JP2002528516A

JP2002528516A - 固相コンジュゲートワクチンの調製方法

Info

Publication number: JP2002528516A
Application number: JP2000579251A
Authority: JP
Inventors: リース，アンドリュー
Original assignee: ヘンリー・エム・ジャクソン・ファンデイション・フォー・ジ・アドヴァンスメント・オヴ・ミリタリー・メディシン
Priority date: 1998-10-29
Filing date: 1999-10-29
Publication date: 2002-09-03
Also published as: WO2000025812A2; EP1124576B1; WO2000025812A3; ATE285790T1; ES2237210T3; AU1457100A; DE69922990D1; AU763691B2; CA2348063A1; EP1124576A2; US6585973B1; DE69922990T2

Abstract

(57)【要約】固相アジュバントにタンパク質を吸着させ、この吸着させたタンパク質に炭水化物を共有結合で結合させることによる、コンジュゲートワクチンの調製方法を提供する。また、最初に固相アジュバントに炭水化物を吸着させ、その後この炭水化物にタンパク質を共有結合で結合させてもよい。炭水化物は化学的に活性化することができる。コンジュゲートを形成していないタンパク質が存在してもよい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、35 U.S.C. § 119(e) に基づき、1998年10月29日に出願された米国
特許仮出願第60/106,090号の優先権を主張するものである。

【０００２】政府の利権本明細書に記載した発明は、それに対する特許権使用料を支払うことなく、政
府の目的のために製造し、実施し、使用することができる。

【０００３】発明の背景発明の分野本発明は、コンジュゲートワクチンに関する。より詳細には、本発明は固相コ
ンジュゲートワクチンに関する。

【０００４】関連技術の説明ワクチン接種のプロセスにおいて、医学は、抗原で身体を免疫することにより
、侵入物質から自己を防御する身体の本来の能力を利用する。使用する抗原は、
病気を引き起こすことなくその病気から身体を防御する抗体の形成を刺激するよ
うになる。例えば、腸チフス熱や百日ぜき等の細菌性疾患から防御するためには
死滅した微生物を注射し、破傷風およびボツリヌス毒から防御するためには毒素
を注射し、また灰白髄炎やはしか等のウイルス性疾患から防御するためには弱毒
化微生物を注射する。

【０００５】しかし、単に外来物質を注射するだけでは、抗体形成を必ずしも刺激すること
ができるというわけではない。ワクチン製剤は、免疫原性でなければならない。
つまり、免疫応答を誘導することができなければならない。破傷風トキソイド等
のある種の物質は、もともと免疫原性であり、修飾することなくワクチンとして
投与することができる。しかし、他の重要な物質は免疫原性がなく、免疫応答を
誘導することができるように免疫原性分子に変換する必要がある。免疫応答は、
一般に以下のように記載することができる複合した反応系である：（１）抗原は
体内に入ると抗原提示細胞に出会い、この抗原提示細胞は、該抗原をプロセシン
グして該抗原の断片をその細胞表面上に保持する、（２）抗原提示細胞上に保持
された抗原断片をＴ細胞が認識し、Ｔ細胞は、Ｂ細胞に助けを提供する、（３）
Ｂ細胞が刺激されて、その抗原に対する抗体を分泌する抗体産生細胞へと増殖し
、分割する。

【０００６】多くの抗原は、Ｔ細胞からの助けを借りたときのみ抗体を導き出すので、従っ
てT-依存性（TD）として公知である。このようなT-依存性抗原の例としては、破
傷風トキソイドおよびジフテリアトキソイドが挙げられる。

【０００７】抗原提示細胞は、多糖等の幾つかの抗原を、適切にプロセシングすることがで
きず、T細胞はかかる抗原を認識しない。これらの抗原は、抗体産生を導くため
にT細胞の助けを必要とせず、B細胞を直接活性化することができるので、従って
T-非依存性抗原（TI）として公知である。このようなT-非依存性抗原には、イン
フルエンザb菌（H. influenzae type b）のポリリボシル-リビトール-リン酸お
よび肺炎球菌の莢膜多糖が含まれる。

【０００８】 T-非依存性抗原とT-依存性抗原とのこの他の違いとしては、以下のものがある
。

【０００９】（a）T-依存性抗原は、同じ抗原での二次抗原投与に対して記憶応答が生じるよ
うに、免疫応答を呼び起こす（prime）ことができるが、T-非依存性抗原はでき
ない。

【００１０】（b）抗原に対する抗体の親和性は、T-依存性抗原での免疫後には経時的に増加
するが、T-非依存性抗原では増加しない。

【００１１】（c）T-依存性抗原は、T-非依存性抗原よりも効率的に、未成熟なもしくは新生
児の免疫系を刺激する。

【００１２】（d）T-依存性抗原は通常、IgM、IgG1、IgG2aおよびIgE抗体を刺激するが、一方
T-非依存性抗原は、IgM、IgG1、IgG2bおよびIgG3抗体を刺激する。

【００１３】 T-依存性抗原は、一次および二次応答を刺激することができ、成人および新生
児の免疫系の両方において長く続くが、しばしばアジュバントと共に投与しなけ
ればならない。ペプチド等の非常に小さなタンパク質は、アジュバントと共に投
与したときであっても、めったに免疫原性を持たない。

【００１４】多糖などのT-非依存性抗原は、アジュバントの不在下で免疫応答を刺激するこ
とができるが、高レベルまたは長期間の抗体反応を刺激することはできない。ま
たT-非依存性抗原は、未成熟な免疫系またはB細胞欠損性免疫系を刺激すること
もできない（Mond JJ., Immunological Reviews, 64: 99(1982)(Mosier DEら、J . Immunol. , 119: 1874(1977)。T-非依存性抗原の場合、子供に該抗原に対する
、特に多糖（例えば、インフルエンザ菌（H. influenzae)および肺炎球菌(S. pn
eumoniae)）に対する防御免疫を提供することが非常に重要である。T-依存性抗
原の場合は、様々な病原体の一次抗原決定基を呈示する合成ペプチドに基づいた
ワクチンを開発することが非常に重要である。

【００１５】 T-非依存性抗原に対する免疫応答を増強する１つの方法としては、インフルエ
ンザ菌（H. influenzae)PRP等の多糖（Cruse JM, Lewis RE Jr.編, Conjugate V accines in Contributions to Microbiology and Immunology , Vol. 10, (1989)
）またはオリゴ糖抗原（Anderson PW.ら、J. Immunol., 142: 2464, (1989)）を
、破傷風トキソイドまたはジフテリアトキソイドなどの単一のT-依存性抗原に結
合してコンジュゲートを形成することがある。このようにしてＴ細胞の助けを増
強すると、免疫をすでに受けている多くの幼児達に増強した免疫力を賦与するこ
とが示されている。

【００１６】タンパク質-多糖コンジュゲートワクチンは、多糖のみには応答することがで
きない幼児において、抗多糖抗体応答を刺激する。

【００１７】コンジュゲートワクチンは効果的であるが、生産コストが高い（Cruseを参照
されたい）。コンジュゲートワクチンの調製における１つの問題は、共有結合に
より結合したタンパク質からコンジュゲートを形成していないタンパク質を除去
することである。典型的には、除去は、サイズ排除ゲル濾過によって行われ、大
きな専用カラムを必要とする。Houenらは、固相アルミニウムアジュバントに吸
着させたタンパク質にペプチドを結合することができることを示した（Houen, G
ら、J. Immun. Meth., 206: 125(1997)）。さらに、彼らは、これらの固相コン
ジュゲートによって誘導される抗ペプチド抗体応答が、液相で調製したコンジュ
ゲートにより誘導される抗ペプチド抗体応答よりも高いことを発見した。これら
の固相コンジュゲートの合成は単純であり、該固相成分の遠心分離によってコン
ジュゲートを形成していないペプチドおよび試薬を除去することができる。重要
なことに、固相自体がアジュバントであるため、免疫原を合成した固相足場（so
lid phase scaffold）から、コンジュゲートを分離する必要は無かった。これは
他の固相合成法の重大な欠点を克服するものである。しかし、Houenらは、ペプ
チド以外（例えば炭水化物）への応用は検討しなかった。

【００１８】 Kossovskyは、タンパク質抗原に結合しうる「コロイド表面」を形成するため
に、二糖類セロビオースでコーティングしたダイヤモンドナノ粒子で作製した「
抗原送達媒体」について論じている。Kossovskyら、Bioconj. Chem. 6(5), pp.5
07-520(1995)。抗原送達媒体は、タンパク質抗原を提示することにより、このタ
ンパク質抗原に対する「強力な免疫原応答を誘発する」役割を果たす。セロビオ
ースは一般的な食品添加物であるセルロースの反復ユニットであるので、該二糖
類に対するいかなる免疫原応答も誘発しないことが要求され、実際、誘発するこ
とは望ましくないであろう。

