JP2708487B2 - 薬学的構造 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は医薬用組成物に関し、この構造中でハプテン
及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質がたん白質担
体と結合している。
及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質がたん白質担
体と結合している。
ハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質が
たん白質、たとえば血清アルブミンと結合し、それによ
ってその免疫性又は作用を増加することはすでに試みら
れている。この公知の形成物に於てたん白質分子は、乱
雑に溶液の形で又は非構造性集塊として存在する。その
際ハプテン結合部位又は免疫原性又は免疫刺激性物質の
結合部位は、その性質、種類、数及びたん白質分子中で
の位置によって著しく異なり、それによってハプテン及
び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質とたん白質分子
との十分に限定された結合は全く不可能である。
たん白質、たとえば血清アルブミンと結合し、それによ
ってその免疫性又は作用を増加することはすでに試みら
れている。この公知の形成物に於てたん白質分子は、乱
雑に溶液の形で又は非構造性集塊として存在する。その
際ハプテン結合部位又は免疫原性又は免疫刺激性物質の
結合部位は、その性質、種類、数及びたん白質分子中で
の位置によって著しく異なり、それによってハプテン及
び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質とたん白質分子
との十分に限定された結合は全く不可能である。
本発明は冒頭に示したタイプの医薬用組成物を生じる
ことを課題とする。その構造に於て結合部位の正確に限
定された数が存在し、ハプテン及び（又は）免疫原性又
は免疫刺激性物質の正確に限定された量を正確に限定さ
れた方法で担体に結合することができる。
ことを課題とする。その構造に於て結合部位の正確に限
定された数が存在し、ハプテン及び（又は）免疫原性又
は免疫刺激性物質の正確に限定された量を正確に限定さ
れた方法で担体に結合することができる。
本発明によればこの課題は、たん白質担体を結晶性又
はパラ結晶性の互いに隣接した、場合により相互に共有
架橋された、たん白質分子又はたん白質含有分子によっ
て形成することによって解決される。結晶性又はパラ結
晶性構造によってたん白質分子は、常に正確に一定の空
間配列を互いに有する。それによって結合の種類並びに
結合されるハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激
性物質の数及び空間配置及びハプテン結合部位の又は免
疫原性又は免疫刺激性物質の結合部位の除去は、相互に
常に正確に限定される。
はパラ結晶性の互いに隣接した、場合により相互に共有
架橋された、たん白質分子又はたん白質含有分子によっ
て形成することによって解決される。結晶性又はパラ結
晶性構造によってたん白質分子は、常に正確に一定の空
間配列を互いに有する。それによって結合の種類並びに
結合されるハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激
性物質の数及び空間配置及びハプテン結合部位の又は免
疫原性又は免疫刺激性物質の結合部位の除去は、相互に
常に正確に限定される。
更にたん白質担体を、それがその形、その大きさその
配置及び表面性質に基づき有利に食菌される様に選択す
ることができる。それによってハプテン及び（又は）免
疫原性又は免疫刺激性物質の摂取を食菌細胞、たとえば
マクロファージによって促進する。結果としてより一層
有効な免疫応答が得られる。
配置及び表面性質に基づき有利に食菌される様に選択す
ることができる。それによってハプテン及び（又は）免
疫原性又は免疫刺激性物質の摂取を食菌細胞、たとえば
マクロファージによって促進する。結果としてより一層
有効な免疫応答が得られる。
結晶性又はパラ結晶性の互いに隣接するたん白質含有
分子は糖たん白質であるのが好ましい。それによって担
体の構造を細胞表面構造又は細胞の形により一層良好に
近づけることができる。その際結晶性の互いに隣接する
分子は、１又は数種の微生物細胞壁層に起因する。それ
によって糖たん白質は特別簡単な方法で得られる。その
場合結晶性又はパラ結晶性たん白質担体に付加的に他の
細胞壁成分が付着することができる。適切な微生物を選
択した場合、微生物細胞壁のフラグメントにもハプテン
及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質がつくことが
できる。その上結晶性表面層を形成するたん白質分子に
加えて基礎となる強硬の層、たとえばペプチドグリカン
−又は擬ムレイン層が存在するすべての微生物が特に適
する。
分子は糖たん白質であるのが好ましい。それによって担
体の構造を細胞表面構造又は細胞の形により一層良好に
近づけることができる。その際結晶性の互いに隣接する
分子は、１又は数種の微生物細胞壁層に起因する。それ
