JP2009541259A - 糖抗原に対する特異抗体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1) 高分子足場のいずれかを適切な緩衝水性溶液に溶解し、
2) 工程(1)の溶液に、縮合剤、および適切な量のTnまたはTF抗原(これらはそれぞれ縮合剤の存在下で適切なリンカーと結合していることがある)を加え、
3) 工程(2)から得られる溶液を適切な時間混合および撹拌して得られた生成物を回収する。
1) BALB/cマウスを免疫し、
2) 動物を屠殺し、脾臓を切除し、
3) 体細胞ハイブリダイゼーション(融合)により抗体産生細胞を不死化し、
4) HAT培養液中でハイブリッド細胞を選択し、
5) ELISAアッセイによりスクリーニングして最も特異的なクローンを得、次いで
6) サブクローニングする。
1) 適切な緩衝水性溶液中に高分子足場のいずれかを溶解し、
2) 適切な縮合剤の存在下で、工程(1)の溶液に、適切な量のビオチンまたはビオチン化剤を加え、
3) 工程(2)から得られる溶液に、適切な縮合剤、および適切な量の選択されたTnまたはTF抗原(それらはそれぞれ適切なリンカーと結合していることがある)を加え、
4) 工程(3)から得られる溶液を適切な時間混合および撹拌して得られる生成物を回収する。
実験の項
材料と方法
キャピラリー電気泳動
HPLC-UV
HPLC-MS
cBSA-Tnコンジュゲート化合物の製造
Tn抗原(1mg)およびcBSA(2mg)をMES緩衝液含有溶液(0.2M)、pH6に溶解し、EDCおよびNHSをわずかに化学量論的過剰で加え、次いで混合物を2時間撹拌した。次に、溶液を透析し、凍結乾燥し、標記化合物を回収した。
-アルギネート-Tnコンジュゲート化合物;
-デキストラン-Tnコンジュゲート化合物;
-cBSA-TFコンジュゲート化合物;
-アルギネート-TFコンジュゲート化合物;
-デキストラン-TFコンジュゲート化合物。
実施例2
ビオチン化アルギネート-Tnコンジュゲート化合物の製造
1) アルギネートのビオチン化
2) ビオチン化アルギネートのTnによる誘導体化
実施例3
実施例1のコンジュゲート化合物の置換度の検出
実施例4
実施例2のコンジュゲート化合物の置換度の測定
実施例5
抗Tnおよび抗TF抗体の製造および選択
1) 2匹の8週齢の雌BALB/cマウスにRibi’s(MPL(登録商標)+TDM Adijuvant System;Sigma)で適切にエマルジョン化したTn-cBSA 200μgを3回腹腔内注射して免疫し、免疫応答を観察した。次に、PBSで適切に希釈した選択したコンジュゲート化合物20μgをさらに3回静脈内注射した。
2) 動物を屠殺し、脾臓を切除した。
3) 抗体産生細胞を体細胞ハイブリダイゼーション(融合)により不死化した。
4) ハイブリッド細胞をHAT培養液で選択した。
5) ELISA試験を行って最も特異的なクローンを得た。
6) サブクローニングを行った。
実施例6
抗体の選択
- マイクロタイタープレートのウェルを炭酸緩衝液(100mM、pH9,6)中の10μg/mlストレプトアビジンで4℃、一夜コートした。
- PBSで洗浄した後、ウェルに100μg/mlのTn-ビオチン化アルギネートコンジュゲートを満たし、37℃で1時間インキュベートした。
- PBSによる洗浄を室温で3回行った。
- PBSオボアルブミン1%溶液で37℃、1時間ブロックした。
- PBSによる洗浄を室温で3回行った。
- マウス血清ハイブリドーマ上清をウェルに加え、37℃で1時間インキュベートした。
- PBS Tween0,02%溶液で3回洗浄した。
- 抗マウスIgG-HRP結合第二抗体を加え、室温で1時間インキュベートした。
- PBS Tween0,02%溶液で、室温で3回洗浄した。
- 0,5mg/ml ABTSパーオキシダーゼ基質を加えた。
