ES2707294T3

ES2707294T3 - Composición inmunogénica

Info

Publication number: ES2707294T3
Application number: ES13743463T
Authority: ES
Inventors: Subhash Vinayak Kapre; Sambhaji Shankar Pisal
Original assignee: Serum Institute of India Pvt Ltd
Current assignee: Serum Institute of India Pvt Ltd
Priority date: 2012-01-30
Filing date: 2013-01-29
Publication date: 2019-04-03
Anticipated expiration: 2033-01-29
Also published as: RU2634405C2; BR112014018815A8; TR201900778T4; BR112014018815B1; EP2809349B1; CN104302315A; SI2809349T1; MX354103B; PT2809349T; US20140377302A1; CN104302315B; US9198977B2; RU2014134288A; DK2809349T3; JP2015509111A; WO2013114268A1; HUE040914T4; EP2809349A4; JP6042455B2; SG11201404447WA

Abstract

Una composición inmunogénica que comprende un conjugado de polisacárido X de N. meningitidis-proteína y conjugado(s) adicional(es) de sacáridos que comprenden un sacárido capsular de N. meningitidis derivado de los serogrupos A, C, W135 e Y, en donde la composición comprende (a) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo A de N. meningitidis, y (ii) toxoide del tétanos; (b) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo C de N. meningitidis, y (ii) CRM197; (c) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo Y de N. meningitidis, y (ii) CRM197; (d) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo W135 de N. meningitidis, y (ii) CRM197; y (d) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo X de N. meningitidis, y (ii) toxoide del tétanos, en donde cada uno de los sacáridos de N. meningitidis está conjugado a la proteína portadora a través de un ligando hetero u homo-bifuncional mediante química de conjugación de cianilación, en donde dicho reactivo de cianilación se selecciona de un grupo de tetrafluoroborato de 1-ciano-4-pirrolidinopiridinio (CPPT), 1-ciano-imidazol (1-CI), 1-cianobenzotriazol (1- CBT) o 2-cianopiridazina-3(2H)ona (2-CPO).

Description

DESCRIPCIÓN

Composición inmunogénica

Antecedentes de la invención

La Neisseria meningitidis (meningococo) es un patógeno humano Gram negativo. Coloniza la faringe, causando meningitis y, ocasionalmente, septicemia en ausencia de meningitis. Está estrechamente relacionada con N. gonorrhoeae, aunque una característica que diferencia claramente al meningococo es la presencia de una cápsula de polisacáridos que está presente en todos los meningococos patogénicos. En base al polisacárido capsular del organismo, se han identificado doce serogrupos de N. meningitidis (A, B, C, H, I, K, L, 29E, W135, X, Y y Z).

El serogrupo A (“MenA”) es la causa más común de enfermedad epidémica en el África sub-sahariana. Los serogrupos B y C son responsables de la mayor parte de los casos en los países desarrollados, estando causados el resto de casos por los serogrupos W135 e Y.

Las vacunas que utilizan el polisacárido (PS) solo tienen relativamente baja inmunogenicidad. Para solventar la relativamente baja inmunogenicidad del polisacárido, las vacunas PS se conjugan con portadores proteínicos para aumentar la inmunogenicidad y proporcionar protección duradera en niños jóvenes. Ya se han aprobado muchas vacunas de conjugado meningococales y se comercializan en todo el mundo. Los ejemplos de tales vacunas, conocidas como “conjugados de Neisseria meningitidis” son el conjugado A meningococal monovalente (MenAfriVac), el conjugado C meningococal monovalente (Meningitec) y los conjugados meningococales A C Y W tetravalentes (Menveo y Menactra).

Además de ser usado para la clasificación, el polisacárido capsular ha sido usado para vacunación. Se conoce desde hace muchos años una vacuna tetravalente inyectable de polisacáridos capsulares de los serogrupos A, C, Y y W135, y está licenciada para uso humano. Aunque efectiva en adolescentes y adultos, induce una pobre respuesta inmune y una corta duración de la protección, y no puede ser usada en niños. Mencevax ACWY™ y Menomune™ contienen ambas 50 |jg de cada polisacárido purificado una vez reconstituidas a partir de sus formas liofilizadas. Los sacáridos capsulares de los serogrupos A, C, W135 e Y también han sido combinados en la forma de conjugados para producir vacunas tetravalentes, p.ej., el producto sin adyuvantes Menactra™. También se ha aprobado para uso humano el polisacárido se serogrupo A conjugado como MenAfriVac™, los oligosacáridos del serogrupo C han sido aprobados para uso humano como Menjugate™, Meningitec™ y NeisVac-C™.

La cepas de serogrupo X de N. meningitidis fueron descritas por vez primera en los años 60 del siglo XX, y han sido aisladas a partir de unos pocos casos de enfermedades meningococales invasivas en Norte América, Europa, Australia y China. Se han reportado brotes de cepas de serogrupo X de N. meningitidis en Níger, Kenia occidental y el norte de Ghana. Se reportó que las cepas voy del serogrupo X de N. meningitidis son muy eficientes en la colonización entre reclutas militares en el Reino Unido. Referencia Kilic et al; “Neisseria meningitidis Serogroup X Sequence Type 767 in Turkey”; Journal of Clinical Microbiology, Nov. 2010, p. 4340-4341; Vol. 48, n° 11.

