
Nach der pEs-Einstellung wurden unter ununterbrochenem Mischen 3 1 einer 25%igen wäßrigen Glutardialdehydlösung zugegeben, wonach 3 h bei Raumtemperatur gemischt wurde.
Danach wurde das Reaktionsgemisch mit Trinkwasser auf ein Gesamtvolumen von 300 1 verdünnt und abzentrifugiert (Sharples-Separator).
Es wurden 24 kg feuchte Masse einzelner vernetzter Zellen aus dem Produzentenstamm gewonnen.
Zu 24 kg Paste der vernetzten Zellen wurden 45 1 Trinkwasser zugegeben, wonach die Suspension 1 h mit einem Vibrationsmischer homogenisiert wurde; das Suspensionsvolumen betrug 70 1.
Die homogene Suspension der vernetzten Zellen wurde dann in einen Extraktionskessel gepumpt, mit 7 1 Butylacetat versetzt und 3 h bei Raumtemperatur intensiv gemischt.
Anschließend wurde die Suspension unter Mischen mit 33 1 Trinkwasser verdünnt, worauf 2,68 1 einer 25%igen wäßrigen Tensidlösung (Slovafol 909) zugegeben wurden.
Nach Zugabe des Tensids wurde die Suspension 30 min weiter gemischt und danach mit Trinkwasser auf ein Gesamtvolumen von 300 1 verdünnt; anschließend wurden die vernetzten Zellen abzentrifugiert (Sharples-Separator).
Es wurden insgesamt 22 kg vernetzte und teilweise permeabilisierte Zellen in Form einer feuchten Zellpaste gewonnen.
Zu 22 kg dieser Paste wurden 88 1 Trinkwasser zugegeben; die Suspension wurde 1 h mit einem Vibrationsmischer homogenisiert. Nach dieser Zeit wurde die homogene Suspension in einen Mischkessel aus rostfreiem Stahl übergepumpt, darin auf 40 OC erhitzt und bei dieser Temperatur 72 h lang scharf gemischt.
Im Anschluß daran wurde die Suspension der ver-0 netzten und permeabilisierten Zellen auf 20 C abgekühlt und mit Trinkwasser auf ein Gesamtvolumen von 100 1 aufgefüllt; nach Einstellen des pH-Werts der Suspension mit 2 n NaOH-Lösung auf 7,0 wurde unter Mischen 0,5 kg Polyäthylenimin (Sedipur KA) zugesetzt.
Die Suspension wurde noch etwa 15 min weiter gemischt; anschließend wurden 4 1 einer 25%igen wäßrigen Glutardialdehydlösung zugegeben; das gemischte Reaktionsgemisch wurde anschließend sofort in Polyäthylenbeutel zu 750 ml abgefüllt und darin eingeschweißt.
Unmittelbar nach dem Abfüllen der Polyäthylenbeutel wurden diese waagerecht auf vorgekühlte Teller aus rost-0 freiem Stahl gelegt und 5 h bei -25 C in einen Gefrierschrank gestellt. Anschließend wurden die Beutel herausgenommen und der gefrorene Beutelinhalt mechanisch in kleinere Stücke zerbrochen, die Beutel zerschnitten und ihr Inhalt nacheinander in 150 1 Trinkwasser hineingeschüttet, das bei Raumtemperatur in einem Kessel aus rostfreiem Stahl vorgelegt worden war. Nach dem Einschütten des Inhalts sämtlicher Beutel wurden die gebundenen Zellen im vorgelegten Wasser 2 h lang in Ruhe belassen. Nach dieser Zeit wurden die aufgetauten Teilchen der gebundenen Zellen aufgemischt und auf eine mit einem Filtertuch versehene Saugnutsche (Terylen-Filtertuch) gepumpt, durch Vakuum abgesaugt und danach dreimal in 120 1 Trinkwasser dekantiert. Nach der letzten Dekantation wurden die Teilchen nochmals durch Vakuum abgesaugt und im Anschluß daran gewogen.
