JPH0343280B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、ヒトのＴ−抗原決定基を有する人工
抗原に関する。 50年以上前にトムゼン（Thomsen）注１） はヒ
トの赤血球細胞を試験管内でトランスフオーメー
シヨンさせて通常のABO適合血清によつて凝集
するようにできることを観察した。フリーデンラ
イヒ（Friedenreich）２） は広範な研究の後トム
ゼンの物質が、天然の抗原決定基を分解していわ
ゆるＴレセプタ、すなわちヒト血清中に一般に産
生する凝集素によつて結合される構造体を遊離す
る細菌酵素であると結論した。現在ではこのトラ
ンスフオーメーシヨンに関係する酵素がノイラミ
ニダーゼであり、これが特定のシアログリコプロ
テイン３） からＮ−アセチル−α−Ｄ−ノイラミ
ニン酸残基（α−シアロシド）を除去することに
よりＴ−決定基を露出させたことが確証されてい
る。 1966年この決定基の構造がキム（Kim）およ
びウーレンブルツク（Uhlenbruck）４） によつて
糖蛋白質中でトレオニンまたはセリン残基とグリ
コシド結合したジサツカリドβ Ｄ Gal（１→
３）＆Ｄ Gal NAcであることが示された。現
在ではＴ−決定基が広範囲の糖蛋白質５，６） 中
に産生することが知られている。 この構造体が腫瘍を伴う抗原中に産生するとの
最近の発見によりこの抗原および相応する抗体の
研究に関心の復活が見られる。特に種々の研究者
によつてＴ−抗原を動物およびヒト由来７〜10）
の腫瘍細胞上に示すことができること；Ｔ−抗原
に対する即時型および遅延型過敏症反応を特定の
形状のガン11） を有する患者で示すことができる
こと、かつ血清抗−Ｔ濃度の変化が若干のガン11〜
12） に関して診断学的に重要であり得ることが示
された。 これらの観察の全てが明らかに重要な臨床的
な、潜在的および顕在的両方の合意を有してい
る。しかし臨床的適用を開発する、１つの大きな
困難は本発明以前にはキー成分のＴ−抗原が主と
して酵素処理されたヒト赤血球膜13） の困難な抽
出を通して天然源からしか入手し得ないことであ
つた。この方法は比較的少量の物質しか得られ
ず、この物質はその由来から精製および特性づけ
るのが本来困難である。その上に例えばＴ−抗原
物質をヒトに注射する遅延型過敏症反応のような
適用についてはヒトの血液生成物に由来する、か
かる物質は肝炎を伝搬する危険を有する。 Ｔ−抗原決定基の末端ジサツカリドを含有する
化合物Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→
３）−Ｏ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−α
−Ｄ−ガラクトピラノシル）−Ｎ−トシル−Ｌ−
セリンの合成が報告された14） 。しかしこの化合
物がヒトのＴ−抗原決定基としての有用性を持つ
ことは立証されなかつた。該化合物を抗原形成支
持体に結合し得たかどうか、および更に形成され
たとして得られる結合体が人工Ｔ−抗原として機
能したかどうかを明らかにするのは容易ではな
い。実際にはアグリコン部分に存在する非天然性
の、高度に抗原性のＮ−トシル基がこの化合物か
らの抗原を免疫化学的に天然のＴ−抗原とは似て
いないものにすると予想された。 米国特許第4137401号明細書（レミユー
（Lemieux）、バンドル（Bundle）およびベーカ
ー（Baker））にはアルドース部分にＯ−β−グ
リコシド結合した側鎖が記載されている。この側
鎖は構造式：Ｏ−Ｒ−COR″（ここでＲはＣ−原
子数３〜17を有する脂肪族炭化水素部分であり、
かつR″はＨ、OH、NH₂、NHNH₂、N₃または
低級アルコキシ基である）を有している。この側
鎖は炭化水素抗原決定基を支持分子または固体の
支持体に結合して人工抗原を作ることができる。
該側鎖をアルドース部分に結合することに関する
文献に明示されている反応条件はβ−Ｄ−アノマ
ーのグリコシド結合を作るものであるが優れてい
ると認められる。α−Ｄ−アノマーの側鎖がＴ−
抗原決定基では望ましい。 米国特許第4195174号明細書（３月25日、1980
年）、レミユー（Lemieux）およびラトクリフ
