ES2237210T3 - Metodo para preparar vacunas conjugadas en fase solida. - Google Patents

Abstract

Un método para preparar una vacuna en fase sólida, que comprende las etapas de: a) adsorber una proteína a un adyuvante en fase sólida b) unir de manera covalente un carbohidrato a la proteína adsorbida, donde tanto la proteína como el carbohidrato son capaces de inducir una respuesta inmune c) purificar la vacuna en fase sólida por centrifugación, sedimentación o filtración.

Description

Método para preparar vacunas conjugadas en fase sólida.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a vacunas conjugadas. Más particularmente, la presente invención se refiere a vacunas conjugadas en fase sólida.

Descripción de las técnicas relacionadas

En el proceso de vacunación, la ciencia médica usa la capacidad innata del cuerpo de protegerse a sí mismo frente a agentes invasores inmunizando el cuerpo con antígenos que no provocarán la enfermedad pero que estimularán la formación de anticuerpos que protegerán frente a la enfermedad. Por ejemplo, se inyectan organismos muertos para proteger frente a enfermedades bacterianas tales como la fiebre tifoidea y la tos ferina, se inyectan toxinas para proteger frente al tétanos y botulismo, y se inyectan organismos atenuados para proteger frente a enfermedades virales tales como la poliomielitis y el sarampión.

Sin embargo, no siempre es posible estimular la formación de anticuerpos simplemente inyectando el agente extraño. La preparación de vacuna debe ser inmunógena, es decir, debe ser capaz de inducir una respuesta inmune. Ciertos agentes tales como el toxoide tetánico son inmunógenos de manera innata, y pueden administrarse en vacunas sin modificación. Sin embargo, otros agentes importantes no son inmunógenos y deben convertirse en moléculas inmunógenas antes de que puedan inducir una respuesta inmune. La respuesta inmune es una serie compleja de reacciones que puede describirse en líneas generales de la siguiente manera: (1) el antígeno entra en el cuerpo y encuentra células presentadoras de antígeno que procesan el antígeno y retienen fragmentos del antígeno en sus superficies; (2) los fragmentos antigénicos retenidos en las células presentadoras de antígeno se reconocen por células T que proporcionan ayuda a las células B; y (3) las células B se estimulan para proliferar y dividirse en células formadoras de anticuerpo que secretan anticuerpos frente al antígeno.

La mayoría de los antígenos solo obtienen anticuerpos con asistencia de células T y, por lo tanto, se conocen como T-dependientes (TD). Los ejemplos de dichos antígenos T-dependientes son los toxoides tetánico y diftérico.

Algunos antígenos, tales como polisacáridos, no pueden procesarse adecuadamente por células presentadoras de antígeno y no son reconocidas por células T. Estos antígenos no requieran la asistencia de células T para obtener la formación de anticuerpos pero pueden activar células B directamente y, por lo tanto, se conocen como antígenos T-independientes (TI). Dichos antígenos T-independientes incluyen polirribosil-ribitol-fosfato de H. influenzae tipo b y polisacáridos de la cápsula de pneumococos.

Otras diferencias entre los antígenos T-independientes y T-dependientes son:

a) Los antígenos T-dependientes, pero no los antígenos T-independientes, pueden preparar una respuesta inmune de modo que dan como resultado una respuesta de memoria en una estimulación secundaria con el mismo antígeno.

b) La afinidad del anticuerpo por el antígeno incrementa con el tiempo después de la inmunización con antígenos T-dependientes pero no con antígenos T-independientes.

c) Los antígenos T-dependientes estimulan un sistema inmune inmaduro o neonato de manera más eficaz que los antígenos T-independientes.

d) Los antígenos T-dependientes habitualmente estimulan anticuerpos IgM, IgG1, IgG2a, e IgE, mientras que los antígenos T-independientes estimulan anticuerpos IgM, IgG1, IgG2b, e IgG3.

Los antígenos T-dependientes pueden estimular respuestas primarias o secundarias que son de vida larga tanto en sistemas inmunes de adultos como de neonatos, pero frecuentemente deben administrarse con adyuvantes. Las proteínas muy pequeñas, tales como péptidos, raramente son inmunógenas, incluso cuando se administran con adyuvantes.

Los antígenos T-independientes, tales como polisacáridos, son capaces de estimular respuestas inmunes en ausencia de adyuvantes, pero no pueden estimular respuestas de anticuerpo de alto nivel o prolongadas. También son incapaces de estimular un sistema inmune inmaduro o deficiente en células B (Mond JJ., Immunological Reviews, 64:99 (1982) (Moiser DE, et al., J. Immunol., 119:1874 (1977). Para los antígenos T-independientes, es crítico proporcionar inmunidad de protección frente a dichos antígenos en niños, especialmente frente a polisacáridos tales como H. influenzae y S. pneumoniae. Para antígenos T-independientes, es crítico desarrollar vacunas basadas en péptidos sintéticos que representan los determinantes antigénicos primarios de diversos patógenos.

Una enfoque para potenciar la respuesta inmune a antígenos T-independientes implica conjugar polisacáridos tales como PRP de H. influenzae (Cruse JM, Lewis RE Jr. ed., Conjugate Vaccines in Contributions to Microbiology and Immunology, Vol. 10, (1989) o antígenos oligosacáridos (Anderson PW, et al., J. Immunol., 142:2464, (1989) con un antígeno T-dependiente tal como los toxoides tetánico o diftérico. Se ha mostrado que el reclutamiento de ayuda de células T proporciona inmunidad potenciada en muchos niños que se han inmunizado.

Las vacunas conjugadas de proteína-polisacárido estimulan una respuesta de anticuerpo anti-polisacárido en niños que de otro modo son incapaces de responder al polisacárido solo.

Las vacunas conjugadas son eficaces, pero caras de producir. Véase Cruse. Un problema en la preparación de vacunas conjugadas es retirar la proteína no conjugada de la proteína unida de manera covalente. Típicamente, esto se hace por filtración en gel de exclusión de tamaño y requiere una columna grande y especializada. Houen et al. demostraron que los péptidos podían acoplase a proteínas absorbidas a adyuvantes de aluminio en fase sólida. Houen, G. et al., J. Immun. Meth., 206:125 (1997). Además, descubrieron que la respuesta de anticuerpo anti-péptido inducida por los conjugados en fase sólida era mayor que la inducida por conjugados preparados en fase de solución. La síntesis de estos conjugados en fase sólida era simple porque el péptido no conjugado y los reactivos podían retirarse por centrifugación de los componentes en fase sólida. En gran medida, ya que la fase sólida es adyuvante por sí misma, no había necesidad para el conjugado de retirarse de la estructura en fase sólida en la que se sintetizaba el inmunógeno. Esto supera una desventaja significativa de otros enfoques sintéticos en fase sólida. Pero Houen et al. no dirigieron aplicaciones no peptídicas, por ejemplo, carbohidratos.

El documento WO-A-9700697 (Peetermans, J. et al) describe una vacuna que comprende un antígeno conjugado con polisacárido que se adsorbe a fosfato de aluminio. El documento WO-A-9640239 (Jennings, H. et. al) describe una vacuna en la que polisacáridos modificados químicamente se conjugan con un vehículo proteico. El documento WO-A-983029 (Lees, A. et al) describe un proceso para preparar un conjugado proteína-polisacárido, donde el polisacárido de peso molecular bajo se retira por diálisis o ultrafiltración.

Kossovsky analiza "vehículos liberadores de antígeno" hechos de una nanopartícula de diamante que está recubierta con celobiosa, un disacárido, para formar una "superficie coloide" que podría unirse a un antígeno proteico. Kossovsky et al., Bioconj. Chem. 6(5), pág. 507-520 (1995). El vehículo de liberación de antígeno sirve para presentar el antígeno proteico para "provocar una respuesta inmunógena fuerte" al antígeno proteico. Esto no se busca, y de hecho no sería deseable provocar cualquier respuesta inmunógena al disacárido, porque la celobiosa es una unidad repetida de celulosa, que es un aditivo habitual para alimentos.

De este modo, permanece una necesidad de la técnica de simplificar la preparación de vacunas conjugadas con vehículos duales en fase sólida, en particular la retirar de hapteno libre, proteína y polisacárido.

Sumario de la invención

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención es proporcionar un método mejorado para preparar vacunas conjugadas en fase sólida.

Otro aspecto de la invención es proporcionar un método mejorado para purificar una vacuna conjugada que contiene un carbohidrato.