【００１９】このように、固相２成分担体コンジュゲートワクチン（solid phase dual car
rier conjugate vaccine）の調製、特に遊離のハプテン、タンパク質および多糖
の除去を単純化することが当技術分野では、依然として必要とされている。

【００２０】発明の概要したがって、本発明の１つの態様は、固相コンジュゲートワクチンを調製する
ための改良された方法を提供することである。

【００２１】本発明の他の態様は、炭水化物を含むコンジュゲートワクチンを精製するため
の改良された方法を提供することである。

【００２２】本発明の他の態様は、アルミニウム固相、タンパク質および炭水化物を含む固
相コンジュゲートワクチンを調製するための改良された方法を提供することであ
る。

【００２３】本発明のさらに他の態様は、ハプテンを含む固相コンジュゲートワクチンを調
製するための改良された方法を提供することである。

【００２４】本発明の更なる態様は、以下の説明にその一部が記載され、他の部分は、以下
の説明から自明であるか、または本発明の実施によって学ぶことができるであろ
う。本発明の態様は、特許請求の範囲に特に記載された要素および組合せを用い
て実現および達成されるであろう。

【００２５】本発明は、タンパク質をまず固相アジュバントに吸着させた後、この吸着タン
パク質にオリゴ糖または多糖を共有結合により結合させることを特徴とする、固
相コンジュゲートワクチンを調製するための新規な方法を提供する。

【００２６】本発明はさらに、炭水化物をまず固相アジュバントに吸着させた後、この吸着
炭水化物にタンパク質を共有結合により結合させることを特徴とする、新規な方
法を提供する。

【００２７】また、本発明はさらに、タンパク質に結合させる前に炭水化物を活性化させる
ことを特徴とする方法を提供する。

【００２８】また、本発明はさらに、タンパク質にハプテンを結合させることを特徴とする
、固相コンジュゲートワクチンの調製方法を提供する。

【００２９】この単純で低コストのプロセスは、クロマトグラフィーを必要とせず、コンジ
ュゲート形成されていない炭水化物（これは免疫応答を阻害することが分かった
）の迅速な除去を可能とする。

【００３０】上記一般的な記載および以下の発明の詳細な説明はいずれも説明のためだけの
単なる例であり、特許請求の範囲を限定するものではない。

【００３１】詳細な説明巨大分子の表面につながれた分子に対して化学作用を施すプロセスである固相
化学は、当分野において周知である（G.B. Fields & S.P. Colowick, Ed., “So
lid Phase Peptide Synthesis,” Meth. Enzym., Vol. 289, Academic Press, 1
997）。固相合成では、試薬は簡単に除去され、単純な洗浄工程によって生成物
が得られる。

【００３２】ヒトワクチンの調製において、固相（典型的にはポリマー支持体）からのワク
チン生成物の除去は、問題が多い。この問題の解決策は、固相として免疫原に適
した物質（例えばアルミニウムアジュバント等）を使用することである。アルミ
ニウムアジュバントは、小児に使用することが許可された唯一のアジュバントで
ある。

【００３３】本発明者は、吸着させたタンパク質にハプテンではなく巨大分子（特に多糖）
を共有結合により結合させることを特徴とする、タンパク質-多糖コンジュゲー
トワクチンを合成するための改良されたプロセスを開発した。分子量が非常に大
きい多糖でさえも低速ではペレット化しないので、コンジュゲート形成していな
い多糖は、吸着されたコンジュゲートから遠心分離により簡単に分離される。こ
れにより、他の方法では困難であったコンジュゲート形成していない多糖の除去
に、簡単且つ低コストの解決策を提供する。上記のように、コンジュゲート形成
していないが吸着されたタンパク質は、除去する必要がなくなり、事実、該タン
パク質成分に対する抗体反応を増強するのに有益である。

【００３４】現在のFDA規格は、コンジュゲートワクチンからの遊離タンパク質の除去を必
要としないが、許容可能な量の遊離多糖を設定する。遊離多糖は、特に全量の10
％を超える場合、コンジュゲート形成した多糖に対する体液性免疫応答を阻害す
ることが分かった（Peeters, C.ら、Vaccine, 10: 833, 1992）。したがって、
最終製品中の遊離多糖の量を最少限にとどめることが重要である。しかし、遊離
多糖の除去は、特にその多糖が高分子量を有する場合、ゲル濾過によっては難し
い。

【００３５】固相結合法は、他の方法では難しかった溶解性の低いタンパク質または濃縮溶
液として調製することが難しいタンパク質のいずれかを用いたタンパク質-多糖
コンジュゲートの調製を可能とする。多くの巨大分子のコンジュゲート形成では
、該成分を高濃度で有することが重要である。この固相法は、吸着されたタンパ
ク質を簡単に濃縮することができるので、この方法以外では濃縮が難しいタンパ
ク質を用いてこれを可能とすることができる。例えば、Fタンパク質（RSウイル
スから単離したもの）は簡単に濃縮されず、界面活性剤にしか溶けなかった。今
日まで、Ｆタンパク質は、従来手段によっては希釈界面活性剤溶液の中で多糖に
連結されなかった。しかし、Ｆタンパク質をアルヒドロゲルに吸着させてから、
この吸着させたタンパク質に多糖を共有結合で結合させることが可能である。

【００３６】タンパク質は疎水性およびイオン性の両方の相互作用によってアルミニウムア
ジュバントに吸着される。Al-Shakhshir R.H.ら、Vaccine 13: 41, 1995。結合
はしばしばそのタンパク質の等電点付近で最適となる。相互作用の混合態様によ
り、タンパク質の吸着を確実性を持って予測することは不可能であり、最適な条
件は実験的に決定しなければならない。結合は可逆的なこともある。したがって
、そのタンパク質を脱着する条件を使用しない、またはタンパク質をアジュバン
トに容易に再吸着できる、化学作用を使用することが必要である。

【００３７】タンパク質は特に限定されない。好適なタンパク質の例としては、ウイルス、
細菌、寄生生物、動物および真菌のタンパク質またはリポタンパク質が挙げられ
るが、これらに限定されない。好ましくは、タンパク質アルブミン（ウシ血清ア
ルブミン等）、Ｆタンパク質、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、また
は細菌外膜タンパク質があり、これらは全て生化学または製薬供給会社から入手
することもでき、または標準的な方法（Cruse, JM(編) Conjugate Vaccines in Contributions to Microbiology and Immunology , vol. 10(1989), 本明細書中
に参照として特に組み込まれる）によって合成することもできる。他の好適なタ
ンパク質は、免疫学の分野において通常の知識を有する者には知られている。

【００３８】好ましくは、炭水化物はオリゴ糖または多糖である。好適な炭水化物の例とし
ては、中性多糖（肺炎球菌14型莢膜多糖（Pn14）およびデキストランなど）およ
び荷電多糖（ナイセリア属細菌(Neisseria)PsC、肺炎球菌多糖6型（Pn6）等）が
挙げられるが、これらに限定されない。

【００３９】好ましくは、炭水化物は活性化される。活性化剤は、特に限定されない。好適
な活性化剤の例としては、CDAP（1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジンテトラフ
ルオロボレート）およびシアノゲンブロミドが挙げられるが、これらに限定され
ない。タンパク質は活性化された多糖に直接加えることもでき、これら２つの成
分の化学結合を単純化する（Lees, A.ら、Vaccine, 14: 190, 1996; 米国特許第
5,651,971号および第5,693,326号も参照されたい）。好ましくは、活性化剤はCD
APである。様々な化学作用によって、スペーサを用いてまたは用いずに、炭水化
物へのタンパク質の結合が可能となる。

【００４０】アルミニウムアジュバントは特に限定されない。一般に、アルミニウム塩やカ
ルシウム塩などの金属塩が使用される。好適な活性化剤の例としては、アルム（
硫酸カリウムアルミニウム）、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、オキ
ソ水酸化アルミニウム（aluminium oxohydroxide）、ヒドロキシホスフェートア
ルミニウム、リン酸カルシウム、硝酸セリウム、硫酸亜鉛、コロイド水酸化鉄お
よび塩化カルシウムが挙げられるが、これらに限定されない。異なる物理的特性
を有する幾つかのアルミニウムアジュバントが市販されており、ヒトへの使用が
許可されている。好ましくは、アジュバントは水酸化アルミニウムまたはリン酸
アルミニウムである。R.H. Al-Shekhshirら、Vaccine, Vol. 13, 41; (1995); R
.K. Guptaら、Vaccine, Vol. 11, 293(1993), M.F. Powellら、“Vaccine Desig
n, the Subunit and Adjuvant Approach,” Pharmaceutical Biotech, Vol. 6,
Plenum Press (1995)。等電点（P_i）11を有するアルヒドロゲル（Alhydrogel、
水酸化アルミニウム）は、破傷風トキソイドやBSAなどの低いP_iを有する多くの
タンパク質を簡単に吸着するが、リソザイムなどの塩基性タンパク質を吸着しな
い。等電点（P_i）5を有するアジュホス（Adjuphos、リン酸アルミニウム）はリ
ソザイムに結合するがBSAには結合しない。A1-Shakhshir R.H.ら、Vaccine 13:
41, 1995。アルヒドロゲルの等電点は、リン酸塩を加えることにより下げること
ができ、このリン酸塩の添加により、該アジュバントの負の電荷が増大してより
塩基性のタンパク質の吸着を可能とする。Rinella Jr. J.V.ら、Vaccine 14: 29
8, 1996。