（Ratcliffe））には、Ｏ−アシル化２−アジド−
２−デオキシグリコシルハライドの合成法が記載
されている。これらのハライドはＯ−アシル化−
２−アジド−２−デオキシグリコシドに変換する
ことができる。特に該特許には３，４，６−トリ
−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−β
−Ｄ−ガラクトピラノシルクロリドの合成および
これをアグリコン側鎖を含有するアルコールと反
応させて３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−
アジド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノ
シドを形成することが報告されている。 Ｔ−抗原物質を得る問題を解決するため、本発
明によればＴ−抗原決定基の化学的合成に成功
し、該決定基を有する人工Ｔ−抗原を大量に製造
する方法が提供される。本発明により合成された
人工Ｔ−抗原は、ガンの存在を診断するための遅
延型過敏症反応（DTH）を誘発し得るため特に
重要であり、免疫抗原が従来の天然抗原に対する
ハプテン特異的DTHが人工抗原にも応答するこ
とがはじめて見出された。 本発明で使用されるＴ−抗原決定基は次のよう
にして製造される： ３，４，６−トリ−Ｏ−アシル−２−アジド−
２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロ
ミドと一般式： HO（CH₂）_oCOR 〔式中ｎは３〜19であり、かつＲはアルコキシ
またはアリールオキシ保護基である〕のモノヒド
ロキシカルボキシレートとをR′₄NBr（ここで
R′は低級アルキル基である）の存在で好適な溶
剤中で反応させる。次いで反応生成物を任意の順
序で還元およびＮ−アセチル化してアジド基をア
セトアミド基に変え、かつ脱Ｏ−アシル化して構
造式： を有するＯ−α−グリコシドを製造する。 もう１つの方法によれば、Ｏ−アシル化２−ア
ジド−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ルクロリドと一般式： HO（CH₂）_oCOR 〔式中ｎは３〜19であり、かつＲはアルコキシ
またはアリールオキシ保護基である〕のモノヒド
ロキシカルボキシレートとを促進剤シアン化水銀
の存在で好適な溶剤中で反応させることにより前
記のＯ−α−グリコシドを形成する。次いで反応
生成物を任意の順序で還元かつＮ−アセチル化し
てアジド基をアセトアミド基に変え、かつ脱Ｏ−
アシル化して前記のＯ−α−グリコシドを製造す
る。 次いでＯ−α−グリコシドを４，６−Ｏ−位で
選択的に保護し、かつ２，３，４，６−テトラ−
Ｏ−アシル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルハライ
ドと促進剤の存在で縮合させ、保護基脱離の後、
構造式： を有するＴ−抗原決定ハプテンを形成する。 本発明によるＴ抗原決定基を有する人口抗原
は、式 ［式中ｎは３〜19であり、かつＲはアミノ基に
よりアミド結合せる可溶性の、アミン化されたか
またはアミンを含有する抗原形成支持体残基を表
わす］で示される構造を有する。 望ましいＴ抗原決定基は８−メトキシカルボニ
ルオクチル−２−アセトアミド−２−デオキシ−
３−０−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−α−Ｄ
−ガラクトピラノシドである。 支持体はアルブミン、ヘモグロビンおよびイム
ノグロブリンＧの群から、とくにウシアルブミ
ン、ウマヘモグロビン、ヒト血清アルブミンおよ
びヒトイムノグロブミンＧの群から選択され、殊
にヒト血清アルブミンであるのが望ましい。 従つて、優れた人工抗原は、ヒト血清アルブミ
ンに結合した８−メトキシカルボニルオクチル−
２−アセトアミド−２−デオキシ−３−０−（β
−Ｄ−ガラクトピラノシル）−α−Ｄ−ガラクト
ピラノシドからなる。この場合、支持体に結合し
たＴ−抗原決定基の量は、望ましくは約７〜16当
量／モルである。 本発明による人工抗原は遅延型過敏症反応を確
認するのに利用することが可能であり、該方法は