18 kg der feuchten Masse der gebundenen Zellen wurden unter Mischen in 50 1 eines Aceton-Wasser-Gemischs (1:1) suspendiert, das zuvor auf -20 OC abgekühlt worden war; die Suspension wurde 3 min lang gemischt. Danach wurden die Teilchen sofort scharf abgesaugt, worauf auf der Nutsche noch 30 min lang Luft durchgesaugt wurde; danach wurden sie in 50 1 0,05 M Phosphatpuffer nach Sörensen mit pH 7,6 suspendiert, über Nacht bei +8 OC aufquellen gelassen und nach dem Aufquellen wiederum gut abgenutscht, worauf noch 30 min lang Luft durchgesaugt wurde.
Die Teilchen wurden anschließend in einem Polyäthylenbehälter aufbewahrt, gewogen und bei +8 OC und 57 % relativer Feuchte (40 % H2S04) 72 h lang getrocknet.
Es wurden insgesamt 15,5 kg feuchte Masse der gebundenen Zellen gewonnen, was einem Trockengewicht von 6,2 kg und einer Ausbeute von 62 %, bezogen auf die nativen Zellen, entspricht; der Feuchtigkeitsgehalt des gebundenen Zellmaterials betrug 60 %.
Die spezifische Penicillinacylaseaktivität der gebundenen Zellen betrug 7,8 /umol 6-APS/h.mg feuchte Masse, was einer Ausbeute der spezifiscnen Enzymaktivität von 86,7 %, bezogen auf die nativen Zellen, entspricht.
2,5 g der feuchten Masse der gebundenen, in 25 ml Wasser suspendierten Zellen sedimentierten während 3 min quantitativ; diese Menge im angegebenen Volumen nahm nach der Sedimentitation ein Volumen von 8 ml ein.
Die Partikelgrößenverteilung lag im Bereich von 150 bis 250 /um (0,15 bis 0,225 mm).
Das Material bestand aus kleinen, dunkelbraunen Plättchen mit sandartigem Charakter.
Die Stabilität des Materials wurde bei der nach dem angegebenen Verfahren erhaltenen feuchten Teilchenmasse in verschlossenen Polyäthylenflaschen bei +2 bis +8 OC getestet. Innerhalb von 2 Monaten unter den angegebenen Lagerbedingungen kam es zu keinerlei Abfall der Enzymaktivität der aus gebundenen Zellen bestehenden Partikel.
Die mechanische Abriebfestigkeit wurde 2 Monate lang an einer Suspension von 20 g der feuchten Masse in 100 ml destilliertem Wasser untersucht; die Suspension wurde in gläserne Siedekolben von 500 ml Inhalt eingefüllt und mit Aluminiumfolie abgedeckt; die Kolben wurden bei 30 OC auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 260 U/min geschüttelt. Die spezirische Aktivität der Partikel betrug nach 2 Monaten ununterbrochenem Schütteln unter den angegebenen Bedingungen 93,8 % der Ausgangsaktivität bei einem Gesamtrückstand der feuchten Partikelmasse von 16,5 g (82,5 %).
Die hydrodynamischen Eigenschaften des Materials wurden ebenfalls untersucht. 50 g der feuchten Masse der gebundenen Zellen wurden in eine gläserne Säule von 2,6 cm Durchmesser mit Thermostatisiermantel bei 37 OC eingefüllt.
Durch das Material wurde 0,05 M Phosphatpuffer von pil 7,6 von unten nach oben mit einer Geschwindigkeit von 1846 ml/h hindurchgepumpt. Das Volumen des in der Schwebe befindlichen Materials betrug bei dieser Durchflußgeschwindigkeit 220,3 ml, die Höhe des Materials 41,5 cm.
Bei dieser Anordnung wurden fünf wiederholte Umwandlungen von 0,5 1 einer 6,5%igen Lösung des Kaliumsalzes von Benzylpenicillin zu 6-APS durch Rückführung des Reaktionsgemischs bei kontinuierlicher Korrektur des pH-Werts mit verdünntem Ammoniakwasser in einem außerhalb der Säule vorgesehenen gläsernen Mischgefäß durchgeführt. Der durchschnittliche Umsatz betrug 95,2 % in 2,5 h.
