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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft das Binden von Polysacchariden und betrifft ein
an Cellulose bindendes Polysaccharidkonjugat, Produkte, die das
Polysaccharidkonjugat einschließen
und Zielverfahren, unter Verwendung des Polysaccharidkonjugats.
Im Zusammenhang der Erfindung ist der Begriff „Polysaccharid" vorgesehen, Polysaccharide
und Oligosaccharide abzudecken und Hinweise auf „Polysaccharid" und „Polysaccharidkonjugat" sollten entsprechend
aufgefasst werden. Der verwendete Begriff „Konjugat" betrifft Einheiten, gebunden oder befestigt
aneinander (physikalisch und/oder chemisch) mit einem „Polysaccharidkonjugat", umfassend eine Polysaccharid-gebundene
oder aneinander befestigte Einheit.
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Hintergrund der Erfindung
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Es
ist bekannt, dass verschiedene natürlich vorkommende Polysaccharide,
wie Erbsenxyloglucan, Tamarindensamenxyloglucan, usw., durch Polysaccharid:Polysaccharid-Wechselwirkung
an Cellulose binden; tatsächlich
ist diese Bindungsfähigkeit
für die
Funktion von Pflanzenzellwänden
wichtig.
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US-A-3297604
betrifft Polymerzusammensetzungen, die Galactose, oxidiert unter
Bildung einer Carbonylgruppe an der C6-Position,
enthalten. Die aktive Carbonylgruppe kann in bekannter Weise, z.B.
unter Bildung von Cyanhydrinen, Bisulfitadditionsverbindungen, Oximen,
Hydrazonen, usw., reagieren. Die Zusammensetzungen können auch
wirken, um Polymere, einschließlich
Cellulose, zu vernetzen. Das Polymer kann beispielsweise Guar-,
Johannisbrotbaumgummi, usw., sein. Es gibt keine Offenbarung eines
Polysaccharidkonjugats mit gebundener Einheit von einem Molekulargewicht
von mindestens 5 000. Ob wohl die Polymerzusammensetzung selbst an
Cellulose binden kann, ist dies nicht unerwartet, und es gibt keine
Offenbarung eines Polysaccharidkonjugats, das an Cellulose binden
kann.
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US-A-2949397
betrifft die Verwendung von Mineralfüllstoff, beschichtet mindestens
teilweise mit in Wasser dispergiertem, organischem Kolloid, um die
Retention von Füllstoff
an Cellulosefasern bei der Papierherstellung zu fördern. Das
Kolloid kann z.B. ein Galactomannan oder substituiertes Mannan,
wie Johannisbrotbaumgummi und Guargummi, sein. Der beschichtete
Füllstoff
wird durch elektrostatische Wirkung an Cellulosefasern angezogen.
Der Füllstoff
und Kolloid werden miteinander vermischt, trennen sich jedoch beim Stehen,
und folglich liegen sie in Form eines einfachen Gemisches, nicht
eines Polysaccharidkonjugats, vor.
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Der
Artikel von Hayashi et al. mit dem Titel „Pea Xyloglucan and Cellulose" in Plant. Physiol.
(1987) 83, 384–389,
beschreibt Untersuchungen zum Binden von Erbsenxyloglucan an Cellulose,
unter Verwendung von Fluorescein-markiertem Xyloglucan, hergestellt
durch Behandeln von Xyloglucan mit CNBr und Inkubieren mit Fluoresceinamin,
und auch unter Verwendung von radiojodiertem Xyloglucan, das durch
Reaktion von 125I mit der Fluoresceineinheit
an Xyloglucan hergestellt wurde. Diese Markierungen wurden verwendet,
um das Binden des Polysaccharids zu verfolgen und sind unter den
kleinsten Molekülmarkierungseinheiten
bekannt.
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Die
vorliegende Erfindung basiert auf dem überraschenden Befund, dass
Polysaccharide mit viel größeren gebundenen
Einheiten als jene, verwendet von Hayashi et al., dennoch schnell
mit hoher Wirksamkeit an Cellulose durch Polysaccharid:Polysaccharid-Wechselwirkung
binden können.
Dies ist überraschend,
weil das Binden an vielen Stellen entlang der Polysaccharidgerüste stattfindet,
anstatt an einer einzelnen Bindungsstelle, wie mit Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen,
und es wäre
vorauszusehen, dass das Binden durch das Anbringen von großen Einheiten
an Cellulosebindungs-Poly saccharide unterbrochen würde. Die
Erfindung eröffnet
somit die Möglichkeit
der Anwendung von Polysacchariden zur zielgerichteten Befestigung von
Einheiten an Cellulose, z.B. in Textil, Papier, usw..