Se reportó que una vacunación en masa repetida en muchos países africanos podría haber contribuido a la colonización de enfermedades meningococales debido a cepas del serogrupo X y podría dar como resultado un cambio del perfil de la enfermedad meningococal. Referencia, Gagneux, S. P. et al.; “Prospective Study of a serogroup X Neisseria meningitidis outbreak in northern Ghana”. J. Infect. Dis. 185: 618-626; 2002.

Los polisacáridos capsulares de los meningococos de serogrupo B, C, Y y W135 están compuestos por derivados de ácido siálico. Los meningococos de serogrupo B y C expresan ácido polisiálico ligado en (a 2-8) y (a 2-9 239), respectivamente, mientras que N. meningitidis de serogrupo Y y W135 expresan secuencias alternantes de D-glucosa y D-galactosa y ácido siálico. Por el contrario, la cápsula de los meningococos de serogrupo A está compuesta por N-acetilmannosamina 6-fosfato ligado en (a 1-6), mientras que N. meningitidis de serogrupo X sintetiza polímeros capsulares de N-acetilglucosamina 1-fosfato ligado en (a 1-4). Referencia, Yih-Ling Tzeng et al; “Genetic Basis for Biosynthesis of the ( 134)-Linked N-Acetyl-D-Glucosamine 1-Phosphate Capsule of Neisseria meningitidis Serogroup X”; Infection And Immunity, Dic. 2003, p. 6712-6720; Vol. 71, n° 12.

El documento WO2008/102173 describe vacunas de conjugado de polisacárido de N. meningitidis, en donde el descubrimiento fue que se deberían usar los sacáridos de las vesículas de membrana exterior (OMVs).

Las vacunas de conjugados meningococales existentes están basadas en los polisacáridos A C Y W135. El aumento de la incidencia de la enfermedad MenX en el Cinturón de la Meningitis Africano en los últimos 5 años [1,4] justifica el desarrollo y la introducción de una vacuna de conjugado de polisacárido MenX en áreas seleccionadas de la región para prevenir y controlar epidemias futuras. Aunque se ha publicado con anterioridad. A pesar de la disponibilidad de la seroprevalencia completa y de los datos estructurales para los meningococos X, todavía se debe desarrollar una vacuna de conjugado viable comercialmente que incluya el polisacárido X debido al éxito extremadamente limitado en los aspectos de purificación, conjugación y estabilidad de formulación de la misma. Esto da lugar a un desafío adicional para abordar y controlar con éxito varios parámetros, especialmente cuando se emplea un proceso de conjugación escalable para la fabricación a gran escala de conjugados de Neisseria meningitidis que contienen el polisacárido X de Neisseria meningitidis.

La presente invención surge del descubrimiento sorprendente de que es posible preparar una composición inmunogénica monovalente o multivalente basada en conjugados de polisacárido meningococal del serogrupo X utilizando un proceso de conjugación eficiente y escalable.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a conjugados de proteína portadora-sacárido X de N. meningitidis preparados mediante una reacción de conjugación que comprende i) clasificar el polisacárido por tamaño, ii) activación basada en CPPT del polisacárido clasificado que tiene un peso molecular medio entre 100-150 kDa, y a un pH entre 9 y 9,5, iii) adición de ADH tras una duración de aproximadamente 2 a 5 minutos seguido de un periodo de incubación de 4-20 h, y iv) hacer reaccionar el polisacárido activado con ADH con la proteína portadora purificada no activada en una relación de entre 0,75 - 1,5 en presencia de tampón MES y EDAC seguido de un periodo de incubación de 3-4 h, que se caracteriza porque la reacción de conjugación se lleva a cabo a 2-8°C dando como resultado un rendimiento de conjugado de entre 20% y aproximadamente 30%, y que presentando una relación de sacárido a proteína entre 0,2 y aproximadamente 0,6 en el conjugado final.

Alternativamente, los conjugados de sacárido X de N. meningitidis-proteína portadora también se pueden preparar mediante una reacción de conjugación que comprende i) clasificar el polisacárido por tamaño, ii) activación basada en CPPT del polisacárido clasificado que tiene un peso molecular medio entre 100-150 kDa, a un pH entre 9 y 9,5, iii) adición de proteína portadora activada con ADH con una relación sacárido:proteína de entre 0,5 - 2 después de 2-3 minutos seguida de un periodo de incubación de 2 a 20 h, que se caracteriza porque la reacción de conjugación se lleva a cabo entre 22°C y 25°C dando como resultado un rendimiento de conjugado de entre 5% y aproximadamente 10%.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a una composición de conjugado de proteína polisacárido meningococal multivalente que comprende sacáridos capsulares de los serogrupos X y sacáridos capsulares A, C, W135 e Y, en donde i) los polisacáridos A, C, W135 y X se clasificación por tamaño mecánicamente mientras que el polisacárido Y se clasifica por tamaño químicamente, ii) todos los sacáridos son conjugados a una proteína portadora a través de un ligando mediante reacción de conjugación por cianilación, iii) todas las relaciones de sacárido a proteína en los conjugados finales se encuentran entre 0,2 - 0,6, y iv) se utilizan al menos dos proteínas portadoras diferentes seleccionadas del grupo que consiste en TT, DT y CRM197.

Descripción de las figuras

Figura 1: Superposición de la reacción de conjugación cuando Men X Ps (215 KDa) está conjugado a TT derivatizado con hidracina.

Figura 2: Conjugado purificado cuando Men X Ps (215 KDa) está conjugado a TT derivatizado con hidracina.