- ELISAプレート上に結合した抗原を405nmで比色定量した。
Claims (20)
- カチオン化ウシ血清アルブミン(cBSA)、アルギネート、またはデキストランからなる群から選ばれる高分子足場と直接またはあらゆる適切なリンカーを介して結合している複数のTnまたはTF抗原を含む化合物。
- 高分子足場がcBSAである請求項1記載の化合物。
- 抗原が高分子足場と直接連結している請求項1記載の化合物。
- 抗原があらゆる適切なリンカーを介して高分子足場と結合している請求項1記載の化合物。
- リンカーが直鎖または分岐鎖の合成または天然アミノ酸およびその誘導体、適切なペプチド、および炭化水素からなる群から選ばれる請求項4記載の化合物。
- 該アミノ酸または炭化水素リンカーが2〜10個の炭素原子を含む請求項5記載の化合物。
- 複数のTn抗原がcBSAと直接結合している請求項1記載の化合物。
- 医薬として用いるための請求項1〜7のいずれかに記載の化合物。
- 腫瘍に対するワクチンの製造における請求項8記載の使用。
- 有効量の請求項1〜7に記載のいずれかの化合物を適切な溶媒および1またはそれ以上の医薬的に許容される賦形剤とともに含む医薬組成物。
- 有効量の請求項1〜7の化合物またはそのあらゆる医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む腫瘍の治療方法。
- 1) 高分子足場のいずれかを適切な緩衝水性溶液に溶解し、
2) 工程(1)の溶液に、縮合剤ならびに適切な量のTnまたはTF抗原(これらはそれぞれ縮合剤の存在下で適切なリンカーと結合していることがある)を加え、
3) 工程(2)から得られる溶液を適切な時間混合および撹拌して得られた生成物を回収する
工程を含む、請求項1〜7のいずれかに記載の化合物の製造方法。 - 1) BALB/cマウスを免疫し、
2) 動物を屠殺し、脾臓を切除し、
3) 体細胞ハイブリダイゼーション(融合)により抗体産生細胞を不死化し、
4) HAT培養液中でハイブリッド細胞を選択し、
5) ELISAアッセイによりスクリーニングして最も特異的なクローンを得、
6) サブクローニングする
(ここで、工程(1)は請求項1〜7のいずれかに記載の化合物を注射することを含み、該抗原はそれぞれTnまたはTFである。)
工程を含む抗Tn抗体または抗TF抗体の製造方法。 - ビオチン化アルギネートと直接またはあらゆる適切なリンカーを介して結合している複数のTnまたはTF抗原を含む化合物。
- ビオチン化アルギネートがTnまたはTF抗原と直接結合している請求項14記載の化合物。
- 1) 緩衝溶液にアルギネートを溶解し、
2) 先に得られた溶液に適切な量のビオチンまたはビオチン化剤を加え、
3) 工程(2)から得られる溶液に、それぞれ直鎖または分岐鎖の合成または天然アミノ酸およびその誘導体、適切なペプチド、および炭化水素からなる群から選ばれる適切なリンカーと結合していることがある適切な量のTnまたはTF抗原を加え、
4) 得られる溶液を適切な時間混合および撹拌して得られた生成物を回収する
工程を含む請求項14または15のいずれかのコンジュゲート化合物の製造方法。 - 抗Tnまたは抗TF抗原を選択するための請求項14または15に記載のコンジュゲート化合物の使用。
- 1) マイクロタイターウェルプレートをストレプトアビジンでコートし、
2) 工程1)から得られた固相に請求項14または15に記載のコンジュゲート化合物を固定化する工程を含む抗Tnまたは抗TF抗体を選択するためのELISA試験。 - 請求項13に従って製造される、および/または請求項18に従って選択される抗体。
- さらに治療的または診断的部分で機能化された請求項19記載の抗体。
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