Otro aspecto de la invención es proporcionar un método mejorado para preparar vacunas conjugadas en fase sólida que contienen una fase sólida de aluminio, una proteína y un carbohidrato.

Otro aspecto más de la presente invención es proporcionar un método mejorado para prepara vacunas conjugadas en fase sólida que contienen un hapteno.

Los aspectos adicionales de la invención se expondrán en parte en la siguiente descripción, y en parte se harán evidentes a partir de la descripción, o pueden aprenderse por la práctica de la invención. Los aspectos de la invención se realizarán y se conseguirán por medio de los elementos y combinaciones particularmente señalados en las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención proporciona un nuevo método para preparar vacunas conjugadas en fase sólida, donde una proteína se adsorbe primero a un adyuvante en fase sólida y después un oligosacárido o polisacárido se une a la proteína adsorbida.

La presente invención proporciona adicionalmente un nuevo método donde un carbohidrato se adsorbe primero a un adyuvante en fase sólida y después una proteína se une de manera covalente al carbohidrato adsorbido.

La presente invención proporciona también adicionalmente un método donde el carbohidrato se activa antes de acoplarse a la proteína.

La presente invención proporciona también adicionalmente un método para preparar vacunas conjugadas en fase sólida, donde una hapteno se une a una proteína.

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Los procesos simples de bajo coste eliminan la necesidad de cromatografía y permiten la retirar rápida de carbohidrato no conjugado, que ha mostrado que inhibe la respuesta inmune.

Tanto la descripción general precedente como la siguiente descripción detallada de la invención son solo ejemplares y aclaratorias y no restrictivas de la invención reivindicada.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una representación gráfica de los efectos de proporciones variadas de polisacárido/proteína.

La Figura 2(a) ilustra la etapa de adsorber una proteína a un adyuvante en fase sólida, seguido por centrifugación para producir la proteína con adyuvante en fase sólida.

La Figura 2(b) ilustra la etapa de conjugar el polisacárido activado con una proteína en fase sólida, seguido por centrifugación para retirar el exceso de polisacárido activado para producir una vacuna conjugada proteína-polisacárido en fase sólida.

La Figura 3 ilustra tres vías para la preparación de una vacuna conjugada dual.

Descripción detallada de la invención

La química de fase sólida, un proceso en el que se realiza la química en moléculas unidas a superficies macromoleculares, se conoce bien en la técnica. G.B. Fields & S.P. Colowick, Ed., "Solid Phase Peptide Synthesis", Meth. Enzym., Vol. 289, Academic Press, 1997. En síntesis en fase sólida, los reactivos se retiran fácilmente y el producto se obtiene por simples etapas de lavado.

En la preparación de vacunas para vacunas humanas, es problemática la retirada del producto de vacuna de la fase sólida, que típicamente es un soporte polimérico. Una solución a este problema es usar, como fase sólida, material apropiado para inmunógenos, tales como adyuvantes de aluminio. Los adyuvantes de aluminio son solo adyuvantes aprobados para el uso pediátrico.

Se ha desarrollado un proceso mejorado para la síntesis de vacunas conjugadas proteína-polisacárido, en las que las macromoléculas, más particularmente polisacáridos, no haptenos, están unidos de manera covalente a la proteína adsorbida. Ya que incluso los polisacáridos de muy alto peso molecular no sedimentarán a baja velocidad, los polisacáridos conjugados se separan fácilmente del conjugado adsorbido a centrifugación. Esto proporciona una solución fácil y de bajo coste para la retirada del polisacárido no conjugado, que de otra manera sería difícil. Como se describió anteriormente, la proteína no conjugada pero adsorbida puede no necesitar retirarse y puede, de hecho, ser beneficiosa para potenciar la respuesta de anticuerpo frente al componente proteico.

Las actuales memorias descriptivas FDA no requieren que la proteína libre se retire de las vacunas conjugadas, pero ajustan la cantidad permisible de polisacárido libre. El polisacárido libre, especialmente cuando es mayor del 10% del total, ha mostrado inhibir la respuesta inmune humoral al polisacárido conjugado. Peeters, C. et al. Vaccine, 10:833, 1992. Por lo tanto, es importante que la cantidad de polisacárido libre en el producto final esté minimizada. Sin embargo, la retirada del polisacárido libre es difícil por filtración en gel, particularmente cuando el polisacárido es de alto peso molecular.

El método para acoplar en fase sólida permite la preparación de conjugados proteína-polisacárido, con proteínas que de otra manera serían poco solubles y difíciles de preparar como soluciones concentradas. Para conjugar la mayoría de las macromoléculas, es importante tener una concentración alta de los componentes. El método de fase sólida hace que esto se pueda conseguir que las proteínas adsorbidas puedan concentrarse fácilmente, con proteínas con las que sería difícil de hacer de otra manera. Por ejemplo, la proteína F (asilada del Virus Sincitial Respiratorio) no se concentraba fácilmente y era soluble solo en detergente. Hasta la fecha, la proteína F no se ha unido en una solución de detergente diluida a un polisacárido por un medio convencional. Sin embargo, es posible adsorber la proteína F a Alhydrogel, y unir después el polisacárido de manera covalente a la proteína adsorbida.

Las proteínas se adsorben a los adyuvantes de aluminio por medio de interacciones hidrófobas e iónicas. Al-Shakhshir R.H. et al., Vaccine 13:41, 1995. La unión a menudo es óptima cerca del punto isoeléctrico de la proteína. Debido al modo mezclado de la interacción, no puede predecirse con certeza la adsorción de las proteínas y deben determinarse experimentalmente las condiciones óptimas. La unión a veces es reversible. De este modo, es necesario usar una química que no use condiciones que desorban la proteína, o en la que la proteína pueda readsorberse fácilmente al adyuvante.

La proteína no está particularmente limitada. Los ejemplos de proteínas apropiadas incluyen, aunque sin limitación, proteínas virales, bacterianas, parasitarias, animales y fúngicas o lipoproteínas. Preferiblemente, la proteína albúmina (tales como la albúmina de suero bovino), la proteína F, el toxoide tetánico, el toxoide diftérico, o la proteína de membrana externa bacteriana, todas las cuales pueden obtenerse por compañías de suministro bioquímico o farmacéutico o prepararse por metodología convencional (Cruse, JM (ed.) Conjugate Vaccines in Contributions to Microbiology and Immunology, vol. 10(1989)). Otras proteínas apropiadas podrían conocerse por los especialistas en la técnica de inmunología.

Preferiblemente, el carbohidrato es un oligosacárido o polisacárido. Los ejemplos de carbohidratos apropiados incluyen, aunque sin limitación, polisacáridos neutros, tales como el polisacárido de la cápsula de pneumococos tipo 14 (Pn14), y dextrano, y polisacáridos cargados, tales como PsC de Neisseria, polisacárido de pneumococos tipo 6 (Pn6).

Preferiblemente, el carbohidrato está activado. El activador no está particularmente limitado. Los ejemplos de activadores apropiados incluyen, aunque sin limitación, CDAP (tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridina) y bromuro de cianógeno. La proteína puede añadirse directamente al polisacárido activado, simplificando la unión química de los dos componentes. Lees, A. et al., Vaccine, 14:190, 1996; véase también las Patentes de Estados Unidos Nº 5.651.971 y 5.693.326. Preferiblemente, el activador es CDAP. Diversas químicas permiten el acoplamiento de proteínas a carbohidratos, con o sin un espaciador.

El adyuvante de aluminio no está particularmente limitado. En general, pueden usarse sales de metales, por ejemplo, sales de aluminio y calcio. Los ejemplos de activadores apropiados incluyen, aunque sin limitación, alumbre (sulfato de potasio y aluminio), hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, oxohidróxido de aluminio, hidroxifosfato de aluminio, fosfato de calcio, nitrato de cerio, sulfato de cinc, hidróxido de hierro coloide, y cloruro de calcio. Varios adyuvantes de aluminio con diferentes propiedades físicas están disponibles en el mercado y aprobados para el uso humano. Preferiblemente, el adyuvante es hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio. R.H. Al-Shekhshir, et al., Vaccine, Vol. 13, 41; (1995); R.K. Gupta, et al., Vaccine, Vol. 11, 293 (1993), M.F. Powell, et al., "Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach", Pharmaceutical Biotech, Vol. 6, Plenum Press (1995). Alhydrogel (hidróxido de aluminio) con un punto isoeléctrico (P_{i}) de 11, adsorbe fácilmente muchas proteínas con un P_{i} bajo tales como el toxoide tetánico y BSA, pero no proteínas básicas tales como la lisozima. Adjuphos (fosfato de aluminio), con un Pi de 5, une lisozima pero no BSA. Al-Shakhshir R.H. et al., Vaccine 13:41, 1995. El punto isoeléctrico de Alhydrogel puede reducirse por la adición de fosfato, que aumenta la carga negativa del adyuvante y permite la adsorción de proteínas más básicas. Rinella Jr. J.V. et al., Vaccine 14:298, 1996.