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Kurzdarstellung der Erfindung
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In
einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Polysaccharidkonjugat
bereitgestellt, umfassend ein Polysaccharid mit einer gebundenen
Einheit mit einem Molekulargewicht von mindestens 5000, wobei das Polysaccharidkonjugat
in der Lage ist, an Cellulose zu binden und die gebundene Einheit
ein Enzym, ein Antikörper
oder Antikörperfragment
darstellt, wobei das Polysaccharid eine 1-4-gebundene β-Glycan-Gerüststruktur
hat und wobei das Polysaccharid ausgewählt ist aus Xyloglucanen und
Galactomannanen.
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Das
Polysaccharidkonjugat ist vorzugsweise zum Binden an Cellulose durch
Polysaccharid:Polysaccharid-Wechselwirkung in der Lage.
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Das
Polysaccharid kann jenes sein, das natürlich an Cellulose bindet oder
derivatisiert wurde oder anderweitig modifiziert wurde, um an Cellulose
zu binden. Das Polysaccharid kann in natürlicher Weise vorkommen oder
synthetisch sein.
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Das
Polysaccharid hat eine 1-4-gebundene β-Glycan-(im Allgemeinen Zucker)-Gerüststruktur,
die stereochemisch mit Cellulose kompatibel ist, wie ein Glucangerüst (bestehend
aus β-1-4-gebundenen
Glucoseresten), ein Mannangerüst
(bestehend aus β-1-4-gebundenen
Mannoseresten) oder ein Xylangerüst
(bestehend aus β-1-4-gebundenen
Xyloseresten). Geeignete Polysaccharide sind Xyloglucane, Galactomannane. Siehe „Physiology
and Biochemistry of Plant Cell Walls" (1990) von C. Brett und K. Waldron
für eine
Erörterung dieser
Materialien.
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Die
für Celluloseoligomere
zum Binden an Cellulose erforderliche minimale Kettenlänge ist
4 Glucoseeinheiten. Für
Xyloglucane machen die Seitenketten das Binden weniger wirksam und
12 Gerüstglucoseeinheiten
(d.h. etwa 25 Gesamtzuckereinheiten) sind zum Binden an Cellulose
erforderlich. Strukturbetrachtungen, die Galactomannane vorschlagen,
liegen bei der Bindungswirksamkeit dazwischen, und etwa 6 bis 8
Gerüstreste
werden zum Binden an Cellulose als erforderlich erwartet. Das Polysaccharid
sollte somit mindestens 4 und vorzugsweise mindestens 10 Gerüstreste
aufweisen, die vorzugsweise β-1-9-gebunden
sind.
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Natürliche vorkommende
Polysaccharide, die schnell und stark an Cellulose durch Polysaccharid:Polysaccharid-Wechselwirkung binden,
umfassen Xyloglucane, wie Erbsenxyloglucan und Tamarindensamenxyloglucan
(TXG) (das ein β-1-9-gebundenes Glucangerüst mit Seitenketten
von α-D-Xylopyranose
und -D-Galactopyranosyl-(1-2)-α-D-xylopyranose
aufweist, beide 1-6-gebunden an das Gerüst: siehe Gidley et al. Carbohydrate
Research, 214 (1991) 200–314,
für eine
Erörterung
der Struktur von Tamarindensamenpolysaccharid); und Galactomannane,
insbesondere Galactomannane mit niedrigem Galactosegehalt, wie Johannisbrotbaumgummi
(LBG) (welches ein Mannangerüst
von β-1-4-gebundenen
Mannoseresten mit Einzeleinheit-Galactoseseitenketten,
1-6-gebunden an das Gerüst,
aufweist), Enzym-modifiziertes Guar (EMG) (Guargummi hat die gleichen
Struktureinheiten wie LBG, hat jedoch einen viel höheren Anteil
an Galactosesubstitution, in einem solchen Ausmaß, dass es dort hindurch kein
ausreichend zugängliches
Mannangerüst
gibt, um Cellulose zu binden. EMG wird durch enzymatische Entfernung
eines steuerbaren Prozentsatzes der Galactosereste aus Guargummi
zur Erzeugung einer Vielzahl an Materialien, die an Cellulose binden
können,
jedoch kostengünstiger
und konsistenter erhältlich
sind als LBG, hergestellt. (Siehe Bulpin et al. in Carbohydrate
Polymers 12 (1990) 155–168
für eine
Erörterung
von EMG), Taragalactomannan und Cassiagalactomannan. Diese Materialien
sind kommerziell erhältlich
und liefern somit potenziell nutzbare Quellen von geeigneten Polysacchariden.
Diese Materialien haben die Vorteile, relativ billig zu sein und
werden bereits für
die Verwendung in Lebensmitteln akzeptiert.
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Das
Polysaccharid hat wünschenswerterweise
Seitenkettengalactosereste, die gegen Oxidation durch Galactoseoxidase
anfällig
sind, zur Herstellung einer Aldehydgruppe zum Kuppeln einer Proteineinheit,
wie nachstehend erläutert
wird. TXG, LBG und EMG haben solche Galactosereste.