【００４１】肺炎球菌14型莢膜多糖（Pn14）やデキストランなどの中性多糖は、アルヒドロ
ゲルに簡単には吸着されない。したがって、これらのコンジュゲート形成してい
ない多糖は、固相の遠心分離および再懸濁を繰返し行うことにより、コンジュゲ
ートから簡単に除去される。

【００４２】肺炎球菌多糖6型（Pn6）等の荷電多糖は、アジュバントに吸着され得る。この
ような多糖の場合、遊離多糖の吸着が最少となる条件を決定することが必要であ
る。これはリン酸陰イオンを用いて固相アジュバントの表面電荷を変えて、アジ
ュバントの等電点を低下させることによって行うことができる。Rinella Jr. J.
V.ら、Vaccine 14: 298, 199; Chang M.ら、PDA J. Pharm. Sci Tech., 51: 25,
1997。

【００４３】固相法に関する他の潜在的な問題は、均質な生成物を調製するために、架橋条
件を慎重に調節しなければならないことである。液相では、高レベルの架橋によ
って粘性が高くなる可能性があるが、なお使用可能な生成物が生じる。固相では
、過度の架橋は凝集につながり、均一な用量を投与することが難しくなる。した
がって、コンジュゲーション条件（例えば多糖の化学的活性化の程度およびタン
パク質の濃度など）の最適化が必要である。

【００４４】好適な実施形態において、固相アジュバント方法論を用いてハプテン-タンパ
ク質-多糖コンジュゲートを合成する。

【００４５】他の好適な実施形態において、ワクチンの３成分（ハプテン、タンパク質およ
び多糖）全てに対する増強した抗体反応を刺激するために、高分子量のタンパク
質-多糖コンジュゲートにハプテンを結合させる。タンパク質およびハプテンは
、多糖上の多価アレイで提示されるので、B細胞活性化の増強につながり、その
結果、抗体分泌が促進される。これを、ハプテン-タンパク質-高分子量多糖から
なるという意味で、「２成分コンジュゲートワクチン」と呼ぶ。Leesら、Vaccin e , 12: 1160, 1994; 米国特許第5,585,100号。

【００４６】他の好適な実施形態において、該タンパク質または多糖成分の１以上に、更に
他の成分（moiety）が結合してコンジュゲート形成する。このようなコンジュゲ
ーションは、その成分に対する抗体反応の増強を促進する。このような成分を結
合させてコンジュゲートを形成する技法は、当業者には周知であり、利用可能な
官能基（アミノ基、カルボキシル基、チオ基およびアルデヒド基等）を介する結
合を一部含む。S.S. Wong, Chemistry of Protein Conjugate and Crosslinking , CRC Press (1991), およびBrenkeleyら、“Brief Survey of Methods for Pre
paring Protein Conjugates With Dyes, Haptens and Cross-Linking Agents,”
Bioconjugate Chemistry 3: 1(Jan. 1992), G.T. Hermanson, Bioconjugate Te chniques , Academic Press, (1996)を参照されたい（これらの文献は全体を本明
細書中に参考として特に組み込まれる）。本明細書で使用される「成分」とは、
それ自体でまたは一度結合することにより免疫系を刺激することができる、任意
の物質である。成分には、ハプテン、抗原、またはこれらの組合せが含まれる。

【００４７】ハプテンとは、それ自体は抗体反応を誘発することができないが、一度担体に
結合すると抗体反応を誘発することができる、小さな有機分子（例えばペプチド
、ホスホリルコリン、TNP等）をさす。抗原は、正しい条件下において、抗体の
形成を誘導することができる任意の分子である。これらのハプテンおよび抗原は
、細菌、リケッチア、真菌、ウイルス、寄生生物、薬物または化学物質に由来す
るものであってもよいが、これらに限定されない。これらには例えば、ペプチド
等の小さな分子、オリゴ糖（例えばH. influenzaeのポリリボシル-リビトール-
ホスフェート）、毒素、内毒素等が含まれる。

【００４８】固相アジュバント法は、吸着されたタンパク質に対して連続的なコンジュゲー
ション化学作用を行うことができ、また該吸着されたタンパク質からの未反応成
分の分離が簡単に行えるので、２成分コンジュゲートワクチンの調製に非常に適
している。このように、吸着されたタンパク質は、多糖に結合される前またはさ
れた後に、ハプテンで標識することができる。しかし、荷電ハプテンは、いくつ
かのアジュバントに非特異的に結合し得る。荷電多糖と同様に、当業者が簡単に
決定することができるように、アジュバントの表面電荷を変えることにより、ま
たはより好適な固相を選択することにより、これを克服することができる。固相
アジュバントの１つの例は、免疫強化特性を有する粒子である。

【００４９】好適な実施形態において、固相アジュバントを用い、S. pneumoniaの重要な防
御エピトープを含むことが分かっている抗原を用いて、ハプテン-タンパク質-多
糖コンジュゲートを合成する。

【００５０】肺炎球菌は、タイプ特異的莢膜多糖に加え、その種に共通する多くの抗原を有
する。ホスホリルコリン（PC）は肺炎球菌のC多糖の主な決定基であり、PCに対
する抗体は、実験的な肺炎球菌感染からマウスを防御することが分かった（Wall
ick, Sら、J. Immunol., 130: 2871（1983）; McDaniel L.S.ら、J. Immunol.,
133: 3308, (1984)）。

【００５１】肺炎球菌表面タンパク質A（PspA）は、マウスにおいて肺炎球菌セプシスに対
する防御免疫を誘発することが分かっている表面露出病原性因子（surface expo
sed virulence factor）であり、異なる莢膜タイプの肺炎球菌に対する防御を誘
発することができる。Wu, H-Yら、J. Infec. Dis., 175: 837, 1997。

【００５２】また本発明は、免疫促進量の該ワクチンを投与することによる患者の治療にも
関する。患者は、その治療が有益である被験者であって、哺乳動物、好ましくは
ヒト、ウマ、ウシ、イヌおよびネコ、ならびにニワトリなどの鳥類などが挙げら
れるが、これらに限定されない。

【００５３】免疫促進量とは、病気の予防、改善または治療のために患者の免疫応答を刺激
することができる、ワクチンの量を指す。本発明のワクチンは、任意の経路で投
与することができるが、好ましくは、静脈内、筋肉内、および皮下注射によって
投与される。

【００５４】また、本発明は、宿主を上記ワクチンで免疫して、該ワクチンに対する抗体を
ドナーに産生させることによって、細菌、ウイルス、寄生生物、真菌、または化
学物質によって引き起こされる感染に対する免疫治療剤を調製する方法にも関す
る。抗体を単離するかまたはB細胞を得た後、これを骨髄腫細胞に融合させて、
モノクローナル抗体を作製することができる。モノクローナル抗体の作製方法は
、当分野では周知であるため、本明細書中でさらに記載する必要はない。Kohler
およびMilstein, Nature 256: 495 (1975)（本明細書中に参考として特に組み込
まれる）。

【００５５】本明細書で使用される「免疫治療剤」とは、患者の受動的治療で使用する特定
の免疫原に対する抗体の組成物を指す。血漿のドナーとは、ワクチンを注射して
そのワクチンに含まれる免疫原に対する抗体を産生させるための任意の被験体で
ある。

【００５６】また、本発明は、防御的な量の免疫治療剤を投与することによって患者を治療
する方法にも関する。このような治療は、免疫原に対する抗体を産生させること
を患者に求めるのではなく、その免疫原に対して血漿のドナーによって産生され
た抗体を使用する、という意味で受動的である。ある量の治療的抗体が、その免
疫原により引き起こされる病気を予防、改善または治療することができるくらい
十分な数の抗体を提供する場合、その治療的抗体の量は防御的であるという。こ
のような量は、当業者によって決定することができ、その患者およびその病気の
プロフィールの特徴によって異なる。

【００５７】また、本発明は、上記ワクチンで宿主を免疫し、その宿主にその物質に対する
抗体（またはB細胞）を産生させることによって、例えば細菌、ウイルス、真菌
、寄生生物または化学物質により引き起こされる病気に特徴的である物質を検出
するための診断用試薬および/または研究用試薬を産生する方法にも関する。抗
体および/またはB細胞は、上記のように単離することができる。本明細書中で使
用される「診断用試薬」とは、病気に特徴的な物質を検出するために使用するこ
とができる抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）の組成物を指す。本明
細書中で使用される「研究用試薬」とは、実験室で使用することができる抗体（
ポリクローナルまたはモノクローナル）の組成物を指す。