によって糖たん白質は特別簡単な方法で得られる。その
場合結晶性又はパラ結晶性たん白質担体に付加的に他の
細胞壁成分が付着することができる。適切な微生物を選
択した場合、微生物細胞壁のフラグメントにもハプテン
及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質がつくことが
できる。その上結晶性表面層を形成するたん白質分子に
加えて基礎となる強硬の層、たとえばペプチドグリカン
−又は擬ムレイン層が存在するすべての微生物が特に適
する。
その際ハプテン及び（又は）免疫性又は免疫原性物質
を担体のたん白質部分と結合することができる。その他
のハプテンに対しては、これが場合により炭水化物に糖
たん白質が結合する場合に有利である。したがって２つ
の結合のうちのどれを選ぶかは、ハプテン及び（又は）
免疫原性又は免疫刺激性物質に並びに医薬用組成物の使
用に依存する。但しこの際一定の条件下で２つの混合形
であるのも有利である。
を担体のたん白質部分と結合することができる。その他
のハプテンに対しては、これが場合により炭水化物に糖
たん白質が結合する場合に有利である。したがって２つ
の結合のうちのどれを選ぶかは、ハプテン及び（又は）
免疫原性又は免疫刺激性物質に並びに医薬用組成物の使
用に依存する。但しこの際一定の条件下で２つの混合形
であるのも有利である。
更にハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物
質を夫々の担体分子と分子間、たとえばホモ−又はヘテ
ロ二官能性架橋剤又はペプチド鎖（たとえばポリリジ
ン）を介して結合することができる。この様ないわゆる
“スペーサー”又は活性な分子間の導入は、それによっ
てハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質の
離脱及び同時に酵素性分解によってマクロファージのエ
ンドゾーム（リソソーム）中に生じる断片の種類をより
一層正確にコントロールすることができるという利点を
有する。この分子間によって“標準破片部位”を生じ、
それを分解酵素が攻撃する。
質を夫々の担体分子と分子間、たとえばホモ−又はヘテ
ロ二官能性架橋剤又はペプチド鎖（たとえばポリリジ
ン）を介して結合することができる。この様ないわゆる
“スペーサー”又は活性な分子間の導入は、それによっ
てハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質の
離脱及び同時に酵素性分解によってマクロファージのエ
ンドゾーム（リソソーム）中に生じる断片の種類をより
一層正確にコントロールすることができるという利点を
有する。この分子間によって“標準破片部位”を生じ、
それを分解酵素が攻撃する。
結局種々の担体及び（又は）種々のハプテン及び（又
は）免疫原性又は免疫刺激性物質がつく担体を一緒にす
ることができる。それによって種々の機能を医薬用組成
物中に生じること、すなわち著しい疎水性である担体分
子はハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質
がつく担体と一緒にして有効になることが達成される。
このことは結果として医薬用組成物の改良された摂取を
食菌細胞によって生じる。また種々のハプテン及び（又
は）免疫原性又は免疫刺激性物質がつく担体も用意する
ことができる。それによって医薬用組成物の作用特徴を
正確に調節することができる。
は）免疫原性又は免疫刺激性物質がつく担体を一緒にす
ることができる。それによって種々の機能を医薬用組成
物中に生じること、すなわち著しい疎水性である担体分
子はハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質
がつく担体と一緒にして有効になることが達成される。
このことは結果として医薬用組成物の改良された摂取を
食菌細胞によって生じる。また種々のハプテン及び（又
は）免疫原性又は免疫刺激性物質がつく担体も用意する
ことができる。それによって医薬用組成物の作用特徴を
正確に調節することができる。
本発明による医薬用組成物の有利な製造方法に於て、
ハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質を結
合する、たん白質分子又はたん白質含有分子の基をハプ
テンの添加前に活性化する。それによってハプテン及び
（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質の対応する基への
確実に正確な及び再生産しうる安定な結合を生じる。
ハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質を結
合する、たん白質分子又はたん白質含有分子の基をハプ
テンの添加前に活性化する。それによってハプテン及び
（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質の対応する基への
確実に正確な及び再生産しうる安定な結合を生じる。
ハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質と
炭水化物部位との接合のために、糖たん白質の炭水化物