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Die
gebundene Einheit kann ausgewählt
sein aus einem breiten Bereich von Einheiten, die im Allgemeinen
eine verwendbare Wirkung, in Annäherung
an Cellulose, ausführen;
beispielsweise in Textil, Papier, usw., und ist ein Enzym, Antikörper oder
Antikörperfragment.
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Das
Enzym ist geeigneterweise eine Oxidase, Peroxidase, Katalase oder
Urease. Diese Enzyme wirken, indem ihr Substrat durch sie hindurch
diffundiert und erzeugen einen Fluss von aktivem Produkt von Molekülen, die
hinweg diffundieren. Redoxenzyme, beispielsweise Oxidasen, wie Glucoseoxidase,
erzeugen Wasserstoffperoxid, das als ein Bleichmittel wirken kann.
Peroxidase katalysiert die Oxidation von einer Vielzahl von Substraten
durch Wasserstoffperoxid. Urease katalysiert die Hydrolyse von Harnstoff,
unter Freisetzen eines Flusses von Ammoniumionen, die den örtlichen
pH-Wert erhöhen.
Katalase ist eine Oxidoreduktase, die die Umwandlung von Wasserstoffperoxid
zu Wasser und Sauerstoff katalysiert.
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Antikörper oder
Antikörperfragmente
können
beispielsweise bei Trenn- oder Reinigungstechniken, wie nachstehend
beschrieben, oder in Immunoassays verwendet werden.
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Die
Einheit kann an das Polysaccharid durch eine Vielzahl von physikalischen
oder chemischen Mitteln gebunden werden. Beispielsweise werden Proteine
zweckmäßigerweise
chemisch an Polysaccharide mit Galactoseseitenketten durch enzymatisches
Oxidieren der Galactose, beispielsweise unter Verwendung von Galactoseoxidase,
gebunden, unter Erzeugung einer Aldehydgruppe, an die eine Aminogruppe
eines Proteins chemisch gebunden sein kann. Wie vorstehend angemerkt,
haben TXG, LBG und EMG geeignete Galactoseseitenketten. Für Poly saccharide
ohne geeignete Galactoseseitenketten können verschiedene Verfahren
des chemischen Bindens von Proteinen verwendet werden. Alternative
Techniken schließen
begrenzte Perjodatoxidation, die erfordert, dass das Polysaccharid
zwei benachbarte Hydroxylgruppen in cis-Orientierung aufweist, ein
und zur Erzeugung von Aldehydgruppen führt, die reduktiv aminiert
werden können.
Eine weitere Möglichkeit
ist die Reaktion von Bromcyan (CNBr), was in Zuckerringe bei vicinalen
Diolen eingeschoben wird; sowohl in das Gerüst als auch in die Seitenketten,
unter Bereitstellung einer Isoharnstoffbindung an die Aminogruppen
von Proteinen. Es ist bevorzugt, chemische Techniken zu verwenden,
die nicht die Polysaccharidgerüstlänge beeinflussen,
was die Cellulosebindungsfähigkeit
des Polysaccharids vermindern würde.
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Weil
das Polysaccharidkonjugat an Cellulose bindet, welche in Baumwolle
und anderen Textilien, Papier, usw., vorliegt, bringt das Binden
des Konjugats an Cellulose die gebundene Einheit in enge Nachbarschaft zu
einer Oberfläche
aus oder enthaltend Cellulose. Die Erfindung ermöglicht somit Zielen von gebundenen Einheiten
auf solche Oberflächen.
Diese Zielfunktion ist in einer Vielzahl verschiedener potenzieller
Anwendungen von Nutzen, einschließlich der nachstehenden:
- 1. Zielen von Enzymen zum Binden an Textil,
beispielsweise löslich
oxidierende Enzyme, wie Glucoseoxidase. Solche Enzyme wirken unter
Freisetzen von Wasserstoffperoxid, welches als ein Bleichmittel
wirken kann und somit einen Textil reinigenden Effekt aufweist oder
zum Blockieren von Farbstoffübertragung
während
des Waschens zum Verhindern von Abfärben oder Vergrauung. Polysaccharidoxidasekonjugate
finden somit Verwendung bei der Behandlung von neuer Bekleidung,
insbesondere Baumwolle enthaltender Kleidung, und als ein Bestandteil
von Wäschereiprodukten,
wie Textil-Waschen, und Konditionierungsprodukten.
- 2. Zielen von Enzymen, Antikörpern,
usw., um an Papier zu binden, beispielsweise unter Erzeugung von Bleichen
oder Färben
des Papiers.
