ES2198792T5 - Conjugado de polisacarido capaz de unirse a celulosa. - Google Patents
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Abstract
Un conjugado de polisacárido que comprende un polisacárido con una entidad adherida que tiene un peso molecular de al menos 5000, siendo el conjugado de polisacárido capaz de unirse a celulosa, y siendo la entidad adherida una enzima, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.
Description
Conjugado de polisacárido capaz de unirse a
celulosa.
Esta invención se refiere a la unión de
polisacáridos y trata de un conjugado de polisacárido que se une a
celulosa, de productos que incluyen el conjugado de polisacárido, y
métodos para seleccionar dianas usando el conjugado de
polisacárido. En el contexto de la invención, el término
"polisacárido" está destinado a cubrir polisacáridos y
oligosacáridos, y las referencias a "polisacárido" y
"conjugado de polisacárido" se deben interpretar en
consecuencia. El término "conjugado" se usa para referirse a
unidades unidas o aseguradas juntas (física y/o químicamente),
comprendiendo el "conjugado de polisacárido" un polisacárido
unido o asegurado a otra entidad.
Se sabe que diversos polisacáridos de origen
natural, tales como xiloglucano de guisante, xiloglucano de semilla
de tamarindo, etc., se unen a celulosa mediante una interacción
polisacárido:polisacárido; de hecho, esta capacidad de unión es
importante en el funcionamiento de las paredes celulares de la
planta.
El documento
US-A-3297604 se refiere a
composiciones polímeras que contienen galactosa oxidada para formar
un grupo carbonílico en la posición C6. El grupo carbonílico activo
puede reaccionar de manera conocida, por ejemplo para formar
cianohidrinas, compuestos de adición de bisulfitos, oximas,
hidrazonas, etc. Las composiciones también pueden actuar para
reticular polímeros, incluyendo celulosa. El polímero puede ser, por
ejemplo, goma guar, goma de algarroba, etc. No hay descripción
alguna de un conjugado de polisacárido con entidad adherida de peso
molecular de al menos 5.000. Aunque la propia composición polímera
puede ser capaz de unirse a celulosa, esto no es inesperado, y no
hay ninguna descripción de un conjugado de polisacárido que sea
capaz de unirse a celulosa.
El documento
US-A-2949397 se refiere al uso de
carga mineral revestida, al menos parcialmente, con coloide
orgánico disperso en agua, para promover la retención de la carga en
fibras celulósicas en la obtención de papel. El coloide puede ser,
por ejemplo, un galactomanano, o un manano sustituido tal como goma
de algarroba y goma guar. La carga revestida es atraída a las
fibras de celulosa mediante acción electrostática. La carga y el
coloide se mezclan juntos, pero se separan al dejar reposar y por
tanto están en forma de una mezcla simple y no como un conjugado de
polisacárido.
El trabajo de Hayashi y otros, titulado "Pea
Xyloglucan and Cellulose" en Plant Physiol. (1987) 83,
384-389, describe investigaciones de unión de
xiloglucano de guisante a celulosa, usando xiloglucano marcado con
fluoresceína, preparado tratando xiloglucano con CNBr e incubándolo
con fluoresceinamina, y también usando xiloglucano radioyodado
preparado por reacción de ^{125}I con el resto fluoresceínico en
xiloglucano. Estos marcadores se usaron para rastrear la unión del
polisacárido y están entre las entidades de marcado isotópico
moleculares más pequeñas conocidas.
La presente invención se basa en el
descubrimiento sorprendente de que los polisacáridos con entidades
adheridas mucho mayores que aquellas usadas por Hayashi y otros,
pueden aún unirse rápidamente con elevada eficiencia a celulosa
mediante interacción de polisacárido:polisacárido. Esto es
sorprendente debido a que la unión ocurre en múltiples sitios a lo
largo de las cadenas principales de los polisacáridos, en vez de en
un único sitio de unión como con las interacciones
anticuerpo-antígeno, y se habría predicho que la
unión habría sido interrumpida por la adhesión de grandes entidades
a polisacáridos que se unen a celulosa. La invención abre de este
modo la posibilidad de usar polisacáridos para seleccionar como
dianas a entidades adheridas a celulosa, por ejemplo en tejido,
papel,
etc.
etc.