Figura 3: Superposición de la reacción de conjugación cuando Men X Ps (326 KDa) está conjugado a TT derivatizado con ADH.

Figura 4: Conjugado purificado cuando Men X Ps (326 KDa) está conjugado a TT derivatizado con ADH.

Figura 5: Superposición de la reacción de conjugación cuando Men X Ps (120 KDa) está conjugado a TT derivatizado con ADH.

Figura 6: Conjugado purificado cuando Men X Ps (120 KDa) está conjugado a TT derivatizado con ADH.

Figura 7: Cromatograma de polisacárido X meningococal nativo.

Figura 8: Superposición de la reacción de conjugación cuando Men X Ps (510 KDa) está activado con ADH y conjugado a TT purificado.

Figura 9: Conjugado purificado cuando Men X Ps (510 KDa) está activado con ADH y conjugado a TT purificado.

Figura 10: Superposición de la reacción de conjugación cuando Men X Ps (250 KDa) está activado con ADH y conjugado a TT purificado.

Figura 11: Conjugado purificado cuando Men X Ps (250 KDa) está activado con ADH y conjugado a TT purificado.

Descripción detallada de la invención

“Composiciones inmunogénicas multivalentes” se refiere a:

En la presente memoria se describe la Composición I que comprende (a) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo A de N. meningitidis y (ii) toxoide del tétanos; (b) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo C de N. meningitidis y (ii) toxoide del tétanos; (c) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo Y de N. meningitidis y (ii) toxoide de la difteria; (d) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo W135 de N.

meningitidis y (ii) toxoide del tétanos; y (d) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo X de N. meningitidis y (ii) toxoide del tétanos.

También se describe la Composición II que comprende (a) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo A de N. meningitidis y (ii) toxoide del tétanos; (b) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo C de N. meningitidis y (ii) CRM197; (c) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo Y de N. meningitidis y (ii) toxoide del tétanos; (d) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo W135 de N. meningitidis y (ii) CRM197; y (d) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo X de N. meningitidis y (ii) CRM197.

Además se describe la Composición III que comprende (a) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo A de N. meningitidis y (ii) CRM 197; (b) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo C de N. meningitidis y (ii) CRM197; (c) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo Y de N. meningitidis y (ii) toxoide del tétanos; (d) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo W135N de N. meningitidis y (ii) CRM197; y (d) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo X de N. meningitidis y (ii) toxoide del tétanos, que se caracteriza porque los conjugados que contienen toxoide del tétanos como proteína portadora se observa que potencian la inmunogenicidad de los conjugados que contienen CRM 197 como proteína portadora.

La presente invención se refiere a la composición IV que comprende (a) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo A de N. meningitidis y (ii) toxoide del tétanos; (b) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo C de N. meningitidis y (ii) CRM197; (c) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo Y de N. meningitidis y (ii) CRM197; (d) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo W135 de N. meningitidis y (ii) CRM197; y (d) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo X de N. meningitidis y (ii) toxoide del tétanos, tal como se caracteriza en las reivindicaciones.

También se describe la Composición V que comprende (a) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo A de N. meningitidis y (ii) CRM 197; (b) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo C de N. meningitidis y (ii) CRM197; (c) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo Y de N. meningitidis y (ii) CRM197; (d) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo W135 de N. meningitidis y (ii) CRM197; y (d) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo X de N. meningitidis y (ii) toxoide del tétanos.

Por consiguiente, en una primera realización, la composición puede comprender el sacárido del serogrupo A, C, Y, W135 y X en una cantidad de 0,5-10 |jg, 0,5-5 |jg o 0,5-2 |jg por 0,5 mL de dosis.

Otro aspecto de la primera realización es que dicha composición puede comprender 10 jg de sacárido de serogrupo A, 5 jg de sacárido de serogrupo C, 5 jg de sacárido de serogrupo W135, 5 jg de sacárido de serogrupo Y, y 5 jg de sacárido de serogrupo X.

Alternativamente, dicha composición inmunogénica multivalente puede comprender 5 jg de sacárido de serogrupo A, 5 jg de sacárido de serogrupo C, 5 jg de sacárido de serogrupo W135, 5 jg de sacárido de serogrupo Y, y 5 jg de sacárido de serogrupo X.

Por consiguiente, en una segunda realización, dicho uno o más conjugados de sacárido de N. meningitidis pueden estar adsorbidos opcionalmente sobre hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio o una mezcla de ambos, o estar sin adsorber sobre un adyuvante.

Un aspecto de la segunda realización es que el adyuvante de sal de aluminio puede añadirse en una cantidad de 20 300 jg , 20-200 jg , 25-150 jg de Al+++ por 0,5 mL de dosis.

Otro aspecto de la segunda realización es que el adyuvante de sal de aluminio puede añadirse en una cantidad de 25-125 jg de Al+++ por 0,5 mL.

Una tercera realización de la presente invención es que dicha composición puede comprender un conservante seleccionado entre tiomersal y 2-fenoxietanol.

Un aspecto de la tercera realización es que dicha composición puede comprender además fosfato sódico, cloruro sódico o una combinación de los mismos.

Una cuarta realización de la presente invención es que dicha composición inmunogénica multivalente puede estar en una forma líquida tamponada o en una forma liofilizada.