本発明によるＴ−抗原決定基を人工抗原をヒトの
身体に皮内注射し、次いでヒトの身体による遅延
型過敏症反応を観察することより成る。 参考例 下記一般式で示されるＴ−抗原決定ハプテン８
−メトキシカルボニルオクチル−２−アセトア
ミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（β−Ｄ−ガラ
クトピラノシル）−α−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド(6)の合成 ベンゼン（２ml）中の２，３，５，６−テトラ
−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブ
ロミド（0.315ｇ）の溶液を化合物(4) （0.30ｇ）、シアン化水銀（0.18ｇ）、無水硫酸
カルシウム（0.97ｇ）および無水ベンゼン／ニト
ロメタン（１：1v／ｖ）（50ml）の混合物に添加
した。この混合物を50゜で３時間撹拌し、この時
点で更にブロミド（0.05ｇ）を添加し、かつ反応
を付加的に１時間続けた。固体を除去し、かつ濾
液をジクロルメタン（100ml）で希釈し、水（50
ml×２）で洗い、かつ乾かした。溶剤を除去する
と、フオーム状生成物(5) ８−メトキシカルボニルオクチル−２−アセト
アミド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキ
シ−３−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−ア
セチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−α−Ｄ
−ガラクトピラノシド（0.50ｇ）が残り、これは
結晶しなかつた。この物質をジクロルメタン（５
ml）に溶かし、かつ90％−水性トリフルオル酢酸
（１ml）を加えた（水性酢酸または水素化を４−
および６−ヒドロキシル基の脱保護基に使用する
こともできる。室温で２分後トルエン（５ml）を
加え、次いで溶剤を30゜で真空下に除いた。残渣
をシリカゲル（40ｇ）のカラム（20×1.5cm）に
加え、ベンゼン／酢酸エチル／エタノール（３：
３：１）で溶離した。主フラクシヨンはシロツプ
状物（0.30ｇ）〔¹³Cnmr（CDCl₃）：97.7（Ｃ−１）、
101.7（Ｃ−1′）〕を与え、これをメタノール中の
接触的ナトリウムメトキシドで脱Ｏ−アセチル化
し、引続きナトリウムイオンを酸樹脂で除いた。
濾過および蒸発によりフオーム状物（0.175ｇ、
収率51％）が得られ、これはイソプロパノール／
水酸化アンモニウム／水（ｖ／ｖ）（７：１：２）
により展開したTLCによれば１つの均一なスポ
ツトであり、かつｎ−ブタノール／エタノールか
ら晶出させて純粋な８−メトキシカルボニルオク
チル２−アセトアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−
（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−α−Ｄ−ガラク
トピラノシド(6)が得られた。融点：208〜210゜。
〔α〕²⁵ _D＋92.7゜（ｃ、1.05、水）；¹Hnmr（D₂O）〓
：
4.91（ｄ、1H、J₁.₂ 3.5Hz、Ｈ−１）、4.49（ｄ、
1H、J₁′_.2′ 6.25Hz、Ｈ−1′）、2.05（ｓ、CH₂）。
¹³Cnmr（CD₃OD）δ：98.1（Ｃ−１）、105.7（Ｃ−
1′）。 分 析 C₂₄H₄₃N₁O₁₃・H₂O： 計算値 C50.42；H7.93；N2.45。 実測値 C50.62；H8.00；N2.53 例 １ 化合物(6)によるヒト抗−Ｔの抑制 ヒト抗−Ｔ（滴定1/32）による、ノイラミダー
ゼで処理されたＯ−赤血球20）の凝集は濃度１
mg／mlの化合物(6)により完全に抑制された。それ
に対してメチルβ−Ｄ−ガラクトピラノシドおよ
び一般式： で示される８−メトキシカルボニルオクチル−２
−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラク
トピラノシド(3)はこの濃度で抑制を示さなかつ