Los polisacáridos neutros, tales como el polisacárido de la cápsula de pneumococos tipo 14 (Pn14) y dextrano, no se adsorben fácilmente a Alhydrogel. Por lo tanto, estos polisacáridos no conjugados se retiran fácilmente del conjugado por centrifugación repetida y resuspensión de la fase sólida.

Los polisacáridos cargados, tales como el polisacárido de pneumococos tipo 6 (Pn 6), pueden adsorberse al adyuvante. Para tales polisacáridos, será necesario determinar las condiciones en las que hay una adsorción mínima de polisacáridos libres. Esto puede hacerse modificando la carga de superficie del adyuvante en fase sólida con anión fosfato, que disminuye el punto isoeléctrico del adyuvante. Rinella Jr. J.V. et al., Vaccine 14: 298, 1996; Chang M. et al., PDA J. Pharm. Sci Tech., 51:25, 1997.

Otro problema potencial con el método de fase sólida es que las condiciones de reticulación deben controlarse cuidadosamente para preparar un producto homogéneo. En fase de solución los niveles altos de reticulación pueden conducir a un producto más viscoso pero aun útil. En la fase sólida, la reticulación puede conducir a la agrupación, haciendo difícil la administración de dosis uniformes. De este modo, es necesario optimizar las condiciones de conjugación, por ejemplo, grado de activación química del polisacárido y concentración de la proteína.

En una realización preferida, la metodología de adyuvante en fase sólida se usa para sintetizar un conjugado hapteno-proteína-polisacárido.

En otra realización preferida, los haptenos se acoplan a conjugados proteína-polisacárido de alto peso molecular para estimular las respuestas de anticuerpo potenciadas a los tres componentes de la vacuna: hapteno, proteína y polisacárido. La proteína y el hapteno se presentan en una serie multivalente en el polisacárido, conduciendo de este modo a la activación de células B potenciadas y a la secreción de anticuerpos potenciadas consecuentemente. Esto es una "vacuna conjugada dual", porque está compuesta por hapteno-proteína-polisacárido de alto peso molecular. Lees et al., Vaccine, 12:1160, 1994; Patente de Estado Unidos Nº 5.585.100.

En otra realización preferida, pueden conjugarse restos a uno o más de los componentes de proteína o polisacárido. Dicha conjugación promueve las respuestas de anticuerpo potenciadas al motivo. Las técnicas para conjugar dichos motivos son bien conocidas por los especialista en la técnica, incluyen, en parte, el acoplamiento a través de grupos funcionales apropiados (tales como grupos amino, carboxilo, tio y aldehído). Véase S.S. Wong, Chemistry of Protein Conjugate and Crosslinking, CRC Press (1991), y Brenkeley et al., "Brief Survey of Methods for Preparing Protein Conjugates With Dyes, Haptens and Cross-Linking Agents, "Bioconjugate Chemistry 3:1 (Enero 1992) G.T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, (1996). Como se usa en este documento, motivo es cualquier sustancia que es capaz de estimular la respuesta inmune por si misma o una vez acoplada. Los motivos incluyen haptenos, antígenos o combinaciones de los mismos.

Haptenos se refiere a moléculas orgánicas pequeñas, por ejemplo, péptidos, fosforilcolina, y TNP, que por si mismas no pueden obtener una respuesta de anticuerpo, pero pueden obtener una respuesta de anticuerpo una vez acopladas a un vehículo. Un antígeno es cualquier molécula que, en las circunstancias apropiadas, puede inducir la formación de anticuerpos. Estos haptenos y antígenos pueden obtenerse de, aunque sin limitación, de bacterias, rickettsias, hongos, virus, parásitos, fármacos, o productos químicos. Estos pueden incluir, por ejemplo, moléculas pequeñas tales como péptidos, oligosacáridos (por ejemplo, el poliribosil-ribitol-fosfato de H. influenzae), toxinas, endotoxinas, etc.

El enfoque de adyuvante en fase sólida es ideal para la preparación de vacunas conjugadas duales, ya que puede realizarse la química de conjugación secuencial en la proteína adsorbida, y la separación de componentes que no han reaccionado del conjugado adsorbido se consigue fácilmente. De este modo, la proteína adsorbida puede marcarse con hapteno, antes o después de acoplarse al polisacárido. Sin embargo, los haptenos cargados pueden unirse no específicamente a algunos adyuvantes. Con polisacáridos cargados, estos se pueden superar modificando la carga de superficie del adyuvante, o por selección de una fase sólida más apropiada, como un especialista en la técnica puede determinar fácilmente. Un ejemplo de un adyuvante en fase sólida es una partícula con propiedades potenciadoras inmunes.

En una realización preferida, se usa un adyuvante en fase sólida para sintetizar conjugados hapteno-proteína-polisacárido, usando antígenos que se han mostrado que contienen importantes epítopos de protección frente a S. pneumonia.

Los pneumococos tienen, además de polisacáridos de cápsula de tipo específico, una cantidad de antígenos habituales comunes en las especies. Fosforilcolina (PC) es un determinante principal del polisacárido C de pneumococos, y los anticuerpos frente a PF han mostrado proteger a ratones de infección de pneumococos experimental. Wallick, S. et al. J. Immunol., 130:2871, (1983); Mc Daniel L.S. et al., J. Immunol., 133:3308, (1984).

La proteína de superficie de pneumococos A (PspA) es un factor de virulencia expuesto de superficie que ha mostrado obtener inmunidad de protección frente a sepsis de pneumococos en ratones y puede obtener protección frente a pneumococos en cápsulas de tipos diferentes. Wu, H-Y et al., J. Infec. Dis., 175:839, 1997.

Una vacuna que se prepara de acuerdo con la invención es útil para el tratamiento de un paciente por administración de una cantidad inmunoestimuladora de la vacuna. Un paciente es cualquier sujeto para el que el tratamiento puede ser beneficioso e incluye, aunque sin limitación, mamíferos, preferiblemente humanos, caballos, vacas, perros y gatos así como aves, tales como gallinas.

Una cantidad inmunoestimuladora se refiere a una cantidad de vacuna que es capaz de estimular la respuesta inmune del paciente para la prevención, mejora o tratamiento de enfermedades. La vacuna de la invención puede administrarse por cualquier vía, pero se administra preferiblemente por inyecciones intravenosas, intramusculares, y subcutáneas.

La vacuna preparada de acuerdo con la invención puede también usarse en un método para preparar un agente inmunoterapéutico frente a infecciones causadas por bacterias, virus, parásitos, hongos, o productos químicos inmunizando un hospedador con la vacuna descrita anteriormente de modo que el donante produce anticuerpos dirigidos frente a la vacuna. Los anticuerpos podrían asilarse o pueden obtenerse células B para fusionarlas después con células de mieloma para producir anticuerpos monoclonales. El método de preparación de anticuerpos monoclonales se conoce bien en la técnica, Kohler y Milstein, Nature 256:495 (1975), y se incorpora específicamente en este documento como referencia, y no necesita descripción adicional aquí.

Los agentes inmunoterapéuticos se refieren a una composición de anticuerpos que está dirigida frente a inmunógenos específicos para usar en tratamiento pasivo de pacientes. Un donante de plasma es cualquier sujeto al que se inyecta una vacuna para la producción de anticuerpos frente a los inmunógenos contenidos en la vacuna.

La vacuna preparada de acuerdo con la invención puede también usarse en un método para tratar un paciente mediante la administración de una cantidad protectora del agente inmunopterapéutico. Dicho tratamiento es pasivo en que no está preparado para producir anticuerpos en el paciente frente a un inmunógeno, si no que prefiere usar anticuerpos producidos por el donante de plasma frente al inmunógeno. La cantidad de anticuerpos terapéuticos protectora si está presente una cantidad suficiente de anticuerpos que puede prevenir, mejorar, o tratar la enfermedad causada por el inmunógeno. Dicha cantidad puede determinarse por los especialistas en la técnica y varía en base a las características del paciente y el perfil de la enfermedad.