部位の結合部分を酸化によって、たとえば過ヨウ素酸塩
によって生じることができる。たん色質分子の結合部位
の形成をたん白質分子を共有架橋する剤、たとえばグル
タルアルデヒドによって行うことができる。それによっ
てたん白質分子の架橋が、処理工程中で同時にハプテン
及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質の結合に対す
る活性基を生じる。結合部位の形成を活性基の導入によ
っても行うことができる。それによって結合の数及び種
類のより一層正確な調節が行われる。特に安定な結果に
関しては、ハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激
性物質をたん白質担体のカルボキシル基とアミド様に結
合することができる。一定の活性結合部位に関して、ハ
プテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質の結合
をシッフの塩の形で行うことができる。この際場合によ
りシッフの塩基を還元して第二アミンとなすことができ
る。
炭水化物部位との接合のために、糖たん白質の炭水化物
部位の結合部分を酸化によって、たとえば過ヨウ素酸塩
によって生じることができる。たん色質分子の結合部位
の形成をたん白質分子を共有架橋する剤、たとえばグル
タルアルデヒドによって行うことができる。それによっ
てたん白質分子の架橋が、処理工程中で同時にハプテン
及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質の結合に対す
る活性基を生じる。結合部位の形成を活性基の導入によ
っても行うことができる。それによって結合の数及び種
類のより一層正確な調節が行われる。特に安定な結果に
関しては、ハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激
性物質をたん白質担体のカルボキシル基とアミド様に結
合することができる。一定の活性結合部位に関して、ハ
プテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質の結合
をシッフの塩の形で行うことができる。この際場合によ
りシッフの塩基を還元して第二アミンとなすことができ
る。
更に特異的結合又は特異的に開裂する結合は、２つの
末端が活性化された結合部位を有する分子間、たとえば
ホモ−又はヘテロ二官能性架橋剤（架橋剤）又はヘプチ
ド鎖（たとえばポリリジン）を一方の末端で担体と結合
することによって得ることができる。その後次いでハプ
テン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質を分子間
のもう一方の末端と結合する。次いでこの方法でいわゆ
る“スペーサー”を構造中に導入する。
末端が活性化された結合部位を有する分子間、たとえば
ホモ−又はヘテロ二官能性架橋剤（架橋剤）又はヘプチ
ド鎖（たとえばポリリジン）を一方の末端で担体と結合
することによって得ることができる。その後次いでハプ
テン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質を分子間
のもう一方の末端と結合する。次いでこの方法でいわゆ
る“スペーサー”を構造中に導入する。
結局、種々の担体及び（又は）種々のハプテン及び
（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質がつく担体を、担
体の架橋後場合により除去される補助層上に施すことが
できる。したがって医薬用組成物を生じる可能性を与
え、それは種々の担体分子−これはたとえば結晶性構造
等々の点で相互に異なる−を薬学的調製物中で一緒にす
ることである。しかし種々のハプテン及び（又は）免疫
原性又は免疫刺激性物質を担体も一緒にして同様に医薬
用組成物となすことができる。
（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質がつく担体を、担
体の架橋後場合により除去される補助層上に施すことが
できる。したがって医薬用組成物を生じる可能性を与
え、それは種々の担体分子−これはたとえば結晶性構造
等々の点で相互に異なる−を薬学的調製物中で一緒にす
ることである。しかし種々のハプテン及び（又は）免疫
原性又は免疫刺激性物質を担体も一緒にして同様に医薬
用組成物となすことができる。
同様に有利にハプテンの及び（又は）免疫原子性又は
免疫刺激性物質の結合部位を活性化することができ、ハ
プテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質をこの
活性された結合部位を介してたん白質担体又は糖たん白
質担体と結合することができる。このことはまた特別安
定な結合を生じる本発明を更に例によって詳細に説明す
る。
免疫刺激性物質の結合部位を活性化することができ、ハ
プテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質をこの
活性された結合部位を介してたん白質担体又は糖たん白
質担体と結合することができる。このことはまた特別安
定な結合を生じる本発明を更に例によって詳細に説明す