【００５８】手順固相コンジュゲートを調製するための全体的なプロセスを図３に示す。

【００５９】試薬肺炎球菌6B型および14型は、ATCCから入手可能である。破傷風トキソイドは、
Statens Seruminstitute(Denmark)から入手可能である。安定化アルミニウムア
ジュバントであるアルヒドロゲル(Alhydrogel)(水酸化アルミニウム)およびアジ
ュホス(Adjuphos)(リン酸アルミニウム)は、Accurate Chemical(Westbury, NY)
から入手可能である。Spandeの方法により調製されたホスホリルコリン類似体で
ある6-(Ｏ-ホスホリルコリン)ヒドロキシヘキサン酸(PC-CO₂H)は、J.Kenny(Nati
onal Institute on Aging, NIH)から寄与された。Spande, T.F., J. Org Chem.,
45:3081, (1980)。

【００６０】Ｎ末端の290アミノ酸、および６×HisのＣ末端を含んでなる組換え肺炎球菌表
面タンパク質Ａ(rPspA)を、Worthamら, Infect. Immun., 66:1513, 1998に記載
されるように酵母細胞中で培養した。Ni-NTAクロマトグラフィー(Qiagen)による
初期精製の後、該タンパク質は以下のようにイオン交換クロマトグラフィーによ
りさらに精製してもよい。すなわち、Ni-NTA画分を5 mM TrisHCl + 15 mM Tris
に透析し、同じバッファーで平衡化したMono Qカラムにロードする。50 mM NaCl
まで塩を段階的に上げ、50 mM〜0.4 M NaClの勾配の間にタンパク質を溶出する
。ELISAで測定したrPspAピークを、プールし、限外濾過により5 mg/mlにまで濃
縮し、生理食塩水に交換し、Millex GV 0.2 μフィルターで滅菌濾過する。SDS-
PAGEにより純度を確認した。計算された吸光係数(7620 M^-1)から濃度を決定した
。

【００６１】タンパク質の固相アジュバントへの吸着タンパク質をアルヒドロゲルに吸着させる標準的処置は、以下の通りであり、
図2aに一般的に示す。すなわち、Houenら(“Conjugation to Preadsorbed Preac
tivated Proteins and Efficient Generation of Antipeptide Antibodies,” J .Immunol. Meth. , 206: 125-134, (1997))に一般的に記載されるように、BSAを
アルヒドロゲルに吸着させた。まず、4.2 mlのBSA(生理食塩水に50 mg/mlで含有
されている)を23 mlのアルヒドロゲル(生理食塩水中1:2に希釈されている)と組
合せ、50 mlの試験管中で回転させて一晩穏やかに混合することにより、BSAをア
ルミニウムアジュバントであるアルヒドロゲルに吸着させた。吸着したタンパク
質を、3200×ｇで10分間の遠心分離により３回洗浄し、生理食塩水に再懸濁した
。最終的なペレットを、10 mlの生理食塩水＋0.02％アジ化物に再懸濁し、４℃
で保存した。吸着したBSAを、可溶性BSAを標準品として用い、マイクロBCAアッ
セイ(Pierce Chemical)を用いてアッセイした。＞95％のBSAが固相アジュバント
と結合していることが分かった。

【００６２】破傷風トキソイド(5 mg/ml)を、10 mM MES、0.15 M NaCl(pH 6)に透析した。r
PspA(5 mg/ml)を、50 mM酢酸ナトリウム(pH 5)に透析した。タンパク質を、１％
アルヒドロゲルと混合し、室温にて１時間穏やかに攪拌した。固相アジュバント
吸着タンパク質を、1.5 mlの試験管中で、小型微量遠心機に入れて、16,000×ｇ
にて、15分間遠心分離し、上清を除去した。ペレットを、マイクロホモゲナイザ
ー(Kontes “Pellet Pestle”)を用いて、１mlの25 mM酢酸ナトリウム(pH 5)に
再懸濁し、再度遠心分離した。洗浄ステップをさらに２回繰り返し、吸着したタ
ンパク質を最終バッファーに再懸濁した。吸着したタンパク質の濃度を変化させ
る場合、１mgのタンパク質当たり0.25〜5 mgの割合のアルヒドロゲルを使用して
もよい。1 mgのアルヒドロゲル当たりのタンパク質が１mgの場合、＞90％のタン
パク質が吸着していた。必要であれば、Rinella, Jr., J.V.ら, Vaccine 14:298
(1996)に記載されるように、限定量のリン酸塩を添加することにより、アルヒ
ドロゲルの等電点を下げてもよい。アルヒドロゲルが、負に荷電された多糖(Pn6
など)または負に荷電されたハプテンを含む構築物(ホスホリルコリンなど)との
固相タンパク質-多糖コンジュゲートの調製における使用に不十分なものであれ
ば、該タンパク質を、等電点の低い固相アルミニウムアジュバント(例えば、ア
ジュホス)に吸着させてもよい。アジュホスに吸着したタンパク質およびコンジ
ュゲートは、アルヒドロゲルの場合に使用する25 mM酢酸ナトリウムバッファー
の代わりに、25 mM(pH 9)の炭酸塩バッファーに再懸濁する。

【００６３】 BCAマイクロアッセイ(Pierce Chem. Co.)を用いてタンパク質をアッセイした
。テストタンパク質であるBSAを使用し、全ての画分を「記帳(bookkeeping)」する
ことで、吸着タンパク質が本方法により数量化できることを決定した。

【００６４】多糖を、Monsignyら, Anal. Biochem., 175:525 (1988)のレゾルシノール/硫
酸法でアッセイした。

【００６５】多糖のCDAP活性化のための一般的な処置(２) Pn14を、水に10 mg/mlで溶解した。CDAP(Research Organics)をアセトニトリ
ル中100 mg/mlで調製した。ｔ＝０において、CDAPをPSに添加した。30秒時に、0
.2 Mトリエチルアミン(TEA)を添加して、pHを9.5まで上げた。pHは、9〜9.5に維
持し、2.5分時に攪拌されたタンパク質溶液(溶解または吸着したもの)に添加し
た。固相コンジュゲートを、マイクロホモゲナイザーで最初の１時間周期的に混
合した。一晩の反応の後、0.1 Mまでエタノールアミンを添加し、１時間インキ
ュベートすることにより溶液を停止した。液相コンジュゲートを、S400HRカラム
(Pharmacia)上のゲル濾過により処理し、非コンジュゲート形成タンパク質を除
去した。非コンジュゲート形成多糖は、まず溶液を酢酸ナトリウム中で25 mMに
し、１N HClでpHを５まで下げ、室温にて１時間インキュベートすることにより
、アジュバント吸着タンパク質から除去した。固相コンジュゲートを記載するよ
うに洗浄した。多糖活性化の程度を変化させるために、1 mgのPS当たりCDAPが0.
25〜1 mgの比でテストした。結合条件を変化させるために、吸着したタンパク質
を、CDAPで活性化されたPSを添加する前に、５、10または20 mg/mlにて再懸濁し
た。CDAPで活性化されたPn14を、アジュバントに吸着したPC-rPspAに結合させて
もよい。

【００６６】上述した全ての場合において、遊離の非コンジュゲート形成ハプテン、タンパ
ク質または多糖は、遠心分離、およびコンジュゲートワクチンを含有するアルヒ
ドロゲルの洗浄により最終製品から除去された。これは、コンジュゲートワクチ
ンの調製において時間および費用を節約するための主要なステップとなる。なぜ
なら、遊離のハプテン、タンパク質または多糖を除去するためにカラムクロマト
グラフィーを使用する必要がなくなるからである。

【００６７】免疫以下は、マウスにおいてどのように免疫を行いうるかの例を示す。１群５匹の
Balb/cマウスを、0.01〜10μｇの範囲の用量の様々なワクチン構築物で、０およ
び14日目に皮下免疫し、14日後に採血した。アジュバントの量を最適化するため
、免疫原を、0〜0.5mg/マウスの範囲にわたる追加のアルヒドロゲルと混合した
。追加のアジュバントの量を最適化する例として、固相コンジュゲート免疫原を
アルヒドロゲルと混合する。