Un aspecto de la cuarta realización es que dicha composición inmunogénica liofilizada puede comprender una combinación de estabilizante seleccionada entre a) de 2 a 5% (p/v) de trehalosa, de 0,25 a 0,75% de citrato sódico; b) de 2 a 5% (p/v) de sacarosa y de 0,25 a 0,75% de citrato sódico; c) de 2 a 5% (p/v) de sacarosa, de 2 a 5% (p/v) de lactosa y de 0,25 a 0,75% de citrato sódico; y d) de 2 a 5% (p/v) de trehalosa, de 2 a 5% (p/v) de lactosa y de 0,25 a 0,75% de citrato sódico.

Otro aspecto de la cuarta realización es que dicha composición inmunogénica liofilizada puede comprender además un tampón seleccionado entre Tris y fosfato.

Por consiguiente, en una quinta realización, dichos polisacáridos A C W y X pueden clasificarse por tamaño mecánicamente para presentar un peso molecular medio de entre 100-600 KDa, 100-400 KDa, preferiblemente 100 200 KDa, lo más preferiblemente 100-150 KDa. Se prefieren los métodos de clasificación por tamaño mecánicos como la homogeneización, la microfluidización y la disrupción celular a alta presión.

En otro aspecto de la quinta realización, dicho polisacárido Y se puede clasificar por tamaño para presentar un peso molecular medio de entre 90-110 KDa, mediante un método seleccionado entre hidrólisis ácida, degradación alcalina, oxidación por periodato, ozonolisis, hidrólisis enzimática, sonicación, fragmentación mediante haz electrónico. Preferiblemente, la clasificación por tamaño mediante medios químicos es con acetato sódico a una temperatura entre 60 y 80°C.

Todos los sacáridos de N. meningitidis se conjugan a la proteína portadora a través de un ligando hetero o homobifuncional empleando química de conjugación por cianilación.

Dicho polisacárido clasificado por tamaño es activado utilizando un reactivo de cianilación diferente a CDAP y seleccionado de un grupo de tetrafluoroborato de I-ciano-4-pirrolidinopiridinio (CPPT), 1-ciano-imidazol (1-CI), 1-cianobenzotriazol (1-CBT) o 2-cianopiridazina-3(2H)ona (2-CPO), o un derivado funcional o una modificación de los mismos.

En otro aspecto, dicho polisacárido activado o proteína portadora, particularmente el polisacárido, se hace reaccionar con hidracina, carbohidrazida, cloruro de hidracina, una dihidrazida, una mezcla de las mismas, preferiblemente con dihidrazida de ácido adípico.

Los grupos hidrazida se pueden introducir en proteínas a través de los grupos carboxilo de los residuos de ácido aspártico y de ácido glutámico de la proteína usando una reacción de carbodiimida, por ejemplo, mediante reacción con hidracina, carbohidrazida, succinil dihidrazida, dihidrazida de ácido adípico, cloruro de hidracina (p.ej., dihidrocloruro de hidracina) o cualesquier otras dihidrazidas en presencia de EDC. Se emplea EDC como catalizador para activar y modificar el reactivo de proteína con hidracina o la dihidrazida. Como catalizador se puede usar cualquier carbodiimida soluble en agua, que incluye EDC. Las proteínas catalizadas con EDC generalmente presentan tendencia a polimerizar y precipitar. Ver Schneerson et al., Infect. Immun. 1986, 52: 519-528; Shafer et al., Vaccine 2000; 18(13): 1273-1281; e Inman et al., Biochemistry 1969; 8: 4074-4082.

En la presente memoria también se describen composiciones multivalentes de conjugado de polisacárido meningococal y proteína que contienen polisacáridos de A, B, C, H, I, K, L, 29E, W135, Y y Z conjugados individualmente a dos o más tipos diferentes de proteínas portadoras. Los sacáridos capsulares se eligen de los serogrupos meningococales A, C, W135, Y y X, de tal modo que las composiciones incluyen sacáridos de 1, 2, 3, 4 o 5 de estos cinco serogrupos. Composiciones específicas comprenden sacáridos de: serogrupos A y X; serogrupos X y W135; serogrupos X e Y; serogrupos C y X; serogrupos A, Y y X; serogrupos C, X y W135; serogrupos X, Y y W135; serogrupos A, C y X; serogrupos Y, C y X; serogrupos A, W y X; serogrupos Y y W135 y C y X; serogrupos Y y W135 y A y X; serogrupos C y W135 y A y X; serogrupos Y y C y A y X; serogrupos A y C e Y y W135 y X.

Las proteínas portadoras descritas en la presente memoria se pueden seleccionar del grupo, aunque sin limitación, CRM 197, toxoide de la difteria, toxoide del tétanos, toxoide pertúsico, LT de E. coli, ST de E. coli, y exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, complejo C de membrana exterior (OMPC), porinas, proteínas de unión a transferrina, pneumolisina, proteína A superficial pneumococal (PspA), proteína adhesina pneumococal (PsaA), proteínas superficiales pneumococales BVH-3 y BVH-11, antígeno protector (PA) de Bacillus anthracis y factor de edema (EF) y factor letal (LF) destoxificados de Bacillus anthracis, ovalbúmina, hemocianina de lapa de ojo de cerradura (KLH), albúmina de suero humano, albúmina de suero bovino (BSA) y derivado proteínico purificado de tuberculina (PPD). Preferiblemente, las combinaciones de proteínas portadoras a utilizar comprenden toxoide del tétanos y toxoide de la difteria, CRM197 y toxoide del tétanos.