る。
例１ A.担体の製造 クロストリディウムサーモヒドロスルフリクム（Clos
tridium thermohydrosulfuricum）L111−69（2.5g）の
細胞を50mMトリス−HCl−緩衝液（pH7.2）中で懸濁し、
短時間、すなわち約１分間超音波で処理する。２％トリ
トンＸ−100溶液12.5mlの添加後、懸濁液を15分、50℃
で培養する。この処理によって、細胞の細胞質及び細胞
質膜を分解する。これに反して結晶又はパラ結晶性たん
白質含有細胞壁層（以下、“Ｓ−層”と略称する。）及
び基礎となるペプチドグリカン層がフラグメントとして
残存する。次いで20.000gで遠心分離し、洗剤の除去の
ために３回水洗する。その後ペレットを5mM塩化マグネ
シウム溶液（25ml）中に懸濁し、原形質残部及び核酸の
除去のために、DNAse125μｇ並びにRNAse500μｇを加
え、15分37℃で攪拌する。次いで３回水洗し、この場合
20.000gで遠心分離する。ペレットを0.1Mカコジル酸塩
緩衝液（pH7.2）20ml中に懸濁し、水中にグルタルアル
デヒドを有する50％溶液を４℃で加え0.5％の最終濃度
に至らしめる。次いで４℃で２〜３分強く攪拌し、遠心
分離し、水洗する。ペレットを水25ml中に懸濁し、その
後トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン（“トリ
ス）”を加える。室温で10分間放置後、新たに遠心分離
（20.000g）し、洗浄する。
tridium thermohydrosulfuricum）L111−69（2.5g）の
細胞を50mMトリス−HCl−緩衝液（pH7.2）中で懸濁し、
短時間、すなわち約１分間超音波で処理する。２％トリ
トンＸ−100溶液12.5mlの添加後、懸濁液を15分、50℃
で培養する。この処理によって、細胞の細胞質及び細胞
質膜を分解する。これに反して結晶又はパラ結晶性たん
白質含有細胞壁層（以下、“Ｓ−層”と略称する。）及
び基礎となるペプチドグリカン層がフラグメントとして
残存する。次いで20.000gで遠心分離し、洗剤の除去の
ために３回水洗する。その後ペレットを5mM塩化マグネ
シウム溶液（25ml）中に懸濁し、原形質残部及び核酸の
除去のために、DNAse125μｇ並びにRNAse500μｇを加
え、15分37℃で攪拌する。次いで３回水洗し、この場合
20.000gで遠心分離する。ペレットを0.1Mカコジル酸塩
緩衝液（pH7.2）20ml中に懸濁し、水中にグルタルアル
デヒドを有する50％溶液を４℃で加え0.5％の最終濃度
に至らしめる。次いで４℃で２〜３分強く攪拌し、遠心
分離し、水洗する。ペレットを水25ml中に懸濁し、その
後トリス−ヒドロキシメチルアミノメタン（“トリ
ス）”を加える。室温で10分間放置後、新たに遠心分離
（20.000g）し、洗浄する。
微生物の細胞形が得られ、かつ原形質のみを細胞から
除去しなければならない場合、一定の条件下で超音波に
よる細胞の処理をやめることができる。
除去しなければならない場合、一定の条件下で超音波に
よる細胞の処理をやめることができる。
上述の様に、前記処理法でたん白質含有細胞壁層に基
礎となるペプチドグルカン層も残存する。この際多くの
組織で付加的なＳ−層を形成することができる。その結
果としてここでフラグメント又はからの微生物さや−こ
れはＳ−層及びペプチドグリカン層からのみ成る−がペ
プチドグリカン層の内側に同様にＳ−層を有することが
できる。その時この層にはハプテン及び（又は）免疫原
性又は免疫刺激性物質又は他の有効物質がつくことがで
きる。この様な場合ヘプチドグリカンが妨げになる場
合、これをペプチドグリカンを分解する酵素、たとえば
リゾチームによって除去することができる。更にＡに従
って製造されたペレットをリゾチーム溶液（50mMトリス
−HCl−緩衝溶液（pH7.2）mlあたりリゾチーム0.5mg）
で１時間36℃で処理する。その際湿潤ペレット0.5gあた
りリゾチーム溶液10mlを加える。製造されたＳ−層−フ
ラグメントは微生物に応じて一重又は二重Ｓ−層から成
る。この場合細胞の超音波処理で妨げのないフラグメン
トが存在する。これに反して超音波で処理しない細胞の
場合、細胞形又は結晶性又はパラ結晶性Ｓ−層が破壊さ
れずに残存する。
礎となるペプチドグルカン層も残存する。この際多くの
組織で付加的なＳ−層を形成することができる。その結
果としてここでフラグメント又はからの微生物さや−こ
れはＳ−層及びペプチドグリカン層からのみ成る−がペ
プチドグリカン層の内側に同様にＳ−層を有することが
できる。その時この層にはハプテン及び（又は）免疫原
性又は免疫刺激性物質又は他の有効物質がつくことがで
きる。この様な場合ヘプチドグリカンが妨げになる場
合、これをペプチドグリカンを分解する酵素、たとえば
リゾチームによって除去することができる。更にＡに従
って製造されたペレットをリゾチーム溶液（50mMトリス
−HCl−緩衝溶液（pH7.2）mlあたりリゾチーム0.5mg）
で１時間36℃で処理する。その際湿潤ペレット0.5gあた
りリゾチーム溶液10mlを加える。製造されたＳ−層−フ
ラグメントは微生物に応じて一重又は二重Ｓ−層から成
る。この場合細胞の超音波処理で妨げのないフラグメン