Beispiel 2 25 kg einer Zellpaste von E. coli wurden wie in Beispiel 1 vernetzt. Nach Beendigung der Reaktion, Verdünnung und Abtrennung der Zellen wurden die vernetzten Zellen im gleichen Volumen homogenisiert und in einen Mischkessel aus rostfreiem Stahl eingebracht, in dem die Suspension auf 40 OC temperiert wurde.
Nach der Temperatureinstellung der Suspension, deren Gesamtvolumen 70 1 betrug, wurden unter kräftigem Rühren 7 1 Butylacetat und 0,5 kg Tensid (Slovafol 910) zugegeben, worauf das Gemisch bei 40 OC 10 h lang gemischt wurde.
Anschließend wurde die Suspension der vernetzten und permeabilisierten Zellen mit Trinkwasser auf ein Gesamtvolumen von 500 1 verdünnt und abzentrifugiert (Sharples-Separatoren). Es wurden insgesamt 20 kg feuchte Zellpaste aus vernetzten und permeabilisierten Zellen gewonnen.
Die Paste wurde homogenisiert, in einen Mischkessel aus rostfreiem Stahl gepumpt, darin auf ein Gesamtvolumen von 100 1 verdünnt und bei 20 OC mit Polyäthylenimin (Sedipur KA) und Glutardialdehyd in gleichen Konzentrationen wie in Beispiel 1 versetzt; die Weiterverarbeitung erfolgte ebenfalls wie in Beispiel 1.
Es wurden insgesamt 17 kg feuchte Zellmasse in einer Ausbeute von 68 %, bezogen auf das Gewicht der nativen Zellen, erhalten.
Die spezifische Aktivität der Penicillinacylase betrug 8,0 ,umol 6-APS/h.mg feuchte Masse, was einer Ausbeute an spezifischer Enzymaktivität von 88,9 %, bezogen auf die nativen Zellen, entspricht.
Die Partikelgröße lag im Bereich von 300 bis 450 /um (o,3 bis 0,45 mm).
Das Material bestand aus dunkelbraunen bis schwarzen Plättchen mit sandartigem Charakter.
Unter den in Beispiel 1 angegebenen Sedimentationsbedingungen sedimentierte das Material innerhalb 2 min quantitativ.
Beispiel 3 Vernetzung und Permeabilisation von einzelnen Zellen von E. coli (25 kg Zellmasse) wurden wie in Beispiel 2 vorgenommen. Es wurden wiederum 20 kg feuchte Zellpaste gewonnen. Die Paste wurde auf gleiche Weise homogenisiert und in einem Mischkessel aus rostfreiem Stahl bei +20 C auf ein Gesamtvolumen von 100 1 verdünnt.
Anschließend wurde anstelle des Polyäthylenimins (Sedipur KA) 0,5 kg Hexamethylendiamin sowie danach unter ansonsten gleichen Bedingungen Glutardialdehyd in gleicher Konzentration wie in Beispiel 1 zugesetzt. Die Weiterverarbeitung erfolgte wie in Beispiel 1.
Es wurden insgesamt 16,8 kg feuchte Masse der gebundenen Zellen in einer Ausbeute von 67,2 %, bezogen auf das Gewicht der nativen Zellen, erhalten.
Die spezifische Aktivität der Penicillinacylase betrug 5,4 /umol 6-APS/h.mg feuchte Masse, was einer Ausbeute an spezifischer Enzymaktivität von 60 %, bezogen auf die nativen Zellen, entspricht.
Die Partikelgröße lag im Bereich von 75 bis 150 um (0,07 bis 0,15 mm).
Das Material bestand aus unregelmäßigen Plättchen von rotbrauner Farbe und sandartigem Charakter.
Guter gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 kam es zu einer quantitativen Sedimentation des Materials in 4 min.
Beispiel 4 Die Vernetzung der einzelnen Zellen, ihre Permeabilisation und Bindung wurde wie in Beispiel 2 vorgenommen mit dem Unterschied, daß anstelle von Polyäthylenimin (Sedipur KA) Äthylendiamin in einer Menge von 0,75 kg eingesetzt wurde.