た。 人工抗原の製造に関する化合物(6)の有用性はこ
のジサツカリドをカルボニル基のアミド結合を介
して可溶性支持体に結合することにより示され
た。参考例２で化合物(6)をヒドラジンヒドレート
で処理してアシルヒドラジドに変え、次いで前記
のアシルアジドカツプリング法19） により可溶性
支持体に結合して人工Ｔ−抗原が得られた。好適
な抗原形成支持分子は当業者によつて可溶性、高
分子量のアミン化された、または天然のアミン含
有化合物であると認められる。支持体の例はたん
白質、糖たん白質およびポリサツカリドである。 参考例 ２ 下記一般式で示される８−ヒドラジノカルボニ
ルオクチル−２−アセトアミド−２−デオキシ
−３−Ｏ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−α
−Ｄ−ガラクトピラノシド(7)の製造 化合物(6)をヒドラジンヒドレートに溶かし、か
つ２時間放置した。溶剤をブタノール／水（１：
1v／ｖ）（５ml×３）とともに共蒸発させて除去
して、下記の人工抗原の製造に使用されるヒドラ
ジド(7)が得られた。 例 ２ ８−ヒドラジノカルボニルオクチル−２−アセ
トアミド−２−デオキシ−３−Ｏ（β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル−α−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド(7)からの人工抗原の製造 ジメチルホルムアミド（1.5ml）中の化合物(7)
（0.109ｇ）の懸濁液を不活性ガス雰囲気下に約−
20℃に冷却し、これに塩酸（186μ）及び硝酸
ｔ−ブチル（50μ）中の4.5Nジオキサンを加え
た。生じた溶液を２時間冷却下に撹拌した。次
に、この反応をジメチルホルムアミド（0.408ml）
中に溶かしたスルフアミン酸（0.01ｇ）を添加す
ることにより終わらせ、撹拌及び冷却を更に15分
間継続した。次に、この混合物をヒト血清アルブ
ミン（HSA）及び0.2N Ｎ−エチルジエタノール
アミン水溶液の溶液（36ml、PH9.03）に直接加
え、０〜４℃に冷却した。20時間後、この混合物
を水に対して透析し、塩及び未反応試薬を除去
し、人工抗原を得るために凍結乾燥させる。カル
ボヒドレート測定はHSA1分子あたりハプテン基
13の混入を示した。 混入の値は使用するHSAの量に対して使用す
る化合物(7)の量を減少又は増加させることにより
６〜30の範囲で変化させることができる。有利な
ハプテン混入値は約７〜16当量／モルの範囲であ
る。硼酸塩緩衝剤のような他の緩衝剤を使用する
こともできるし、他の支持分子を使用することも
できる。 製造された抗原の例を次の表に示す：

【表】 参考例 ３ ８−ヒドロキシカルボニルオクチル−２−アセ
トアミド−２−デオキシ−３−Ｏ−（β−Ｄ−
ガラクトピラノシル）−α−Ｄ−ガラクトピラ
ノシド(8)の製造 エステル化合物(6)（0.17ｇ）を0.1N NaOH（４
ml）を用いて室温で２時間処理した。次いでこの
溶液を酸性イオン交換樹脂で脱イオンし、溶剤を
除去すると表題化合物の酸(8)が得られた。 例 ２ Ｔ−ハプテン化細胞の製造 包装された赤血球細胞（OLe^a+b-型）１mlを３
回少量の緩衝液（Ｎ−エチルジエタノールアミン
0.01モル、NaCl0.15モル、PH6.0）で洗浄した。
これら洗浄した細胞のmlの3/4を同じ緩衝液1.75
ml中に懸濁させると、30％懸濁液が得られるか
ら、これを12×75mm試験管中で冷却した。 酸誘導体(8)（５mg）及び１−エチル−３−
（3′−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミ
ド、塩酸塩（３mg）0.15M NaCl150μ中に溶か
した。この溶液を室温で５分間保持し、次いで赤
血球細胞懸濁液に４℃で加えた。この反応混合物
をおだやかな揺動下に２時間４℃に恒温保持し、
試薬を燐酸塩緩衝生理含塩水５倍容量で５回洗浄
することにより除却した。 ハプテン化はヒト抗−Ｔ抗体により処理された
赤血球の凝集反応を示す血清学的試験により確認
された。 過去においては免疫応答は２つの独立した型を
有するものとみなされていた、１方は抗体が介在