【００６８】ELISA 全てのイムノアッセイを、Nunc Maxisorpストリップウェル(Nunc 469949)を使
用して行った。ホスホリルコリン、PspA、破傷風トキソイド、Pn14およびPn6Bに
対して、予め調製した抗血清を使用して、予備実験を行い、被覆抗原の最適濃度
を決定した。上述した手順を使用してPCをBSAと結合させて、ELISA抗原として用
いた。ELISAのために、100μｌのPBS中の抗原溶液(pH7.4)を、全てのウェルに添
加し、プレートをプレート密封体で被覆し、室温にて一晩インキュベートする。
ウェルを、0.05％Tween-20(PBS-T)を含有するPBSで４回洗浄して、非結合被覆抗
原を除去する。血清サンプルを、PBS-T中で調製された６〜７倍希釈液としてテ
ストする。各希釈液を100μｌずつ添加して、抗原被覆プレート上のウェルを複
製する。陰性対照ウェルには、PBS-Tのみを入れる。陽性対照ウェルは含める。
比較のために、各ELISAは、最も新しい血清サンプル、および先の血清サンプル
を含む。血清サンプルを添加した後、プレートを室温にて30〜60分インキュベー
トし、ウェルをPBS-Tで再度洗浄する。全てのウェルに、HRPとコンジュゲート形
成した95μｌのウサギ抗マウスIgG(γ特異的)を入れる。プレートを再度、室温
にて30〜60分間インキュベートし、PBS-Tで洗浄する。100μｌのTMB基質を全て
のウェルに添加し、プレートを暗所で室温にて15分間インキュベートする。80μ
ｌのTMB Stop Solutionを添加して反応をとめ、Molecular Devicesマイクロプレ
ートリーダーを450nmフィルターと共に用いて吸光度を測定する。SoftMaxプログ
ラムを使用して、力価を計算する。抗PC抗体の特異性を、抗体と100μg/mlのホ
スホリルコリン(Aldrich)との予備インキュベーションにより確認し、PC-BSAへ
の抗体結合の阻止を測定する。

【００６９】任意の例では、オプソニンアッセイを用いて、血清の防御活性を評価する。Fi
scher, GWら, J.Infect.Dis., 169:324(1994)。当業者は、固相タンパク質-多糖
コンジュゲートを調製するための手順が、PC-PspA-Pn6などの所与のコンジュゲ
ートのために最適化を必要としうることを理解するであろう。例えば、PCおよび
Pn6の非特異的な吸着を防ぐための条件を改変するのに必要になるかもしれない
。したがって、限定量のリン酸塩の吸着によりアルヒドロゲルの正電荷を減らし
ても非特異的結合を防げない場合、または荷電されたアジュホスにPspAを吸着す
ることができない場合には、Ｃ末端のポリリシンテイルを遺伝子操作することに
よりPspAの等電点を上げて、タンパク質のアジュホス(約５の等電点を有する)へ
の結合を促進することができる。負に荷電されたアジュホスは、陰イオンと結合
しない。

【００７０】実施例Ａ．固相コンジュゲートワクチンの調製これらの実施例は、固相マトリクスへのコンジュゲーション処置を示し、高分
子量多糖(PS)を固相アジュバンド吸着タンパク質に結合するのに重要ないくつか
のパラメータを試験する。BSAを、タンパク質の代表として使用し、Houen, Gら,
J.Imm.Meth., 206:125, 1997に記載されているように、市販されている固相水
酸化アルミニウムアジュバントであるアルヒドロゲルに吸着させた。Leesら, Va ccine , 14:190(1996)に一般的に記載されているように、多糖を１-シアノ-４-ジ
メチルアミノピリジン・テトラフルオロボレート(CDAP)で活性化させ、以下に記
載するように吸着タンパク質に結合させた。

【００７１】実施例１．多糖活性化および結合pHの、固体アジュバントマトリクスに吸着したタンパク質へのコンジュゲーションの効率に対する影響 S.pneumoniae多糖14型(Pn14)(10 mg/mlで3 mg)を、多糖1 mg当たり0.25、0.5
または1 mgのCDAP、および２×モル量のトリエチルアミン(TEA)で活性化し、100
μlの0.1 Mホウ酸ナトリウム(pH 9.3)に懸濁した3 mgのBSA/アルヒドロゲルに添
加した。混合しながらの一晩のインキュベーションの後、エタノールアミンで溶
液をクエンチし、遠心分離により洗浄して非コンジュゲート形成していない多糖
を除去した。BCAマイクロアッセイ(Pierce Chemical Co.)を用いてタンパク質を
アッセイし、Monsignyら, Anal. Biochem., 175:525 (1988)のレゾルシノール/
硫酸法で多糖をアッセイした。表１に示すように、使用するCDAPの量が多いほど
、吸着タンパク質へのPS結合の程度が大きかった。

【００７２】 HEPESバッファー(pH7.3)においても反応を行った。表１に示すように、PSのタ
ンパク質への結合効率は、pH7.3において有意に低かった。

【００７３】この実験は、CDAPで活性化された多糖がアジュバントに吸着したタンパク質と
反応し、CDAP活性化の程度および結合のpHが、液相反応に類似する様式で結合効
率の程度に影響を与えることを示す。Lees, AらVaccine, 14:190(1996)。

【００７４】

【表１】

【００７５】実施例２．多糖/タンパク質インプット比を変化させることの影響 BSAを、アルヒドロゲルに吸着させ、CDAPで活性化されたデキストランを上述
したように調製して、図１に示す比率で吸着タンパク質に添加した。BSAに対す
るデキストランの量が増加するとともに、コンジュゲート形成するデキストラン
の割合が減少したが、コンジュゲート形成したデキストランの絶対量は全体的に
増加した(図１)。これは、PS/タンパク質インプット比を変化させることで、多
糖対タンパク質の比率を変化できることを示す。

【００７６】実施例３．非コンジュゲート、中性多糖はアルヒドロゲルに吸着しない３mgのデキストランまたはCDAP活性化デキストラン(10 mg/ml)を、3 mgのアル
ヒドロゲル吸着BSA(10 mg/mlで5 mMホウ酸ナトリウム(pH 9.3)に含有される)に
添加した。一晩の反応の後、１M酢酸ナトリウムを添加してpHを５まで減少させ
た。固相材料を遠心分離し、１mlの50 mM酢酸ナトリウム(pH 5)に３回再懸濁し
た。

【００７７】タンパク質および多糖の回収率を測定した。表２に示すように、デキストラン
はCDAPで活性化されない限り、たとえあったとしてもわずかなデキストランしか
固相タンパク質に吸着しなかった。この実験はまた、固相法により得られるコン
ジュゲートの回収率が優れていることも示す。同様の結果がPn14でも得られた。

【００７８】

【表２】

【００７９】実施例４．固相マトリクス上のモデルコンジュゲートワクチンの合成、およびマウスの免疫化 BSAを、アルヒドロゲルに吸着させ、上記「手順」の節で記載したように洗浄し
た。Pn14をCDAPで(上記「手順」の節で記載したように)活性化し、BSA/アルヒドロ
ゲルに添加した。一晩の反応の後、サンプルをクエンチし、連続した遠心分離に
より洗浄して、遊離PSを除去した。Pn14を単独でまたは吸着タンパク質と共にア
ルヒドロゲル(“Alhy.”)と混合させて、またCDAP活性化Pn14をアルヒドロゲル
と混合させることにより対照を調製した。

【００８０】１群４匹のBalb/cマウスを、０、14および28日目に、固相合成により調製され
たコンジュゲートとして、または表３に示すものとしての2.5μgのPn14で皮下免
疫した。コンジュゲート群のマウスには３μgのBSAを与えた。BSAのみの群は５
μgのBSAを与えた。42日目の採血から得た血清を、ELISAによりPn14のIgG抗体に
ついて測定した。

【００８１】この実験は、固相アプローチにより調製されたコンジュゲートを用いて、抗多
糖抗体を誘導できることを示す。多糖とタンパク質との共有結合がない場合には
、抗多糖抗体は検出されなかった。多糖とタンパク質との共有結合は、多糖が(
例えば、CDAPにより)活性化された場合にのみ生じる。この実験では、固相で調
製されたコンジュゲートと、従来の方法により調製されたコンジュゲートとの効
力を比較しなかった。

【００８２】

【表３】

【００８３】Ｂ．抗体誘導 Streptococcus pneumoniae（肺炎連鎖球菌）の防御抗体を誘導することが示さ
れている抗原を用いた。これらの実施例では、提案するワクチン成分であるホス
ホリルコリン(PC)および肺炎球菌表面タンパク質Ａ(PspA)を用いて、S.pneumoni
aeの防御抗体、高力価防御抗体を誘導する。

【００８４】実施例５．固相アジュバントマトリクスを使用した、臨床上適切なコンジュゲートワクチンの合成融合タンパク質(RSV Fタンパク質)を、HEp-2細胞中で培養したRSウイルスから
精製し、アルヒドロゲルに吸着させた。アルヒドロゲル吸着タンパク質を、遠心
分離により洗浄して、非吸着タンパク質を除去し、CDAP活性化Pn14に結合させた
。非コンジュゲートPn14を遠心分離により除去した。１群４匹のBalb/cマウスを
、０および14日目に、アルヒドロゲル上で調製した2.0μgのＦタンパク質Pn14コ
ンジュゲート、またはアルヒドロゲルに吸着させた２μgのＦタンパク質を５μg
のPn14と混合したもので、皮下免疫した。追加のアルヒドロゲルをそれぞれの免
疫原と混合して、各マウスに１回の免疫につき合計0.1 mgのアルヒドロゲルを与
えるようにした。抗Ｆタンパク質および抗Pn14 ELISA力価を、28日目に採血した
マウスから得た血清に対して測定した。