En un aspecto, la presente invención proporciona
un conjugado de polisacárido que comprende un polisacárido con una
entidad adherida que tiene un peso molecular de al menos 5.000,
siendo capaz el conjugado de polisacárido de unirse a celulosa, y
siendo la entidad adherida una enzima, anticuerpo o fragmento de
anticuerpo, en el que el polisacárido tiene una estructura de
cadena principal de \beta-glicano enlazado vía
1-4, y en el que el polisacárido se selecciona entre
xiloglucanos y galactomananos.
El conjugado de polisacárido es preferiblemente
capaz de unirse a celulosa mediante interacción
polisacárido:po-
lisacárido.
lisacárido.
El polisacárido puede ser aquél que se une
naturalmente a la celulosa, o del que se ha obtenido un derivado o
se ha modificado de otro modo para unirse a celulosa. El
polisacárido puede ser de origen natural o sintético.
El polisacárido tiene una estructura de cadena
principal (azúcar generalizado) de \beta-glicano
enlazado vía 1-4, que es estereoquímicamente
compatible con celulosa, tal como una cadena principal de glucano
(que consta de residuos de glucosa enlazados vía \beta
1-4), una cadena principal de manano (que consta de
residuos de manosa enlazados vía \beta 1-4), o
una cadena principal de xilano (que consta de residuos de xilosa
enlazados vía \beta 1-4). Los polisacáridos
adecuados son xiloglucanos, y galactomananos. Véase "Physiology
and Biochemistry of Plant Cell Walls" (1990) por C. Brett y K.
Waldron para una discusión de estos materiales.
El requisito de longitud mínima de cadena para
que los oligómeros de celulosa se unan a la celulosa es de 4
unidades de glucosa. Para xiloglucanos, las cadenas laterales hacen
a la unión menos eficiente, y se requieren 12 unidades de glucosa
en la cadena principal (es decir, alrededor de 25 unidades totales
de azúcar) para la unión a celulosa. Consideraciones estructurales
sugieren que los galactomananos son intermedios en la eficiencia de
unión, y se espera que se requieran alrededor de 6 a 8 residuos en
la cadena principal para la unión a celulosa. De este modo, el
polisacárido debe tener al menos 4, y preferiblemente al menos 10,
residuos en la cadena principal, que están enlazados preferiblemente
vía \beta 1-4.
Los polisacáridos de origen natural que se unen
rápida y fuertemente a celulosa mediante interacción
polisacárido:polisacárido incluyen xiloglucanos, tales como
xiloglucano de guisante y xiloglucano de semilla de tamarindo (TXG)
(que tiene una cadena principal de glucano enlazada vía \beta
1-4, con cadenas laterales de
\alpha-D-xilopiranosa y
-D-galactopiranosil-(1-2)-\alpha-D-xilopiranosa,
ambas enlazadas vía 1-6 a la cadena principal: véase
Gidley y otros Carbohydrate Research, 214 (1991)
200-314 para una discusión de la estructura del
polisacárido de semilla de tamarindo); y galactomananos,
particularmente galactomananos con bajo contenido en galactosa, tal
como goma de algarroba (LBG) (que tiene una cadena principal de
manano de residuos de manosa enlazados vía \beta
1-4, con cadenas laterales de una sola unidad de
galactosa enlazadas 1-6 a la cadena principal), guar
modificada por enzimas (EMG) (goma guar que tiene las mismas
unidades estructurales que LBG, pero que tiene un nivel mucho mayor
de sustitución con galactosa, hasta el grado de que no hay
suficiente cadena principal de manano accesible a través de la cual
unirse a celulosa. La EMG se produce mediante eliminación
enzimática, a partir de la goma guar, de un porcentaje controlable
de los residuos de la galactosa para producir un intervalo de
materiales que son capaces de unirse a celulosa, pero que son más
baratos y están más consistentemente disponibles que LBG. Véase
Bulpin y otros en Carbohydrate Polymers 12 (1990)
155-168 para una discusión de EMG), galactomanano
de tara y galactomanano de casia. Estos materiales están
comercialmente disponibles y proporcionan de este modo fuentes
potencialmente útiles de polisacáridos adecuados. Estos materiales
tienen las ventajas de ser relativamente baratos, y ya se han
aceptado para el uso alimentario.