La invención también se refiere a un método para producir un reactivo de diagnostico y/o investigación para detectar agentes que son característicos de enfermedades causadas por, por ejemplo, bacterias, virus, hongos, parásitos o productos químicos inmunizando un hospedador con una vacuna descrita anteriormente de modo que el hospedador produce anticuerpos (o células B) frente a los agentes. Los anticuerpos y/o células B pueden asilarse como se ha descrito anteriormente. Como se usa en este documento, el reactivo de diagnostico se refiere a una composición de anticuerpos (policlonal o monoclonal) que puede usarse para detectar agentes que son característicos de enfermedades. Como se usa en este documento, reactivo de investigación se refiere a una composición de anticuerpos (policlonal o monoclonal) que puede usarse en el laboratorio.

Metodología

El proceso completo para preparar un conjugado en fase sólida se ilustra en la Figura 3.

Reactivos

Los pneumococos tipos 6B y 14 están disponibles en la ATCC. El toxoide tetánico está disponible en el Statens Seruminstitute (Dinamarca). Los adyuvantes de aluminio estabilizados, Alhydrogel (hidróxido de aluminio) y Adjuphos (fosfato de aluminio) están disponibles en Accurate Chemical (Westbury, NY). El análogo de fosforilcolina, ácido 6-(O-fosforilcolina) hidroxihexanoico (PC-CO_{2}H), preparado por el método de Spande fue un obsequio de Kenny, (National Institute on Aging, NIH). Spande, T, F,. J. Org Chem., 45:3081, (1980).

La proteína de superficie de pneumococos recombinante A (rPspA), que está compuesta por 290 aminoácidos N-terminales y un C-terminal 6xHis, se puso a crecer en células de levadura como se describe en Wortham et al., Infect Immun., 66:1513, 1998. Después de la purificación inicial por cromatografía en Ni-NTA (Qiagen), la proteína puede purificarse adicionalmente por cromatografía de intercambio iónico de la siguiente manera: La fracción de Ni-NTA se dializó en TrisHCL 5 mM + Tris 15 mM y se cargó en una columna Mono Q equilibrada con el mismo tampón. La sal se gradúa con NaCl 50 mM y la proteína se eluye a través de un gradiente de NaCl 50 mM-0,4 M. El pico de rPspA determinado por ELISA, se reúne y concentra por ultrafiltración a 5 mg/ml, se intercambia en solución salina y se filtra en condiciones estériles con un filtro Millex GV 0,2 \mu. La pureza se confirmó por PAGE en SDS. La concentración se determinó por el coeficiente de extinción calculado de 7620 M^{-1}.

Adsorción de proteínas en adyuvantes en fase sólida

El procedimiento convencional para adsorción de proteínas a Alhydrogel es como se explica a continuación, y como se ilustra en líneas generales en la Figura 2a. Se adsorbió BSA a Alhydrogel como se describe de manera general en Houen et al., "Conjugation to Preadsorbed Preactivated Proteins and Efficient Generation of Antipeptide Antibodies", J. Immunol. Meth., 206: 125-134, (1997). Primero se adsorbió BSA en adyuvante de aluminio, Alhydrogel, combinando 4,2 ml de BSA (50 mg/ml en solución salina) con 23 ml de Alhydrogel (dilución 1:2 en solución salina) y mezclando suavemente durante una noche por agitación en un tubo de 50 ml. La proteína adsorbida se lavó tres veces por centrifugación a 3200 x g durante 10 minutos y se resuspendió en solución salina. El sedimento final se resuspendió en 10 ml de solución salina + azida al 0,02% y se mantuvo a 4ºC. La BSA adsorbida se ensayó usando el ensayo micro BCA (Pierce Chemical) con BSA soluble como patrón. Se descubrió que más del 95% de BSA estaba con el adyuvante en fase sólida.

El toxoide tetánico (5 mg/ml) se dializó en MES, 10 mM, NaCl 0,5 M, pH 6. Se dializó rPspA (5 mg/ml) en acetato de sodio 50 mM, pH 5. La proteína se mezcló con Alhydrogel al 1% y se agitó suavemente durante una hora a temperatura ambiente. La proteína adsorbida al adyuvante en fase sólida se centrifugó durante 15 minutos en tubos de 1,5 ml en una micrófuga a 16.000 x g y se retiró el sobrenadante. El sedimento se resuspendió en 1 ml de acetato de sodio 25 mM, pH 5 usando un microhomogeneizador (Kontes "Pellet Pestle") y se recentrifugó. Las etapas de lavado se repitieron 2 veces más y la proteína adsorbida se resuspensión en el tampón final. Para variar la densidad de la proteína adsorbida, se pueden usar proporciones de 0,25-5 mg de Alhydrogel por mg de proteína. A 1 mg de proteína/mg de Alhydrogel, se adsorbió más del 90% de la proteína. Si es necesario, el punto isoeléctrico del Alhydrogel puede reducirse por la adición de cantidades limitadas de fosfato, como se describe por Rinella, Jr., J.V. et al., Vaccine 14:298 (1996). Si se demuestra que Alhydrogel no es satisfactorio para usarlo en la preparación de conjugados proteína-polisacárido en fase sólida con polisacárido cargados negativamente, tales como Pn6, o construcciones que contienen haptenos cargados negativamente, tales como fosforilcolina, la proteína puede adorberse a un adyuvante de aluminio en fase sólida con un punto isoeléctrico bajo por ejemplo, Adjuphos. La proteína adsorbida a Adjuphos y los conjugados se resuspenden en tampón de carbonato 25 mM a pH 9, en lugar del tampón de acetato sódico 25 mM usado con Alhydrogel.

La proteína se ensayó usando el microensayo BCA (Pierce Chem. Co). usando la proteína de ensayo, BSA, y "contabilizando" todas las fracciones, se ha determinado que la proteína adsorbida puede cuantificarse con este método.

El polisacárido se ensayó con el método de resorcinol/ácido sulfúrico de Monsigny et al., Anal Biochem., 175: 525 (1988).

Procedimiento general para la activación de CDAP de polisacárido (2)

Se solubilizó Pn14 a 10 mg/ml en agua. CDAP (Research Organics) se preparó a 100 mg/ml en acetonitrilo. A t = 0, se añadió CDAP a PS. A los 30 segundos, se añadió trietilamina (TEA) 0,2 M para llevar el pH a 9,5. Se mantuvo el pH a 9-9,5, y a los 2,5 minutos se añadió a una solución agitada de proteína (soluble o adsorbida). Los conjugados en fase sólida se mezclaron periódicamente con un microhomogeneizador durante la primera hora. Después de reaccionar durante una noche, la solución se inactivó añadiendo etanolamina a 0,1 M e incubando durante una hora. Los conjugados en fase sólida se procesaron por filtración en gel en una columna S400HR (Pharmacia) para retirar la proteína no conjugada. El polisacárido no conjugado se retiró de las proteínas adsorbidas en el adyuvante haciendo primero la solución a 25 mM en acetato de sodio, reduciendo el pH a 5 con HCl 1 N, e incubando a temperatura ambiente durante 1 hora. El conjugado en fase sólida se lavó como se ha descrito. Para variar el grado de activación de polisacárido, se ensayaron proporciones de CDAP de 0,25-1 mg CDAP/mg PS. Para variar las condiciones de acoplamiento, la proteína adsorbida se resuspendió a 5, 10 o 20 mg/ml antes de la adición del PS activado por CDAP. El Pn14 activado por CPAD puede unirse al PC-rPspA adsorbido al adyuvante.

En todos los casos anteriores se retiró el hapteno, proteína o polisacárido libre no conjugado del producto final por centrifugación y lavado del Alhydrogel, que contiene la vacuna conjugada. Esta es la principal etapa de ahorro en tiempo y costes en la preparación de las vacunas conjugadas, ya que no se necesita usar una columna cromatográfica para retirar el hapteno, proteína o polisacárido libre.

Inmunizaciones

A continuación se proporciona un ejemplo de como se pueden realizar las inmunizaciones en ratones. Se inmunizaron grupos de 5 ratones Balb/c de manera subcutánea en los días 0 y 14 y se les extrajo sangre días después con las diversas construcciones de vacuna a dosis que varían entre 0,01-10 \mug. Para optimizar la cantidad de adyuvante, los inmunógenos se mezclaron con Alhydrogel adicional sobre un intervalo de 0-0,5 mg por ratón. Como ejemplo para optimizar la cantidad de adyuvantes adicionales, los inmunógenos conjugados en fase sólida se mezclan con Alhydrogel.