トが存在する。これに反して超音波で処理しない細胞の
場合、細胞形又は結晶性又はパラ結晶性Ｓ−層が破壊さ
れずに残存する。
B.結合部位の形成。
Ａにより製造されたペレットを水5ml中に懸濁し、そ
の後過ヨウ化ナトリウムの0.1M溶液5mlを加える。次い
でこの懸濁液を24時間４℃で光の遮断下で放置する。そ
の後遠心分離し、ヨウ素含有塩の除去のために10mM塩化
ナトリウム溶液で洗浄する。
の後過ヨウ化ナトリウムの0.1M溶液5mlを加える。次い
でこの懸濁液を24時間４℃で光の遮断下で放置する。そ
の後遠心分離し、ヨウ素含有塩の除去のために10mM塩化
ナトリウム溶液で洗浄する。
C.たん白質と得られたＳ−層との結合。
Ｂにより得られたペレット（約0.2g）を水1ml中に懸
濁し、水10mlあたり牛血清アルブミン50mgを有する溶液
1mlを加える。次いでこの溶液を60分室温で放置し、遠
心分離する。
濁し、水10mlあたり牛血清アルブミン50mgを有する溶液
1mlを加える。次いでこの溶液を60分室温で放置し、遠
心分離する。
担体と結合するアルブミンの量を測定するために過ヨ
ウ素酸塩で酸化する代りに水で培養された調製物と比較
して750nmでの消滅を測定する。この測定結果を第一図
に記載する。これから、過ヨウ素酸塩で酸化されたＳ−
層で著しいより一層多くの結合が行われることが明らか
に認められる。
ウ素酸塩で酸化する代りに水で培養された調製物と比較
して750nmでの消滅を測定する。この測定結果を第一図
に記載する。これから、過ヨウ素酸塩で酸化されたＳ−
層で著しいより一層多くの結合が行われることが明らか
に認められる。
例２ 担体の製造。
バチルスステアロサーモフィルス（Bacillus stearot
hermophilus）PV72（2.5g）の細胞を50mMトリスHCl−緩
衝液（pH7.2）中に懸濁し、約１分超音波で処理する。
２％トリトンＸ−100（12.5ml）の添加後、懸濁液を15
分50℃で培養する。この処理によって、細胞の細胞質が
分解され、Ｓ−層と基礎となるペプチドグリカン層との
間に残存する。細菌細胞の主な形に著しく対応するフラ
グメントが生じる（いわゆる“ゴースト”）。次いで2
0.000で遠心分離し、洗剤の除去のために３回水洗す
る。次いでペレットを5mM塩化マグネシウム溶液（25m
l）中に懸濁し、DNAse125μｇ及びRNAse500μｇを加
え、15分37℃で攪拌する。次いで３回水洗し、この際そ
の間に20.000gで遠心分離する。ペレットを0.1Mカコジ
ル酸塩緩衝液（pH7.2）中に懸濁し、水中にグルタルア
ルデヒドを有する50％溶液を４℃で加え、0.5％の最終
濃度に至らしめる。
hermophilus）PV72（2.5g）の細胞を50mMトリスHCl−緩
衝液（pH7.2）中に懸濁し、約１分超音波で処理する。
２％トリトンＸ−100（12.5ml）の添加後、懸濁液を15
分50℃で培養する。この処理によって、細胞の細胞質が
分解され、Ｓ−層と基礎となるペプチドグリカン層との
間に残存する。細菌細胞の主な形に著しく対応するフラ
グメントが生じる（いわゆる“ゴースト”）。次いで2
0.000で遠心分離し、洗剤の除去のために３回水洗す
る。次いでペレットを5mM塩化マグネシウム溶液（25m
l）中に懸濁し、DNAse125μｇ及びRNAse500μｇを加
え、15分37℃で攪拌する。次いで３回水洗し、この際そ
の間に20.000gで遠心分離する。ペレットを0.1Mカコジ
ル酸塩緩衝液（pH7.2）中に懸濁し、水中にグルタルア
ルデヒドを有する50％溶液を４℃で加え、0.5％の最終
濃度に至らしめる。
次いで懸濁液を４℃で２〜３時間強く攪拌し、遠心分
離し、水洗する。この処理によってアルデヒド官能基の
みと結合するグルタルアルデヒド残基が遊離結合部位と
して用いられるので、特異的結合部位の産出は無用であ
る。たとえばこれは例1Bに従って酸化によって生ぜしめ
られる。
離し、水洗する。この処理によってアルデヒド官能基の
みと結合するグルタルアルデヒド残基が遊離結合部位と
して用いられるので、特異的結合部位の産出は無用であ
る。たとえばこれは例1Bに従って酸化によって生ぜしめ
られる。
B.たん白質と得られたＳ−層との結合。
上述の様にして得られたＳ−層に、例1Cに於けると同
様に牛血清アルブミンを加え、結合するたん白質の量を
そこに記載した様に測定する。
様に牛血清アルブミンを加え、結合するたん白質の量を
そこに記載した様に測定する。
例３ 担体の製造。
クロストリディウムサーモヒドロスルフリクムL111−
69の細胞壁を最も外の細胞壁層（Ｓ−層）の安定化のた
めに、グルタルアルデヒド（0.1Mナトリウム−カコジル
酸塩緩衝液（pH7.2）中に0.5％）で20分20℃で処理す
る。反応を過剰のエタノールアミンの添加によって停止
する。細胞壁フラグメントを架橋反応の間懸濁して存在
させるか又は多孔性構造上に付与する（Ｓ−層−限外濾
過膜）ことができる。反応混合物の除去のために、細胞
壁フラグメントを蒸留水で洗浄する。
69の細胞壁を最も外の細胞壁層（Ｓ−層）の安定化のた
めに、グルタルアルデヒド（0.1Mナトリウム−カコジル
酸塩緩衝液（pH7.2）中に0.5％）で20分20℃で処理す