El polisacárido tiene deseablemente residuos de
galactosa en la cadena lateral susceptibles de oxidación mediante
galactosa-oxidasa, para la producción de un grupo
aldehído para el acoplamiento de una entidad proteínica, como se
describirá más abajo. El TXG, la LBG y la EMG tienen tales residuos
de galactosa.
La entidad adherida se puede seleccionar de un
amplio intervalo de entidades que generalmente realizan una función
útil en proximidad a la celulosa, por ejemplo en tejido, papel,
etc., y es una enzima, anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
La enzima es convenientemente una oxidasa,
peroxidasa, catalasa o ureasa. Estas enzimas funcionan mediante la
difusión de sus sustratos a ellas, y generan un flujo de producto
activo de moléculas que se difunden. Las enzimas redox, por ejemplo
oxidasas tales como glucosa-oxidasa, generan
peróxido de hidrógeno que puede actuar como un agente de blanqueo.
La peroxidasa cataliza la oxidación por peróxido de hidrógeno de un
número de sustratos. La ureasa cataliza la hidrólisis de urea,
liberando un flujo de iones amonio que eleva el pH local. La
catalasa es una oxidorreductasa que cataliza la conversión de
peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se
pueden usar, por ejemplo, en técnicas de separación o purificación,
como se describe más abajo, o en inmunoensayos.
La entidad se puede adherir al polisacárido
mediante un intervalo de medios físicos y químicos. Por ejemplo,
las proteínas se enlazan químicamente de forma conveniente a
polisacáridos que tienen cadenas laterales de galactosa oxidando
enzimáticamente la galactosa, por ejemplo usando
galactosa-oxidasa, para producir un grupo
aldehídico al que se puede enlazar químicamente un grupo amino de
una proteína. Como se señala anteriormente, el TXG, la LBG y la EMG
tienen cadenas laterales adecuadas de galactosa. Para los
polisacáridos que no tienen cadenas laterales adecuadas de
galactosa, se pueden usar diferentes métodos de enlace químico de
proteínas. Técnicas alternativas incluyen la oxidación limitada con
peryodato, que requiere que el polisacárido tenga dos grupos
hidroxílicos adyacentes en orientación cis, y da como resultado la
producción de grupos aldehídicos que se pueden aminar de forma
reductora. Una posibilidad adicional es la reacción con bromuro de
cianógeno (CNBr) que se inserta en los anillos de los azúcares en
dioles vecinales, tanto en la cadena principal como en las cadenas
laterales, para proporcionar un enlace de isourea a los grupos amino
de las proteínas. Se prefiere usar técnicas químicas que no afecten
a la longitud de la cadena principal del polisacárido, lo que
reduciría la capacidad de unión del polisacárido a la celulosa.
Debido a que el conjugado de polisacárido se une
a la celulosa, que está presente en el algodón y otros tejidos,
papel, etc., la unión del conjugado a la celulosa aproxima mucho a
la entidad adherida a una superficie de celulosa, o que contiene
celulosa. La invención permite de este modo la selección como dianas
de entidades adheridas para tales superficies. Esta función de
selección como dianas es de uso en un número de diferentes
aplicaciones potenciales, que incluyen las siguientes:
1. Selección como dianas de enzimas para unirlas
a tejidos, por ejemplo enzimas oxidantes solubles, tales como
glucosa-oxidasa. Tales enzimas actuarán liberando
peróxido de hidrógeno que puede actuar como un agente de blanqueo
y, de este modo, tiene un efecto de limpieza de los tejidos, o actúa
bloqueando la transferencia de colorantes durante el lavado para
evitar que se pierdan los colores o evitar que las prendas de color
blanco se pongan de un color gris. Los conjugados de
polisacárido-oxidasa encuentran uso de este modo en
el tratamiento de nuevas prendas, particularmente prendas que
contienen algodón, y como ingredientes en productos para la colada,
tales como productos de lavado y acondicionamiento de tejidos.
2. Selección como dianas de enzimas,
anticuerpos, etc., para unirlas a papel, por ejemplo para producir
el blanqueo o el teñido del papel.
3. La inmovilización de anticuerpos, enzimas o
fragmentos de anticuerpos sobre una superficie que contiene
celulosa, por ejemplo partículas de celulosa o papel, por ejemplo
para uso en ensayos de diagnóstico o sistemas inmunoabsorbentes.