- 3. Immobilisieren von Antikörpern,
Enzymen oder Antikörperfragmenten
an eine Cellulose-enthaltende Oberflächen, z.B. Celluloseteilchen
oder Papier, beispielsweise zur Verwendung in diagnostischen Tests oder
Immunoabsorbentsystemen.
- 4. Bei Trennungs- oder Reinigungstechniken, die den Durchgang
von Polysaccharidkonjugat durch ein Cellulosebett beinhalten, unter
Entfernung des Konjugats. Beispielsweise durch Verwendung eines
geeigneten Antikörper-Polysaccharid-Konjugats kann Antigen
an das Konjugat gebunden werden und dann entfernt werden, beispielsweise
aus der Lösung,
durch Binden des Konjugats (und an gebundenes Antigen) an Cellulose,
beispielsweise in einem Cellulosebett.
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Ein
weiterer Vorteil der Erfindung erwächst aus der Tatsache, dass
im Gegensatz zu den meisten anderen Zielmolekülen Cellulose-bindende Polysaccharide
besonders robust sind. Proteine, wie eine Cellulose-bindende Domäne, können durch
Wärme oder
aggressive Tenside inaktiviert werden (denaturiert), während Polysaccharide,
wie LBG, TXG, usw., durch solche Behandlungen vollständig unbeeinflusst
bleiben. Die erfindungsgemäßen Polysaccharidkonjugate
eröffnen
somit den großen
Vorteil von zusätzlicher
Stabilität
und Produktkompatibilität,
verglichen mit anderen Zielmolekülen.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Produkt
unter Einbezug eines Polysaccharidkonjugats gemäß der Erfindung bereit. Das
Produkt ist zweckmäßigerweise
ein Wäschereiprodukt,
wie ein Textilwaschprodukt, beispielsweise ein Waschmittelprodukt
oder ein Textil konditionierendes Produkt. In diesem Fall kann die
gebundene Einheit ein Enzym sein.
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Die
Erfindung findet auch Anwendung bei Körperpflegeprodukten. Andere
Anwendungen schließen zum
Beispiel diagnostische Testsysteme, Papierprodukte, usw., ein.
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Das
Produkt kann ansonsten von im Allgemeinen üblicher Formulierung sein,
wie sie dem Fachmann gut bekannt sein wird. Für eine Erörterung von bekannten Waschmittelzusammen setzungen
siehe beispielsweise WO-A-95/34628, insbesondere Seiten 11 bis 15.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum gezielten Binden
an eine Einheit von Cellulose durch die Verwendung eines Polysaccharidkonjugats
gemäß der Erfindung
bereit.
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Die
Erfindung wird weiterhin zur Erläuterung
in den nachstehenden Beispielen beschrieben.
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BEISPIEL 1: Konjugation
von Johannisbrotbaumgummi mit Glucoseoxidase.
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MATERIALIEN UND VERFAHREN
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Reinigung von Johannisbrotbaumgummi
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Johannisbrotbaumgummi
(LBG) (bezogen von Meyhall) wurde gemäß dem nachstehenden Verfahren gereinigt.
Eine 1%ige (Gewicht/Volumen) wässrige
LBG-Lösung
wurde durch Auflösen
von 15 g LBG in 1500 ml Wasser bei 80–90°C für 30 Minuten, unter mechanischem
Rühren
in einem Silverson-Homogenisator, hergestellt. Die erhaltene Lösung wurde
bei 27 000 G (Sorval RCSC, 6 × 250
ml Lösungen,
GSA Rotor) 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und
die verbleibenden Pellets wurden in 500 ml desionisiertem Wasser
gelöst,
wiederum bei 80–90°C für 30 Minuten,
mit Hilfe des Silverson-Rührers. Diese
Lösung
wurde wie vorstehend weiter zentrifugiert. Die erhaltenen vereinigten Überstände wurden
dann in Isopropanol (1:2, Überstand:Isopropanol)
bei Umgebungstemperatur ausgefällt.
Der zähflüssige Niederschlag
wurde in Isopropanol weiter gewaschen, in Aceton für eine Stunde
stehen lassen und dann zweimal mit frischem Aceton gewaschen. Dieses
gereinigte LBG wurde an der Luft und dann in einem Vakuumofen bei
45°C getrocknet.
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Oxidation von Johannisbrotbaumgummi
mit Hilfe von Galactoseoxidase
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Gereinigtes
LBG wurde mit 0,1% (Gewicht/Volumen) in 0,1M Natriumphosphat (pH
7,0) durch Erhitzen auf 80–90°C und periodischem
Rühren
mit einem Ultra-Turrax-Homogenisator gelöst. Galactoseoxidase (Sigma,
G7907) wurde in Natriumphosphat, pH 7,0, zu einer Konzentration
von 50 μg/ml
gelöst.
Eine aliquote Menge dieser Lösung
von 400 μl
wurde zu 1,2 ml LBG-Lösung
(0,1% Gewicht/Volumen) gegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei
37°C 5–16 Stunden,
in Abhängigkeit
von dem einzelnen Versuch, inkubiert.