Es wurden 13,8 kg feuchte Masse der gebundenen Zellen in einer Ausbeute von 55,2 %, bezogen auf das Gewicht der nativen Zellen, erhalten.
Die spezifische Aktivität der Penicillinacylase betrug 3,9 umol 6-APS/h.mg feuchte Masse, was einer Ausbeute an spezifischer Enzymaktivität von 43,3 %, bezogen auf die nativen Zellen, entspricht.
Die Größe der Partikel lag im Bereich von 50 bis 150 /um (0,05 bis 0,15 mm).
Das Material bestand aus braunen, unregelmäßig geformten Plättchen mit sandartigem Charakter.
Unter gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 sedimentierte das Material während 5 min quantitativ.
Beispiel 5 Die Vernetzung einzelner Zellen und ihre Permeabilisation wurden nach Beispiel 2 durchgeführt. 20 kg der vernetzten und permeabilisierten Zeilpaste wurden in 50 1 Wasser homogenisiert und danach in einen Mischkessel aus rostfreiem Stahl übergepumpt, in dem das Gesamtvolumen bei 20 bis 25 OC auf 100 1 eingestellt wurde; nach Einstellung des pH-Werts auf 7,0 wurden 100 g Polyäthylenimin (Sedipur KA) zugegeben und eingemischt; anschließend wurde der Mischer abgestellt und das Reaktionsgemisch 30 min lang ruhig stehengelassen, um eine quantitative Ausflockung der Zellen zu erzielen.
Dnach wurde das Reaktionsgemisch langsam gerührt und die ausgeflockte Suspension mit 4 1 einer 25%igen wäßrigen Lösung von Glutardialdehyd versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 20 OC 2 h langsam gerührt (50 U/min).
Danach wurde das System durch Zugabe von 400 1 Trinkwasser verdünnt, worauf die Partikel der gebundenen Zellen abzentrifugiert wurde (Sharples-Separator). Die abgetrennten feuchten Partikel wurden zweimal mit Trinkwasser dekantiert und anschließend wie in Beispiel 1 abgenutscht. Die gut abgesaugten Partikel der gebundenen Zellen wurden danach in 30 1 reinem Aceton, das auf -25 OC abgekühlt worden war, suspendiert, wonach die erhaltene Suspension 3 min lang gemischt wurde.
Die Weiterverarbeitung erfolgte wie in Beispiel 1.
Es wurden insgesamt 8,9 g feuchte Zellmasse erhalten, was einer Ausbeute von 35,6 %, bezogen auf das Gewicht der nativen Zellen, entspricht.
Die spezifische Aktivität der Penicillinacylase betrug 6,1 /umol 6-APS/h.mg feuchte Masse, was einer Ausbeute an spezifischer Enzymaktivität von 67 X, bezogen auf die nativen Zellen, entspricht.
Die Partikelgröße lag im Bereich von 25 bis 100 /um (0,025 bis 0,1 mm).
Das Material bestand aus braunen1 unregelmäßig geformten Partikeln.
Das Material sedimentierte bei der Sedimentation wie in Beispiel 1 innerhalb 6,5 min quantitativ.
Beispiel 6 Die Vernetzung einzelner Zellen und ihre Permeabilisation wurden wie in Beispiel 2 durchgeführt. Danach wurde wie in Beispiel 5 verfahren mit dem Unterschied, daß nach Zugabe von 100 g Polyäthylenimin (Sedipur KA), Mischen und Ausflockung der Suspension, Zugabe von Glutardialdehyd und kurzzeitigem Aufmischen die Reaktion während 3 h ohne Mischen unter ruhigem Stehenlassen durchgeführt wurde.
Danach wurde das Reaktionsgemisch vorsichtig gemischt und das Material sofort wie in Beispiel 5 weiterverarbeitet.
Es wurden insgesamt 5 kg feuchte Zellmasse in einer Ausbeute von 20 %, bezogen auf das Gewicht der nativen Zellen, erhalten.
Die spezifische Aktivität der Penicillinacylase betrug 4,5 ,umol 6-APS/h-mg feuchte Masse, was einer Ausbeute an spezifischer Enzymaktivität von 50 %, bezogen auf die nativen Zellen, entspricht.