Elisa

Todos los inmunoensayos se realizan usando tiras de ensayo en un Maxisorp Nunc (Nunc 469949). Usando el antisuero preparado previamente para fosforilcolina, PspA, toxoide tetánico, Pn14 y Pn6B, los experimentos preliminares se hacen para determinar la concentración óptima del antígeno de recubrimiento. PC se une a BSA para usar como un antígeno ELISA, usando el procedimiento descrito anteriormente. Para ELISA, se añaden 100 \mum de solución de antígeno en PBS (pH 7,4) a todos los pocillos y la placa recubierta con un cubreobjetos y se incuba durante una noche a temperatura ambiente. Los pocillos se lavan 4 veces con PBS que contiene Tween-20 a 0,05% (PBS-T) para retirar el antígeno de recubrimiento no unido. Las muestras de suero se ensayan a 6-7diluciones, preparadas en PBST. Se añaden 100 \mul de cada dilución a pocillos duplicados en la placa recubierta con antígeno. Los pocillos de control negativo solo tienen PBS-T. Se incluyen los pocillos de control positivo. Para propósitos de comparación, cada ELISA incluye las muestras de suero más recientes así como las muestras de suero previas. Después de la adición de las muestras de suero, la placa se incuba durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente, y los pocillos se lavan otra vez con PBS-T. Todos los pocillos reciben 95 \mul de IgG de conejo anti-ratón (gamma-específico) conjugado con HRP. Las placas se incuban otra vez a temperatura ambiente durante 30-60 minutos y se lavan con PBS-T. Se añadirán 100 \mul de sustrato TMB a todos los pocillos y la placa se incuba en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos. La reacción se parará añadiendo de 80 \mul de solución de parada TBM y las absorbancias se determinan usando un lector de microplaca Molecular Devices con un filtro de 450 nm. Los títulos se calculan usando el programa SoftMax. La especificidad de anticuerpos anti-PC se confirma por preincubación del anticuerpo con 100 \mug/ml de fosforilcolina (Aldrich) y se determina el bloqueo de la unión de anticuerpo a PC-
BSA.

En casos los seleccionados se evalúa la actividad de protección del suero usando un ensayo opsónico. Fischer, GW et al., J. Infect. Dis., 169:323 (1994). Los especialistas en la técnica entenderán que la metodología para la preparación de conjugados proteína-polisacárido en fase sólida puede requerir la optimización de un conjugado dado tal como PC-PspA-Pn6. Por ejemplo, puede ser necesario modificar las condiciones para prevenir la adsorción no específica de PC y Pn6. De este modo, si la reducción de la carga positiva del Alhydrogel adsorbiendo cantidades limitantes de fosfato no previene la unión no específica o si no se puede adsorber PspA a Adjuphos cargado, el punto isoeléctrico de la PspA puede aumentarse modificando genéticamente una cola de polilisina en el C-terminal, para promover la unión de la proteína a Adjuphos, que tiene un punto isoeléctrico de aproximadamente 5. El Adjuphos cargado negativamente no debe unirse a aniones.

Ejemplos A Preparación de vacuna conjugada en fase sólida

Estos ejemplos demuestran el procedimiento de conjugación en una matriz en fase sólida y examinan alguno de los parámetros que son importantes para el acoplamiento de polisacáridos de alto peso molecular (PS) en fase sólida, adyuvante-proteína adsorbida. Se usó BSA como una proteína representativa y se adsorbió al adyuvante de hidróxido de aluminio en fase sólida comercial, Alhydrogel, como se describe en Houen, G, et al., J. Imm. Meth., 206:125, 1997. El polisacárido se activó con tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridina (CDAP), como se describe de manera general en Lees et al., Vaccine., 14:190 (1996) y después se acopla a la proteína adsorbida como se describe a continuación.

Ejemplo 1 Efecto de la activación del polisacárido y del pH de acoplamiento en la eficacia de conjugación a la proteína adsorbida a una matriz de adyuvante sólida

Se activó el polisacárido tipo 14 de S. pneumoniae (Pn14) (3 mg a 10 mg/ml) con 0,25, 0,5 o 1 mg de CDAP/mg de polisacárido y una cantidad molar 2x de trietilamina (TEA) y se añadió a 3 mg de BSA/Alhydrogel suspendido en 100 \mul de borato sódico 0,1 M, pH 9,3. Después de una incubación durante una noche mientras se mezcla, las soluciones se inactivaron con etanolamina y se lavaron por centrifugación para retirar el polisacárido no conjugado. La proteína se ensayó usando el microensayo BCA (Pierce Chemical Co.) y se ensayó el polisacárido con el método de resorcinol/ácido sulfúrico de Monsigny et al., Anal Biochem., 175:525 (1988). Como se indica en la Tabla 1, cuanto mayor es la cantidad usada de CDAP, mayor fue la extensión de acoplamiento de PS a la proteína adsorbida.

La reacción también se realizó en un tampón HEPES a pH 7,3. Como se muestra en la Tabla 1, la eficacia de acoplamiento del PS a la proteína fue significativamente inferior a pH 7,3.

Este experimento demuestra que los polisacáridos activados por CDAP reaccionarán con la proteína adsorbida a adyuvante y que el grado de activación de CDAP y el pH de acoplamiento influye en la extensión de la eficacia de acoplamiento de un modo similar a las reacciones en fase de solución. Lees, A, et al. Vaccine, 14:190 (1996).

TABLA 1 Efecto de la activación de polisacárido y el pH de acoplamiento en la eficacia de conjugación de la proteína

1

Ejemplo 2 Efecto de la proporción de entrada variable de polisacárido/proteína

Se adsorbió BSA a Alhydrogel y el dextrano activado por CDAP se preparó como se ha descrito anteriormente y se añadió a la proteína adsorbida a las proporciones indicadas en la Figura 1. Como se aumentó la cantidad de dextrano relativa a BSA, disminuyó en el porcentaje de dextrano que se conjugó, aunque hubo un aumento total en la cantidad absoluta de dextrano que se conjugó (Figura 1). Esto demuestra que la proporción de polisacárido a proteína puede variar variando la proporción de entrada de PS/Proteína.

Ejemplo 3 El polisacárido no conjugado neutro no se adsorbe a Alhydrogel

Se añadieron 3 mg de dextrano o dextrano activado por CDAP a 10 mg/ml a 3mg de BSA adsorbido a Alhydrogel a 10 mg/ml en borato sódico 5 mM, pH 9,3. Después de reaccionar durante una noche, el pH se redujo a 5 añadiendo acetato sódico 1 M. El material en fase sólida se centrifugó y se resuspendió 3 veces en 1 ml de acetato sódico 50 mM (pH 5).

Se determinó la recuperación de proteína y polisacárido. Como se muestra en la Tabla 2, se adsorbió muy poco dextrano, si acaso algo, en la proteína en base sólida salvo que se active el dextrano con CDAP. Este experimento también indica la excelente recuperación del conjugado que se puede conseguir por metodología en fase sólida. Con Pn14 se obtuvieron resultados similares.

TABLA 2 Adsorción de polisacárido a Alhydrogel

2

Ejemplo 4 Síntesis de una vacuna conjugada modelo en una matriz sólida e inmunización de ratones

Se adsorbió BSA a Alhydrogel y se lavó como se ha descrito anteriormente en la sección de Metodología. Se activó Pn14 con CDAP (como se ha descrito anteriormente en la sección de Metodología) y se añadió al BSA/Alhydrogel. Después de reaccionar durante una noche, las mezclas se inactivaron y se lavaron por centrifugación repetida para retirar Ps libre. Los controles se prepararon mezclando Pn14 con Alhydrogel ("Alhy"), solo y con proteína adsorbida, y mezclando Pn14 activado por CDAP con Alhydrogel.

Se inmunizaron grupos de 4 ratones Balb/c por vía subcutánea en los días 0,14 y 28 con 2,5 \mug de Pn14, como conjugados preparados por síntesis en fase sólida o como se indica en la Tabla 3. Los ratones del grupo conjugado recibieron 3 \mug de BSA. Los grupos de solo BSA recibieron 5 \mug de BSA. Se tituló suero de muestra sanguínea del día 42 por ELISA para anticuerpo IgG frente a Pn14.

Este experimento demuestra que los anticuerpos anti-polisacárido pueden inducirse usando conjugados preparados usando un enfoque de fase sólida. En ausencia de unión covalente del polisacárido a la proteína, no se detectaron anticuerpos anti-polisacárido. La unión covalente del polisacárido a la proteína solo sucede cuando el polisacárido se ha activado, por ejemplo, por CDAP. Este experimento no comparó la eficacia de conjugados preparados en fase sólida frente a métodos convencionales.