En otro aspecto de la tercera realización, la reacción de conjugación utiliza ligandos seleccionados del grupo que consiste en dihidrazida de ácido adípico, ácido £-aminohexanoico, clorohexanol dimetil acetal, D-glucuronolactona, cistamina y p-nitrofeniletil amina.

Tras la conjugación, los conjugados pueden purificarse de la proteína y el polisacárido que no han reaccionado mediante cualquier técnica estándar, que incluye, entre otras, cromatografía de exclusión de tamaño, centrifugación de gradiente de densidad, ultrafiltración, cromatografía de interacción hidrofóbica o fraccionamiento de sulfato amónico. Ver, p.ej., P. W. Anderson, et al. (1986). J. Immunol. 137: 1181-1186. Ver también H. J. Jennings y C. Lugowski (1981) J. Immunol. 127: 1011-1018.

En una realización, dicha composición inmunogénica de la presente invención puede comprender además un conjugado de proteína polisacárido no meningococal adicional, en donde dichos polisacáridos y oligosacáridos para uso pueden seleccionarse, aunque sin limitación, de polisacáridos pneumococales de los serogrupos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19F, 19A, 20, 22F, 23F y 33F; fosfato de polirribosilrribitol de polisacárido de Haemophilus influenzae de tipo b, polisacáridos estreptococales de grupo B de los serotipos III y V, y polisacárido Vi de Salmonella typhi. También son adecuados para su uso en la presente memoria otros polisacáridos de serotipos pneumococales y estreptococales de grupo B, como lo son otros antígenos T-independientes de polisacárido y oligosacárido, por ejemplo, los polisacáridos u oligosacáridos derivados de estreptococos de grupo A, estafilococos, enterococos, Klebsiella pneumoniae, E. coli, Pseudomonas aeruginosa y Bacillus anthracis. Aunque son particularmente preferidos los polisacáridos y oligosacáridos bacterianos, también se pueden emplear los lipopolisacáridos y lipooligosacáridos bacterianos gram (-) y sus derivados de polisacárido y oligosacárido, y polisacáridos y oligosacáridos virales.

Las composiciones de la invención se pueden presentar y empaquetar de diversas formas. Las composiciones pueden presentarse en viales, o pueden presentarse en jeringas ya preparadas. Las jeringas se pueden suministrar con o sin agujas. Una jeringa incluirá una dosis individual de la composición, mientras que un vial puede incluir una dosis individual o múltiples dosis. Las composiciones inyectables habitualmente serán disoluciones líquidas o suspensiones. Alternativamente, pueden presentarse en forma sólida (p.ej., secadas por congelación) para disolución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección.

Ejemplos:

Ejemplo 1:

Preparación de polisacárido meningococal X

a) Fermentación y purificación de polisacárido meningococal X

Los polisacáridos meningococales X se obtienen de cepas de N. meningitidis (8210 y 9601) utilizando un medio de fermentación adecuado en un modo de fermentación semi-continuo en las condiciones de fermentador óptimas. Otros polisacáridos capsulares meningococales X se preparan típicamente mediante un proceso que comprende las etapas de precipitación basada en CTAB, tratamiento con etanol (96%) seguido de filtración en profundidad, filtración en carbón, precipitación con CaCl², tratamiento con etanol (96%) y ultrafiltración.

b) Clasificación por tamaño de polisacárido meningococal X

Los polisacáridos meningococales X purificados fueron sometidos a 1-2 rondas de clasificación por tamaño mecánica (disruptor celular Constant Systems) en WFI a una presión de aproximadamente 2,07-2,76 x 108 Pa (30-40 kpsi).

Ejemplo 2:

Conjugación de polisacárido meningococal X a proteína portadora.

a) Polisacárido meningococal X de peso molecular medio variable conjugado a toxoide de tétanos (TT) derivatizado con hidracina

Ejemplo comparativo: En primer lugar, el polisacárido de X (Cepa 9601) homogeneizado, peso molecular medio 215 KDa en SEC HPLC, (30 mg/mL), 45 mg, fue activado con 90 mg de CDAP (disuelto a 100 mg/mL en acetonitrilo), el pH de la mezcla se ajustó a 9,5 con NaOH 1M. A continuación, después de 3 min, se añadió a la reacción TT activado con hidracina (30 mg/mL en NaCl 1 M), 67,5 mg. La reacción se monitorizó en HPLC y continuó hasta las 18 h. Después de 18 h la reacción se detuvo mediante la adición de glicina y el conjugado sin purificar se purificó mediante una membrana de diafiltración de TFF de 300 KDa en Tris 10 mM pH 7,2. Se usaron columnas Shodex SB-804 HQ y SB-805 HQ secuencialmente con PBS como fase móvil a un caudal de 1 mL/min. Se determinó la concentración de polisacárido y de proteína mediante ensayo de fósforo y ensayo de Lowry modificado, respectivamente.

En segundo lugar, el polisacárido de X (Cepa 8210), peso molecular medio 326 KDa en SEC HPLC, (24 mg/mL en NaCl 2 M), 60 mg, fue activado con 150 mg de CPPT (disuelto a 114 mg/mL en acetonitrilo), el pH de la mezcla se ajustó a 9,5 con NaOH 2,5 M. A continuación, después de 3 min, se añadió a la reacción TT activado con ADH (37 mg/mL en NaCl 2 M), 37,5 mg, y la reacción se monitorizó en HPLC y continuó hasta las 5 h. Después de 5 h la reacción se detuvo mediante la adición de glicina y el conjugado sin purificar se purificó mediante una membrana de diafiltración de TFF de 500 KDa en PBS 10 mM, seguido de Tris 10 mM pH 7,2.