Die Partikelgröße lag im Bereich von 25 bis 100 um (0,025 bis 0,1 mm).
Das Material bestand aus sehr kleinen, braunen Partikeln unregelmäßiger Form.
Bei Sedimentation wie in Beispiel 1 sedimentierte das Material innerhalb 10 min quantitativ.

Claims

Ansprüche 1. Gebundene Zellen mit Penicillinacylaseaktivität, erhältlich durch (a) Vernetzung des Zellinhalts von Penicillinacylase erzeugenden Mikroorganismen mit einem Dialdehyd, (b) Permeabilisation der vernetzten Zellen durch Einwirkung erhöhter Temperatur und/oder eines organischen Lösungsmittels und/oder eines Tensids, (c) Umsetzung des intermediären Zellmaterials in wäßrigem Medium mit einer wasserlöslichen Verbindung, die mindestens zwei primäre und/oder sekundäre Aminogruppen aufweist, und dem Dialdehyd, (d) Abtrennung der resultierenden gebundenen Zellenpartikel und mechanische Verfestigung durch Einwirkung von organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, ggfsim Gemisch mit Wasser, bei O bis -30 OC unter gleichzeitiger partieller Dehydratation und (e) Uberführung in die enzymatisch aktive Form durch Rehydratation in einem wäßrigen Medium von pH 7 - 8.
2. Gebundene Zellen mit Penicillinacylaseaktivität nach Anspruch 1, erhältlich unter Verwendung von Glutardialdehyd in Schritt (a).
3. Gebundene Zellen nach Anspruch 1 oder 2, erhältlich unter Verwendung von Aceton oder Propanol bzw deren Gemischen mit Wasser in Schritt (d0.
4. Gebundene Zellen mit Penicillinacylaseaktivität nach einem der Ansprüche 1 bis 3, erhältlich unter Umsetzung des intermediären Zellmaterials in Schritt (c) bei einer Temperatur unter dem Schmelzpunkt des Reaktionsgemischs.
5. Gebundene Zellen mit Penicillinacylaseaktivität nach einem der Ansprüche 1 bis 4, erhältlich unter Anwendung einer Temperatur von 15 bis 25 OC in Schritt (c).
6. Verfahren zur Herstellung der gebundenen Zellen mit Penicillinacylaseaktivität nach einem der Ansprüche 1 bis 5 unter Verwendung bifunktioneller Aldehyde, gekennzeichnet durch (a) Vernetzung des Zellinhalts von Penicillinacylase erzeugenden Mikroorganismen mit einem Dialdehyd, (b) Permeabilisation der vernetzten Zellen durch Einwirkung erhöhter Temperatur und/oder eines organischen Lösungsmittels und/oder eines Tensids, (c) Umsetzung des intermediären Zellmaterials in wäßrigem Medium mit einer wasserlöslichen Verbindung, die mindestens zwei primäre und/oder sekundäre Aminogruppen aufweist, und dem Dialdehyd, (d) Abtrennung der resultierenden gebundenen Zellenpartikel und mechanische Verfestigung durch Einwirkung von organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln, ggfsim Gemisch mit Wasser, bei o bis -30 OC unter gleichzeitiger partieller Dehydratation und (e) Überführung in die enzymatisch aktive Form durch Rehydratation in einem wäßrigen Medium von pH 7 - 8 vor dem Gebrauch.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (a) Glutardialdehyd verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (d) als Lösungsmittel Aceton oder Propanol, ggf im Gemisch mit Wasser, verwendet wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in Schritt (c) bei einer Temperatur unter dem Schmelzpunkt des Reaktionsgemischs vorgenommen wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in Schritt (c) bei 15 bis 25 OC durchgeführt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung ohne Rühren oder unter Rühren mit 40 bis 60 U/min durchgeführt wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 11, aadurch gekennzeichnet, daß die Rehydratation in Schritt (e) in einem Phosphatpuffer vorgenommen wird.
13. Verwendung der gebundenen Zellen mit Penicillinacylaseaktivität nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur biochemischen Hydrolyse nativer Penicilline zu 6-.sminopenicillansäure.