する応答であり、ここでは病原がリンパ球Ｂによ
つて合成された特異的な抗体分子により効力を失
ない、もう１方は胸腺に由来する（Ｔ）リンパ球
の保護機能を基礎とする、細胞が介在する免疫性
である。しかし現在では、免疫系のこれらの部分
間に多くの相互作用が存在し、かつ抗原の攻撃に
対する固体の適合反応が細胞及び可溶性細胞生成
物間の複雑な相互作用を包含するということが明
らかになつたので、前記の考え方はあまりにも単
純化されすぎていることは公知である。現在この
相互作用を調節するフアクターに関する理解は全
く限られている。遅延型過敏症反応、すなわち
“細胞介在”応答に関しては、所与のハプテンの
例えば支持体型及びハプテン混入度のような多く
のフアクターがハプテン特異性DTH反応を起こ
すことを決定はするが22） 、この事に関して従来
十分に解明されていないということは公知であ
る。 Ｔ抗原の場合、すべての健康な個体はその血清
中に抗−Ｔ凝集素を有しているが、一般に彼らは
Ｔ抗原の皮内注射11） に全くDTH反応を起こさな
い。それに対して、一定の型の癌、特に肺癌はＴ
抗原に対してDTH反応を示す11） 。こうして天然
Ｔ抗原へのこの反応は癌の存在を強力に指示し、
診断上非常に重要である。癌患者における本発明
の生成物、人工Ｔ抗原、Ｔ−ESAへのDTH反応
について以下に詳説する。 参考例 ４ 転移性肺癌の患者におけるＴ−HSA人工抗原
に対する遅延型過敏腫DTHのデモンストレー
シヨン 患者：実験グループ（23人）は現在W.W.
Cross Cancer Institute（カナダ・アルバータ
州・エドモントン）で治療を受けている術後第４
期の転移性肺癌患者からなる。この実験に加わる
ことを志願したすべての患者から同意は得られ
た。 抗原：ヒト血清アルブミン（HSA）とＴ−ハ
プテンとの結合は前記無菌条件下に製造した。人
体に使用するために、抗原形成支持体分子は非毒
性であるべきである。４種の異なる混入度ｎ＝
７、12、14及び22を試験した。使用したHSAは
米国フツト・アンド・ドラツグ・アドミニストレ
イシヨン（U.S.Food and Drug
Administration）の要求に従つてヒト血漿のコ
ーン分割法により製造した。同様にすべての患者
にハプテンを反応混合物中に使用しないというこ
と以外はＴ−HSA抗原の製造のために記載した
と同じように加工されたHSAをも投与した。 抗原の投与：Ｔ−HSA及びHSAを上腕の異な
つた位置に総合量生理食塩水0.1mlで皮内注射し
た。抗原の濃度は100及び200mg／mlであつた（注
射あたり抗原10及び20mg） 遅延型過敏症反応：陽性反応を24時間後に硬化
をともなつているか又は硬化をともなわない直径
５mmより大きい紅斑とする。疑問のある場合に
は、重点を硬化の度合いに置く。Ｔ−HSAへの
陽性の応答は８〜20mmで変化する。TT−HSAに
対して陽性の場合、血管周囲リンパ球浸潤を示す
スキン・パンチ（skin punch）生検により確認
された。 結果：試験した患者においてもだれもHSAに
陽性を示さず16人（70％）がＴ−HSAにDTH反
応を示した（ｎ＝12又は14）。陽性反応を示した
患者に関しては、応答は高抗原濃度でより大であ
つた。DTH応答はハプテン混入度によつても影
響され、最も大きな応答は“ｎ”の値が12〜14の
間である抗原に対してである。Ｔ−HSAに反応
しないこれらの患者は最近種々の治療プログラム
を受けており（３ケ月以内）、これによつて多分
Ｔ抗原に対するアネルギーとなつたということが
わかつた。このような患者は後で、この実験から
除外した。 本発明はその有利な実施形式に関して記載して
おり、本発明の思想及び範囲内で他の実施形式も
可能である。 注 １ O.Thomsen著、“Z.Immun.−Forsch.”52
（1927）85−107頁。 ２ V.Friedenreich著，“The Thomsen
Hemagglutination Phenmenon，“Levin＆
Munksgaard，Copenhagen（1930）。 ３ C.M.Chu著，“Nature，”161（1948）606−
607頁。 ４ Z.KimおよびG.Uhlenbruck共著，“Z.