る。反応を過剰のエタノールアミンの添加によって停止
する。細胞壁フラグメントを架橋反応の間懸濁して存在
させるか又は多孔性構造上に付与する（Ｓ−層−限外濾
過膜）ことができる。反応混合物の除去のために、細胞
壁フラグメントを蒸留水で洗浄する。
B.SH−基含有配位子に対する結合部位の産出。
その後ペレット0.2gを蒸留水30ml中に懸濁し、Ｓ−層
の露出されたカルボキシル基の活性化のために、１−エ
チル−3,3′（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド（DEC）60mgをpH−値4.75の維持下に加える。次いで
過剰のヘキサメチレンジアミン（0.5g）を加え、pH−値
を60分の反応時間の間8.0に一定に保つ。反応を酢酸の
添加によって停止し、懸濁液を20.000gで遠心分離し、
ペレットを３回蒸留水で洗浄する。湿性ペレット100mg
をリン酸塩緩衝液（50mM,pH7.0）9ml中で懸濁し、メタ
−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミ
ドエステル（MBS）（50mg/mlテトラヒドロフラン）の溶
液1mlを加え、30分20℃で培養する。
の露出されたカルボキシル基の活性化のために、１−エ
チル−3,3′（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ
ド（DEC）60mgをpH−値4.75の維持下に加える。次いで
過剰のヘキサメチレンジアミン（0.5g）を加え、pH−値
を60分の反応時間の間8.0に一定に保つ。反応を酢酸の
添加によって停止し、懸濁液を20.000gで遠心分離し、
ペレットを３回蒸留水で洗浄する。湿性ペレット100mg
をリン酸塩緩衝液（50mM,pH7.0）9ml中で懸濁し、メタ
−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミ
ドエステル（MBS）（50mg/mlテトラヒドロフラン）の溶
液1mlを加え、30分20℃で培養する。
C.SH−基−含有たん白質と得られたＳ−層との結合。
20.000gで遠心分離後、ペレットを50mMリン酸塩緩衝
液（pH7.0）中に懸濁し、β−ガラクトシダーゼ20mgを
加え、２時間20℃で培養する。20.000gで遠心分離し、
リン酸塩緩衝液で再洗浄した後、たん白質マトリックス
と共有結合するβ−ガラクトシダーゼの活性を測定す
る。
液（pH7.0）中に懸濁し、β−ガラクトシダーゼ20mgを
加え、２時間20℃で培養する。20.000gで遠心分離し、
リン酸塩緩衝液で再洗浄した後、たん白質マトリックス
と共有結合するβ−ガラクトシダーゼの活性を測定す
る。
例４ 転化酵素の結合に、Ｓ−層−たん白質と共有結合する
炭水化物部分の隣接OH−基を利用する。
炭水化物部分の隣接OH−基を利用する。
細胞壁フラグメントに例３に於けるＡに記載した様
に、最の外の細胞表面の安定化のためにグルタルアルデ
ヒドを加える。
に、最の外の細胞表面の安定化のためにグルタルアルデ
ヒドを加える。
B.結合部位の産生。
細胞壁フラグメント100mgを無水テトラヒドロフラン
（THF）中に懸濁し、10分20℃で培養し、20.000gで遠心
分離し、次いでブロムシアン−溶液（テトラヒドロフラ
ン中に2.5％）10ml中に再懸濁する。２時間の培養後、
細胞壁フラグメントを20.000gで遠心して分離し、THFで
洗浄し、残存する試剤を除去する。
（THF）中に懸濁し、10分20℃で培養し、20.000gで遠心
分離し、次いでブロムシアン−溶液（テトラヒドロフラ
ン中に2.5％）10ml中に再懸濁する。２時間の培養後、
細胞壁フラグメントを20.000gで遠心して分離し、THFで
洗浄し、残存する試剤を除去する。
C.たん白質と処理されたＳ−層との結合。
ペレットを50mMリン酸塩緩衝液（pH8.0）10ml−これ
は転化酵素20mgを含有する−中に再懸濁し、18時間４℃
で培養する。20.000gで遠心分離した後、ペレットを２
回リン酸塩緩衝液で洗浄し、たん白質マトリックスと結
合する転化酵素の酵素活性を測定する。
は転化酵素20mgを含有する−中に再懸濁し、18時間４℃
で培養する。20.000gで遠心分離した後、ペレットを２
回リン酸塩緩衝液で洗浄し、たん白質マトリックスと結
合する転化酵素の酵素活性を測定する。
例５ クロストリディウムサーモヒドロスルフリクムL111p6
9の細胞壁フラグメントを例３に於けるＡに記載した様
にグルタルアルデヒドで固定する。
9の細胞壁フラグメントを例３に於けるＡに記載した様
にグルタルアルデヒドで固定する。
B.結合部位の産生。
細胞壁フラグメント0.1gを無水ジメチルホルムアルデ
ヒド（DMF）20ml中に懸濁し、その後EDe60ml及びＮ−ヒ
ドロキシサクシンイミド0.5gを加える。１時間の培養時
間後、懸濁液を20.000gで遠心分離し、２回DMFで洗浄す
る。
ヒド（DMF）20ml中に懸濁し、その後EDe60ml及びＮ−ヒ
ドロキシサクシンイミド0.5gを加える。１時間の培養時
間後、懸濁液を20.000gで遠心分離し、２回DMFで洗浄す
る。
C.たん白質と得られたＳ−層との結合。
得られたペレットを0.1M炭酸水素ナトリウム（pH8.