4. En técnicas de separación o purificación, que
implican hacer pasar al conjugado de polisacárido a través de un
lecho de celulosa para eliminar el conjugado. Por ejemplo, mediante
uso de un conjugado adecuado de
anticuerpo-polisacárido, el antígeno se puede unir
al conjugado y eliminarlo a continuación, por ejemplo de la
disolución, mediante la unión del conjugado (y del antígeno
adherido) a la celulosa, por ejemplo en un lecho de celulosa.
Un beneficio adicional de la invención surge del
hecho de que, a diferencia de la mayoría de las moléculas
selectoras de dianas, los polisacáridos que se unen a celulosa son
especialmente robustos. Las proteínas, tales como el dominio de
unión a celulosa, se pueden inactivar (desnaturalizar) mediante
calor o con tensioactivos agresivos, mientras que los polisacáridos
tales como LBG, TXG, etc., no se ven afectados por tales
tratamientos. Los conjugados de polisacárido de la invención
ofrecen de este modo la ventaja considerable de una estabilidad
extra y una compatibilidad de producto comparada con otras moléculas
selectoras de dianas.
En un aspecto adicional, la presente invención
proporciona un producto que incorpora un conjugado de polisacárido
según la invención. El producto es convenientemente un producto para
la colada, tal como un producto para el lavado de tejidos, por
ejemplo un producto detergente, o un producto acondicionador de
tejidos. En este caso, la entidad adherida puede ser una enzima.
La invención también encuentra aplicación en los
productos personales. Otras aplicaciones incluyen, por ejemplo,
sistemas analíticos de diagnóstico, productos papeleros, etc.
El producto puede ser, de otro modo, de una
formulación generalmente convencional, como es bien conocida para
los expertos en la técnica. Para una discusión de composiciones
detergentes conocidas véase, por ejemplo el documento
WO-A-95/34628, particularmente las
páginas 11 a 15.
La presente invención también proporciona un
método para seleccionar como diana la unión de una entidad a la
celulosa mediante el uso de un conjugado de polisacárido según la
invención.
La invención se describirá adicionalmente a
título de ilustración, en los siguientes ejemplos.
Se purificó goma de algarroba (LBG)
(suministrada por Meyhall) según el siguiente método. Se preparó una
disolución acuosa de LBG al 1% (p/v) disolviendo 15 g de LBG en
1500 ml de agua a 80-90ºC durante 30 minutos con
agitación mecánica en un homogeneizador Silverson. La disolución
resultante se sometió a centrifugación a 27.000 g (Sorval RC5C, 6
disoluciones de 250 ml, rotor de GSA) durante 30 minutos. Se retiró
el sobrenadante, y los gránulos que quedaron se disolvieron en 500
ml de agua desionizada, nuevamente a 80-90ºC durante
30 minutos con la ayuda del agitador Silverson. Esta disolución se
centrifugó posteriormente como antes. Los sobrenadantes combinados
resultantes se precipitaron entonces en isopropanol (1:2,
sobrenadante:isopropanol) a temperatura ambiente. El precipitado
filamentoso se lavó adicionalmente en isopropanol, se dejó reposar
en acetona durante una hora y entonces se lavó dos veces con
acetona reciente. Este LBG purificado se secó en aire, y entonces en
un horno de vacío a 45ºC.
La LBG purificada se disolvió a 0,1% (p/v) en
fosfato de sodio 0,1 M (pH 7,0) calentando hasta
80-90ºC, y agitando periódicamente con un
homogeneizador Ultra-Turrax. Se disolvió
galactosa-oxidasa (Sigma, G7907) en fosfato de
sodio, pH 7,0, hasta una concentración de 50 \mug/ml. Se añadió
una alícuota de 400 \mul de esta disolución a 1,2 ml de disolución
de LBG (0,1% (p/v)), y la mezcla de reacción se incubó a 37ºC
durante 5-16 horas, dependiendo del experimento
particular.