Además, el polisacárido de X (Cepa 8210), peso molecular medio 120 KDa en SEC HPLC, (20 mg/mL en NaCl 1 M), 200 mg, fue activado con 400 mg de CPIP (disuelto a 114 mg/mL en acetonitrilo), el pH de la mezcla se ajustó a 9,5 con NaOH 1 M. A continuación, después de 3 min, se añadió a la reacción TT activado con ADH (30 mg/mL), 150 mg. La reacción se monitorizó en HPLC y continuó hasta las 4 h. Después de 4 h la reacción se detuvo mediante la adición de glicina y el conjugado sin purificar se purificó mediante una membrana de diafiltración de TFF de 300 KDa en PBS 10 mM, seguido de Tris 10 mM pH 7,2.

b) Polisacárido meningococal X de peso molecular medio variable activado con ADH y conjugado a toxoide de tétanos (TT) no activado purificado

En primer lugar, el polisacárido de X (Cepa 8210) con un peso molecular medio de 510 KDa en SEC HPLC (27 mg/mL en NaCl 2 M), 200 mg, fue activado con 400 mg de CPPT (disuelto a 114 mg/mL en acetonitrilo) y el pH de la mezcla se ajustó a 9,5 con NaOH 2,5 M. A continuación, después de 3 min, se añadió a la reacción 1,5 g de ADH (100 mg/mL en tampón de carbonato), y se dejó continuar la reacción hasta 4 h. Después de 4 h se añadió glicina y la mezcla de reacción se diafiltró con membrana de TFF de 8 KDa. Después se concentró el ADH-Men polisacárido X. A 44 mg de éste (7,5 mg/mL), se añadió TT purificado (37,5 mg/mL en NaCl 0,9%) y tampón MES pH 6,0, de tal modo que la fuerza final del tampón de MES fue de 100 mM, seguido de la adición de 37,5 mg de EDAC (disuelto en MES 100 mM, pH 6,0). La reacción continuó durante 4 h y se monitorizó con HPLC. El polisacárido no ligado se eliminó mediante cromatografía de filtración en Gel usando la resina HW65 Toyopearl en un Akta Chromatography System (GE Amersham). Las fracciones fueron recolectadas y agrupadas en base al perfil de pico y a la relación sacárido-proteína.

En segundo lugar, el polisacárido de X (Cepa 8210) con un peso molecular medio de 250 KDa en SEC HPLC se concentró a 18 mg/mL en NaCl 2M. Una cantidad de 200 mg fue activada con 296 mg de CPPT (disuelto a 114 mg/mL en acetonitrilo) y el pH de la mezcla se ajustó a 9,5 con NaOH 2,5 M. A continuación, después de 3 min, se añadió a la reacción 1,12 g de ADH (100 mg/mL en tampón de carbonato), y se dejó continuar la reacción hasta 4 h. Después de 4 h se añadió glicina y la mezcla de reacción se diafiltró con membrana de TFF de 8 KDa. Después se concentró el ADH-Polisacárido Men X. A 200 mg de éste (7,5 mg/mL), se añadió TT purificado (36,7 mg/mL en NaCl 0,9%) y tampón MES pH 6,0, de tal modo que la fuerza final del tampón de MES fue de 100 mM, seguido de la adición de 200 mg de EDAC (disuelto en MES 100 mM, pH 6,0). La reacción continuó durante 4 h y se monitorizó con HPLC. El conjugado sin purificar se purificó mediante diafiltración en membrana de TFF de 500 KDa en PBS 10 mM seguido de Tris 10 mM pH 7.2.

Tabla 1. Conjugación de polisacárido meningococal X-proteína

Los datos anteriores indican que se puede obtener un rendimiento final de conjugado de aproximadamente 20 a 30% utilizando i) Polisacárido meningococal X de PM (Peso Molecular) medio de aproximadamente 100 a 200 KDa, ii) Polisacárido meningococal X activado con ADH, iii) TT no activado, iv) relación sacárido:proteína entre 0,5 y 2 durante la reacción de conjugación, v) CPPT como reactivo de cianilación, y vi) incubación de reacción de conjugación entre 2 y 8°C, vi) relación sacárido:proteína entre 0,2 y 0,6 en conjugado final.

Ejemplo 3:

Conjugación de polisacárido meningococal A, C, Y, W135 a proteína portadora CRM197.

Se conjugaron polisacáridos meningococales A, C, Y, W135 purificados con un PM medio entre 100 y 200 a CRM197, con una relación sacárido:proteína inferior a 1, utilizando un reactivo de cianilación adecuado (CDAp o CPPT). Los conjugados fueron purificados adicionalmente mediante diafiltración en TFF de 300 KDa con 50 volúmenes de PBS 10 mM y 50 volúmenes de Tris 10 mM.