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Konjugation von Glucoseoxidase
(GOX) zu oxidiertem LBG
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Glucoseoxidase
(Sigma-Produkt Nr. 7141, 12,5 mg) wurde in ein Röhrchen eingewogen und 0,5 ml oxidierte
LBG/Galactoseoxidaselösung
wurden zugegeben. Das Gemisch wurde leicht angeklopft zum Auflösen von
Glucoseoxidase, dann für
2 Stunden bei Umgebungstemperatur gelagert. Natriumcyanoborhydrid (NaBH3CN, 10 μl
bei 19 mg/ml) wurde zugegeben und das Röhrchen wurde über Nacht
bei Umgebungstemperatur belassen. Glucoseoxidase hat ein ungefähres Molekulargewicht
von 160 000.
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Assay für aktives
Konjugat (Cellulosebinden)
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Allgemeines Verfahren
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Alle
Assays nutzten die Fähigkeit
von Galactomannanen, an Cellulose durch Polysaccharid:Polysaccharid-Wechselwirkung
zu binden. Sigmacell Typ 20 Celluloseteilchen mit einer mittleren
Teilchengröße von 20
m (von Sigma) wurden zum Bereitstellen einer Oberfläche, auf
der Cellulosebindungsmoleküle
eingefangen wurden, verwendet. Eine Aufschlämmung von Sigmacell von 50
mg/ml wurde in PBS + Tween 20 (0,05) (PBST) hergestellt. Die Assays
wurden an Filterplatten (Millipore, Produkt Nr. MAHVN4550) mit 0,45
m Porengrößenfiltern
durchgeführt.
Die Platten wurden immer durch Vollsaugen über Nacht in PBST mit Rinderserumalbumin
(BSA, 2% Gewicht/Volumen) zum Verhindern von unspezifischem Binden
von Enzym oder Konjugat vorbehandelt. Die Lösungen wurden durch die Filterplatte
unter Verwendung einer individuell verfügbaren Vakuumleitung (Anachem)
abgezogen. Die über
Nacht behandelte Lösung
(PBST/BSA) wurde vor dem Versuch entfernt. 100 μl Sigmacell-Aufschlämmung (unmittelbar vor der
Zugabe geschüttelt)
wurden zu jeder Vertiefung gegeben. 100 μl von geeignet verdünnten LBG-Konjugaten
(siehe nachstehend) wurden zu dem Sigmacell in den 96-Vertiefungs-Platten
gegeben und 10 Minuten inkubiert, um das Binden an die Celluloseoberfläche zu erlauben.
Nach 10 Minuten wurde die Lösung
unter Vakuum abgezogen und die Cellulose durch Zugabe von 150 μl PBS + Tween
(0,05%) fünfmal
gewaschen. Die Assays wurden dann, wie nachstehend gezeigt, für jedes der
Konjugate fortgesetzt.
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Assay von LBG/GOX-Konjugat
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Das
Stamm-LBG/GOX-Konjugat, enthaltend 25 mg/ml Glucoseoxidase und 0,1%
(Gewicht/Volumen) LBG, wurde zu einer Konzentration von 25 μg/ml in PBST
+ BSA (2% Gewicht/Volumen) verdünnt.
Ein Kontrollgemisch, enthaltend 25 mg/ml Glucoseoxidase mit unmodifiziertem
LBG, wurde auch zu der gleichen Konzentration verdünnt, um
auf nichtspezifisches Binden zu untersuchen. Nach Inkubation mit
den Konjugaten wurden die Sigmacellteilchen gewaschen und dann wurde
TMB-GOx-Substrat zu jeder Vertiefung gegeben. Das TMB-Substrat wurde
durch Auflösen
der nachstehenden Bestandteile in 20 ml Wasser hergestellt:
- – Dinatriumphosphat
(0,45 mg),
- – Zitronensäure (150
mg),
- – D-Glucose
(0,54 g),
- – Meerrettich-Peroxidase
(100 ng) und
- – 200 μl einer 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin-(TMB)-Stammlösung in
DMSO (100 mg/10 ml DMSO).
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Das
Substrat. wurde mit den Teilchen für einige Minuten, bis sich
eine blaue Farbe entwickelte, belassen. Bevor die optischen Dichten
aufgezeichnet wurden, wurde die Substratlösung Ansäuerung durch Zugabe von 50 μl 2M HCl
zu jeder Vertiefung unterzogen und das gelbe Produkt wurde auf einer
Flachboden-96-Vertiefungs-Platte ausgezogen. Die OD bei 450 nm wurde
bestimmt und an einem automatischen Plattenleser aufgezeichnet.