8）−これ中にデキストラナーゼ20mgを溶解する−中に
懸濁し、反応仕込物を18時間４℃で培養する。デキスト
ラナーゼがつく細胞壁フラグメントが20.000gで遠心分
離して得られ、２回蒸留水で洗浄する。次いでペレット
のデキストラナーゼ−活性を測定する。
8）−これ中にデキストラナーゼ20mgを溶解する−中に
懸濁し、反応仕込物を18時間４℃で培養する。デキスト
ラナーゼがつく細胞壁フラグメントが20.000gで遠心分
離して得られ、２回蒸留水で洗浄する。次いでペレット
のデキストラナーゼ−活性を測定する。
例６ 合成炭水化物−抗原の酸化されたＳ−層への結合 A.担体の製造及び B.結合部位の産生。
酸化された糖たん白質−Ｓ−層の製造を例１及びＡ及
びＢに於て記載した様に実施する。
びＢに於て記載した様に実施する。
C.炭水化物−抗原と担体との結合。
ポリアルデヒド−生成物を二糖類の３−（２−アミノ
エチル）チオプロピルグリコシドと共にシッフの塩基の
形成下に培養する。この段階を、アミノ基を含有するア
グリコンと結合する、すべての他の糖類を用いて実施す
ることもできる。
エチル）チオプロピルグリコシドと共にシッフの塩基の
形成下に培養する。この段階を、アミノ基を含有するア
グリコンと結合する、すべての他の糖類を用いて実施す
ることもできる。
αKDOP2 ４αKDOP（COH2CH2CH2SCH2CH2NH3） 〔２−ケト−３−デソキシ−オクトン酸から成る二
糖類の３−（２−アンモニノチエル）チオプロピルグル
コンド．〕 ３−（２−アミノエチルチオ）プロピルグルコシドをア
リルグリコシドから製造するための一般的製法。
糖類の３−（２−アンモニノチエル）チオプロピルグル
コンド．〕 ３−（２−アミノエチルチオ）プロピルグルコシドをア
リルグリコシドから製造するための一般的製法。
システアミンヒドロクロリド（15ミリ当量チオール
基）の溶液10ml中にアリルグリコシド（50mM）を有する
溶液を1.5時間室温で放置する。この反応時間はさまざ
まであってよい。次いで反応混合物をカチオン−交換体
カラム（たとえばRexyn101,アンモニウム形、200−400
メッシュ）を介して分離する。水、0.5Mアンモニア及び
1.0Mアンモニアで洗浄する。過剰のアリルグリコシドが
水性溶離液中に生じ、３−（２−アミノエチルチオ）プ
ロピルグリコシドは1.0Mアンモニアで生じる。夫々の生
成物を含有する分画を蒸発する。
基）の溶液10ml中にアリルグリコシド（50mM）を有する
溶液を1.5時間室温で放置する。この反応時間はさまざ
まであってよい。次いで反応混合物をカチオン−交換体
カラム（たとえばRexyn101,アンモニウム形、200−400
メッシュ）を介して分離する。水、0.5Mアンモニア及び
1.0Mアンモニアで洗浄する。過剰のアリルグリコシドが
水性溶離液中に生じ、３−（２−アミノエチルチオ）プ
ロピルグリコシドは1.0Mアンモニアで生じる。夫々の生
成物を含有する分画を蒸発する。
３−（２−アミノエチルチオ）プロピルグリコシドの
結合によって得られるシッフの塩基をそのまま抗体の結
合に使用する。これをフエリチン、ホースラディッシュ
ペルオキシダーゼ又は125Jで標識した場合、これを直ち
に測定することができる。しかし結合する抗体もいわゆ
る“サンドウィッチ”−法に従ってこれに合せて付加さ
れた抗体の結合によって測定することもできる。
結合によって得られるシッフの塩基をそのまま抗体の結
合に使用する。これをフエリチン、ホースラディッシュ
ペルオキシダーゼ又は125Jで標識した場合、これを直ち
に測定することができる。しかし結合する抗体もいわゆ
る“サンドウィッチ”−法に従ってこれに合せて付加さ
れた抗体の結合によって測定することもできる。
３−（２−アミノエチルチオ）プロピルグリコシドの
結合によって得られるシッフの塩基をナトリウムシアノ
ボルヒドリドとの反応によって第二アミンに変えること
ができる。
結合によって得られるシッフの塩基をナトリウムシアノ
ボルヒドリドとの反応によって第二アミンに変えること
ができる。
その時この結合は酸に安定である。
過ヨウ素酸塩で酸化した後、多糖類部分中の遊離アル
デヒド基の測定は、フエニルヒドラジン又は2,4−ジニ
トロフエニルヒドラジンを用いる慣用法に対応して行わ
れる。
デヒド基の測定は、フエニルヒドラジン又は2,4−ジニ
トロフエニルヒドラジンを用いる慣用法に対応して行わ
れる。
適当な炭水化物含有Ｓ−層を例１に於けるＡ及びＢに
記載した様に過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する。ヨウ素
酸塩及び過ヨウ素酸塩を水との透析によって除去する。
次いで対応するヒドラジン誘導体の溶液を10％酢酸中に
加え、全体を１時間反応させる。
記載した様に過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する。ヨウ素
酸塩及び過ヨウ素酸塩を水との透析によって除去する。
次いで対応するヒドラジン誘導体の溶液を10％酢酸中に
加え、全体を１時間反応させる。
次いで過剰の試剤を透析によって除去し、形成された
ヒドラゾン基の量を比色により測定する。
ヒドラゾン基の量を比色により測定する。
この方法を、遊離の残存基の測定のためにアミノ基含
有ハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質の
結合後に使用することもできる。
有ハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質の
結合後に使用することもできる。
本発明による医薬用組成物は、特に免疫抗原として高
い抗体力価を得るのに適する。免疫原性物質として抗体
を使用する場合、この様な抗イディオタイプ抗体を得る
ことができる。更にこの組成物は組合せ組織免疫抗原−
ブースター（同一のハプテン及び（又は）免疫原性又は
免疫刺激性物質、異なる株から由来する二つのＳ−層−
糖たん白質−種に合体）として有利である。この組成物
を免疫吸着剤としてたとえば診断装置又は所望されない
抗体の体外除去（血液洗浄）に使用することができる。
い抗体力価を得るのに適する。免疫原性物質として抗体
を使用する場合、この様な抗イディオタイプ抗体を得る
ことができる。更にこの組成物は組合せ組織免疫抗原−
ブースター（同一のハプテン及び（又は）免疫原性又は
免疫刺激性物質、異なる株から由来する二つのＳ−層−
糖たん白質−種に合体）として有利である。この組成物
を免疫吸着剤としてたとえば診断装置又は所望されない
抗体の体外除去（血液洗浄）に使用することができる。
第一図は、本発明による、たん白質と得られたＳ−層と
の結合状態を示すグラフである。
の結合状態を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 39/39 Ａ６１Ｋ 39/39
Claims (18)
- 【請求項１】たん白質担体を結晶性又はパラ結晶性の互
いに隣接する、場合により相互に共有架橋されたたん白
質分子又はたん白質含有分子によって形成することを特
徴とする、ハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激
性物質とたん白質担体とが結合する医薬用組成物。 - 【請求項２】結晶性又はパラ結晶性の互に隣接するたん
白質含有分子が、糖たん白質である、請求項１記載の医