La glucosa-oxidasa (producto de
Sigma nº 7141, 12,5 mg) se pesó en un tubo, y se añadieron 0,5 ml de
disolución de LBG oxidada/galactosa-oxidasa. A la
mezcla se le dieron golpecitos suavemente para disolver la
glucosa-oxidasa, y a continuación se dejó reposar a
temperatura ambiente durante 2 horas. Se añadió cianoborohidruro de
sodio (NaBH_{3}CN, 10 \mul a 19 mg/ml), y el tubo se dejó a
temperatura ambiente toda la noche. La
glucosa-oxidasa tuvo un peso molecular aproximado de
160.000.
Todos los ensayos explotaron la capacidad de los
galactomananos para unirse a celulosa mediante interacción
polisacárido:polisacárido. Se usaron partículas de celulosa
Sigmacell Tipo 20, con un tamaño medio de 20 m (de Sigma) para
proporcionar una superficie sobre la que capturar las moléculas que
se unen a la celulosa. Se obtuvo una suspensión de 50 mg/ml de
Sigmacell en PBS + Tween (0,05%) (PBST). Los ensayos se realizaron
en placas de filtro (Millipore, Producto nº MAHVN4550) con filtros
de tamaño de poros de 0,45 m. Las placas siempre se pretrataron
empapándolas toda la noche en PBST con albúmina de suero bovino
(BSA, 2% p/v) para evitar la unión no específica de la enzima o del
conjugado. Las disoluciones se extrajeron a través de la placa de
filtro usando un colector de vacío comercialmente disponible
(Anachem). La disolución de tratamiento (PBST/BSA) de la noche se
eliminó antes del experimento. Se añadieron 100 \mul de la
suspensión Sigmacell (agitada inmediatamente antes de la adición) a
cada pocillo. Se añadieron 100 \mul de conjugados de LBG diluidos
apropiadamente (véase más abajo) a la suspensión de Sigmacell en
placas de 96 pocillos, y se incubó durante 10 minutos para permitir
la unión a la superficie de la celulosa. Tras 10 minutos, la
disolución se eliminó a vacío, y la celulosa se lavó mediante
adición de 150 \mul de PBS + Tween (0,05%), cinco veces. Los
ensayos se continuaron entonces como se muestra más abajo para cada
uno de los conjugados.
Se diluyó el conjugado madre de LBG/GOX, que
contiene 25 mg/ml de glucosa-oxidasa y 0,1% (p/v) de
LBG, hasta una concentración de 25 \mug/ml en PBST + PSA (2% p/v).
También se diluyó hasta la misma concentración una mezcla de
control que contiene 25 mg/ml de glucosa-oxidasa con
LBG sin modificar, para comprobar la unión no específica. Tras la
incubación con los conjugados, las partículas de Sigmacell se
lavaron, y a continuación se añadió a cada pocillo el sustrato TMB
GOx. El sustrato de TMB se preparó disolviendo los siguientes
ingredientes en 20 ml de agua:
- fosfato disódico (0,45 mg),
- ácido cítrico (150 mg),
- D-glucosa (0,54 g),
- peroxidasa de rábano picante (100 ng) y
- 200 \mul de una disolución madre de
3,3',5,5'-tetrametilbencidina en DMSO (100 mg/10 ml
de DMSO).
El sustrato se dejó con las partículas durante
varios minutos, hasta que apareció un color azul. Antes de que se
registraran las densidades ópticas, la disolución del sustrato se
acidificó mediante adición de 50 \mul de HCl 2 M a cada pocillo,
y el producto amarillo se extrajo sobre una placa de 96 pocillos de
fondo redondo. Se determinó la densidad óptica (OD) a 450 nm, y se
registró en un lector automático de placas.
El procedimiento de conjugación mediante
aminación reductora produjo un conjugado activo de dos moléculas,
GOx y LBG, como se muestra mediante los valores de densidad óptica
en la Tabla 1. Se retuvieron tanto la actividad de unión a celulosa
del galactomanano como la actividad enzimática de la GOx, y se
combinaron efectivamente en el conjugado. Por contra, el bajo valor
de la OD para la mezcla simple de LBG y GOx proporciona una
confirmación de que el comportamiento del conjugado resultó de la
conjugación química de las dos moléculas.
| Muestra de ensayo | Densidad óptica |
| Conjugado de LBG/GOx | 1,031 |
| Mezcla de LBG/GOx | 0,001 |
La LBG se purificó y oxidó como se describe en
el Ejemplo 1.