TABLA 3 Inmunización de ratones por vacuna conjugada en matriz sólida

3

* Titulación Elisa a un corte de OD 0,5

B. Inducción de anticuerpos

Se usaron antígenos que se ha demostrado que inducen anticuerpos de protección para Streptococcus pneumoniae. Estos ejemplos inducen anticuerpos de protección de alto título de protección a S. pneumoniae usando los componentes de vacuna propuestos fosforilcolina (PC) y la proteína de superficie A de neumococos (PspA).

Ejemplo 5 Síntesis de una vacuna conjugada clínicamente relevante usando una matriz de adyuvante en fase sólida

Se purificó la proteína de fusión (proteína RSVF) del virus sincitial respiratorio desarrollado en células HEp-2 y se adsorbió a Alhydrogel. La proteína adsorbida a Alhydrogel se lavó por centrifugación para retirar la proteína no adsorbida y se acopló a Pn14 activada por CDAP. El Pn14 no conjugado se retiró por centrifugación. Se inmunizaron grupos de 4 ratones Balb/c por vía subcutánea en los días 0 y 14 con 2,0 \mug de conjugado de Pn14 con proteína F preparado a Alhydrogel o con 2 \mug de proteína F adsorbida a Alhydrogel más 5 \mug de Pn14, co-mezclado con la proteína. Se mezcló Alhydrogel adicional con cada inmunógeno de modo que cada ratón recibió un total de 0,1 mg de Alhydrogel por inmunización. Se determinaron los títulos ELISA anti-proteína F y anti-Pn14 en suero combinado de muestra sanguínea de ratones en el día 28.

Las combinaciones de los sueros anteriores se ensayaron para su capacidad de promover opsonofagocitosis. Se descubrió que solo el suero de ratones inmunizados con el Pn14 conjugado tenía actividad opsonofagocítica. Este experimento demuestra que la vacuna conjugada preparada usando proteína RS VF conjugada con Pn14 usando un sistema en fase sólida inducía el anticuerpo de alta titulación tanto frente a PS como al componente proteico. En contraste, los ratones inmunizados con la proteína F en fase sólida co-mezclada con Pn14 no dieron titulación frente a polisacárido. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4 Síntesis de una vacuna conjugada clínicamente relevante usando una matriz adyuvante en fase sólida

4

Ejemplo 6 Inducción de anticuerpos antifosforilcolina (PC) de alta titulación que son de protección

Para estudiar si se podría inducir anticuerpos de alta titulación y de protección frente a PC, se conjugó un análogo de PC con el toxoide tetánico o el toxoide diftérico (PC-TT, PC,-PT), esencialmente como se describe en los Métodos, y se inmunizaron ratones DBA/2 con 5 \mug de proteína.

Se estimularon los ratones 14 días después, y el suero del día 28 se tituló para anticuerpos IgG frente a PC. Como se observa en la Tabla 5, los ratones se estimularon para producir anticuerpos anti-PC de alta titulación después de la inmunización de estimulación. Todos los ratones inyectados con conjugados TT o PT también desarrollaron respuestas de anticuerpo de alto título frente a la molécula vehículo (no mostrada).

TABLA 5 Inducción de anticuerpos de protección antifosforilcolina (PC) de alto título

5

Para ensayar si los anticuerpos anti-PC que se inducían por estos inmunógenos eran de protección, se inyectaron ratones con 0,1 ml de suero de ensayo o control. 24 horas después, los ratones se infectaron con 20.000 organismos de la cepa WU2 de S. pneumoniae. Mientras que los 5 ratones de control inyectados murieron en 72 horas, ninguno de los ratones a los que se les dio suero que contenía anti-PC murieron. Esto demuestra que se pueden producir anticuerpos de alto título y de protección después de la conjugación de PC frente a vehículos relevantes clínicamente.

Ejemplo 7 Inducción de anticuerpos frente a epítopos múltiples de S. pneumoniae

Para determinar si se podría conjugar PC a otro epítopo de protección de S. pneumoniae e inducir anticuerpos a ambos componentes, se conjugó un análogo de PC a la proteína de superficie de neumococos (PspA), como se describe en los Métodos y se inyectaron 0,5 \mul s.c. en 5 ratones DBA/2 en los días 0 y 14. Se les extrajo sangre a los ratones 14 días después y se tituló el suero para los anticuerpos IgG frente a PC y PspA. Cinco \mug de PspA-A o 5 \mug de PspA son solubles o se mezclan con Alhydrogel. Los datos de la Tabla 6 demuestran que se pueden inducir anticuerpos IgG de alto título frente a componentes PC y PspA de la vacuna.

TABLA 6 Inducción de anticuerpos frente a epítopos múltiples de S. pneumoniae

6

Ejemplo 8 Los conjugados que contienen proteína no conjugada son inmunógenos y de protección

Se conjugó TT con Pn14 usando CDAP y se retiró la proteína libre por filtración en gel en una columna S400HR. Se dializó otra alícuota del mismo conjugado solo (punto de corte de 14 kDa) y contenía aproximadamente un 50% de TT no conjugado (determinado por HPLC de exclusión de tamaño). La recuperación de polisacárido fue notablemente superior para las muestras solo dializadas que para las muestras en gel (>del 95% frente al 37%). Se inmunizaron grupos de 4 ratones con cada preparación en los días 0 y 14 y se extrajo la sangre 14 días a partir de entonces. Los títulos anti-IgG se determinaron por ELISA. Tanto las titulaciones de anticuerpo anti-proteína y anti-PS fueron superiores para las formulaciones solo dializadas.

TABLA 7 Efecto de la proteína no conjugada

7

a. corte ELISA de OD 0,1

b. corte ELISA de OD 0,5

c. basado en Pn14

\newpage

Los datos sugieren que la proteína no conjugada homóloga, presente con la proteína conjugada, estimula la respuesta inmune más que los conjugados en los que se ha retirado la proteína libre. De este modo, la presencia de proteína no conjugada adsorbida a los inmunógenos proteína-polisacárido en fase sólida proporciona respuestas inmunes potenciadas sobre las preparaciones convencionales.

Ejemplo 9 Inmunogenicidad de conjugados TTPS preparados usando adyuvantes en fase sólida con diversos PS y químicas de unión

Se adsorbió TT a Alhydrogel y se acopló a Pn14 o PsC Neisseria. Se activó Pn14 con CDAP, se acopló usando química de tio-éter o conjugación haloacilo. El método de química de tio-éter se analiza de manera general en Lees, Vaccine, 12:1160 (1994). La conjugación haloacilo se describe por ejemplo, en Lees et al., Abstract for 11^{th} Int. Pathogen. Neisseria Conf., Niza, Francia, pág. 161 (1998). Después de la conjugación, se retiró PS libre por centrifugación y el conjugado en fase sólida se ensayó para PS y TT. Se inmunizaron grupos de 4 ratones Balb/c con 5 \mug de PS conjugado que contenía la cantidad indicada de TT, en el día 0 y 14 y se les extrajo sangre 14 días después. Los sueros combinados de las muestras sanguíneas del día 28 se ensayaron por ELISA para la PS homóloga y para TT.

TABLA 8 Efecto de PS variable y química de unión

8

*corte ELISA de OD 0,1 para PS y de 0,5 para TT.

Esto demuestra que el método es apropiado para una diversidad de diferentes químicas, proteínas, y polisacáridos. Se observa que el conjugado haloacilo/PsC dio una respuesta anti-PsC alta, consecuente con la ausencia de resultados con conjugados TT-(haloacilo)-PsC en fase de solución. Se observa que no se hizo ningún esfuerzo para optimizar el protocolo de conjugación o la dosis. El propósito de este experimento fue demostrar que usando una diversidad de químicas, podrían acoplarse polisacáridos y usarse para inducir anticuerpos. Además, no pudieron compararse los títulos anti-PsC y Pn14.

Los siguientes cuatro ejemplos demuestran la preparación de vacunas conjugadas duales se puede hacer referencia adicional a la Patente de Estados Unidos Nº 5.955.079.

Ejemplo 10 Conjugación de PS con adyuvante-hapteno adsorbido-proteína (descrito en líneas generales en la Figura 3 (II))

Se adsorbió el toxoide tetánico (TT) a Alhydrogel como se ha descrito anteriormente, y se resuspendió a 5 mg/ml en tampón HEPES, (HEPES 0,5 M, EDTA 2 mM, pH 7,3). Se añadió yodoacetato de N-hidroxisuccinimidilo (SIA) de una reserva 0,1 M en dimetilformamida a una proporción molar de 10 veces de SIA a TT y se hizo reaccionar en la oscuridad. Después de una hora, se lavó el TT por centrifugación con tampón HEPES para retirar el reactivo no reaccionado. El TT adsorbido yodoacetilado se resuspendió en tampón HEPES a 10 mg/ml.