薬用組成物。 - 【請求項３】結晶性の互に隣接する分子が、１種又はそ
れ以上の微生物細胞壁層から由来する、請求項１又は２
記載の医薬用組成物。 - 【請求項４】結晶性又はパラ結晶性たん白質担体に、付
加的に他の細胞壁成分が付着する、請求項１ないし３の
いずれかに記載した医薬用組成物。 - 【請求項５】微生物細胞壁のフラグメントには、ハプテ
ン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質がついてい
る、請求項３又は４記載の医薬用組成物。 - 【請求項６】ハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺
激性物質が、担体のたん白質部分と結合している、請求
項１ないし５のいずれかに記載した医薬用組成物。 - 【請求項７】ハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺
激性物質が、糖たん白質の炭水化物と結合している、請
求項２ないし５のいずれかに記載した医薬用組成物。 - 【請求項８】ハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺
激性物質が夫々の担体分子と分子間を介して結合してい
る、請求項６又は７記載の医薬用組成物。 - 【請求項９】種々の担体及び（又は）種々のハプテン及
び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質がついている担
体を一緒にする、請求項１ないし８のいずれかに記載し
た医薬用組成物。 - 【請求項１０】ハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫
刺激性物質が結合される、たん白質分子又はたん白質含
有分子の基をハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺
激物質の添加の前に活性化する、請求項１ないし９のい
ずれかに記載した医薬用組成物を製造する方法。 - 【請求項１１】糖たん白質の炭化水素部分の結合部位
が、たとえば過ヨウ素酸塩での酸化によって生じる、請
求項10記載の方法。 - 【請求項１２】ハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫
刺激性物質のたん白質分子への結合を、たん白質分子を
共有架橋する剤、たとえばグルタルアルデヒドによって
生じせしめる、請求項10記載の方法。 - 【請求項１３】結合部位の形成を活性基の導入によって
行う、請求項12記載の方法。 - 【請求項１４】ハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫
刺激性物質を、たん白質担体のカルボキシル基とアミド
の様に結合する、請求項10記載の方法。 - 【請求項１５】ハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫
刺激性物質の結合をシッフの塩基の形で行い、この際場
合によりシッフの塩基を還元して第二アミンとなす、請
求項11記載の方法。 - 【請求項１６】ハプテンの及び（又は）免疫原性又は免
疫刺激性物質の結合部位を活性化し、ハプテン及び（又
は）免疫原性又は免疫刺激性物質をこの活性された結合
部位を介してたん白質担体のNH2−基と結合する、請求
項１ないし９のいずれかに記載した医薬用組成物の生成
方法。 - 【請求項１７】２つの末端が活性された結合部位を有す
る分子間の一方の末端で担体が結合され、その後次いで
ハプテン及び（又は）免疫原性又は免疫刺激性物質が分
子間のもう一方の末端で結合される、請求項８記載の医
薬用組成物を生成する方法。 - 【請求項１８】種々の担体及び（又は）種々のハプテン
及び（又は）免疫性又は免疫刺激性物質が結合する担体
を補助層上に施し、その層を担体の架橋後に場合により
除去する、請求項９記載の医薬用組成物を生成する方
法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| DE19873727987 DE3727987A1 (de) | 1987-08-21 | 1987-08-21 | Pharmazeutische struktur |
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01207245A JPH01207245A (ja) | 1989-08-21 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Country Status (7)
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| JP (1) | JP2708487B2 (ja) |
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| AU (1) | AU627154B2 (ja) |
| DE (2) | DE3727987A1 (ja) |
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| DE4115038A1 (de) * | 1991-05-08 | 1992-11-12 | Genentech Inc | Neue konjugate, bestehend aus einem glykoprotein und einer nukleinsaeure-bindenden substanz |
| JP2008523116A (ja) * | 2004-12-14 | 2008-07-03 | アルカベロ アクチェセルスカプ | 異種タンパク質化合物をディスプレイするバクテリア細胞を含んでなる医薬組成物 |
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| EP0037388B1 (fr) * | 1980-03-31 | 1984-12-12 | Institut International De Pathologie Cellulaire Et Moleculaire | Formes pharmaceutiques, leur préparation et les compositions qui les contiennent |
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| AT373278B (de) * | 1982-03-23 | 1984-01-10 | Inst Po Mikrobiologia | Verfahren zur immobilisierung von mikrobenzellen mit einer glucose-isomerase-aktivitaet |
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| CA1267087A (en) * | 1985-02-14 | 1990-03-27 | Nicolaas Visser | Synthetic immunogen |
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