Se dializó toda la noche una disolución de un
anticuerpo monoclonal denominado 3299 (MAb 3299, obtenido de
Unipath), específico para la gonadotropina coriónica humana (HCG) de
la hormona del embarazo, frente a tampón de fosfato de sodio 0,1 M,
pH 6,5. La concentración final del anticuerpo se ajustó a 10 mg/ml
mediante dilución adicional con el mismo tampón, según sea
apropiado. El MAb 3299 tuvo un peso molecular apropiado de
150.000.
Se mezcló una muestra (20 \mul) de esta
disolución de MAb 3299 con 20 l de la disolución de LBG oxidada
(como antes), y la mezcla se mantuvo a temperatura ambiente durante
2 horas. Se añadió una disolución (1 \mul) de NaBH_{3}CN (19
mg/ml), y la reacción se dejó a temperatura ambiente, toda la
noche.
Se diluyó en PBST + BSA (2% p/v) la disolución
madre del conjugado de LBG/MAb 3299, que contiene 5 mg/ml de MAb
3299 y 0,05% de LBG, hasta una concentración de anticuerpo de 25
\mug/ml. También se diluyó hasta la misma concentración una
mezcla de control, que contiene 25 mg/ml de MAb 3299 con LBG sin
modificar, para comprobar la unión no específica. Tras la
incubación con las partículas de celulosa, y el posterior lavado, se
determinó el anticuerpo monoclonal unido a celulosa por medio de
moléculas trazadoras conjugadas de fosfatasa alcalina. Estas fueron
(a) conjugado de IgG anti-ratón de conejo con
fosfatasa alcalina, o bien (b) conjugado de HCG con fosfatasa
alcalina. Estos conjugados trazadores se diluyeron en PBST + BSA (2%
p/v).
a) El conjugado trazador (Sigma) de IgG
anti-ratón de conejo con fosfatasa alcalina se
diluyó 1/1000, y se añadieron 150 \mul de éste a cada mezcla
celulósica de LBG/MAb en las placas de filtro. Tras 1 hora, el
conjugado trazador se eliminó por filtración, y las placas se
lavaron 10 veces con 200 \mul de PBST por pocillo. Se añadió
sustrato de fosfatasa alcalina (Sigma 104) a cada pocillo (200
\mul de fosfato de para-nitrofenilo, pNPP, 1
mg/ml en tampón de dietanolamina, pH 10), y se mantuvo a temperatura
ambiente hasta que se produjo un color amarillo significativo
(alrededor de 30 minutos). El producto amarillo se extrajo entonces
sobre una placa de microtitulación de la forma habitual, y se
determinó la OD a 405 nm.
b) El conjugado trazador de HCG con fosfatasa
alcalina se diluyó 1/200, y se añadieron 150 \mul de éste a cada
mezcla celulósica de LBG/MAb en las placas de filtro. El experimento
transcurrió entonces como en (a) anterior.
Se encontró que el procedimiento de aminación
reductora era efectivo para conjugar anticuerpos con LBG, según se
muestra mediante los valores en la Tabla 2. En cuanto a GOx, los
valores muestran que fue necesario un procedimiento de reticulación
química (más que un mezclamiento simple) para obtener un conjugado
activo, y el procedimiento no dio como resultado la pérdida de la
actividad de unión en ninguna de las moléculas. Las diferentes
moléculas trazadoras (IgG anti-ratón, y HCG)
confirmaron que el anticuerpo se había unido a la celulosa en una
forma que retenía su capacidad de unión específica, inmunológica
(HCG), así como sus cualidades de inmunoglobulina general (IgG
anti-ratón).
Los bajos valores de unión, pero medibles,
encontrados con la muestra mezclada es una evidencia de una
"pegajosidad" general asociada con el anticuerpo monoclonal y
las partículas de celulosa (adsorción no específica). Sin embargo,
la diferencia entre los dos conjuntos es una clara evidencia de la
eficiencia aceptable de la conjugación.
| Muestra de ensayo | OD 405 nm | |
| a) IgG anti-ratón de conejo/FA | b) HCG/FA | |
| Conjugado de LBG/MAb 3299 | 1.040 | 0,831 |
| Mezcla de LBG + MAb 3299 | 0,063 | 0,071 |
La LBG se purificó y oxidó como se describe en
el Ejemplo 1.