【００８５】上記血清を、オプソニン食作用を促進する能力についてテストした。コンジュ
ゲート形成されたPn14で免疫したマウスから得た血清のみがオプソニン食作用活
性を有することが分かった。この実験は、固相系を使用してPn14にコンジュゲー
ト形成されたRSV Ｆタンパク質を用いて調製したコンジュゲートワクチンが、PS
およびタンパク質成分の両方に対して高力価抗体を誘導することを示す。対照的
に、Pn14と混合した固相Ｆタンパク質で免疫されたマウスは、多糖に対して力価
を生じなかった。結果を表４に示す。

【００８６】

【表４】

【００８７】実施例６．防御性のある高力価抗ホスホリルコリン(PC)抗体の誘導 PCに対する高力価の防御抗体を誘導できるか否かを研究するために、本質的に
「方法」に記載するように、PC類似体を破傷風トキソイドまたは百日咳トキソイド
と結合してコンジュゲートを形成させ(PC-TT、PC-PT)、DBA/2マウスを５μgのタ
ンパク質で免疫した。14日後にマウスを追加免疫し、28日目の血清をPCのIgG抗
体について測定した。表５に示すように、マウスは、追加免疫後、刺激されて、
高力価の抗PC抗体を生成した。TTまたはPTコンジュゲートを注射した全てのマウ
スが、担体分子(図示せず)に対する高力価抗体反応も高めた。

【００８８】

【表５】

【００８９】上記免疫原により誘導された抗PC抗体が防御性のものか否かをテストするため
に、マウスに0.1mlのテスト血清または対照血清を注射した。24時間後、マウス
を20,000体のS.pneumonia由来WU2株に感染させた。注射を受けた５匹の対照マウ
スが72時間以内に全て死んだのに対して、抗PC含有血清を投与されたマウスは全
く死ななかった。これは、PCを、臨床上適切な担体とコンジュゲート形成するこ
とにより、高力価の防御抗体を生成できることを示す。

【００９０】実施例７．多数のS.pneumoniaeエピトープに対する抗体の誘導 PCを別のS.pneumoniae防御エピトープとコンジュゲート形成し、両方の成分に
対する抗体を誘導できるか否かを調べるために、「方法」に記載したようにPC類似
体を肺炎球菌表面タンパク質Ａ(PspA)とコンジュゲート形成させ、5.0μgを５匹
のDBA/2マウスに０および14日目に皮下注射した。14日後にマウスから採血し、
血清を、PCおよびPspAの両方に対するIgG抗体について測定した。５μgのPsP-A
または５μgのPsPAを、アルヒドロゲルと溶解または混合した。表６のデータは
、ワクチンのPCおよびPspA成分の両方に対して高力価のIgG抗体を誘導できるこ
とを示す。

【００９１】

【表６】

【００９２】実施例８．非コンジュゲートタンパク質を含むコンジュゲートは免疫性および防御性を有する TTを、CDAPを用いてPn14とコンジュゲート形成させ、S400HRカラム上でのゲル
濾過により遊離タンパク質を除去した。別な一定量の同じコンジュゲートは、透
析のみ行ったところ(カットオフ値、14 kDa)、約50％の非コンジュゲートTTを含
んでいた(サイズ排除HPLCで測定)。多糖の回収率は、透析のみのサンプルの方が
ゲル濾過サンプルよりも顕著に高かった(＞95％対37％)。１群４匹のマウスを、
０および14日目に各調製物で免疫し、その14日後に採血した。抗IgG力価をELISA
により測定した。抗タンパク質力価および抗Ps抗体力価の両方とも、透析のみの
調製物の方がより高かった。

【００９３】

【表７】

【００９４】データは、コンジュゲート形成されたタンパク質と共に存在する、同種非コン
ジュゲートタンパク質が、遊離タンパク質を除去したコンジュゲートよりも、免
疫反応を刺激することを示唆する。つまり、固相タンパク質-多糖免疫原中の非
コンジュゲート吸着タンパク質の存在により、従来の調製物よりもエンハンスさ
れた免疫反応が得られる。

【００９５】実施例９．固相アジュバントを用いて様々なPSおよび結合化学作用で調製された TTPSコンジュゲートの免疫原性 TTをアルヒドロゲルに吸着させ、Pn14またはナイセリアPsCのいずれかと結合
させた。Pn14をCDAPで活性化し、チオエーテル化学またはハロアシル(haloacyl)
コンジュゲート形成法を用いて結合させた。チオエーテル化学法は、Lees, Vacc ine , 12:1160(1994)に概ね記載されている。ハロアシルコンジュゲートは、例え
ば、Leesら, Abstract for 11th Int.Pathogen.Neisseria Conf., Nice, France
, p. 161(1998)に記載されている。コンジュゲート形成の後、遊離PSを遠心分離
により除去し、固相コンジュゲートをPSおよびTTグループについてアッセイした
。４匹のBalb/cマウスを、０および14日目に、指示量のTTを含む５μｇのコンジ
ュゲート形成されたPSで免疫し、14日後に採血した。28日目の採血から得た血清
を、ELISAにより同種PSおよびTTについてアッセイした。

【００９６】

【表８】

【００９７】これは、本方法が、様々な異なる化学作用、タンパク質、および多糖に対して
適していることを示す。ハロアシル/PsCコンジュゲートが高い抗PsC反応を示し
、液相TT-(ハロアシル)-PsCコンジュゲートが不在な場合の結果と一致すること
に留意されたい。コンジュゲート形成プロトコールまたは用量を最適化すること
は試みなかった。この実験の目的は、様々な化学作用を用いて、多糖を結合し、
抗体を誘導できることを示すことであった。さらに、抗PsC力価および抗Pn14力
価を比較することはできなかった。

【００９８】以下の４つの実施例は、二重コンジュゲートワクチンの調製を示す。さらなる
参考文献として、米国特許第5,955,079号を引用し、この開示内容の全てを参考
として本明細書に取り入れるものとする。

【００９９】実施例１０．PSをアジュバント吸着ハプテン-タンパク質とコンジュゲート形成
させる(図３(II)に概ね記載) 破傷風トキソイド(TT)を、上述したようにアルヒドロゲルと吸着させ、HEPES
緩衝液(0.15 M HEPES、2 mM EDTA、pH 7.3)に5 mg/mlで再懸濁させた。0.1 Mの
Ｎ-ヒドロキシスクシンイミジル・ヨード酢酸のジメチルホルムアミド溶液(SIA)
を、SIA対TTが10倍モル比となるように、添加し、暗所で反応させた。１時間後
、TTを、HEPES緩衝液との遠心分離により洗浄し、非反応試薬を除去した。ヨー
ドアセチル化(iodoacetylated)吸着TTを、HEPES緩衝液に10 mg/mlで再懸濁した
。

【０１００】毒素原性大腸菌由来のコンセンサスペプチド(FJ Casselsら J. Industrial Mi crobiology and Biotechnology 19:66 (1997)(配列：CVEKNITVTASVDPTIDLLQADGS
ALPSAVALTYSPAG))をHEPES緩衝液＋10％アセトニトリルに10 mg/mlで溶解した。
エルマン試薬を用いて、遊離チオール含量を測定した。

【０１０１】 TT１モル当たり10モルの遊離チオールの比率となるよう、ヨードアセチル化吸
着TTにペプチドを添加する。一晩反応させた後、溶液に0.2mMメルカプトエタノ
ールを加えて１時間置き、その後遠心分離を繰り返して洗浄し、HEPES緩衝液に
再懸濁する。TTの最終濃度は10 mg/mlである。

【０１０２】 10 mg/mlのPn14をCDAPで活性化し、他の実施例に記載するように吸着ペプチド
/TTに結合させる。

【０１０３】あるいはまた、Houenらに概ね記載されるように、ペプチドを吸着タンパク質
に結合させる。PSを、他の実施例に記載されるように、吸着ペプチド-タンパク
質に結合させる。

【０１０４】実施例１１．固相に吸着させる前にハプテン-タンパク質を調製する(概ね図３(I )に記載) TTをHEPES緩衝液に5 mg/mlで懸濁し、10倍モル過剰のSIAと反応させる。１時
間後、タンパク質を脱塩し、Ultrafree 30装置(Millipore)を使用して10 mg/ml
まで濃縮する。ペプチドを上述したように調製し、添加する。ON反応の後、溶液
を0.2 mMメルカプトエタノールで反応を止め、１時間置く。非コンジュゲートペ
プチドをS200HRカラム(Pharmacia)でゲル濾過により除去し、生理食塩水で平衡
化する。ペプチド-TT画分を、10 mg/mlまで濃縮し、アルヒドロゲルに吸着させ
た。