Se solubilizó un péptido consenso obtenido de E. coli enteroxigénico (FJ Cassels et al., J. Industrial Microbiology and Biotechnology 19:66 (1997) (secuencia: CVEKNITVTASVDPTIDLLQADGSALPSAVALTYSPAG) se solubilizó a 10 mg/ml en tampón HEPES + acetonitrilo al 10%. El contenido de tiol libre se determinó usando el reactivo de Ellman.

Se añadió péptido al TT adsorbido yodoacetilado en una proporción de 10 moles de tiol libre por mol de TT. Después de reaccionar durante una noche, la solución se hizo 0,2 mM en mercaptoetanol durante una hora y después se lavó por centrifugación repetida y resuspensión en tampón HEPES. La concentración final de TT es 10
mg/ml.

Se activó Pn14 a 10 mg/ml con CDAP y se acopló al péptido/TT adsorbido como se ha descrito en otros ejemplos.

Como alternativa, el péptido se acopla a la proteína adsorbida como se describe en líneas generales en Houen et al. PS se acopla a la proteína-péptido adsorbida como se ha descrito en otros ejemplos.

Ejemplo 11 Hapteno-proteína preparado antes de la adsorción a la fase sólida (descrito en líneas generales en la Figura 3(I))

Se suspende TT en tampón HEPES a 5 mg/ml y se pone a reaccionar con un exceso de 10 M de SIA. Después de una hora, se desaló la proteína y se concentró usando un dispositivo Ultrafree 30 (Millipore) a 10 mg/ml. El péptido se prepara y se añade como antes. Después de una reacción ON, se paró la solución con mercaptoetanol 0,2 mM durante una hora. El péptido no conjugado se retira por filtración en gel en una columna S200HR (Pharmacia), equilibrada con solución salina. La fracción péptido-TT se concentra a 10 mg/ml y se adsorbe a Alhydrogel.

Se activa Pn14 a 10 mg/ml con CDAP y se acopla al péptido/TT adsorbido como se ha descrito en otros ejemplos.

Ejemplo 12 Hapteno acoplado a la proteína-Ps adsorbida (descrito en líneas generales en la Figura 3 (III)

Se conjuga Pn14 con TT adsorbido a Alhydrogel como se ha descrito. El Pn14-proteína adsorbido se yodoacetila con SIA como se ha descrito anteriormente. El péptido se prepara como se ha descrito y se añade a la proteína/Ps yodoacetilada. Después de reaccionar durante una noche, la solución se inactiva con mercaptoetanol y el péptido no conjugado se retira por lavado repetido por centrifugación.

Ejemplo 13 Conjugación de la proteína al polisacárido adsorbido

Ciertas Ps se adsorben bien a Alhydrogel, por ejemplo, A. Neisseria meningiditis (Neiss PsA). Neiss PsA se suspende a 10 mg/ml en agua y se mezcla con un peso igual de Alhydrogel. Después de una hora, se retira el Ps no adsorbido mediante lavado por centrifugación y se resuspende a 10 mg/ml en solución salina.

El Ps adsorbido se activa con CDAP. 1 mg de CDAP por mg de Ps adsorbido de una reserva de 10 mg/ml de CDAP en acetonitrilo. A los 30 segundos, el pH se aumentó y se mantuvo ese pH durante dos minutos más, usando TEA de una reserva de 0,2 M. A los 2,5 minutos, se añade TT en una proporción de 1mg de TT/mg Ps y el pH se ajusta inmediatamente a 9. Después de una reacción de una hora, se retira la proteína no adsorbida a lavado/centrifugación. Como en otros ejemplos, se puede añadir el hapteno a la proteína antes o después del acoplamiento con el Ps adsorbi-
do.

Ejemplo 14 Conjugados Intimin-polisacárido en fase sólida

Este ejemplo ilustra la adsorción de una proteína a Alhydrogel y Adjuphos, adyuvantes de aluminio en fase sólida con bajo y alto punto isoeléctrico. El ejemplo indica que los conjugados con polisacárido cargados negativamente, que se adsorben a Alhydrogel, pueden preparase en una proteína adsorbida a Adjuphos. Los conjugados indujeron una respuesta anti-polisacárido inmune en ratones.

La Intimina es una proteína bacteriana que promueve el acoplamiento al epitelio intestinal y es un factor de virulencia para las cepas EHEC O157:H7 es decir, entre otras. La Intimina tiene un punto isoeléctrico de 9,35 y de este modo es una proteína básica. Se ha descubierto que se adsorbe bien tanto a Alhydrogel como a Adjuphos.

A. Unión covalente del polisacárido de neumococos tipo 14 a la Intimina adsorbida a Alhydrogel

Se purificó Intimina recombinante de E. coli (M. L. McKee y A.D. O'Brien, Infect. Immun., 64:2225 (1996) y se dializó en diacetato sódico 20 mM, pH 5,8. Se mezclo 1,4 ml de Intimina (\sim1 mg/ml) con 1,4 mg de Alhydrogel. Después de 1 hora el material adsorbido se centrifugó y se resuspendió a 10 mg/ml en HEPES 20 mM, pH 8. El polisacárido de neumococos tipo 14 (Pn14) se activó con tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridina (CDAP) como se explica a continuación. A 2 mg de Pn14 (10 mg/ml en solución salina) se le añadieron 5 \mul de CDAP (100 mg/ml en acetonitrilo). A los 30 segundos, se añadieron 10 \mul de trietilamina 0,2 M. A los 2,5 minutos, se mezcló el Pn14 activado con la suspensión de Intimina. La mezcla se agitó suavemente durante 3 horas y después se dializó durante una noche en acetato sódico 20 mM, pH 5,8. Se retiró el material no adsorbido a centrifugación y se resuspendió dos veces en el mismo tampón. El sedimento final se resuspendió en acetato sódico 20 mM a un volumen final de 0,68 ml. Usando el ensayo BCA para determinar la proteína adsorbida y el ensayo de resorcinol/ácido sulfúrico para determinar el polisacárido, se descubrió que había 0,4 mg de Pn14 por mg de Intimina.

Se descubrió que el polisacárido A Neisseria meningiditis (PsA), un polímero cargado negativamente, se adsorbió a Alhydrogel pero no a Adjuphos.

Se mezcló un mg de PsA (10 mg/ml, agua) con 1 mg de Adjuphos (5 mg/ml en carbonato sódico 50 mM, pH 9,3). Después de incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente, se retiró el material no adsorbido a centrifugación y se resuspendió dos veces en el mismo tampón. Usando el ensayo de resorcinol/ácido sulfúrico, se determinó que se adsorbió menos del 3% del polisacárido. Cuando se incubó 1 mg de PsA con 1 mg de Alhydrogel en acetato sódico 25 mM, pH 5 y se retiró el material no adsorbido a centrifugación y se resuspendió en el mismo tampón, se descubrió que se absorbía más del 25% del polisacárido a Alhydrogel. Por lo tanto, Adjuphos sería apropiado para preparar conjugados en fase sólida de carbohidratos cargados negativamente, como se ilustra en el siguiente ejemplo.

B. Unión covalente del polisacárido A de Neisseria meningiditis a Intimina adsorbida a Adjuphos

Se mezcló una solución de 1 ml de Intimina recombinante (absorbancia a 280 nm = 1,5) en acetato sódico 20 mM, pH 5,8 con dos 2,5 mg de Adjuphos (disponible en Accurate Scientific, NY). Después de 1 hora, la solución se centrifugó y se resuspendió dos veces en acetato sódico 20 mM, pH 5,8 y finalmente se resuspendió en 100 \mul del mismo tampón. El polisacárido A de Neisseria meningiditis (PsA) se hidrolizó con HCl aproximadamente un peso molecular medio de 25 kDa y se derivatizó en su extremo reductor con vinilsulfona, como se describe en líneas generales en el documento WO-A-97/41897. El exceso de reactivo se retiró por dializado. Se combinaron 2,2 mg de PsA activado por vinilsulfona en 0,2 ml con la Intimina adsorbida y se añadieron 100 \mul de carbonato sódico 1 M, pH 9. Después de una incubación durante una noche a 4ºC en la oscuridad, el material no adsorbido se retiró por centrifugación y se resuspendió con solución salina. El sedimento final se resuspendió en 0,5 ml de acetato sódico 20 mM,
pH 5,8. Usando los ensayos anteriores, se determinó que la suspensión contenía 0,2 mg de PsA por mg de Intimina.