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ERGEBNISSE
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Das
reduktive Aminierungs-Konjugationsverfahren ergab ein aktives Konjugat
der zwei Moleküle,
GOx und LBG, wie durch die optischen Dichtewerte in Tabelle 1 gezeigt.
Sowohl die Cellulosebindungsaktivität des Galactomannans als auch
die Enzymaktivität
des GOx wurden zurückbehalten
und wurden wirksam in dem Konjugat vereinigt. Im Gegensatz dazu
liefert der niedrige OD-Wert für
das einfache Gemisch von LBG und GOx Bestätigung, dass sich eine Konjugatleistung
aus der chemischen Konjugation der zwei Moleküle ergab.
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Tabelle
1. Optische Dichtewerte, abgeleitet von dem Assaytest und Kontrollproben,
erzeugt durch das reduktive Aminierungs-Konjugationsverfahren. Inkubation
mit Substrat wurde für
nur 5 Minuten fortgesetzt, bevor die OD-Werte bestimmt wurden.
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BEISPIEL 2: Konjugation
von Johannisbrotbaumgummi mit monoklonalem Antikörper 3299
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MATERIALIEN UND VERFAHREN
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LBG
wurde gereinigt und wie in Beispiel 1 beschrieben oxidiert.
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Konjugation von monoklonalem
Antikörper
3299 an oxidiertes LBG
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Eine
Lösung
eines monoklonalen Antikörpers,
bezeichnet 3299 (MAb 3299, erhalten von Unipath), spezifisch für das Schwangerschaftshormon
von humanem chorionischem Gonadotrophin (HCG), wurde über Nacht
gegen 0,1M Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, dialysiert. Die Endkonzentration
des Antikörpers
wurde durch weitere Verdünnung
mit dem gleichen Puffer, falls geeignet, auf 10 mg/ml eingestellt.
MAb 3299 hat ein geeignetes Molekulargewicht von 150 000.
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Eine
Probe (20 μl)
von dieser MAb 3299-Lösung
wurde mit 20 1 der oxidierten LBG-Lösung (wie vorstehend) vermischt
und das Gemisch 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen lassen. Eine
Lösung
(1 μl) von NaBH3CN (19 mg/ml) wurde zugegeben und die Reaktion über Nacht
bei Umgebungstemperatur belassen.
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Assay für LBG/monoklonaler
Antikörper-3299-Konjugat
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LBG/MAb-3299-Konjugat-Stammlösung, enthaltend
5 mg/ml MAb 3299 und 0,05 LBG, wurde in PBST + BSA (2% Gewicht/Volumen)
auf eine Antikörperkonzentration
von 25 μg/ml
verdünnt.
Ein Kontrollgemisch, enthaltend 25 mg/ml MAb 3299, mit unmodifiziertem
LBG, wurde auch auf die gleiche Konzentration verdünnt, um
auf nichtspezifisches Binden zu untersuchen. Nach Inkubation mit
den Celluloseteilchen und anschließendem Waschen, wurde Cellulose-gebundener,
monoklonaler Antikörper
mit Hilfe von alkalischer Phosphatase-konjugierten Tracermolekülen bestimmt.
Diese waren entweder (a) Kaninchen-anti-Maus-IgG-alkalische Phosphatase
oder (b) HCG-alkalische Phosphatase. Diese Tracerkonjugate wurden
in PBST + BSA (2% Gewicht/Volumen) verdünnt.
- a)
Kaninchen-anti-Maus-IgG-alkalisches Phosphatase-Tracerkonjugat (Sigma) wurde 1:1000
verdünnt
und 150 μl
davon wurden zu jedem LBG/MAb-Cellulosegemisch in den Filterplatten
gegeben. Nach 1 Stunde wurde das Tracerkonjugat durch Filtration
entfernt und die Platten 10 × mit
200 μl pro
Vertiefung PBST gewaschen. Alkalisches Phosphatasesubstrat (Sigma
104) wurde zu jeder Vertiefung (200 μl para-Nitrophenylphosphat,
pNPP, 1 mg/ml in Diethanolaminpuffer, pH 10) gegeben und bei Umgebungstemperatur
gehalten, bis sich eine gelbe Farbe entwickelt hatte (etwa 30 Minuten).
Das gelbe Produkt wurde dann in der üblichen Weise auf einer Mikrotiterplatte
ausgezogen und OD bei 405 nm bestimmt.
- b) HCG-alkalische Phosphatase-Tracerkonjugat wurde 1:200 verdünnt und
150 μl davon
wurden zu jedem LBG/MAb Cellulosegemisch in den Filterplatten gegeben.
Der Versuch wurde dann wie vorstehend in a) ablaufen lassen.