【０１０５】 10 mg/mlのPn14をCDAPで活性化し、他の実施例に記載するように、吸着ペプチ
ド/TTに結合させた。

【０１０６】実施例１２．吸着タンパク質-Psに結合したハプテン(図３(III)に概ね記載) Pn14を、記載するように、アルヒドロゲルが吸着したTTとコンジュゲート形成
する。吸着Pn14-タンパク質を、上述したようにSIAでヨードアセチル化する。上
述したようにペプチドを調製し、ヨードアセチル化タンパク質/Psに添加する。
一晩反応させた後,溶液をメルカプトエタノールで反応止め、非コンジュゲート
ペプチドを、遠心分離と洗浄の繰返しにより除去する。

【０１０７】実施例１３．タンパク質の吸着多糖とのコンジュゲート形成特定のPsは、アルヒドロゲルとよく吸着する(例えば、Neisseria meningiditi
s A.(Neiss PsA))。Neiss PsAを、水に10 mg/mlで懸濁し、等量のアルヒドロゲ
ルと混合する。１時間後、非吸着Psを、遠心分離による洗浄で除去し、生理食塩
水に10 mg/mlで再懸濁する。

【０１０８】吸着したPsをCDAPで活性化する。100 mg/mlのCDAP含有アセトニトリル溶液を
、１mgの吸着Ps当たり１mgのCDAPとなるよう加えた。30秒時点で、pHを9.5まで
上昇させ、0.2 MTEA溶液を用いて、さらに２分間そのpHを維持させる。2.5分時
点において、１mgTT/mg Psの割合でTTを添加し、pHをすぐに９に調節する。３時
間の反応後、非吸着タンパク質を洗浄/遠心分離により除去する。他の実施例と
同様に、ハプテンは、吸着Psに結合させる前でも後でもタンパク質に添加できる
。

【０１０９】実施例１４．固相インチミン(intimin)-多糖コンジュゲート本実施例は、タンパク質のアルヒドロゲルおよびアジュホスへの吸着、低等電
点および高等電点を有する固相アルミニウムアジュバントを示す。本実施例は、
アルヒドロゲルに吸着する、負に荷電された多糖とのコンジュゲートが、アジュ
ホスに吸着したタンパク質上で調製できることを示す。コンジュゲートは、マウ
スにおける抗多糖免疫反応を誘導する。

【０１１０】インチミンは、腸上皮への付着を促進する細菌タンパク質であり、とりわけ、
EHEC O157:H7株の毒素である。インチミンは、9.35の等電点を有するため、塩基
性タンパク質であり、アルヒドロゲルおよびアジュホスの両方によく吸着するこ
とが分かっている。

【０１１１】Ａ．肺炎球菌14型多糖の、アルヒドロゲルに吸着したインチミンへの共有結合組換えインチミンを大腸菌から精製し(M. L. McKeeおよびA.D.O’Brien, Infe ct.Immun. , 64:2225(1996))、20 mM酢酸ナトリウム(pH 5.8)に透析した。1.4 ml
のインチミン(約１mg/ml)を、1.4 mgのアルヒドロゲルと混合した。１時間後、
吸着した材料を遠心分離し、20 mM HEPES(pH 8)中に10 mg/mlで再懸濁した。肺
炎球菌14型多糖(Pn14)を、以下に記載するように、１-シアノ-４-ジメチルアミ
ノピリジン・テトラフルオロホウ酸(CDAP)で活性化した。2 mgのPn14(生理食塩
水中10 mg/ml)に対して、50μlのCDAP(アセトニトリル中100 mg/ml)を添加した
。30秒時点で、100μlの0.2 Mトリエチルアミンを添加した。2.5分時点で、活性
化Pn14をインチミンの懸濁液と混合した。混合物を、３時間穏やかに攪拌し、20
mM酢酸ナトリウム(pH 5.8)に一晩透析した。非吸着材料を、２回の遠心分離お
よび同じ緩衝液への再懸濁により除去した。最終的なペレットを、20 mM酢酸ナ
トリウムに最終容量が0.64 mlになるまで再懸濁した。BCAアッセイを用いて吸着
タンパク質を測定し、レゾルシノール/硫酸アッセイで多糖を測定したところ、
インチミン１mgにつき0.4 mgのPn14がみとめられた。

【０１１２】 Neisseria meningiditis多糖Ａ(PsA)、すなわち負に荷電された高分子が、ア
ジュホスではなくアルヒドロゲルに吸着したことが分かった。

【０１１３】 1 mg PsA(10 mg/ml、水)を1 mg アジュホス(50 mM炭酸ナトリウム中5 mg/ml、
pH 9.3)と混合した。室温にて15分間インキュベートした後、非吸着材料を遠心
分離により除去し、同じ緩衝液に２回懸濁した。レゾルシノール/硫酸アッセイ
を用いて、３％未満の多糖が吸着されたと決定した。1 mgのPsAを1 mgのアルヒ
ドロゲルと25 mM酢酸ナトリウム(pH 5)中でインキュベートし、非吸着材料を遠
心分離により除去し、同じ緩衝液に再懸濁した場合、25％を上回る多糖がアルヒ
ドロゲルに吸着していることが分かった。つまり、次の実施例に例示するように
、アジュホスは負に荷電された炭水化物の固相コンジュゲートを調製するのに適
している。

【０１１４】Ｂ．Neisseria meningiditis多糖Ａの、アジュホスに吸着したインチミンへの共有結合 1 mlの組換えインチミン(吸光度、280 nm＝1.5)を20 mM酢酸ナトリウム(pH 5.
8)に含有させた溶液を、同じ緩衝液に含有された2.5 mgのアジュホス(Accurate
Scientific, NYから入手可能)と混合した。１時間後、溶液を２回、遠心分離お
よび20 mM酢酸ナトリウム(pH 5.8)に懸濁し、最終的に100μlの同緩衝液に再懸
濁した。1997年5月7日に出願された同時係属中の米国特許出願第08/852,733号(
特に参考として本明細書に取り入れる)に概ね記載されるように、Neisseria men
ingiditis多糖Ａ(PsA)を、平均分子量約25 kDaとなるまでHClで加水分解し、そ
の還元末端をビニルスルホンで誘導した。余分な試薬を透析で除去した。2.2 mg
のビニルスルホン活性化PsAを0.9 ml、吸着インチミンと合わせ、100μlの1 M炭
酸ナトリウム(pH 9)を添加した。暗所、４℃で一晩インキュベーションした後、
非吸着材料を遠心分離で除去し、生理食塩水に再懸濁した。最終的なペレットを
0.5 mlの20 mM酢酸ナトリウム(pH 5.8)に再懸濁した。上述のアッセイを用いて
、懸濁液が1 mgのインチミンにつき0.2 mgのPsAを含有すると決定した。

【０１１５】Ｃ．アルヒドロゲルおよびアジュホス上での固相として調製されたインチミン-
多糖コンジュゲートの免疫原性比較のために、破傷風トキソイドを、液相反応で、Pn14およびPsAに共有結合
させた。１群４匹のBalb/Cマウスを、０および14日目に2.5μgの多糖で免疫する
。28日目にマウスから採血し、ELISAにより血清を抗多糖抗体についてアッセイ
した。

【０１１６】

【表９】

【０１１７】実施例１５．酸化アルミニウムナノ粒子様々な固相アジュバント化粒子を用いて、固相タンパク質-多糖コンジュゲー
トワクチンを調製することができる。先の実施例では、水酸化アルミニウムおよ
びリン酸アルミニウムアジュバント(特に、それぞれ市販品であるアルヒドロゲ
ルおよびアジュホス)を採用してきた。以下の実施例は、その他の粒子の使用に
ついて記載する。

【０１１８】ペプチドは、機能性酸化アルミニウムナノ粒子(粒径：0.3μｍ)に共有結合さ
せて、免疫原として使用されている(Freyら, Bioconjugate Chem., 8:4204, (19
97))。これらの酸化アルミニウムナノ粒子は安定かつ均一であり、十分に特徴決
定されている。水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムアジュバントとは
異なり、酸化アルミニウムナノ粒子は「劣化」しない。これらの性質はワクチンを
製造する上で利点となりうる。クロロアセチル基で誘導された酸化アルミニウム
粒子(0.3μ)は、National Institutes of Health, Bethesda, MDのF.A.Robey博
士から提供された。これらの調製は、Freyら, Bioconjugate Chem., 8:4204, (1
997)に概して記載されている。非誘導型酸化アルミニウム粒子は、Fluka(#06280
)から購入した。