Ejemplo comparativo 4:

Liofilización y formulación de conjugado Men A C Y W135 y X que contiene dos proteínas portadoras diferentes

Se prepararon formulaciones liofilizadas que contenían conjugados de N. meningitidis, citrato sódico y tampón Tris en diversas combinaciones con trehalosa, sacarosa y lactosa, en donde el contenido libre de polisacáridos estuvo dentro de los límites y el contenido de humedad fue inferior al 2%. Dicha combinación de estabilizante se seleccionó entre a) de 2 a 5% (p/v) de trehalosa, de 0,25 a 0,75% de citrato sódico; b) de 2 a 5 % (p/v) de sacarosa y de 0,25 a 0,75% de citrato sódico; c) de 2 a 5% (p/v) de sacarosa, de 2 a 5% (p/v) de lactosa y de 0,25 a 0,75% de citrato sódico; y de 2 a 5% (p/v) de trehalosa, de 2 a 5% (p/v) de lactosa y de 0,25 a 0,75% de citrato sódico.

Tabla 2.

Formulación líquida que contiene conjugado de Men X monovalente-toxoide del tétanos

Tabla 3.

Formulación líquida multivalente que contiene conjugado Men X-toxoide de tétanos

Tabla 4.

Formulación líquida multivalente que contiene conjugado Men X-TT (cepa 8210)

Tabla 5.

Formulación líquida multivalente que contiene conjugado Men X-TT (cepa 8210)

.

Formulación multivalente liofilizada que contiene conjugado Men X-TT (cepa 8210)

Ejemplo comparativo 5:

Actividad biológica de composición de conjugado monovalente y multivalente que contiene conjugado de sacárido Men X.

Todas las formulaciones fueron inmunizadas en seis hembras de ratón albino suizo de 16-20 g de peso corporal. Los ratones fueron inmunizados subcutáneamente en el día 0, 14 y 28. Se tomaron muestras de sangre de todos los ratones 1 y 2 semanas después de la segunda inmunización (día 21 y día 35).

Se realizó la valoración de anticuerpos mediante ensayo basado en partículas y SBA. Se mezclaron las muestras de suero de pre-inmunización de los seis ratones para preparar un único suero agrupado para cada formulación desde el estudio 4 en adelante, y también se mezcló muestra de suero post-inmunización de los seis ratones pertenecientes todos a la cepa albina suiza para cada formulación para preparar los conjuntos 1, 2 y 3 usando suero de Ratón 1+2, 3+4 y 5+6, respectivamente. Todos los conjuntos fueron analizados para determinar los títulos de IgG totales (ensayo basado en partículas multiplex) y los títulos de anticuerpos funcionales (SBA).

Tabla 7

Tabla 8

Tabla 9

Tabla 10

Tabla 11

Tabla 12

Tabla 13

Tabla 14

Tabla 15

Tabla 16

Los anteriores datos de inmunogenicidad de ratón indican que las composiciones líquidas y liofilizadas de conjugado de monovalente X-toxoide de tétanos y de los conjugados multivalentes que contienen conjugado X-toxoide del tétanos son inmunogénicos. Además, la composición líquida monovalente que contiene 1 |jg de conjugado X-toxoide del tétanos, cloruro sódico, tiomersal y 125 jg de Al+++ proporciona una respuesta inmunogénica óptima. También la composición multivalente de 0,5 mL que contiene los conjugados A-CRM197, C-CRM197, Y-toxoide del tétanos, W-CRM197 y X-toxoide del tétanos con 1 jg de cada uno de los 5 sacáridos, cloruro sódico, tiomersal y 25 j de Al+++ proporciona una respuesta inmunogénica óptima. De esta manera, en esta composición de conjugado multivalente, se observa que los conjugados que contienen toxoide del tétanos como proteína portadora potencian la inmunogenicidad de los conjugados que contienen CRM 197 como proteína portadora.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogénica que comprende un conjugado de polisacárido X de N. meningitidis-proteína y conjugado(s) adicional(es) de sacáridos que comprenden un sacárido capsular de N. meningitidis derivado de los serogrupos A, C, W135 e Y, en donde la composición comprende (a) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo A de N. meningitidis, y (ii) toxoide del tétanos; (b) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo C de N. meningitidis, y (ii) CRM197; (c) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo Y de N. meningitidis, y (ii) CRM197; (d) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo W135 de N. meningitidis, y (ii) CRM197; y (d) un conjugado de (i) el sacárido capsular del serogrupo X de N. meningitidis, y (ii) toxoide del tétanos, en donde cada uno de los sacáridos de N. meningitidis está conjugado a la proteína portadora a través de un ligando hetero u homobifuncional mediante química de conjugación de cianilación, en donde dicho reactivo de cianilación se selecciona de un grupo de tetrafluoroborato de 1 -ciano-4-pirrolidinopiridinio (CPPT), 1-ciano-imidazol (1-CI), 1-cianobenzotriazol (1-CBT) o 2-cianopiridazina-3(2H)ona (2-CPO).

2. Una composición inmunogénica de la reivindicación 1, en donde cada polisacárido capsular tiene un tamaño medio de entre 100 y 600 KDa.

3. Una composición inmunogénica de la reivindicación 2, en donde cada polisacárido capsular tiene un tamaño medio de entre 100 y 300 KDa.

4. Una composición inmunogénica de la reivindicación 3, en donde cada polisacárido capsular tiene un tamaño medio de entre 100 y 200 KDa.

5. Una composición inmunogénica de la reivindicación 1, en donde al menos 3 polisacáridos de N. meningitidis de los serogrupos A, C, W135 y X tras clasificación por tamaño presentan un tamaño medio de entre 100 y 150 KDa.