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ERGEBNISSE
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Das
reduktive Aminierungsverfahren erwies sich als wirksam zum Konjugieren
von Antikörpern
an LBG, wie durch die Werte in Tabelle 2 gezeigt. Wie für GOx zeigen
die Werte, dass ein chemisches Vernetzungsverfahren notwendig war
(anstatt einfachen Vermischens), um ein aktives Konjugat herzustellen,
und das Verfahren ergab keinen Verlust an Bindungsaktivität in beiden
Molekülen.
Die verschiedenen Tracermoleküle
(anti-Maus-IgG und HCG) bestätigten,
dass der Antikörper
an die Cellulose in einer Form gebunden war, die ihre spezifische,
immunologische Bindungsfähigkeit
(HCG) sowie ihre allgemeinen Immunoglobulineigenschaften (anti-Maus-IgG)
erhielt.
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Die
niedrigen, jedoch messbaren Bindungswerte, die mit der gemischten
Probe gefunden wurden, sind ein Beweis für ein allgemeines „Haftvermögen", das mit dem monoklonalen
Antikörper
und den Celluloseteilchen (nichtspezifische Adsorption) einhergeht.
Jedoch ist der Unterschied zwischen den zwei Einstellungen ein deutlicher
Beweis einer annehmbaren Konjugationswirksamkeit.
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Tabelle
2. Optische Dichtewerte, abgeleitet von dem Assay-Test und Kontrollproben,
die durch das reduktive Aminierungs-Konjugationsverfahren erzeugt
wurden.
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BEISPIEL 3: Konjugation
von Johannisbrotbaumgummi mit scFv3299
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MATERIALIEN
UND VERFAHREN
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LBG
wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gereinigt und oxidiert.
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Das
Einzelketten-Fv-Antikörperfragment
von 3299 (scFv3299) ist ein genetisch erzeugtes Fragment, das aus
den Variablenbereichen des 3299-Stamm-Antikörpers besteht, erzeugt in Mikroorganismen,
transformiert mit den relevanten Genen, geeigneterweise für den Wirt
formatiert. Um mit diesem Material zu arbeiten, war es zunächst erforderlich,
den transformierten Wirtsorganismus zu züchten, Expression des Gens
einzuleiten und dann den scFv aus der Überstandsflüssigkeit der Kultur zu reinigen.
Das gentechnisch erzeugte scFv3299 trägt auch einen kurzen Oligohistidin„schwanz", der an immobilisierte
Nickelionen als Mittel der Reinigung binden könnte (das IMMAC-Verfahren).
scFv3299 hat ein ungefähres
Molekulargewicht von 26 000.
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Herstellung
und Reinigung von ScFv
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Das
Antikörperfragment
scFv3299, modifiziert durch die Zugabe eines kurzen Oligohistidinschwanzes,
wurde in einem transformierten Wirtsmikroorganismus (z.B. E. coli)
unter Verwendung herkömmlicher Verfahren,
die dem Fachmann gut bekannt sind, erzeugt. Das scFv3299-Protein
wurde durch Standardverfahren durch ein IMMAC-Verfahren und dann
durch Mono-S-(Kationenaustausch)-Chromatographie
gereinigt. Die gereinigte Proteinlösung wurde einem Pufferaustauschverfahren
durch eine PD-10-Gel-Filtrationssäule (Pharmacia) in 0,1M Phosphatpuffer,
pH 6,5, unterzogen.
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Thiolierung von ScFv3299
mit 5-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid
(SAMSA)
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Gereinigtes
scFv3299 mit 1,4 mg/ml in Phosphatpuffer, pH 6,5, 0,1M (150 μl), wurde
in 0,6 ml „Reactivial" (Pierce) angeordnet.
Eine Lösung
(20 μl)
von SAMSA (bezogen von Sigma), gelöst in Dimethylformamid mit
einer Geschwindigkeit von 6 mg/ml, wurde dann zu dem Fläschchen
gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei Umgebungstemperatur
gerührt.
Das Nachstehende wurde dann nacheinander zugegeben, wobei das erhaltene
Gemisch 5 Minuten nach jeder Zugabe gerührt wurde:
25 μl 0,1M EDTA,
pH 8,0
100 μl
0,1M Tris-HCl, pH 7,0
100 μl
1M Hydroxylamin
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Nach
der Endzugabe wurde das Gemisch mit 2,5 ml in 0,1M Natriumphosphat
+ 5 mM EDTA, pH 6,5, verdünnt
und auf eine PD-10-Gel-Filtrationssäule aufgetragen. Das Protein-Thiol-Konjugat wurde
in 3 ml Phosphat + EDTA-Puffer eluiert, was wiederum durch Vermindern
des Volumens auf 150 μl
durch eine Centricon-10-Vorrichtung (Amicon) auf konzentriert wurde.
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Derivatisierung von LBG
mit MPBH
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4-(4-N-Maleimidophenyl)buttersäurehydrazid.HCl
(MPBH, Pierce Product Nr. 22305) wurde in 10 mg/ml in Dimethylsulfoxid
(DMSO) gelöst.