El fragmento de anticuerpo Fv de cadena única de
3299 (scFv3299) es un fragmento genéticamente modificado por
ingeniería que consta de las regiones variables del anticuerpo
progenitor 3299, producido en microorganismos transformados con los
genes relevantes, formateado adecuadamente para ese hospedante. Para
trabajar con este material, primero fue necesario cultivar el
organismo hospedador transformado, e inducir la expresión del gen y
entonces purificar el scFv del fluido sobrenadante del cultivo. El
scFv3299 modificado por ingeniería también llevó una "cola"
corta de oligo-histidina, que se podría unir a iones
de níquel inmovilizados como un medio de purificación (el
procedimiento IMMAC). El scFv 3299 tuvo un peso molecular aproximado
de 26.000.
El fragmento de anticuerpo scFv3299, modificado
por adición de una cola corta de oligo-histidina, se
produjo en un microorganismo hospedante transformado (por ejemplo
E. coli) usando métodos convencionales bien conocidos por
los expertos en la técnica. La proteína de scFv3299 se purificó
mediante métodos estándares a través de un procedimiento IMMAC, y
entonces a través de una cromatografía mono S (intercambio
catiónico). La disolución proteínica purificada se sometió a un
procedimiento de intercambio con tampón a través de una columna de
filtración en gel de PD-10 (Pharmacia) en tampón de
fosfato 0,1 M, pH 6,5.
El scFv3299 purificado a 1,4 mg/ml en tampón de
fosfato, pH 6,5, 0,1 M (150 \mul), se colocó en un
"Reactivial" (Pierce) de 0,6 ml. Entonces se añadió al vial
una disolución (20 \mul) de SAMSA (suministrado por Sigma)
disuelto en dimetilformamida a una velocidad de 6 mg/ml. Esta mezcla
de reacción se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Entonces se añadieron en sucesión los siguientes, agitándose la
mezcla resultante durante 5 minutos tras cada adición:
- 25 \mul de EDTA 0,1 M, pH 8,0
- 100 \mul de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0
- 100 \mul de hidroxilamina 1 M
Tras la adición final, la mezcla se diluyó hasta
2,5 ml en fosfato de sodio 0,1 M + EDTA 5 mM, pH 6,5, y se aplicó a
una columna de filtración en gel de PD-10. El
conjugado de proteína-tiol se eluyó en 3 ml de
tampón de fosfato + EDTA, que se concentró nuevamente reduciendo el
volumen hasta 150 \mul a través de un dispositivo Centricon 10
(Amicon).
Se disolvió hidrocloruro de hidrazida de ácido
4-(4-N-maleimidofenil)butírico
(MPBH, producto de Pierce nº 22305) a 10 mg/ml en dimetilsulfóxido
(DMSO). La LBG oxidada se preparó como se describe anteriormente,
excepto que al final del procedimiento la
galactosa-oxidasa dejada con el producto se
desnaturalizó calentando a 98ºC durante 15 minutos. La disolución
resultante se sometió a intercambio con tampón con acetato de sodio
0,1 M, pH 5,5, mediante un dispositivo Centricon 30 (Amicon), y a
continuación el volumen se ajustó nuevamente al volumen de partida
mediante adición de más disolución de tampón, según sea apropiado.
En este punto del procedimiento, se añadió MPBH en DMSO (21,3
\mul) a 600 \mul de la disolución de LBG oxidada, para dar una
concentración de MPBH final de 1 mM. Esta mezcla de reacción se
mantuvo a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación suave.
El producto de LBG derivada se sometió entonces a intercambio de
tampón con tampón fosfato 0,1 M, pH 6,5, mediante un dispositivo
Centricon 30, tras lo cual se reajustó el volumen a 600 \mul.
La disolución de scFv-SAMSA (75
\mul que contiene 0,105 mg) se mezcló con LBG-MPBH
(25 \mul), y el volumen se llevó hasta 125 \mul con tampón de
fosfato. La mezcla de reacción se dejó a temperatura ambiente toda
la noche.