6. Una composición inmunogénica de la reivindicación 5, en donde la clasificación por tamaño se realiza usando un sistema de disrupción celular a alta presión.

7. Una composición inmunogénica de la reivindicación 1, en donde el polisacárido de N. meningitidis del serogrupo Y tras una clasificación por tamaño química presenta un tamaño medio de entre 90 y 110 KDa.

8. Una composición inmunogénica de la reivindicación 7, en donde la clasificación por tamaño química se realiza usando acetato sódico a una temperatura entre 60 y 80°C.

9. Una composición inmunogénica de la reivindicación 1, en donde el ligando es ADH.

10. Una composición inmunogénica de la reivindicación 1, en donde los conjugados de sacárido X de N. meningitidis-toxoide del tétanos se preparan mediante una reacción de conjugación que comprende i) clasificar por tamaño el polisacárido, ii) activación basada en CPPT del polisacárido clasificado que tiene un peso molecular medio entre 100 150 KDa, a un pH entre 9 y 9,5, iii) adición de ADH después de una duración de aproximadamente 2 a 3 minutos seguido de un periodo de incubación de 4-20 h, iv) diafiltración para eliminar el ADH no reaccionado, y v) reacción del polisacárido activado con ADH con proteína portadora purificada no activada en una relación de 0,75 - 1,5 en presencia de tampón MES y EDAC seguido de un periodo de incubación de 3-4 h, que se caracteriza porque la reacción de conjugación se lleva a cabo a una temperatura entre 2-8°C y la relación de sacárido a proteína en el conjugado final está entre 0,2 y 0,6.

11. Una composición inmunogénica de la reivindicación 1, en donde los conjugados de sacárido X de N. meningitidis-toxoide del tétanos se preparan mediante una reacción de conjugación que comprende i) clasificar por tamaño el polisacárido, ii) activación basada en CPPT del polisacárido clasificado que tiene un peso molecular medio entre 100 150 KDa, a un pH entre 9 y 9,5, iii) adición de proteína portadora activada con ADH con una relación sacárido:proteína entre 0,5-2 después de 2-3 minutos seguido de un periodo de incubación de 2 a 20 h, que se caracteriza porque la reacción de conjugación se lleva a cabo a una temperatura entre 22°C y aproximadamente 25°C y la relación de sacárido a proteína en el conjugado final está entre 0,2 y 0,6.

12. Una composición inmunogénica de la reivindicación 1, que comprende sacárido de serogrupo A, C, Y, W135 y X en una cantidad de 0,5-10 |jg, 0,5-5 |jg o 0,5-2 |jg por dosis de 0,5 mL.

13. Una composición inmunogénica de la reivindicación 12, que comprende 10 jg de sacárido de serogrupo A, 5 jg de sacárido de serogrupo C, 5 jg de sacárido de serogrupo W135, 5 jg de sacárido de serogrupo Y, y 5 jg de sacárido de serogrupo X.

14. Una composición inmunogénica de la reivindicación 12, que comprende 5 jg de sacárido de serogrupo A, 5 jg de sacárido de serogrupo C, 5 jg de sacárido de serogrupo W135, 5 jg de sacárido de serogrupo Y, y 5 jg de sacárido de serogrupo X.

15. Una composición inmunogénica según la reivindicación 12, en donde uno o más conjugados de sacárido de N. meningitidis están adsorbidos sobre hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio o una mezcla de ambos, o están sin adsorber sobre un adyuvante.

16. Una composición inmunogénica según la reivindicación 15, que comprende una etapa de añadir adyuvante de sal de aluminio en una cantidad de 20-300 |jg, 20-200 |jg, 25-150 |jg de Al+++ por dosis de 0,5 mL.

17. Una composición inmunogénica según la reivindicación 16, que comprende una etapa de añadir adyuvante de sal de aluminio en una cantidad de 25-125 jg de Al+++ por 0,5 mL.

18. Una composición inmunogénica de la reivindicación 17, que además comprende un conservante seleccionado entre tiomersal y 2-fenoxietanol.

19. Una composición inmunogénica de la reivindicación 18, en donde la composición comprende fosfato sódico, cloruro sódico o una combinación de ambos.

20. Una composición inmunogénica según cualquier reivindicación precedente, en donde los conjugados de sacárido se encuentran en forma líquida tamponada.

21. Una composición inmunogénica según las reivindicaciones 1-19, en donde los conjugados de sacárido se encuentran en forma liofilizada.

22. Una composición inmunogénica liofilizada según la reivindicación 21, que comprende una combinación estabilizante seleccionada entre a) de 2 a 5% (p/v) de trehalosa, de 0,25 a 0,75% de citrato sódico; b) de 2 a 5% (p/v) de sacarosa y de 0,25 a 0,75% de citrato sódico; c) de 2 a 5% (p/v) de sacarosa, de 2 a 5% (p/v) de lactosa y de 0,25 a 0,75% de citrato sódico; y d) de 2 a 5% (p/v) de trehalosa, de 2 a 5% (p/v) de lactosa y de 0,25 a 0,75% de citrato sódico.

23. Una composición inmunogénica liofilizada según la reivindicación 22, que además comprende un tampón seleccionado entre Tris y fosfato.

24. La composición inmunogénica de las reivindicaciones 1-23 para uso en inmunización de un hospedante humano contra la enfermedad provocada por infección de Neisseria meningitidis.