Immun.−Forsch.”，130（1966）88−99頁。 ５ R.R.RaceおよびR.Sanger共著，“Blood
Groups in Men”，第６版，Blackwell
Scientific Publications，Oxford（1978）486−
487頁。 ６ P.VaithおよびG.Uhlenbruck共著，“Z.
Immun.−Forsch.”，154（1978）１−14頁。 ７ P.J.Klein，R.A.Newman，P.Muller，G.
Uhlenbruck，H.E.Schaefer，K.J.Lennartzお
よびR.Fischer共著，“Klin，Wschr.”，56
（1978）761−765頁。 ８ D.R.Howard，“Vox.Sang”，37（1979）107
−110頁。 ９ R.A.Newman，P.J.KleinおよびP.S.
Rudland共著，“JNCI”63、（1979）1339−
1346頁。 10 J.H.Anslin，Jr.M.P.LernerおよびR.E.
Nordquist，“Nature”，269（1977）254−255
頁。 11 G.F.Springer，P.R.Desai，M.S.Murthy，
H.TegtmeyerおよびE.F.Sanlon共著，“Prog.
Allergy”，26（1979）42−96および該論文中
の参考文献。 12 Y.D.Kim.米国特許第4241044号明細書。 13 G.F.SpringerおよびP.R.Desai共著，
“Carbohyd.Res.”，40（1975）183−192頁。 14 R.KaifuおよびT.Osawa，“Carbohyd.
Res.”，69（1979）79−88頁。 19 R.U.Lemieux，D.R.BundleおよびD.A.
Baker共著，“J.Amer.CHem.Soc.”97（1975）
4076−4083頁。 20 H.H.Sunson，F.StrattonおよびG.W.
Mnllard共著，“Brit.J.Haematol.”，18
（1970）309−316頁。 22 V.E.JonesおよびS.Leskowitz共著，
“Nature”，207（1965）596−597頁。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 構造式： ［式中ｎは３〜19であり、かつＲはアミノ基に
   よりアミド結合せる可溶性の、アミン化されたか
   またはアミンを含有する抗原形成支持体残基を表
   わす］で示される、Ｔ−抗原決定基を有する人工
   抗原。 ２ Ｔ抗原決定基が８−メトキシカルボニルオク
   チル−２−アセトアミド−２−デオキシ−３−０
   −（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−α−Ｄ−ガラ
   クトピラノシドからなる、特許請求の範囲第１項
   記載の人工抗原。 ３ 支持体がアルブミン、ヘモグロビンおよびイ
   ムノグロブリンＧの群から選択される、特許請求
   の範囲第１項または第２項記載の人工抗原。 ４ 支持体がウシアルブミン、ウマヘモグロビ
   ン、ヒト血清アルブミンおよびヒトイムノグロブ
   リンＧの群から選択される、特許請求の範囲第１
   項または第２項記載の人工抗原。 ５ 支持体がヒト血清アルブミンである、特許請
   求の範囲第１項または第２項記載の人工抗原。 ６ 支持体がヒト血清アルブミンであり、かつ支
   持体に結合されたヒトのＴ抗原決定ハプテンの量
   が７〜16当量／モルである、特許請求の範囲第１
   項または第２項記載の人工抗原。