La disolución madre del conjugado LBG/scFv3299,
que contiene 0,34 mg/ml de scFv3299 y 0,02% de LBG, se diluyó en
PBST + BSA (2% p/v) hasta una concentración de scFv de 34 \mug. Al
igual que con todo el conjugado del anticuerpo, se diluyó hasta la
misma concentración una mezcla de scFv y LBG, que contiene las
mismas cantidades relativas. El procedimiento de ensayo fue como se
describió anteriormente para todo el conjugado de anticuerpo, pero
sólo con el conjugado trazador de HCG con fosfatasa alcalina (puesto
que un fragmento de scFv no se podría detectar con IgG
anti-ratón).
Se encontró que el fragmento de anticuerpo
scFv3299 se conjugó con LBG, según se muestra a partir de los
valores en la Tabla 3, incluso aunque se utilizó un método de
conjugación más complejo y diferente. La diferencia entre los
valores de la mezcla de control y los valores del conjugado es menor
que con los otros sistemas, indicando bien una menor eficacia de
conjugación o bien una mayor tendencia del material no conjugado a
adsorberse no específicamente. Es más probable una menor eficiencia
de la conjugación, puesto que se necesitó un tiempo de incubación
más prolongado con el sustrato para producir valores de OD
adecuados.
Sin embargo, los resultados muestran claramente
que, incluso con el fragmento de scFv, se logró un grado
significativo y útil de conjugación química.
| Muestra de ensayo | Densidad óptica (405 nm) |
| Conjugado de LBG/scFv3299 | 0,714 |
| Mezcla de LBG + scFv3299 | 0,147 |
Se disolvió polisacárido de semilla de tamarindo
(Glyoid 3S de Dainippon Pharmaceutical Co., Osaka, Japón) en agua
desionizada (16 horas a 25ºC, o 10 minutos a 80ºC, seguido de
2-3 horas a 25ºC), para dar una suspensión al
0,5-1,0% p/v que se aclaró mediante centrifugación
(20.000 g, 30 minutos), se dializó ampliamente frente a agua
desionizada, y se liofilizó.
Entonces se formaron conjugados del TXG
resultante con glucosa-oxidasa, MAb 3299 y con scFv
3299, exactamente como se describe en los Ejemplos 1, 2 y 3, y se
encontró que los conjugados resultantes se unían a celulosa.
Claims (11)
1. Un conjugado de polisacárido que comprende un
polisacárido con una entidad adherida que tiene un peso molecular de
al menos 5000, siendo el conjugado de polisacárido capaz de unirse a
celulosa, y siendo la entidad adherida una enzima, un anticuerpo o
un fragmento de anticuerpo, en el que el polisacárido tiene una
estructura de cadena principal de \beta-glicano
enlazado vía 1-4, y en el que el polisacárido se
selecciona entre xiloglucanos y galactomananos.
2. Un conjugado de polisacárido según la
reivindicación 1, en el que los xiloglucanos se seleccionan entre
xiloglucano de semilla de tamarindo (TXG) y xiloglucano de guisante
y los galactomananos se seleccionan entre galactomananos de goma de
algarroba (LBG), goma guar modificada por enzimas (EMG),
galactomanano de tara y galactomanano de casia.
3. Un conjugado según la reivindicación 2, en el
que el polisacárido tiene residuos de galactosa en la cadena lateral
susceptibles de oxidación mediante
galactosa-oxidasa.
4. Un conjugado según cualquier reivindacación
anterior, en el que la enzima es una oxidasa, peroxidasa, catalasa o
ureasa.
5. Un conjugado según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la entidad está adherida al
polisacárido por medios físicos o químicos.
6. Un conjugado según la reivindicación 5, en el
que la entidad tiene grupos amino disponibles, y está enlazada
químicamente a grupos aldehídos formados en el polisacárido.
7. Un conjugado según la reivindicación 7, en el
que una entidad proteínica está enlazada químicamente a TXG, LBG o
EMG vía grupos aldehídicos producidos mediante oxidación enzimática
de cadenas laterales de galactosa.
8. Un producto que incorpora un conjugado de
polisacárido según una cualquiera de las reivindicaciones
precedentes.
9. Un producto según la reivindicación 8, que
comprende un producto para la colada tal como un producto para el
lavado de tejidos, por ejemplo un producto detergente, o un producto
para el acondicionamiento de tejidos.
10. Un producto según la reivindicación 9, en el
que la entidad adherida es una enzima.
11. Un método para seleccionar como diana la
unión de una entidad a celulosa mediante uso de un conjugado de
polisacárido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
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