C. Inmunogenicidad de los conjugados Intimina-polisacárido preparados como una fase sólida a Alhydrogel y Adjuphos

Para comparación, el toxoide tetánico se unió covalentemente a Pn14 y PsA en reacciones en fase de solución. Se inmunizaron grupos de 4 ratones Balb/C con 2,5 \mug de polisacárido en los días 0 y 14. Se les extrajo sangre a los ratones en el día 28 y se ensayaron los sueros para anticuerpos anti-polisacárido por ELISA.

TABLA 9

Inmunogenicidad de conjugados Intimina-polisacárido Título de Anticuerpo

9

10

Ejemplo 15 Nanopartículas de óxido de aluminio

Pueden usarse una diversidad de partículas adyuvantes en fase sólida para preparar vacunas conjugadas proteína-polisacárido en fase sólida. Los ejemplos previos han empleado adyuvantes de hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, específicamente los productos comerciales Alhydrogel y Adjuphos, respectivamente. Los siguientes ejemplos describen el uso de otras partículas.

Los péptidos se han unido covalentemente a partículas de óxido de aluminio funcionalizadas (0,3 \mum de diámetro) y usadas como inmunógenos (Frey et al., Bioconjugate Chem., 8:4204, (1997)). Estas nanopartículas de óxido de aluminio son estables, uniformes y bien caracterizadas. A diferencia de los adyuvantes de hidróxido y fosfato de aluminio, estos no "envejecen". Estas propiedades podrían ser ventajosas en la producción de vacunas. Las partículas de óxido de aluminio (0,3 \mu) derivatizadas con grupos de cloroacetilo fueron un obsequio del doctor F.A. Robey del National Institute of Health, Bethesda, MD. Un proceso para su preparación se describe de manera general en Frey et al., Bioconjugate Chem., 8:4204, (1997). Las partículas de aluminio no derivatizadas se adquirieron en Fluka (Nº 06280).

El toxoide tetánico (TT) se adsorbió a las partículas de óxido de aluminio como se explica a continuación: Las partículas de óxido de aluminio se suspendieron en agua a 2 g/ml y se añadieron 3 mg de TT (14,5 mg/ml en NaCl 2 M). Después de una incubación durante 1 hora, se retiró el material no adsorbido por centrifugación y se resuspendió en agua. Se mezclaron 45 mg de óxido de aluminio adicionales con el TT no adsorbido y se procesó como antes. Todo el TT adsorbido se combinó y se resuspendió en 0,32 ml de PBS. Por el ensayo BCA, la muestra contenía 1,8 mg de TT. Se activaron tres mg de Pn14 (10 mg/ml en agua) por la adición de 30 \mul de CDAP (100 mg/ml en acetonitrilo) seguido 30 segundos después por la adición de 60 \mul de trietilamina 0,2 M. A los 2,5 minutos se añadió el Pn14 activado al TT adsorbido al óxido de aluminio. Después de 4 horas, la reacción se interrumpió añadiendo 100 \mul de glicina 1 M, pH 8 y el material no adsorbido se retiró por centrifugación y se resuspendió en solución salina. El conjugado final se resuspendió en 1 ml de solución salina y se determinó que contenía 0,6 mg de Pn14 por mg de
TT.

Como un control, se mezcló Pn14 no activado con el TT adsorbido al óxido de aluminio y se procesó como antes. Esta preparación se llamó el conjugado simulado y contenía menos de 0,3 mg de Pn14 /mg de TT.

Se unió covalentemente TT a nanopartículas de óxido de aluminio derivatizadas por cloroacetilo como se explica a continuación: Se añadió tiopropil ditiopropidil N-hidroxisuccinimida (8 \mul de una reserva de 10 mM) a 2 mg de TT (14,5 mg en NaCl 2M + 25 ML de HEPES 0,75 M, EDTA 10 mM, pH 7,3). Después de 2 horas, se añadieron 3 \mul de acetato sódico 1 M (pH 5) junto con 9 \mul de ditiotreitol 0,5 M. Después de 30 minutos, se desaló la solución en una columna P6 DG (BioRad), equilibrada con acetato sódico 10 mM, cloruro sódico 0,5 M, pH 5. La fracción de volumen vacío se concentró a 230 \mul usando un dispositivo Ultrafree 30 (Millipore). Se determinó que había 3,7 moles de tiol por mol de TT. El tiol/TT se añadió a una suspensión de 50 \mug del óxido de aluminio activado suspendido en 20 \mul de EDTA 0,1 M + 50 \mul de HEPES 1 M, pH 8. Después de una incubación durante una noche, se lavó la resina 3 veces por centrifugación y se resuspendió en pBS, siendo el volumen final de 200 \mul. Después la reacción se interrumpió añadiendo 4 \mul de mercaptoetanol 10 mM. Después de 30 minutos, se volvió a lavar la resina por centrifugación y se resuspendió en 0,2 ml de PBS. Usando en el ensayo BCA, se descubrió que se conjugaron 0,59 mg de TT con la resina. El polisacárido de pneumococos tipo 14 se activó con CDAP añadiendo 10 \mul de una solución de 10 mg/ml de CDAP a 100 \mul de una solución de Pn14 10 mg/ml. Tres segundos después se añadieron 20 \mul de trietilamina 0,2 M. A los 2,54 minutos, se añadió el Pn14 activado por CDAP a la solución de TT unida de manera covalente al óxido de aluminio. Después de una incubación durante una noche, se paró la reacción por la adición de 50 \mul de glicina 1 M, pH 8 y se lavó por centrifugación con PBS y se resuspendió en 0,2 ml de PBS. Se determinó que el producto contenía 0,2 mg de Pn14 por mg de TT.

Inmunogenicidad de los conjugados TT-P14

Se inmunizaron grupos de 14 ratones BALB/C en los días 0 y 14 con 2,5 \mug de polisacárido de pneumococos, solo o conjugado. Para comparación, se incluyó un conjugado TT-Pn14 en fase de solución. (Se inmunizó un segundo grupo de manera similar. El título de este experimento está entre paréntesis).

TABLA 10 Inmunogenicidad de conjugados TT-P14

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Estos resultados indican que la resina de óxido de aluminio puede usarse para preparar conjugados proteína-polisacárido. También se sugiere que la unión covalente de la proteína con la resina puede ser excelente para la adsorción.

La descripción escrita anteriormente se refiere a diversas realizaciones de la presente invención. Pueden hacerse numerosos cambios y modificaciones en la misma sin alejarse del espíritu y alcance de la invención como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (10)

1. Un método para preparar una vacuna en fase sólida, que comprende las etapas de:

a) adsorber una proteína a un adyuvante en fase sólida

b) unir de manera covalente un carbohidrato a la proteína adsorbida, dondetanto la proteína como el carbohidrato son capaces de inducir una respuesta inmune

c) purificar la vacuna en fase sólida por centrifugación, sedimentación o filtración.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el carbohidrato es un oligosacárido o un polisacárido.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el carbohidrato es el polisacárido de cápsula de pneumococos tipo 14 (Pn14) o PsC de Neisseria.

4. El método de la reivindicación 1, que también comprende la etapa de activar el carbohidrato antes de la etapa (b).

5. El método de la reivindicación 4, donde la etapa de activación se realiza por la acción de tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridina (CDAP).

6. El método de la reivindicación 1, que también comprende la etapa de añadir un hapteno a la proteína después de la etapa (b).

7. El método de la reivindicación 1, donde la proteína es una proteína viral, bacteriana, parasitaria, animal o fúngica.

8. El método de la reivindicación 1, donde la proteína es la proteína F, la proteína de superficie A de pneumococos (PspA), el toxoide tetánico, el toxoide diftérico, la proteína de membrana externa bacteriana, la proteína de membrana externa viral, o combinaciones de las mismas.

9. El método de la reivindicación 2, donde el oligosacárido o polisacárido es natural o sintético.

10. Un método para preparar una vacuna en fase sólida, que comprende las etapas de:

a) adsorber un carbohidrato a un adyuvante en fase sólida

b) unir de manera covalente una proteína al carbohidrato adsorbido, donde tanto la proteína como el carbohidrato son capaces de inducir una respuesta inmune

c) purificar la vacuna en fase sólida por centrifugación, sedimentación o filtración.