Oxidiertes LBG wurde wie vorstehend beschrieben hergestellt, mit der
Ausnahme, dass am Ende des Verfahrens die Galactoseoxidase, die
mit dem Produkt zurückblieb,
durch Erhitzen auf 98°C
für 15
Minuten denaturiert wurde. Die erhaltene Lösung wurde Pufferaustausch
mit 0,1M Natriumacetat, pH 5,5, mit Hilfe einer Centricon-30-Vorrichtung
(Amicon) unterzogen, und dann wurde das Volumen durch die Zugabe
von weiterer Pufferlösung,
falls geeignet, zurück
auf das Ausgangsvolumen eingestellt. An diesem Punkt in dem Verfahren
wurde MPBH in DMSO (21, 3 μl)
zu 600 μl
der oxidierten LBG-Lösung
gegeben, unter Gewinnung einer End-MPBH-Konzentration von 1 mM. Dieses
Reaktionsgemisch wurde unter mildem Rühren 2 Stunden bei Umgebungstemperatur
gehal ten. Das derivatisierte LBG-Produkt wurde dann Pufferaustausch
mit 0,1M Phosphatpuffer, pH 6,5, mit Hilfe einer Centricon-30-Vorrichtung
unterzogen, wonach das Volumen erneut auf 600 μl eingestellt wurde.
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Konjugation von SAMSA-derivatisiertem
ScFv mit MPBH-derivatisiertem
LBG
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Die
ScFv-SAMSA-Lösung
(75 μl,
enthaltend 0,105 mg) wurde mit LBG-MPBH (25 μl) vermischt und das Volumen
auf 125 μl
mit Phosphatpuffer aufgefüllt.
Das Reaktionsgemisch wurde über
Nacht bei Umgebungstemperatur belassen.
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Assay für LBG/scFv3299-Konjugat
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LBG/scFv3299-Konjugat-Stammlösung, enthaltend
0,34 mg/ml scFv3299 und 0,02 LBG, wurde in PBST + BSA (2% Gewicht/Volumen)
auf eine scFv-Konzentration von 34 μg verdünnt. Wie mit dem gesamten Antikörperkonjugat,
wurde ein Gemisch von scFv und LBG, enthaltend die gleichen relativen
Mengen, auf die gleiche Konzentration verdünnt. Das Assayverfahren war
wie vorstehend für
das Ganz-Antikörper-Konjugat beschrieben,
jedoch nur mit dem HCG-alkalischen Phosphatase-Tracerkonjugat (da ein scFv-Fragment
nicht mit anti-Maus-IgG nachgewiesen werden konnte).
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ERGEBNISSE
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Es
wurde gefunden, dass das scFv3299-Antikörperfragment mit LBG konjugiert
ist, wie aus den Werten in Tabelle 3 gezeigt; auch wenn ein anderes,
komplexeres Konjugationsverfahren verwendet wurde. Der Unterschied
zwischen den Kontrollgemischwerten und den Konjugatwerten ist weniger
als mit anderen Systemen, was entweder eine niedrigere Wirksamkeit
der Konjugation oder eine größere Tendenz
für das
unkonjugierte Material, unspezifisch adsorbiert zu werden, ausweist.
Eine niedrigere Konjugationswirksamkeit ist wahrscheinlicher, da
eine längere
Inkubationszeit mit Substrat zum Erzeugen von hinreichenden OD-Werten benötigt wurde.
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Jedoch
zeigen die Ergebnisse deutlich, dass auch mit dem scFv-Fragment
ein wesentlicher und verwendbarer Grad an chemischer Konjugation
erreicht wurde.
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Tabelle
3. Optische Dichtewerte, abgeleitet von dem Assaytest, und Kontrollproben,
erzeugt durch das SAMSA/MPBH-Konjugationsverfahren.
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Beispiel 4: Konjugation
von aktiven Proteinen an Tamarindensamenxyloglucan (TXG)
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Tamarindensamenpolysaccharid
(Glyoid 3S von Dainippon Pharmaceutical Co., Osaka, Japan) wurde in
desionisiertem Wasser (16 Stunden bei 25°C oder 10 Minuten bei 80°C, gefolgt
von 2–3
Stunden bei 25°C) gelöst, unter
Gewinnung einer 0,5–1,0%-Gewicht/Volumen-Suspension,
die durch Zentrifugation (20000 G, 30 Minuten) gereinigt wurde,
sorgfältig
gegen desionisiertes Wasser dialysiert und lyophilisiert wurde.
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Das
erhaltene TXG wurde dann in Konjugate mit Glucoseoxidase, MAb 3299
und scFv 3299 exakt, wie in Beispielen 1, 2 und 3 beschrieben, gebildet
und es wurde gefunden, dass die erhaltenen Konjugate an Cellulose
gebunden sind.