【０１１９】破傷風トキソイド(TT)を、以下のようにして酸化アルミニウム粒子に吸着させ
た。すなわち、酸化アルミニウム粒子を、水に2 g/mlで懸濁し、3 mgのTT(2M Na
Cl中14.5 mg/ml)を添加した。１時間のインキュベーションの後、非吸着材料を
遠心分離により除去し、水に再懸濁させた。45 mgの追加の酸化アルミニウムを
非吸着TTと混合し、上述したように処理した。吸着TTを全て合せて、0.32 ml PB
Sに再懸濁した。BCAアッセイによれば、サンプルは1.8 mg TTを含有していた。3
mgのPn14(水中に10 mg/ml)を、30μlのCDAP(アセトニトリル中に100 mg/ml)を
添加して活性化し、その30秒後に60μlの0.2 Mトリエチルアミンを添加した。2.
5分時点で、活性化Pn14を、酸化アルミニウムに吸着したTTに添加した。４時間
後、100μlの1 Mグリシン(pH 8)を添加して反応を止め、非吸着材料を遠心分離
により除去し、生理食塩水に再懸濁した。最終的なコンジュゲートを、1 mlの生
理食塩水に再懸濁し、1 mgのTTにつき0.6 mgのPn14を含むと決定した。

【０１２０】対照として、非活性化Pn14を、酸化アルミニウムに吸着したTTと混合し、上述
したように処理した。この調製物は偽コンジュゲート(sham conjugate)と称し、
1 mgのTTにつき0.3 mg未満のPn14を含有していた。

【０１２１】以下のように、TTを、クロルアセチル(chloracetyl)誘導型酸化アルミニウム
ナノ粒子と共有結合させた。すなわち、チオプロピルジチオピリジルＮ-ヒドロ
キシスクシンイミド(8μlの10 mM溶液)を、2 mgのTT(2 M NaCl + 25 Ml 0.75 M
HEPES、10 mM EDTA(pH 7.3)中14.5 mg)に添加した。２時間後、30μl 1 M酢酸ナ
トリウム(pH 5)を９μlの0.5 Mジチオスレイトールと共に添加した。30分後、P6
DGカラム(BioRad)上で溶液を脱塩し、10 mM酢酸ナトリウム、0.15 M塩化ナトリ
ウム(pH 5)で平衡化した。Ultrafree 30装置(Millipore)を用いて、ボイドボリ
ューム画分を230μlまで濃縮した。１モルのTTにつき3.7モルのチオールが存在
することを決定した。チオール-TTを、20μl 0.1 M EDTA + 50μl M HEPES(pH 8
)に懸濁した50 mgの活性化酸化アルミニウムの懸濁液に添加した。一晩のインキ
ュベーションの後、遠心分離により樹脂を３回洗浄し、PBSに再懸濁し、最終容
量を200μlとした。次いで、４μlの10 mMメルカプトエタノールを添加して反応
を止めた。30分後、遠心分離により再度樹脂を洗浄し、0.2 ml PBSに再懸濁した
。BCAアッセイを使用して、0.59 mgのTTが樹脂とコンジュゲート形成しているこ
とが分かった。100 mg/mlのCDAPの溶液(10μl)を、10 mg/mlのPn14の溶液(100μ
l)に添加することにより、肺炎球菌14型多糖をCDAPで活性化した。30秒後、20μ
lの0.2 Mトリエチルアミンを添加した。2.5分時点において、CDAPで活性化され
たPn14を、酸化アルミニウムに共有結合したTTの溶液に添加した。一晩のインキ
ュベーションの後、50μlの1 Mグリシン(pH 8)を添加して反応を止め、PBSを用
いた遠心分離により洗浄し、0.2 ml PBSに再懸濁した。生成物は、1 mgのTT当た
り0.2 mgのPn14を含有すると決定した。

【０１２２】TT-P14コンジュゲートの免疫原性１群４匹のBALB/Cマウスを、０および14日目に、2.5μgの肺炎球菌多糖(単独
またはコンジュゲート形成したもの)で免疫した。比較のために、液相TT-Pn14コ
ンジュゲートを含めた。(第２群のマウスも同様に免疫した。この実験で得た力
価を括弧内に示す。)

【表１０】

【０１２３】上記結果は、酸化アルミニウム樹脂を用いて、タンパク質-多糖コンジュゲー
トが調製できることを示す。上記結果はまた、タンパク質と樹脂との共有結合が
吸着よりも優れうることを示す。

【０１２４】上記記載は、本発明の様々な実施形態に関する。上記記載に対して、請求項に
定義する本発明の思想および範囲から逸脱することなく、多くの変更および改変
を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、多糖とタンパク質との比を変えたときの影響を示すグラフである。

【図２】図２（a）は、固相アジュバントにタンパク質を吸着させた後、遠心分離を行
って、固相アジュバント化タンパク質を生成する工程を示し、図２（b）は、固
相タンパク質に活性化多糖をコンジュゲート形成させた後、過剰な活性化多糖を
除去するために遠心分離を行って、固相タンパク質-多糖コンジュゲートワクチ
ンを生成する工程を示す。

【図３】図３は、２成分コンジュゲートワクチンの調製のための３つの経路を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 ＤＪＮ 47/48 47/48 Ａ６１Ｐ 31/04 Ａ６１Ｐ 31/04 31/10 31/10 31/12 31/12 33/00 33/00 39/00 39/00 Ｃ０７Ｋ 16/00 Ｃ０７Ｋ 16/00 // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＦターム(参考） 4B065 AA90X AC14 CA24 CA25 CA45 4C076 CC31 CC34 CC35 CC41 EE38 EE41 EE59 FF68 4C085 AA03 AA04 AA13 AA14 AA19 AA22 AA38 BA16 BA33 BA34 BA47 BB12 BB13 BB15 CC07 CC08 CC24 CC33 DD51 DD73 EE06 FF02 FF13 FF14 GG02 GG03 GG04 4H045 AA10 AA11 BA10 BA53 BA60 CA10 CA20 CA40 DA76 DA86 EA20 EA50 FA50 FA72

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】固相ワクチンを調製する方法であって、 a）固相アジュバントにタンパク質を吸着させる工程と、 b）吸着させたタンパク質に炭水化物を共有結合で結合させる工程と、を含み、該タンパク質および該炭水化物が両方とも免疫応答を誘導することがで
きることを特徴とする、上記方法。
【請求項２】前記炭水化物がオリゴ糖または多糖である、請求項１記載の
方法。
【請求項３】前記炭水化物がPn14またはナイセリア属細菌PsCである、請
求項１記載の方法。
【請求項４】工程b)の前に前記炭水化物を活性化する工程をさらに含む、
請求項１記載の方法。
【請求項５】前記活性化工程がCDAPの作用によって行われる、請求項４記
載の方法。
【請求項６】工程b)の前または後に前記タンパク質にハプテンを付加する
工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】遠心分離、沈降、または濾過によって前記固相ワクチンを精
製する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】前記タンパク質が、ウイルス、細菌、寄生生物、動物または
真菌タンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項９】前記タンパク質が、Fタンパク質、PspA、破傷風毒素、ジフ
テリア毒素、細菌外膜タンパク質、ウイルス外膜タンパク質、またはこれらの組
合せである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】前記オリゴ糖または多糖が天然のものまたは合成されたも
のである、請求項１記載の方法。
【請求項１１】固相ワクチンを調製する方法であって、 a）固相アジュバントに炭水化物を吸着させる工程と、 b）吸着させた炭水化物にタンパク質を共有結合で結合させる工程と、を含み、該タンパク質および該炭水化物が両方とも免疫応答を誘導することがで
きることを特徴とする、上記方法。
【請求項１２】請求項１記載のワクチンおよび製薬上許容可能な担体を含
む、ワクチン。
【請求項１３】免疫促進量の請求項１２記載のワクチンを患者に投与する
ことを含む、患者の治療方法。
【請求項１４】前記ワクチンを静脈内、筋肉内または皮下投与する、請求
項１３記載の方法。
【請求項１５】細菌、リケッチア、ウイルス、寄生生物、真菌または化学
物質が原因で起こる疾病に対する抗体を調製する方法であって、請求項１２記載
のワクチンで免疫して該免疫原に対する抗体を産生させる工程、およびドナーか
ら該抗体またはB細胞を単離する工程を含む、上記方法。
【請求項１６】請求項１５記載の方法によって調製された抗体を含む、免
疫治療用組成物。
【請求項１７】モノクローナル抗体を産生するために前記B細胞が使用さ
れる、請求項１６記載の免疫治療組成物。
【請求項１８】治療上有効な量の請求項１７記載の免疫治療用組成物を患
者に投与することを含む、患者の治療方法。
【請求項１９】請求項１５記載の方法によって調製された抗体を含む、診
断用試薬。
【請求項２０】請求項１５記載の方法によって調製された抗体を含む、研
究用試薬。